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Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 1 BIOSEGURIDAD Es la aplicación de conocimientos, técnicas y equipamientos para proteger a personas, laboratorios, áreas hospitalarias y medio ambiente de la exposición a agentes potencialmente infecciosos o considerados de riesgo biológico. El centro para el control y prevención de enfermedades (CDC) de los Estados Unidos, específica cuatro niveles de bioseguridad para el manejo de agentes biológicos, los cuales son conocidos como Niveles de bioseguridad del 1 al 4. • GRUPO 1: riesgo individual y poblacional escaso o nulo Bacillos cereus, E. coli K12, Lactobacillus acidophilus, Virus Distemper (moquillo) canino. Pocas probabilidades de provocar enfermedades en el hombre. • GRUPO 2: riesgo individual moderado, riesgo poblacional bajo Clostridium spp., Listeria monocytogenes, virus sarampión, virus hepatitis, Salmonella typhi. Enfermedades del hombre, de bajo riesgo para el personal de laboratorio, en las que existe medidas terapéuticas y preventivas eficaces. • GRUPO 3: M. tuberculosis, Brucella spp., Rickettsia spp., Virus rabia. Riesgo individual elevado, riesgo poblacional bajo existen medidas terapéuticas y preventivas eficaces. • GRUPO 4: virus de la fiebre aftosa, virus Machupo. Riesgo individual y poblacional elevado, no existen medidas terapéuticas ni preventivas eficaces. En Argentina, solo hay un laboratorio nivel 4, el laboratorio de Senasa. http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 2 CONTROL DEL DESARROLLO MICROBIANO Conceptos claves para la vida general ESTERILIZACIÓN: proceso por el que se alcanza la muerte de todas las formas de vida microbianas, incluyendo bacterias y sus formas esporuladas altamente resistentes. Se realiza por métodos físicos y químicos. Físicos: • Incineración, el material se quema. eliminación de desechos infecciosos. • Calor húmedo, autoclave objetos resistentes al calor. Quedan 30min a 121°C a 1atm.Calor seco, estufa, materiales que se dañarían en una autoclave (pueden ser materiales inertes o biológicos). Quedan 1-3horas a 160-180°C • Radiación gamma (i), radiación de corta longitud de onda y alta energía (material desechable) • Radiación UV (n.i) NO ionizante de bajo poder de penetracion, superficies. • Filtración, pasaje de substancias por membranas. Químicos: Óxido de etileno, H2O2 vaporizado (plasma gaseoso), Glutaraldehído, Formaldehído. DESINFECCIÓN: es el proceso por el cual los microorganismos patógenos son destruidos a excepción de las esporas. Se realiza por métodos físicos y químicos. Físicos • Ebullición (100ºC x 30 min) • Pasteurización (leche) que puede ser 65ºC 30 min o 72ºC 15 seg. y luego enfriamiento rápido a 10ºC • Radiación UV Químicos • ALTO PODER: Son esterilizantes (destruyen las esporas), actúan modificando de forma irreversible grupos funcionales de proteínas y ácidos nucleicos - Glutaraldehido 2%, peróxido de hidrogeno (3-25%), Formaldehido 8% • MEDIO PODER: Elimina M.TBC, hongos y virus no lipídicos. NO elimina las esporas. están los Clorogenos y los yodoformos (iodo y alcohol iodado) que son oxidantes: actúan a nivel de proteínas y ácidos nucleicos y los alcoholes y fenoles que actúan a nivel de la membrana plasmática. • BAJO PODER: Compuestos de amonio cuaternario, anfóteros (detergentes) y las sales de plata que son agentes catiónicos, y actúan sobre la membrana plasmática. La selección del agente desinfectante depende del tipo de objeto a desinfectar CRÍTICOS - catéteres, agujas hipodérmicas, equipos de hemodiálisis SEMICRÍTICOS - termómetros (de uso rectal y oral), fibroscopios, tubos endotraqueales, broncoscopios http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 3 NO CRITÍCOS - Estetoscopios, máscaras faciales y humidificadores ANTISEPSIA: es el proceso que, por su baja toxicidad, se utiliza para la destrucción de microorganismos presentes sobre la superficie cutaneomucosa. Se realiza por métodos químicos. Un antiséptico se recomienda para: • Disminuir la colonización por gérmenes • Preparar la piel para procedimientos invasivos • Atender pacientes inmunosuprimidos • Lavado quirúrgico de manos • Preparación prequirúrgica de la piel • Luego de manipular material contaminado • Prevenir infecciones intrahospitalarias (IIH) Antisépticos en uso • Alcohol 70% • Clorhexidina 2% • Povidona Yodada 10% • triclosán 0,5% http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 4 DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO El diagnóstico microbiológico se basa en un conjunto de procedimientos que permiten identificar la causa (etiología) de una enfermedad infecciosa. Es importante entender que, aunque el laboratorio de microbiología clinica desempeña un papel importante en el diagnóstico y el control de las enfermedades infecciosas, la capacidad del laboratorio de detección del patógeno está vinculada a la calidad de la muestra recogida en el paciente, el medio de transporte de la muestra al laboratorio y las técnicas ultilizaas para demostrar la presencia del microorganismo. Incluso los protocolos diagnósticos más sofisticados carecen de valor cuando la muestra recogida no es representativa del foco de la infección. Muchas muestras enviadas a los laboratorios para su análisis estan mal tomadas o se contaminan durante el proceso de recogida con microorganismos que colonizan la piel y mucosas. Una muestra contaminada implica perdida de materiales del laboratorio, una nueva toma de muestra y demora en el tratamiento del paciente. Por eso al tomar una muestra tenemos que tener en cuenta, como tomarla, como mandarla al laboratorio, que estamos buscando a fin de indicar los medios de cultivo o pruebas que tenemos que pedir para que el laboratorio pueda saber cómo proceder. DIAGNOSTICO Es el conjunto de procedimientos que se toma desde el momento que entra el paciente. Incluye anamnesis y evaluación clínica: Epidemiología, signos y síntomas, análisis clínicos, diagnóstico por imágenes, diagnóstico presuntivo y microbiológico de certeza. DIAGNOSTICO EM MICROBIOLOGIA Se divide en MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DIRECTO Son procedimientos que implican la demostración directa de un agente (presencia) o sus distintos componentes en las muestras clínicas de un paciente. Puede ser la visualización del microorganismo, de antígenos o aun del efecto citopático. Y MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO INDIRECTO Permiten demostrar que el agente ha tomado contacto con el sistema inmune del individuo. Es una “huella” que indica que el patógeno está o estuvo presente en algún momento. No necesariamente demuestra que el paciente está infectado, si no que tuvo contacto con el patógeno. http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 5 PROPIEDADES DE LAS PRUEBAS DX - ESTADISTICA VALOR DE LOS RESULTADOS Cuando hablamos de pruebas diagnóstico, describimos características de las pruebas como SENSIBILIDAD, ESPECIFICIDAD, VALOR PREDICTIVO POSITIVO, VALOR PREDICTIVO NEGATIVO. Conocer estas características nos permite saber en qué momento las usamos, la probabilidad que el resultado de la prueba diagnóstica sea positivo. VERDADERO POSITIVO - Condición presente y se diagnostica el paciente como enfermo. VERDADERO NEGATIVO - La condición no está presente y se diagnostica el paciente como sano FALSO NEGATIVO - La condición está presente y se diagnostica el paciente como sano FALSO POSITIVO - El paciente no presenta la enfermedad y se diagnostica como enfermo VALOR PREDICTIVO POSITIVO = A / (A + B)- Cantidad de individuos que tienen la enfermedad/ condición y presentan la prueba positiva VALOR PREDICTIVO NEGATIVO = D / (C + D) - proporción de sujetos con la prueba negativa que no presentan la enfermedad/condición SENSIBILIDAD = A / (A + C) http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 6 - Es la capacidad que tiene una prueba diagnóstica para detectar los que tienen la condición/patologia. Es la proporción de individuos enfermos que poseen una prueba positiva. ESPECIFICIDAD = D / (B + D) - La capacidad que tiene una prueba para detectar los que no tienen la condición/patologia. PREVALENCIA Número de infectados y enfermos (VP) en una población ¿Qué me dicen estos resultados? Podemos inferir que la Sensibilidad y la especificidad representan la validez de una prueba diagnóstica y que el VPP y el VPN representan la seguridad de una prueba diagnóstica. - PRUEBAS DE TAMIZAJE (SCREENING) Son pruebas rápidas, de bajo costo, que puede ser aplicadas a toda, o gran parte de la población de forma rápida. NO necesitan mucho entrenamiento o conocimiento para realizarlas. Baja especificidad - EVALUACIÓN COMPLETA Se evalúa todo el paciente, historia, historia clínica, resultados de laboratorio nuevos y antiguos para llegar una diagnóstico correcto, de certeza. Se demanda mucha energia, mucho tiempo y profesionales altamente entrenados. http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 7 DIAGNOSTICO BACTERIANO • DIRECTO Veo el microorganismo (la bacteria) o Observo al microscopio optico o Cultivo o antígenos o Genoma bacteriano • INDIRECTO (detección de Anticuerpos séricos específicos) o Por Inmunofluorescencia o Aglutinación (Elisa) Para hacer el DIAGNOSTICO DE BACTERIAS tenemos que seguir algunos pasos: 1. TOMA DE MUESTRA • RESPIRATORIA o Hisopado, aspirado, esputo, lavado bonquiolar, cepillado bronquio alveolar. • URINARIA o Micción, al acecho, Punción de sonda, punción suprapúbica • GASTROINTESTINAL o deposición, hisopado rectal • SNC o LCR, sangre • SISTEMICO o Sangre o Hemocultivos • GENITAL o Hisopado, improntas de ulceras HISOPADO PUNCION >CONTENIDO DE FLORA, por lo que hay que diferencias entre la flora y patógeno Cultivos cuantitativos <FLORA MO y cultivo con >significado 2. TRANSPORTE Y CONSERVACION Lo tiene que proteger ante los • Cambios de temperatura • Falta de humedad • Desarrollo de flora (contaminación) • Anaerobiosis o aerobiosis http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 8 3. ¿COMO CONSERVO LA MUESTRA? TEMPERATURA AMBIENTE HELADERA Exudado faríngeo Sangre LCR Exudado genital, ocular, piel Muestra para anaerobiosis Orina Esputo Heces 4. PROCESAMIENTO POR MICROSCOPIA DX DE CERTEZA AUXILIAR Inmunofluorescencia directa, veo los antígenos de la bacteria marcados Campo oscuro (Treponema) Fresco GRAM Ziehl neelsen POR CULTIVO MEDIO LIQUIDO MEDIO SOLIDO PARA ENRIQUECER (AUMENTAR LA MUESTRA) PARA AISLAR Medios selectivos y medios diferenciales 5. IDENTIFICACIÓN • Pruebas bioquímicas • identificación de antígenos o Serotipificacion o Aglutinación • detección de resistencias/susceptibilidad o Antibiograma ▪ Por difusión (método de kirby) ▪ Por cantidad (1/2 liquido) o detección de secuencias de ADN/ARN, genes de resistencia antibiótica Como por ejemplo M. Tuberculosis > Rifampicina http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 9 DIAGNOSTICO MICOLOGICO ¿Que tengo en cuenta al evaluar? • Historia clínica del paciente • Epidemiologia • Brotes • Sensibilidad fúngica o Comportamiento de las drogas antimicóticas "in vitro" ¿Cuáles formas de diagnóstico tenemos? • DIRECTO o Cultivo o Microscopia óptica o Estructura molecular o moléculas estructurales o ácidos nucleicos 1. TOMA DE MUESTRA - CONSERVACION • Tengo que conocer las características clínicas y evolutivas de las lesiones. Antes de tomar una muestra, ya deberíamos saber que está en esta muestra o que esperamos encontrar, a fin de saber cuál es la mejor forma de toma de muestra para cada lesión. Es importante evaluar el riesgo y la morbilidad asociado a la toma de muestra. El paciente no puede haber empezado ningún tratamiento o estar usando cremas, talcos ungüentos, cosméticos (esmaltes, cremas, perfumes) TODO lo que pueda perjudicar el diagnostico. o MICOSIS SUPERFICIALES • Como solamente afectan la parte más externa de la piel, la capa cornea y sus faneras. La toma de muestra será la retirada de escamas por raspado o escarificación. En caso sea pelo/vello es importante tener la raíz del pelo. Se toma con material estéril, se conserva en un frasco estéril, a T° AMB y se debe procesar antes de las 24hs. Toma por escamas de piel Toma por raspado http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 10 o SUBCULTANEAS Y PROFUNDAS • Entre las micosis subcutáneas y profundas tenemos una gran variedad de muestras En el caso de las subcutáneas o las profundas con manifestaciones cutáneas, se suele obtener por BIOPSIAS de preferencia profundas. La incisión deberá llegar hasta encontrar tejido subcutáneo sano. El procesamiento debería ser inmediato o lo más rápido posible, y su conservación deberá ser en formol para la microscopia o en solución salina si el examen directo es en fresco. Para los fluidos como ESPUTO, LCR, tienen distinto niveles de contaminación que se debe tener en cuenta. La SANGRE, se debe usar anticoagulantes para la visualización de los hongos, ya que en la sangre coagulada los hongos que generan invasión intracelular pueden no ser visualizados. Las muestras deben ser conservadas en recipiente estéril y procesada casi inmediatamente para sus óptimos resultados de identificación. Ya los EXUDADOS son recolectados por punción- aspiración o si drenan por sí solos la simples recolección basta. 2. EXAMEN EN FRESCO - DIRECTO • Tiene baja sensibilidad y alta especificidad, tengo que saber los antecedentes del paciente, el estado y origen de la muestra. ¿PARA QUE SIRVE EL EXAMEN DIRECTO? o Veo si son hongos u otros microorganismos (bacterias) o Diferencio levaduras y micelios o Diferencio los tipos de micelios Todas las características que puedo diferenciar me van a ayudar en el momento de armar un cultivo. Los tejidos queratinizados como escamas, polvo de uñas, y raspados de córnea deben ser tratados con KOH (hidróxido de potasio) al 10-20% en el portaobjetos para la degradación de la queratina. COLORACION http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 11 o GRAM • En lo común se puede usar una tinción de GRAM principalmente para diferenciar de infecciones por bacterias. o GIEMSA • Se usa para encontrar estructuras intracelulares que fueron fagocitadas por polimorfonucleares o macrófagos. o ZIEHL-NEELSEN • Se usa igual que las bacterias para las especies nicóticas que son Acido-alcohol resistentes. también se usa el KINYOUN que es una variante del ZN. o GROMORI- GROCOTT • Se usa la oxidación de la plata como forma de ver las estructuras nicóticas que toman una tonalidad negra, se usa especialmente para neumomicosis. o AZUL DE METILENO • Se usa de forma de rutina, ya que es una forma barata y fácil de identificar estructuras nicóticas principalmente las micosis o BLANCO DE CALCOFLUOR • Es una tinción de fluorescencia, aunquees una tinción simple de hacerse, se necesita que el microscopio que se observa tenga luz UV, para que se resalte las estructuras que presentan alta afinidad como la quitina y algunos polisacáridos. o CULTIVOS • Así como las bacterias podemos usar medios líquidos y sólidos. SABOURAUD • El agar Sabouraud es un medio de cultivo básico que por sus características funciona como medio de enriquecimiento para hongos y que, en caso de contener cloranfenicol u otro antibiótico, se convierte en un medio selectivo para los mismos. El medio contiene peptonas1 y una elevada concentración de glucosa que favorece el crecimiento de los hongos sobre las bacterias. http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 12 BHI - BRAIN- HEART INFUSION - INFUSION CEREBRO CORAZON • Es un medio de cultivo para que se desarrollen organismos fastidiosos, se puede usar en medio liquido o en agar. Para los hongos dismórficos (que tienen distintas características con la variación de T°) se cultiva en Sabouraud a 27-28°C y BHI a 37°C, simulando así sus dos formas; ambiental e invasora. BIOMARCADORES Puedo buscar distintos ANTIGENOS de los hongos para poder identificar la especie. NO se usa en todos los tipos de muestra y tampoco se usa en para todos los hongos. Se puede buscar: o GALACTOMANANOS: ASPERGILLUS (en suero y LCR) o BETAGLUCANOS o GXM (GLUCOROXILOMANANOS): CRIPTOCOCCUS (LCR) Son métodos rápidos que permiten los resultados en pocas horas, con bajos costos y una sensibilidad y especificidad relativamente altas, lo que permite arrancar rápidamente un tratamiento. DETECCION DE ACIDOS NUCLEICOS No se hace de rutina, no es standard PCR y RT-PCR Se puede usar para aspergillus 3. INDIRECTOS Busco la respuesta del sistema inmune ante la presencia de los hongos. Anticuerpos específicos (IgM y IgG), se usan más que nada, en Argentina para las micosis sistémicas endémicas, hay dos formas que se pueden hacer por: • TECNICAS DE PRECIPITACIÓN Son de baja sensibilidad y alta especificidad, son dependentes del antígeno que se usa, por lo tanto, hay una variación grande entre laboratorios. • TECNICAS DE ELISA Anticuerpos específicos (IgE) se usa para Aspergillus, ya que este hongo provoca una reacción específica, la aspergilosis broncopulmonar alérgica. Que es necesaria la cuantificación de los valores de IgE para el tratamiento y seguimiento. http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 13 • INTRADERMOREACCIONES Son reacciones que se hacen en la piel del paciente, normalmente antebrazo. Se inyecta de forma intradérmica un antígeno conocido a fin de medir la respuesta inmune del paciente. Se usa, en hongos, para las micosis sistémicas endémicas. http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 14 DIAGNOSTICO VIROLOGICO Antes de arrancar con los virus tenemos que mencionar los - POSTULADOS DE KOCH: 1. El agente patógeno debe estar presente en los animales enfermos y ausente en los sanos 2. El agente debe ser cultivado en un cultivo axénico puro aislado del cuerpo del animal. 3. El agente aislado en un cultivo axénico debe provocar la enfermedad en un animal susceptible al ser inoculado. 4. El agente debe ser aislado de nuevo de las lesiones producidas en los animales de experimentación y ser exactamente el mismo al aislado originalmente. - POSTULADOS DE RIVERS Thomas Milton Rivers, 1937 - Modifica los postulados de Koch (válidos en infecciones bacterianas), para que sean validos en el diagnóstico de los virus: http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 15 1. Aislamiento del virus desde el hospedador enfermo. 2. Aislamiento de virus en cultivo en células. 3. Prueba de tamaño por filtrado. 4. Producción de enfermedad comparable cuando el virus cultivado es inoculado para infectar animales de experimentación. 5. Re-aislamiento del mismo virus desde el animal de experimentación. 6. Detección de una respuesta inmune específica contra el virus. Siguiendo ambos postulados podemos identificar cualquier patógeno infectológico. - DX VIROLOGICO Para el diagnóstico viral es crucial para realizar el diagnóstico de laboratorio de un virus, cualquiera sea el método empleado, es la toma y el procesamiento de una muestra clínica adecuada. Como en el resto de la Infectología, el diagnóstico puede ser visualizando el microorganismo y su efecto en el cuerpo o las marcas inmunológicas. El método a ser usado varia con el momento de la enfermedad del paciente: En nuestro cuadro esquemático: AMARILLO: los pacientes SUSCEPTIBLES son pacientes que no estuvieron en contacto con el microorganismo y por lo tanto sus pruebas directas e indirectas serán negativas ROJO: los pacientes que están infectados o tienen en su cuerpo el microorganismo, de modo que las pruebas directas serán positivas y las indirectas van a variar con el momento de la enfermedad/infección. http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 16 ROSA: los portadores también tendrán sus pruebas positivas, pero puede ser que tengan menos concentración de patógenos. VERDE: los pacientes curados son aquellos que directamente no tienen más el patógeno, pero si van a responder + a las pruebas indirectas. • DIRECTO Voy a buscar el microorganismo, sus antígenos o su efecto citopático - CULTIVO CELULAR Es el estudio que se obtiene a partir a tejidos humanos o de mamíferos que se mantienen por generaciones para que pierdan sus características del tejido y se puedan replicar indefinidamente. Se usan los cultivos celulares para ver los efectos citopáticos que los virus pueden provocar. - MICROSCOPIA OPTICA Veo lo que causa el virus por medio de un microscopio óptico, como el aumento no es suficiente no logro ver el virus. (SALVO LOS VIRUS POX, que es el virus más grande y el único que se puede visualizar) Puedo diagnosticar el virus por: EFECTO CITOPATICO: los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. A lo largo del ciclo viral intracelular, desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular, prácticamente todos los componentes y orgánulos celulares sufren alteraciones drásticas a nivel molecular, muchas de las cuales tienen manifestación morfológica. La mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis, etc. Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones. http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 17 VIRUS EFECTO CITOPATICO PICORNAVIRUS Picnosis celular, proliferación de membranas HERPESVIRUS proliferación de membranas nuclear PAPILOMAVIRUS Vacuolas en el citoplasma PARAMIXOVIRUS, CORONAVIRUS Sincicios (células gigantes multinucleadas por fusión celular) HERPESVIRUS, RHABDOVIRUS, Redondeamiento y desprendimiento celular, ADENOVIRUS, PICORNAVIRUS cuerpos de inclusión ADENOVIRUS Viriones enel núcleo RHABDOVIRUS Nucleocápsides en citoplasma (cuerpos de negri) POXVIRUS Inclusiones en el citoplasma (cuerpos de guarnieri) Los tiempos para los efectos varían entre 24-48hs (herpes, enterobios) y varias semanas (citomegalovirus, rubeola). NO TODOS LOS VIRUS CAUSAN EFECTOS CITOPATICOS Para evidenciar los efectos en MO, se pueden usar tinciones como: - GIEMSA -TEST DE TZANCK: Es un examen directo que permite confirmar cualquier forma de infección por Herpesvirus, tanto las causadas por herpes simple tipos I y II como por virus varicela-zóster, antes de iniciar un tratamiento antiviral empírico. Su papel diagnóstico resulta especialmente relevante en las formas clínicas atípicas, como ocurre en el paciente inmunodeprimido, en el que la infección herpética puede mostrarse en forma de úlceras de evolución tórpida en lugar de las http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 18 clásicas vesículas, o en aquellos casos en los que el diagnóstico de sospecha es poco frecuente para la edad del paciente. Consiste en la toma de una muestra del contenido líquido de las vesículas herpéticas o del frotis de la base de las lesiones ulcero-costrosas. Esta muestra se fija en un portaobjetos y se tiñe con tinción de Giemsa o azul de toluidina, con el fin de observar el efecto citopático que ejerce el virus. A pesar de ser una técnica clásica, el TT sigue teniendo una gran utilidad clínica, y representa un método sencillo y económico de confirmar de forma rápida el origen herpético de una lesión cutánea, sobre todo en ámbitos médicos en los que no se disponga de técnicas como PCR o real time PCR para el diagnóstico de las infecciones herpética - PAPNICOLAU: También llamada citología vaginal, es una exploración complementaria que se realiza para diagnosticar el cáncer cervicouterino. También se puede realizar citología anal para detección de cáncer anorrectal. Las células son tomadas por raspado de la abertura del cuello uterino se examinan bajo un microscopio. • MICROSCOPIA ELECTRONICA Puedo ver el virus, en realidad una partícula viral, en su forma característica: Hay dos formas de microscopia de barrido y de transmisión. Tinción directa: Se realiza por corte ultrafino de la muestra y coloración con colorantes de electrones densos, luego puedo buscar la partícula viral en el citoplasma o en el núcleo celular. La desventaja es que la reducida área histológica de análisis. Tinción indirecta o negativa: Para virus en suspensión, hago una especie de foto o negativo de la foto y veo esta impresión sobre el área de visualización. • DETECCION DE ANTIGENOS Y ACIDOS NUCLEICOS Son métodos rápidos de diagnóstico, ya que tengo el resultado en pocas horas. Como los virus son formados por proteínas y ácidos nucleicos, puedo usar anticuerpos específicos para marcarlos desde fluidos biológicos, sangre, orina, material fecal, orina, LCR. Sea por inmunofluorescencia directa o indirecta, inmunoensayos, ELISA, WESTERN, PCR. http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 19 • INDIRECTO - SEROLOGICO metodologías de detección de anticuerpos específicos contra antígenos virales. Se usa para evaluar infecciones virales agudas o crónicas, o conocer el estado inmunitario de un individuo o de una población. IgM y seroconversión IgG: En agudas IgG: Para un crónicas, diagnostico retrospectivo. http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 20 DIAGNOSTICO PARASITOLOGICO ¿Qué estadio del parásitos encontramos? Tenemos que recordar el estadio de transmisión del parasito que vamos a buscar en la muestra. • COPROPARASITOLOGICO - MUESTRA DE MATERIA FECAL 1. TOMA DE MUESTRA La muestra suele ser emitida espontanea, y es la mejor para el examen coprológico. Al paciente se lo prepara con dieta, se suspende los tratamientos previos Se debe recogerse en un recipiente (frasco o caja plástica) seco y limpio. FRESCO: No se debe mezclar con orina y debe enviarse al laboratorio inmediatamente. SERIADO: Se recogen varias muestras seriadas para aumentar la concentración, tenemos un frasco con una mezcla de formol para que se mantenga la muestra "bien" y un último frasco con solución fisiológica donde los parásitos están "vivos". 2. PROCESAMIENTO y CONSERVACIÓN Se debe llegar al laboratorio lo más pronto posible, ya que la muestra puede perder valor, características morfológicas: putrefacción, multiplicación bacteriana, pueden hacer que la muestra sea inadecuada se pasa después de un tiempo prolongado. Se puede refrigerar, por algunas horas o un día entero. en la heladera a 4°C, pero no en el congelador. FORMOL: Se usa formol diluido al 5-10%, disminuye el mal olor y fija los parásitos. 3. EXAMEN COPROLOGICO DIRECTO MACROSCOPICO: la consistencia de las heces fecales y clasificarlas en liquidas, blandas o duras. Buscamos por sangre, moco, restos alimentarios o helmintos. MICROSCOPICO: es simples y trabajoso, se coloca eosina, una gota de solución salina y otra de Lugol. Se hace una suspensión y esta mezcla es lo que se pone en al microscopio, los parásitos móviles se va a teñir con eosina y el Lugol resalta los núcleos de los protozoarios y da una coloración café a los huevos y larvas. Se puede observar leucocitos, eritrocitos, cristales de charcot-leyden (formados por la desintegración de los eosinófilos y se asocian a la "alergia" que causan las parasitosis. http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 21 • COPROGRAMA Se llama así al estudio más completo de la materia fecal, que incluye, además del estudio microscópico (COPROPASITOLOGICO), se hacen análisis bioquímicos. -pH -Azucares reductores -Sangre oculta Cuando la cantidad de sangre en la materia fecal es muy pequeña para verse en la microscopia, se puede detectar por formas bioquímicas por reaccionar con los derivados de la hemoglobina. • Prueba hemoglobina humana METODOS DE RECUENTO DE HUEVOS Sirve para cuantificar el número de huevos por gramo de materias fecales. Permite clasificar las parasitosis en intensidades, leves, medianas e intensas. también podemos evaluar la eficacia de los tratamientos. RECUENTO EN PLACA MICROSCOPICA Es el procedimiento más simple, pero menos exacto. El recuento se hace recorriendo toda la lámina (de 22x22mm). El numero huevos se multiplica por 500. TECNICA DE KATO-KATZ Es el que más se usa, está homologado por la OMS, es una método japones que luego fue actualizado por Katz. Se analiza aproximadamente 50mg de materia fecal, por eso también se llama FROTIS GRUESO. Es como una concentración por la cantidad de materia fecal examinada. METODOS DE CONCENTRACIÓN Se usa para aumentar el número de parásitos en el volumen de la materia fecal que se examina, por métodos de sedimentación o flotación. COLORACION http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 22 Aunque no se utilizan coloraciones permanentes en el da de rutina de las parasitosis, pueden ser útiles en alguns casos especiales, para diagnosticar de especies, para almacenar o remitir a laboratorios especializados. -Hematoxilina -Tricromica -Kinyoun • METODOS ESPECIALES o METODO DE GRAHAM Se usa para tomar muestra, procesar y mirar al microscopio al Enterobius (oxiuros), que es un parasito que tiene hábitos de salir para poner huevos en la región perianal, durante la noche.Se aplica una cinta engomada para retirar los huevos. La misma cinta se pega en el portaobjetos y se observa al microscopio. o ESTUDIO DEL FLUJO VAGINAL Si se hace en fresco es mejor. Si la muestra no se examina de inmediato de debe conservar en solución salina. Se pueden teñir con los mismos colorantes que otros exámenes: GRAM, papnicolaou. o PARASITOSIS SANGUINEAS MALARIA: GOTA GRUESA se obtiene la sangre por punción. Se hace la coloración con GIEMSA, FIELD, WRIGTH, y luego se hace un recuento de Plasmodium. o PARASITOSIS TISULARES Para la toma de muestra, se hace biopsia del lugar infectado de acuerdo con la localización del parasito. Luego se puede colorear y mirar al microscopio. Algunas parasitosis por su localización no se hace biopsia, se usan métodos de diagnóstico por imágenes, como Equinococcus o cisticercosis. SEROLOGIA DIRECTO: No se suele medir antígenos o acido nucleicos, hay pocos disponibles. INDIRECTO: En casos de parasitosis la IgE esta aumentada, pero es completamente inespecífico. http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 23 Las pruebas serológicas son muy limitadas ya que no me dicen carga parasitaria, ya que la carga parasitaria no es proporcional a la respuesta inmune. Reacciones cruzadas Especificidad / Sensibilidad son muy variables. http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 24 MEDIOS DE CULTIVO Las bases del diagnóstico microbiano son los medios de cultivo y las tinciones. Por eso es importante conocer los medios, sus propiedades y fundamentos. Así podemos saber cuál es la mejor forma de cultivar cada muestra. Usamos los cultivos para como una forma de obtener colonias puras de una muestra de microorganismos desconocidos. Los medios de cultivo pueden ser solidos o líquidos y colocados en placas de Petri o tubos de ensayo. Los medios los podemos clasificar en • DEFINIDOS Son medios que sabemos exactamente las cantidades de cada ingrediente que tenemos en él. Suelen ser medios más simples. • INDEFINIDOS Son medios más complejos, en que no todas las cantidades están cuantificadas. • SELECTIVOS Son medios que seleccionan un género/especie usando algún componente inhibitorio en su composición. Podemos usar como ejemplo poner antibióticos en un medio seria selectivo para las bacterias que son resistentes a él. • DIFERENCIALES http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 25 Son medios que presentan un cambio fisiológico - bioquimico cuando un organismo especifico crece, el más común es el cambio de color. • AGAR COMUN o AGAR BASICO o aun AGAR NUTRITIVO. El medio más básico que se usa. Es un medio común compuesto de proteínas y azucares que permite el crecimiento de prácticamente todos los microorganismos. • AGAR SANGRE Es un agar al que se le suma sangre de oveja que es muy nutritivo para casi todas las especies de bacterias Gram positivas siendo selectivo ya que inhibe el crecimiento de casi todas las especies negativas por tener antibioticos específicos para ellas y es diferencial porque podemos ver 3 tipos de hemolisis alfa, beta y gamma. Se usa para observar y aislar especies clínicas de staphylo y strepto http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 26 • AGAR CHOCOLATE Es un medio en el cual pongo sangre calentada a mi mezcla de agar. La función es dar factor X y V a las bacterias. A la diferencia del Agar sangre estas son bacterias que no pueden hemolizar la sangre. Se usa casi exclusivamente para Neisseria y Haemophylus • MAC CONKEY Es un medio usado para aislar y diferenciar las distintas especies de Enterobacteriaceae, basado en la habilidad de fermentar lactosa. Es un medio selectivo y diferencial, con lactosa, sales biliares y colorantes rojos y violeta. Las sales biliares y el colorante violeta inhiben el crecimiento de las bacterias Gram positivas. Ya el colorante rojo, se mantiene sin color si el pH es mayor a 6.8 y en rojo si el pH es menor que 6.8, si la bacteria fermenta la lactosa los desechos de esta fermentación acidifican el medio y vemos la placa roja, si bacteria no es fermentadora toda la placa queda incolora. http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 27 • MANITOL HIPER SALADO - CHAPMAN Es usado en casi exclusividad para Staphylococcus Aureus, aunque se puede usar para otras especies staphylo Su fundamento es contener manitol, sal y un indicador de pH el colorante phenol rojo que es amarillo en pH ácidos <6.8 rojo entre 7.4 y 8.4 rosa arriba de 8.4 Es selectivo ya que solamente el género de las stahylo logra crecer en un medio tan salado y diferencial ya que las especies patógenas de staphylo son fermentadoras de manitol lo que acidifica el medio cambiándolo de color a amarillo. • SALMONELLA SHIGELLA (AGAR SS) Se fundamenta en la capacidad de fermentar carbohidratos y tiosulfato de sodio que es una fuente de azufre. Por un lado, vamos a ver un cambio de color del medio si la bacteria fermenta la lactosa, pasando de rojo a incolora. Esas son tanto shigella cuanta salmonella. Por otro lado, si la bacteria puede dar el siguiente paso y reducir el tiosulfato se verán puntos negros en el centro de las colonias. Como Proteus o Salmonella. http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 28 • TIOGLICOLATO Es un medio que se usa en líquido para bacterias anaerobias o microaerofilicas. Tienen una variedad de suplementos dependiendo de la especie que se necesita cultivar. Los más importantes son el tioglicolato de sodio y L-cisteina que son responsables por reducir el O2 a agua. • CALDO DE CARNE COCIDA Es un caldo que se usa específicamente para el desarrollo de las especies de Clostridium patogeno. Como el propio medio es capaz de ser anaeróbico por sí solo, puedo cultivarlo en una incubadora común sin la necesidad de equipamientos que mantengan la anaerobiosis. además de la carne en realidad corazón vacuno, hay peptona y dextrosa. El color negruzco del medio y la producción de gas, me indica indirectamente que el crecimiento proteolítico. http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 29 • LOWENSTEIN-JENSEN Es un medio que se usa para las especies de Micobacterias, excepto Leprae ya que no crece en medios. Se usa el rojo congo y/o verde malaquita para inhibir el crecimiento de otras especies contaminantes. http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 30 • TSI (AGAR HIERRO TRIPLE AZUCAR) El medio se usa para la diferenciación de las enterobacterias, en base a la fermentación de Hidratos de Carbono (Glucosa, lactosa y sacarosa) y la producción de ácido sulfhídrico. La fermentación de los azucares hace que el medio cambie de color al amarillo por la baja de pH. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrogeno y luego reacciona con una sal de hierro proporcionando el color negro del sulfuro de hierro. http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 31 TINCIONES Las distintas tinciones se usan para evidenciar estructuras que luego se observan en la microscopia óptica. Algunas tinciones son simples con un colorante, otras son complicadas conmuchos colorantes y pasos. • GRAM Es la tinción más común en la microbiología, se usa para clasificar las bacterias en positivas y negativas, dependiendo del color que se tiñen. Se usan dos colorantes que pueden variar, pero siempre un violeta y un rosa. El fundamento de la técnica de GRAM está la pared de las bacterias. Las + tienen una pared marcadamente más grande con muchos peptidoglucanos que incorporan el primer pigmento el violeta y no se destiñen con el Lugol y luego no se pinta de nuevo con la safranina. Ya las bacterias - aunque sean tenidas por el color violeta, con el Lugol y alcohol se destiñen para ser pintadas con el colorante rosa. Aunque las levaduras también se pintan, no es una tinción apropiada para hongos. http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 32 • GIEMSA La tinción de Giemsa es un tipo de coloración de muestras clínicas, basada en la mezcla de colorantes ácidos y básicos. Este método tiene utilidad sobre todo para poner de manifiesto las rickettsias localizadas dentro de las células huéspedes. La coloración de Giemsa se emplea también para teñir frotis de sangre en el examen para protozoos. Se pueden emplear, como variaciones, otras coloraciones como es la técnica de cito concentración para parásitos sanguíneos, la cual tiene un bajo coste y ofrece la posibilidad de aislar e identificar en el mismo sedimento el parásito principal. El fundamento de la técnica de Giemsa está en sus varios colorantes: los tintes neutros utilizados combinan el azul de metileno, Azure A y Azure B como tintes básicos, y la eosina como tinte ácido, lo que da una amplia gama de colores. El azul de metileno y el Azure son colorantes metacromáticos, de ahí que muchas estructuras se tiñan de púrpura y no de azul. El pH de la solución de coloración es crítico y se debe ajustar idealmente según diversos fijadores. La gama del pH debe estar entre 6.4 y 6.9. Células de la serie roja: Rosa pálido Núcleos: Azul H. Pylori, hongos y otras bacterias: Azul Mastocitos: Azul / Rosa pálido http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 33 • ZIEHL- NEELSEN La tinción de Ziehl-Neelsen es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, usada para la identificación de bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR), como M. tuberculosis o el filo Apicomplexa (coccidios intestinales) entre otros. Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes: Franz Ziehl, un bacteriólogo, y Friedrich Neelsen, un patólogo. Las paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de los ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y las que no, se ven de color azul ya que se utiliza azul de metileno como tinción de contraste. Se utiliza para teñir micobacterias y otros microorganismos acidorresistentes. Los microorganismos se tiñen con carbolfucsina básica y resisten a la descoloración con soluciones de ácido-alcohol. Se realiza contratinción del fondo con azul de metileno. Los microorganismos aparecen de color rojo sobre un fondo azul claro. La captación de carbolfucsina precisa el calentamiento de la muestra (tinción acidorresistente caliente). http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 34 • KINYOUN Tinción acidorresistente en frío (no precisa calentamiento). El fundamento de esta tinción se basa en la resistencia al alcohol ácido. El reactivo principal es la fucsina fenicada, la cual tiene la propiedad de unirse a los ácidos carboxílicos de la pared celular de las micobacterias y algunos parásitos. El fenol es capaz de disolver los lípidos de la pared celular, permitiendo la entrada del colorante fucsina, el cual se queda fijo, incluso en presencia de alcohol ácido. http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 35 • CALCOFLOUR Es una tinción fluorescente que se usa para unirse con los polímeros polisacáridos. Se utiliza para detectar elementos fúngicos o parasitarios como el género Pneumocystis. El colorante se une a la celulosa y la quitina de las paredes celulares, se puede mezclar el colorante con KOH. • TINTA CHINA Es una tinción negativa de cápsulas. Para realizar una tinción negativa de cápsulas para observar, precisamente, las cápsulas de una levadura. La tinción negativa de cápsulas es una tinción estructural, ya que pone de manifiesto las cápsulas y no tiñe los microorganismos. Tiñe el fondo de color negruzco y permite ver los microorganismos sin colorear sobre dicho fondo. De este modo genera el contraste suficiente como para permitir su visualización al microscopio. Para esta tinción se pueden utilizar dos colorantes diferentes: nigrosina o tinta china. En la práctica se utiliza tinta china. http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 36 • AZUL DE METILENO + KOH La coloración con azul de metileno tiñe a todas las estructuras por igual. Se utiliza el colorante para teñir las estructuras presentes. No es diferencial porque cuando se tiñen microorganismos con este colorante tiñe a todos por igual. • YODO LUGOL Se añade yodo a preparaciones en fresco de muestras de parasitología para mejorar el contraste de las estructuras internas. Esto facilita la diferenciación entre las amebas y los leucocitos del huésped. http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 37 PRUEBAS BIOQUIMICAS • PRUEBA CATALASA Se utiliza en la caracterización inicial de la mayoría de las bacterias. La enzima catalasa está presente en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. Son excepción Estreptococos spp y Enterococcus spp. Las bacterias que sintetizan catalasa hidrolizan el peróxido de hidrogeno en agua y oxígeno gaseoso, y como resultado se liberan burbujas de gas. • PRUEBA DE LA OXIDASA Prueba utilizada para determinar si un microorganismo produce la enzima citocromooxidasa. La prueba se usa en la caracterización inicial de bacterias gramnegativas. En presencia de oxígeno atmosférico la enzima intracelular citocromo oxidasa oxida el reactivo fenilendiamina y forma un compuesto color purpura (indofeno) http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 38 • CAMP TEST Determinar la capacidad de un microorganismo para producir una proteína que produce un efecto sinérgico con la beta-hemolisina de S. aureus. Algunos microorganismos sintetizan una proteína que produce un efecto sinérgico con la beta hemolisina de S. aureus sobre eritrocitos ovinos y bovinos. Si ambos microorganismos se siembran próximos en un medio de agar sangre, se produce un fenómeno lítico en el punto de intersección de los dos microorganismos. La proteína se denominó factor CAMP por las iniciales de los nombres de los autores que descubrieron este fenómeno con la proteína B de Estreptococos agalactiae, y esta prueba permite identificar presuntivamente este microorganismo.Alternativas: • CAMP-Test inverso: la hemolisis de algunos microorganismos se inhibe por la beta-hemolisina de S. aureus. • Determinar la producción de fosfolipasa D que inhibe la reacción de la prueba del CAMP en la especie Arcanobacterium haemolyticum. • Determinar la producción de fosfolipasa E que inhibe la reacción de la prueba del CAMP en la especie Rhodococcus equi. http://www.filadd.com/academia-filadd Luana Sader Para más información www.filadd.com/academia-filadd 39 • PRUEBA DE LA COAGULASA Se utiliza para la diferenciación de especies del género Staphylococcus debido a la capacidad de coagular el plasma por la acción de la enzima coagulasa. La coagulasa es un enzima que convierte el fibrinógeno en fibrina. Existe en dos formas: clumping factor o coagulasa unida a la pared celular y coagulasa libre o enzima extracelular que solo se produce cuando la bacteria se cultiva en caldo. La primera se detecta mediante la prueba de la coagulasa en porta y ambas mediante la prueba de la coagulasa en tubo. • PRUEBA DE LA ADNasa Se utiliza para diferenciar microorganismos en base a la actividad de desoxirribonucleasa (ADNasa). Esta prueba se utiliza principalmente en la diferenciación de estafilococos que producen grandes cantidades de ADNasa extracelular. La mayoría de las cepas de La ADNasa es un enzima que hidroliza el ácido desoxirribonucleico (ADN) y libera oligonucleótidos y fosfato. Hay muchos medios de cultivo con y sin indicadores para detectar este enzima. En el medio de cultivo, la tripteína es la fuente de nitrógeno, aminoácidos, y aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano. El ácido desoxirribonucleico (ADN), se encuentra en grado altamente polimerizado, y es el sustrato de la enzima desoxirribonucleasa (ADNasa), la cual lo hidroliza. http://www.filadd.com/academia-filadd
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