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TP 1 GENETICA
Un gen es una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico, ya sea proteínas o ARN. Representa la unidad básica de la herencia y está asociado a secuencias reguladoras que modulan su expresión. 
Un alelo son las distintas variantes que puede presentar un mismo gen. 
Locus es la posición o localización fija de un gen en un cromosoma que determina posición de un gen o de un marcador. Un loci pl se define como una forma plural para definir varias localizaciones.
El genoma humano está conformado por alrededor de 3000 millones de pares de bases y contiene unos 20 mil genes que se disponen de forma lineal a lo largo de los cromosomas que a su vez, se organizan en 23 pares de cromosomas lineales, dando un total de 46 cromosomas. 
La molecula de doble hélice del ADN se encuentra empaquetada a distintos niveles según en qué momento del ciclo celular se encuentre. El mayor nivel de compactación se encuentra en metafase donde los cromosomas adoptan la clásica forma de X con las que se los asocia. 
El cromosoma metafásico se encuentra duplicado y altamente condensado. El mismo está compuesto por 2 cromatides hermanas unidas mediante su centrómero. Los brazos superiores al centrómero se denominan Brazos P o cortos, mientras los que se encuentran inferiores al centrómero se llaman Brazos Q o largos. 
Los extremos de los cromosomas poseen unas regiones de ADN repetitivo denominadas telómeros que protegen a la cadena de ADN del acortamiento al que están sometidos las moléculas de ADN lineales en cada ciclo de replicación. 
Los cromosomas pueden clasificarse en distintos tipos según la ubicación del centrómero:
-Los cromosomas metacéntricos poseen un centrómero en el centro y los brazos P y Q poseen el mismo tamaño. 
-Los cromosomas submetacéntricos poseen un centrómero entre el centro y el extremo del cromosoma
-Los cromosomas acrocéntricos poseen un centrómero en el extremo del cromosoma dejando un brazo P muy pequeño. 
-Los cromosomas teocéntricos tienen un centrómero en los telómeros. (No pasa en humanos)
CITOGENETICA
La citogenética es una rama de la genética que comprende el estudio de la estructura, función y comportamiento de los cromosomas. Incluye la utilización de técnicas como el cariotipo, el análisis por bandeo genicromosomas, fluorescencia, fish, etc. 
Un cariotipo representa el patrón cromosómico de una especia expresado a través de un código establecido por convenio que describe las características de sus cromosomas. 
En el reporte de un cariotipo en humanos se escribe el número total de cromosomas, seguido de una coma, y se aclara la composición del par sexual. De esta forma, un cariotipo normal femenino seria: 46, XX; y un cariotipo normal masculino: 46, XY. 
Un cariograma es la representación grafica de los cromosomas de una célula metafásica. 
Un idiograma es una representación de los cromosomas ordenados de acuerdo a su morfología y tamaño mostrando el patrón de bandas. Este ordenamiento y las más observadas (que requiere un tratamiento de extinción extra luego de la recesión del cariotipo) son específicos de una especie y tienen los mismos patrones entre todos los individuos sanos de la misma especie. 
Protocolo cariotipo
Para la realización de un cariotipo es necesario primero obtener una muestra de células viables. La fuente más común es mediante la extracción de sangre, de donde se obtienen los linfocitos que serán posteriormente cultivados. Otra fuente de células posibles son las células descamadas de la piel del feto obtenidas por amniocentesis o de las células provenientes de una punción de las vellosidades coriónicas. 
Una vez obtenidas las células, estas son cultivadas en un medio adecuado entre 2 o 3 días para amplificarlas. Posteriormente, se les agrega colchicina (sustancia que inhibe la formación de microtúbulos) llevando a que cuando las células en división lleguen a metafase (donde sus cromosomas alcanzan un alto grado de compactación) el ciclo celular se detenga ya que no se puede continuar con la anafase. De esta forma, el cultivo queda eventualmente sincronizado en metafase. 
Finalmente, las células son sometidas a una solución hipotónica para ser luego fijadas y goteadas en un portaobjetos. La solución hipotónica genera que las células se hinchen considerablemente, por lo que al dejar caer una gota de una solución suficientemente diluida sobre un vidrio, el impacto genera la ruptura de la célula con la consecuente liberación de los cromosomas. 
Este proceso puede completarse con una tinción que permite observar los cromosomas al microscopio. Esta tinción puede hacerse con colorantes, sondas fluorescentes o pre tratando con enzimas el preparado antes de agregar un colorante. 
Tincion con Giemsa. Bandeo G
Uno de los colorantes más utilizados en citogenética es el colorante de Giemsa. Con la tinción de este colorante los cromosomas pueden ser usados de un color violáceo. Esta coloración solo nos permite observar el número de cromosomas e identificar algunas formas y estructuras básicas. 
Para un mayor detalle se utiliza la tinción bandeo cromosómico. El más utilizado es el Bandeo G que utiliza Giemsa como colorante. En esta técnica luego de realizar el cariotipo y prueba de tinción con Giemsa, los cromosomas son tratados con prisina una enzima que degrada proteínas. Esto permite que luego de la tinción se observe un patrón de bandeado estable, donde las bandas oscuras se asocian a regiones del cromosoma ricas en A-T; mientras que las bandas claras se asocian a regiones ricas en C-G.
Bandeo cromosómico
De esta forma, una banda es una parte definida de un cromosoma que se tiñe claro u oscuro, según sea la técnica usada. Cada cromosoma tiene su patrón de banda definido, por lo tanto, el bandeo cromosómico contribuye a identificar los cromosomas individuales y las anomalías estructurales de los mismos. Cada banda, comprende varios genes y la disposición y distribución de dichas bandas puede utilizarse para definir la posición o el locus de un gen. Es asi, que los cromosomas están separados en regiones, bandas, sub-bandas y hasta sub-sub-bandas. Las regiones se numeran desde el centrómero hacia la periferia. Dentro de cada región, las bandas reciben el mismo tratamiento, siendo la banda 1 la más cercana al centrómero. Si se trata de un bandeado de alta definición, también dentro de las bandas, podemos ver sub-bandas y dentro de estas a sub-sub-bandas. De esta forma para decir que un locus es especifico se escribe primero el numero de cromosoma donde esta ese locus (por ejemplo, el gen de un regulador transmembrana cuya falla puede alcanzar la fibrosis quística se encuentra el cromosoma 7 en el brazo largo por lo que se coloca una letra Q luego del 7; luego se coloca la región, en este caso 3, seguida de la banda que es 1; a continuación se agrega un “;” y a este se pone la sub-banda en este caso 2 y si lo hubiera se pone luego la sub-sub-banda). 
De esta forma el locus de este gen se escribe: “7q31.2” y se lee: “cromosoma 7, brazo largo, región 3, banda 1, sub-banda 2” 
Alteraciones cromosómicas
1) Alteraciones numéricas: esta alterado el número total de cromosomas (diferente a 46)
	Del conjunto
	Poliploidía (aceptan todo el conjunto de cromosomas, inviables en animales)
	Triploidía
Tetraploidía
	
	Parentales
	Diandría (letal, todo el set cromosómico es paterno, MOLA)
Dignia (letal, todo el set cromosómico es materno)
	Parciales, autosómicas (aneuploidías autosómicas)
	Trisomías autosómicas (aceptan algunos de los cromosomas, en humanos)
	Trisomía 21 (síndrome de Down)
Trisomía 18 (síndrome de Edwars)
Trisomía 13 (síndrome de Patau)
	
	Monosomías
	
	
	Mosaicos aneuploides
	Ej: 47/46; +21
	Parciales, sexuales (aneuploidias sexuales)
	Trisomias sexuales
	XXY (síndrome de Klinefelter)
XXX (triple X o trisomía del X)
XYY (síndrome XYY)
	
	Monosomias sexuales (única viable)
	X0 (síndrome de Turner)
	
	Polisomias sexuales
	XXXY (variante de síndrome de Klinefelter)
XXXXY
XXXX (tetrasomia del X)
	
	Mosaicos aneuploides 
	XXY/XY; XXXY/XYX0/XX
Poliploidias: 69, XXX --- 92, XXXY
Trisomias: 47, XY, +21 --- 47, XXY
Monosomias: 45, X
Mosaicismos: 47/46, XX, +18. Son patologías donde se observa una mezcla en la población de células, donde un grupo de células posee un grupo de células normal de cromosomas; mientras que otras presentan alguna alteración cromosómica. Este tipo de alteraciones puede presentar una variedad de síntomas asociados a los tipos de alteraciones presentes. Por otro lado, su grado de gravedad esta asociado a la proporción de células normales vs aceptadas. 
La forma de reportar una alteración numérica es reportando un numero total de cromosomas seguido de una “,” y la combinación de cromosomas sexuales correspondientes; seguidos de una “,” y un signo “+” seguido del cromosoma extra. En el caso de las monosomias o polisomias sexuales se expresa el numero total de cromosomas seguido de una “,” y la combinación de cromosomas sexuales correspondiente. Por ejemplo: un masculino con una trisomía del 21 se reporta como: “47, XY, +21” y un síndrome de Turner se reporta como: “45, X” 
No disyunción meiótica
Las celulas que no contienen un numero de cromosomas multiplo de 23 se denominan aneuploides y presentan perdida o ganancia de cromosoma. La causa mas frecuente en la aneuploidia es la ausencia de disyunción, es decir, la incapacidad de los cromosomas para separarse normalmente durante la meiosis. La ausencia de disyunción puede producirse durante la meiosis I o la II. La gameta resultante carece de un cromosoma o posee 2 copias del mismo, produciendo un cigoto monosomico o trisomico respectivamente. 
2) Alteraciones estructurales
El numero de cromosomas no se ve alterado, pero se presentan cambios en las estructuras de los mismos. Además de la perdida o ganancia de los cromosomas completos o durante la formación de las gametas, se pueden perder o duplicar partes de cromosomas o se pueden alterar la disposición de regiones cromosómicas. 
Las cromosomopatías estructurales pueden ser no balanceadas (el reordenamiento origina una ganancia o perdida de material cromosomico) o balanceadas (sin perdida ni ganancia de material). A menudo, los reordenamientos estructurales balanceados no tienen consecuencias individuales para el individuo, aunque si pueden afectar a la descendencia. No obstante, las anomalías no balanceadas pueden producir grandes enfermedades tanto en el individuo portador como en su descendencia. 
Este tipo de cromosomopatías estructurales pueden producirse cuando los cromosomas homologos se alinean de un modo inapropiado durante la meiosis. Además, tanto en la meiosis como en la mitosis, se puede producir una rotura cromosómica cuyos mecanismos de reparación en ocasiones terminan alterando la secuencia original, quedando asi una anomalía estructural. 
La forma de reportar una alteración estructural en un cariotipo es expresando el numero de cromosomas totales, seguido de una “,” y el par sexual correspondiente, una nueva “,” y la letra del tipo de alteración que se observa según la tabla donde se aclara entre paréntesis los cromosomas involucrados, separado por un “;”. Finalmente, entre otro juego de paréntesis, se colocan los LOTIS?? correspondiente a los lugares afectados por dicha alteración. 
-Traslocaciones: Un masculino con una traslocacion reciproca entre el cromosoma 1 y 6 se escribiría como: “46, XY, t (1;6) (q32; p23)”. La banda del brazo largo, región 3, banda 2, del cromosoma 1 se intercambio con la banda del brazo corto, región 2, banda 3 del cromosoma 6. 
46, XX der (q14; q21)
-Deleciones: 46, XX, del (7q11.23)
-Inversiones: 46, XX, inv (4) (p14-q22)
-Duplicaciones
-Isocromosomas
-Cromosomas en anillo
Situaciones en la que es conveniente el uso de un cariotipo:
-El cariotipo no requiere tener información previa de lo que se busca. 
-Solo se detectan alteraciones grandes, de mas de 5 millones de pares de bases 
-No requiere un equipamiento muy complejo y puede hacerse en cualquier lado 
-Suelen involucrar un importante numero de genes por lo que se asocian a síntomas variados que no parecen poseer una correlacion embriológica o genética entre si. 
FISH (hibridación in situ por fluorescencia)
Es una técnica empleada en la que un fragmento marcado de ADN especifico de un cromosoma o sonda se expone a cromosomas desnaturalizados en metafase, profase o interfase. Se puede realizar luego de la realización de un cariotipo donde en lugar de proceder con una tinción con un colorante, los cromosomas son desnaturalizados por temperatura para exponer las hebras de la doble hélice y asi la sonda experimenta entonces un apareamiento de bases complementarias o hibridación con la secuencia de ADN que concuerda con su localización en un cromosoma especifico. 
Dado que la sonda esta marcada con un fluorocromo, la posición en la que se unirá con los cromosomas del paciente puede utilizarse con un microscopio de fluorescencia
Una aplicación frecuente de la hibridación in situ es la de determinar la existencia de una delecion en una región cromosómica de un paciente. En un individuo normal, una sonda hibridará en dos lugares, reflejando la presencia de 2 cromosomas homologos en el nucleo. Si una sonda de un fragmento cromosómico determinado solo hibrida con uno de los cromosomas del paciente, probablemente tenga una delecion en la copia cromosómica con la que no se ha hibridado. 
En la imagen se observa como el centrómero de los cromosomas 17 marcado en rojo, muestra la presencia de los pares homologos. Sin embargo, la sonda verde que hibrida con una región del brazo largo del cromosoma 17, solo se une a 1 de los cromosomas indicando que el que no tiene dicha porción ha sufrido una delecion(izq) en esa región. De similar manera, si se marcan dos pares cromosómicos con 2 colores distintos es posible identificar una translocación reciproca(der) por la presencia de regiones de color verde en el cromosoma rojo y regiones rojas en el cromosoma verde. 
 
FISH: Pintado cromosómico
La técnica de FISH puede ser ampliada con la utilización de multiples sondas, cada una marcada con un color diferente, de forma que se puede detectar simultáneamente en una misma celula varias de las anomalías numéricas mas frecuentes. Además, en las nuevas técnicas como el cariotipo espectral, se utilizan combinaciones variables de 5 sondas fluorescentes distintas junto con cámaras especiales y un programa informatico de procesamiento de imágenes, de manera que cada cromosoma es coloreado de un único color para poder identificarlo rápidamente. Estas imágenes son útiles para la identificación de reordenamientos cromosómicos. 
Situaciones en las que se puede usar FISH:
-Se requiere conocer la secuencia que se esta buscando
-Detecta alteraciones de mas de 100 mil pares de bases
-Requiere equipamiento mas complejo y los reactivos son mas caros
-Suelen utilizarse para buscar un gen en particular por lo que se utiliza normalmente para detectar enfermedades del tipo monogeneticas
Array CGH o hibridación genómica comparada
Las perdidas o duplicaciones de regiones cromosómicas o especificas pueden detectarse mediante una técnica conocida como hibridación genómica comparada o Array CGH. El adn que se va a analizar se marca con una sustancia que muestra un color verde en el microscopio de fluorescencia. El ADN de las células controles normales se marca con un 2do color (rojo). Ambos ADN se dividen con una micromatriz que posee sondas representando todo el contenido genómico de una celula normal. Si cualquier región cromosómica esta duplicada en la celula en estudio, esta región del cromosoma en el Array hibridará con cantidades excesivas del ADN marcado en verde, y mostrara color verde al microscopio. 
Por el contrario, si una región esta delecionada en la celula en estudio, la correspondiente región del cromosoma en metafase hibridará con un exceso de un ADN marcado en rojo y la región mostrara color rojo al microscopio. 
Esta técnica es útil para detectar deleciones y duplicaciones de material cromosómico en las células en estudio,en las que la detección de estas alteraciones puede ser útil para el diagnostico. 
Situaciones en las que se puede usar un Array CGH
-No se requiere conocer la secuencia que se esta buscando
-Puede detectar alteraciones de alrededor de 10 mil pares de bases
-Requiere equipamiento mas complejo y los reactivos son mas caros
-Es un estudio que comprende la extensión de todo el genoma y permite detectar anomalías en relaciona a un exceso o reducción del material genético. 
Simbologia árbol genealogico
Usa las relaciones entre los miembros de una familia y muestran quienes están afectados o no con enfermedades genéticas. Una flecha señala el caso índice o propósito que dio sentido al estudio. 
Herencia de polodactilia postaxial. Ejemplo de herencia autosómica dominante
Por convención, el árbol se comienza a construir con un grupo parental, donde se coloca al individuo masculino o cuadrado hacia la izquierda y al femenino o circulo hacia la derecha. A partir de ahí el resto de los individuos se colocan en orden de nacimiento. Se marca con una “A” al gen afectado dominante y con una “a” al alelo normal posesivo. 
Este árbol representa las cosas importantes de la herencia autosómica dominante. En primer lugar, los dos sexos poseen la misma probabilidad de tener la enfermedad y transmitirla a su descendencia. En segundo lugar, no existe un salto generacional respondiendo a un patrón de transmicion vertical. En tercer lugar, hay transmicion de padre a hijo, lo que determina que se trata de una enfermedad autosómica, excluyendo la posibilidad de una herencia ligada al X. 
TP 1 RESUELTO
1)
a) SOX9 es un factor de transcripción involucrado en la diferenciación del cartílago y de los huesos de osificación endocondral y de la diferenciación de las crestas gonadales en testículos. La expresión insuficiente de SOX9 en cartílago/hueso provoca una displasia esquelética conocida como “Displasia campomélica”. La expresión insuficiente en la cresta gonadal 46,XY impide la diferenciación testicular, provocando una “Disgenesia gonadal”; como consecuencia de ello, el feto no se masculiniza adecuadamente (desarrolla genitales femeninos o ambiguos, por deficiencia de hormonas testiculares). 
¿Cuál es la ubicación cromosómica del gen SOX9 humano? Búsquela en OMIM y describa su ubicación (cromosoma, brazo, región, banda, etc.).
Cytogenetic location: 17q24.3 (se lee 17 q 2 – 4 – punto 3, no veinticuatro) 
Quiere decir: cromosoma 17, brazo largo, región 2, banda 4, sub-banda 3 
b) Usted atiende a un niño con genitales ambiguos y displasia esquelética.
 ¿Qué estudio genético le haría en primer lugar para investigar el diagnóstico? ¿Qué hallazgos podrían apoyar el diagnóstico?
Si se lee la descripción al hacer click en 608160. SRY-BOX 9; SOX9, se ve que SOX9 es un gen involucrado en el desarrollo sexual y el esquelético (esta no es información que deba saber el alumno, simplemente se usa en este ejercicio a modo ilustrativo). 
Recordar del TP de Genital que el desarrollo del testículo es indispensable para la producción de andrógenos y AMH, hormonas que virilizan al feto. Si el desarrollo testicular está afectado (disgenesia gonadal), la producción hormonal es insuficiente y los genitales no se virilizan correctamentegenitales ambiguos. 
Por otra parte, SOX9 regula la expresión del colágeno tipo 2 (gen COL2A1), importante en el desarrollo de los huesos de osificación endocondral (huesos largos). Si falla la producción de colágeno 2, hay una anomalía (displasia esquelética). Esta no es información que deba conocer el alumno. Se le brinda aquí para usarla de modo ilustrativo para resolver el problema. 
Entonces si uno tiene un paciente con genitales ambiguos y displasia esquelética, puede pensar en una mutación del gen SOX9. Se puede estudiar mediante secuenciación por la técnica de Sanger. Si hay alguna variante génica (mutación, deleción, etc.) del gen SOX9, ello podría explicar el fenotipo. 
Comentarios extra: la transmisión es autosómica (cromosoma 17) dominante. Se puede preguntar a los alumnos qué pasa si se encuentra un alelo mutado y uno normal. La respuesta es que eso puede justificar el cuadro del paciente. Otra pregunta: los padres son normales, puede ser? Sí, por ejemplo si la mutación es “de novo”, o sea que ninguno de los padres la posee (si no, deberían estar afectados) y se generó durante la gametogénesis de alguno de los padres. 
c) El cariotipo con bandeo arroja un resultado “normal”
 ¿Qué otros estudios citogenéticos podrían ser de utilidad? Explique por qué.
Si hay una deleción < 5 Mb, el cariotipo convencional no lo detecta. Podría usarse .la técnica de FISH (con una sonda para la región donde está SOX9), que detecta deleciones > 0,1 Mb (o sea 100 kb), o bien con la técnica de Microarreglos CGH (Hibridación Genómica Comparativa), que detecta deleciones de 10 kb. 
d) Ninguno de los estudios citogenéticos identifica anomalías. Usted sospecha que hay una mutación de pocas bases en SOX9 (que no se ven en los estudios realizados). 
 El resultado del estudio genético informa: “Se secuenciaron los 5 exones, no hallándose mutaciones”. ¿Usted descarta que se trate de una anomalía de SOX9? Justifique la respuesta. 
No. Puede haber por ejemplo mutaciones en los intrones, que afecten el splicing, o bien en regiones reguladoras (promotor) que afecten la expresión. 
e) Usted recibe otro paciente, con disgenesia gonadal (46,XY con genitales ambiguos), pero sin displasia esquelética. El paciente ya había sido estudiado, y trae un informe de estudios de biología celular y molecular que indican una “deficiencia gonadal de SOX9”.
 ¿Dónde podría estar la mutación? Justifique la respuesta.
La expresión de SOX9 en el testículo y en el cartílago es regulada por factores transcripcionales diferentes, que se unen cada uno de ellos a regiones específicas del promotor de SOX9. Si existe una mutación en el sitio de unión para alguno de los factores específicos testiculares que regulan SOX9, habrá una deficiencia en la expresión testicular de SOX9 pero no en el cartílago. Por ejemplo existe una región en el promotor de SOX9 que se denomina TESCO (Testis-Specific Core), en la que se unen factores específicos del testículo (no se unen a ella factores del cartílago). Esta no es información que deba conocer el alumno. Se le brinda aquí para usarla de modo ilustrativo para resolver el problema. 
f) El estudio de la región reguladora de SOX9 denominada TESCO (Testis-Specific Core) no encuentra anomalías. 
 ¿Usted descarta que se trate de una “deficiencia gonadal de SOX9”? Justifique la respuesta. 
No, puede haber otras regiones regulatorias, además de la región TESCO, que sean específicas del testículo (aunque no se conozcan hasta hoy). El alumno no tiene que conocer otras secuencias reguladoras, pero sí debe razonar que pueden existir otras secuencias reguladoras. 
2) 
a) Dos estudios citogenéticos, uno en un paciente con Sme. de Prader-Willi (hipotonía muscular, obesidad, retardo mental, estatura baja, hipogonadismo, manos pequeñas) y otro en un paciente con Sme. de Angelman (retardo mental, anomalías en los movimientos y limitaciones severas en el lenguaje) informan el mismo resultado 46,XY,del(15)(q11.1q13). 
Describa la ubicación del locus involucrado (cromosoma, brazo, región, banda, etc.). 
Explique cómo es posible que habiendo un cromosoma con la misma deleción y uno normal, los pacientes tengan enfermedades genéticas distintas. Explique en qué momento se produjo la anomalía genética.
Locus: cromosoma 15, brazo largo, deleción que involucra desde la región 1, banda 1, subbanda 1 hasta la región 1, banda 3. 
Se debe a que si el cromosoma con la deleción proviene del padre ocurre el Sme Prader Willi; en cambio, si el cromosoma con la deleción proviene de la madre se da el Sme Angelman. Esta no es información que deba conocer el alumno. Se le brinda aquí para usarla de modo ilustrativo para resolverel problema. 
Esto se debe a que, durante la gametogénesis femenina, en la región en cuestión hay genes que se silencian por imprinting. En el hijo, sólo se expresan los alelos paternos de dichos genes. Pero si en el cromosoma paterno hay una deleción, los genes en cuestión no se expresan, provocando una deficiencia que lleva al Sme PW (ver figura). El alumno no tiene que saber cuál alelo se imprinta en el padre y en la madre (se le brinda la información para usarla de modo ilustrativo para resolver el problema) pero sí debe razonar que puede haber imprinting diferencial en la espermatogénesis y en la ovogénesis. 
De modo similar, hay genes que se silencian por imprinting en la gametogénesis masculina. En el hijo, sólo se expresan los alelos maternos de dichos genes. Pero si en el cromosoma materno hay una deleción, los genes en cuestión no se expresan, provocando una deficiencia que lleva al Sme Angelman. 
La deleción debe haber ocurrido durante la gametogénesis paterna/materna. 
b) Un paciente con Sme. de Prader-Willi y otro en un paciente con Sme. de Angelman no tienen deleciones en el cromosoma 15.
 Explique cómo es posible que habiendo dos cromosomas 15 normales en cada uno de los pacientes, los mismos tengan las mismas enfermedades genéticas que los pacientes anteriores. Explique en qué momento se produjo la anomalía genética. 
Puede deberse a que el paciente con Sme PW tiene una disomía uniparental materna (o sea que los 2 cromosomas 15 que tiene provienen de la madre, por lo que tiene ambos alelos de los genes de la región SPW imprintados, que no se expresan). O bien en el paciente con Sme Angelman, que tiene una disomía uniparental paterna (o sea 2 cromosomas 15 provenientes del padre, con los alelos de la región SA imprintados). El alumno no tiene que saber cuál alelo se imprinta en el padre y en la madre (se le brinda la información para usarla de modo ilustrativo para resolver el problema) pero sí debe razonar que puede haber disomía uniparental como mecanismo subyacente a la falta de expresión del alelo paterno o del materno. 
3) A una mujer primigesta de 37 años, se le practica una punción de vellosidades coriónicas para estudio del cariotipo; el resultado se muestra en la figura A.
A							B
 
a) El informe dice: 46,XY,t(3;21) 
  Interprete el informe del cariotipo A. ¿El cariotipo corresponde a la madre o al feto? Explique por qué. 
  Explique en qué momento se produjo la anomalía cromosómica. 
  ¿El recién nacido será normal? Fundamente su respuesta. 
  ¿Qué riesgos de enfermedad genética tienen los nietos de la mujer? Explique por qué. 
  ¿Un microarray CGH detectaría la anomalía? Fundamente su respuesta. 
Cariotipo A: es un cariotipo XY, con una traslocación de parte del cromosoma 3 en el 21. Es del feto, no puede ser de la madre, quien debe ser 46,XX. 
La traslocación debe haber tenido lugar durante la gametogénesis de alguno de los progenitores. 
El RN puede ser normal ya que la traslocación es balanceada (no se pierde ni se gana material genético), siempre y cuando el punto de quiebre esté en regiones intergénicas. Pero puede ser anormal si los puntos de quiebre de los cromosomas se dan en el medio o en la región promotora de algún gen. 
Los nietos pueden tener una trisomía 3 parcial (si el paciente les transmite en sus espermatozoides el 3 normal y el 21 con parte del 3 traslocado) o bien una monosomía 3 parcial (si el paciente les transmite en sus espermatozoides el 3 que perdió material y el 21 normal). 
Un microarray CGH no detecta las traslocaciones balanceadas, ya que lo que detecta son cambios en el n° de copias de una región del ADN. En las traslocaciones balanceadas (por ejemplo del 3 en el 21), hay el mismo n° de copias de la región del cromosoma 3 traslocada que en un individuo normal. Lo que cambia es la posición de esa región del ADN, pero eso no es detectado por el array CGH. 
b) Si el cariotipo hubiera sido el B, 
  ¿Qué diría el informe? 
  Identifique las posibles causas de esta anormalidad. 
  ¿Qué riesgo de transmisión a la descendencia hay? 
  ¿Un microarray CGH detectaría la anomalía? Fundamente su respuesta. 
Cariotipo B: es un cariotipo 47,XX,+21. Significa que tiene una trisomía del 21. 
Causas posibles: falla de disyunción del 21 durante la meiosis I o meiosis II. 
Las trisomías provocan esterilidad en el varón, pero no en la mujer. 
Un microarray CGH detecta las trisomías o monosomías completas, al detectar cambios en el n° de copias de una región del ADN: habrá más copias del ADN del cromosoma 21.
4) (Ejercicio de razonamiento basado en la comprensión de las técnicas de laboratorio genético y en los procesos de segregación de cromosomas o genes).
a) Los pacientes con Síndrome de Williams-Beuren (Estenosis aórtica supravalvular, retardo mental, anomalías faciales) presentan habitualmente una deleción en el locus 7q11.23.
 Describa la ubicación del locus involucrado (cromosoma, brazo, región, banda, etc.). 
Cromosoma 7, brazo largo, región 1, banda 1, subbanda 2, sub-subbanda 3. 
b) Con fines diagnósticos, se estudia en un paciente el locus 7q11.23 por hibridación in situ por fluorescencia (FISH) empleando una sonda específica verde (representada por un triángulo). Además, para identificar la región pericentromérica del cromosoma 7 se emplea una sonda control roja (rectángulo). 
 Interprete el resultado del estudio de FISH. 
Hay 2 cromosomas 7, detectados por la sonda pericentromérica roja (representada esquemáticamente por los rectángulos). Hay una deleción de 7q11.23 en uno de ellos: falta la señal verde (esquemáticamente representadas por triángulos). Obviamente en el microscopio se ven como puntos coloreados, aquí esquemáticamente pusimos rectángulos y triángulos por no poder usar colores en las fotocopias. 
5) (Ejercicio de razonamiento basado en la comprensión de las técnicas de laboratorio genético y en los procesos de segregación de cromosomas o genes) 
Se encontró en una familia una niña con síndrome de Turner (45,X). La niña presentaba además ceguera para el color rojo (carácter ligado al cromosoma X), al igual que los individuos marcados con símbolos sombreados. 
 ¿Cuál es el cromosoma X que se encuentra en la niña con síndrome de Turner, el materno o el paterno? Justifique su respuesta. 
El cromosoma X de la niña es el materno, al igual que el de su hermano y de sus 2 tíos maternos. Los varones tienen un solo X, al portar la mutación tienen imposibilidad de detectar el color rojo. La niña 45,X también tiene un solo X, con la mutación. La madre tiene 2 cromosomas X, uno de ellos es normal por lo cual detecta el rojo. No puede venir del padre por dos razones: si tuviera el X mutado sería enfermo. Además no puede transmitirle un X a su hijo varón, solo puede transmitirle el Y. 
6)Una niña recién nacida presentó múltiples anomalías congénitas que incluyen labio leporino y microcefalia. Se realizó un análisis cromosómico cuyo resultado se encuentra representado en la figura. 
  ¿Qué puede decir respecto de los cromosomas 1 y 5 maternos y paternos? ¿Cuál es la causa del cuadro que presenta la niña? 
  Si le realizara un microarray CGH a la madre, al padre y a la niña, ¿qué resultados esperaría encontrar en cada uno de ellos? Fundamente su respuesta. 
Los cromosomas del padre son normales, los de la madre tiene una translocación balanceada (un derivado del 1, que tiene una pequeña fracción del 5 y un derivado del 5 que tiene una pequeña fracción del 1). 
La niña heredó dos cromosomas 1 normales, pero heredó un cromosoma 5 normal y un 5 materno con una deficiencia de una fracción del 5 y un exceso de una fracción del 1 monosomía parcial del 5 y trisomía parcial del 1. Una de ellas o ambas pueden ser responsables del cuadro. 
CGH: normal en padre y madre, porque tiene traslocación balanceada (CGH detecta cambios en n° de copias). La niña va a tener resultado anormal: excesode n° de copias del ADN del extremo telomérico del cromosoma 1 y un defecto del n° de copias del ADN del telómero del cromosoma 5. 
7) Una paciente consulta por presentar manchas color café con leche en la piel, anomalías en varios huesos y desarrollo precoz de caracteres sexuales secundarios. El diagnóstico probable es Sme. McCune-Albright, en el que habitualmente se encuentra una mutación en el gen GNAS1. Se toma una muestra de sangre, se prepara ADN y se estudia el gen GNAS1. El informe indica que no se encontraron mutaciones. 
  Explique por qué no se encontró la mutación en la muestra de ADN obtenida de la sangre. 
  Explique en qué momento se generó la anomalía.
Se trata de mutaciones somáticas (post-cigóticas), que ocurren en el feto luego de que el cigoto normal ya se dividió varias veces. Si la célula en la que se produjo la mutación no da origen a tejido hemopoyético, la mutación no se hallará en ADN obtenido de sangre.
SG 1: EL GENOMA HUMANO
El genoma es el contenido total de ADN en la celula. Incluye la porción codificante y regiones intergenicas y ADN repetidos. En una celula animal se encuentran 2 genomas: el nuclear y mitocondrial. 
La secuencia de ADN definida en el proyecto del genoma humano representa el mosaico de la secuencia de un grupo pequeño de donantes anónimos, o sea que no es la secuencia de un único individuo. El genoma humano esta formado por alrededor de 3000 millones de pares de bases, teniendo en cuenta el set haploide de cromosomas. 
En el genoma humano habría entre 21000 y 25000 genes distintos. Cada uno de estos genes contiene codificada la información necesaria para la síntesis de 1 o varias proteínas o para ARN funcionales. El ADN que codifica para proteínas y para ARN funcionales clásicos (ARNt y ARNr) constituye solo entre el 1,5% y 2% de los 3000 millones de pares de bases del genoma. La mayor parte del genoma humano no tiene función codificante, pero puede tener funciones reguladoras o estructurales. 
Polimorfismos de nucleótido simple (SNPs)
El ADN de dos individuos es altamente homogéneo con una similitud de secuencia del 99,9%. Como el genoma tiene 3000 millones de pares de bases, aun esta pequeña diferencia del 0,1% representa una cantidad sustancial de variantes de secuencia entre los individuos. Una de las fuentes de estas variaciones son los cambios de un solo nucleótido en la misma posición entre distintos individuos. Estos cambios, se denominan polimorfismos de mononucleotidos o nucleótidos simples. Los SNPs no están distribuidos uniformemente a lo largo del genoma, pero en promedio aparece 1 cada 1000 bases de secuencia. Los SNPs son mas frecuentes (en orden de mayor cantidad): en los intrones, en el ADN intergenico y en los exones (en regiones codificantes). 
Además de estas diferencias entre individuos generadas por los SNPs, hay diferencias entre humanos debida a variaciones del numero de copias de un segmento dado de ADN dentro del mismo genoma. Estas variaciones del numero de copias puede elevar las diferencias entre individuos a niveles de entre el 5% y 6%. 
-Variantes de un solo par de nucleótidos en una secuencia de ADN entre una parte de la población y otra. 
-La variante debe darse en al menos 1% de los individuos para considerarse como SNP
-La diferencia de secuencia en el genoma entre dos individuos es de 0,1%. 
-Eligiendo dos personas al azar: diferencia entre genomas: 3 millones de diferencias
-Se estudian para determinar la relacion entre las secuencias y enfermedades como la diabetes. 
Clasificacion de las secuencias de ADN
1) Según su grado de repetición
Teniendo en cuenta el numero de veces en que se encuentran en el genoma las secuencias de ADN pueden ser únicas si hay una sola copia; o repetidas. 
-De alta repetición (ADN satélites o el centromero): Cuando el numero de repeticiones de una secuencia dada pasa del millón. 
-De moderada repetición (retroposones, transposones, ADN telomerico, familias génicas, microsatelites, minisatelites): Si las repeticiones van desde unas pocas copias hasta decenas de miles de copias. 
-De secuencia única (genes, ADN intergenico no repetido). 
2) Según su función
La mayor parte del genoma nuclear humano, al igual que el de otros organismos eucariontes, esta representado por secuencias no codificantes que en algunos casos tienen una función estructural como es el caso del ADN de los telomeros o centrómeros. El ADN codificante para proteínas o para ARN funcionales constituye una parte pequeña del genoma. 
-Codificantes: 
De elementos propios (ARNs y proteinas)
De elementos accesorios (retroposones, transposones)
-No codificantes:
De función estructural (ADN satélites y telomerico)
De función regulatoria (Promotores, reguladores)
De función desconocida (ADN intergenico)
1) Tipos de ADN repetitivo
En el ADN repetitivo, ya sea de alta o moderada repetición, las secuencias que se repiten pueden encontrarse una a continuación de la otra (repetidos entandem) o sino pueden estar separadas por otra secuencia de ADN y en ese caso se denominan repeticiones disperas. Dentro del ADN altamente repetido encontramos el ADN de las regiones centromericas o ADN satélite alfa. 
El ADN satélite alfa que se encuentra en los centrómeros representa el 5% del genoma humano. Esta formado por monómeros de 171 pares de bases organizados en tándem (flechas de colores). Las secuencias monomericas no son exactamente idénticas, pueden diferir hasta el un 40%. Un numero determinado de estos monómeros da lugar a una repetición de orden superior (barras coloreadas con punta de flecha negra) y que abarcan desde varios cientos de kilo-bases (kb) hasta varias mega-bases (mb). El orden de los monómeros dentro de estas regiones varia entre los distintos cromosomas humanos, por lo que la secuencia general de los centrómeros es especifica para cada par de cromosomas. A medida que nos alejamos del nucleo o centro del centrómero, las repeticiones divergen cada vez mas. 
La alteración de estas secuencias causa la segregación irregular de los cromosomas en algunas enfermedades como el cáncer. 
Las secuencias moderadamente repetidas son un conjunto muy variados de secuencias, llamadas asi porque pueden encontrarse en unas pocas copias o en hasta decenas de miles de copias. En su mayoría son secuencias no codificantes, pero dentro de este grupo se encuentran secuencias repetidas codificantes como los genes del ARNr o codificantes de proteínas, los cuales forman las denominadas familias génicas. 
ADN telomerico (ADN moderadamente repetido en tandem)
Las unidades de repetición pueden encontrarse una a continuación de otra (tandem). Un ejemplo de esto es el ADN de los telomeros, que en el ser humano esta formado por el exanucleotido TTAGGG y su complementario. Esta repetición forma conjuntos que tienen en promedio unos 10 kb. El ADN de los telomeros humanos forma un lazo que forma la mayor parte de esas 10kb y que se denomina Lazo T (por telomerico). Este lazo protege el extremo del cromosoma de la acción de nucleasas. El ADN telomerico tiene una cadena mas larga que la otra ya que la cadena rica en guanina que termina en el extremo 3` es mas larga. El extremo de esta cadena se inserta en la doble hélice en el sitio que corresponde al inicio del brazo T y desplaza una de las cadenas para emparejarse con su complementaria, lo cual forma un bucle mas pequeño denominado Lazo D (por desplazamiento). 
Ademas del ADN, los telomeros tienen muchas proteínas especificas entre las que se destacan los complejos proteicos que forman los factores 1 y 2 ligadores de repeticiones telomericas y que se abrevian TRF 1 y TRF 2. Estas proteínas son imprescindibles para que se forme el Lazo T y por lo tanto, para la funcionalidad del telomero. 
En el ser humano, la longitud del ADN telomerico se mantiene por la actividad de la enzima telomerasa en las celuilas de la línea germinal. A diferencia de las células germinales, la mayoría de las células somaticas humanas no tienen telomerasa activa o tienen niveles muy bajos,por lo tanto, experimentan un acortamiento del ADN de los telomeros con cada división celular. 
Cuando los telomeros alcanzan un punto critico de acortamiento, las células muestran señales de envejecimiento o senescencia. Este punto critico se conoce como Limite de Heyflick y es un punto de control de la división celular. Si este control falla las células siguen perdiendo nucleótidos en sus telomeros, lo que deriva en la muerte celular. 
En algunos casos, hay células que adquieren una capacidad de proliferación ilimitada y tienen una longitud estable de los telomeros como es el caso de las células tumorales. 
La presencia de telomeros mas cortos de lo normal esta asociada a diferentes trastornos englobados con el nombre de síndromes de telomeros cortos. En algunas de estas enfermedades, la longitud de los telomeros tiene valor pronostico, por lo que se han desarrollado técnicas que permiten estimar el numero de repeticiones telomericas, a partir de muestras de ADN de distintos tipos celulares. 
Mini satélites y microsatelites (ADN moderadamente repetido en tandem)
Otro ejemplo de secuencias repetidas en tándem es los mini y microsatelites, que difieren en la extensión de la secuencia que se repiten. Ambos son muy polimórficos porque el numero de las repeticiones es altamente variable entre individuos, y estas variaciones se heredan de manera mendeliana. 
Los minisatelites tienen unidades de repetición de 50 a 100 pares de bases dispuestas en tándem. Se identifican también como VNTRs (repeticiones en tándem de numero variable). Pueden encontrarse en regiones no codificantes, cerca de los telomeros, o incluso dentro de los genes. Algunos minisatelites se denominan hipervariables porque el numero de repeticiones es diferente en cada individuo. Estos minisatelites se usan como marcadores moleculares en estudios que se conocen como perfil o huella digital genética. 
El termino microsatelite se usa para describir repeticiones consecutivas cortas, de 2 a 5 pares de bases. Los microsatelites se denominan también STRs. Al igual que los minisatelites, son muy polimórficos debido a la variabilidad del numero de repeticiones entre individuos. Los STRs son útiles para realizar pruebas de filiación destinada a identificar a uno de los progenitores; o para establecer relaciones familiares y de paternidad. También, en casos de delitos como violaciones, secuestros, etc. 
Secuencias repetidas dispersas
Están representadas por secuencias que se originaron a partir de un ARN por la acción de retrovirus. 
La mayoría de las secuencias repetidas dispersas del genoma humano esta formada por las denominadas secuencias repetidas dispersas cortas (SINEs) y las secuencias repetidas disperas largas (LINEs). 
Se originaron por acción de la retrotranscriptasa de algunos virus a partir de ARN transcriptos de la ARNpol II o de la ARNpol III. 
Su movilidad actual en el genoma es escasa o nula
SINEs
-Elementos dispersos cortos
-Los mas abundantes: familia de secuencias Alu
-Secuencia de 300pb
-500 mil copias (10% del genoma)
-Localizadas predominantemente en las bandas R (G+C)
-Parece originada a partir del gen que codifica para el ARN de la PRS, copiado por una transcriptasa inversa e insertado en el ADN. 
-Tienen movilidad aunque en bajo porcentaje, y esto puede causar que se inserten dentro de un gen causando mutaciones 
LINEs
-Elementos dispersos largos
-Los mas abundantes: secuencias L1
-Secuencia de 6,4kb
-10 mil copias
-Localizadas en las bandas G (T+A)
-Parece originada a partir de ARNm (o sea de transcriptos de la ARNpol II), copiado por una transcriptasa inversa e insertado en el ADN (tiene cola poli A y algunas tienen marco de lectura abierta)
-Tienen movilidad aunque en bajo porcentaje, y esto puede causar que se inserten dentro de un gen causando mutaciones 
Las secuencias que codifican para proteínas o para ARN funcionales están representadas por los genes. En su mayoría, los genes se encuentran en copia única en el genoma humano haploide, pero existen algunos que se agrupan en familias génicas originadas durante la evolución por duplicación de un único gen. 
Familias génicas y pseudogenes
Un caso de duplicación génica es el de la familia de las globinas, que codifican para las subunidades de los distintos tipos de hemoglobina humana. La hemoglobina principal del adulto esta formada por 4 polipeptidos de 2 tipos: alfa y beta. Los genes que codifican para estos péptidos se encuentran en los cromosomas 11 y 16 y están acompañados por copias incompletas y no funcionales que se denominan pseudogenes. Estos se volvieron mas funcionales por diferentes tipos de mutaciones, o sea cambios en la secuencia del ADN durante la evolución de un grupo de organismos. Estos cambios pueden ocurrir sin que existan consecuencias perjudiciales para el individuo porque existen otras copias del mismo gen que forman parte de esta familia génicas. Esas copias siguen siendo completamente funcionales y garantizan la síntesis de la proteína normal. 
TP 2 GENETICA
Las alteraciones a nivel del ADN son génicas. Sin embargo, las alteraciones a nivel del ARN mensajero y a nivel de las proteínas, son alteraciones de la expresión del gen en estudio. 
Las alteraciones o mutaciones pueden acarrear distintas consecuencias. Estas consecuencias a nivel del exón, cuando hay cambios mutacionales pueden generar cambios de sentido, pueden ser sin sentido o incluso cambios del marco de lectura. También las mutaciones pueden ocurrir en sitios promotores, en sitios de empalme o splicing o en secuencias. 
Las mutaciones de cambio de sentido, tiene cambios que se dan en general en la posición 1 o 2 del codón. Una simple sustitución de una guanina por una adenina, genera el cambio de un aminoácido. Este cambio es mas frecuente que ocurra cuando están en la posición 1 o 2 del codón y no en la 3, ya que nuestro código genético se denomina degenerado ya que mas de un codón o triplete codifica para un mismo aminoácido y esas diferencias ocurren en la tercera posición de ese triplete. 
Las mutaciones sin sentido o finalizadora son aquellas que genera un codón de terminación, por ejemplo, si se sustituye una C por G, la sustitución acarrea a la formación de un codón UAA que es un codón de stop, poniéndole fin a la traducción de este polipéptido y por ende la posibilidad de formar la proteína normal. 
Un cambio en el marco de lectura se debe a una inserción o delecion. Por ejemplo, la inserción de una C, además de la propia A que tiene. Al insertarse a un nuevo nucleótido, cuando el código genético comienza a leer cada 3 bases, hay un corrimiento en el marco de lectura y por ende, desde ese lugar hay un cambio en el aminoácido correspondiente y de ahí en adelante cambia totalmente la estructura primaria de la proteína en cuestión. 
Consecuencias de las mutaciones
-Ganancia de función: aquellas mutaciones que generan un incremento en la función del gen en estudio. Una mutacion cambia la función para mayor actividad de la que tenia ese gen anteriormente a esa mutacicon. 
-Perdida de función: es lo contrario a ganancia de función. Son enfermedades de tipo recesivas donde una persona heterocigota no se ve alterada la función del gen en cuestión porque el 50% restante del alelo normal es suficiente para la función de dicho gen. 
-Haploinsuficiencia: la mutacion aunque ocurra en un único alelo, son enfermedades de tipo dominantes ya que el 50% restante del alelo que esta normal no alcanza en la cantidad de función o transcripto o traducción de mismo para cubrir la función de dicho gen
-Negativas dominantes: son aquellas que la simple mutacion en uno de los alelos genera un producto que anula totalmente la función de ese gen. 
HERRAMIENTAS
1) Enzimas de restricción: Son enzimas que están en organismos procariontes. Están catalogadas las secuencias en donde cortan y las formas en que cortan dichas enzimas. 
2) Hibridacion
3) Electroforesis: generar en un campo eléctrico una migración de una muestra determinada (ADN, ARN o proteinas) que va a migrardesde un polo negativo hacia el polo positivo. Se distinguen a estas muestras de acuerdo a su tamaño. 
Tecnicas:
-Las que nos sirven para observar alteraciones a nivel del ADN
-Las que nos sirven para observar alteraciones a nivel del ARN, es decir, la expresión de ese gen
-Las que nos sirven para observar alteraciones a nivel de las proteínas que también habla sobre la expresión del gen. 
Tecnica Southern Blot
Sirve para identificar alteraciones a nivel del ADN que ocurrieran en un sitio de corte de una enzima de restricción. Si esa alteración no se da en un sitio de corte, no va a evidenciar distintos patrones alelicos de cortes cuando se utilice una enzima de restricción, por ende el Southern no serviría. Entonces, el Southern no sirve para alteraciones que justamente modifican sitios de corte de una enzima de restriccion
Tecnica Northern Blot
Sirve para identificar alteraciones a nivel del ARN, en vez del ADN (southern)
Pasos:
1) Sobre el ADN o ARN, se corta con enzimas de restricción y se generaba la electroforesis de esos segmentos de ADN o ARN en ese campo eléctrico
2) Se transfiere lo que se encuentra en el gel a un papel. Colocaba ese gel en un papel especifico y encima unas toallas de papel que generaban un incremento del liquido del vaso en el cual están sumergidos por capilaridad. De manera tal de obtener una imagen totalmente igual de aquello que se encontraba en el gel que se transfirió totalmente al papel.
Estos segmentos en estudio son detectados por sondas que estaban marcadas. Estas sondas marcadas se hibridaban a la cantidad de segmentos que encontraron por complementariedad de bases en cada una de las muestras, sin importar en cuantos segmentos estuviera cortado ese segmento en cuestión. Luego se ponía o revelaba con una placa radiográfica y se observaba la presencia o lugar de sitio de unión por complementariedad de bases de la sonda marcada. Como siempre se corria un patrón de peso molecular, podía detectar a que altura de peso molecular estaba cada uno de esos fragmentos. Una sonda es un segmento de oligonucleótidos marcados. La unión de esta sonda marcada se debe a la complementariedad de bases con la secuencia en estudio. 
Tecnica RFLP
Esta abocada a las alteraciones en un sitio de restricción de una enzima que genera fragmentos de una longitud variable y que son reconocidos por una sonda marcada. Utiliza los fundamentos de un Southern Blot. Lo único que cambia es que es utilizado para fragmentos polimórficos que se encuentran en nuestro ADN y que se ven variados en distintas alteraciones generando patrones alelicos diferentes en general son 2, puede estar el corte o no en el sitio polimórfico. Estos patrones alelicos permiten diferenciar o no la alteración en cuestión y poder generar este tipo de familigramas. 
Estos patrones de RFLP se pueden usar para paternidad, forense. 
Tecnica VNTR o STR
Son muy similares a los RFLP. Son alteraciones en la secuencia polimórficas del ADN y en lo que difieren con las RFLP es que son variables repetitivas en tándem, que si son muy grandes son VNTR y si son muy cortas son STR. Si son de 1 solo nucleótido son SNP. En cualquiera de estas ultimas 3, se pone en evidencia:
Primero, se realizan a partir de templados de ADN del sitio en cuestión las PCR correspondientes (flanquean el sitio que nos interesa).
Los cuadrados en gris son los primers que están flanqueando el sitio que va a amplificar. Un alelo (azul) presenta 3 copias, entonces se muestra ese fragmento azul a la altura de 3 y el otro alelo tiene 6 y se muestra a la altura de 6. Siempre en cada calle de corrida (cuadrado hundido de castillo, pocillo) esta la representación de ambos alelos, si ambos alelos son iguales coincidirán los fragmentos, si ambos alelos son distintos se pondrá en evidencia el patrón alélico de ambos en esa calle. 
Tecnica PCR (reacción en cadena de la polimerasa)
Utiliza un templado, cosnta de un momento de desnaturalización, un momento de hibridación donde se usan cebadores, una ADN polimerasa que le permite ingresar nucleótidos y copiar la cadena de templado, y luego esto se repite n veces, generando la amplificación de un segmento de interés. Esta reacción en cadena mejoro con la utilización de una PAS polimerasa que hizo que la PCR sea mucho mas eficiente, porque era una enzima que podía soportar las distintas variaciones en las temperaturas que ocurrían en cada uno de estos pasos. 
La PCR a simple viste no permite ver nada a menos que este acoplada a un software o a una electroforesis. 
Una modificación previa a la PCR seria generar previamente una retrotranscripcion, que significa obtener una extracción de ARN por una retrotranscriptasa pasarla a CNA, y ese ADN recién ser utilizado para una amplificación en PCR. 
La utilidad de la PCR es amplificar un segmento; determinar la presencia o no de un segmento determinado como un virus en sangre; poder semicuantificar o cuantificar un determinado contenido de ADN o ARN; poder diseñar de acuerdo al diseño de primers y poder encontrar alelos específicamente asociados a distintas alteraciones; etc. 
Tecnica PCR-ASA
Utiliza primers diseñados para hibridizar con los alelos específicos en estudio. Esto significa que, por ejemplo, si se diseñan los primers que solo van a hibridizar con el templado en caso de encontrar la alteración a nivel del ADN, por lo tanto, luego de ocurrir la PCR y generar la corrida electroforética para evidenciar la presencia del fragmento, la presencia del mismo nos dira que esta presente la alteración en estudio. Si por el contrario, los primers hubieran sido diseñados para solo hibridizarse a los alelos normales, la presencia del segmento en cuestión no estaría hablando de alelos totalmente normales. Es decir, el análisis de esta corrida electroforética y tinción con bromuro de tilio de los segmentos correspondientes depende de como fueron diseñados los primers en cuestión. 
Tecnica PCR-ASO
Usa primers que abarcan la secuencia de estudio. Esos primers son bastante estándar, es decir, flanquean la zona de estudio pero no son alelo-especifico. Se pone en evidencia la parte especifica de alelo: una vez realizada la PCR, esta se coloca en pequeños puntos, se deja secar en ese papel en donde se coloco esos pequeños puntos, por cada paciente se generan 2 puntos, de manera tal que una línea va a ser hibridizada con una sonda alelo-especifica normal y otra línea va a ser hibridizar con una sonda alelo-especifica mutada. 
La aparición de la hibridacion de la sonda normal y mutada nos da la idea de heterocigosidad. La aparición de un solo punto para una u otra sonda da la idea homocigosidad y va a depender de si la enfermedad es dominante o recesiva y si el paciente en cuestión va a padecer la alteración. 
-Alelo identificado por oligo
-Alelo especifico
Técnica MLPA 
Es una PCR bastante universal, donde no se necesita conocer mucho del gen en cuestión. Sirve para detectar distintos segmentos de distintos tamaños en donde si se quiere evidenciar, por ejemplo, secuencias repetitivas en tándem se utilizan sondas universales que están bastante cercanas entre si; hay un proceso y un paso de ligación, y estas sondas son utilizadas desde ese momento como primers o cebadores, para amplificar las n veces necesarias para poner en evidencia fragmentos de distinta longitud. En general esta técnica esta asociada a software que nos permite ver los distintos fragmentos en distintos tamaños, analizando esta secuencia de picos. 
-Reaccion de unión-ligacion de sondas con la zona homologa de interes
-Amplificacion por PCR
-Analisis de fragmentos aprovechando la diferencia de tamaño. 
Secuenciacion
Es como llegar a lo máximo que podemos poner la lupa a nivel del ADN. Hay 4 tubos y en cada uno hay un templado, una enzima ADN polimerasa y los nucleótidos. La diferencia que hay en los tubos es que en cada uno hay uno de los nucleótidos que es desoxinucleotido. Cuando la ADN polimerasa toma ese desoxinucleotido, detiene su copia del templado. De esta manera, esta cantidad de templado en excesopuede generar distintos tipos de tamaños de fragmentos donde se terminaba la copia por la ADN polimerasa y si luego se corria en una electroforesis, se podía empezar a leer el código genético desde el fragmento mas pequeño, por ejemplo: si esta se detuvo en G, entonces ese es el ultimo nucleótido que ingreso a la ADN polimerasa. Es la secuencia complementaria de lo que seria el ADN original. 
Western Blot (Proteinas)
Como las proteínas tienen una secuencia que dependen de la composición de aminoácidos para tener una carga determinada, para independizarnos de esa carga las proteínas son puestas en contacto con un detergente y que las cargan con carga negativa a cualquier proteína que sea expuesta a este detergente, y que cuando se realice la corrida electroforética solo van a estar involucrados la presencia de estos segmentos. Se puede analizar solo alteraciones a nivel de la estructura primaria de una proteína. Estas proteínas se colocan y se siembran en pocillo, los geles son verticales. Esta corrida electroforética nuevamente cumple los mismos pasos, es transferida por capilaridad manual o forzada a un papel, este papel se pone a incubar con anticuerpos que reconozcan a esta proteína en estudio que están marcados. Una vez que ocurre el periodo de incubación, este papel se impactaría con una placa radiográfica y con una autoradiografia pondría en evidencia los sitios en los que el anticuerpo detecta la proteína en cuestión, la cantidad de fragmentos que uno encuentra, el tipo de fragmentos y a que altura
Otra manera de detectar a nivel proteico es la inmunocitoquimica o inmunofluorescencia, se localiza una proteína, su localización en la celula o tejido y análisis de estructuras secundarias, terciarias, etc. 
TP 2 RESUELTO
1) a) Se sabe que existe una serie de 3 alelos para el carácter grupo sanguíneo (A, B y 0). 
¿Cuántos alelos estarían presentes en: 
  1 cromosoma? 
  un par cromosómico? 
  un individuo de la especie? 
  una gameta del individuo? 
  ¿Cuántas combinaciones diferentes de alelos se espera que ocurran en la población completa? 
Primero conviene explicar (el alumno no tiene porqué saberlo) que los grupos sanguíneos dependen de que una persona exprese la forma A de glicosilación la glucoproteína ABO que se expresa en la superficie del eritrocito, la forma B o ninguna de ambas. Esto depende de los alelos del gen ABO, que está en 9q34.2 y que codifica para una glicosiltransferasa. La variante (alelo) A de la glicosiltransferasa glicosila la proteína de una manera, la B de otra y la variante 0 (algunos dicen “o”, otros dicen “cero”, tanto en castellano como en inglés; se aceptan ambas) no induce glicosilación. 
Cada cromosoma 9 tiene un solo alelo (el A, el B o el 0) de la glicosiltransferasa ABO. 
En 2 cromosomas 9 de un individuo puede haber 2 alelos diferentes si el individuo es heterocigoto (el A en uno y el B en el otro, el A y el 0, el B y el 0), o bien el mismo alelo (2 alelos A, o 2 B o 2 0) si es homocigoto. 
En una gameta, hay un solo cromosoma 9 un solo alelo. 
Combinaciones posibles: AA, A0, AB, BB, B0, 00. 
b) Defina como homocigoto o heterocigoto a un individuo AA, uno AB, uno A0, uno 00, uno B0. 
AA (homocigota) y A0 heterocigota (A dominante), AB es codominante; BB y B0 (ídem a AA y A0). 00 homocigota recesivo. 
c) Sabiendo que los alelos A y B son dominantes (codifican proteínas inmunogénicas), mientras que el alelo 0 es recesivo (no genera proteína inmunogénica): 
 Explique cuál será el fenotipo (grupo sanguíneo) de cada uno de los pacientes. 
 ¿Cuál(es) de los pacientes puede darle sangre a cuál(es) sin riesgo de una reacción inmune? ¿Cuál es donante universal? ¿Cuál es receptor universal? Fundamente su respuesta. 
AA (homocigota) y A0 heterocigota (A dominante) son fenotípicamente iguales: expresan A, pueden donar sangre a individuos A y AB y recibir de A y de 0. Si reciben de B o de AB, reaccionan con Ac anti-B. 
BB (homocigota) y B0 heterocigota (B dominante) son fenotípicamente iguales: expresan B, pueden donar sangre a individuos B y AB y recibir de B y de 0. Si reciben de A o de AB, reaccionan con Ac anti-A. 
AB es codominante; puede dar a AB, recibir de A, B, AB o 0, ya que no reaccionan con Ac (son receptores universales). 
00: pueden dar sangre a todos al no tener antígeno A ni B (donante universal). Sólo puede recibir de 0, ya que reacciona con Ac anti-A y anti-B. 
2) Ud. trabaja en un laboratorio de diagnóstico molecular y sabe que la anemia falciforme es una hemoglobinopatía caracterizada por el cambio de una única base (A/T), que implica el cambio de un aminoácido Glu por un aminoácido Val en la cadena β. 
También conoce el mapa de restricción del gen de la cadena β y sabe que la enzima MstII reconoce y corta la secuencia CCTNAGG indicada por las flechas (donde N es cualquier nucleótido). 
  Analice los resultados obtenidos por Southern blot y determine los fenotipos y genotipos de los individuos A, B, C, D y E. Tenga en cuenta que la enfermedad se expresa clínicamente sólo en los individuos homocigotas. 
  Ud. decide utilizar la técnica de PCR de modo tal que le permita diagnosticar anemia falciforme. ¿De dónde obtiene la muestra? Fundamente su respuesta. 
Repasar el fundamento del Southern blot (no la receta, sino la lógica): se digiere el ADN con la enzima: si existe el sitio reconocido por la enzima, el ADN se corta (en el caso normal en 2 fragmentos); si no existe el sitio (caso mutado), queda un solo fragmento. La muestra de ADN sometida a la enzima se introduce en un gel y se hace una electroforesis, que permite separar los fragmentos de ADN según su tamaño. Se coloca una sonda de ADN que reconoce al fragmento de interés. Como la sonda está marcada con radioactivo, al revelar el resultado en una placa radiográfica, el radioactivo da una banda por cada fragmento marcado). Los pacientes A, B y E tienen un alelo normal (banda 1,15 + banda 0,2 kb) y un alelo mutado (banda 1,35 kb): son heterocigotos. Como la enfermedad es recesiva, son portadores sanos. El paciente C solo tiene las bandas normales (es homocigoto normal). El paciente D solo tiene la banda anormal: es homocigoto afectado. 
Para obtener ADN para una PCR, hay que tener células nucleadas: se usa habitualmente la sangre (porque es fácil de obtener). Atención, de la sangre se usan los glóbulos blancos (no los rojos, que no tienen núcleo, por lo que no tienen ADN). 
3)En un caso de homicidio, para tratar de identificar al posible agresor, se obtuvo ADN de células que quedaron debajo de las uñas de la víctima. Se realizó el estudio forense del ADN por la técnica de RFLP, comparándolo con el ADN de 6 individuos sospechosos (S1 a S6). 
  ¿Alguno de los sospechosos puede ser el agresor? Justifique su respuesta. 
  ¿El resultado obtenido es a su criterio, prueba lo suficientemente contundente como para condenar al imputado? Justifique su respuesta. 
Recordar el fundamento (no la receta) de la técnica de RFLP (estudio de fragmentos de restricción de longitud polimórfica: restriction fragment length polymorphism): similar al Southern, pero se usan varias enzimas, que digieren todo el genoma. Cada individuo tiene una combinación de fragmentos o perfil que le es propio (como las huellas digitales). El Sospechoso 5 tiene un perfil similar al encontrado en el ADN debajo de las uñas de la víctima. 
Podría haber 2 individuos con el mismo perfil (aunque es poco probable). O sea, es una prueba que complica al sospechoso, pero no es suficiente. 
4) La fibrosis quística (FQ) se transmite de modo autosómico recesivo.
La mutación más común del gen CFTR en los enfermos que padecen FQ provoca la deleción del aminoácido fenilalanina n° 508 (∆F508). 
El diagrama muestra la genealogía de un paciente. 
Los resultados de una PCR alelo-específica seguida por dot blot revelan la presencia/ausencia de las secuencias normales o con la deleción característica de la FQ. Observe el gráfico. 
  Indique el genotipo de cada unode los integrantes de la familia (homocigoto normal, homocigoto mutado, heterocigoto, heterocigoto compuesto). 
  Indique si algún integrante de la familia padece la enfermedad. Justifique su respuesta. 
Recordar el fundamento (no la receta) de la técnica de dot blot: a partir de ADN de los diferentes individuos, se hace una PCR usando primers que se hibridan con la secuencia normal y una PCR con primers que se hibridan con la secuencia anormal. El resultado (una gota) de la primera PCR se pone en la fila de arriba y el de la segunda PCR en la fila de abajo. Se hibrida con una sonda radiactiva (o con otra marca, que puede emitir fluorescencia, luminiscencia, etc.) específica para CFTR. Se coloca una placa radiográfica (u otra que pueda ser sensible a fluorescencia o luz). El padre, la madre y el hermano 1 son heterocigotos. El hermano 2 y 3 son homocigotos. 
El hermano 3 es el único enfermo (homocigoto mutado). Padre, madre y H1 son portadores sanos, H2 es sano, no portador.
5) a) Compare los árboles genealógicos: 
 ¿Qué tipo de herencia reflejan? Justifique su respuesta. 
A B
La idea general es que se razonen los árboles genealógicos y se evite el uso de los típicos slogans “salta generaciones, lo transmiten las mujeres y padecen los varones, bla, bla, bla”.
En este caso, para distinguir transmisión autosómica dominante de otras que se pueden parecer. 
El árbol A es típico de una enfermedad de transmisión autosómica dominante. 
Repasar entonces por qué autosómica (debe estar en un autosoma= cromosoma 1 a 22) porque los varones lo pasan tanto a varones como a mujeres (si fuera en el Y, sólo pasaría a varones; si fuera en el X, sólo a mujeres). 
Por qué dominante? Para ser recesiva, aún sin saber si la mujer de la generación I es portadora sana, sería poco probable que la mujer de la generación II también sea portadora sana (a menos que sea una enfermedad muy, muy, muy frecuente, como se puede dar en grupos pequeños con alta endogamia). 
El árbol B es típico de una enfermedad de transmisión mitocondrial. 
Repasar herencia mitocondrial: es por mutaciones del ADN mitocondrial, que es heredado solamente por vía materna. 
Podría ser autosómico dominante, pero es raro que solamente las mujeres lo transmitan. 
Podría ser ligado al X dominante, epro es raro que nunca un hombra lo transmita a su hija mujer. 
b) Analice el árbol genealógico 
Típico de dominante con penetrancia variable o incompleta.
Quiere decir que es heredado en forma dominante, pero no siempre se expresa la enfermedad, por ejemplo en Aa de la generación II.
No siempre se sabe bien por qué esto ocurre. Más abajo veremos el caso de “pérdida de heterocigosidad”. Otra posibilidad sería que haya otros genes que interactúen con el gen mutado. Dicha interacción puede ser variable entre individuos, llegando en algunos casos al “umbral de enfermedad” y en otros casos, no.
c) Analice el árbol genealógico 
¿Qué tipo de herencia refleja? Justifique su respuesta. 
Típico de herencia ligada al X recesiva. Evitar el slogan clásico “transmitida por mujeres, padecida por varones, etc.” Tratar de razonar: 
Quiere decir que es heredada por mutación en un gen del cr. X. Las mujeres, al tener 2 X, pueden tener uno normal y por eso la enfermedad no se manifiesta (recesiva). 
Los varones son hemicigotos (un solo alelo, que está en el X, excepto raros casos de genes que también están en el Y, como los de las regiones pseudoautosómicas). Por eso, cuando el único alelo está mutado, se da la enfermedad. 
La madre se lo transmite a su hijo varón y éste padece la enfermedad. Le puede transmitir el alelo a su hija mujer, pero esta será portadora sana (punto) ya que recibe del padre un alelo normal. 
Si el padre enfermo trasmite a su hija mujer el alelo mutado, la hija será portadora sana ya que recibe de su madre un alelo normal. 
Sería rarísimo que reciba de su madre otro alelo mutado (salvo en poblaciones pequeñas con alta endogamia), en cuyo caso la hija sería enferma (homocigota mutada). 
d) Elabore el árbol genealógico:
El caso índice es una mujer de 20 años con Hiperplasia Suprarrenal Congénita (HSC), una enfermedad autosómica recesiva. Es heterocigota compuesta.
El padre es portador sano y la madre es portadora sana de una mutación diferente.
Los abuelos paternos fallecieron ambos, no conociéndose antecedentes.
El abuelo materno es homocigoto sano y la abuela materna es portadora sana.
Tiene 2 hermanas mujeres: una de 17 años portadora sana (mutación materna) y una de 15 años enferma (heterocigota compuesta). Tiene 2 hermanos varones de 12 años (gemelos monocigóticos), homocigotos sanos. Todos son hijos del mismo padre y la misma madre que la paciente. 
Tiene un medio hermano varón de 2 años, hijo del mismo padre, pero de otra madre. El niño es portador sano. Su madre es homocigota sana y está embarazada (no se conoce el sexo del feto). 
Aprovechar para repasar simbología: 
6) (Ejercicio de razonamiento basado en conocimientos de patrones de herencia) 
a) La forma juvenil de la enfermedad de Parkinson (inicio antes de los 40 años) se debe a mutaciones al estado homocigota o heterocigota compuesta del gen PRKN, que codifica la parkina, una proteína necesaria para la sobrevida de las neuronas de la sustancia nigra.
b) La Pubertad Precoz Independiente de Gonadotrofinas, o Testotoxicosis, es una enfermedad rara que ocurre por mutaciones activadoras del gen LHCGR, que codifica para el receptor de LH. El receptor de LH es responsable de activar la producción de testosterona, que genera el desarrollo de los caracteres sexuales secundarios en la pubertad. 
c) La displasia campomélica es consecuencia de una falla en la formación de colágeno en el tejido cartilaginoso y en el tejido óseo. El factor SOX9 es un activador transcripcional del gen del colágeno. Es necesario tener 2 copias activas de SOX9 para que se produzca suficiente cantidad de colágeno. 
d) El receptor β de hormonas tiroideas (THRB) se dimeriza con otro receptor ya sea THRB, THRA (alfa) o con receptores de ácido retinoico para ejercer su función (respuesta a las hormonas tiroideas). Cuando un alelo THRB está mutado, la proteína anormal puede unirse a la proteína normal producida por el otro alelo e impedir que la misma funcione normalmente, provocando así una Resistencia a Hormonas Tiroideas.
e) La proteína RET es un supresor tumoral. Si un individuo recibe un alelo mutado de alguno de sus progenitores, no desarrolla tumores mientras el otro alelo esté normal y produzca suficiente cantidad de proteína RET (o sea mientras se mantenga la heterocigosidad del RET). Pero si en una célula (por ejemplo, en las células C o parafoliculares de la tiroides) se produce una mutación somática del otro alelo, se pierde completamente la producción de RET en esa céula y todas las que deriven de ella por mitosis, llevando al desarrollo de un tumor (Cáncer medular de tiroides). 
Compare los diferentes casos e indique si se tratan de: o Herencia recesiva
o Dominancia negativa
o Dominancia por insuficiencia haploide 
o Dominancia por ganancia de función
o Penetrancia variable por Pérdida de heterocigosidad 
1) Recesiva: es el caso a. Tiene que haber 2 alelos mutados: uno de cada progenitor. Los progenitores pueden ser portadores sanos o enfermos. Puede pasar, a veces, que uno de los progenitores no tenga la mutación en ADN de leucocitos, sino que en su gametogénesis se produce la mutación “de novo”, y esta es transmitida al embrión. 
2) Dominante: con un solo alelo mutado alcanza. Ahora bien, por qué en estas enfermedades un alelo mutado produce enfermedad y en las recesivas no? Eso se explica gracias a los mecanismos de dominancia: 
Dominancia negativa: es el caso d, donde el producto (proteína) del alelo mutado le impide al producto del alelo normal funcionar normalmente. 
Insuficiencia haploide: es elcaso c, donde la cantidad de proteína producida por un solo alelo es insuficiente para que las células funcionen correctamente. Hace falta una cantidad de proteína mayor (2 alelos). 
Ganancia o exceso de función: es el caso b, donde el gen se expresa de más y produce un exceso de actividad celular. 
Penetrancia variable por pérdida de heterocigosidad: es el caso e. Típico de los “supresores de tumor” o “anti-oncogenes”. Un progenitor le transmite a su hijo un alelo del supresor de tumor que está mutado. Pero como el hijo recibe un alelo normal de su otro progenitor, es heterocigoto. No manifiesta la enfermedad porque se comporta hasta aquí como recesiva. Pero si en una célula C de la tiroides, por ejemplo, se produce una mutación somática en el hijo, esa célula deja de ser heterocigota para transformarse en heterocigota mutada, deja de expresar el supresor de tumor RET y se desarrolla el tumor. En otras palabras, lo que se hereda en forma dominante es la susceptibilidad a tener el tumor. Lo que pasa es que la ocurrencia de mutación somática es muy frecuente en todos los tejidos. Por eso si el paciente ya tiene una mutación del otro alelo por línea germinal, la enfermedad ocurre casi seguro. Se habla de dos golpes (hits): el primer golpe es la mutación germinal heredada, el segundo golpe es la mutación somática. En aquellos casos en que la mutación somática no ocurre, la enfermedad no se da (son portadores). 
7) El síndrome de Silver-Russell se caracteriza por retardo de crecimiento intrauterino (RCIU) que lleva al nacimiento de niño pequeños para la edad gestacional (PEG), además de retardo de crecimiento postnatal y anomalías cráneo-faciales. Una de las causas es la falta del locus 7p11.2 paterno. 
  Enumere causas posibles de faltas posibles del locus 7p11.2 paterno, con hemicigosis o sin hemicigosis. 
  Describa los mecanismos posibles que llevan a la pérdida del alelo paterno. 
La idea es discutir herencia no mendeliana:
El 7p11.2 paterno puede faltar porque lo heredó así del padre (quien debería estar afectado si heredó la deleción de su padre, pero no si la heredó de su madre). El 7p11.2 materno está metilado o con alguna otra impronta que lo silencia, por lo tanto no se expresa. El único que se expresa es el paterno. 
Puede faltar porque en el padre normal, durante la espermatogénesis, se produce una deleción de novo de 7p11.2, que se trasmite al embrión. 
O porque en la ovogénesis materna, hay una falla de disyunción del cr7 que lleva a formar un ovocito con 2 cr7 y un ovocito sin cr7. Si el ovocito con 2 cr7 es fecundado, se forma un embrión con una trisomía 7. Como suele ser inestable la trisomía, se suele perder un cr7. Si se pierde el materno, no pasa nada, se recupera la disomía normal. Pero si el que se pierde es el cr7 paterno, el embrión es viable prque tiene 2 cr7, pero son ambos maternos (disomía uniparental materna). Ambos están imprintados y no se expresan. 
Finalmente podríamos imaginarnos una impronta (metilación, etc.) anormal durante la espermatogénesis paterna. El embrión recibe el cr7 paterno metilado (silenciado) en 7p11.2. El materno siempre está silenciado, por lo cual es hijo estará afectado. No sería una falta del locus paterno, sino una falta de expresión por imprinting o impronta anormal. 
8) La Falla Ovárica Prematura (FOP) es la pérdida de la capacidad funcional del ovario antes de los 40 años, llevando a una menopausia precoz. La proteína BMP15 es uno de los factores involucrados en el mantenimiento de la función ovárica. 
La idea es discutir fundamentos de métodos diagnósticos, utilidades y limitaciones (no las recetas de cómo se hace). 
a) Usted está estudiando una paciente con FOP y sospecha que puede tener una mutación del gen BMP15. Unestudio por PCR informa: “Se utilizó la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), seguida de una electroforesis del producto de PCR y se observó la amplificación del gen BMP15, con una banda del tamaño normal en el gel de electroforesis”.
 ¿Puede concluirse que el gen BMP15 es normal?
La PCR necesita que haya: secuencias de ADN molde (es el ADN del paciente en este caso; en inglés se dice template, pero en castellano NO se traduce templado, que quiere decir ni frío ni cálido), cebadores o primers, nucleótidos y ADN polimerasa, además de buffer y sales para que la reacción ocurra. 
Si la secuencia de BMP15 está, la PCR amplifica y da una banda normal, aunque haya una mutación en el gen. O sea, PCR positiva no significa gen normal. 
Si la secuencia no está (deleción) o si la mutación está justo donde se hibrida el cebador, la PCR no amplifica y no se ve banda en la electroforesis. PCR negativa significa gen anormal(por supuesto, siempre suponiendo que se hizo correctamente desde el punto de vista técnico, o sea bien aplicada la receta, temperaturas, etc.). 
 ¿Qué método solicitaría al laboratorio que realice para confirmar que etl gen BMP15 no tiene mutaciones responsables de la FOP de esta paciente? Fundamentesu respuesta. 
Pediría una secuenciación de Sanger, que permite leer toda la secuencia de basers del gen.
b) Usted recibe un informe que dice: “Se amplificaron por PCR los 2 exones del gen BMP15 y luego seutilizó la técnica de secuenciación directa de Sanger.No se hallaron mutaciones”. 
 ¿Puede concluirse que el gen BMP15 es normal?
En la secuenciación de Sanger, debe haber secuencias de ADN molde (es el ADN del paciente), o primers, nucleótidos y ADN polimerasa, además de buffer y sales para que lapreacción ocurra. Los nucleótidos están marcados con un fluorocromo (azul, verde, amarillo, reojo) que permite identificarlos en el electroferograma.
Sólo puede afirmarse que los exones están normales, no se puede excluir que haya mutaciones en el intrón o las regiones reguladoras. 
 ¿Qué solicitaría al laboratorio para confirmar que el gen BMP15 no tiene mutaciones responsables de la FOP de esta paciente? Fundamente su respuesta. 
Secuenciación del intrón y regiones flanqueantes en 5’ y 3’. 
c) Usted recibe un informe que dice: “Se amplificaron por PCR las regiones 5 ́y 3 ́flanqueantes del gen BMP15, así como todo el intrón, y luego se utilizó la técnica de secuenciación directa de Sanger. No se hallaron mutaciones”. 
 ¿Puede concluirse que el gen BMP15 es normal? Fundamente su respuesta. 
Puede decirse que no hay mutaciones en el gen y sus regiones reguladoras próximas, no se pueden excluir mutaciones en regiones reguladoras alejadas ni problemas de metilación (imprinting). 
d) Todos los estudios realizados descartan al gen BMP15 como causante de la FOP. No se conocen otros genes potencialmente responsables. 
 ¿Qué método podría utilizarse para encontrar una causa genética no conocida de FOP? Fundamente su respuesta. 
Puede recurrirse a técnicas de secuenciación masiva (next generation sequencing “NGS”). En este caso se agregan primers para todo el genoma (whole genome sequencing “WGS”) o para todos los exones de todos los genes del genoma (whole exome sequencing “WES”). Estas técnicas permiten secuenciar todo el genoma o todo el exoma de un paciente en aprox. 1 día. Son costosas (aprox. 1000–5000 dólares), existen en Argentina. 
Produce una cantidad impresionante de información (toda la secuencia del genoma o del exoma), que debe ser analizada mediante programas bioinformáticos. 
Permite identificar variantes en genes que no se pensaba que pudieran ser causantes de la enfermedad (a diferencia de las técnicas antes descriptas, que requieren conocer el gen “candidato”). Se llaman “variantes” a las diferencias en las secuencias halladas al comprar con bases de datos locales o internacionales (en las que están disponibles las secuencias de genomas “normales”). Ahora tiende a reservarse el término mutación para una variante causante de enfermedad. Las variantes comunes, que no causan enfermedad, suelen denominarse “polimorfismos”. 
Hallar una variante no quiere decir que la misma sea causante

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