PROYECTO 3 BIOMOL (2)

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PROYECTO 3 
REGULACIÓN GENÉTICA: 
 EL OPERÓN DE LACTOSA 
 
 
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA 
LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR 
 
INTEGRANTES 
Catalán García Karla Angelica 
Chavez Mex Bitia Eunice 
Flores Zapotl Gladiz Berenisse 
 
DOCENTE 
Dra. Muñoz Muñoz Patricia Lilian Alejandra 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
OBSERVACIONES 
*Las bacterias de E.Coli que fueron tratadas en frío en una disolución de CaCl2 y 
después sometidas a un choque térmico de 37°C se hicieron competentes 
permitiendo la entrada de ADN del fago λ. 
*Las células se encontraban a -20°C 
*Se utilizó la cepa E. coli XL1Blue MRF 
*Los plásmidos utilizados pUC19 y pQF301 
*El inductor utilizado en la práctica fue Isopropylthiogalactosido (IPTG) que es 
análogo a la alolactosa que se unirá satisfactoriamente al represor del operón de 
la lactosa. 
*Se utilizo 2XYT para recuperar las células, que es una solución rico en nutrientes. 
*Se incubó 30 minutos a 37°C y 300 rpm, esto para que las bacterias se recuperen 
del trauma del tratamiento de competencia. 
*Se debe pasar a inocular la cepa de E.coli en caja Petri antes de la hora, ya que 
si pasa más de ese tiempo se pueden expulsar los plásmidos. 
*Agar utilizado LB solido con ampicilina 
 
 
RESULTADOS 
 
 
 
Al llevarse a cabo el proceso de clonaje y 
amplificación con el gen de interés en las 
bacteria de E.coli, aquellos que tienen la 
subunidad alfa, esta es interrumpida por lo tanto 
ya no se expresaran más; por lo tanto las colonias 
portarán los plásmidos recombinantes; esto 
quiere decir que contienen el gen de interés , las 
colonias tendrán una coloración blanca (Figura 
1)cuando crecen en un medio sólido de X-gal e 
IPTG(inductor). Por lo tanto, las colonias son 
resistentes a la Ampicilina. 
 Figura 1. Cepa de E. coli XL1Blue MRF con plásmido pQF301 
 
 
Las secuencias que no fueron interrumpidas 
permiten que Lac Z se transcriba y se traduzca por 
lo tanto X-gal es hidrolizado manifestando 
plásmidos no recombinantes con colonias de color 
azul (Figura 2). Las colonias no serán resistentes a 
la Ampicilina, debido a que no contienen el gen de 
interés. 
 
 
 
 
 
 
 
DISCUSIÓN 
Las bacterias para sobrevivir y adaptarse a las necesidades ambientales son 
capaces de regular su expresión génica; esto sucede cuando las bacterias 
presentan resistencia a antibióticos. 
En este proyecto experimental se manifiesta que la Bacteria E. coli al ser 
sometida a una regulación génica a nivel transcripción tiene la capacidad ser 
resistente al antibiótico de ampicilina, debido al que operón de lactosa se 
compone de tres genes estructurales que son Z, Y, A; que codifican a tres enzimas 
diferentes: β-galactosidasa (Z), galactósido permeasa (Y) y tiogalactósido 
transacetilasa(A); el cual el gen de interés al clonarse toma el lugar de los genes 
Z, Y, A ; por lo tanto el operón de Lac inhibe la síntesis de la enzima β-
galactosidasa que permite transformar la lactosa en alolactosa que es el inductor 
(inductor análogo utilizado IPTG); pero no expresara más dando como resultado 
a que no se pueda hidrolizar X-gal, debido a esto tendremos colonias con plásmidos 
recombinantes (gen de interés) de color blanco indicando resistencia a Ampicilina. 
En el caso donde las bacterias que no contienen el plásmido recombinante se 
producirán de manera satisfactoria la síntesis de la enzima β-galactosidasa que a 
su vez será hidrolizada por X-gal produciendo colonias de color azul, manifestando 
no resistencia a Ampicilina. 
Figura 2. Cepa de E. coli XL1Blue MRF con plásmido pUC19. 
 
CONCLUSIÓN 
El encendido y apagado de algunos genes ha permitido a la ciencia experimentar 
la regulación genética. En nuestro proyecto de regulación genética del operón de 
lactosa nos permitió aprender y entender el fundamento y la técnica para 
obtener cepas de E.coli con plásmidos recombinantes resistentes al Antibiótico de 
Ampicilina observando colonias de color blanco; contrastando con cepas de E.coli 
con plásmido no recombinante produciendo colonias de color azul manifestando 
que no son resistentes a Ampicilina. 
Gracias a esta técnica se ha logrado la producción de insulina para tratar la 
enfermedad degenerativa Diabetes Mellitus Tipo 1; utilizando el gen que codifica 
insulina en humanos, estos plásmidos son insertados a la bacteria E.coli para 
producir Insulina. 
 
CUESTIONARIO 
 
1. ¿Investigue qué es la transformación bacteriana? 
 
La Transformación bacteriana es el proceso que ocurre cuando una célula 
ingiere ADN extraño de sus alrededores; que entonces puede amplificar o 
clonar el ADN. La transformación puede ocurrir en la naturaleza en ciertos 
tipos de bacterias o reproducirse artificialmente en el laboratorio mediante 
la creación de poros en las membranas celulares bacterianas.[1] 
 
La transformación es un paso clave en la clonación de ADN. Ocurre después 
de los tratamientos de digestión con enzimas de restricción y ligación y 
transfiere plásmidos recién hechos a las bacterias.[2] 
 
2. ¿Qué función tiene el calcio en la transformación? 
 
El calcio facilita la adsorción del ADN sobre la superficie celular y el shock 
térmico permite la entrada del ADN absorbido al citoplasma de la célula. 
[3] 
 
3. ¿Qué otros métodos de transformación bacteriana existen? 
 
Transformación: Proceso el cual las bacterias captan fragmentos de ADN 
desnudo y lo incorporan a su genoma. 
 
Electroporación: Consiste en la transferencia directa de ADN dentro de la 
célula huésped; poros temporales son creados en la membrana de la célula 
https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloning-tutorial/a/restriction-enzymes-dna-ligase
huésped cuando son sujetos a un impulso eléctrico, de esta manera el ADN 
pasa a la célula huésped.[4] 
 
Transformación Natural: 
 
Las células que pueden transformar su ADN que está en su ambiente se 
encuentran en un estado competente: [5] 
 
Bacterias Gram Positivas 
*Streptococcus pneumoniae 
 
Bacterias Gram Negativas 
*Neisseria gonorrhoeae 
 
Conjugación: Transferencia del ADN de una bacteria donante a una 
receptora por medio de pilis Manera como se transfiere los Plásmidos R o de 
conjugación 
 
Transducción: Transferencia de ADN de una bacteria donante a una 
receptora por medio de un virus bacteriófago o fagos. 
 
 
4. Busque las características de la cepa bacteriana usada en esta práctica 
Las cepas de E. coli XL1-blue, permite hacer procedimientos de clonación 
y la selección con el sistema azul/blanco con una interrupción en el gen 
lacZM15, tienen alta estabilidad en los insertos debido a una mutación en 
el gen recA1 y permiten una alta producción y calidad de ADN por la 
mutación en endA. 
 
Las células competentes XL-1 blue se utilizan para el rescate de fagemido 
de una sola hebra de ADN y la transformación del ADN metilado [12] 
 
5. ¿Por qué se crecen las bacterias en medio LB líquido durante 30 minutos 
antes de pasarlas al medio sólido que contiene ampicilina? 
 
Para que se recuperen de todo el procedimiento sometido, y de esta forma 
sean capaces de expresar resistencia; ya que si las inoculamos en un medio 
sólido inmediatamente puede suceder que mueran debido a que no se les 
dio el tiempo necesario para expresar resistencia a la Ampicilina. 
 
 
6. ¿Por qué se crecen las bacterias durante toda la noche en un medio 
sólido con ampicilina? 
 
Para identificar aquellas bacterias que tienen el gen recombinante a las que 
no cuentan con el gen recombinante; por lo tanto, aquellas no tienen gen 
recombinante no crecerán en un medio de Ampicilina. 
 
 
7. Define: 
Homocigoto: Composición genética de una característica específica en un 
organismo diplóide. Cada alelo de un gen en particular se hereda de cada 
progenitor. Si ambos alelos para ese gen en particular son iguales,entonces 
el organismo es homocigoto.[7] 
Heterocigoto: Se refiere a haber heredado dos formas diferentes de un gen 
en particular, una de cada progenitor. Lo contrario es un genotipo 
homocigoto, donde un individuo hereda formas idénticas de un gen en 
concreto del padre y de la madre.[8] 
Alelo: Cada una de las dos o más versiones de un gen. Un individuo hereda 
dos alelos para cada gen, uno del padre y el otro de la madre.[9] 
Endonucleasa: Las endonucleasas son enzimas que son capaces de cortar 
cadenas de ADN o ARN en puntos intermedios de la misma mediante la 
rotura del enlace fosfodiéster.[10] 
Palindrome: Segmento de ADN de doble cadena en el que la secuencia de 
bases de las dos hebras tiene una simetría binaria por rotación alrededor de 
un centro. También se hallan palíndromos en cadenas simples de material 
genético, como por ejemplo en las enterobacterias.[11] 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
https://www.quimica.es/enciclopedia/ADN.html
https://www.quimica.es/enciclopedia/Bacteria.html
ANEXOS 
Anexo 1 
¿Cómo es el protocolo de preparación de las células competentes y su 
fundamento? 
Las bacterias tienen la capacidad de intercambiar material genético (ácido 
desoxirribonucleico, ADN) en un proceso conocido como transferencia de genes 
horizontal. La incorporación de ADN exógeno proporciona un mecanismo mediante 
el cual las bacterias pueden adquirir nuevos rasgos genéticos que les permiten 
adaptarse a las condiciones ambientales cambiantes, como la presencia de 
antibióticos o anticuerpos o moléculas que se encuentran en hábitats naturales. 
Existen tres mecanismos de transferencia génica horizontal: transformación, 
transducción y conjugación. 
El proceso de transformación tiene cuatro pasos generales: 
1) Preparación de células competentes 
2) Incubación con ADN 
3) Recuperación de las células 
4) Células de chapado para el crecimiento de los transformadores. 
Para que se produzca la transformación, las bacterias receptoras deben estar en 
un estado conocido como competencia. Algunas bacterias tienen la capacidad de 
llegar a ser naturalmente competentes en respuesta a ciertas condiciones 
ambientales. Sin embargo, muchas otras bacterias no se vuelven competentes 
naturalmente, o las condiciones para este proceso son aún desconocidas. La 
capacidad de introducir ADN en bacterias tiene una gama de aplicaciones de 
investigación: generar múltiples copias de una molécula de ADN de interés, para 
expresar una gran cantidad de proteínas, como un componente en los 
procedimientos de clonación, y otros. Debido al valor de la transformación a la 
biología molecular, existen varios protocolos destinados a hacer que las células 
sean artificialmente competentes cuando se desconocen las condiciones de 
competencia natural. [16] 
Procedimiento 
1. A 10 ml de medio LB (Luria-Bertani) previamente autoclavado se le añaden, 
"picando" de una colonia, las bacterias (E. coli). Preparación de medio LB (para 1 
litro): 10 g Triptona (Pronadisa, Cat. 1612.00), 5g extracto de levadura (Pronadisa, 
Cat. 1702.00) y 10 g NaCl (pH=7) 
2. Se deja crecer en agitación y a 37ºC hasta que llega a una D.O. de 0.6-0.7 
3. Poner en hielo rápidamente en cuanto se retiren de la agitación. 
4. Se centrifugan a 5 º C durante 7 minutos a 4000 r.p.m. en una centrífuga de 
mesa (8000 g) 
5. Se descarta el sobrenadante y al pellet (bacterias) se le añaden 5 ml de CaCl2 
0.1 M 
6. Se mantienen las bacterias en hielo durante 10 minutos. 
7. Se vuelve a centrifugar 5 minutos a 2500 r.p.m. en la misma centrífuga (2500 g) 
8. Descartamos el sobrenadante y al pellet se le añade 1ml de CaCl2 0.1 M frío 
9. Aquí tendremos ya las células competentes, que pueden conservarse a -80ºC. 
10. Cuando queramos introducirles el ADN (transformación), a esas células les 
añadiremos 2-mercaptoetanol (para permeabilizar más las membranas), tomando 
2 µl de una mezcla de 2 µl 2-merc.+ 8 µl agua. 
11. Ahora introduciremos la disolución de plásmido para que quede a una 
concentración de 10-15 ng/µl. 
12. Mantenemos durante media hora en hielo. 
13. Posteriormente ponemos durante un minuto la muestra en un baño a 42 ºC 
14. Volvemos a dejar en hielo durante un minuto. 
15. Añadimos 1 ml de LB 
16. Pasaremos ahora las células a crecer (las metemos durante una hora a 37ºC en 
un agitador o baño) 
17. Retiramos todo el líquido (las células precipitan) excepto unos 200 µl 
18. Usando una pipeta resuspendemos suavemente las células (porque aún tienen 
las paredes débiles). 
19. Plaqueamos en una placa de cultivo de LB-agar (Pronadisa, Cat. 1083.00) 
usando un asa de vidrio para extender. 
20. Llevamos el cultivo a una estufa a 37º C y lo dejamos crecer un día.[17] 
 
 
 
 
 
 
Anexo 2 
¿Cuál es el fundamento de la transformación por choque térmico? 
Transformación es el proceso que ocurre cuando una célula ingiere ADN extraño 
de sus alrededores. Puede ocurrir en la naturaleza en ciertas bacterias. En biología 
molecular, la transformación es reproducir artificialmente en el laboratorio 
mediante la creación de poros en las membranas celulares bacterianas. Las células 
bacterianas que son capaces de tomar ADN del ambiente se denominan células 
competentes. En el laboratorio, las células bacterianas pueden hacerse 
competentes y el ADN es introducido posteriormente por un procedimiento 
llamado el método de choque de calor. 
Transformación de choque de calor utiliza un ambiente rico de calcio 
proporcionado por cloruro de calcio para contrarrestar la repulsión electrostática 
entre el ADN plásmido y la membrana celular bacteriana. Un aumento repentino 
en la temperatura crea poros en la membrana plasmática de las bacterias y ADN 
plásmido permite entrar en la célula bacteriana. Este video va a través de un 
procedimiento paso a paso sobre cómo crear bacteria químicamente competente, 
realizar transformación de choque de calor, placa de la bacteria transformada y 
calcular la eficiencia de transformación. 
Transformación bacteriana es un método ampliamente utilizado donde se 
introduce ADN extraño en una bacteria, que entonces puede amplificar o clonar el 
ADN. Las células que tienen la capacidad para fácilmente tomar este ADN se 
denominan células competentes. Aunque la transformación se produce 
naturalmente en muchos tipos de bacterias, los científicos han encontrado 
maneras de inducir artificialmente y mejorar la capacidad de una célula 
bacteriana. En este video vamos a hablar sobre una de estas maneras, 
transformación de choque de calor. 
Antes de hablar de la técnica de choque de calor, vamos a discutir primero el tipo 
de ADN más comúnmente utilizado en la transformación bacteriana: el plásmido. 
Un plásmido es un pequeño, circular, doble cadena de ADN que puede reducir su 
tamaño por superenrollamiento, por lo que puede pasar fácilmente a través de 
poros en la membrana de la célula. 
Un plásmido contiene algunas regiones importantes digno de mencionar. Los 
plásmidos disponibles comercialmente contienen un sitio de clonación múltiple o 
MCS. Esta región contiene secuencias específicas reconocidas por endonucleasas 
de restricción o enzimas de restricción, que hieren el DNA. Fragmentos de ADN de 
interés para el investigador pueden introducirse en el sitio de clonación múltiple 
del plásmido y el fragmento de ADN se corta con las endonucleasas mismas. 
Los plásmidos también contienen un origen de replicación, o ORI, que proporciona 
información a la celda donde debe comenzar la replicación del plásmido. 
Además, el origen de replicación y el sitio de clonación múltiple, la mayoría de los 
plásmidos incluirá un gen de resistencia a los antibióticos. Este gen confiere 
resistencia a los antibióticos a todas las celdas que contienen el plásmido, 
permitiendo que esas células sobrevivan en el antibiótico que contiene los medios 
de comunicación. 
Ahora que hemos analizado plásmidos, vamos a hablarde las células en que se 
presentará: las células competentes. La más comúnmente utilizada este tipo de 
bacterias en la investigación de la biología molecular y transformación es E. coli, 
que también habitan el intestino inferior. Las células típicamente se hacen 
competentes a través de la exposición a un ambiente rico de calcio. 
Las cargas positivas de los iones de calcio neutralizan las cargas negativas de los 
plásmidos y la pared celular bacteriana disipando la repulsión electrostática y 
debilitamiento de la pared celular. 
Al exponer las células a un aumento repentino en la temperatura o choque 
térmico, se crea una diferencia de presión entre el exterior y el interior de la 
célula, que induce la formación de poros, a través del cual se puede introducir 
DNA plasmídico superenrollado. Después de regresar a las células a una 
temperatura normal, la pared celular le self-heal. 
Una vez que las células han tomado el plásmido, serán capaces de crecer en placas 
de agar con antibióticos. [6] 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Anexo 3 
Colocar una imagen correspondiente al plásmido pBluescript SK- y describir sus 
características. 
 
Los vectores pBC se derivaron del fagémido pBluescript II. El gen de resistencia a 
la ampicilina ha sido reemplazado por el gen de resistencia al cloranfenicol. Los 
fagémidos pBC (plásmidos con un origen de fago) son vectores de clonación 
diseñados para simplificar los procedimientos de clonación y secuenciación de uso 
común, incluida la construcción de deleciones anidadas para la secuenciación de 
ADN, la generación de transcritos de ARN in vitro y la mutagénesis específica del 
sitio y el mapeo de genes. Selección conveniente al subclonar a partir de vectores 
de clonación resistentes a ampicilina. Con un policonector grande y versátil en 
orientación Sac-->Kpn y origen f1 en cualquier orientación (-).[18] 
 
 
Anexo 4 
¿Qué son las colonias satélites? 
Las colonias satélites son blancas ya que no incorporan el plásmido pGal el cual 
contiene el gen que permite a las células disponer de la β-galactosidasa. 
Las pequeñas colonias "satélite" o colonias "alimentadoras" no son resistentes a la 
ampicilina, simplemente están creciendo en una región de agar donde la β-
lactamasa se ha difundido e inactivado el antibiótico ampicilina. El número de 
colonias satélites aumenta si la concentración de ampicilina es baja o las placas 
se han incubado durante tiempos más largos.[19] 
 
Cuando se selecciona resistencia a ampicilina, las células transformadas deben 
sembrarse a una densidad <104 por caja de 9 cm ø e incubarse menos de 20 h a 
37°C. De otro modo, pueden generarse falsos positivos (colonias satélites).[20] 
 
Anexo 5 
¿Qué es un promotor inducible y qué es un promotor constitutivo? 
El promotor es una secuencia de ADN necesaria para convertir un gen en activado 
o desactivado. [21] 
Promotor Inducible: Pueden ser activados en respuesta a diferentes estímulos, 
incluyendo señales endógenas y factores físicos y químicos externos, bajo 
condiciones experimentales controladas. Este promotor ha sido adaptado y 
refinado para inducir la actividad de un gen independientemente de otros factores 
bióticos o abióticos. Su efecto es reversible (pierden actividad en ausencia del 
estímulo) y son muy útiles cuando se requiere expresión temporal.[22] 
Los promotores constitutivos: Dirigen Ia expresión en Ia mayoría o en todos los 
tejidos, y son de utilidad cuando niveles altos de producción de un producto génico 
son deseados en toda Ia planta. El promotor 35S de virus del mosaico de Ia coliflor 
(VMC) es el promotor que se usa más frecuentemente para dirigir niveles altos de 
expresión constitutiva en plantas.[23] 
 
Anexo 6 
Investigar las características de la cepa de E. coli XL1Blue MRF´ 
La cepa XL1-Blue permite la detección de color blanco azulado para plásmidos 
recombinantes y es una excelente cepa huésped para la clonación de rutina. 
aplicaciones que utilizan vectores plasmídicos o lambda. 
Las células XL1-Blue tienen deficiencia de endonucleasa (endA), lo que mejora en 
gran medida la calidad de la mini preparación 
ADN, y son deficientes en recombinación (recA), lo que mejora la estabilidad del 
inserto. La mutación hsdR impide la escisión del ADN clonado por el 
Sistema de endonucleasa EcoK. el lacIq 
El gen Z∆M15 en el episoma F´ permite la detección de color azul-blanco. [13] 
Las células competentes XL-1 Blue MRF' permiten una clonación representacional 
y de alta eficiencia de ADN metilado. Se han eliminado todos los sistemas de 
restricción de E. coli K12 conocidos. Utilice células XL1-Blue MRF cuando clone 
ADNc metilado o ADN genómico, o cuando clone productos PCR metilados. 
Al clonar plásmidos resistentes a la tetraciclina, use células supercompetentes 
XL1-Blue MRF' Kan para seleccionar el episoma F' y proporcionar un color azul más 
intenso para la detección azul-blanca.[14] 
 
 
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
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