Identificação do reservatório de Febre Hemorrágica Argentina por PCR-RFLP

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Brazilian Journal of Animal and Environmental Research 1329 
ISSN: 2595-573X 
Brazilian Journal of Animal and Environmental Research, Curitiba, v.4, n.1, p. 1329-1344 jan./mar. 2021 
 
 
Identificación del reservorio de Fiebre Hemorrágica Argentina mediante la 
técnica de PCR-RFLP 
 
Identification of the Argentine Hemorrhagic Fever reservoir using PCR-RFLP 
 
DOI: 10.34188/bjaerv4n1-109 
 
Recebimento dos originais: 20/11/2020 
Aceitação para publicação: 20/12/2020 
 
Julieta Torchia 
Licenciada en Genética (Universidad Nacional del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires – 
UNNOBA) 
Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas “Dr. Julio I. Maiztegui” (INEVH) - 
Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud (ANLIS). 
Dirección: Monteagudo 2510, Pergamino, Provincia de Buenos Aires, Argentina. CP: 2700 
E-mail: julietatorchia@hotmail.com 
 
Patricia Muzulín 
Dra. en Biología Molecular (Universidad de Buenos Aires – UBA) 
Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas “Dr. Julio I. Maiztegui” (INEVH) - 
Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud (ANLIS). 
Dirección: Monteagudo 2510, Pergamino, Provincia de Buenos Aires, Argentina. CP: 2700 
E-mail: pmuzulin@anlis.gob.ar 
 
María Laura Martin 
Dra. en Ciencias Naturales (Universidad Nacional de La Plata – UNLP) 
Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas “Dr. Julio I. Maiztegui” (INEVH) - 
Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud (ANLIS). 
Dirección: Monteagudo 2510, Pergamino, Provincia de Buenos Aires, Argentina. CP: 2700 
E-mail: mlmartin@anlis.gob.ar 
 
 
RESUMEN 
La Fiebre Hemorrágica Argentina (FHA) es una enfermedad zoonótica viral transmitida por roedores 
cuya tasa de letalidad se encuentra entre el 15 y el 30%. El roedor Calomys musculinus es el 
reservorio del Mammarenavirus argentino, agente etiológico de la FHA. El seguimiento de sus 
poblaciones a través de la vigilancia continua representa uno de los instrumentos para reconocer y 
reducir al mínimo el impacto de la enfermedad. En este estudio, se evaluó la utilidad de la técnica de 
PCR-RFLP (Amplificación en cadena de la polimerasa–Polimorfismos de longitud de fragmentos de 
restricción) del gen mitocondrial Citocromo b (Cytb), usado como marcador genético para la 
identificación de especies del género Calomys. Se utilizaron secuencias de consensos del gen Cytb 
de distintas especies del género Calomys (C. musculinus, C. callidus, C. laucha y C. boliviae) para 
seleccionar in silico las enzimas de restricción (ER) a utilizar. Como resultado de esta selección se 
eligió la ER AluI. Los resultados de la amplificación del gen por PCR seguidos de la digestión con 
AluI se visualizaron en geles de agarosa. La obtención de patrones diferenciales de bandas 
permitieron discriminar las diferentes especies en estudio, haciendo posible la identificación de C. 
musculinus. La identificación molecular de las especies por la secuenciación de marcadores 
genéticos es la técnica gold estándar, sin embargo, los resultados obtenidos demuestran que la 
identificación del reservorio por la técnica de PCR-RFLP reemplazaría, en principio y puntualmente 
para la identificación de dicha especie, la secuenciación genómica, la cual requiere mayores costos y 
mayor tiempo, permitiendo priorizar mediante esta técnica el análisis virológico. 
 
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Palabras clave: Fiebre Hemorrágica Argentina, Mammarenavirus argentino, Calomys musculinus, 
PCR-RFLP, Citocromo b. 
 
ABSTRACT 
Argentine Hemorrhagic Fever (AHF) is a rodent-borne viral zoonotic disease with a case fatality rate 
of 15-30%. Calomys musculinus is the rodent reservoir of the Argentine mammarenavirus, 
etiological agent of AHF. The monitoring of their populations through continuous surveillance 
represents one of the tools to recognize and minimize the impact of the disease. In this study, the 
usefulness of the PCR-RFLP technique in mitochondrial gene Cytochrome b (Cytb) -used as a 
genetic marker for the identification of species of the genus Calomys- was evaluated. Consensus 
sequences of the Cytb gene from different species of the genus Calomys (C. musculinus, C. callidus, 
C. laucha and C. boliviae) were used to select “in silico” the restriction enzymes to be used. As a 
result of this selection, the restriction enzyme AluI was chosen. The results of gene amplification by 
PCR followed by digestion with the AluI enzyme were visualized on agarose gels. Differential 
banding patterns enable to discriminate the different species under study, making the identification 
of C. musculinus possible. Therefore, the identification of the reservoir by PCR-RFLP technique 
would avoid genomic sequencing, which requires higher costs and more time, allowing to prioritize 
the virological analysis by this technique. 
 
Keywords: Argentine Hemorrhagic Fever, Argentine mammarenavirus, Calomys musculinus, PCR-
RFLP, Cytochrome b. 
 
 
1 INTRODUCCIÓN 
La Fiebre Hemorrágica Argentina (FHA) es una enfermedad zoonótica viral transmitida por 
roedores que se caracteriza por alteraciones vasculares, hematológicas, renales, neurológicas e 
inmunológicas. En el caso de FHA, la tasa de letalidad se encuentra en el rango del 15 al 30% 
(Briggiler et al., 2015; Enria et al., 1998; García et al., 2000; Maiztegui, 1975). La administración 
del plasma inmune atenúa la gravedad de la enfermedad y reduce significativamente la mortalidad 
por FHA (Maiztegui et al., 1998). 
El ratón de campo, Calomys musculinus, conocido como ratón maicero, es el reservorio del 
Virus Junín, recientemente renombrado por el Comité Internacional de Taxonomía de Virus como 
Mammarenavirus argentino (JUNV) (Maes et al., 2018). Este virus es el agente etiológico de la 
FHA o Mal de los Rastrojos (R. E. González-Ittig et al., 2007; Steinmann et al., 2011) y su 
reservorio ha sido ampliamente estudiado en Argentina por su implicancia en la salud pública 
(Steinmann et al., 2011). 
La vigilancia ecoepidemiológica de C. musculinus brinda información de la circulación viral 
en las poblaciones reservorio y puede llevarse a cabo a través del seguimiento de las mismas. La 
vigilancia representa uno de los instrumentos más valiosos para reconocer y reducir al mínimo el 
impacto de los brotes de enfermedades infecciosas (Mills et al., 1995), ya que permite gestionar 
medidas de control y prevención adecuadas. Implica la captura de roedores y el análisis de sus 
respectivas muestras, a través de estudios serológicos y/o moleculares que permiten conocer la 
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circulación viral en las distintas áreas. Los datos de las comunidades de roedores provenientes de la 
vigilancia, por ejemplo, la abundancia relativa de la especie reservorio, actúan como indicadores de 
riesgo de contraer la enfermedad, ya que una alta densidad de población de roedores podría 
contribuir a aumentar la transmisión horizontal del virus y al mantenimiento del mismo en la 
naturaleza, al mismo tiempo que puede expandir los límites de infección y aumentar el riesgo de 
transmisión viral a los humanos (Polop et al., 2007; Simone et al., 2012). 
Dado que la distribución geográfica de C. musculinus es mucho más amplia que el área 
endémica de FHA (Polop et al., 2007), la vigilancia ecoepidemiológica del reservorio se realiza 
dentro y fuera del área endémica. La vigilancia fuera del área endémica permite, en el caso de 
hallarse roedores infectados, reducir la incidencia de la enfermedad en la población a través de la 
administración de la vacuna Candid#1, una vacuna a virus atenuado contra laFHA producida en 
Argentina (Barrera Oro & McKee, 1991; Briggiler et al., 2015). 
Debido a que las distribuciones de las distintas especies se encuentran solapadas (Figura 1) y 
que los roedores del género Calomys son morfológicamente similares entre sí, la identificación de 
los mamíferos capturados utilizando criterios morfológicos no resulta suficiente para diferenciarlos, 
por lo tanto, es necesario confirmar dichos resultados mediante estudios moleculares. 
 
Figura 1. Mapa de distribución de las distintas especies en estudio. 
 
Fuente: The IUCN Red List of Threatened Species. Red List versión 2019. Disponible en: https://www.iucnredlist.org. 
 
 
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El ADN mitocondrial (ADNmt) es ampliamente utilizado en estudios taxonómicos, 
filogenéticos y para la identificación molecular de las especies. 
El gen mitocondrial Citocromo b (Cytb) está involucrado en el transporte de electrones en la 
cadena respiratoria de la mitocondria. La variabilidad exhibida por el gen a diferentes niveles 
taxonómicos y su uso exitoso como marcador, permitiría la identificación genética de roedores 
reservorios. Utilizando la técnica de PCR-RFLP sobre marcadores mitocondriales, González Ittig & 
Gardenal (2002, 2004), han estudiado la diversidad de haplotipos dentro de las poblaciones de C. 
musculinus. 
Las tareas de vigilancia incluyen la identificación molecular de los roedores reservorios 
capturados a campo a través de la secuenciación de marcadores genéticos. Dado el gran volumen de 
muestras a procesar generado como resultado de estas capturas, el objetivo de este trabajo fue 
evaluar la utilización de la técnica de PCR-RFLP para distinguir entre las especies del género 
Calomys con el fin de reducir la cantidad de muestras a secuenciar, para priorizar adecuadamente los 
análisis virológicos. 
 
2 MATERIALES Y MÉTODOS 
2.1 MUESTRAS 
Se utilizaron 35 muestras de roedores de las especies C. musculinus (9), Calomys callidus (9), 
Calomys boliviae (9) y Calomys laucha (8) previamente identificados molecularmente por la 
secuenciación genómica del gen mitocondrial Ctyb. Las muestras analizadas incluyeron ejemplares 
de cada una de las especies capturadas en distintas provincias argentinas que forman parte del área 
de distribución de C. musculinus (Santiago del Estero, Tucumán, Córdoba, La Pampa, Buenos Aires, 
Entre Ríos, Chaco, Santa Fe), con el objetivo de analizar la posible existencia de polimorfismos 
intraespecíficos. 
 
2.2 SELECCIÓN DE ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (ER) Y DIGESTIÓN IN SILICO DE LAS 
SECUENCIAS DE CYTB CON LAS ENZIMAS SELECCIONADAS 
Las secuencias del gen Ctyb de las distintas especies de roedores fueron analizadas utilizando 
el software bioinformático en línea Sequence Manipulation Suite (SMS) versión 2, que permite 
identificar, en las secuencias cargadas en la plataforma, todos los sitios de reconocimiento posibles 
para las todas las ER existentes. Los fragmentos resultantes se clasifican por tamaño, y esto permite 
la selección de ER que pudieran ser capaces de diferenciar entre las especies mediante sus patrones 
de PCR-RFLP. 
Para el uso de la plataforma bioinfórmatica se utilizaron secuencias de consensos del gen 
Cytb publicados en la base de datos GenBank y secuencias obtenidas en el Instituto Nacional de 
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Enfermedades Virales Humanas “Dr. Julio I. Maiztegui” (INEVH) - Administración Nacional de 
Laboratorios e Institutos de Salud (ANLIS). 
El análisis de las secuencias arrojó como resultado la generación in silico de fragmentos 
cortados con las enzimas AluI y BamHI, con patrones de restricción capaces de diferenciar entre 
especies, por lo cual estas dos enzimas fueron las seleccionadas para evaluar su utilización en la 
técnica de PCR-RFLP. 
 
2.3 EXTRACCIÓN DE ADN 
EL ADN de cada espécimen se extrajo a partir de muestras de sangre entera o a partir de 
muestras de tejido utilizando las colas de los roedores. La extracción se realizó utilizando el kit 
comercial DNeasyBlood and Tissue (QIAGEN), siguiendo las instrucciones del fabricante. Todas las 
muestras se manipularon en un gabinete de seguridad biológica 2. 
 
2.4 AMPLIFICACIÓN DEL MARCADOR MOLECULAR CYTB POR PCR 
Se realizó la amplificación del gen Ctyb por PCR utilizando los oligonucleótidos cebadores 
Mus14095 (5´ GACATGAAAAATCATCGTTGTAATTC 3´) y Mus15398 (5´ 
GAATATCAGCTTTGGGTGTTGRTG 3´) (Anderson & Yates, 2000). Las amplificaciones se 
realizaron en termocicladores marca MyCyclerTMBio Rad (ThermalCycler, Bio Rad, Foster City, 
CA, USA) utilizando los reactivos citados en la tabla 1 en volúmenes de reacción de 50 μl y 
siguiendo las condiciones detalladas en González-Ittig et al., (2010, 2014). 
 
Tabla 1. Reactivos y volúmenes utilizados en la reacción de PCR para la amplificación del gen mitocondrial Cytb. 
 
Fuente: del autor. 
 
2.5 DIGESTIÓN CON ER 
Los amplicones fueron digeridos con las ER AluI (Thermo Fisher Scientific) y BamHI 
(Thermo Fisher Scientific) siguiendo las instrucciones indicadas por el fabricante, utilizándose dos 
volúmenes diferentes de dichas enzimas: 0,5 μl y 1 μl de una concentración stock de 10 unidades/μl. 
 
 
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2.6 VISUALIZACIÓN DE LOS PRODUCTOS DE RESTRICCIÓN 
La visualización de los fragmentos resultantes de la digestión se realizó mediante 
electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con 10 μl de SYBR ® Safe ADN gel stain 10.000 X, 
utilizando 10 μl de cada una de las muestras. La electroforesis se desarrolló a una intensidad de 80 
voltios. Se ensayaron dos tiempos distintos de corrida electroforética (60 y 90 minutos) para evaluar 
la resolución de los fragmentos, que se visualizaron en un transiluminador bajo luz ultravioleta. Los 
patrones de bandas obtenidos se evaluaron comparando los tamaños de los fragmentos con un 
marcador molecular de 100 pares de bases (pb) (GeneRuler 100 bp DNA Ladder - Thermo Fisher 
Scientific). 
 
2.7 ANÁLISIS DE LOS DATOS 
Para el análisis de los resultados obtenidos, se tomaron fotos digitales de los geles y se evaluó 
si los patrones resultantes permitían distinguir entre las distintas especies del género. Las diferencias 
en los patrones de las bandas se analizaron de manera gráfica utilizando la versión de prueba del 
software GelQuest © 2006. 
 
3 RESULTADOS 
3.1 DIGESTIÓN IN SILICO DE LAS SECUENCIAS CON LAS ER SELECCIONADAS 
La digestión in silico permitió seleccionar las enzimas AluI y BamHI; las cuales poseen sitios 
de reconocimiento sobre el amplicón del gen Ctyb de las distintas especies estudiadas y generan, 
además, patrones de restricción diferenciales entre ellas. 
En la tabla 2 se presentan los resultados de las digestiones in silico con las enzimas AluI y 
BamHI para las distintas especies. 
 
 
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Tabla 2. Fragmentos resultantes de la digestión in silico de las secuencias consenso del gen Ctyb con las enzimas de 
restricción AluI (A) y Bam HI (B) utilizando la plataforma Sequence Manipulation Suite. 
 
Fuente: del autor. 
 
3.2 PCR-RFLP CON LAS ENZIMAS ALUI Y BAMHI 
Los análisis de restricción con las enzimas AluI y BamHI fueron realizados evaluando dos 
condiciones: concentración de la enzimas (medida como número de unidades de la misma) y tiempo 
de corrida electroforéticadel gel de agarosa, posterior a la digestión. 
Los resultados obtenidos fueron similares cuando se utilizaron 0,5 μl y 1 μl de ER de una 
concentración stock de 10 unidades/μl, asimismo no hubo diferencias respecto a los tiempos de 
corrida electroforética ensayados (60 y 90 minutos) (Figuras 2A y 2B). 
Las digestiones enzimáticas con AluI permitieron obtener patrones de bandas capaces de 
distinguir a las cuatro especies del genero Calomys. Por otro lado, las digestiones con la enzima 
BamHI no generaron patrones de restricción capaces de distinguir entre especies, ya que C. callidus 
y C. musculinus mostraron un patrón de bandas muy similar (Figuras 2A y 2B), motivo por el cual se 
excluyó dicha enzima de restricción en los posteriores ensayos realizados. 
 
 
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Figura 2. Ensayo de digestión con AluI y BamHI utilizando diferentes volúmenes de las mismas (0,5 μl y 1 μl) y 60 (A) 
y 90 (B) minutos de corrida electroforética. Cb: C. boliviae; Cc: C. callidus; Cm: C. musculinus; Cl: C. laucha; MM: 
marcador molecular. 
 
Fuente: del autor. 
 
3.3 PCR-RFLP DE MUESTRAS CON ALUI 
La figura 3 muestra el resultado de la digestión con la enzima AluI de los amplicones del gen 
mitocondrial Ctyb de muestras de roedores de las especies: C. boliviae (Figura 3A), C. callidus 
(Figura 3B), C. laucha (Figura 3C) y C. musculinus (Figura 3D). La tabla 3 muestra la cantidad y la 
longitud de los fragmentos producidos. 
El análisis in silico de las secuencias de la especie C. boliviae mostraron que no existe un 
sitio de reconocimiento, con lo cual sólo se generaría un fragmento de la longitud del gen Cytb 
(≅1100 pb), este hecho es concordante con los resultados obtenidos experimentalmente (Figura 3A). 
De la misma forma, el patrón de restricción obtenido en la especie C. callidus es análogo al 
predecido por la digestión in silico, representado por dos fragmentos, que permiten discriminar a 
esta especie de las restantes especies estudiadas (Figura 3B). 
La digestión con la enzima AluI en la especie C. laucha produjo 3 bandas, en este caso, no 
hubo concordancia con los resultados teóricos arrojados por el software, que predijo un patrón de 4 
bandas. Es necesario mencionar que los fragmentos más pequeños generados poseen casi la misma 
longitud, difieren sólo en 9 bases (114 y 105 pb), lo cual hace improbable poder visualizarlos en un 
gel de agarosa. De todos modos, este patrón de 3 bandas permitió discriminar esta especie de las 
restantes. 
 
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Finalmente, la figura 3D presenta el patrón de bandas obtenido de la digestión de muestras de 
C. musculinus. En este caso se observaron dos fragmentos, uno más difuso de aproximadamente 300 
pb y otro más nítido de unas 900 pb. Sin embargo, en las tres primeras calles del gel no se observó el 
fragmento más pequeño. Al igual que en los casos anteriores, este patrón de bandas se diferencia del 
obtenido para el resto de las especies y coincide con el patrón resultante de la digestión in silico. 
La diversidad geográfica de muestras evaluadas, provenientes de poblaciones distantes 
geográficamente, no se vio reflejada en los patrones de restricción, ya que las muestras de diferentes 
regiones no produjeron diferencias en los patrones de restricción, indicando que los sitos de 
reconocimiento para las enzimas evaluadas están conservados dentro de las poblaciones. 
 
Figura 3. Ensayo de digestión con AluI a muestras de C. boliviae (A), C. callidus (B), C. laucha (C) y C. musculinus (D), 
comparando los patrones de bandas obtenidos de cada una de las especies con controles de las especies restantes. Cb: C. 
boliviae; Cc: C. callidus; Cm: C. musculinus; Cl: C. laucha; MM: marcador molecular. 
 
Fuente: del autor. 
 
 
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Tabla 3. Comparación de los fragmentos producidos por la enzima AluI in silico y experimentalmente. 
 
Fuente: del autor 
 
3.4 ANÁLISIS DE LAS IMÁGENES MEDIANTE EL SOFTWARE GELQUEST 
En la figura 4 se observan las agrupaciones resultantes del análisis de los patrones de bandas 
para establecer los distintos grupos de especies. 
Los grupos de patrones formados se corresponden con grupos de muestras de la misma 
especie. Estos resultados demuestran que los patrones obtenidos de cada una de las especies, son 
realmente diferentes y claramente diferenciables. 
 
4 DISCUSIÓN 
La infección por JUNV constituye un importante problema de salud pública por lo cual las 
actividades de vigilancia que permiten conocer la circulación del virus son indispensables; ya que 
reducen el impacto de los brotes de FHA (Mills et al., 1995; Steimann et al., 2011). Los estudios de 
vigilancia ecoepidemiológica se basan en la captura de diferentes especies de roedores cuya 
identificación inequívoca es de suma importancia para el control de la enfermedad. 
En el presente trabajo, se han seleccionado un total de 35 ejemplares que pertenecen a 
diferentes especies del género Calomys (9 corresponden a C. boliviae, 9 a C. musculinus, 9 a C. 
callidus y 8 a C. laucha) provenientes de capturas realizadas en distintas regiones del área de 
distribución de C. musculinus (Santiago del Estero, Tucumán, Córdoba, La Pampa, Buenos Aires, 
Entre Ríos, Chaco, Santa Fe). 
El análisis bioinformático y la generación in silico de los fragmentos generados con las 
enzimas AluI y BamH, condujeron a que dichas enzimas fueran las selecionadas para evaluar su 
utilización en la técnica de PCR-RFLP. 
 
 
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Figura 4. Agrupaciones de los patrones de bandas observados en las fotos digitales de los geles generadas mediante el 
software GelQuest. C.b.: C. boliviae; C.m.: C. musculinus; C.c.: C. callidus; C.l.: C. laucha 
 
Fuente: del autor. 
 
Los resultados obtenidos mostraron que la ER AluI generó fragmentos de restricción 
diferentes en cada una de las especies en estudio; por lo tanto, fue útil como herramienta para 
discriminar entre especies de interés del género Calomys (Figura 2). Si bien la secuenciación 
genómica de marcadores genéticos constituye la forma inequívoca de identificación de especies, 
estos resultados nos permitirían reducir significativamente el costo en la identificación de la especie 
reservorio de FHA, lo cual redunda en un mejor manejo de recursos, permitiendo la priorización de 
los análisis virológicos, puntualmente reduciéndose la secuenciación de las muestras a sólo aquellos 
individuos de interés. 
Además, los resultados obtenidos utilizando la ER AluI, mostraron que no existieron 
diferencias en los patrones de restricción dentro de cada uno de los ejemplares de la misma especie, a 
pesar de haber sido capturados en regiones geográficamente distantes entre sí. Este hecho sugiere 
que no existen polimorfismos en los sitios de reconocimento de la ER en el gen a nivel 
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intraespecífico y, por lo tanto, estos sitios de corte estarían conservados en las diferentes 
poblaciones, lo cual reafirma su utilidad, ya que podría emplearse independientemente del sitio de 
captura de los roedores. 
Por otro lado, el análisis de los patronesgenerado por la enzima AluI, mostró que en Calomys 
laucha no pudo definirse el fragmento más pequeño del patrón esperado (n de bases). Si bien la 
técnica de PCR-RFLP utilizando la enzima AluI resultó útil en la discriminación de las especies de 
interés, se deberá continuar con el análisis, aumentando el número de individuos provenientes de 
diferentes regiones geográficas, así como también evaluar otros posibles marcadores genéticos con 
potencial para discriminación intragénero. 
Los análisis de los fragmentos generados por la enzima BamHI (Figura 2), mostraron que no 
se generaron patrones diferenciales entre las especies, ya que C. callidus y C. musculinus mostraron 
un patrón de bandas muy similar. Este hecho podría deberse a cuestiones relacionadas con la 
actividad enzimática “per se” y debería verificarse en un estudio posterior, en el cual, se ensayen 
diferentes condiciones de digestión, tales como la temperatura y la cantidad de unidades de enzima 
por sustrato. 
La técnica de PCR-RFLP es un método indirecto para estudiar la variación de nucleótidos (R. 
E. González-Ittig et al., 2007), y ha sido cuestionada por algunos autores que consideran que los 
sitios de restricción inferidos ofrecen menos resolución que la secuenciación directa de nucleótidos. 
Además, ha sido considerada obsoleta o superflua por Carr & Marshall, 2011; Kocher et al., 1989 y 
Wilson et al., 1989. Aunque no todas las enzimas de restricción utilizadas en la técnica RFLP 
pueden ser capaces de diferenciar entre todas las especies, lo que hace necesario una selección in 
silico previa de las enzimas, la utilización de esta técnica es de especial importancia en los estudios 
de identificación de especies por su simpleza, rapidez y menor costo respecto a la secuenciación 
genómica. En este trabajo se observó que la menor concentración de enzima utilizada resultó 
suficiente para la obtención de patrones de restricción diferenciales, sin necesidad de corridas 
electroforéticas prolongadas. 
En relación a lo antes mencionado, se realizó un cálculo aproximado de los tiempos y costos 
empleados en la técnica de PCR-RFLP, la cual mostró ser aproximadamente 75% más económica 
comparada con la técnica de secuenciación genómica. 
Varios investigadores (Behere et al., 2008; Nasri et al., 2015; Vanlerberghe-Masutti, 1994) 
han utilizado la técnica de PCR-RFLP para la diferenciación entre especies del mismo género, 
utilizando marcadores de ADNmt o marcadores de ADN nuclear. Vanlerberghe-Masutti (1994) 
utilizó la técnica de RFLP del ADNmt para determinar su capacidad para discriminar entre 7 
especies de avispas parásitas de cultivos pertenecientes al género Trichogramma. Las comparaciones 
de los mapas de restricción de ADNmt que fueron obtenidos, revelaron una diferenciación 
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considerable entre las 7 especies estudiadas; Behere et al., (2008) analizaron 4 especies de plagas de 
plantas cultivadas del género Helicoverpa mediante PCR-RFLP. Los patrones de restricción 
generados demostraron una diferenciación confiable de las 4 especies; Nasri et al., (2015) utilizaron 
el gen de la β-tubulina nuclear como marcador para diferenciar entre especies del género Aspergillus, 
determinando que el perfil de RFLP generó patrones únicos para 6 especies de Aspergillus 
clínicamente importantes. Los resultados de estos trabajos han sido similares a los obtenidos en el 
presente estudio, indicando que la técnica se puede adaptar a diferentes especies utilizando 
marcadores tanto nucleares como mitocondriales. 
Otros investigadores (R. González-Ittig et al., 2002), utilizaron la técnica de PCR-RFLP para 
estudiar la región D-loop del ADNmt de 3 especies del género Calomys (C. musculinus, C. laucha y 
C. venustus). Analizaron 9 endonucleasas, entre ellas AluI. Esta enzima no discriminó entre C. 
musculinus y C. laucha, pero distinguió claramente ambas especies de C. venustus. Estos 
investigadores repitieron la metodología propuesta en el trabajo de Corachm & Semorile (1989), 
quienes propusieron distinguir a C. musculinus y C. laucha por los diferentes patrones obtenidos 
luego de la digestión del ADN genómico total, sin embargo encontraron que para obtener patrones 
bien resueltos se requiere ADN de alta calidad a una alta concentración. En el presente estudio, se 
demuestra que utilizando el gen Cytb del ADNmt, las digestiones realizadas con AluI permiten 
distinguir C. musculinus de C. laucha, ya que produce un patrón de bandas diferencial para ambas 
especies, sin necesidad de digerir la totalidad del genoma. 
González Ittig & Gardenal (2002) estudiaron la diversidad de haplotipos de la región D-loop 
del ADNmt en C. musculinus utilizando la técnica de PCR-RFLP. Los resultados muestran que 
analizando 65 ejemplares provenientes de cinco localidades (Pergamino, provincia de Buenos Aires; 
Laguna Larga, provincia de Córdoba y Uranga, Oliveros y Alcorta, provincia Santa Fe), se 
detectaron 20 haplotipos diferentes. Resultados similares fueron obtenidos por los mismos 
investigadores en el año 2007. En dicho trabajo analizaron 231 especímenes capturados de 9 
localidades del área endémica de FHA, de 2 localidades de la zona marginal y de 5 localidades que 
se encuentran fuera de la zona endémica. Se detectaron 16 haplotipos utilizando la técnica de PCR-
RFLP. Comparando estos resultados con los del presente trabajo en el que se analizaron 35 
individuos provenientes de capturas realizadas en distintas provincias del área de distribución de C. 
musculinus ya mencionadas, en este estudio no se encontraron polimorfismos dentro de cada una de 
las especies analizadas. Esto puede deberse a que se utiliza un marcador molecular diferente que se 
encuentra suficientemente conservado de modo que todos los miembros de la misma especie tienen 
una secuencia de ADN muy similar, indicando que puede no existir una correlación entre las 
distancias genéticas y geográficas; en cambio el marcador D-loop es conocido como el más variable 
en tamaño, en organización y en composición de nucleótidos (González Ittig & Gardenal, 2002). 
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ISSN: 2595-573X 
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El agrupamiento observado de las especies mediante distancias genéticas (Figura 4), es 
coincidente con los agrupamientos en los estudios evolutivos realizados por Haag et al. (2007) 
utilizando el mismo gen. 
Si bien sería conveniente ampliar el número de roedores por cada una de las especies en 
estudio, los resultados aquí presentados demuestran que la técnica es eficiente para el objetivo 
propuesto. 
 
5 CONCLUSIÓN 
Analizar los datos que aporta la vigilancia epidemiológica permite conocer la distribución de 
los factores que afectan directa o indirectamente la salud de la población, identificando precozmente 
los hechos que impliquen un riesgo para la salud pública. Es sustento para la planificación, ejecución 
y evaluación de las acciones de salud y una de las principales herramientas para conocer el 
comportamiento de las enfermedades, en particular de las que tienen potencial epidémico, 
permitiendo generar acciones para limitar su impacto. 
En este trabajo, el uso de la enzima de restricción AluI utilizando la técnica de PCR-RFLP 
para el gen Ctyb permitió diferenciar las 4 especies de roedores analizadas (C. musculinus, C. 
callidus, C. boliviae y C. laucha). La ventaja de utilizar esta técnica se basa en la posibilidad de 
reducir el número de especímenes que deberán identificarse por secuenciación, priorizando, de esta 
manera, el análisis virológico. 
Por otra parte, se observó que la menor concentración de enzima utilizada resultó suficientepara la obtención de patrones de restricción, sin necesidad de corridas electroforéticas prolongadas. 
Además, se determinó que la metodología empleada resulta aproximadamente 75% menos 
onerosa que la secuenciación genómica, por lo que es sumamente ventajosa para este objetivo. 
 
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