ACTIVIDAD 2 PRUEBAS BIOQUÍMICAS

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TSI LIA MIO SIM
Triple Sugar Iron Agar Lisina Hierro Agar Movilidad indol, ornitina Medio sulfuro, indol y movilidad
PRO
PÓSI
TO
Observar la fermentación de
carbohidratos en la familia
Enterobacteriaceae
Diferenciar microorganismos, especialmente
Salmonella spp.
Identificar enterobacterias con en base
en movilidad, producción de indol y
actividad de ornitina descarboxilasa.
Verificar movilidad, producción
de indol y de SH2 . Útil para
diferenciar miembros de la
familia Enterobacteriaceae.
FUNDA
MENTO
El extracto de carne y la
pluripeptona aportan
nutrientes.
Lactosa, sacarosa y glucosa
son los carbohidratos
fermentables. El tiosulfato de
sodio es el sustrato para
producción de H2S, el sulfato
de hierro y amonio, es la
fuente de iones Fe3+ , los
cuales se combinan con el
ácido sulfhídrico y producen
sulfuro de hierro, de color
negro. El rojo de fenol es el
indicador de pH. Por
fermentación de azúcares, se
producen ácidos, que se
detectan por medio del
indicador rojo de fenol, el
cual vira al color amarillo en
medio ácido. El tiosulfato de
sodio se reduce a sulfuro de
hidrógeno que reacciona
luego con una sal de hierro
proporcionando el típico
sulfuro de hierro de color
negro.
Peptona y extracto de levadura aportan los
nutrientes. Glucosa es el carbohidrato
fermentable y la lisina es el sustrato utilizado
para detectar la enzimas decarboxilasa y
deaminasa. El citrato de hierro y amonio y el
tiosulfato de sodio son los indicadores de la
producción de HS. El púrpura de bromocresol,
es el indicador de pH. Los m.o. fermentadores
de glucosa acidifican el medio y provocan el
viraje del color uva al amarillo. El ambiente
ácido favorece la actividad enzimática
decarboxilasa y se metaboliza la lisina a
cadaverina elevando el pH del medio de cultivo
y tornándolo al color púrpura o violeta. Los m.o.
fermentadores de glucosa que no tienen
actividad lisina decarboxilasa, producen un
viraje de la totalidad del medio de cultivo al
color amarillo. A las 24 horas de incubación se
observa el fondo del tubo color amarillo y la
superficie de color violeta por consumo de las
peptonas que producen alcalinidad. La
generación de HS se ve por el ennegrecimiento
del medio. La desaminación de la lisina
produce un ácido α-ceto-carbónico, el cual con
la sal de hierro y bajo la influencia del O2 forma
un color rojizo en la superficie del medio.
Muy nutritivo por la presencia de
extracto de levadura, peptona y
tripteína. La tripteína aporta gran
cantidad de triptófano, sustrato de la
enzima triptofanasa a partir del cual se
forma indol que puede ser revelado
con el reactivo de Ehrlich o de Kovac´s
por la formación de un compuesto de
color rojo. La glucosa es el
carbohidrato fermentable, la ornitina
es el sustrato para la detección de la
enzima ornitina decarboxilasa, el
púrpura de bromocresol es el
indicador de pH (alcalino: uva y ácido:
amarillo). Agar semisólido para
detectar movilidad, evidenciada por
enturbiamiento del medio o por
crecimiento que difunde mas allá de la
línea de inoculación. Los m.o.
fermentadores de glucosa acidifican el
medio de cultivo y producen viraje del
uva al amarillo. Las condiciones de
acidez son favorables para la actividad
enzimática ornitina decarboxilasa, que
actúa sobre la ornitina generando
putrescina, con la consecuente
alcalinización del medio de cultivo y
viraje al color púrpura
La tripteína y la peptona aportan
nutrientes. El triptófano compone
a la triptepina y puede ser
metabolizado para formar indol.
En el proceso interviene un
conjunto de enzimas
(triptofanasas). El indol producido
se combina con el aldehído del
reactivo de Ehrlich o de Kovac´s,
para originar un compuesto de
color rojo. A partir del tiosulfato
de sodio los m.o. pueden generar
SH2 que reacciona con el Fe
presente formándose un
compuesto de color negro. Ser
semisólido lo hace ideal para
detectar movilidad, que se
evidencia por el enturbiamiento
del medio o por crecimiento que
difunde mas allá de la línea de
siembra del microorganismo en
estudio.
TSI LIA MIO SIM
Forma de inoculación y tiempo de 
incubación
A partir de un cultivo puro, con
aguja de inoculación inocular
picando el fondo y extendiendo
sobre la superficie.
En aerobiosis, a 33-37°C por 18-
24 h.
A partir de un cultivo puro con
una aguja de inoculación,
inocular picando el fondo y
extendiendo sobre la
superficie.
En aerobiosis, a 33-37 ºC
durante 18-24 horas.
A partir de un cultivo puro, por
punción profunda con aguja de
inoculación.
En aerobiosis, a 33-37 °C
durante 18-24 horas.
Por punción profunda con
aguja de inoculación recta.
Inocular el centro del tubo, y la
punción debe abarcar 2 tercios
de profundidad del medio de
cultivo desde la superficie.
En aerobiosis, a 33-37 °C,
durante 18-24 horas.
Tratamiento post incubación - - Prueba de Indol: Agregar al medio de cultivo 3-5 gotas de Indol 
Reactivo.
Interpretación de resultados +/- Superficie alcalina/profundidad
ácida (pico rojo/fondo
amarillo): el microorganismo
solamente fermenta la glucosa.
Superficie ácida/Profundidad
ácida (pico amarillo/fondo
amarillo): el microorganismo
fermenta glucosa, lactosa y/o
sacarosa.
Superficie alcalina/Profundidad
alcalina (pico rojo/fondo rojo):
el microorganismo es no
fermentador de azúcares.
La presencia de burbujas o la
ruptura del medio de cultivo
indican que el microorganismo
produce gas.
El ennegrecimiento del medio
indica que el microorganismo
produce ácido sulfhídrico.
Descarboxilación de la lisina:
Resultado Positivo: superficie
alcalina / profundidad alcalina
(pico violeta / fondo violeta).
Resultado negativo: superficie
alcalina /profundidad ácida
(pico violeta / fondo amarillo).
Desaminación de la lisina:
Resultado positivo: superficie
rojiza / profundidad ácida. Esto
sucede con cepas del género
Proteus, Providencia y algunas
de Morganella spp.
Producción de SH2 :
Resultado positivo:
ennegrecimiento del medio de
cultivo (especialmente en el
límite entre la superficie y
profundidad).
Resultado negativo: el medio
de cultivo permanece sin
cambio de color.
Movilidad:
Resultado positivo: presencia
de turbidez o crecimiento mas
allá de la línea de siembra.
Resultado negativo:
crecimiento solamente en la
línea de siembra.
Ornitina decarboxilasa:
Resultado positivo: color
púrpura.
Resultado negativo: color
amarillo. A veces se puede
desarrollar un color violáceo en
la superficie del medio
Prueba del indol:
Resultado positivo: color rojo.
Resultado negativo: color del
reactivo revelador es amarillo o
incoloro
Movilidad:
Resultado positivo: presencia
de turbidez o crecimiento mas
allá de la línea de siembra.
Resultado negativo:
crecimiento solamente en la
línea de siembra.
Producción de SH2 :
Resultado positivo:
ennegrecimiento del medio de
cultivo a lo largo de la línea de
siembra o en todo el medio.
Resultado negativo: el medio
permanece sin cambio de
color.
Prueba del indol:
Resultado positivo: color rojo.
Resultado negativo: el color del
reactivo revelador permanece
incoloro-amarillento.
AGAR CITRATO DE SIMMONS CALDO UREA CALDO MR-VP CALDO ROJO DE FENOL 
LACTOSA
Agar citrato de simmons Caldo urea Caldo rojo de metilo-voges prokauer
Prop
ósito
Diferenciación de enterobacterias en
base a la capacidad de usar citrato
como única fuente de carbono y
energía
Determinación de actividad de urea
de Enterobacterias, así como de
microorganismos de las familias de
Brucella, Bacilos, Micrococos,
Micobacterias y Proteus.
Diferenciación dentro de las
enterobacterias del grupo coli y
Klebsiella-Enterobacter.
Base para la adición de los
carbohidratos para determinar las
reacciones de fermentación de los
microorganismos. Debe ser capaz de
soportar el crecimiento de
organismos de prueba.
Fund
amen
to
Fosfato monoamónico es la única
fuente de N y el citrato de sodio es la
única fuente de C. Ambos
componentes son necesarios para el
desarrollo bacteriano. Las sales de
fosfato forman un sistema buffer, el
Mg es cofactor enzimático. El NaCl
mantiene el balance osmótico, el azul
de bromotimol es el indicador de pH,
que vira al color azul en medio
alcalinoy el agar es el agente
solidificante. El medio de cultivo es
diferencial en base a que los m.o.
capaces de utilizar citrato como única
fuente de carbono usan sales de
amonio como única fuente de
nitrógeno, con la consiguiente
producción de alcalinidad. El
metabolismo del citrato se realiza, en
aquellas bacterias poseedoras de
citrato permeasa, a través del ciclo del
ácido tricarboxílico. El desdoblamiento
del citrato genera progresivamente,
oxalacetato y piruvato. Este último, en
presencia de un medio alcalino, da
origen a ácidos orgánicos que al ser
utilizados como fuente de carbono,
producen carbonatos y bicarbonatos
alcalinos. El medio entonces vira al
azul y esto es indicativo de la
producción de citrato permeasa.
La urea es una fuente de nitrógeno
para aquellos organismos que
producen ureasa. El extracto de
levadura es una fuente de vitaminas,
particularmente del grupo B, esencial
para el crecimiento bacteriano. Los
fosfatos de potasio proporcionan una
capacidad de amortiguación. El rojo
fenol es el indicador de pH. Cuando
los organismos utilizan urea, se
genera amoníaco durante la
incubación, lo cual hace que la
reacción de estos medios sea alcalina.
Los tubos ureasa positivos hacen que
el indicador de fenol tome un color
rojo oscuro-violáceo (alcalinización).
Generalmente sólo reacciona a los
altos niveles de amoníaco de Proteus,
Morganella y Providencia en las
primeras 24 horas de incubación.
Las enterobacterias son anaerobios
facultativos que utilizarán la glucosa
en dos fases: primero la
metabolizarán aeróbicamente,
consumiendo rápidamente el oxígeno
del medio, para, en segundo lugar,
continuar metabolizándola por vía
anaerobia (fermentación).
Ésta puede ser de dos tipos:
Fermentación ácido mixta: La realizan
las bacterias del grupo de E. coli y los
productos finales son ácidos
orgánicos (ácidos fórmico, acético,
láctico y succínico) que provocan un
fuerte descenso del pH inicial del
medio. Puede detectarse por el viraje
del indicador de rojo de metilo que
permanece amarillo por encima de
pH 5,1 y rojo por debajo de 4,4.
Fermentación butilén glicólica: La
realizan las bacterias del grupo
Klebsiella-Enterobacter. Los
productos finales son compuestos
neutros como el butanodiol y el
etanol, produciéndose acetoína como
intermediario que podrá ser
detectada añadiendo al medio KOH
(reactivo A de Voges-Proskauer) y α-
naftol (reactivo B de Voges-
Proskauer) que reaccionarán con este
compuesto produciendo un color rojo
característico.
La peptona de caseína proporciona N,
vitaminas, minerales y aminoácidos
esenciales para el crecimiento, y
permite el crecimiento abundante de
una amplia variedad de m.o.
exigentes. El NaCl suministra
electrolitos esenciales para el
transporte y el equilibrio osmótico. El
rojo fenol es el indicador de pH.
La base de caldo rojo fenol se utiliza
para los estudios de fermentación de
carbohidratos de muchos
microorganismos. Los tubos de
control de medio sin inocular deben
estudiarse en paralelo con los tubos
inoculados. Los tubos deben
examinarse con frecuencia porque se
utilizan diferentes carbohidratos a
velocidades variables. La base de
caldo rojo fenol es un excelente
sustrato para estreptococos, así como
para otras bacterias menos exigentes.
Para los anaerobios, el
Medio debe usarse el mismo día de la
preparación. De lo contrario, el medio
debe calentarse y enfriarse antes de
su uso.
AGAR CITRATO DE 
SIMMONS
CALDO UREA CALDO MR-VP CALDO ROJO DE FENOL 
LACTOSA
Forma de inoculación y tiempo de 
incubación
Estriar la superficie del medio
de cultivo.
En aerobiosis, a 33-37 ºC
durante 24-72 horas. Algunos
m.o. pueden requerir hasta 7
días de incubación.
Inoculación con asa
bacteriológica en medio
líquido.
En aerobiosis 35±2 ºC por 24 h).
Inoculación con asa
bacteriológica en medio
líquido.
Aerobiosis a 37 º C por 24-48
horas
Inoculación con asa
bacteriológica en medio
líquido.
Incubar a 35±2 °C durante 18-
48 horas.
Tratamiento post incubación - - Se separa el cultivo en dos
porciones de unos 2 a 5 ml que
servirán para cada uno de los
dos ensayos: Rojo de Metilo: A
uno de los tubos se le añade
unas gotas (4-5) de solución
indicadora MR. Se agita
ligeramente para
homogeneizar y se observa la
coloración.
Voges-Proskauer: A la otra
porción de cultivo se le añade:
0,6 ml del Reactivo A de
Voges-Proskauer (α-naftol al
5% en alcohol etílico absoluto).
-
Interpretación de resultados +/- Positivo: crecimiento
bacteriano con un intenso
color azul en el pico de flauta. -
Negativo: ausencia de
crecimiento y permanencia del
color verde del medio de
cultivo.
Microorganismos que
hidrolizan la urea: el medio de
cultivo es de color rosado-
rojizo.
Microorganismos que no
hidrolizan la urea: el medio de
cultivo permanece de color
amarillo.
Prueba del rojo de metilo:
Resultado positivo: color rojo.
Resultado negativo: color
amarillo.
Prueba de Voges Proskauer:
Resultado positivo: desarrollo
de un color rojo en pocos
minutos después de una
completa agitación del tubo.
Resultado negativo: ausencia
de color rojo.
Positivo: El medio se torna
color amarillo. Producción de
gas variable.
Negativo: El medio mantiene
su color rosa-rojizo.
TSI LIA MIO SIM AGAR CITRATO DE SIMMONS CALDO UREA CALDO MR-VP CALDO ROJO 
DE FENOL 
LACTOSA
Picando el fondo y 
extendiendo sobre la 
superficie. 
Punción profunda con aguja 
de inoculación recta
Para SIM: la punción abarca 
2/3 de profundidad del medio 
desde la superficie
Estrias Asa bacteriológica en medio líquido
ANEXO 1: FORMAS DE INOCULACIÓN
ANEXO 2: RESULTADOS POSITIVOS Y NEGATIVOS
MIO SIM
TSI LIA
+ -
MOVILIDAD
SH3
INDOL
+ -
+ -
+ -
ANEXO 2: RESULTADOS POSITIVOS Y NEGATIVOS
CALDO MR-VP CALDO ROJO DE FENOL LACTOSA
AGAR CITRATO DE SIMMONS CALDO UREA
VP MR
+ -
REFERENCIAS
Lab, B. (Marzo de 2021). BritaniaLab. Obtenido de BritaniaLan: 
https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_6070743f4ed75.pdf
Lab, B. (Marzo de 2021). BritaniaLab. Obtenido de BritaniaLab: 
https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_6070922459b84.pdf
Lab, B. (Marzo de 2021). BritaniaLab. Obtenido de BritaniaLab: 
https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_6070971eb11bd.pdf
Lab, B. (Marzo de 2021). BritaniaLab. Obtenido de BritaniaLab: 
https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_6054e85d48c47.pdf
Lab, B. (Marzo de 2021). BritaniaLab. Obtenido de BritaniaLab: 
https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_607092758cfa8.pdf
Lab, C. (13 de Mayo de 2019). Condalab. Obtenido de Condalab: https://www.condalab.com/medios-de-
cultivo-deshidratados/997-14955-caldo-urea.html#/2-formato-500_g
Pruebas Bioquímicas de Identificación de microorganismos (s.f.) [Archivo PDF]
Tema 12. Identificación microbiana (s.f.) [Archivo PDF]
UNAM (s.f.) Siembra en tubo por estría. Obtenido de: 
https://mediacampus.cuaieed.unam.mx/node/4248#:~:text=La%20inoculaci%C3%B3n%20o%20siemb
ra%20es,as%C3%A9ptica%20y%20de%20material%20est%C3%A9ril.