PROYECTO 2 BIOMOL

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PROYECTO 2 
DETECCIÓN MOLECULAR DE ENTEROBACTERIAS 
UTILIZANDO UN FRAGMENTO DEL GEN 
CODIFICANTE PARA EL RNA RIBOSOMAL 16S 
 
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA 
LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR 
 
INTEGRANTES 
Catalán García Karla Angelica 
Chavez Mex Bitia Eunice 
Flores Zapotl Gladiz Berenisse 
 
DOCENTE 
Dra. Muñoz Muñoz Patricia Lilian Alejandra 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
OBSERVACIONES 
Para llevarse a cabo el proyecto 2 de “Detección molecular de enterobacterias 
utilizando un fragmento del gen codificante para el RNA ribosomal 16S”, se realizó 
una búsqueda de la secuencia codificante del gen ARNr 16S en la base de datos 
del Centro Nacional de Información en Biotecnología de los E.U.A.(NCBI). Los 
oligonucleótidos utilizados para amplificar los genes ARNr 16S fueron analizados 
mediante un software OLIGO. 
Las colonias de enterobacterias fueron obtenidas por el Cepario de la F.C.Q.I. de 
la U.A.B.C. El ADN bacteriano fue obtenido mediante extracción de lisis bacteriana 
por calor, posteriormente se suspendió en 1 ml en agua destilada estéril y lisada 
por 10 minutos a 100°C y los restos celulares se separaron mediante centrifugación 
y el sobrenadante (ADN bacteriano) se conservó a -20°C para su uso posterior en 
el PCR. 
Se realizó la amplificación del ADN bacteriano mediante PCR codificando a 
aproximadamente a 800 pb para el gen ARNr 16S, se utilizó la enzima Taq como 
polimerizante. Para su verificación se realizó electroforesis de agarosa. 
Posteriormente se llevó a cabo la electroforesis de agarosa de RFLP, el cual se 
utilizaron enzimas de restricción HindIII y AluI ya que los fragmentos del gen ARNr 
16S pueden ser digeridas mediante ellas. 
 
RESULTADOS 
 
Electroforesis de gel de agarosa del PCR del ARNr 16S 
 
La electroforesis muestra el resultado del análisis 
de 3 muestras de PCR que codifican para el gen 
ARNr 16S. En el primer carril se muestra el marcador 
de peso molecular que nos permite identificar qué 
talla se encuentran nuestros fragmentos, en base a 
ello identificamos que los tres fragmentos 
analizados codifican aproximadamente 800 pb para 
el gen ARNr 16S. 
 
 
 
Electroforesis de gel de agarosa del RFLP del ARNr 16S 
 
La electroforesis del RFLP de ARNr 16S se 
analizaron 3 muestras, el cual se utilizaron para 
su digestión dos endonucleasas de restricción 
HindIII y AluI. En el primer carril se muestran los 
pesos moleculares. Se observan el corte de tres 
fragmentos por carril, siendo que el primer 
fragmento se encuentra en una banda en el rango 
de 100pb, el segundo fragmento se encuentra en 
una banda aproximadamente a 200 pb y el tercer 
carril en una banda aproximada de 400 pb. En 
base a esas observaciones podemos descartar la 
bacteria M.morgani su fragmento más grande es 
de 224 pb, de igual forma podemos descartar la 
bacteria K. pneumoniae su fragmento más 
grande es de 324 pb. Por último, podemos 
descartar la bacteria K. oxytoca aunque codifica 
a 403 pb en su fragmento más grande la 
descartamos por su segundo corte ya que codifica 
a 323 pb. Podemos inferir que nuestra bacteria 
en análisis es la enterobacteria E.coli debido a 
que codifica a 415 , 165, 158 pb; se encuentra más 
cercano a las bandas obtenidas de los fragmentos 
de la RFLP. Las tres muestras analizadas 
corresponden a Escherichia coli. 
 
 
DISCUSIONES 
El ARNr 16S es un polirribonucleótido de aproximadamente 1500 nucleótidos 
codificado por el gen rrs (ADN ribosomal 16). En base a esta secuencia se puede 
obtener información filogenética y taxonómica de los procariotas; de esta forma 
se puede identificar de manera específica y exacta a las bacterias. [1] 
Se analizaron tres muestras de PCR mediante Electroforesis de Agarosa en cual 
codificaron aproximadamente a 800 pb para el gen ARNr 16S. Posteriormente se 
realizó la Electroforesis de Agarosa de RFLP utilizando dos endonucleasas de 
restricción HindIII y AluI; se analizaron las muestras que codificaron para el gen 
ARNr 16S. Para descartar e identificar a la bacteria se utilizó una predicción 
bioinformática, el cual nos permitió descartar a las bacterias e identificar la 
enterobacteria correcta. Se descartó la bacteria M.morgani debido a que su 
fragmento más grande es de 224 pb, de igual forma descartó la bacteria K. 
pneumoniae su fragmento más grande es de 324 pb. Por último, se descartó la 
bacteria K. oxytoca aunque codifica a 403 pb en su fragmento más grande la 
descartamos por su segundo corte ya que codifica a 323 pb. De acuerdo a los 
bandas obtenidas en la electroforesis de RFLP identificamos que la Bacteria que 
se analizó es la Enterobacteria E.coli debido a que codifica a 415 , 165, 158 pb, 
se encuentra muy cercano a las bandas obtenidas de los fragmentos de la RFLP. 
Las tres muestras analizadas corresponden a Escherichia coli. 
 
CONCLUSIÓN 
El PCR es una técnica selectiva, exacta; que nos permite obtener amplificación del 
ADN, en conjunto con la Electroforesis de RFLP identificamos de manera certera 
el microorganismo bacteriológico. Esta técnica es de gran importancia para el área 
de salud debido a que se logra obtener un diagnóstico , pronóstico y seguimiento 
oportuno para el paciente; debido a que se logra identificar de manera 
filogenética y taxonómica a nuestra bacteria. Las Enterobacterias codifican 
aproximadamente 800 pb de ARNr 16S, de acuerdo a nuestra Electroforesis de RFLP 
concluimos que la Enterobacteria es E.coli . 
 
CUESTIONARIO 
1. Menciona las características de las diferentes Enterobacterias utilizadas en 
el presente proyecto? 
E.coli: Es un bacilo Gram negativo, no esporulante, produce indol a partir de 
triptófano, no utiliza citrato como fuente de carbono y no produce acetoína. 
Además, fermenta la glucosa y la lactosa con la producción de gas. Su cubierta 
consta de tres elementos: la membrana citoplasmática, la membrana externa y, 
entre ambas, un espacio periplásmico constituido por péptido-glucano. Esta última 
estructura confiere a la bacteria su forma y rigidez, y le permite resistir presiones 
osmóticas ambientales relativamente elevadas. 
E. coli es una bacteria mesófila; es sensible a temperaturas superiores a 70 ºC [2] 
K.pneumoniae: Es una bacteria Gram negativa, encapsulada, no móvil, fermenta 
la lactosa, anaerobio facultativo. Es encontrada en la flora normal de la boca, la 
piel y los intestinos.[3] 
M.morganii: Es un bacilo que se encuentra con frecuencia en el suelo, agua y 
drenajes y forma parte de la flora colónica normal de un pequeño porcentaje de 
humanos, mamíferos y reptiles. Bacilo, Gram negativo, anaerobio facultativo, 
fermenta la glucosa, manosa pero no lactosa, hemolítico, bacteria entérica con 
presencia de fimbrias, no capsulado, hidrolizante de ureasa, reductor de nitritos, 
perteneciente a la tribu Proteeae familia Enterobacteriaceae, la identificación de 
esta patógeno es hecho por la recuperación de pequeñas oxidasas-negativa y 
catalasa en agar sangre o agar MacConkey. 
Este microorganismo tiene una característica participar de ser resistente a 
antibióticos betalactamasa por lo que puede retrasar un tratamiento adecuado [4] 
K.oxytoca: Enterobacterias Bacilo Gram (-) negativo, crecen en diversos medios 
de cultivo, son bacterias oportunistas. Son bacterias de la flora normal 
gastrointestinal. [5] 
 
2. Que enfermedades pueden causar cada una de ellas? 
E.coli: Diarrea, infecciones urinarias, enfermedades respiratorias e infecciones del 
torrente sanguíneo. [6] 
K.pneumoniae:La neumonía por Klebsiella, una enfermedad rara y grave que se 
manifiesta con un esputo marrón oscuro o grosella, formación de abscesos 
pulmonares y empiema, es más común entre pacientes diabéticos y alcohólicos. 
[7] 
M.morganii: Asociada a infecciones neonatales, graves de inicio precoz, 
neumonías y sepsis, conantecedentes de parto prematuro. [8] 
K.oxytoca: Causa colitis hemorrágica asociada a antibióticos, daño en los 
pulmones, infecciones urinarias, neumonías.[9] 
 
3. Cuáles son las ventajas de un diagnóstico molecular por RFLP vs métodos 
convencionales. 
La técnica PCR-RFLP tiene ventajas sobre la estrategia SSCP-secuenciación para 
establecer de forma rápida, reproducible y confiable el diagnóstico.[10] 
El análisis de fragmentos (Restriction Fragment Length Polymorphisms) consiste en 
la obtención a partir de enzimas de restricción de secuencias cortas y concretas 
de ADN. Permite detectar especies bacterianas y su posterior identificación, 
gracias a variaciones en el RNA ribosomal 16S. Es un método rápido y sensible. 
Las técnicas tradicionales basadas principalmente en el cultivo o en la detección 
de antígenos requieren en la mayoría de los casos condiciones específicas y mucho 
tiempo para llegar a la identificación del microorganismo. Una de las alternativas 
que cumple con las características de proceso de identificación ideal es la biología 
molecular: proceso rápido, sensible y específico, utilizando un volumen de muestra 
pequeño, sin condiciones especiales de extracción, transporte y conservación.[11] 
4. Que propiedades fisicoquímicas posee el ARN ribosomal 16S y porque es tan 
utilizado este gen en diversas pruebas moleculares? 
Es un polirribonucleótido de aproximadamente 1,500 nucleótidos, codificado por 
el gen rrs, también denominado ADN ribosomal 16S (ADNr 16S), a partir de la 
secuencia se puede obtener información filogenética y taxonómica. Como 
cualquier secuencia de nucleótidos de cadena sencilla, el ARNr 16S se pliega en 
una estructura secundaria, caracterizada por la presencia de segmentos de doble 
cadena, alternando con regiones de cadena sencilla. 
El análisis de los ARNr 16S se ha utilizado ampliamente para establecer las 
relaciones filogenéticas dentro del mundo procariota, causando un profundo 
impacto en nuestra visión de la evolución y, como consecuencia, en la clasificación 
e identificación bacteriana. Basan su estructuración del mundo procariota en las 
relaciones filogenéticas establecidas con esta macromolécula. [12] 
 
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
[1] Valenzuela-González, F., Casillas-Hernández, R., Villalpando, E., & Vargas-
Albores, F. (2015). The 16S rRNA gene in the study of marine microbial 
communities. Ciencias marinas, 41(4), 297–313. 
https://doi.org/10.7773/cm.v41i4.2492 
[2] Canet, J. J. (2016, enero 19). Escherichia Coli: características, patogenicidad 
y prevención (I). Blog sobre seguridad alimentaria. 
https://www.betelgeux.es/blog/2016/01/19/escherichia-coli-caracteristicas-
patogenicidad-y-prevencion-i/ 
[3] Tártara.S. Patógenos emergentes: tercera parte. Klebsiella pneumoniae 
productora de carbapenemasas (KPN-KPC). Org.ar. Recuperado el 10 de mayo de 
2022, de https://www.revistarenal.org.ar/index.php/rndt/article/view/168/863 
[4] Óscar, A., Castejón, C. 1., Tania, P., Alexander, R., Savoff, N., Bush, S. W., 
Alberto, O., & Cruz, C. (n.d.). Infección Por Morganella Morganii En Paciente 
Postransplantado De Riñón: Reporte De Caso Y Revisión De Literatura. Bvs.Hn. 
CITADO May 16, 2022, from http://www.bvs.hn/RMH/pdf/2017/pdf/Vol85-3-4-
2017-12.pdf 
[5] MicrobitosBlog. (2015, April 20). Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, K. ozanae. 
morfologia, medio de cultivo, enfermedades y más. Microbitos Blog. 
https://microbitosblog.com/2015/04/20/klebsiella_medio_cultivo_infeccion_gra
m/ 
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https://www.betelgeux.es/blog/2016/01/19/escherichia-coli-caracteristicas-patogenicidad-y-prevencion-i/
https://www.betelgeux.es/blog/2016/01/19/escherichia-coli-caracteristicas-patogenicidad-y-prevencion-i/
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https://microbitosblog.com/2015/04/20/klebsiella_medio_cultivo_infeccion_gram/
https://microbitosblog.com/2015/04/20/klebsiella_medio_cultivo_infeccion_gram/
[6] CDC. (2022, May 9). La E. coli y la seguridad de los alimentos. Centers for 
Disease Control and Prevention. 
https://www.cdc.gov/foodsafety/es/communication/ecoli-and-food-safety.html 
[7] Infecciones por Klebsiella, Enterobacter y Serratia. (n.d.). Manual MSD versión 
para profesionales. CITADOMay 24, 2022, from https://www.msdmanuals.com/es-
mx/professional/enfermedades-infecciosas/bacilos-gramnegativos/infecciones-
por-y 
[8] Parra, D. S., Tovar, Q. F. B. J., Alejandra, O. Q. F. B., & Tovar, M. (n.d.). 
Uaslp.Mx. CITADOMay 24, 2022, from 
https://repositorioinstitucional.uaslp.mx/xmlui/bitstream/handle/i/4435/Antiob
iograma%20Morganella%20morganii%20%20por%20Daniela%20S%C3%A1nchez.pdf?se
quence=1&isAllowed=y#:~:text=Morganella%20morganii%20se%20ha%20asociado,c
on%20antecedentes%20de%20parto%20prematuro. 
[9] SAVALnet - Klebsiella oxytoca sería la principal causa de colitis hemorrágica 
asociada a antibióticos. (n.d.). SAVALnet. CITADO May 24, 2022, from 
https://www.savalnet.cl/cienciaymedicina/destacados/8901.html 
[10]Alejandro-Esperón A, Noa-Hechavarría I, Reyes-Navarro L. Introducción de la 
técnica PCR-RFLP para el diagnóstico de dos mutaciones en el gen VHL. Medisur 
[revista en Internet]. 2013 [citado 2022 May 25]; 11(3): [aprox. 6 p.]. Disponible 
en: http://www.medisur.sld.cu/index.php/medisur/article/view/2474 
[11] NPunto Volumen III. Número 30. Septiembre 2020 / Técnicas De Biología 
Molecular En El Diagnóstico De Enfermedades (citado el 25 de mayo del 2022) 
https://www.npunto.es/revista/30/tecnicas-de-biologia-molecular-en-el-
diagnostico-de-enfermedades-infecciosas 
[12] Rodicio, M. del R., & Mendoza, M. del C. (2004). Identificación bacteriana 
mediante secuenciación del ARNr 16S: fundamento, metodología y aplicaciones en 
microbiología clínica. Enfermedades infecciosas y microbiología clínica, CITADO 
22 de mayo del 2022 https://doi.org/10.1157/13059055 
 
 
 
 
 
https://www.cdc.gov/foodsafety/es/communication/ecoli-and-food-safety.html
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https://repositorioinstitucional.uaslp.mx/xmlui/bitstream/handle/i/4435/Antiobiograma%20Morganella%20morganii%20%20por%20Daniela%20S%C3%A1nchez.pdf?sequence=1&isAllowed=y#:~:text=Morganella%20morganii%20se%20ha%20asociado,con%20antecedentes%20de%20parto%20prematuro
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https://repositorioinstitucional.uaslp.mx/xmlui/bitstream/handle/i/4435/Antiobiograma%20Morganella%20morganii%20%20por%20Daniela%20S%C3%A1nchez.pdf?sequence=1&isAllowed=y#:~:text=Morganella%20morganii%20se%20ha%20asociado,con%20antecedentes%20de%20parto%20prematuro
https://www.savalnet.cl/cienciaymedicina/destacados/8901.html
http://www.medisur.sld.cu/index.php/medisur/article/view/2474
https://www.npunto.es/revista/npunto-volumen-iii-numero-30-septiembre-2020
https://www.npunto.es/revista/30/tecnicas-de-biologia-molecular-en-el-diagnostico-de-enfermedades-infecciosas
https://www.npunto.es/revista/30/tecnicas-de-biologia-molecular-en-el-diagnostico-de-enfermedades-infecciosas
https://doi.org/10.1157/13059055