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MANUAL DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Práctica 1 – Bioseguridad y elementos del laboratorio de Microbiología PRINCIPIOS DE BIOSEGURIDAD ● Bioseguridad La seguridad biológica o bioseguridad, es la aplicación del conocimiento, de las técnicas y de los equipos necesarios para prevenir la exposición del personal del área de laboratorio y del medio ambiente a agentes potencialmente infecciosos o biopeligrosos. ● Agentes Biopeligrosos Son todos aquellos agentes biológicos y materiales que son potencialmente peligrosos, patógenos para los seres humanos, los animales y las plantas. Entre ellos podemos citar: bacterias, virus, hongos, parásitos, productos recombinantes, alergenos, priones, etc. ● Riesgo Microbiológico El Riesgo Microbiológico se encuentra presente cada vez que se realiza una actividad práctica en el laboratorio, donde se requiera la manipulación de cultivos de microorganismos, los cuales pueden alcanzar concentraciones muy elevadas y pueden llegar a provocar una infección si no son manipulados adecuadamente. Para que se produzca un accidente por un agente biológico deben estar presentes básicamente 4 elementos: un huésped susceptible, un agente infeccioso, una concentración suficiente de éste y una ruta de transmisión adecuada; siendo este último punto el que mejor se puede controlar en el laboratorio. ● Vías de Infección Los microorganismos pueden ingresar al organismo a través de: la boca, los pulmones, la piel (intacta o lesionada), la conjuntiva, etc. Las vías de contaminación más frecuentes en el laboratorio se dan a través de: La boca o Comer o beber en el laboratorio. o Realizar transferencias con pipetas sin utilizar ningún tipo de protección. o Transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos o utensilios contaminados (lápices, bolígrafos, etc.). La piel o Inoculación accidental con una aguja hipodérmica u otros instrumentos punzantes o de vidrio. o Cortaduras o rasguños. 2 Los ojos o Salpicaduras de materiales infecciosos. o Transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos contaminados. Los pulmones o Inhalación de microorganismos transportados por el aire (aerosoles). MEDIDAS EN CASO DE EMERGENCIA A continuación, mencionaremos los pasos que se deben seguir en caso de que ocurran los siguientes accidentes: Derrame de material biológico sobre el cuerpo: o Remover la ropa inmediatamente. o Lavar vigorosamente el área expuesta con agua y jabón por un minuto. o Reportar el incidente al profesor. o Buscar atención médica si es necesaria. o La ropa contaminada debe ser colocada en una solución desinfectante antes de ser lavada. Salpicaduras en los ojos con materiales biopeligrosos: o Lavar inmediatamente el globo ocular e interior de la superficie del párpado con abundante agua durante 15 minutos aproximadamente. Abrir el ojo para asegurar efectivamente el lavado, comenzando por los párpados. o Reportar el incidente al profesor. o Buscar atención médica inmediatamente. Cortes menores y heridas por pinchazo: o Lavar vigorosamente la herida con agua y jabón por varios minutos. o Aplicar un antiséptico adecuado o Reportar el incidente al profesor. o Buscar atención médica inmediatamente. En el caso de derrames: o Reportar el incidente al profesor. 3 o Colocarse guantes y cubrir con papel absorbente el área del derrame. o Verter un desinfectante adecuado y dejar actuar por el tiempo necesario. o Retirar el material absorbente junto al material roto y colocarlos en un recipiente para residuos contaminados o bolsa de desechos, la cual debe esterilizarse junto con los guantes utilizados. o Limpiar y desinfectar nuevamente el área empleando nuevas toallas de papel y desinfectante. o Lavarse las manos con abundante agua y jabón. El éxito de estas normas depende de la sinceridad, la constancia, la participación activa y cooperativa de cada estudiante, por ello antes de asistir al laboratorio, deben leer el fundamento y las actividades a realizar, para así evitar posibles accidentes, con el conocimiento y las técnicas de trabajo apropiadas. 4 EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA - ELEMENTOS DEL LABORATORIO La principal función del Laboratorio de Microbiología Clínica es ayudar al médico en el diagnóstico y tratamiento del paciente con enfermedades infecciosas. OBJETIVO Conocer los equipos, materiales y reactivos utilizados en el laboratorio microbiológico, en cuanto a su manejo y cuidados. Aprender a utilizar los equipos disponibles en el Laboratorio de la Facultad de Medicina. EQUIPOS A) EL MICROSCOPIO Proporciona la amplificación aparente que nos permite ver organismos y estructuras invisibles a simple vista, con una amplificación desde cien a cientos de miles de veces. Las dos categorías de microscopios disponibles son los microscopios ópticos (de luz) y los microscopios electrónicos. 5 B) AUTOCLAVE Esteriliza por el calor del vapor generado, manteniendo por 15 min, 1210, a presión superior de lo normal, de 1 atm. Este método implica desnaturalización proteica, fusión y desorganización de membranas, y/o la ocurrencia de procesos oxidativos irreversibles. Partes: 1. Fuente de calor 2. Cámara de esterilización 3. Aparatos de control Esterilización a 1,5 atmósfera de presión, aproximadamente 121ºC durante 15 minutos. Usar indicadores de esterilización: Cintas indicadoras de esterilización. C) ESTUFAS O INCUBADORAS ● Incubación o de cultivo (Mantienen temperaturas de 35 a 37 ºC.) ● Esterilización (calor seco, a 80 ºC, en equipos de vidrio y plástico, variando el margen de tiempo) D) LA CENTRIFUGA Una centrifuga es una máquina que pone en rotación una muestra para poder separar sus fases (generalmente una fase sólida de una líquida) a través de la fuerza centrífuga que se genera. La centrifugación es un método mecánico de separación de líquidos no miscibles, o de sólidos y líquidos por la aplicación de una fuerza centrífuga. Este aparato somete la muestra a fuerzas de aceleración que obligan a las moléculas a concentrarse en el fondo del envase utilizado, separándolas del medio en que se encuentran. E) OTROS EQUIPOS Y ELEMENTOS NECESARIOS − Asa bacteriológica con alambre de níquel-cromo. − Baja lenguas desechables. − Balanza analítica. − Bandejas para coloraciones. − Baño maría para temperaturas variables hasta 80 ºC. 6 − Bisturí con hojas desechables. − Cepillos para limpiezas de tubos diversos. − Congeladora. − Cubetas para coloraciones. − Embudos de varios tamaños. − Espátulas. − Frascos de boca ancha y tapa rosca. − Frascos de Erlenmeyer − Gradillas para tubos de ensayo, centrífuga y de precipitación − Heladera − Jarra con tapa hermética para anaerobios y atmósfera de CO2. − Jeringas estériles desechables de 1, 3, 5 y 10 ml. − Láminas portaobjetos. − Laminillas cubreobjetos. − Lancetas estériles desechables − Lápices, marcadores para vidrio. − Reloj “Timer”, de 0 a 60 minutos. − Soporte para coloraciones. − Tela metálica. − Trípode metálico. − Tubos cónicos para centrífuga de 10 a 15 ml. − Tubos de ensayo con tapa rosca, de distintos tamaños. − Tubos de ensayo, de distintos tamaños. − Varillas de vidrio. − Vasos de precipitados de 250, 500 y 1000 ml, − Vasos cónicos, de 250 y 500 ml. − La lista de equipos necesarios en un laboratorio de microbiología puede muy extensa, y debe adecuarse a las necesidades en cada caso. 7 ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO Introducción: En el laboratorio de microbiología es imprescindible trabajar con material y soluciones estériles con objeto de que los resultados que se obtengan correspondan a los microorganismos que están presentes en la muestra en estudio y no a contaminantes procedentes del medio o de los materiales. Para ello antes de comenzar el trabajo práctico se esterilizará, junto con los medios de cultivo, el material que posteriormente va a ser utilizado. Objetivos Que el alumno conozca los principios generales de la preparación y técnicas de esterilización de diversos materialesy medios de cultivo de uso común en Microbiología. Conocer el efecto de las condiciones de asepsia en el control de la contaminación microbiana en el laboratorio. Concepto: Esterilización es un término absoluto que implica la pérdida de la viabilidad de todos los microorganismos contenidos en un objeto o sustancia, o su separación de acuerdo al método empleado. Se entiende por pérdida de viabilidad, a la pérdida irreversible de la capacidad de reproducción, no implicando necesariamente la destrucción de todas las enzimas constitutivas o de sus productos metabólicos: toxinas, etc., los que podrían permanecer luego del proceso de esterilización. Un ejemplo de ello son las sustancias piretógenas que no son eliminadas de los inyectables por el proceso de esterilización habitual, (piretógenas son sustancias por lo general no proteicas, que introducidas al torrente sanguíneo provocan un cuadro febril). En la práctica microbiológica es necesario llevar a cabo la esterilización, al fin de que al sembrar un microorganismo determinado en un cierto medio de cultivo las 8 manifestaciones de vida que se evidencian se puedan asignar con seguridad a dicho microorganismo y no a una mezcla de varios. Para lograr la esterilización de un material se cuenta con varios métodos, cuya elección depende de: 1- La sensibilidad del material al agente esterilizante. 2- La penetrabilidad del agente en el material de esterilización. 3- La presentación del material, referido al tamaño o volumen. 4- El uso posterior del material Los métodos habituales de esterilización son los siguientes: A) FISICO-QUIMICOS (provocan la pérdida de la viabilidad) a) Métodos Físicos: * Radiaciones * Calor b) Agentes Químicos: * Oxido de propileno * Óxido de Etileno * Formaldehido B) MECANICOS: Filtración esterilizante (separación de los microorganismos) a) Métodos de esterilización basados en la muerte microbiana b) Métodos físicos. CALOR: Aquellos que utilizan el calor como métodos de esterilización lo podemos dividir en el esquema siguiente: Flameado Acción directa de la llama Rojo incipiente Incineración Acción de la llama de alcohol Calor Seco 9 Acción indirecta de la llama u otros Estufas de calor seco Generadores de calor Ebullición directa Acción del agua caliente Baño María hirviente Tindalización Pasteurización Calor Húmedo A presión normal (vapor fluente) Acción del vapor de agua A presión superior a la normal (autoclave) CALOR HÚMEDO: Los métodos basados en la aplicación del calor como agente esterilizante son preferidos para esterilizar todos los materiales, excepto aquellos que sufren daños por su termosensibilidad. El proceso es rápido, todos los microorganismos son susceptibles, y el calor llega a lugares que podrían estar protegidos para agentes químicos. El mecanismo de este método como agente esterilizante implica desnaturalización proteica, fusión y desorganización de membranas, y/o la ocurrencia de procesos oxidativos irreversibles. La acción deletérea sobre lípidos y proteínas requiere mayores temperaturas, cuando el material está totalmente seco. Para lograr una esterilización confiable el método estándar, es el vapor saturado en autoclave, a una temperatura de 121º C, durante 15 minutos. Esta temperatura se logra por vapor de agua a una atmósfera de presión por sobre la atmosférica. ¿Qué es el vapor saturado?: es cuando el vapor que ocupa o colma un ambiente dado, está constituido por el máximo posible de agua que, de acuerdo con el volumen y la 10 temperatura del recinto, puede estar suspendida en forma de vapor y no de líquido. El vapor saturado es el más concentrado que puede existir en un recinto de volumen y temperatura dados. Es el máximo y constante poder esterilizante. La rápida acción del calor depende en parte, del alto valor del calor latente de vaporización del agua (540 cal/gr), que hace que los objetos fríos sean rápidamente calentados por condensación del vapor sobre su superficie. En el uso de la autoclave, es muy importante permitir que el vapor fluente desplace totalmente el aire de la cámara de esterilización que está ocupando la parte inferior de la misma, del material que se va a esterilizar y de los componentes de protección aséptica del mismo. De no ser así la presión resultante será la suma de las presiones parciales del aire y del vapor del agua, la temperatura resultante será lo tanto menor, cuanto mayor contenido de aire tenga la cámara. A este procedimiento de eliminación de todo el aire que contenga la autoclave se denomina purgado. Los recipientes a colocar en las autoclaves, no deben estar totalmente llenos, y deben tener tapas flojas o estar tapados con algodón, con una sobre tapa, para permitir la ebullición libre y la liberación del aire disuelto. Con objetos porosos grandes o grandes volúmenes de líquido, debe permitirse un mayor tiempo de purgado. La esterilización en autoclave se utiliza para todo material termorresistente que no sea afectado por el vapor de agua, y para microorganismos situados en la superficie del material insoluble y también de aquellos situados en la masa hidrosoluble del material a esterilizar Se utiliza para esterilizar medios de cultivo y soluciones. Cuando el calor puro proviene de la disociación del vapor al chocar contra una pared más fría, atraviesa dicha pared, y del otro lado se encuentra con agua líquida que puede ser destilada o una solución acuosa (que se está sometiendo a esterilización), dicho calor se asocia nuevamente al agua, y se vuelve a potenciar su poder mortífero, la 11 diferencia es que el agua que se asocia al calor, se halla en estado líquido en vez de estarlo en forma de vapor. También se usa para esterilizar, la ropa de cama y el material textil en general, siempre que la autoclave este provisto de un sistema de secado por vacío. No se utiliza para esterilizar, los líquidos que forman emulsiones con el agua, ej. Aceites o vaselina (los que se deben esterilizar por calor seco, en estufa, teniendo la precaución de que la temperatura de esterilización no sea superior a la temperatura de descomposición del aceite). Tampoco se esterilizan de esta manera sólidos y materiales pulverulentos Insolubles, como caolín, talco. Es decir que el vapor de agua saturado y a una temperatura de 121º-123ºC sólo serviría para esterilizar las superficies de materiales, ya sean sólidos o líquidos. El material de vidrio puede ser esterilizado por autoclave, pero luego debe ser secado. Por esta razón habitualmente se lo esteriliza en estufa a 160-170 ºC durante 1-2 horas. AUTOCLAVE Normas de uso generales: Controlar siempre el autoclave antes de usar: a) El nivel de agua: completar con agua desionizada en caso necesario. b) Posición abierta de la espita. c) Funcionamiento de la válvula de seguridad. Cumplidos estos requisitos se procede a: a) Introducir y disponer correctamente el material a esterilizar. 12 b) Cerrar perfectamente la tapa c) Encender la fuente de calor. d) Purgar perfectamente para eliminar el aire del interior de la cámara de esterilización e) Cerrar la espita. f) Cuando alcanza la presión deseada (indicadora de la temperatura), se comienza a contar el tiempo de esterilización regulando la llama a fin de mantener la presión uniforme durante todo el proceso de esterilización. g) Una vez concluido el proceso apagar la fuente de calor y dejar disminuir la presión espontáneamente sin abrir la espita. No enfriar artificialmente la autoclave. h) Cuando el manómetro indica que la presión ha llegado a cero, abrir la espita a fin de eliminar cualquier exceso de presión residual. i) Abrir la autoclave y retirar el material estéril. Cuando la autoclave no está en uso, la tapa debe permanecer apoyada sobre el cuerpo de la autoclave. Limpiar periódicamente la cámara y el depósito de agua a fin de eliminar posibles incrustaciones. Ventajas del calor húmedo: 1) Rápido calentamientoy penetración. 2) Destrucción de bacterias y esporas en corto tiempo. 3) Bajo deterioro del material expuesto (por menor temperatura y menor tiempo). 4) No deja residuo toxico 5) Es económico Precauciones: 1) Eliminación total del aire de la cámara de esterilización. 2) Es posible el sobrecalentamiento del vapor con daño del material. 3) No se puede usar para esterilizar aceite, grasas, o polvos. CALOR SECO: 13 Aquí son primordiales los procesos oxidativos y de fusión de membrana por sobre la desnaturalización proteica. Los métodos más empleados son: 1)Acción directa de la llama: a) Flameado: Se aprovecha la llama de un mechero de Bunsen o similar. Se utiliza para esterilizar varillas, planchas de vidrio, espátulas, bocas de recipientes de vidrio, etc. Más que un método real de esterilización, reduce la chance por contaminación ambiental. b) Rojo incipiente: Consiste en calentar directamente a la llama, llevando hasta rojo incipiente y manteniendo unos segundos en este estado. Se utiliza para ansas de platino, lancetas, agujas de disección, etc. c) Acción de la llama de alcohol: Se vierte una cantidad apropiada de alcohol que permita, al encenderlo, que su llama alcance toda la superficie a esterilizar durante varios minutos. Se utiliza para morteros, material de vidrio, material de cirugía, etc. (Es un procedimiento de emergencia). d) Incineración: Obviamente es utilizado para material de descarte. 2) Acción del sobrecalentamiento Estufas u hornos de esterilización por calor seco. El agente esterilizante es el aire caliente seco. El proceso de esterilización requiere mayor temperatura y tiempo que en el caso del vapor saturado, ya que el aire tiene una menor capacidad para tomar, transportar y ceder el calor. Debe permitirse la convección del aire no colocando grandes paquetes de material que obstruyan su circulación. El calor se dirige desde los puntos de mayor temperatura a los de menor temperatura, cesando la propagación del calentamiento cuando en todos los puntos se igualó la temperatura. La temperatura de esterilización debe variar entre 150,170 ºC, requiriéndose distintos tiempos de esterilización (desde 5 hs a 140ºC hasta 1 hora a 170ºC). 14 En caso de tratarse de material voluminoso o difícilmente penetrable por el aire, los tiempos deben ser aumentados. El papel y el algodón, así como el material acondicionado con elementos, no deben esterilizarse a más de 160ºC, ya que se carbonizan. En forma estándar, para material de vidrio, placas de petri, tambores con pipetas, etc. se utilizan 2 hs. A 160ºC. NORMAS DE USO GENERAL. 1) Cargar la estufa de forma tal que: a) No impida la convección del aire. b) El material no toque las paredes 2) Controlar la posición del termómetro: Su bulbo no debe tocar la carcasa metálica, ni la puerta, pues se podrían registrar temperaturas falsas (mayores que las reales). 3) Poner en funcionamiento. 4) Cuando se alcanza la temperatura deseada comenzar a contar el tiempo de esterilización. 5) Terminado el tiempo de esterilización, dejar enfriar antes de retirar el material. Práctica 1 – BIOSEGURIDAD - ELEMENTOS DEL LABORATORIO -ESTERILIZACIÓN Nombre del alumno…………………………………………………………………………... Fecha…………………………………………………………………………………………. Sección……………………………………………………………………………………….. Número de grupo……………………………………………………………………………... 1-Reconocimiento del laboratorio, elementos de laboratorio y reactivos. Ubicación de los equipos. 2-Ubicación de los lugares del lavado de manos, disposición correcta de los residuos. 3- Manejo de las normas de bioseguridad y esterilización en el laboratorio de Microbiología. 15 OBJETIVOS CUESTIONARIO 1. Cita al menos dos microorganismos según su grupo de riesgo 1, 2, 3 y 4 Grupo de riesgo tipo 1 1) 2) Grupo de riesgo tipo 2 1) 2) Grupo de riesgo tipo 3 1) 2) Grupo de riesgo tipo 4 1) 2) 2. Cuáles son las medidas de protección personal imprescindibles en el laboratorio de Microbiología Clínica. Las barreras protectoras. 3. Describe los cuatro niveles de bioseguridad en cuanto al equipo de seguridad utilizado para cada uno. 4. Explica el método de esterilización que utiliza la autoclave. Práctica 2 – MANEJO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO – EXAMEN EN FRESCO DE MUESTRAS BIOLÓGICAS Nombre del alumno…………………………………………………………………………... Fecha…………………………………………………………………………………………. Sección……………………………………………………………………………………….. Número de grupo……………………………………………………………………………... OBJETIVO 16 1. El alumno deberá reconocer el microscopio compuesto, su utilidad y cuidados, identificar cada una de sus partes y manejar correctamente, observando la presencia de microorganismos en muestras biológicas. 2. Reconocer la presencia de leucocitos, hematíes, células epiteliales, otros, en muestras biológicas. Determinar su importancia. MATERIALES MUESTRAS Microscopio Orina u otro líquido o secreción biológica Centrífuga Porta y cubre objetos Tubos cónicos Pipeta Pasteur o automática Papel tisú Hipoclorito de sodio al 10% INTRODUCCION El microscopio es el instrumento más frecuentemente utilizado y el más útil en un laboratorio de microbiología, mediante la amplificación de imágenes nos permite ver organismos y estructuras invisibles a simple vista. Las dos categorías de microscopios disponibles son los microscopios ópticos y los microscopios electrónicos. Los microscopios ópticos utilizan un sistema de lente ópticas y comprenden los microscopios de campo claro, campo oscuro, fluorescencia y contraste de fases. Los microscopios electrónicos emplean haces de electrones en lugar de ondas de luz para producir una imagen ampliada. El microscopio óptico (de luz): El microscopio simple: presenta un solo lente. 17 El microscopio compuesto: utiliza un sistema de lentes ópticos que va amplificando la imagen sucesivamente y comprende: - Microscopio de campo claro - Microscopio de campo oscuro - Microscopio de fluorescencia - Microscopio de contraste de fases El microscopio óptico compuesto Es importante recordar algunos conceptos sobre las partes, usos y cuidados del microscopio. Es el instrumento más ampliamente utilizado para microscopía de rutina. Aquí el área observada está brillantemente iluminada y los objetos en estudio aparecen más oscuros. Generalmente producen un aumento útil de unos l000 diámetros. La amplificación se logra mediante el uso de sistemas de lentes diseñados y acomodados para proporcionar la amplificación en forma óptima. Presenta lentes en el condensador, en los objetivos y en los oculares. El lente del condensador enfoca un cono de luz sobre el campo donde se coloca la muestra. Algunos de los rayos de luz de este cono pasan directamente al lente del objetivo para formar el fondo de luz o campo claro. Los rayos de luz que chocan con los objetos (microorganismos) que hay en la muestra y se “curvan”, son conducidos al lente del objetivo para formar una imagen del objeto. La imagen es amplificada por la lente ocular. Comúnmente los microscopios están equipados con tres o más objetivos, y se encuentran montados en una plataforma llamada revólver, que al hacerse girar pone a uno de ellos en la línea del condensador. Cada objetivo proporciona distinto grado de aumento. 18 El poder de resolución: Es la capacidad del sistema óptico del microscopio para diferenciar dos puntos próximos entre sí y está determinado por la longitud de onda de la luz y por una propiedad del objetivo y del lente del condensador. Sistema mecánico: Base, brazo, cuerpo del tubo, tubo intercambiable del microscopio, platina, revólver, objetivos de 10, 40 y 100 X, tornillo macrométrico, tornillo micrométrico, condensador y diafragma. Condensador: Conjunto de lentes convergentes que distribuye la luz emitida desde la fuente luminosa. Diafragma: Regula la intensidad de la luz emitida desde la fuente luminosa. MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO OPTICO. 1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente.Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones 2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas. 3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el 10x directamente. 4. Para realizar el enfoque: a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos. b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe una imagen nítida de la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino. 5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. Actividad - EXAMEN EN FRESCO DE ORINA 19 1. Homogeneizar la orina. 2. Colocar 10 ml de orina en un tubo de ensayo. 3. Centrifugar a 2500 rpm, por 5 minutos. 4. Eliminar la parte líquida, y observar el sedimento en el microscopio 5. Con la pipeta recoger 20 microlitros del sedimento (Con pipeta). 6. Colocar sobre la lámina y cubrir con laminilla. 7. Enfocar la imagen en el microscopio. 8. Observar a 40 X. CUESTIONARIO 1- ¿Qué es poder de resolución? 2- ¿Cuál es la función del diafragma y del condensador? Diafragma: Condensador: 3- ¿Qué pudiste observar en las muestras que se estudiaron? 4- ¿Qué importancia tiene el observar los leucocitos, hematíes y otros elementos en el examen en fresco de muestras biológicas? 20 5- Escribe el nombre de cada una de las partes del microscopio compuesto: Notas de la práctica: Práctica 3 - TINCIÓN DE GRAM Nombre del alumno…………………………………………………………………………... 21 Fecha…………………………………………………………………………………………. Sección……………………………………………………………………………………….. Número de grupo……………………………………………………………………………... OBJETIVO El alumno aplicará una técnica de coloración diferencial para la identificación de bacterias Gram positivas y Gram negativas. MATERIAL Asa de platino Microscopio Porta objetos Aceite de inmersión Cultivos SUSTANCIAS COLORANTES Colorante violeta cristal Solución decolorante alcohol-acetona Safranina Lugol INTRODUCCIÓN TINCI ÓN DE GRAM Tinción empleada en microbiología para la visualización de bacterias en muestras clínicas. También se emplea como primer paso en la diferenciación bacteriana. El examen con microscopio óptico de preparación con tinción de Gram se emplea de rutina para determinar la forma de las bacterias. Las formas comunes son cocos (esféricas), bacilos (alargadas) y formas espiraladas. Y las bacterias pueden diferenciarse con esa tinción en dos grupos. Los microorganismos Gram positivos se tiñen de azul o violeta, mientras que los Gram negativos se tiñen de rojo o rosa. Las aplicaciones más comunes de la coloración de Gram son las siguientes: La presencia de cocos Gram positivos agrupados (en duplos, tétradas o racimos), sugiere estafilococos; en duplos, en cadenas cortas o largas sugiere estreptococos; en forma de lanceoladas a los diplococos, ejemplo Streptococcus pneumoniae. La presencia de diplococos Gram negativos son características de especies de Neisseria. 22 Los bacilos Gram positivos grandes sugieren especies de Bacillus o Clostridium, los bacilos Gram positivos pequeños sugieren especies de Listeria. Bacilos Gram negativos incluyen a enterobacterias, bacilos no fermentadores y especies de Haemophilus. El valor diagnóstico de esta tinción es variable; normalmente permite una buena orientación al microbiólogo para seleccionar las técnicas de cultivo más adecuadas y también tiene valor en orientar hacia un diagnóstico etiológico, en especial para instaurar un tratamiento inicial. PROCEDIMIENTO REALIZACION DEL FROTIS 1. Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. 2. Flamear el asa de siembra, tomar en condiciones asépticas la muestra del contenedor. 3. Remover con el asa de siembra la mezcla hasta formar una suspensión homogénea que quede bastante extendida para facilitar su secado. - Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensión bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos. 4. Esperar hasta que el líquido se evapore. Fijar pasando a través de la llama del mechero, una vez que la lámina se seque. TINCIÓN DE GRAM 1. Teñir con cristal violeta 1 min. 2. Lavar con abundante agua el exceso de colorante 3. Cubrir con Lugol 1 min. 4. Lavar con agua el exceso de Lugol. 5. Decolorar con alcohol-acetona (5 segundos). 6. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente 7. Teñir con safranina 1 min. 8. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste 9. Secar la preparación 23 10. Aplicar una gota de aceite de inmersión a la lámina en la zona coloreada y observar en el microscopio a 100 X CUESTIONARIO 1. ¿Qué es un Frotis? 2. ¿Cuál es la utilidad de la tinción de Gram en las muestras biológicas? 3. ¿Por qué es necesario emplear aceite de inmersión para la observación de los microorganismos? 4. ¿Qué función tiene el Yodo en la tinción de Gram? 5. ¿Qué coloración tiñen las bacterias Gram positivas? 6. ¿Qué coloración tiñen las bacterias Gram negativas? 7. Menciona dos bacterias que tiñen Gram positivas y escribe la patología que producen cada una. - - 8. Menciona dos bacterias que tiñen Gram negativas y escribe la enfermedad que causa cada una. 24 - - Práctica 4 - TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN TINCIÓN ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTE Nombre del alumno…………………………………………………………………………... Fecha…………………………………………………………………………………………. Sección……………………………………………………………………………………….. Número de grupo……………………………………………………………………………... INTRODUCCIÓN La tinción de Ziehl-Neelsen se conoce como “coloración en caliente” porque se utiliza calor para facilitar la penetración del colorante a través de la pared celular. La gran cantidad de lípidos, ácidos micólicos presentes en la pared celular bacteriana, es la causa de la alta absorción y retención de la fucsina. Utiliza calor para facilitar la penetración del colorante a través de la pared celular. El ácido micólico que es un ácido graso de largas cadenas de carbono le da un carácter hidrofóbico a la pared celular de las Micobacterias, por lo que la penetración del colorante dentro de la célula es favorecida por el calor. Una vez que ingresa el colorante a la célula, el B.A.A.R. ya no se decolora adquiriendo un característico color rojo o rosa. OBJETIVOS 1. Conocer el fundamento de la coloración de Ziehl-Neelsen. 2. Manejar el procedimiento ante una sospecha de BAAR, toma de muestra, cuidados a tener en cuenta con las muestras. 3. Identificar BAAR en muestras clínicas. MATERIALES Mechero de Bunsen o velas Asas 25 Láminas limpias y desengrasadas Colorantes de Ziehl-Neelsen Aceite de inmersión Microscopio Muestra biológica: Esputo Obs: Área de trabajo con cabina de bioseguridad que cuente con extractor de aire con filtro. Reactivos para la coloración de Ziehl – Neelsen: 1. Carbolfucsina (colorante primario). 2. Alcohol etílico – Ácido clorhídrico (decolorante). 3. Azul de metileno (colorante secundario o de contraste). Fundamento: Se basa en la capacidad que tienen ciertas bacterias de retener el colorante carbolfucsina debido a que la pared celular de estas bacterias contiene largas cadenas de ácidos grasos (ácido micólico), lo que les da a éstas la resistencia a decolorarse al adicionar alcohol–ácido. El calor permite la entrada de los colorantes básicos a la pared celular. Unavez teñida, la bacteria ácido–alcohol resistente no se decolora, mientras las otras bacterias son desteñida. PROCEDIMIENTO 1. Preparar el frotis, fijar a la llama. Colocar la lámina sobre el soporte adecuado. Cubrir la lámina con Carbolfucsina. 2. Calentar la preparación pasando ligeramente la llama del mechero varias veces por debajo de la lámina. Continuar calentando hasta la emisión de vapores blancos. Evitar la ebullición. El calor permite la entrada de la Carbolfucsina a la pared celular. 3. Mantener el calentamiento durante 5 minutos aproximadamente. Adicionar más colorante para evitar desecación. 4. Dejar que la lámina se enfríe unos segundos. Lavar con agua corriente. 5. Agregar el decolorante (Alcohol- ácido). Mantener durante 2 minutos. 26 6. Lavar la lámina con agua corriente. 7. Cubrir la lámina con azul de metileno (Colorante secundario o de contraste) por 30 segundos. 8. Lavar la lámina de nuevo con agua corriente. 9. Observar al microscopio con el objetivo de 100x y con una gota de aceite de inmersión. Las bacterias que resisten la decoloración se observan de color rosado intenso mientras las otras son desteñidas y toman el color del colorante de contraste que es azul. Informes de búsqueda de BAAR: − No se observa BAAR. (No se observa BAAR) 27 − 1 a 9 bacilos en 100 campos observados . Informar la cifra exacta. 10 a 99 BAAR en 100 campos observados. (+) − 1 a 10 BAAR en 50 campos observados. (++) − Más de 10 BAAR en promedio en 20 campos. (+++) CUESTIONARIO 1. Explica brevemente el fundamento la coloración de Ziehl Neelsen 2. ¿Cuándo solicitar una baciloscopía y cultivo en búsqueda de BAAR? 3. ¿Cuál es el agente causal de la Tuberculosis? ¿Cuáles son sus características? 28 Notas de la práctica: Práctica 5 - DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTITREPONÉMICOS Nombre del alumno…………………………………………………………………………... Fecha…………………………………………………………………………………………. Sección……………………………………………………………………………………….. Número de grupo……………………………………………………………………………... FUNDAMENTO Los anticuerpos presentes en individuos infectados por T. pallidum se detectan en suero por la reacción con el antígeno cardiolipínico. Si la muestra contiene el anticuerpo, éste se unirá al antígeno produciendo una floculación visible en microscopio. OBJETIVO Detección de los anticuerpos anti-treponémicos MATERIAL SUSTANCIA Lámina de vidrio Reactivo VDRL. Microscopio Control positivo Algodón Control negativo. Pipeta automática, punteras 29 Jeringa Alcohol al 70% Muestra: Suero del paciente INTRODUCCIÓN La prueba del VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) constituye una técnica serológica con la suficiente sensibilidad y especificidad para complementar el diagnóstico de sífilis y analizar la respuesta al tratamiento específico. Su costo y complejidad la hacen ideal para el estudio de esta enfermedad de trasmisión sexual en grandes masas de población. El médico de la familia es el máximo responsable de los programas nacionales para el control de las enfermedades sexualmente trasmisibles; por tanto, entre sus funciones básicas se encuentran la indicación y la interpretación a primera instancia de los resultados de ésta. VDRL es una técnica de floculación que utiliza el antígeno de cardiolipína para detectar anticuerpos antitreponémicos inespecíficos producidos por el individuo ante una infección sifilítica. Se practica normalmente en lámina de cristal, en la que se mezcla el suero del paciente, con una suspensión fresca de antígeno de cardiolipina; esta mezcla se agita de forma rotatoria y al cabo de pocos minutos puede observarse la floculación utilizando un microscopio con el objetivo de 10 x; sus resultados pueden expresarse tanto cualitativa como cuantitativamente (haciendo diluciones). PROCEDIMIENTO 1- Colocar 20 microlitros de suero en el primer círculo y 20 microlitros del antígeno. 2- Homogeneizar. 3- Agitar suavemente por 2 minutos. 4- Observar con el aumento de 10x 5- Anotar lo observado. CUESTIONARIO 30 1. ¿En que se fundamenta la técnica detección de anticuerpos antitreponémicos, VDRL? ¿Cuál es la reacción que ocurre? 2. ¿En qué casos podría dar falsos positivos? 3. Cita características del Treponema pallidum Práctica 6 - PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS SÓLIDOS - SEMBRADO EN PLACA DE MICROORGANISMOS DEL MEDIO AMBIENTE, (MANOS LIMPIAS, MANOS SUCIAS) Nombre del alumno…………………………………………………………………………... Fecha…………………………………………………………………………………………. Sección……………………………………………………………………………………….. Número de grupo……………………………………………………………………………... OBJETIVOS 1. Instruir al alumno en la preparación de los diferentes medios de cultivo. 2. Conocer el procedimiento para la obtención de medios estériles para cultivo de muestras biológicas. Utilización de la autoclave. 31 3. Observar la gran variedad de microorganismos presentes en el medio ambiente, manos y objetos inertes, determinado por las diferentes morfologías de colonias que se obtienen. 4. Verificar los efectos de un desinfectante por medio del crecimiento o no de colonias de bacterias en un medio de cultivo en cajas de Petri. MATERIALES SUSTANCIAS Matraz Erlenmeyer Agar base sangre Baño maría Agar Mc Conkey Mechero – encendedor Sangre humana Vasos de precipitado de 250 mL Espátula o varilla de vidrio Embudo Vidrio reloj. Cuchara. Cajas o placas de Petri. Papel aluminio Cintas de autoclave Pincel marcador Hisopos estériles Solución fisiológica Alcohol al 70% Autoclave Balanza analítica INTRODUCCIÓN Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el denominado Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxigeno adecuado, así como un grado correcto de acidez y alcanilidad. 32 Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. Debe ser estéril, por cual es autoclavado. La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por ello, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extracto de carne y peptona a la que se añadirían otros componentes. El agar es un elemento solidificante, muy empleado para la preparación de medios de cultivo. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre humana o de cordero, bilis, etc. Los hidratos de carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar la nutrición del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. Por su aspecto físico. Los medios de cultivo preparados pueden ser clasificados por su aspecto en: Líquidos, semisólidos, sólidos. Y por su uso en: I. Medios de cultivos básicos. II. Medios de cultivos especiales: enriquecidos, mejorados, selectivos, diferenciales, de transporte. PROCEDIMIENTO PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS SÓLIDOS 1- Leer las instrucciones del fabricante para cada medio de cultivo y pesar la cantidad necesaria según el volumen requerido. 2- Colocar el medio en un erlenmeyer que contenga el agua destilada o desionizada en el volumen requerido, agitar y calentar a ebullición para disolver el agar. Colocar una tapa y la cinta de autoclave. - En el último paso se deber tener cuidado ya que el recipiente se calienta en exceso y el producto tiende a hervir y proyectarse, lo cual puedeproducir serias quemaduras. El Agar disuelto hace transparente al medio que originalmente estaba turbio. Puede utilizarse un baño maría para aumentar la solubilidad. 3- Esterilizar la preparación a 121 oC, 1 atm de presión, durante 15 minutos. Al terminar, es conveniente mantener el mechero encendido para formar un área de esterilidad al momento del vaciado en las cajas de petri aproximadamente de 15 ml a 20 ml de agar por caja procurando que no se forman burbujas. Tapar la caja inmediatamente. 4- Para preparar el agar base sangre es necesario adicionar en condiciones de asepsia sangre desfibrinada estéril en concentración final de 5 % aproximadamente. Después de la esterilización del agar base, y una vez atemperada bajo agua de grifo, 33 alcanzando una temperatura de 50 oC aproximadamente, mezclar cuidadosamente y poner en cajas Petri estériles. VACIADO EN CAJAS DE PETRI 5- No destapar las cajas de Petri hasta el momento que vayan a ser utilizadas. Es conveniente colocarse un cubre bocas la persona que va a realizar el vaciado y evitar hablar en todo momento para no contaminar el medio de cultivo. 6- Es conveniente mantener el mechero encendido y trabajar cerca del área estéril al momento del vaciado en las cajas de petri. Se vierte 15 ml a 20 ml de agar por caja procurando que no se forman burbujas, se procede a tapar la caja inmediatamente. - Si se forman burbujas, tomar el mechero, flamear el medio de cultivo sobre la superficie de la caja de Petri y de manera rápida. Se procede a tapar la caja. 7- Esperar a que el medio solidifique, Se rotulan los medios de cultivo, anotando la fecha y con iniciales el tipo de medio de cultivo. Si las placas no se van a utilizar el mismo día se sujetan con cinta y se colocan en el refrigerador de manera invertida para evitar que el vapor condensado caiga sobre el medio de cultivo y lo pueda contaminar. 8- Cuando vayan a utilizar los medios de cultivo preparados, será necesario secar las placas invertidas en estufa a 35 a 37 °C. Antes de realizar el sembrado de microorganismos. PROCEDIMIENTO DE SIEMBRA MANOS LIMPIAS, MANOS SUCIAS U OBJETOS En esta actividad utilizaremos las placas preparadas y las manos (unas manos limpias y otras manos sin lavar ni desinfectar), u objetos inanimados escogidos, como manija, bolígrafos, celulares, etc. Esta práctica nos ayudará a confirmar la presencia de microorganismos y los efectos de un desinfectante. 1. Toma una caja de Petri sin abrir y con el marcador, divide la base de la caja en dos secciones iguales. Escribe el nombre del objeto o ML/MS al otro lado. 2. En el caso de las manos coloca directamente dedo a dedo sobre el agar. 3. En caso de objetos inanimados abre la caja de hisopos de algodón y escoge uno con cuidado para no tocar la punta. Limpia tu objeto escogido con todos los lados de la punta del hisopo volteándolo y retorciéndolo el hisopo a medida que lo mueves por la superficie del objeto. (Media placa para antes de limpiar y media placa para luego de desinfectarlo, esto con el fin de compararlo). 4. Abre la tapa de la caja y suavemente haz las siembras sobre la superficie de la caja. Presiona firme pero suavemente y no retiñas las siembras anteriores. Tus siembras solo deben dejar una impresión muy ligera en el Agar. 5. Esteriliza los hisopos quemándolos o usando desinfectante y descártalos en la bolsa de residuos biológicos. 34 6. Incubar a 35°C por 24 hs. 7. Limpia tu área de trabajo con la solución desinfectante y lava tus manos. 8. Después de que hayan pasado 24 hs, mirar cuidadosamente las cajas de Petri iniciales. 9. PARA DESECHAR cuidadosamente sellar con cintas adhesivas las placas, arrojarlas en la bolsa de residuos biológicos. Y/o el profesor se encargará de destruir los residuos biológicos. Limpia tu área de trabajo con la solución desinfectante. FUNDAMENTO La población microbiana existente en nuestro entorno es grande y compleja. Cientos de especies microbianas habitan normalmente en distintas partes de nuestro cuerpo, incluídas la boca, el tracto intestinal, la piel (manos), etc., a la cual se les denomina microbiota normal, pero también podríamos contaminarnos con bacterias patógenas, por lo cual es importante el lavado correcto y frecuente de las manos sobre todo en personales de la salud. Las células microbianas se reproducen tan rápidamente y las muestras sembradas en placas de Petri con medios de cultivo específicos se hacen visibles en un lapso de 18 a 24 horas, éstas masas visibles de células son denominadas colonias. Las cuales podrán ser observadas, diferenciadas, etc, en los medios de cultivo, para su identificación y estudio. CUESTIONARIO 1- ¿Qué es un medio de cultivo? 2- ¿Qué finalidad tiene utilizar medios de cultivos sólidos? 3- Cita el nombre de medios de cultivos que pueden ser empleados en el laboratorio de microbiología según sus caraterísticas. Selectivos Diferenciales De transporte Suplementados 35 - - - - - - - - 4- Escribe la composición química para cada medio de cultivo que utilizaste. Agar base sangre: Agar Mc Conkey: 5- Completa en la siguiente tabla anotado X en los espacios correspondientes a las divisiones realizadas en donde hayan crecido los microorganismos. MEDIOS DE CULTIVO AGAR MC CONKEY Placa 1 Placa 2 MUESTRA SIEMBRA 1 2 1 2 CRECIMIENTO Obs: MEDIOS DE CULTIVO AGAR SANGRE 36 Placa 1 Placa 2 MUESTRA SIEMBRA 1 2 1 2 CRECIMIENTO Obs: Práctica 7 - PARASITOLOGÍA Nombre del alumno…………………………………………………………………………... Fecha…………………………………………………………………………………………. Sección……………………………………………………………………………………….. Número de grupo……………………………………………………………………………... INFORME Paciente: Número de muestra: Edad: ÁNALISIS DE HECES Vermes: 37 Protozoarios: Leucocitos: Hematíes: Práctica 8 - MICOLOGÍA Nombre del alumno…………………………………………………………………………... Fecha…………………………………………………………………………………………. Sección……………………………………………………………………………………….. Número de grupo……………………………………………………………………………... INFORME Número de muestra: EXAMEN EN FRESCO CON AZUL DE LACTOFENOL Esporos micóticos: Seudohifas: 38 Formas levaduriformes: Formas filamentosas: Compatibles con: 39
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