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Este resumen esta hecho con informacion toda sacada del Cooper 6ta edicion y algunas cosas que agragamos de seminarios de biologia . Seminario de Integracion Nº1 “Replicación, mantenimiento, y reorganización del ADN genómico” Cada vez una celula se divide es necesario que duplique su genoma, por lo que se requiere de una maquinaria compleja para copiar las grandes moléculas de ADN, tanto de procariotas como eucariotas. Las células han desarrollado mecanismos para corregir los fallos que pueden darse durante la REPLICACION, y también para REPARAR daños que puedan surgir por agentes ambientales. Cabe destacar que para que las especies evolucionen son necesarias las mutaciones y la REORGANIZACION para mantener la variabilidad genética entre los individuos. 1) REPLICACION DEL ADN La replicación del ADN es un proceso semiconservativo, en el que cada hebra parental sirve como molde para la síntesis de una nueva hebra hija. La enzima principal en este proceso es la ADN POLIMERASA, la cual cataliza la unión de los desoxirribonucleosidos 5`-trifosfato (dntp) para formar la cadena de ADN en crecimiento. Igualmente para el proceso de replicación se encuentran involucradas otras proteínas y mecanismos de lectura, los cuales se van a mencionar a continuación. 1A) ADN POLIMERASAS Encargada de catalizar la unión de los desoxirribonucleosidos 5`-trifosfato (dntp) para formar la cadena de ADN en crecimiento. Las células eucariontes posee tres ADN polimerasas ( ), que funcionan en la replicación del ADN nuclear. L ADN polimerasa Y se localiza en las mitocondrias y es la responsable de la replicación del ADN mitocondrial. Todas las ADN polimerasas comparten las siguientes propiedades: -Sintetizan ADN solo en la dirección 5’ a 3´, añadiendo un DNTP al grupo 3´ hidroxilo de una cadena creciente. -Pueden añadir un nuevo desoxirribonucleotido solo a una hebra cebadora ya existente que se encuentre unida a una hebra molde. Las ADN POLIMERASAS difieren de las ARN POLIMERASAS, en que las segundas pueden iniciar la síntesis de una nueva hebra de ARN en ausencia de un cebador. 1B) HORQUILLA DE REPLICACION Están contenidas dentro de moléculas d ADN, y son regiones de la síntesis activa de ADN. En cada horquilla las hebras parentales se separan y son sintetizadas dos nuevas hebras hijas. Las dos hebras de la doble hélice de ADN se disponen de manera ANTIPARALELA, por lo que una de las hebras debe sintetizarse en sentido 5` a 3`, y va a ser sintetizada por la ADN POLIMERASA. En cambio la otra hebra, no podrá ser sintetizada por esta enzima, ya que la ADN polimerasa cataliza la polimerización solo en sentido 5` a 3`; por lo tanto, esta segunda hebra va a ser sintetizada por fragmentos de ARN y por fragmentos de ADN( FRAGMENTOS DE OKASAKI), estos son pequeñas piezas que sintetizan en sentido opuesto al movimiento de la horquilla de replicación, y se van uniendo por acción de la ADN LIGASA, formando una nueva hebra intacta de ADN. Dicho esto podemos dividir a las hebras en: -Una HEBRA CONDUCTORA -Una HEBRA TARDIA La ADN polimerasa de la hebra conductora necesita un cebador. En el caso de la hebra tardía, los fragmentos de okasaki utilizan como cebadores a fragmentos cortos de ARN. Para formar una hebra tardía continua es necesario eliminar a los fragmentos cortos de ARN (cebadores) y ser sustituidos con ADN. En los procariotas estos ARN son eliminados mediante la polimerasa I, mientras que en las células eucariotas hay tres ADN polimerasas implicadas, estas son ( ) La polimerasa A(alfa) se encuentra formando un complejo con las primasas y funciona con ellas para sintetizar fragmentos cortos de ARN-ADN durante la síntesis de la hebra tardía y en los orígenes de replicación. Las polimerasas & y E actúan como las principales polimerasas en la replicación que se ocupan de la síntesis de las hebras conductora y tardía. Estas últimas están asociadas a proteínas de enganche deslizante que sitúan a la polimerasa en el cebador y mantienen su asociación estable con el molde. Hay otras proteínas que desenrollan la hebra molde de ADN y estabilizan regiones de una sola hebra. Las HELICASAS, son enzimas que catalizan el desenrollamiento del ADN parental, emparejadas con la hidrólisis de ATP. Hay también proteínas que se unen al ADN monocatenario y estabilizan la hebra molde de ADN desenrolladla, manteniéndola en un estado de hebra única extendida para que sea copiada por la polimerasa. A medida que las hebras parentales se desenrollan, el ADN a la cabeza de la horquilla de replicación está siendo forzado a girar. Esto es resulto por las TOPOISOMERASAS, enzimas encargadas de catalizar la rotura reversible y la unión de las hebras de ADN. Hay dos tipos: -Topoisomerasa I: Rompe solo una hebra de ADN. -Topoisomerasa II: Induce la rotura simultánea de las dos hebras. Esta es necesaria para desenrollar el ADN, para separar las nuevas moléculas de ADN circular, e interviene en la condensación mitótica de los cromosomas. Todas las enzimas mencionadas, actúan de manera coordinada para sintetizar las hebras conductora y tardía de manera simultánea. C) FIDELIDAD DE REPLICACION Aquí es necesario nombrar a la ADN POLIMERASA, esta enzima aumenta la fidelidad de a replicación por varios motivos: -Ayuda a seleccionar la base correcta para la inserción en el nuevo ADN sintetizado, discrimina en contra de la incorporación de una base desapareada. - Al poseer actividad exonucleasa, puede hidrolizar el ADN en dirección 3` a 5`, es decir en sentido contrario a la síntesis de ADN, por lo que participa en la doble lectura del ADN sintetizado, aumentando la exactitud de la replicación. -Si una base incorrecta es incorporada, la exonucleasa la va a eliminar antes de continuar con la síntesis. D) ORIGENES E INICIACION DE LA REPLICACION La replicación en procariotas como en eucariotas comienza en una única secuencia llamada ORIGEN DE REPLICACION, que sirve como un sitio especifico de unión para las proteínas que inician el proceso de replicación. En procariotas, en E.Coli, una proteína iniciadora se una a secuencias especifica de ADN, esta proteína comienza a desenrollar el origen del ADN y junto con la HELICASA continúan desenrollando y presentando al ADN molde. En eucariotas, se necesitan múltiples orígenes de replicación para replicar los genomas que en estas células son mucho más largos. E) TELOMEROS Y TELOMERASA: EL MANTENIMIENTO DE LOS EXTREMOS DE LOS CROMOSOMAS Debido a que la ADN POLIMERASA, es incapaz de copiar los extremos 5` de las moléculas lineales de ADN, estas secuencias (TELOMEROS) deben entonces ser replicados por la acción de la TELOMERASA, la cual es capaz de mantener a los telómeros catalizando de su síntesis en ausencia de una hebra molde de ADN. Algunas células tienen la capacidad de revertir el acortamiento de los telómeros por la expresión de la telomerasa, una enzima que extiende los telómeros de los cromosomas. La telomerasa es una ADN polimerasa dependiente de ARN, lo que significa que es una enzima que puede producir ADN usando un molde de ARN. Esta telomerasa es denominada como “transcriptasa inversa” La transcriptasa inversa, transcriptasa reversa o retrotranscriptasa es una enzima de tipo ADN-polimerasa, que tiene como función sintetizar ADN de doble cadena utilizando como molde ARN monocatenario, es decir, catalizar la retrotranscripción o transcripción inversa. Los telómeros se van acortando a medida que las células envejecen, este acortamiento desencadena la muerte celular. Hay muchos síndromes de envejecimiento prematuro que se caracterizan por la perdida telomérica y por mutaciones de la telomerasa. La ARN telomerasa extiende a la cadena mas larga y no solo eso ,al extenderla la telomerasa la usa a ella como cebador y extiende la que estabacorta.Y la cadena larga tambien sigue siendo sitetizada usando como molde a la ARN telomerasa ademas ella no presenta problema porque esta en direccion `5 a `3. Curiosamente, muchas células cancerosas tienen telómeros acortados y telomerasa activa. Si se pudiera inhibir la telomerasa con fármacos como parte del tratamiento de un cáncer, su división excesiva (y por lo tanto, el crecimiento del tumor canceroso) potencialmente podrían detenerse. 2) REPARACION DEL ADN Los daños en el ADN pueden bloquear la transcripción o la replicación, pudiendo dar lugar a una gran cantidad de mutaciones. Es por eso que existen dos tipos de reparación, que actúan antes que el ADN sea replicado, estos son: Inversión directa del ADN dañado: Es el camino mas eficiente a la hora de tratar con tipos específicos de daños al ADN, solo determinados tipos de ADN se logran reparar de esta forma. Por ejemplo los dímeros de pirimidina que resultan de la exposición a la luz ultravioleta y los residuos de guanina alquilada que se han modificado por la adición de grupos metilos y etilos en la posición O6 del anillo de purina. Otra reparación es la del daño producido por la reacción entre los agentes alquilantes y el ADN. Escisión de bases dañadas seguida por su reposición con ADN recién sintetizado: Abarca la reparación de gran variedad de alteraciones químicas del ADN. El ADN dañado es reconocido y eliminado, el espacio vacio es rellenado con la síntesis de una nueva hebra de ADN, utilizando la hebra complementaria no dañada como molde. De este, hay tres tipos de reparación: -A) Reparación por escisión de base: En esta, la base dañada es reconocida y eliminada. Un ejemplo, puede ser el del Uracilo, el cual su escisión es catalizada por la ADN GLICOSILASA, enzima que rompe el enlace de unión entre el uracilo y el esqueleto de desoxirribosa del ADN; el resultado es la formación de un sitio apurínico o apirimidínico (un azúcar sin base) en el ADN. La desoxirribosa es eliminada y el espacio es rellenado por una por la ADN polimerasa y ligasa. -B) Reparación por escisión de nucleótidos: Reconoce a una gran variedad de bases dañadas, las cuales son eliminadas como parte de un oligonucleótido que contiene la lesión. En humanos ocurre generalmente en casos de enfermedades hereditarias, en las cuales hay dificultades para reparar al ADN. En los eucariotas actúan las proteínas XPF1/ERCC1 y XPG, las cuales son endonucleasas que cortan al ADN en los extremos 5` y 3` de la región dañada. Se escinde el oligonucleótido que consiste en aproximadamente 30 bases. El hueco resultante es luego, rellenado por la ADN polimerasa & (en asociación con RFC y PCNA) y sellado mediante una ligasa. -B1) Reparación acoplada a la transcripción: Esta es una alternativa a la reparación por escisión de nucleótidos, repara genes que son transcriptos activamente. Implica el reconocimiento de la ARN polimerasa detenida en una lesión de la hebra de ADN que se esta transcribiendo. En mamíferos las proteínas que reconocen la lesión son la CSA y CSB, luego del reconocimiento y de la detención de la ARN polimerasa, las CSA y CSB recluta XPA, RPA y TFIIH hacia la lesión del ADN y se produce una reparación por escisión de nucleótidos como se nombro anteriormente. -C) Reparación por desapareamiento/no complementaria: Este sistema barre al nuevo ADN replicado, si se encuentra una no complementariedad, las enzimas son capaces de reconocer, identificar y escindir la base no complementaria específicamente de la hebra de ADN recién replicada, permitiendo que se corrija el error y la secuencia original sea reemplazada. En mamíferos las enzimas que actúan uniéndose a la base no complementaria son MutS y MulT. D) SINTESIS DE LA TRANSLESION Los sistemas de reversión directa y la reparación por escisión, actúan para corregir daños del ADN antes de la replicación de dicha zona dañada ,para que la síntesis de ADN replicativo pueda proceder empleando una hebra de ADN no dañada como molde.Si sucede que estos mecanismos fallan la celula posee mecanismos alternativos para tratar el adn dañado en la horquilla de replicaion. Aquí actúan ADN polimerasas especializadas. Estas sustituyen a la ADN polimerasa normal que ha quedado detenida frente a una lesión del ADN. Son capaces de hacer proseguir la síntesis en el lugar de la lesión, y luego ser sustituidas nuevamente por una ADN polimerasa replicativa normal. Las ADN polimerasas especializadas tienen una baja fidelidad cuando copian ADN no dañado y carecen de la actividad correctora 3`--5` . E) REPARACION DE ROTURAS DE DOBLE HEBRA Esta variante de daños al ADN es una de las más peligrosas, ya que roturas en ambas hebras interrumpe la continuidad de dicha molécula. Son roturas que se producen de manera natural. Y no pueden repararse por los medios mencionado anteriormente donde se eliminaba el fragmento dañado y se volvía a producir la síntesis. En esta, se da un mecanismo especial denominado REPARACION RECOMBINATORIA, es muy simple y se vuelven a unir los extremos rotos de una sola molécula de ADN sin embargo esto puede dar una delecion de bases en la zona alterada es decir perdida de nucleótidos. Por otro lado, hay otro mecanismo especial que se denomina RECOMBINACION HOMOLOGA, en la cual se rompen y se vuelven a unir dos moléculas de ADN parentales, esto da la posibilidad de una reorganización de la información genética de los dos cromosomas parentales. Sucede que se rompen las dos hebras por la acción de nucleasas que digieren el ADN en sentido 5` a 3`, produciendo extremos 3` monocatenarios colgantes. Estas hebras únicas invaden la otra molécula parental mediante el emparejamiento de bases homologas. Por ultimo los huecos son rellenados por la síntesis reparadora, y las hebras se ligan para producir una molécula recombinante. En procariotas la proteína que actúa es la RecA y en eucariotas la RAD51 .Este tipo de reparación como bien dice su nombre permite mayor variabilidad genética. 3) REORGANIZACION DEL ADN La recombinación homologa mencionada anteriormente da lugar a la reorganización de genes entre pares de cromosomas sin alterar la disposición de los genes en el genoma. -Recombinación especifica de sitio: Se da entre secuencias específicas de ADN que contienen al menos un pequeño centro homologo, da lugar a reordenamientos programados del mismo, lo que puede jugar un papel importante en el desarrollo y regulación de la expresión genética. En los vertebrados, el desarrollo del sistema inmune reconoce las sustancias extrañas (antígenos) y proporciona protección frente a agentes infecciosos. Un ejemplo, son los linfocitos T y B. Los linfocitos B secretan anticuerpos (INMUNOGLOBULINAS) que reaccionan con antígenos solubles. Estas inmunoglobulinas consisten en pares de cadenas de nucleótidos pesadas y ligeras idénticas; estas cadenas están compuestas de regiones variables. Las regiones variables son responsables de la unión con e antígeno, y es la diversidad de las secuencias de los aminoácidos de las regiones variables las que permiten a los anticuerpos de un individuo reconocer a antígenos únicos. Cada linfocito B produce un solo tipo de anticuerpo. Los linfocitos T expresan proteínas de la división celular, que se denominan RECEPTORES DE CELULAS T, las cuales reaccionan con antígenos expresados en la superficie de otras células. Estos también están compuestos de dos cadenas, y cada una presenta regiones variables y constantes. La característica fundamentas de las inmunoglobulinas y de los receptores de las células T es su enorme diversidad, que permite que diferentes anticuerpos o moléculas receptoras de células T reconozcan una amplia gama de antígenos extraños. La recombinación especifica de sitio durante el desarrollo de los linfocitos conduce a la reorganización delgen en la que una sola región V se recombina con una sola región J para generar un gen de cadena ligera funcional. Esta recombinación se encuentra mediada por un complejo de proteínas RAG1 y RAG2; las cuales reconocen las secuencias de señal de recombinación adyacentes a las secuencias codificadoras de cada segmento, e inician las reorganizaciones de ADN introduciendo una rotura de doble hebra entre las secuencias RS y las secuencias codificantes. A continuación, se unen los extremos codificantes de los segmentos génicos para dar lugar a un gen reorganizado de inmunoglobulina o receptor de células T. Incluso se genera más diversidad gracias a dos procesos: RECOMBINACION DE CAMBIO DE CLASE, el cual resulta en la asociación de regiones reordenadas con diferentes regiones constantes de cadenas pesadas, generando la producción de anticuerpos con distintos papeles funcionales en la respuesta inmune. Ejemplo de esto son los distintos tipos de Inmunoglobulinas que encontramos en mamíferos: IgM, IgG, IgE, IgA. El otro proceso es HIPERMUTACION SOMATICA, el cual incrementa la diversidad de las inmunoglobulinas produciendo múltiples mutaciones dentro de las regiones variables reordenadas tanto de las cadenas ligeras como de las cadenas pesadas. A) AMPLIFICACION GENICA Es un tipo diferente de alteración en la estructura del genoma. Incrementa el número de copias de un gen dentro una célula. Es el resultado de la repetición de la replicación del ADN produciendo múltiples copias de una región en particular.La amplificación, es un proceso relativamente infrecuente que ocurre en tipos de células altamente especializadas, y ocurre también como un proceso anormal en las celular cancerígenas. Esta puede traer consecuencias beneficiosas o desfavorables para la célula o el organismo en el que tenga lugar.LEER COPPER pagina 127 a 129. Importante saber que que en la PCR aumentar la temperatura y disminuirla replaza a la accion de la ligasa y la ADN pol es remplazada por la ADN Taq que no se desnaturaliza como las demas enzimas ante el aumento de temperatura.Tambien el gen de interes se obtiene a partir del 3 ciclo ver video de youtube si no me acuerdo como es la PCR.Para leer la electrtoforesis voy a tener el control postivo y negativo averiguar para q sirven. Seminario de Integración Nº2: Ciclo celular, control de la proliferación celular y regulación de la muerte celular programada. Poblaciones celulares, proliferación celular, mantenimiento de los tejidos. Formas de estudio del ciclo celular: citometría de flujo. Índice mitótico La capacidad de autorreproducirse probablemente sea la característica fundamental de las células. Todas las células se reproducen mediante su división en dos, cada célula prenatal dando lugar a dos células hijas al final de cada ciclo de división celular. Estas células hijas a su vez pueden crecer y dividirse, dando lugar a una población celular. La división de todas las células ha de ser finalmente regulada y coordinada con el crecimiento celular y con la replicación del ADN, para asegurar la formación de una progenie de células que contengan sus genomas completos. La progresión de la maquinaria del ciclo celular es regulada por los factores de crecimiento que controlan la proliferación celular. Las alteraciones en la regulación son una causa frecuente de la proliferación anormal de las células cancerosas. El ciclo de la división de la mayoría de las células consiste en 4 procesos coordinados: crecimiento celular, replicación del ADN, distribución de los cromosomas duplicados de las células hijas y división celular. La progresión del ciclo celular está controlada mediante un sistema regulador conservado, que no solo coordina los diferentes procesos del ciclo celular sino que también acopla el ciclo celular con señales extracelulares que controlan la proliferación celular. Fases del ciclo celular: visto al microscopio, el ciclo celular se divide en 2 etapas: mitosis e interfase. La mitosis corresponde a la separación de los cromosomas hijos y termina, generalmente, en la división celular (citocinesis). Durante la interfase, los cromosomas se descondensan y se distribuyen por el núcleo, por lo que el núcleo representa un aspecto uniforme. El ADN solo se sintetiza durante la interfase, por ende esta síntesis divide el ciclo de las células eucariotas en 4 fases diferenciadas: M, G1, S y G2. El análisis del ciclo celular requiere que las células se identifiquen en las diferentes etapas indicadas anteriormente. Aunque las células mitóticas se pueden distinguir al microscopio, las células en las otras fases del ciclo celular se diferencian por su cantidad de ADN. Para ello, se utiliza la citometría de flujo, donde una población de células se marca con una tinción fluorescente que se une al ADN, pudiendo así medir la intensidad de la fluorescencia de las células individuales. Estos datos proporcionan la cantidad de ADN: la distribución muestra dos picos, que corresponden a las células con un contenido de ADN de 2n y de 4n; estas células están en G1 y G2/M. Las células en la fase S tienen una cantidad de ADN entre 2n y 4n y se distribuyen entre los dos picos. Las células animales en G1 son diploides (contienen dos copias de cada cromosoma), por lo que se dice que su cantidad de ADN de la célula es 2n. Durante la fase S, mediante la replicación se aumenta la cantidad de ADN de la célula de 2n a 4n, por lo que las células en fase S tendrán una cantidad de ADN entre 2n y 4n. El contenido de AND se mantiene en 4n en las células en G2 y en M, que se reduce a 2n tras la citocinesis. Osea que en G1 voy a tener 2n es decir 2x23 46 moleculas de ADN en G2 y M voy a tener 4n 4x23 osea 92 moleculas de ADN. Núcleo en contacto con Fase Membrana basal Mitosis (M) Luz, zona apical S Nada (en el medio) G1, G2 Regulación del ciclo celular: regulación de la síntesis, degradación y actividad de los complejos ciclinas-quinasas La progresión de las células a través del ciclo de división celular se regula por señales extracelulares del medio, así como por señales internas que supervisan y coordinan los diversos procesos que tienen lugar el ciclo celular. En los animales, la proliferación se regula en la fase G1 y G2. Concretamente, en G1 se denomina punto de restricción y en este caso, el paso de las células animales a través del ciclo celular se regula, principalmente, por factores de crecimiento extracelulares que son señales de proliferación celular. En presencia de los factores de crecimiento apropiados, las células a traviesan el punto de restricción y entran en la fase S. Por otro lado, si los factores de crecimiento adecuados no están disponibles en G1, la progresión a través del ciclo celular se para en el punto de restricción. La célula entra en un estado de reposo, denominado G0, en el que puede permanecer indefinidamente sin proliferar. Las células en G0 son metabólicamente activas aunque cesa su crecimiento y su ritmo de síntesis de las proteínas es menor. En cambio, cuando la regulación se da en G2, el ejemplo más característico de control del ciclo celular a esta altura lo proporcionan los oocitos. Estos pueden permanecer detenidos en G2 durante largos periodos de tiempo hasta que se activa su paso a la fase M, por la estimulación hormonal. De esta manera, las señales extracelulares pueden controlar la proliferación celular regulando el paso de las fases G2 a M así como de G1 a S. Por ende, estos mecanismos de control regulan la progresión del ciclo celular en respuesta al tamaño celular y a señales extracelulares. Existen por otro lado, reguladores de la progresión del ciclo celular. Estos son mecanismos moleculares que controlan la progresión de las células eucariotas a través del ciclo celular (estos conocimientos se deben a resultados obtenidos mediante experimentos). Factor promotor de la maduración (MPF): induce la entrada a la fase M del ciclo mitótico (regulador general del paso de G2 a M). Está compuesto por 2 subunidades fundamentales: Cdk y ciclina. Esta última es una proteína inductora de la mitosis ya que su acumulación y degradación periódica controla la entrada y la salida de la fase M. La transición de G2 a M se produce a continuación mediante la activación del complejo Cdk 1/ciclina B, y una vez activado este complejo la proteína quinasa Cdk fosforila varias proteínas que inician la fase M. La actividad de Cdk provoca la degradación de la ciclina, que se produce por una proteólisis mediada por ubiquitina. Esta destrucción proteolica de la ciclina inactiva a Cdk, lo que lleva a la célula a salir de mitosis, a sufrir citocinesis, y a volver a la interfase. (Apunte de mi carpeta): Las ciclinas son proteínas reguladoras de la duración de cada una de las etapas del ciclo. Van cambiando su síntesis y degradacion a medida que avanza en la etapa. Cuando aumenta la concentración de ciclina se unen a una proteína quinasa y se forma así el complejo proteico denominado factor promotor. Existen dos tipos de estos: FPS De G1 a S Ciclina E + proteína quinasa Cdk 2 La duplicación del ADN FPM De G2 a M Ciclina B+ proteína quinasa Cdk 1 La división celular. Ejemplo: en la profase la cromatina se condensa para pasar a ser cromosoma, para ello el FPM fosforila a una de las histonas y hace que se enrolle (indicio de que empieza la división celular). ACTIVIDAD DE CDK Se regula por lo menos por cuatro mecanismos el primer nivel de regulación implica la asociason de Cdk con las ciclinas correspondientes. Cdk 4 y Cdk 6 con ciclina D controlan el paso del punto de restriccion en G1. Cdk 2/ciclina E controlan el paso al final de G1 Se requiere `para el paso de G1 a S. Cdk 2/ciclina A se requiere para la progresion a traves de la fase S. Cdk 1/ciclina A regulan la progresion hasta G2. Cdk 1 /ciclina B se requiere para el paso de G2 a M. Dato Cdk1 es la unica quinasa que puede remplazar a las demas ,en cambio a ella no la remplaza nadie. Cuando los complejos se activan se prosigue con el ciclo. El segundo la activacion de complejos Cdk/ciclina requiere de la fosoforilacion de una residuo de trionina conservado alrededor de la posicion 160.Esta fosforilacion activa a Cdk y es llevada a cabo por CAK(Cdk 7 unida a ciclina h) El tercer mecanismo de regulacion de Cdk implica la desfoforilacion de tirosina 15,wee1 ya si estas se encuentran activadas inactivan a Cdk por ende debo desorillarla para activas Cdk. Tambien existen inhibidores de las Cdk como por ejemplo Ink inhibe a Cdk 4 y Cdk 6 de modo que inhibe la progresion en la fase G1.La familia Cip/Kip inhibe a Cdk 2 y eso inhibe la progresion a de G1 A S y S. Puntos de control del ciclo celular Los sucesos que tienen lugar durante las diferentes etapas del ciclo celular deben coordinarse entre sí de tal manera que ocurran en el orden adecuado, esta coordinación depende de un sistema llamado puntos de control, el cual previene la entrada en la siguiente fase del ciclo celular hasta que los eventos de la fase precedente hayan sido completados. Estos diversos puntos de control funcionan a lo largo del ciclo celular para asegurar que los genomas completos se transmitan a las células hijas. Los puntos de control de daños al ADN funcionan en las fases G1, G2 y S del ciclo celular, y garantizan que el ADN dañado no se replicara ni se transmitirá a las células hijas. - El punto de control de G2 impide el comienzo de la mitosis en tanto en cuanto la célula no haya completado la replicación o reparado las lesiones existentes. El ADN dañado activa una vía de señalización que da lugar a la detención del ciclo celular. - El punto de control de G1 hace posible la reparación de cualquier lesión en el ADN con anterioridad al inicio de la fase S, en la que tendría lugar la replicación del ADN dañado. Este punto asegura tanto la monitorización continua de la integridad del ADN para asegurar su reparación en caso de daño, como también representa a su vez un mecanismo de control de calidad que favorece la reparación de cualquier error. - El punto de control al final de la mitosis es muy importante ya que mantiene la integridad del genoma, ya que supervisa que los cromosomas se alineen de manera correcta en el huso mitótico. Esto asegura que se distribuya un juego completo de cromosomas a cada célula hija. La alineación incorrecta de uno o más cromosomas en el huso mitótico provoca que la mitosis se detenga en la metafase, antes de la segregación de los cromosomas recién replicados a los núcleos de sus células hijas. Gracias a este punto de control, los cromosomas no se segregan hasta que se disponga de un juego completo de cromosomas para ser distribuido a cada célula hija. -Disponibilidad de factores tróficos: lo estimulan (protooncogenes),estos son del tipo de regulación positiva hacen que el cilco siga -Limitación por contacto -Integridad del ADN: su alteración lo detiene (proteínas supresoras de tumores: retinoblastoma, p53, p21 son del tipo de regulacion negativa detienen el ciclo). Restringir la replicación del ADN una vez por ciclo celular: El punto de control de G2 impide la iniciación de la mitosis antes de la compleción de la fase S ,asegurando asi que el ADN replicado incompletamente no se tranmita a las células hijas.Tambien es importante asegurar que el genomas solo se replica una vez por ciclo celular.Las células de mamíferos emplean miles de orígenes para replicar su ADN,de modo que la iniciación de la replicación de cada uno de estos orígenes debe ser cuidadosamente controlada.El mecanismo que restringe la replicación del ADN una vez por ciclo implica la acción de una familia de proteínas denominadas MCM que se unen a los orígenes de replicación junto con las proteínas del complejo del origen de replicación.Dichas proteínas MCM solo son capaces de unirse a los orígenes de replicación durante G1,están inactivadas cuando se incorporan al ADN y solo se activan cuando la celula pasa a la fase S .Despues las proteínas MCM se alejan del origen y la replicación no puede volver a iniciarse hasta que la celula complete la mitosis y pase a la fase G1 ,del siguiente cilo celular. Regulación de los mecanismos moleculares de la división celular (fase M) En la fase M se produce la reorganización de casi todos los componentes de la célula. Durante la mitosis, los cromosomas se condensan, la envoltura nuclear de la mayoría de las células se desintegra, el citoesqueleto se reorganiza para formar el huso mitótico, y los cromosomas migran a polos opuestos. Tras la segregación (migracion) de los cromosomas se suele producir la división de la célula (citocinesis). Por ende, podemos decir que la mitosis se divide en 4 etapas: profase, metafase, anafase y telofase. Todos los procesos llevados a cabo en la mitosis son iniciados mediante la activación de la proteína quinasa Cdk 1 / ciclina B (MPF). En particular, las proteína-cinasas de las familias cinasas Aurora (A y B) y cinasas tipo Polo se activan coordinadamente con Cdk para señalizar el paso a la fase M. Estas actúa en un bucle de retroalimentación positiva: Cdk activa a las cinasas Aurora, que activan a las cinasas tipo Polo, que a su vez activan a la Cdk. Todas estas proteína-cinasas tienen múltiples funciones en la mitosis. Son responsables (junto con la activación de Cdk/ciclina B) de la condensación de la cromatina, rotura de la cubierta nuclear, fragmentación del aparato de Golgi, y reorganización de los microtúbulos para formar el huso mitótico. Descripcion de las profase,metafase,telofase y anafase: El comienzo de la profase queda determinado por la aparicion de los cromosomas condensados ,cada uno de los cuales esta constituidopor dos cromatides hermanas(las moleculas de ADN hija que se producieron en la fase S) que se mantienen unidas a traves del centromero que es una region cromosomica a la que se unen proteinas dando lugar al cinetocoro –el lugar de anclaje de los microtubulos del huso-.Ademas de la condensacion de los cromosomas durante la profase se producen cambios en el citoplasma que conducen ald esarollo del huso mitotico.Los centrosomas que se duplicaron en la interfase se separan y migran a lados opuestos del nucelo.En los eucariotas superiores el final de la profase corresponde con la rotura de la envoltura nuclear.Una vez terminada la profase,la celula entra en la prometafase (un periodo de transicion entre la profase y metafase ) donde los microtubulos del huso mitotico se anclan a los cinetocoros de los cromosomas condensados.Los cromosomas se alinean en la placa metafisica en la mitad del huso.Llegando a este punto la celula ha alcanzado la metafase.La mayoria de las celulas permanecen en metafase poco tiempo ,la transicion a anafase se produce por la rutura de la union entre las cromatides hermanas,las cuales se separan y migran a polos opuestos del huso. La mitosis finaliza con la telofase,durante la cual los nucleos se regeneran y los cromosomas se descondensan.La citocineses conmienza normalmente duran la anafase tardia y se completa al final de la telofase,dando lugar a dos celulas hijas en interfase. Pérdida del control del crecimiento normal. Mutaciones oncogénicas en los genes que codifican para las proteínas que promueven y que inhiben la proliferación celular (pérdida de control del ciclo celular) La principal alteración que causa el desarrollo del cáncer es la proliferación continua e incontrolada de células cancerosas. En vez de responder apropiadamente a las señales que controlan el comportamiento celular normal, las células cancerosas crecen y se dividen de manera incontrolada, invadiendo los tejidos y los órganos sanos y, finalmente, diseminándose por todo el cuerpo. La pérdida generalizada del control del crecimiento que muestran las células cancerosas es el resultado neto de la acumulación de alteraciones en múltiples sistemas reguladores de la célula, y se refleja en varios aspectos del comportamiento celular que diferencian a las células cancerosas de sus equivalentes sanas. Entonces, el crecimiento incontrolado de las células cancerosas se debe a la acumulación de alteraciones que afectan a muchos de los mecanismos de regulación celular. Esta relación se observa en muchos de los aspectos del comportamiento celular que diferencian a las células cancerosas de las células normales. Las células cancerosas manifiestan alteraciones en los mecanismos que regulan la proliferación, diferenciación y supervivencia celular normal. En conjunto, estas propiedades características de las células cancerosas permiten una descripción a nivel celular de carácter maligno. Diferencias entre las células cancerosas y las células normales en cultivo: - Las células normales muestran una inhibición de la proliferación dependiente de la densidad. Las normales proliferan hasta alcanzar una densidad celular determinada, en cambio las células tumorales siguen creciendo hasta alcanzar una densidad elevada de células en cultivo. - Las células normales muestran inhibición dependiente de la densidad e inhibición por contacto de su crecimiento y movilidad. Las células normales proliferan hasta que alcanzan una densidad celular finita, determinada por la presencia de factores de crecimiento en el medio de cultivo y por la inhibición resultante de los contactos con células adyacentes, y luego quedan detenidas en G0. En cambio la proliferación de la mayor parte de las células cancerosas no está restringida, como es normal, por la presencia de los factores de crecimiento ni por los contactos entre células. - En algunos casos, las células cancerosas producen factores de crecimiento que estimulan su propia proliferación. Esta producción anormal de un factor de crecimiento por parte de la célula conduce a la autoestimulación continua de la división celular (estimulación autocrina del crecimiento), por lo que las células cancerosas dependen en menor medida de los factores de crecimiento que provengan de otras fuentes fisiológicas normales. - La mayoría de las células cancerosas tiene menos capacidad de adhesión que las células normales, lo que es debido, generalmente, a una expresión reducida de las moléculas de adhesión de la superficie celular. - Las células transformadas en cancerosas suelen secretar proteasas(rompen enlaces peptidicos) que digieren los componentes de la matriz extracelular, lo que permite a las células cancerosas invadir los tejidos normales adyacentes. - La mayoria de las celulas diferenciadas o se dividen con muy poca frecuencia o no se dividen y las células cancerosas en vez de llevar a cabo su programa de diferenciación normal, se bloquean en un estado temprano de diferenciación,lo que concuerda con su proliferacion activa continua. - Muchas células cancerosas no sufren apoptosis, por lo que tienen ciclos vitales más largos en comparación con las células normales. Esta incapacidad de sufrir la muerte celular programada contribuye de una manera sustancial al desarrollo del tumor. Esto se da en parte debido a que las células cancerosas son resistentes a la radiación y a muchas drogas quimioterapéuticas, que actúan dañando el ADN. Por lo tanto ,la supervivencia celular anomala asi como la proliferacion celulas desempeñan un papel fundamental en el crecimiento incontrolable de las celulas cancerosas. Retrovirus: Tipo de virus que emplea el ARN como su material genético. Después de infectar una célula, un retrovirus emplea una enzima llamada transcriptasa inversa para convertir el ARN en ADN. Luego, el retrovirus integra su ADN en el ADN de la célula huésped, que le permite multiplicarse. El VIH, causante del SIDA, es un retrovirus. Los retrovirus causan cáncer en una diversidad de especies animales, incluyendo al humano. Los distintos retrovirus difieren de manera sustancial en su potencial oncogénico. La mayoría de los retrovirus solo contienen 3 genes que son necesarios para la replicación del virus, pero que no desempeñan ningún papel en la transformación celular.Este tipo de retrovirus raramente induce tumores como consecuencia de las mutaciones debidas a la integracion del ADN provirico dentro de los genes celulares-Sin embargo, otros retrovirus contienen genes específicos que inducen la transformación celular y son potentes carcinógenos. El prototipo de estos retrovirus altamente oncogénicos es el virus del sarcoma de Rous (RSV). Oncogenes: el cáncer se debe a las alteraciones en determinados genes reguladores que controlan la proliferación, la diferenciación y la supervivencia celular. Existen algunos genes específicos, denominados oncogenes, capaces de inducir la transformación celular. Sin embargo, la mayoría de los canceres humanos no son inducidos por virus y surgen debido a otras causas (radiación, carcinógenos químicos). Oncogenes retroviricos: la transformación celular puede ocurrir por RSV (virus del sarcoma de Rous) pero no por AVL (virus de la leucosis Aviar) que si bien esta emparentado con el anterior y se replica en las mismas celulas no induce la transformacion. Las células en ambos casos se infectan y se replican en los fibroblastos, pero solo el RSV induce la transformación celular. Esta diferencia en el potencial transformador sugería que el RSV podía contener información genética específica responsable de la transformación de las células infectadas. El RSV contiene información genética necesaria para la transformación pero no para la replicación del virus. Una característica inesperada de los oncogenes retroviricos es que no están involucrados en la replicacióndel virus y esto se debe ya que los oncogenes retroviricos derivan de genes similares de células normales.Se sugirio la hipotesis de que los oncogenes retroviricos procedian de genes de la celula huesped y que ocasionalmente este gen se incorporaba al genoma virico ,dando lugar a un nuevo virus altamente oncogenico como resultado de un porceso de recombinación virus-huesped. Proto-oncogenes: los genes de las células normales a partir de los cuales se originan los oncogenes retro víricos se denominan proto-oncogenes.Es decir que si estos genes se expresan e manera anormal o han mutado dan lugar a ser llamados oncogenes y inducen una proliferación anormal y el desarrollo del tumor. Son genes reguladores importantes ya que en muchos casos codifican proteínas que intervienen en las vías de las transducción de señales que controlan la proliferación celular normal. Los oncogenes son formas de sus correspondientes proto-oncogenes que se expresan de manera anormal o que han mutado. Debido a estas alteraciones, los oncogenes inducen una proliferación celular anormal y el desarrollo del tumor. Un gen que se incorpora en un genoma retrovirico difiere en varios aspectos de su correspondiente proto-oncogén. Genes supresores de tumores: a diferencia de los oncogenes, los genes supresores de tumores inhiben el desarrollo del tumor. El prototipo de un gen supresor de tumores es el Rb. La pérdida o la inactivación por mutación de Rb y de otros genes supresores de tumores, contribuye a que se desarrollen diversos tipos de cáncer en el hombre. Las proteínas codificadas por la mayoría de los genes supresores de tumores intervienen como inhibidores de la proliferación o de la supervivencia celular. Rb es un prototipo de gen supresosr de tumores que funciona como freno que realentiza la progresion del ciclo celular.Rb es forforilada por los complejos Cdk 4 ,6/ciclina D a medida que las celulas rebasan el punto de restriccion en G1,cuando es forforilada Rb se inactiva y se desune a E2F.E2F una vez disociado de Rb se une a secuencias diana y activa la transcripción de genes Muerte celular programada como destino celular (apoptosis), mecanismos moleculares y rol de las caspasas La muerte celular y la proliferación celular están equilibradas durante la vida de los organismos multicelulares. La mayoría de las muertes celulares en estos organismos ocurren como consecuencia de un proceso fisiológico normal de muerte celular programada. En los organismos adultos, la muerte celular debe estar equilibrada con la renovación celular, y la mayoría de los tejidos contienen células madre que son capaces de reemplazar las células que se han perdido. La muerte celular programada es estrechamente regulada de modo que el destino de las células individuales cumple las necesidades del organismo completo. La muerte celular es responsable del equilibrio entre proliferación celular y mantenimiento de números celulares constantes en los tejidos que sufren renovación ulular. Además, proporciona un mecanismo de defensa por el cual las células dañadas y potencialmente peligrosas pueden ser eliminadas por el bien del organismo. En contraste con la muerte accidental de las células que resulta de una lesión aguda (necrosis), la muerte celular programada es un proceso activo, que tiene lugar generalmente mediante una serie concreta de cambios celulares conocidos como apoptosis. Durante la apoptosis, el ADN cromosómico generalmente es fragmentado como resultado de la escisión entre nucleosomas. La cromatina se condensa y a continuación el núcleo se disgrega en pequeños fragmentos. Finalmente, la célula se encoge y se rompe en fragmentos envueltos de membrana denominada cuerpos apoptoticos. Las células que mueren por apoptosis son rápidamente retiradas de los tejidos, en cambio las células que mueren debido a necrosis como resultado de una lesión aguda se hinchan y se lisan, liberando su contenido al espacio extracelular y causando una inflamación. Luego de muchas investigaciones se llegó a la conclusión de que existen 3 genes que juegan papeles clave en la regulación y ejecución de la apoptosis: por un lado los genes Ced-3 y Ced-4, quienes si eran inactivados mediante una mutación, la muerte celular programada no tenía lugar. Y un tercer gen llamado Ced-9, quien actuaba como regulador negativo de la apoptosis. Si este era inactivado mediante una mutación, las células que normalmente sobrevivirían no lo hacían, sino que sufrían apoptosis. Por el contrario, si este gen era expresado a niveles muy elevados, la muerte celular programada normal no ocurría. La clonación molecular y la secuenciación nucleotidica del gen Ced-3 indicaron que codificaba una proteasa, proporcionando la primera señal sobre el mecanismo molecular de la apoptosis. Actualmente se sabe que Ced-3 es un prototipo de una familia conocida como caspasas. Estas son los últimos efectores o ejecutores de la muerte celular programada, desencadenando los procesos de la apoptosis mediante la escisión de más de 100 proteínas celulares diana diferentes. Las caspasas escinden ambas laminas nucleares, dando lugar a la fragmentación del núcleo, y las proteínas citoesqueléticas, desencadenando la desorganización del citoesqueleto, la vesiculizacion de la membrana y la fragmentación celular; y las proteínas de matriz del Golgi, lo que induce a la fragmentación de este aparato. Por ende, las caspasas son una familia de proteasas(rompe uniones fosfodiester) que son las efectoras de la apoptosis. Se clasifican como caspasas iniciadoras o efectoras, y ambas funcionan en una cascada que lleva hacia la muerte celular. En las células de mamífero, la principal caspasa iniciadora es activada en un complejo denominado apoptosoma. Regulador de la apoptosis: el tercer gen identificado como un regulador clave de la muerte celular programada, Ced-9, se encontró que estaba estrechamente relacionado con un gen mamífero denominado bcl-2, el cual inhibe la apoptosis. Ced-9 y bcl-2 eran por tanto similares en cuanto a función, y el papel de la bcl-2 como regulador de la apoptosis centro primero la atención sobre la importancia de la supervivencia celular en el desarrollo del cáncer. Meiosis Es un tipo de ciclo celular especializado que reduce el numero de cromosomas a la mitad dando lugar a células hijas haploides.Mientras que en las celulas somaticas realizan la mitosis para proliferar ,en las células germinales tiene lugar la meiosis para producir gametos haploides. Esta reduccion se realiza mediante dos rondas consecutivas de división nuclear y celular (denominadas meiosis I y meiosis II).La meiosis I comienza despues que finalice la fase S ,durante ella los cromosomas homologs primero se emparejan unos con otros y luego segregan a celulas hijas diferentes.Las cromatides hermanas permanecen unidas.Tras la meiosis I se produce la meiosis II ,que se asemeja a la mitosis en que la cromatides hermanas se separan y segregan a diferentes celulas hijas. La meiosis II da como resultado cuatro celulas hijas haploides. El apareamiento de los cromosomas homologos no solo subyace en la segregacion a los cromosomas en la meiosis,sino que permite la recombinacion entre loscromosomas de origen materno y paterno.Este emparejamiento tiene lugar en la profase de la meiosis I,que se divide en cinco etapas(leptoteno,zigoteno,pzquiteno,diploteno y diacinesis) en funcion de la morfologia cromosomica. La recombinacion se inicia por roturas de doble hebra que se inducen en la profase temprana meiotica(leptoteno) por la accion de una endonucleasa.La formacion de roturas de doble hebra lleva a la formacion de regiones de hebra sencilla que invaden un cromosoma homologo mediante el apareamiento de bases .La asociacion estrecha de los cromosomas homologos (sinapsis)comienza durante la etapa de zigoteno ,la recombinacionse completa en la etapa paquiteno permaneciendo los cromosomas unidos en lugares de sobrentrecruzamiento finalmente en la etapa de doploteno los cromosomas homologos se separan.Y en la diacinesis que es la etapa final que supone la transicion a la metafase es donde los cromosomas se condensan por completo. La union quiasma que mantiene unidos a los cromosomas homologos se rompe en la anafase I,y la union de los centromeros de las cromatides hermanas se rompe en la anfase II. Seminadio de Integracion Nº 3 Regulación de la expresión génica en eucariontes 1: regulación de la transcripción. Regulación prestranscripcional mediada por la remodelación de la cromatina: En el ADN de todas las células eucariticas se encuentra fuertemente unido a las histonas. La unidad estructural básica de la cromatina es el nucleosoma, que consiste en 147 pares de bases de ADN enrollado en torno a dos moléculas compuestas cada una por las histonas H2B, H2A,H3 Y H4, con una molécula de h1 que está unida al ADN donde entra a la partícula del nucleosoma. La cromatina se condensa enrollándose en estructuras de orden superior organizadas en grandes bucles de ADN. Consecuencia, la cromatina va a poseer cierta disponibilidad como molde para la transcripción. Es un punto crítico para la expresión génica en las células. La estructura de la cromatina puede verse alterada por modificaciones de las histonas y reorganización de los nucleosomas. Las histonas tienen dos dominios: un dominio plegado, que interviene en las interacciones con las histonas y en el enrollamiento del ADN alrededor del núcleo del nucleosoma, y un dominio o extremo amino-terminal. El extremo amino-terminal es rico en lisina y puede ser modificado por acetilación. La activación de la transcripción resulta directamente de la acetilación de las histonas. Las histonas no solo se modifican por acetilación, también pueden sufrir metilación de residuos de lisina y arginina y la adición de péptidos pequeños ( ubiquitina y SUMO) a los residuos de lisina. Estas modificaciones se asocian a combos de la actividad transcripcional aportando lugares de unión para otras proteínas que activan o reprimen la transcripción. La activación de transcripción se da cuando la estructura de la cromatina se relaja. Las histonas modificadas actúan como sitio de unión de proteínas que introducen cambios en otras histonas, las modificaciones de las histonas representa un mecanismo de herencia epigenetica. Los nucleosomas parentales se distribuyen entre las hebras hijas durante la replicación del ADN cromosómico. Las histonas modificadas pasan de los cromosomas paternales a los cromosomas hijos. Estas histonas modificadas pueden dirigir otras modificaciones similares de histonas recién sintetizadas, dando lugar al mantenimiento de un patrón de modificaciones de histonas característico de la cromatina activa o inactiva. Los factores remodeladores de la cromatina son complejos proteicos que aprovechan energía generada por hidrolisis de moléculas de atp para alterar los contactos del ADN con las histonas. Una de las funciones de los factores remodeladores es el desplazamiento de los octomeros de las histonas a lo largo de la molécula de ADN. Otra función, pueden inducir cambios conformacionales en los nucleosomas, pueden expulsar a las histonas del ADN dejando regiones libres de nucleosomas. Otros factores de la modificación de histonas, las enzimas modificadoras de histonas( ACETILTRANSFERASA Y METILTRANSFERASA) y factores remodeladores de la cromatina que desplazan temporalmente a los nucleosomas en el transcurso de la transcripción. Regulación de la transcripción por arn no codificantes La expresión génica puede regularse también por moléculas de arn reguladoras no codificantes, como moleculas pequeñas de arn de interferencia (ARNsi) y microARN(ARNmi). Suelen inhibir la traducción o inducir la degradación de ARNm homologos por medio de la interferencia de arn. Los ARNsi y los ARN no codificantes largos pueden regular la expresión génica a nivel de la transcripción. Los ARNsi reprimen la transcripción produciendo modificación en las histonas, provocando la condensación de la cromatina y formación de la heterocromatina. También dirigen la formación de los centrómeros. Los ARNsi se asocian con un complejo proteico denominado COMPLEJO SILENCIADOR DE LA TRANSCRIPCION INDUCIDO POR ARN(RISTS). El complejo RITS contiene proteínas que inducen la condensación de la cromatina y metilación de la lisina en histona h3, dando lugar a la formación de heterocromatina. Los ARN no codificantes largos ( más de 200 nucleótidos) son importantes en la expresión génica. Un ejemplo claro es el CROMOSOMA X contiene 1000 genes que no están presentes en el Y. RECORDEMOS QUE LA MUJER TIENE CROMOSOMA XX, EL VARON XY. El mecanismo de compensación de dosis por el que se inactiva la mayoría de los genes de uno de los cromosomas X de las células de las hembras mediante su conversión a heterocromatina en fases precoces del desarrollo. Por consiguiente, en la célula de las hembras y los machos solo hay una copia disponible para la transcripción de la mayoría de los genes situados en el cromosoma X. Los ARN no codificantes largos ( ARNinc) son reguladores de la expresión génica. Metilación del adn hay una adicion de grupos metilo en la posición del carbono-5. El adn es metilado específicamente en las citosinas(C), esta metilación se correlaciona con la represión transcripcional. la metilación del ADN representa el mecanismo mejor conocido de herencia epigenetica, los patrones de metilación del adn se mantienen de forma estable tras la replicación del ADN por acción de una enzima. Un gen metilado y reprimido en una célula parental continuara estándolo en las células hijas. Regulación de la transcripción mediado por factores de transcripción generales y específicos. La síntesis de ARN se realiza sobre un molde de ADN, denominado unidad transcripcional. Esta unidad transcripcional es el conjunto de todas las secuencias de ADN en un segmento determinado utilizadas en la transcripción. Comienza en el promotor (5´) y termina en la secuencia de finalización (3´). La unidad de transcripción esta constituida por elementos: 1)sitio promotor: es la secuencia de inicio de la transcripción. Es la región donde se abre las hebras de ADN. Esta constituido por varias regiones según el tipo de arn a sintetizar, ejemplo una región de control que es el sitio de unión de hormonas reguladoras( ej hormonas tiroideas), otro ejemplo región TATA BOX que es la secuencia de unión a los ARNpol. 2) exones: secuencias codificantes. 3) intrones: secuencias no codificantes. 4) AATAAA: sitio de terminación y de poliadenilacion. 5) para que comience la síntesis del arn deben actuar primero una serie de proteínas denominadas, factores de transcripción, estos interactúan con secuencias especificas presente en el sitio promotor, y en el regulado. 6) los factores de transcripción se dividen en especificios y basales; los específicos tienen afinidad por el represor y pueden activar o inhibir la síntesis del ARN; los basales tienen afinidad por el sitio promotor, siendo necesaria su presencia para que comience la síntesis. Para que comience la síntesis del ARN deben actuar primero una serie de proteínas denominadas factores de trascripción, estos interactúan con secuencias específicas presentes en el sitio promotor, y en el regulador. Los factores de trascripción se dividen en específicos y basales; los específicos tienen afinidad por el represor y pueden activar o inhibir la síntesis del ARN; los basales tienen afinidad por el sitio promotor, siendo necesaria su presencia para que comience la síntesis. Seminario de Integración Nº 4 Regulación Postranscripcional Maduración y renovación del ARN La maduración de ARNt y ARNr es similartanto en procariotas como en eucariotas. Los procariotas poseen tres ARNr equivalentes a los ARNr 28S, 18S y 5,8S de los eucariotas, los cuales provienen de un mismo pre-ARNr. El único ARNr eucariota de origen diferente es el ARNr5S. En ambos organismos los pre-ARN sufren escisiones para dar lugar a sus productos finales. En eucariotas, la maduración ocurre en el nucléolo y comienza con una escisión en el extremo 5’ del pre-ARNr común dando lugar a los tres ARNr nombrados anteriormente. También se agregan grupos metilo a las bases y residuos de azúcares de nucleótidos y se convierten algunas uridinas en pseudouridinas. En la maduración del ARNt, la ARNasaP (ribozima = enzima formada por ARN y no por proteínas) realiza una escisión en el extremo 5' de los pre-ARNt y se agrega una secuencia terminal CCA (sitio de unión para aminoácidos) al extremo 3' para formar el ARNt maduro. Esta secuencia CCA puede venir ya codificada en el ADN que dará lugar al ARNt como también puede ser agregada durante la maduración, como recién nombramos. También se altera el 10% de las bases del ARNt para dar lugar a nucleótidos modificados en posiciones específicas de este. *Algunos pre-ARNt y pre-ARNr pueden sufrir splicing. En procariotas, no hay una maduración del ARNm previa a la traducción sino que esta comienza cuando aún no ha terminado la transcripción (son simultáneas). En cambio, en eucariotas, el ARNm sintetizado es transportado al citoplasma desde el núcleo para ser utilizado como molde en la síntesis de proteínas. El dominio C-terminal (CTD) de la ARN polimerasa ll sirve como sitio de unión para moléculas involucradas en esta maduración. La maduración del ARNm en eucariotas sigue los siguientes pasos: 1) Se agrega, por adición de una molécula de GTP, una caperuza (nucleótido llamado 7- metil guanosina) al extremo 5' que estabiliza a los ARNm, los protege de las fosfatasas y los alinea en los ribosomas gracias a que es reconocida por la subunidad menor del ribosoma (40s). 2) Poliadenilación (NO ocurre en todos los ARNm, por ejemplo, en los ARNm de las histonas no ocurre): se sintetiza la secuencia AAUAAA que será reconocida por factores (entre estos, una endonucleasa) que cortan la cadena y por una Poli A polimerasa que añade una secuencia de nucleótidos de adenina conocida como “cola de Poli A”, que regula la traducción y estabiliza al ARNm según su longitud (mientras más larga, mejor), al extremo 3' y se degrada el ARN sintetizado por delante del punto de adición de Poli-A. 3) Splicing: a.- Corte del extremo 5’ del intrón, este extremo se une a un nucleótido de adenina (punto de ramificación) en el mismo intrón formando un bucle. b.- Corte en el extremo 3’ del intrón y empalme de exones. c.- Intrones son degradados por nucleasas. El splicing tiene lugar en los espliceosomas que son complejos compuestos de proteínas y ARN (ARNsn) que dan lugar a partículas de ribonucleoproteínas nucleares (RNPsn -> U1, U2 etc.). -Formación spliceosomas: RNPsn U1 se une al sitio de corte 5’ y U2 al punto de ramificación. Se incorpora el complejo U4-U6 y U5, el cual se une corriente arriba del sitio de corte 5’, U4-U6 se separan y se desplaza U1 y U4, U6 se une con U2 formando la estructura de lazo y U5 se une al sitio de corte 3’. *Algunos ARN son capaces de autoempalmarse, es decir, de eliminar sus propios intrones sin necesidad de otras proteínas o ARN; el mismo intrón actúa como ribozima para dirigir su escisión. -Splicing alternativo: Como los pre-ARNm contienen múltiples intrones, se pueden producir diferentes ARNm maduros partiendo de un mismo pre-ARNm combinando los sitios de corte (combinando exones). Este proceso está controlado por activadores que reclutan factores de corte y empalme a sitios específicos. Los activadores más conocidos son las proteínas SR. Casi todos los genes humanos se someten a estos cortes y empalmes alternativos. Un ejemplo son las neuronas. -Transporte ARN: La salida de ARN desde el núcleo es un proceso selectivo mediado por receptores de transporte que interactúan con el complejo de poro nuclear (CPN) y los ARN se transportan en forma de complejos de ribonucleoproteínas (RNP). Las importinas y exportinas transportan la mayoría de los ARNt, ARNr y ARNmi y los precursores de ARNt y ARNmi son transportados mediante exportinas que se unen directamente a estos. Los pre-ARNm se asocian a 20 o más proteínas durante su procesamiento y transporte, el cual está mediado por un complejo exportador de ARNm diferenciado que se une a los pre-ARNm en el núcleo cuando finaliza la maduración de estos. La dirección de este transporte se establece por una ARN-Helicasa situada en el CPN que remodela al complejo ARNm/exportador para liberar al ARNm al citoplasma. Otros ARN pequeños (ARNsn y ARNsno) se transportan al citoplasma mediante Crm1 para asociarse con proteínas y formar RNPsn funcionales para regresar al núcleo. Regulación de la traducción La regulación puede controlarse mediante proteínas represoras y micro ARN (ARNmi) no codificantes, además de estar moderada en respuesta al estrés celular, la disponibilidad de nutrientes y la estimulación por factores de crecimiento. Las proteínas represoras se unen a secuencias específicas de ARNm para bloquear su traducción. Un ejemplo es la síntesis de ferritina cuya traducción está regulada por la cantidad de hierro (mientras más hierro haya, más ferritina se sintetizará ya que la presencia de hierro inhibe la acción de las proteínas represoras a unirse a la secuencia, dando por resultado la traducción). La traducción también puede ser regulada por proteínas que se unen a secuencias de la región 3’ no traducidas de algún ARNm. Estas proteínas represoras se unen al factor de iniciación eIF4E interfiriendo en la interacción de este con eIF4G, inhibiendo la traducción. Estas proteínas son responsables de la localización del ARNm en regiones específicas de la célula lo que es importante ya que las proteínas que se traducen son sintetizadas una vez que el ARNm se encuentra localizado adecuadamente. Existe una regulación vía interferencia de ARN (iARN) mediada por moléculas pequeñas de ARN bicatenarias que 1) inducen la formación de heterocromatina, 2) inhiben la traducción y 3) inducen la degradación de ARNm. Los dos ARN principales en este proceso son el ARN de interferencia pequeños (ARNsi) y el microARN (ARNmi), ambos de distinto origen: el primero se origina por escisión de un ARN largo a partir de nucleasas Dicer y el segundo es, en primer lugar, transcrito por la ARN polimerasa ll y luego sufre escisiones por parte de Dicer y Drosha para llegar a ARNmi. Ambos ARN se incorporan a un complejo de silenciamiento RISC y lo dirigen hacia los ARNm complementarios para ser degradados. Luego es esta degradación, el complejo se separa y es reciclado para ser utilizado en otro ciclo de degradación. Otro mecanismo de regulación a nivel traduccional es a nivel de factores de iniciación como eIF-2 y eIF-4E: -El complejo eIF-2/GTP se une al metionil ARNt iniciador para dirigirlo hacia el ribosoma y se genera una hidrólisis de GTP que lleva a la liberación de un complejo eIF-2/GDP que puede ser reutilizado en otro ciclo si se sustituye GDP por GTP. -Los factores de crecimiento que estimulan la síntesis de proteínas activan quinasas que fosforilan a proteínas reguladoras que se unen a eIF-4E. Sin estos factores de crecimiento, la unión de proteínas SIN FOSFORILAR inhiben la traducción. En el caso de ARN, se puede introducir directamente una cadena antisentido o introducir ADN diseñado para expresarlo. Regulación de la estabilidad de los ARNs : degradación del ARN La mayoría de las secuencias transcritas a partir de pre-ARNm son degradas al interior del núcleo, esto porque el 90% de las secuencias son intrones inservibles para el ARNm maduro. La enzima responsablereconoce el enlace 2’-5’ formado en el punto de ramificación (adenina en el intrón) y otras involucradas reconocen extremos de ARN degradándolo en cualquier dirección : al realizar splicing, quedan los exones empalmados entre sí y protegidos de esta degradación por ambos extremos gracias a la caperuza y a la cola de Poli A agregados anteriormente a los extremos 5’ y 3’, respectivamente. Los intrones, en cambio, quedan desprotegidos y, por ende, son degradados. La célula, además, posee un sistema de control de calidad que detecta y degrada ARNm erróneos, lo que previene la mala síntesis de proteínas y posteriores mutaciones. Un ejemplo de este sistema es el « decaimiento de ARNm mediado sin sentido » que provoca la degradación de ARNm que carecen de marcos completos de lectura abierta (región entre codones de inicio y terminación). Esto ocurre durante la traducción (en el citoplasma) y comienza una vez que los ribosomas detectan codones de terminación prematuros. Los ARNt y ARNr son estables, a diferencia de los ARNm que pueden vivir entre 30 minutos a 20 horas. Los más inestables suelen codificar proteínas reguladoras y los más estables proteínas estructurales. Los ARNm contienen secuencias ricas en AU cerca de sus extremos 3’ que pueden servir como sitios de unión a proteínas para ser estabilizados, o bien para ser marcados y posteriormente degradados. La degradación en el citoplasma de la mayoría de los ARNm comienza con el acortamiento de sus colas de Poli A para proseguir con la degradación de este ARNm, por parte de nucleasas, desde el extremo 3’. Regulación de la función de las proteína -Regulación por pequeñas moléculas : La mayoría de las enzimas son reguladas por cambios en su conformación (mediante la unión de moléculas como aminoácidos o nucleótidos) que modifican su actividad. A esto le llamamos regulación alostérica y un ejemplo sería la retroalimentación negativa, feed-back o retroinhibición, donde el producto final se une a un sitio de la enzima distinto del sitio activo modificando su conformación y, por lo tanto, afectando a este sitio. -Forforilación de proteínas : Catalizada por proteínas quinasas que transfieren un grupo fosfato proveniente del ATP a un grupo hidroxilo de la cadena lateral de serina, treonina o tirosina. Esta fosforilación se revierte gracias a enzimas fosfatasas que catalizan la hidrólisis de un grupo fosfato de un aminoácido fosforilado. Tanto quinasas como fosfatasas son específicas para serina-treonina y para tirosina, aunque algunas fosfatasas reconocen cualquiera de los tres fosfoaminoácidos. En general, las quinasas actúan como cadena, una sobre otra. Es decir, una quinasa A fosforila una quinasa B que, a su vez, fosforila una C, y así sucesivamente. -Interacciones proteína-proteína: La unión de una molécula reguladora a la proteína altera su conformación mediante cambios en las interacciones entre sus subunidades (polipéptidos que pueden ser iguales o distintos en una misma proteína), es decir, en las uniones peptídicas. Ejemplo : proteína quinasa dependiente de AMPc está constituída por dos subunidades reguladoras y dos catalíticas, siendo la actividad de estas últimas inhibida por las primeras, por lo cual la proteína se encuentra inactiva. Esta se activa al unirse a AMPc mediante sus subunidades reguladoras generándose un cambio conformacional de la proteína que disocia al complejo : ahora las dos subunidades catalíticas son libres y están activas. El AMPc actúa entonces como regulador alostérico que altera interacciones proteína- proteína. Regulación de la vida media de las proteínas La vida media de una proteína varía desde pocos minutos a varios días. -Vía de la ubiquitina-proteasoma : Las proteínas quedan marcadas para su degradación por proteasomas mediante la unión de ubiquitina al grupo amino de la cadena lateral de lisina. Estas ubiquitinas son recicladas para utilizarse en un nuevo ciclo. El proceso es el siguiente : 1) Ubiquitina activada por la unión a E1 (enzima activadora). 2) Ubiquitina es transferida a E2 (enzima conjugante). 3) E3 (enzima ligasa) transfiere a ubiquitina a la proteína diana. Distintos miembros de la familia de E3 reconocen distintos sustratos de proteínas : son responsables del reconocimiento selectivo. *La estabilidad de algunas proteínas depende de su capacidad para ubiquitinarse. -Proteólisis lisosómica : Proteínas entran por endocitosis en los lisosomas, los cuales albergan enzimas digestivas (incluyendo proteasas) que degradan a estas proteínas. Autofagia : se forman vesículas que capturan a las proteínas y se fusionan con los lisosomas (proceso NO selectivo). Esto es responde según la disponibilidad de nutrientes en la célula ; bajo ausencia de nutrientes, se degradan proteínas no esenciales y organelas para ser reutilizados sus componentes. TECNICAS: SEMINARIO 5 OBJETIVO DE LAS TECNICAS: cuantificar la expresión de una determina proteína o de ARN, si se expresa (sus niveles de expresión) o no. Determinar la localización en un compartimiento celular especifico, también puedo saber si una proteína se expresa homogéneamente en un tejido. Para comprender: Inmunoglobinas: proteínas producidas específicamente por un subgrupo de células del sistema inmune que participan en un proceso inmunitario conocido como “Respuesta inmunitaria” Un grupo de células del sistema inmune posee en su membrana proteínas denominadas inmunoglobulinas o anticuerpos que pueden reconocer ciertas macromoléculas que pueden estar presentes en bacterias. Este reconocimiento especifico se produce porque el sistema inmune a lo largo de nuestra maduración, genera millones de clones diferentes de inmunoproteina que difieren los unos de los otros levemente en cuál es el motivo molecular que reconocen sus anticuerpos y que en función desea maduración prácticamente cualquier macromolecula exógena que entre en nuestro organismo será reconocida por un subgrupo particular de linfocitos B que tendrán anticuerpos que puedan unirse a esa macromolecula. (Por mas que sea la primera vez que esa molecula entre a nustro cuerpo) Diverso reconocimiento de moléculas, es un proceso genético denominado “RECOMBINACION SOMATICA” Es decir, en los anticuerpos al tener esta capacidad de reconocer específicamente otras proteínas, puede ser utilizado como una herramienta para identificar una proteína que sea de interés Entonces ¿cómo genero anticuerpos para estudiar una proteína que es de interés? ESTRUCTURA ANTICUERPOS: 4 cadenas polipeptidicas 2 cadenas “pesadas” internas 2 cadenas “livianas” externas Todos los AA producidos por un individuo son iguales en las cadenas pesadas: FRACCION CRISTALIZADA. REGION VARIABLE de un clon de llifoncito B: se halla en los otros extremos de la molécula, compuestos por N terminal de la cadena pesada y la cadena liviana: Permite el reconocimiento de esa proteína exógena “antígeno” La proteína de interés probablemente tenga distintos sitios estructurales y cada uno de ellos reconocidos por diversos Linfocitos B y esta particularidad de que una proteína tenga distintas superficies que puedan ser reconocidas por distintos clones de linfocitos B y pueda generarse una diversidad de anticuerpos que reconozcan distintos sectores de esta proteína: “Anticuerpos policlonales” provienen de distintos clones de linfocitos B y cada uno de ellos reconociendo una superficie tridimensional diferente de la misma proteína. A cada una de estas superficies diferentes que fueron reconocidas por este anticuerpo la denominamos Epitopes (motivos estructurales) A.C Monoclonares: Reconocen únicamente un único etipote de la proteína de interés. Anticuerpos derivados de una única línea de células de LB y solo reconocen un etipote del Antigeno. ANTICUERPOS… Celulas productoras de anticuerpos + células del cuerpo, generanHIBRIDOMAS (hibrido celular) heredan de las células productoras de AA la capacidad de de generar AA específicos y heredan de las células tumorales su amplia capacidad mitótica Técnicas 1. Inmunofluorescencia/ Inmunohistoquimica Técnica que utiliza anticuerpos. Permite determinar la localización de determinadas proteínas en un tejido o población celular. Puede aplicarse como: DIRECTA: Utilizar AA que reconozcan una proteína de interés. Para ser observable ese reconocimiento se ha unido al AA, a la fracción cristalizante, moléculas de fluorofenos (moléculas portadoras de florescencia), al ser iluminadas por una determinada longitud de onda pueden emitir fluorescencia. En vez de fluorofenos en la fracción cristlizante, colocamos una enzima capaz de generar un producto coloreado natural cuando se le agrega un sustrato incoloro(INMUNOHISTO) INDIRECTA: Anticuerpo que reconoce nuestra proteína de interés. Ese AA lo llamamos “PRIMARIO” NO tendrá en si mismo conjugado en si mismo el Fluorgeno o la enzima, se utilizara un AA SECUNDARIO que reconoce la F.C del anticuerpo PRIMARIO El aa Secundario (policlonales) tiene unido de manera directa el F o La E. A un único AA Primario se unen varios AA secundarios, en promedio entre 5 y 10 AA secundarios pueden unirse a la FC de un mismo AA Primario. Por cada proteína de interés, yo tendré asociado mucho más Fluorofeno que en el caso de la manera DIRECTA. En contraste con la DIRECTA, nos da mayor sensibilidad, es decir como concentra mayor cantidad de florescencia puede “Operar” mas fácilmente Podemos determinar la localización intracelular de 2 proteinas, pero también la localización puede referirse a un subconjunto de células en un determinado tejido Para comparar: se lo puede relativizar al área o al numero de células todas. El numero de células coloreadas es el dato principal. 2. Fracción subcelular: Objetivo: Obtener fracciones puras de un determinado componente celular ETAPA I: Ruptura mecánica del tejido (hay diversas rupturas mecánicas) para poder generar una solución en un medio isotomico, que no haga que las células exploten por diferencias de presión osmótica, si no que la ruptura este dada por estas fuerzas Se genera una solución HOMOGENATO. Hay derivados celulares de: Núcleos, mitocondrias, ribosomas, sector soluble de la célula (citosol), microsomas (pequeñas vesículas membranosas) ETAPA II: Centrifugación: Estrategia para separar los diversos componentes. Va a permitir que diversas partículas precipiten hacia el fondo del tubo. Al aplicar esto estamos logrando que aumente mediante la aceleración centrifuga la fuerzas gravitatorias efectiva de estas partículas. Mayor sea la densidad de las partículas más fácil será el poder precipitar hacia el fondo del tubo mediante aumente estas fuerzas gravitatorias. Secuencias cada vez más veloces por más tiempo. En cada una de estas centrifugaciones el HOMOGENATO se divide en 2 pares: aquellos componentes que van hacia el fondo (“Pellet”) y aquello que quedo en suspensión (“sobrenadante”) Voy pasando el sobrenadante hacia el siguiente tubo.. y realizo una nueva centrifugación, a más tiempo y a más velocidad. Tiene que ver fundamentalmente con la densidad. Como se evalúa si un fraccionamiento ha tenido éxito? Delimir una enzima marcadora, una enzima que tenga una localización subcelular particular, y determinar en cuál de esas fracciones esta presente la actividad enzimática de la enzima marcadora. Por ejemplo la enzima citocromo oxidasa tiene lugar solo en las mitocondrias, o la glucosa G fosforilasa tiene lugar en los microsomas. Si observo citocromo oxidasa en el núcleo mi región del núcleo está contaminada con mitocondrias. (Función alternativa de la comprobación del tejido) 3. Western Blot. Técnica que utilizara anticuerpos para determinar la presencia de una proteína de interés. Nos va a permitir determinar la presencia o niveles de expresión de una proteína en particular en una fracción subcelular u homogenato 1era etapa: separación por tamaño Todas las proteínas que están presentes en una molécula van a ser separadas de acuerdo a su tamaño. Se logra mediante una electroforesis en gel, utilizara la presencia de un campo eléctrico para permitir la migración de ciertas moléculas esto implica que las únicas moléculas que podrán migrar serán aquellas que tenga una carga eléctrica (ya que migraran por atracción o repulsión a un polo positivo o negativo) La técnica comienza con tratar a la muestra biológica con un detergente denominado “SDS” (..Sulfato de sodio). Este tiene una carga eléctrica negativa que puede unirse en altas concentraciones, puede rodear la superficie de todas las cargas polipeptidicas. Todas las proteínas se desnaturalizan por acción del gel y pierden su estructura axial y además quedan recubiertas por las moléculas de SDS, es decir, quedan rodeadas de cargas negativas. Esto las hará apropiadas a todas las moléculas de poder migrar hacia el polo contrario Esta migración de las moléculas se da en un gel (constituido por una fuerte red de fibras, componentes del gel) las moléculas que van a migrar tienen que atravesar una serie de diversos poros. Esto implica una dificultad mayor para migrar a aquellas moléculas más grandes. Los péptidos más pequeños migran más al mismo tiempo que las moléculas grandes migraran menos. 2da etapa: transferencia a un soporte sólido Todas las proteínas que estaban separadas según su tamaño en el gen, transferirlas en ese formato ordenado a una membrana más resistente. Y una vez que la tenemos en esa membrana resistente vamos a intentar determinar la presencia o ausencia de la proteína de interés incumbando esta membrana con AA específicos que permitan unirse a esa proteína de interés, si es que esta. 3era etapa: visualización mediante la marcación de proteínas con el uso de anticuerpos primarios o secundarios apropiados LEER WB: Poner la misma cantidad del producto que pueda tener nuestra proteína de interés. Para comprobar que pusimos la misma cantidad podemos hacer un WB para una proteína estructural, por ejemplo la actina, la intensidad nos diría si hemos puesto la misma cantidad total del producto. Podemos tener AA que no reconozcan la proteína de interés. Un AA que no sea especifico implica que reconoce un etipote de nuestra proteína que es lo suficientemente similar al etipote de otras proteínas diferentes que también van a ser reconocidas por ese mismo AA. El problema frecuente son los AA primarios. 4. PCR PUNTO FINAL. CONVENCIONAL (más que nada para entender la diferencia con la pcr en tiempo real) Objetivo: Permite la amplificación de un fragmento de ADN en una reacción in vitro. Como consecuencia de la aplicación de esta técnica pueden generarse millones de copias del fragmento de ADN amplificado a partir de un número muy bajo de copias iniciales. Permite generar un diagnóstico https://es.wikipedia.org/wiki/Anticuerpo temprano de algunas enfermedades. Es un aumento especifico del sector del ADN que quiero obtener, un segmento especifico. La PCR es específica. -Necesito: ADN primer especifico de la secuencia de nucleótidos que queremos reproducir (ARN primer no porque se desnaturaliza por la temperatura), ADN-TACpolimeraza (obtenida de una bacteria habitante de aguas termales) con característica termoestable, termocicladoras (maquinas), agua, magnesio, cadena de ADN molde completa y nucleótidos trifosfatados. Tambien necesito un Buffer porque otorga condiciones salimas para el funcionamiento de la enzima. El magnecio cataliza la estabilidad de la reacion y co-factor de la TAC -Funcionamiento: Coloco la molécula de ADN en la termocicladora a temperatura normal. Selecciono un primer de ADN específico para la secuencia de nucleótidos donde quiero que comience a sintetizar la ADN- TAC polimerasa la cadena complementaria de nucleótidos.
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