Alteraciones-en-la-expresion-genica-de-mutantes-de-Arabidopsis-thaliana-como-resultado-de-la-deficiencia-en-una-pirofosfatasa-inorganica-soluble

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE 
MÉXICO 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
ALTERACIONES EN LA EXPRESIÓN GÉNICA DE 
MUTANTES DE Arabidopsis thaliana COMO 
RESULTADO DE LA DEFICIENCIA EN UNA 
PIROFOSFATASA INORGÁNICA SOLUBLE 
 
TESIS 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
INGENIERA QUÍMICA 
 
PRESENTA 
MARÍA JOSÉ, DE VILLAFRANCA CASAS 
 
MÉXICO, D.F. 2011 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
JURADO ASIGNADO: 
PRESIDENTE: RAÚL AGUILAR CABALLERO 
VOCAL: ROGELIO RODRÍGUEZ SOTRES 
SECRETARIO: MIREYA RODRÍGUEZ PENAGOS 
1ER. SUPLENTE: ISMAEL BUSTOS JAIMES 
2DO SUPLENTE: LUIS TONATIHUT SÁNCHEZ LINARES 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
LABORATORIO 115 EDIFICIO E, FACULTAD DE QUÍMICA, UNAM 
 
PROYECTO FINANCIADO POR: DGAPA 210909 
LA SUSTENTANTE FUE APOYADA POR UNA BECA DE ESTE PROYECTO 
 
ASESOR DEL TEMA: 
DR. ROGELIO RODRÍGUEZ SOTRES 
SUPERVISOR TÉCNICO: 
M. EN C. LILIÁN VALENCIA TURCOTTE 
SUSTENTANTE: 
MARÍA JOSÉ DE VILLAFRANCA CASAS 
0 Agradecimientos II 
 
 
 
Agradecimientos 
Primero que nada quisiera agradecer a mi asesor, el Dr. Rogelio Rodríguez Sotres, 
quien me dio la oportunidad de aprender en su laboratorio. Por sus consejos y por 
siempre contestar mis dudas con paciencia. También, quiero agradecer a la M. en C. 
Lilián Valencia Turcotte, y al M. en C. Eric Domínguez Hernández, quienes me enseña-
ron las técnicas de laboratorio necesarias para el desarrollo de este trabajo y me ayuda-
ron cuando lo necesité. Por último pero no menos importante, gracias a los demás 
miembros de laboratorio 115 del departamento de Bioquímica de la Facultad de Quími-
ca de la UNAM, en particular, al Dr. Eneas Chavelas y al Q.F.B. Carlos Páez. 
Gracias también a la UNAM, por la beca otorgada través del proyecto DGAPA 210909. 
I Índice III 
 
 
 
I Índice 
Agradecimientos ...................................................................................................... II 
I Índice ................................................................................................................. III 
II Abreviaturas ..................................................................................................... VI 
III Índice de figuras ................................................................................................ X 
IV Índice de tablas............................................................................................... XIII 
1 Resumen ............................................................................................................ 1 
2 Introducción ....................................................................................................... 3 
3 Antecedentes ..................................................................................................... 5 
3.1 Nutrición de las plantas ...........................................................................................5 
3.1.1 Nitrógeno ........................................................................................................5 
3.1.2 Fósforo ............................................................................................................6 
3.2 El pirofosfato y las pirofosfatasas ............................................................................7 
3.3 AtPPasas en Arabidopsis thaliana ..........................................................................9 
3.3.1 Uso de Arabidopsis thaliana como modelo de estudio ..................................10 
3.3.2 Transformación de Arabidopsis thaliana ........................................................12 
3.4 Condiciones de estrés abiótico y adaptaciones fisiológicas en vegetales..............13 
3.4.1 Estudios previos realizados en nuestro laboratorio de la respuesta de mutantes 
de Arabidopsis thaliana a estrés abiótico ......................................................................14 
3.4.2 Deficiencia de fosfato ....................................................................................16 
3.4.3 Fosfato alto ...................................................................................................16 
3.4.4 Estrés por calor .............................................................................................17 
3.4.5 Estrés salino ..................................................................................................19 
4 Hipótesis .......................................................................................................... 21 
5 Objetivos .......................................................................................................... 22 
I Índice IV 
 
 
 
5.1 Objetivo general ....................................................................................................22 
5.2 Objetivos particulares............................................................................................22 
6 Materiales y Métodos ...................................................................................... 23 
6.1 Materiales .............................................................................................................23 
6.1.1 Material y equipo de laboratorio ....................................................................23 
6.1.2 Reactivos y sustratos ....................................................................................23 
6.1.3 Material Biológico ..........................................................................................24 
6.1.4 Material para Biología Molecular ...................................................................24 
6.1.5 Soluciones.....................................................................................................25 
6.2 Métodos ................................................................................................................28 
6.2.1 Preparación de medio de crecimiento ...........................................................28 
6.2.2 Preparación de medio de crecimiento para selección de semillas mutantes ..28 
6.2.3 Germinación de semillas y crecimiento de plantas ........................................28 
6.2.4 Extracción de RNA total ................................................................................29 
6.2.5 Cuantificación de RNA ..................................................................................30 
6.2.6 Transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) ......30 
6.2.7 Electroforesis de ácidos nucleicos .................................................................31 
6.2.8 Tratamientos bajo condiciones de estrés ......................................................32 
6.2.9 Análisis estadístico de las características foliares de las plantas ...................32 
6.2.10 Microarreglos ................................................................................................33 
7 Resultados y Análisis ..................................................................................... 35 
7.1.1 Selección de plantas con la mutación para la proteína deseada ...................35 
7.1.2 Tratamientos con estrés abiótico ...................................................................41 
7.1.3 Microarreglos ................................................................................................498 Conclusiones ................................................................................................... 61 
9 Perspectivas .................................................................................................... 62 
I Índice V 
 
 
 
V Referencias ...................................................................................................... 63 
VI Anexo ............................................................................................................... 72 
 
II Abreviaturas VI 
 
 
 
II Abreviaturas 
Fórmula Unidad Descripción 
 °C grado Celsius 
 g gramo 
 h hora 
 L Litro 
 m metro 
 min minuto 
 V Volt 
v/v Adimensional Volumen/volumen 
p/v Adimensional Peso/volumen 
Abreviatura Descripción 
μ Prefijo que denota “10-6” 
ABA Ácido abscísico 
Al Aluminio 
ATP Adenosín trifosfato 
AtPPa Pirofosfatasa inorgánica soluble de Arabidopsis 
thaliana 
II Abreviaturas VII 
 
 
 
AtPPaN‡ Pirofosfatasa inorgánica soluble de Arabidopsis 
thaliana, isoenzima N (N=1-6) ‡ 
b Bases nitrogenadas 
BASTA® Nombre comercial del Glufosinato de amonio, 
también conocido como DL-fosfinotricina (herbicida) 
Buffer Amortiguador 
cDNA Ácido desoxirribonucleico complementario 
CO2 Dióxido de carbono 
Ca Calcio 
DEPC (C6H10O5) Dietilpirocarbonato 
DNA Ácido desoxirribonucleico 
DNasa Desoxirribonucleasa 
dNTP Desoxirribonucleótidos trifosfato 
DS Desviación estándar 
Fn Generación filial, n=1,2,3… 
Fe Hierro 
H2O Agua 
H2PO4- o HPO42- Ión ortofosfato 
HSP Proteína de choque térmico (Heat Shock Protein) 
II Abreviaturas VIII 
 
 
 
IPCC Panel Intergubernamental de Cambio Climático 
(Intergovernmental Panel on Climate Change) 
k Prefijo que denota “103” 
KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome 
m Prefijo que denota “10-3” 
MES C6H12NNaO4S (sal de sodio, amortiguador) 
METROMIX-4 Tierra de cultivo 
Mg2+ Ión magnesio 
MOPS 3-morfolinopropano-1- ácido sulfónico (amortiguador) 
mRNA Ácido ribonucleico mensajero 
n Prefijo que denota “10-9” 
N2 Nitrógeno molecular 
NaCl Cloruro de sodio 
NH4+ Ión amonio 
NCBI National Center for Biotechnological Information, EUA 
NO3- Ión nitrato 
Oligo F Secuencia de oligonucleótido hacia adelante 
Oligo R Secuencia de oligonucleótido de reversa 
pb Pares de bases 
II Abreviaturas IX 
 
 
 
PCR Reacción en cadena de la polimerasa 
pH Potencial de hidrógeno 
Pi Fosfato inorgánico 
PO33- Ión fosfito 
PPi Pirofosfato 
RNA Ácido ribonucleico 
RNAsa Ácido ribonucleasa 
RT-PCR Transcripción reversa y amplificación mediante la 
reacción en cadena de la polimerasa 
SWAP Experimento de microarreglos donde se tiñen las 
muestras y se hibrida primero el control vs mutante 
de un color cada uno y después se hace el 
experimento invirtiendo los colorantes en la 
muestras. 
TAE Amortiguador que contiene una mezcla de Tris, ácido 
acético y EDTA. 
TAIR The Arabidopsis Information Resource 
tDNA Ácido desoxirribonucleico de transferencia 
WT “Wild Tipe“ o planta silvestre utilizada como control 
III Índice de figuras X 
 
 
 
III Índice de figuras 
Figura 3.1- Esquema básico de la captación y reducción de nitrógeno y de la formación 
de proteínas en una planta superior [Novoa y Loomis 1981] ................................... 5 
Figura 3.2- Reacción de hidrólisis del pirofosfato ............................................................ 8 
Figura 3.3 - Nivel de expresión de mRNA de las 6 AtPPasas de Arabidopsis thaliana 
[Navarro de la Sancha 2009] .................................................................................. 10 
Figura 3.4 - Representación gráfica del análisis estadístico de las mediciones en las 
hojas de las plantas WT (azul), AtPPa1 (morado) y AtPPa4 (amarillo) después de 
ser sometidas al estrés por calor [Perales Baños 2008]......................................... 15 
Figura 3.5- Representación gráfica del análisis estadístico de las mediciones en las 
hojas de las plantas WT (azul), AtPPa1 (morado) y AtPPa4 (amarillo) después de 
ser sometidas a estrés por fosfato a 2.5mM [Perales Baños 2008]........................ 15 
Figura 6.1- Oligonucleótidos para las seis isoformas .................................................... 24 
Figura 7.1- Selección con BASTA® ............................................................................... 35 
Figura 7.2- Fenotipo de plantas AtPPa5 seleccionadas con BASTA® y WT a las 9, 10 y 
11 semanas de edad .............................................................................................. 36 
Figura 7.3- Fenotipo de plantas seleccionadas con BASTA®, AtPPa2 y AtPPa5 denotan 
que son posibles mutantes a las respectivas proteínas ......................................... 37 
Figura 7.4- Izquierda: Caracterización fenotípica Arabidopsis thaliana: posibles 
mutantes carentes de AtPPa5 (M5c, M5d, M5e) y planta silvestre (WT) a las 16 
semanas de edad. Derecha arriba: PCR con los oligonucleótidos para amplificar el 
mRNA de AtPPa5 en el RNA extraído de las plantas de la izquierda. Derecha 
abajo: Electroforesis del RNA extraído de las plantas mutantes teñido con bromuro 
de etidio .................................................................................................................. 38 
Figura 7.5- Izquierda: Caracterización fenotípica Arabidopsis thaliana: posibles 
mutantes carentes de AtPPa2 (M2a, M2b) y planta silvestre (WT) a las 16 semanas 
de edad. Derecha arriba: PCR con los oligonucleótidos para amplificar el mRNA de 
AtPPa2 en el RNA extraído de las plantas de la izquierda. Derecha abajo: 
Electroforesis del RNA extraído de las plantas mutantes teñido con bromuro de 
etidio ....................................................................................................................... 39 
III Índice de figuras XI 
 
 
 
Figura 7.6- Gel de agarosa con PCR de la mutante a la proteína AtPPa5 (M5c) F2 y WT 
para los oligos de las 6 isoformas AtPPasas (AtPPa1-AtPPa6). Para la mutante 
M5c se realizó un PCR con el RNA previamente amplificado por RT-PCR, mientras 
que para WT se hizo un solo RT-PCR a partir del RNA total. ................................ 40 
Figura 7.7- Izquierda: RNA total de planta de Arabidopsis silvestres (WT) y mutantes F2 
carentes de AtPPa5 (M5c). Derecha: Amplificación por PCR de mRNA para AtPPa3 
y AtPPa5 en la mutante (M5c) y la planta silvestre (WT) ....................................... 40 
Figura 7.8- Comparación de tamaño de vainas de posible mutante AtPPa4 y WT ....... 41 
Figura 7.9 - Medición del largo, ancho y área foliar (mm) con el software Motic Image 
PLUS 2.0. Planta de Arabidopsis carente de AtPPa5 F3, antes del tratamiento con 
estrés abiótico ........................................................................................................ 42 
Figura 7.10 - Medición del largo, ancho y área foliar (mm) con el software Motic Image 
PLUS 2.0. Planta de Arabidopsis carente de AtPPa5 F3 después del tratamiento 
con exceso de fosfato ............................................................................................. 43 
Figura 7.11 - Análisis estadístico de las mediciones de área foliar de las plantas de 
Arabidopsis sometidas a los diferentes tratamientos. Las barras de error indican 
el error estándar y el * indica una diferencia significativa ....................................... 44 
Figura 7.12 - Tratamiento térmico, fotografías del control y de la planta mutante a la 
proteína AtPPa5 F3 a lo largo de 3 semanas. El tratamiento de calor se aplicó por 
1h a 45°C al inicio de cada semana y empezó cuando las plantas tenían 1 mes de 
edad. El aspecto de las plantas silvestres mostrado aquí se observó desde el 
término de la primera semana de tratamiento ........................................................ 45 
Figura 7.13 - Tratamiento salino 35mM NaCl. Fotografías tomadas al término de cada 
semanadurante 3 semanas de la planta mutante a la proteína AtPPa5 F3 y del 
control (WT). El tratamiento inició cuando las plantas tenían 1 mes de edad ........ 46 
Figura 7.14 - Tratamiento por deficiencia de fosfato (medio sin fosfato). 
Fotografías tomadas al término de cada semana durante 3 semanas de la planta 
mutante a la proteína AtPPa5 F3 y del control (WT). El tratamiento inició cuando las 
plantas tenían 1 mes de edad ................................................................................ 47 
Figura 7.15 - Tratamiento por fosfato alto, 2.5mM PO43-. Fotografías tomadas al término 
de cada semana durante 3 semanas de la planta mutante a la proteína AtPPa5 F3 y 
del control (WT). El tratamiento inició cuando las plantas tenían 1 mes de edad... 48 
Figura 7.16- Gráfica diagnóstico experimento SWAP.................................................... 49 
III Índice de figuras XII 
 
 
 
Figura 7.17- Gráfica de la razón de intensidad (R) vs la intensidad media (I) de los 
resultados del SWAP del microarreglo WT vs M5c F2, los valores se encuentran 
normalizados y sin duplicados. Las cruces en verde tienen menos de una 
desviación estándar (DS), los valores en azul obscuro tienen entre 1 y 1.5 DS de la 
media, los valores en azul turquesa tienen entre 1.5 y 2 DS de la media y los 
valores en blanco tienes más de 2 DS de la media. ............................................... 51 
Figura 7.18- Gráfica de la razón de intensidad (R) vs la intensidad media (I) de los 
resultados del SWAP del microarreglo WT vs M5c F2, los valores se encuentran 
normalizados y sin duplicados. Se muestra la representación de los genes con Z-
score mayor a 1.5 ................................................................................................... 52 
Figura 7.19- Comparación de los genes con Z-score mayor a 1.5 que se sobre-
expresaron y los que se sub-expresaron ................................................................ 52 
Figura 7.20- Distribución de los genes con función conocida y desconocida en la base 
de datos KEGG para los genes que se sobre-expresaron ..................................... 53 
Figura 7.21- Clasificación de los genes sobre-expresados con función conocida en la 
base de datos KEGG .............................................................................................. 54 
Figura 7.22- Distribución de los genes con función conocida y desconocida en la base 
de datos KEGG para los genes que se sub-expresaron ........................................ 55 
Figura 7.23- Clasificación de los genes sub-expresados con función conocida en la base 
de datos KEGG ...................................................................................................... 55 
Figura 7.24- Clasificación de los genes sobre-expresados, funciones obtenidas de la 
base de datos del NCBI .......................................................................................... 56 
Figura 7.25- Clasificación de los genes sub-expresados, funciones obtenidas de la base 
de datos del NCBI .................................................................................................. 57 
Figura 9.1- Gráfica original de la razón de intensidad (R) vs la intensidad promedio (I) de 
los resultados del SWAP del microarreglo WT vs M5c F2, datos no normalizados
 ............................................................................................................................... 72 
Figura 9.2- Gráfica de la razón de intensidad (R) vs la intensidad promedio (I) de los 
resultados del SWAP del microarreglo WT vs M5c F2, datos normalizados y sin 
duplicados .............................................................................................................. 72 
IV Índice de tablas XIII 
 
 
 
IV Índice de tablas 
Tabla 6-1. Concentración de nutrientes para medio control y tratamiento con estrés ... 25 
Tabla 6-2. Reactivos para extracción de RNA ............................................................... 25 
Tabla 6-3. Gel de agarosa para electroforesis de RNA ................................................. 26 
Tabla 6-4. Amortiguador MOPS 10X ............................................................................. 26 
Tabla 6-5. Buffer de carga para muestras (gel RNA)..................................................... 26 
Tabla 6-6. Reactivos para tratamiento con DNAsa de Invitrogen® ............................... 26 
Tabla 6-7. Reactivos para reacción con RT ................................................................... 27 
Tabla 6-8. Reactivos y equipo para PCR....................................................................... 27 
Tabla 6-9. Gel de agarosa para electroforesis de DNA ................................................. 27 
Tabla 6-10. Muestras para electroforesis de DNA ......................................................... 27 
 
1 Resumen 1 
1 Resumen 
Las pirofosfatasas inorgánicas solubles (EC 3.6.1.1) son enzimas esenciales para los 
seres vivos cuya función es eliminar el pirofosfato que se genera como subproducto 
durante la biosíntesis de macromoléculas. Diversas evidencias del laboratorio del Dr. 
Rodríguez Sotres indican que estas enzimas tienen un papel importante en la tolerancia 
al estrés por deficiencia de fósforo y datos en la literatura sugieren su participación en la 
respuesta a otros tipos de estrés. La planta modelo Arabidopsis thaliana posee seis 
genes que codifican para pirofosfatasas inorgánicas solubles (AtPPa 1 al 6), cinco de 
las proteínas correspondientes se localizan en el citoplasma, al menos parcialmente. Se 
ignora si estas isoformas son redundantes, sin embargo, datos previos a este trabajo 
indican que este no es el caso. 
En el laboratorio, se tienen mutantes que poseen inserciones de tDNA en los genes 
AtPPa1, AtPPa4, AtPPa2 y AtPPa5. Las dos primeras han sido estudiadas en un traba-
jo previo y se encontró que su respuesta a condiciones de estrés está alterada. 
En el presente trabajo se caracterizó fisiológicamente a la mutante AtPPa5 bajo condi-
ciones óptimas de crecimiento y bajo condiciones de estrés salino, térmico, por defi-
ciencia de fosfato y por fosfato 2.5mM. Se encontró que la planta mutante crece menos 
que la silvestre en condiciones control, pero lo hace mejor bajo algunas condiciones de 
estrés abiótico. En particular, bajo estrés térmico (1h a la semana a 37ºC), salino 
(35mM NaCl) y de fosfato alto (2.5mM de PO43-). 
Adicionalmente, se aisló mRNA tanto de las mutantes como de las plantas silvestres y 
se analizó la expresión génica empleando microarreglos de DNA para monitorear simul-
táneamente la expresión de 22000 genes. 
Dentro de los genes sobre-expresados, se encontraron algunos que codifican para 
factores de transcripción, otros relacionados con la respuesta a auxinas, ABA y bras-
sinoesteroides. También, se encontraron proteínas relacionadas con respuesta a estrés 
salino, por choque térmico y por deficiencia de fosfato. 
1 Resumen 2 
Dentro de los genes sub-expresados, se encontraron algunas proteínas nucleares como 
histonas y otras responsables del remodelado de la cromatina, algunas proteínas de 
choque térmico y enzimas de respuesta a estrés oxidativo. 
La expresión diferencial de estos genes pudiera estar relacionada con el fenotipo ob-
servado (gran cantidad de tallos florales, vainas, flores y semillas) y con la respuesta de 
la planta mutante AtPPa5 a condiciones de estrés abiótico. Sin embargo, se requieren 
estudios posteriores, empleando tácticas más robustas de biología molecular para po-
der hacer conclusiones al respecto. 
2 Introducción 3 
2 Introducción 
A causa del crecimiento mundial de la población, se espera un incremento continuo en 
la demanda de alimentos. Además, hay una demanda reciente de cultivos para producir 
energéticos, por lo que en el futuro, será necesaria una mayor área superficial para uso 
agrícola y un mejor rendimiento por unidad deárea superficial [FAO 2003]. Los fenóme-
nos de intensificación y tecnificación de la agricultura van en aumento y traen como 
consecuencias el deterioro de suelos, contaminación de agua (ríos, lagos y mantos 
freáticos), un aumento en el uso de agua y de fertilizantes minerales [Bennett et al 
2001]. 
A pesar de que, dentro de ciertos límites, el aumento en el rendimiento de producción 
agrícola es directamente proporcional a la cantidad de fertilizante aplicado al suelo 
[FAO 2003], el mayor problema se encuentra en la asimilación de nutrientes en las 
plantas. 
Dos de los macronutrientes limitantes en el desarrollo de las plantas son el nitrógeno y 
el fósforo. Ambos existen de manera natural en diferentes proporciones en la atmósfera 
y corteza terrestre pero no siempre se encuentran de manera en que las plantas pue-
dan asimilarlos. El nitrógeno a pesar de encontrarse de manera abundante como gas en 
la atmósfera (79%) [Holford 1997], puede ser asimilado por las plantas únicamente en 
su forma orgánica, por lo que es necesaria la simbiosis con microorganismos fijadores 
de nitrógeno [Vance 2001]. Por su parte, el fósforo se encuentra principalmente en la 
corteza terrestre en forma de sales insolubles y es asimilado por las plantas únicamente 
como ión fosfato inorgánico (Pi) [Holford 1997]. Generalmente, el Pi se encuentra en la 
tierra en concentraciones menores que algunos otros micronutrientes, siendo la concen-
tración de Pi aún en tierras fértiles pocas veces mayor a10µM [Raghothama 1999]. El Pi 
tiene la particularidad de reaccionar con otros nutrientes existentes en la tierra y algu-
nos estudios han demostrado que hasta el 80% de Pi aplicado como fertilizante es 
fijado por la tierra, forzando a los campesinos a aumentar la dosis de fertilizantes para 
la producción de alimentos [Schachtman et al 1998]. 
2 Introducción 4 
Por otro lado, ya en las plantas, se ha observado que cuando se encuentran sometidas 
a estrés por deficiencia de Pi, se mantienen los niveles de pirofosfato (PPi) en las célu-
las aun cuando la concentración de otros compuestos como ATP y todos los nucleóti-
dos disminuye significativamente [Köck et al 2010]. Las pirofosfatasas inorgánicas solu-
bles (PPasas) son enzimas ubicuas en los seres vivos y están encargadas de mantener 
la disponibilidad de Pi en las células mediante la hidrólisis de PPi en dos moléculas de 
Pi. El PPi es producido principalmente como subproducto de muchas reacciones biosin-
téticas que utilizan ATP (u otros nucleótidos trifosfatados). Un aumento en la concentra-
ción de PPi dificultaría la síntesis de moléculas como DNA, RNA y proteínas debido a la 
naturaleza reversible de algunas de las reacciones involucradas. Concentraciones aún 
mayores resultarían tóxicas para la célula [Coperman et al 1992]. Por otro lado, la con-
centración de PPi en el citoplasma de las células vegetales suele permanecer constante 
[Weiner H. et al 1987], además de que la sobreexpresión de la pirofosfatasa de proto-
nes (H+-PPiasa) aumenta la tolerancia de las plantas a estrés de sequía y salinidad 
[Gaxiola et al 2007], en tanto que el silenciamiento de algunos de los genes de PPiasa 
soluble resulta en plantas con baja tolerancia a la sequía [George et al 2010]. 
Se sabe que Arabidospis thaliana cuenta con seis diferentes isoformas con actividad de 
pirofosfatasa inorgánica soluble (AtPPa1, AtPPa2, AtPPa3, AtPPa4, AtPPa5 y AtPPa6) 
y que la ausencia de alguna de ellas provoca cambios fenotípicos y de adaptación ante 
diferentes estreses [Perales Baños 2008]. Sin embargo, no todas las isoenzimas han 
sido estudiadas para esta especie, ni se ha caracterizado el fenotipo de las mutantes 
que carecen o sobre-expresan estas proteínas, por lo que resulta de gran interés el 
estudio de estas enzimas y su papel en el fenotipo en plantas, así como las diferencias 
o similitudes entre el genotipo de plantas mutantes y la silvestre (WT), particularmente 
bajo condiciones de estrés. 
3 Antecedentes 5 
3 Antecedentes 
3.1 Nutrición de las plantas 
3.1.1 Nitrógeno 
A pesar de que el nitrógeno es uno de los elementos más abundantes en la Tierra (79% 
de la atmósfera), es el elemento crítico limitante en el crecimiento de la mayoría de las 
plantas debido a su escaza disponibilidad. Las plantas adquieren nitrógeno de dos 
fuentes principalmente: (a) de la tierra, a través de fertilizantes comerciales, abono y/o 
mineralización de materia orgánica y (b) de la atmósfera, a través de la fijación simbióti-
ca de N2 [Holford 1997, Vance 2001]. Las plantas superiores absorben el nitrógeno en 
su forma oxidada (nitrato) y reducida (amoniaco), sintetizan aminoácidos cuando éste 
se encuentra en su forma reducida y posteriormente sintetizan proteínas a partir de los 
aminoácidos [Novoa y Loomis 1981]. En la Figura 3.1 se muestra un esquema básico. 
 
Figura 3.1- Esquema básico de la captación y reducción de nitrógeno y de la formación 
de proteínas en una planta superior [Novoa y Loomis 1981] 
3 Antecedentes 6 
3.1.2 Fósforo 
El fósforo es un macronutriente esencial en todos los organismos vivos. Realiza funcio-
nes biológicas básicas como elemento estructural en ácidos nucleicos y fosfolípidos, en 
el metabolismo energético, en la activación de intermediarios metabólicos, como com-
ponente en la transducción de señales (fosforilación y desfosforilación) y en la regula-
ción de enzimas. En plantas, el fosfato juega un papel estructural y de regulación fun-
damental en relación con la fotosíntesis, la conservación de energía y el metabolismo 
del carbono (síntesis de almidón y de sacarosa). Se sabe, que procesos metabólicos 
como la respiración y la fotosíntesis son activados por el fosfato inorgánico (Pi) o alguno 
de sus derivados orgánicos [Raghothama et al. 2004, Abel el at 2002, Gaxiola et al 
2011]. 
El fósforo es el segundo nutriente (después del nitrógeno) que limita el crecimiento y la 
producción agrícola en la mayor parte del mundo. Este elemento es sumamente reacti-
vo y en la naturaleza se encuentra casi siempre como fosfato mineral o formando com-
plejos orgánicos. Existen al menos 170 diferentes minerales, de los cuales los minerales 
de fósforo son los más inmóviles e insolubles, haciéndolo el nutriente de menor disponi-
bilidad [Holford 1997, Raghothama et al 2004]. 
Las plantas adquieren el fósforo de la tierra cuando éste se encuentra como ión ortofos-
fato H2PO4- o HPO42-, dependiendo del pH de la tierra. Para mantener los niveles celula-
res necesarios para el funcionamiento normal de una planta, debe existir una combina-
ción eficiente entre la absorción de fosfato y su translocación, por lo que debido a la 
baja concentración de fosfato en la tierra (que rara vez supera una concentración de 
10µM), las plantas se han adaptado desarrollando diferentes estrategias morfológicas, 
fisiológicas, bioquímicas y moleculares para una mejor absorción y aprovechamiento del 
fosfato [Raghothama 1999, Raghothama et al 2004, Gaxiola et al 2011]. 
Dentro de las adaptaciones morfológicas se encuentran: (a) los factores asociados a las 
raíces como morfología, arquitectura, densidad, longitud, y superficie de absorción de 
nutrientes de las raíces, (b) la asociación con hongos micorrícicos y (c) formación de 
raíces proteoides. 
3 Antecedentes 7 
Las adaptaciones fisiológicas pueden estar dirigidas a modificar el ambiente de la rizós-
fera, mediante la secreción de ácidos orgánicos (malato, citrato y oxalato) que liberan al 
Pi de los complejos inorgánicos de fosfatos de Ca, Fe y Al por quelación del metal, 
dichos complejos se encuentran en el suelo Algunas plantas también solubilizan el Pi 
mediante la secreción de otros compuestos quelantes, los cuales incluyen la producción 
de compuestos fenólicos como ácido pisídico y alfafurano. [Raghothama 1999, Raghot-
hama et al 2004.] 
Otros mecanismos incluyen la secreción de ácidos orgánicos, protones y la secreciónde proteínas, tales como fosfatasas, fitasas y RNAsas, que movilizan fosfato de la mate-
ria orgánica del suelo y aumentan su biodisponibilidad. Adaptaciones fisiológicas y 
bioquímicas dentro de la planta incluyen un aumento en la traslocación de fósforo 
dentro de las plantas, retención de Pi en las raíces, así como modificaciones adaptati-
vas de la respiración, el metabolismo de carbono, la fijación de nitrógeno y la fotosínte-
sis. Entre los cambios bioquímicos documentados se encuentran cambios en la regula-
ción enzimática, con un aumento en la producción de fosfatasas, RNAsas y ácidos 
orgánicos intracelulares, cambios en los patrones de fosforilación de proteínas y la 
activación de un libramiento en la ruta glicolítica. Todos estos cambios son reflejo de 
cambios en la expresión de genes que codifican para fosfatasas y transportadores de 
fosfato entre otros [Jolicoeur et al 2002, Raghothama 1999]. 
Las plantas mantienen una concentración suficiente y constante de Pi en las células, 
cuando existe una situación de suficiencia de Pi, éstas lo almacenan en las vacuolas o 
lo secretan por las raíces [Raghothama 2004]. 
3.2 El pirofosfato y las pirofosfatasas 
El pirofosfato (PPi) es un compuesto de gran importancia bioquímica, ya que su hidróli-
sis proporciona un empuje termodinámico a un gran número reacciones biosintéticas y, 
en muchos organismos, sirve como intermediario en rutas metabólicas tales como la 
degradación de sacarosa y almidón. Además, puede tener un rol como regulador de 
3 Antecedentes 8 
procesos biosintéticos, aunque los mecanismos que median su papel en la regulación 
están muy poco entendidos [Mansurova 1989, Heinonen 2001, Perales Baños 2008]. 
En animales, el PPi tiene un papel importante en la regulación del metabolismo de cal-
cio-fosfato. En microorganismos se han detectado enzimas dependientes de PPi que 
son responsables de la fosforilación de intermediarios esenciales en la glucólisis y la 
gluconeogénesis. En plantas también se han encontrado enzimas dependientes de PPi, 
en el citoplasma, en la mitocondria y en cloroplastos. 
En algunos casos, el PPi puede actuar como donador de energía sustituyendo al ATP 
[Davies et al 1993, Heinonen 2001]. Todo lo anterior ubica al PPi en la bioenergética de 
los organismos superiores contemporáneos [Mansurova 1989], más allá de su papel 
como subproducto de reacciones mediadas por pirofosforólisis y de su posible papel 
como moneda de energía en las células primitivas [Brown & Kornberg 2004]. 
Como se ha dicho anteriormente, la hidrólisis de PPi en dos moléculas de Pi se lleva a 
cabo gracias a la presencia de pirofosfatasas inorgánicas (Figura 3.2), enzimas ubicuas 
en los organismos vivos. La reacción de hidrólisis es una reacción altamente exergónica 
(∆G°’= -33.5 kJ mol-1), lo que compensa los valores de ∆G°’cercanos a cero de muchas 
de las reacciones biosintéticas de pirofosforólisis y que proporciona la fuerza termodi-
námica impulsora para muchos procesos anabólicos [Kornberg 1962]. 
 
Figura 3.2- Reacción de hidrólisis del pirofosfato 
Existen al menos dos grandes familias de pirofosfatasas inorgánicas (PPasas EC 
3.6.1.1) las PPasas solubles y las PPasas H+-translocación asociadas a la membrana 
(H+-PPasas) [Rizhong et al 2009]. Las PPasas asociadas a la membrana están directa-
mente relacionadas con reacciones bioenergéticas. Por su parte, las PPasas solubles 
3 Antecedentes 9 
se han reconocido por su función de hidrólisis de PPi como subproducto de reacciones 
biosintéticas dependientes de ATP, facilitando dicha biosíntesis al proporcionar un im-
pulso termodinámico a dichos procesos [Kornberg 1962, Baltscheffsky et al 1999]. 
Dentro de las pirofosfatasas inorgánicas se han encontrado algunas enzimas membra-
nales que no sólo son capaces de hidrolizar el PPi disipando la energía de su enlace 
fosfoanhídrido, sino que también son capaces de transformar la energía química a eléc-
trica y viceversa [Mansurova 1989]. 
En las plantas, como se ha dicho, el pirofosfato juega roles adicionales, pero desafortu-
nadamente la participación de las pirofosfatasas en estas funciones está poco entendi-
da. Hay evidencia, sin embargo, de que estas enzimas también participan en la asimila-
ción de nutrientes minerales [du Jardin et al 1995]. 
3.3 AtPPasas en Arabidopsis thaliana 
Arabidopsis thaliana cuenta con 6 isoenzimas, de las cuales, las primeras 5 tienen un 
parecido del 69% entre sí, mientras que la sexta tiene una secuencia más larga de 
aminoácidos, pero precedida por un péptido de tránsito al cloroplasto, de manera que la 
proteína madura es ligeramente más pequeña. Ésta última proteína sólo cuenta con una 
semejanza del 22% respecto a las demás [Schulze et al 2004], y su secuencia de 
aminoácidos está más emparentada con la pirofosfatasa de la levadura [Gómez García 
et al 2006]. 
En el laboratorio del Dr. Rodríguez Sotres se caracterizaron cinética y molecularmente a 
las isoenzimas AtPPa1 y AtPPa4, encontrando que ambas proteínas tienen una alta 
especificidad a pirofosfato y son activadas por Mg2+ [Navarro de la Sancha 2005]. La 
isoenzima AtPPa6 también es dependiente de Mg2+ y su pH óptimo es de 7.5 [Schulze 
et al 2004]. En el mismo laboratorio también se ha estudiado la localización de las dife-
rentes isoformas en los compartimientos celulares mediante la ligación de una proteína 
fluorescente al gen de la AtPPasa. Se encontró que AtPPa1 se localiza preferentemente 
en regiones citosólicas encontrándose también, aunque en menor proporción, en el 
núcleo de las células. Las AtPPa2 y AtPPa3 se localizan exclusivamente en el citosol. 
3 Antecedentes 10 
La isoforma AtPPa4 no se localizó claramente en A. thaliana, mientras que la isoforma 
AtPPa5 fue localizada en el citosol y en otras partículas que podrían ser mitocondrias, 
pero cuya identidad no fue establecida con certeza [Navarro de la Sancha 2009]. La 
isoenzima AtPPa6, al menos en experimentos de importación in vitro, se localiza princi-
palmente en cloroplastos [Schulze et al 2004]. 
Se conoce, gracias a estudios de microarreglos y a otras estrategias de biología mole-
cular, el nivel de expresión de las diferentes isoenzimas AtPPasas de Arabidpsis thalia-
na a lo largo del desarrollo de la planta y en cada uno de sus órganos, como se puede 
observar en la Figura 3.3 [http://www.genevestigator.ethz/, Navarro de la Sancha 2009]. 
 
Figura 3.3 - Nivel de expresión de mRNA de las 6 AtPPasas de Arabidopsis thaliana 
[Navarro de la Sancha 2009] 
3.3.1 Uso de Arabidopsis thaliana como modelo de estudio 
Arabidopsis thaliana es una planta floral, considerada maleza, que ha sido sujeto de 
estudio para experimentos de genética vegetal clásica desde hace 67 años y que ha 
3 Antecedentes 11 
sido usada por poco más de 20 años en laboratorios que, desde un enfoque genético 
molecular, estudian problemas de fisiología, bioquímica y desarrollo vegetal. Lo anterior, 
es debido a que reúne propiedades de son de utilidad para la genética vegetal clásica y 
otras útiles para la genética molecular vegetal [Meyerowitz 1989]. 
Dentro de las propiedades útiles para la genética vegetal clásica, se encuentran: 
1. El reducido tamaño de la planta madura y de la semilla. 
2. La producción de un gran número de semillas por planta. 
3. Su capacidad de crecimiento en condiciones controladas de laboratorio (luz fluo-
rescente continua, temperatura ambiente, ya sea en una mezcla de tierra o en un 
medio estéril definido), permitiendo que su crecimiento sea fácil y económico. 
4. Polinización directa y progenie donde se observa segregación Mendeliana [Me-
yerowitz 1989, Hays 2002]. 
Mientras que, dentro de las propiedades útiles para la genética molecular, se en-
cuentran: 
1. Un genoma nuclear de reducido tamaño (125Mpb en los cuales hay 25,498 ge-
nes), que ha sido secuenciado en su totalidad. 
2. La relativa facilidad de transformación de la planta, pudiéndoseseleccionar el fe-
notipo deseado (ver el siguiente apartado) [Meyerowitz 1989, The Arabidopsis 
Genome Initiative 2000, Hays 2002]. 
3. La creación de una plataforma internacional de información genómica que rela-
ciona racionalmente a los genes con las características de la planta [Lee et al 
2010]. 
3 Antecedentes 12 
3.3.2 Transformación de Arabidopsis thaliana 
Una de las herramientas esenciales en el estudio del análisis funcional de los genes en 
un organismo cuyo genoma haya sido completamente secuenciado, es la de generar la 
pérdida de la función de uno o más genes. Para lograrlo, una estrategia frecuente en 
Arabidopsis thaliana y en otras plantas es utilizar a la bacteria Agrobacterium tumefa-
ciens [Alonso et al 2003]. 
Agrobacterium tumefaciens, un fitopatógeno presente en la tierra, es capaz de trans-
formar genéticamente a diversas plantas dicotiledóneas, infectando por medio de heri-
das y causando tumores conocidos como agallas de cuello o corona. Durante la trans-
formación, la bacteria transfiere un segmento específico de su DNA, una copia del lla-
mado tDNA (secuencia T). El tDNA es parte de un plásmido de gran tamaño, denomi-
nado plásmido Ti por su capacidad inductora de tumores. Se encuentra delimitado por 
dos secuencias de 25-pb de repeticiones directas, llamadas bordes del tDNA. Cualquier 
secuencia de DNA contenida entre estos bordes, será transferida a la planta. En con-
traste con otros segmentos de DNA móviles, el tDNA no posee información para auto-
transferirse. Sin embargo, dentro del plásmido Ti se encuentran genes vir, que son 
activados por proteínas liberadas por la planta (VirA, VirB, VirC, VirD, VirG,...). Estos 
genes contienen la información necesaria para generar, cortar y transferir la secuencia-
T (una copia de cadena sencilla del tDNA) de la célula bacteriana a la célula de la plan-
ta. Cuando la secuencia T se encuentra en el núcleo de la planta, ésta se integra a un 
cromosoma [Stachel & Nester 1986, Zupan & Zambryski 1995]. 
El fragmento de tDNA contenido en dicho plásmido, es manipulado mediante ingeniería 
genética, para eliminar las secuencias oncogénicas (causantes de los tumores) e inser-
tar las secuencias de interés para mutar al gen objetivo. A esta secuencia se le inserta 
también un marcador, un gen de resistencia a un herbicida o antibiótico, que permita 
seleccionar las plantas transformadas. Lo anterior es posible debido a que los intrones 
de Arabidopsis thaliana son muy pequeños, por lo que, una inserción de tDNA de una 
longitud de 5 a 25 kb en un exón de un gen de la planta causa la interrupción de la 
secuencia del gen, lo que lleva a la pérdida del mensaje y de la función de dicho gen. 
Las transformaciones se realizan al azar y, posteriormente, utilizando oligonucleótidos 
3 Antecedentes 13 
dirigidos a la secuencia insertada en el vector para secuenciar fragmentos de DNA 
adyacentes a dicho sitio, se puede identificar el sitio de inserción. [De Block 1993, Rad-
hamony et al 2005]. 
Uno de los herbicidas utilizados para la selección de plantas transformadas es el glufo-
sinato de amonio, conocido comercialmente como BASTA®, un potente inhibidor de la 
enzima glutamina sintetasa. Esta enzima es esencial para la asimilación de nitrógeno 
en las plantas y el gen de resistencia proviene de una glutamino sintetasa insensible al 
inhibidor que fue aislada de bacterias de género Streptomices [Powles et al 1996]. 
Para el estudio funcional de los genes de un organismo, se han diseñado estrategias en 
las cuales se transforma al organismo genéticamente y, posteriormente, se analizan las 
diferencias (respecto al organismo silvestre) de los principales productos génicos: 
mRNA, proteínas y metabolitos celulares [Lahner et al 2003]. 
3.4 Condiciones de estrés abiótico y adaptaciones fisiológicas en 
vegetales 
Un estrés biológico se define como una condición o fuerza adversa que inhibe el funcio-
namiento normal y el bienestar de un sistema biológico [Mahajan & Tuteja 2005]. 
Una gran variedad de condiciones ambientales pueden inducir estrés, alterando signifi-
cativamente el metabolismo, crecimiento y desarrollo de plantas. En casos extremos, el 
estrés puede conducir a la muerte del organismo. Los estreses abióticos incluyen se-
quía, alta concentración de sales, temperaturas extremas (altas y bajas), metales pesa-
dos y radiación [Taylor et al 2009]. Es importante entender la respuesta de las plantas a 
condiciones de estrés si se quiere mejorar el rendimiento de cultivo de vegetales bajo 
condiciones poco favorables de crecimiento. Las plantas responden y se adaptan a 
estos estreses a nivel molecular, celular, fisiológico y bioquímico [Urano et al 2010]. La 
adaptación al estrés es mediada a través de cambios profundos en la expresión genéti-
ca y que se traducen en cambios observables. Esta respuesta es un proceso dinámico 
que depende de la intensidad y duración del estrés [Kosová et al 2011]. 
3 Antecedentes 14 
En plantas, la identificación de genes detrás de la variación fenotípica, puede tener 
aplicaciones prácticas, al proveer de recursos útiles en el ámbito agrícola (un posible 
medio para aumentar el rendimiento y la calidad de los cultivos), al mismo tiempo que 
puedan ser identificados los genes clave en la trayectoria evolutiva de las poblaciones 
de plantas. [Bergelson et al 2010]. 
3.4.1 Estudios previos realizados en nuestro laboratorio de la respuesta de mu-
tantes de Arabidopsis thaliana a estrés abiótico 
En el laboratorio del Dr. Rodríguez Sotres se ha estudiado la respuesta a estrés abiótico 
en plantas mutantes a dos de las isoenzimas, AtPPa1y AtPPa4. Se plantaron las semi-
llas con una posible mutación por inserción de tDNA en los genes de las proteínas 
AtPPa1 y AtPPa4 de Arabidopsis thaliana hasta la cuarta generación (F4), de dichas 
plantas se seleccionaron las fenotípicamente diferentes y se evaluó su resistencia a 
BASTA®. Posteriormente, mediante la técnica de RT-PCR se encontró que las plantas 
eran homócigas para la mutación en el gen de AtPPa1 y heterócigas para el gen de 
AtPPa4 (mostrando muy poca señal para esta enzima). Se sometió a las plantas a 
condiciones de estrés térmico, salino, osmótico, deficiencia de fosfato y fosfato alto 
(2.5mM). Y se realizó una caracterización fenotípica. Se encontró que las plantas mu-
tantes heterócigas del gen que codifica para la enzima AtPPa4 son más resistentes al 
estrés por calor (45°C 1 hora a la semana) como se puede observar en la Figura 3.4 y 
que ambas mutantes son resistentes a estrés salino (NaCl 35mM) y a estrés por altas 
concentraciones de fosfato. La planta mutante heteróciga mutante a la isoenzima 
AtPPa4 resultó más resistente al estrés por calor que la planta silvestre (WT) y que la 
planta mutante a la proteína AtPPa1, mientras que la mutante a la isoenzima AtPPa1 
resultó ser más resistente que la mutante a la isoenzima AtPPa4 (heteróciga) al estrés 
por exceso de fosfato como se puede ver en la Figura 3.5 [Perales Baños 2008]. 
3 Antecedentes 15 
 
Figura 3.4 - Representación gráfica del análisis estadístico de las mediciones en las hojas 
de las plantas WT (azul), AtPPa1 (morado) y AtPPa4 (amarillo) después de ser sometidas 
al estrés por calor [Perales Baños 2008] 
 
Figura 3.5- Representación gráfica del análisis estadístico de las mediciones en las hojas 
de las plantas WT (azul), AtPPa1 (morado) y AtPPa4 (amarillo) después de ser sometidas 
a estrés por fosfato a 2.5mM [Perales Baños 2008] 
3 Antecedentes 16 
3.4.2 Deficiencia de fosfato 
La habilidad de las plantas de adquirir fosfato aumenta significativamente cuando éstas 
se encuentran en deficiencia de Pi, este aumento es aparentemente regulado, en parte, 
a nivel transcripcional [Raghothama et al 2004]. 
Cambios bioquímicos 
La deficiencia de Pi rápidamente induce la expresión de genes que codifican para pro-
teínas involucradas en transporte de Pi, llevandoa un incremento en la transcripción y 
síntesis de fosfatasas ácidas tanto intracelulares como extracelulares. Se sabe que los 
niveles de ATP y de todos los nucleótidos disminuyen significativamente en cultivos 
celulares durante deficiencia de Pi, y que el PPi, que se mantiene en altos niveles, por 
lo que éste podría funcionar como una fuente autónoma de energía. Las enzimas con-
sideradas como adaptativas de la ruta de la glucólisis, aquellas que no requieren al Pi 
como sustrato, son activadas con condiciones de deficiencia de Pi, permitiendo que se 
lleve a cabo el metabolismo del carbono en estas condiciones [Plaxton 1996]. 
La deficiencia de Pi también resulta en la activación de una ruta de respiración alterna y 
en la disminución de la tasa de fotosíntesis. [Theodorou & Plaxton 1993, Ragothama 
1999, Ragothama 2004]. 
Las adaptaciones morfológicas y demás estrategias frente a la deficiencia de Pi, fueron 
mencionadas anteriormente en la Sección 3.1.2. 
3.4.3 Fosfato alto 
Así como la falta de nutrientes es un problema serio para cualquier ser vivo, los excesos 
pueden también ser nocivos. En los animales, ejemplos de ello son fácilmente observa-
bles y existen numerosos estudios sobre los efectos de la sobrenutrición. En otros or-
ganismos, la sobrenutrición en la naturaleza es poco frecuente y se ha estudiado con 
menos intensidad. 
3 Antecedentes 17 
En las plantas, la presencia de concentraciones elevadas de algún nutriente en el suelo 
puede conducir a alteraciones en la fisiología del organismo [Rogato et al 2010]. Con 
frecuencia estos efectos pueden deberse a sobreacumulación del nutrimento en los 
tejidos, lo cual puede tener algunos efectos negativos sobre la célula además de que 
puede limitar la absorción de otros minerales por parte de la planta [Bubier et al 2011]. 
En particular, el fósforo suele ser un nutriente escaso en los suelos naturales y rara-
mente alcanzaría niveles tóxicos. Sin embargo, la excesiva aplicación de fertilizantes ha 
generado áreas en donde los suelos se encuentran saturados con fósforo, lo cual se 
traduce en una elevación del contenido de fosfato y otros nutrientes en cuerpos acuáti-
cos. Tal elevación provoca, a su vez, un fenómeno conocido como eutroficación que se 
caracteriza por crecimiento excesivo de ciertas algas que tienen efectos nocivos sobre 
los ecosistemas acuáticos [Behrendt & Boekhold 1993]. 
La toxicidad del exceso de fósforo en la agricultura es conocida por los agricultores, 
pero los efectos en la fisiología de las plantas han sido poco caracterizados. En particu-
lar, las plantas de Arabidopsis afectadas en el transporte de fosfato se convierten en 
hiperacumuladoras de fosfato y acusan claros síntomas de intoxicación por este mineral 
[Delhaize & Randall 1995]. La deficiencia de cinc puede también causar una elevación 
en la toma de fosfato en las plantas, lo que conduce a síntomas de toxicidad por este 
mineral [Singh et al 1988]. 
Bajo condiciones de hidroponia, la aplicación de altas concentraciones de fosfato se ha 
reportado como un factor que debe evitarse, dados sus efectos negativos sobre la pro-
ductividad [Mckeehen et al 1996, Webb & Loneragan 1988]. El exceso de fosfato puede 
tener también efectos negativos sobre la absorción de micronutrientes, particularmente 
hierro [Zheng et al 2009]. 
3.4.4 Estrés por calor 
En la naturaleza, las plantas no sólo están sujetas a modificaciones en la temperatura 
durante los cambios de estación sino también a variaciones de temperatura durante el 
transcurso del día. Aunado a esto, el Panel Intergubernamental de Cambio Climático 
3 Antecedentes 18 
(IPCC, por sus siglas en inglés) ha reportado que la temperatura media global va a 
aumentar 0.3°C cada década. Es por eso, que entender las respuestas de las plantas y 
otros organismos al estrés térmico, es de gran importancia para el género humano. 
Las plantas, al igual que otros organismos, han desarrollado estrategias para prevenir y 
reparar daños causados por el aumento de la temperatura. La respuesta a estrés por 
calor se caracteriza por una rápida reprogramación en la expresión génica, generando 
la acumulación transitoria de proteínas llamadas de choque térmico y lo cual incrementa 
la termotolerancia de las células [Larkindale & Knight 2002, Wahid et al 2007, Ergen et 
al 2009]. 
Las altas temperaturas, ya sean transitorias o constantes, causan una serie de cambios 
documentados en las plantas a nivel morfo-anatómico, fisiológico y bioquímico en los 
organismos vegetales, algunos de los cuales se tratan a continuación. 
Cambios bioquímicos 
Dentro de los efectos a nivel bioquímico, un aumento en la temperatura afecta severa-
mente a la mayoría de los procesos celulares como la fotosíntesis, la respiración, la 
proporción de agua, la estabilidad membranal, la transcripción y la traducción, modu-
lando también los niveles de hormonas y metabolitos primarios y secundarios [Lakindale 
& Knight 2002, Wahid et al 2007]. Los daños directos de las altas temperaturas incluyen 
la desnaturalización y agregación de proteínas y el incremento en la fluidez de la mem-
brana lipídica. Daños indirectos (más lentos) incluyen la inactivación de enzimas en 
cloroplastos y mitocondria, inhibición de síntesis de proteínas, degradación de proteínas 
y pérdida de la integridad de la membrana. Sin embargo, uno de los principales efectos 
es la generación de un estrés oxidativo secundario a la elevación de temperatura. En 
Arabidopsis thaliana,un estudio demostró que el calor causa estrés oxidativo y que éste 
es dependiente de luz, lo que sugiere al cloroplasto como sitio de generación de las 
especies reactivas de oxígeno. Se encontró además, que el calcio, el ácido abscísico, el 
etileno y el ácido salicílico tienen roles de protección o reparación del daño oxidativo 
inducido por calor en dicha planta [Lakindale & Knight 2002]. También, se ha estudiado 
la respuesta de las 6 diferentes AtPPasas a estrés por calor en Arabidopsis thaliana, 
3 Antecedentes 19 
encontrando que los cambios en la expresión de las isoformas provocados por este 
estrés son distintos para cada isoforma y son dependientes del tiempo en que la planta 
se encuentre sometida al estrés y del tiempo de recuperación que se le proporcione a la 
planta. En particular, la expresión de AtPPa2 en hoja se suprime 70% después de que 
la planta es sometida a un estrés por calor a 37°C durante 2 horas, pero se induce 
200% en el tiempo de recuperación posterior al estrés (16 horas). Este estudio muestra 
también que los niveles de expresión de las diferentes isoformas son diferentes en 
tejidos distintos. Por ejemplo, después de que la planta está sometida a estrés por calor 
a 37°C durante 2 horas, la expresión de AtPPa3, disminuye 91% en hoja mientras que 
en raíz se incrementa casi 800% [Ergen et al 2009]. 
Cambios morfo-anatómicos y fisiológicos 
La radiación y el estrés por calor pueden causar quemaduras y cambios de coloración 
de las hojas, tornándolas blancas y también inhibiendo el crecimiento del tallo y de la 
raíz. A nivel sub-celular la mayor modificación ocurre en los cloroplastos, donde las 
altas temperaturas cambian la organización estructural de los tilacoides, causando 
cambios en la fotosíntesis [Wahid et al 2007, Ergen et al 2009]. 
En todos los organismos estudiados la respuesta a choque térmico produce un cambio 
rápido y profundo en la expresión génica. Las proteínas que se expresan fuertemente 
en respuesta a este fenómeno han sino designadas proteínas de choque térmico o 
HSP. En Arabidopsis thaliana, los efectos del choque térmico han sido estudiados 
usando diferentes estrategias y se han identificado un número importante de cambios 
en la expresión genética debidos al choque térmico [Lindquist & Craig 1988, Takanashi 
& Komeda 1989] 
3.4.5 Estrés salino 
La salinidad en un estrés ambiental importante que ha ido aumentado a nivel global, a 
talgrado que se espera que tenga efectos devastadores como la pérdida del 30% de la 
tierra de cultivo en los próximos 25 años y el 50% para mediados del siglo 21. El alto 
3 Antecedentes 20 
contenido de sales causa estrés híper-iónico e híper-osmótico, y puede llevar a la muer-
te de la planta [Mahajan & Tuteja 2005]. 
La toxicidad del Na+, depende de su localización sub-celular. Bajo condiciones de estrés 
salino, la acumulación de sodio en tejido vegetal puede exceder la habilidad natural de 
las células de almacenar los iones en las vacuolas, causando acumulación en el cito-
plasma o en las paredes celulares y originando un desequilibrio osmótico (a corto plazo) 
y toxicidad metabólica (en el largo plazo). El desequilibrio osmótico a su vez genera 
deshidratación celular [Møller & Tester 2007]. Si la concentración de iones Na+ y Cl – 
aumenta en la raíces de la planta y éstos son absorbidos, entonces ocurre un despla-
zamiento de nutrientes como K+, Ca2+ y nitrato con serias consecuencias para la super-
vivencia de la planta [Timperio et al 2008]. 
4 Hipótesis 21 
4 Hipótesis 
Plantas de Arabidopsis thaliana con una mutación por inserción de tDNA en el gen que 
codifica para una pirofosfatasa inorgánica soluble mostrarán un fenotipo diferente y 
presentarán alteraciones en su metabolismo al ser sometidas a condiciones de estrés 
salino, térmico, de deficiencia de fosfato o de altas concentraciones de Pi con respecto 
al de plantas silvestres. 
5 Objetivos 22 
5 Objetivos 
5.1 Objetivo general 
Analizar la expresión génica de plantas mutantes de Arabidopsis thaliana, en las que un 
gen que codifica para alguna de las proteínas AtPPa se encuentra interrumpido. 
Comparar los resultados obtenidos con fenotipos observados al crecer las plantas en 
condiciones de estrés. 
5.2 Objetivos particulares 
- Seleccionar plantas homócigas mutantes de Arabidopsis thaliana con inserciones 
de tDNA en los genes que codifican para las proteínas AtPPa2, AtPPa4 y 
AtPPa5. 
- Extraer mRNA de Arabidopsis thaliana silvestre y de mutantes crecidas bajo 
condiciones control. 
- Demostrar la ausencia de los mRNA mutados mediante transcripción reversa y 
amplificación de los mensajes correspondientes (RT-PCR). 
- Caracterizar la respuesta a estrés salino, estrés por calor, estrés por altas 
concentraciones de fosfato y estrés por deficiencia de fosfato de estas mutantes. 
- Determinar cambios en la expresión génica de las mutantes respecto al control 
por medio de microarreglos de DNA. 
- Analizar los resultados agrupando los genes identificados según el proceso 
fisiológico o bioquímico en el que participan. Correlacionar los resultados con los 
fenotipos observados. 
 
6 Materiales y Métodos 23 
6 Materiales y Métodos 
6.1 Materiales 
6.1.1 Material y equipo de laboratorio 
Cajas Petri de plástico de 8.5 cm de diámetro, cajas Petri de vidrio de 10cm de diáme-
tro, tubos eppendorf tratados con DEPC, Microtubos para PCR de Axygen®, macetas 
de plástico y material común de vidrio y plástico para laboratorio fueron comprados a 
proveedores locales. 
Centrífuga para tubos eppendorf Biofuge pico de Heraeus®. 
Mini incubadora marca Labnet®. 
Espectrofotómetro UV/VIS Optizen® POP Bio, de Mecasys Co., Ltd. 
Fuente de poder EC4000P series 90 programable de THERMO®. 
Termociclador MaxyGene Gradient de Axygen®. 
6.1.2 Reactivos y sustratos 
El sustrato preparado para cultivos vegetales fue METROMIX-4. 
Se utilizó Tris Base de Sigma Chemical Co®, cloruro de sodio, fosfato de sodio dibásico 
y fosfato de sodio monobásico de Baker®, glufosinato de amonio (BASTA®) y Gellan 
Gum Powder. Los ácidos, solventes y otros reactivos comunes, grado analítico se obtu-
vieron de proveedores locales. 
6 Materiales y Métodos 24 
6.1.3 Material Biológico 
Las semillas de Arabidopsis thaliana de las diferentes mutantes con inserciones de 
tDNA, fueron adquiridas del Arabidorsis Biological Resource Center (ABRC), de la 
Universidad de Ohio, EUA, a través de la iniciativa TAIR (The Arabidopsis Information 
Resource). 
6.1.4 Material para Biología Molecular 
Los estuches para protocolos de biología molecular fueron de Invitrogen®, Promega®, 
Ambion® y Quiagen®. 
Los microarreglos 22k para Arabidopsis thaliana se adquirieron en la unidad de micro-
arreglos de Instituto de Fisiología Celular de la UNAM. 
Los seis pares de oligonucleótidos, fueron sintetizados en el Instituto de Fisiología Celu-
lar de la UNAM. Éstos fueron diseñados previamente en el laboratorio (Navarro de la 
Sancha 2009), la secuencia de aminoácidos (3’→5’) se muestra en la Figura 6.1. 
 
Figura 6.1- Oligonucleótidos para las seis isoformas 
6 Materiales y Métodos 25 
6.1.5 Soluciones 
Tabla 6-1. Concentración de nutrientes para medio control y tratamiento con estrés 
 
Tabla 6-2. Reactivos para extracción de RNA 
 
 
 
 
6 Materiales y Métodos 26 
Tabla 6-3. Gel de agarosa para electroforesis de RNA 
 
Tabla 6-4. Amortiguador MOPS 10X 
 
Tabla 6-5. Buffer de carga para muestras (gel RNA) 
 
Tabla 6-6. Reactivos para tratamiento con DNAsa de Invitrogen® 
 
6 Materiales y Métodos 27 
 
Tabla 6-7. Reactivos para reacción con RT 
 
Tabla 6-8. Reactivos y equipo para PCR 
 
Tabla 6-9. Gel de agarosa para electroforesis de DNA 
 
Tabla 6-10. Muestras para electroforesis de DNA 
 
 
6 Materiales y Métodos 28 
6.2 Métodos 
6.2.1 Preparación de medio de crecimiento 
- Se prepara el medio con los nutrientes listados en la Tabla 6-1, agregando 
0.5%p/v de sacarosa y MES 2.35mM. 
- Se ajusta la solución a un pH de 5.7. 
- Se agrega 0.33%p/v de Gellan Gum Powder a la solución. 
- Se esteriliza la solución y se vierte en cajas Petri estériles. 
6.2.2 Preparación de medio de crecimiento para selección de semillas mutantes 
Se prepara el medio de igual manera que en el apartado 6.2.1, pero se agrega a la 
solución estéril BASTA® 10µM previo a ser vertido en las cajas Petri. 
6.2.3 Germinación de semillas y crecimiento de plantas 
6.2.3.1 Desinfección de semillas 
- Se colocan las semillas en un tubo eppendorf y se agrega una solución 70%v/v 
de etanol en agua, se deja durante 2 min y se desecha la solución. 
- Se agrega al tubo con las semillas una solución 10%v/v de hipoclorito de sodio 
(cloro comercial) en H2O, se deja durante 10 min y se desecha la solución. 
- Posteriormente, se hacen 4 lavados rápidos con agua destilada. 
6.2.3.2 Siembra de semillas 
Se colocan las semillas desinfectadas en la caja Petri con medio. (Aproximadamente 25 
semillas/ caja) 
6 Materiales y Métodos 29 
6.2.3.3 Germinación de semillas 
- Las cajas Petri se colocan en refrigeración a 4°C en ausencia de luz 
(envolviéndolas con papel aluminio). Se dejan por 48h. 
- Después de este periodo, se quita el papel aluminio de las cajas Petri, se retiran 
de refrigeración y se transfieren a una cámara de crecimiento a 22°C con luz 
continua por un periodo de 4-6h (para estimular la germinación). 
- Se vuelven a cubrir las cajas con papel aluminio y se dejan en la cámara a 22°C 
por 48h. 
- Finalmente, se retira el papel aluminio y se dejan a 22°C con un foto-periodo de 
16h luz/ 8h obscuridad durante 24h. 
6.2.3.4 Crecimiento de plantas 
- Después de la germinación, las cajas Petri se dejan en una cámara de crecimien-
to a 22°C con un foto-periodo 16h luz/ 8h obscuridad durante 2 semanas más. 
- Una vez concluido este periodo, las plántulas ya tienen un tamaño suficiente para 
empezar los tratamientos con estrés o ser trasplantadas a maceta con tierra de 
cultivo METROMIX-4. 
* En caso de los tratamiento con estrés, a las tres semanas de edad, la plántulas son 
trasplantadas a cajas Petri con medio control en ausencia de BASTA®. Se busca que 
una vez seleccionadas con el herbicida, las plántulas crezcan una semana en medio 
control y se recuperen antes de ser sometidas al estrés correspondiente. 
6.2.4 Extracción de RNA total 
- Se pesa el tejido,se agrega nitrógeno líquido y se pulveriza hasta un polvo fino. 
Sin dejar que se descongele se agrega TRI Reagent® conforme a la Tabla 6-2. 
6 Materiales y Métodos 30 
- Se mezcla y se deja actuar de 5 a 10min. Posteriormente, se transfiere a un tubo 
eppendorf de 2mL. Se incuba a temperatura ambiente por 5 min. Se centrifuga a 
12,000g durante 10min a 4°C y se transfiere el sobrenadante a un nuevo tubo. 
- Se agrega cloroformo en proporción de acuerdo a la Tabla 6-2. Se agita 
vigorosamente por 15s y se deja incubar de 10min a temperatura ambiente. 
- Se centrifuga a 12,000g durante 15min a 4°C. Se transfiere el sobrenadante con 
mucho cuidado a un tubo nuevo. 
- Se agrega isopropanol conforme a la Tabla 6-2. Se agita moderadamente por 
10s y, posteriormente, se incuba a temperatura ambiente por 8min. 
- Se centrifuga a 12,000g por 8min, a 4°C y se retira cuidadosamente el 
sobrenadante sin resuspender la pastilla. 
- Se agrega etanol conforme a la Tabla 6-2. se centrifuga a 7,500g durante 5min, a 
4°C. 
- Se remueve el etanol y se seca la pastilla con nitrógeno gaseoso. 
Posteriormente, se re-suspende el precipitado en agua tratada con DEPC. 
6.2.5 Cuantificación de RNA 
Se lee la absorbencia a 260nm y a 280nm en el espectrofotómetro. Posteriormente, se 
calcula la concentración de RNA tomando en cuenta la dilución utilizada. 
6.2.6 Transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) 
Se siguió el protocolo de los estuches de Invitrogen®. 
• SuperScript™ III Reverse Transcriptase, número de catálogo: 18080-085. Los 
reactivos utilizados se encuentran en la Tabla 6-7. 
• Platinum® Taq DNA Polymerase, número de catálogo: 10966-018. Los reactivos 
utilizados se encuentran en Tabla 6-8. 
6 Materiales y Métodos 31 
6.2.7 Electroforesis de ácidos nucleicos 
6.2.7.1 Electroforesis de RNA 
6.2.7.1.1 Preparación del gel de agarosa 
- Se mezcla agarosa ultra pura con agua y se agrega el amortiguador MOPS 10X. 
- Se calienta la mezcla hasta que la agarosa se disuelva (sin dejar que hierva). 
Una vez disuelta, se espera a que enfríe y se agrega formaldehido conforme a la 
Tabla 6-3. 
- Se vierte en la charola de electroforesis, se coloca el peine y se deja solidificar. 
6.2.7.1.2 Preparación de las muestras 
- Conforme a la concentración obtenida, se calcula el volumen necesario para 1µg 
de RNA. 
- Se agrega al volumen correspondiente a 1µg de muestra, H2O estéril hasta 10µL 
y se añaden 3µL de amortiguador de carga. 
- Se calientan las muestras a 65°C durante 5min y, posteriormente, se ponen en 
hielo. 
Se pone la charola con el gel en la celda de electroforesis, se llena la celda con MOPS 
1X y se cargan las muestras tratadas en los pozos del gel. 
Se conecta la celda a la fuente de poder y se deja correr el gel 45min a 90V. 
6.2.7.2 Electroforesis de DNA 
6.2.7.2.1 Preparación del gel de agarosa 
- Se mezcla agarosa ultra pura y amortiguador TAE 1X conforme a la Tabla 6-9. 
6 Materiales y Métodos 32 
- Se calienta hasta que la agarosa se disuelva (sin dejar que hierva) y cuando en-
fríe se agrega bromuro de etidio, conforme a la Tabla 6-9. 
- Se vierte en la charola de electroforesis, se coloca el peine y se deja solidificar. 
Se pone la charola con el gel en la celda de electroforesis, se llena la celda con TAE 1X 
y se cargan las muestras conforme a la Tabla 6-10, en los pozos del gel. 
Se conecta la celda a la fuente de poder y se deja correr el gel 45min a 90V. 
6.2.8 Tratamientos bajo condiciones de estrés 
A las tres semanas de vida, las plántulas son trasplantadas a frascos con el medio 
correspondiente al estrés conforme a la Tabla 6-1, las plántulas se dejan en una cámara 
de crecimiento a 22°C y un fotoperiodo de 16h luz/ 8h obscuridad por tres semanas 
más. 
Para el estrés térmico, se utiliza medio control y cada semana se transfieren las plántu-
las a una incubadora a 45°C y se dejan por una hora. 
6.2.9 Análisis estadístico de las características foliares de las plantas 
Se toma una fotografía (en microscopio electrónico) de las plantas antes y después de 
los diferentes tratamientos con estrés. Con ayuda del programa MOTIC® Images Plus 
2.0®, se miden el largo, ancho y área foliar de las plantas mutantes y de las plantas 
control. 
Con los datos provenientes de las mediciones, se hace un análisis estadístico ANOVA. 
El análisis estadístico se realizó con el paquete SigmaStat 2.1 (Jendel Scientific, San 
Rafael CA, USA.) 
6 Materiales y Métodos 33 
6.2.10 Microarreglos 
Se extrajeron 30µg de RNA de cada muestra y se llevaron a la Unidad de Microarreglos 
del Instituto de Fisiología Celular de la UNAM, donde se realizaron los experimentos 
SWAP según sus protocolos. 
El dogma central de la biología molecular, formulado por Watson y Crick, establece que 
el flujo de información genética dentro de una célula está contenido en el DNA, es 
transcrito a RNA mensajero (mRNA) y después es traducido a proteínas [Stent 1968]. 
Dependiendo del tipo de célula y de su estado biológico, cada gen se transcribe, luego 
se traduce y se produce una proteína en mayor o menor proporción. Además, la degra-
dación, tanto del RNA como de la proteína es sujeto de control. Si se pudiera medir el 
conjunto de todas las proteínas presentes en una célula, se obtendría información del 
estado actual de la célula, sin embargo, ésta es una pieza de información muy difícil de 
obtener. Por otro lado, aunque la transcripción no determina del todo el contenido de 
proteína de una célula, da indicios muy claros de los cambios que ocurren ella en res-
puesta a diferentes condiciones o estados de desarrollo. Existen tres diferentes conjun-
tos de técnicas para el estudio de la dinámica celular basados en la variación de sus 
contenidos de macromoléculas y metabolitos: 
1. El contenido y distribución de las proteínas totales de la célula (proteómica), bajo 
determinado estado o condición de la célula. 
2. El contenido relativo y la identidad de los mRNA totales que codifican para la forma-
ción de proteínas (transcriptómica), medidos bajo una cierta condición. 
3. Los metabolitos totales presentes en una célula en una condición dada en la célula a 
partir de las proteínas (metalobolómica). 
Una herramienta poderosa para el estudio de la transcriptómica son los microarreglos 
[Karakach et al 2010]. 
Los microarreglos son placas microscópicas hechas con vidrio, nylon o sílica, que con-
tienen fragmentos de DNA (sondas) ordenados y fijados, en un patrón conocido, a la 
superficie de la placa. Posteriormente, estas placas son incubadas con muestras de 
6 Materiales y Métodos 34 
cDNA, DNA o RNA (muestras objetivo) previamente marcadas con colorantes fluores-
centes [Riva et al 2005]. 
Las muestras “objetivo” son las muestras en las que se va a comparar la expresión 
génica total, se obtienen mediante la extracción de RNA total de algún tejido (vegetal o 
animal) o de algún cultivo celular. A continuación, el mRNA es marcado con un coloran-
te fluorescente (se usa un colorante por muestra, azul y rojo, generalmente) mediante la 
reacción catalizada por la enzima transcriptasa reversa, obteniendo DNA complementa-
rio (cDNA) al mRNA. 
La hibridación de las sondas y las muestras de cDNA objetivo se lleva a cabo debido a 
la complementariedad de pares de bases en ambas, dejando expuesto el marcador 
fluorescente. Si un gen es muy activo, entonces producirá muchas cadenas comple-
mentarias de mRNA y por lo tanto, habrá más cDNA hibridado en el microarreglo, gene-
rando una mayor señal fluorescente. Por otro lado, genes con poca actividad producirán 
poco mRNA, en consecuencia poco cDNA se hibridará al microarreglo y la intensidad 
luminosa producida será muy leve. La ausencia de fluorescencia, significa, que no hay 
ningún cDNA hibridado, indicando que el gen respectivo es inactivo [National Human 
Genome Research Center U.S. 2011]. 
Los datos en la imagen del microarreglo son analizadospara agrupar a los genes que 
muestran un patrón de expresión similar, así como a los que son afectados significati-
vamente (ya sea en la sobre-expresión o la represión) respecto al control. Debido a que 
una muestra es marcada de un color y la otra es marcada de otro color, es posible dis-
tinguir diferencias entre ellos (señales rojo y verde) y los genes que son expresados de 
manera similar en ambos (señal amarilla). 
En la era pos-genómica, los análisis que emplean tecnologías de genómica funcional 
como la transcriptómica, la proteómica y le metabolómica han permitido un mayor en-
tendimiento de la complejidad de las redes de regulación asociadas a la adaptación y 
tolerancia a estrés en plantas y otros organismos [Urano et al 2010]. 
7 Resultados y Análisis 35 
7 Resultados y Análisis 
7.1.1 Selección de plantas con la mutación para la proteína deseada 
Se sembraron plantas de Arabidopsis thaliana con posibles mutaciones para los genes 
de AtPPa2, AtPPa4 y AtPPa5 en un medio control con BASTA®, así como WT en me-
dio control sin BASTA®. La mutación para las diferentes AtPPasas está ligada a la 
resistencia al herbicida BASTA®, lo que resulta útil para diferenciar las plantas que 
poseen la mutación de las que no lo hacen. En la Figura 7.1 se muestra la selección de 
plántulas resistentes a BASTA® (la planta resistente se encuentra dentro de un círculo 
rojo). 
 
Figura 7.1- Selección con BASTA® 
Las plantas fueron trasplantadas a METROMIX-4 a las 3 semanas de edad y fueron 
monitoreadas a lo largo de su crecimiento. Se encontraron diferencias fenotípicas entre 
las posibles mutantes y la planta control. 
La posible mutante AtPPa5 (resistente a BASTA) mostró un fenotipo particularmente 
distinto respecto a las demás mutantes y al control. 
7 Resultados y Análisis 36 
Como se puede observar en la Figura 7.2, el desarrollo de las hojas en la roseta es muy 
particular, a pesar de que a las 9 semanas de edad el fenotipo es bastante similar entre 
la posible mutante AtPPa5 y la silvestre. Con forme pasa el tiempo aumenta la cantidad 
de hojas de menor tamaño en la roseta de la posible mutante AtPPa5, fenómeno que no 
sucede en la planta silvestre donde las hojas de la roseta tienden a aumentar su tama-
ño a medida que la planta se desarrolla. 
 
Figura 7.2- Fenotipo de plantas AtPPa5 seleccionadas con BASTA® y WT a las 9, 10 y 11 
semanas de edad 
7 Resultados y Análisis 37 
En lo referente al sistema reproductivo, la posible mutante AtPPa5 muestra un notable 
incremento en el número de tallos florales, flores, vainas y semillas como se puede ver 
en la Figura 7.3. 
 
Figura 7.3- Fenotipo de plantas seleccionadas con BASTA®, AtPPa2 y AtPPa5 denotan 
que son posibles mutantes a las respectivas proteínas 
Una vez seleccionadas las posibles mutantes, se utilizó el método de RT-PCR para 
probar la ausencia o expresión del gen que codifica para la proteína AtPPa5 y la 
proteína AtPPa2. 
De las posibles mutantes AtPPa5, se encontró que la planta denominada M5c denotaba 
la ausencia del mRNA producto de la expresión del genAtPPa5, como se muestra a 
continuación en la Figura 7.4. Las mutantes M5d y M5e presentan una reducción en los 
niveles de mensaje, por lo que es posible que sean heterócigas. En cualquier caso, se 
puede observar que la mutación presenta un fenotipo dominante, ya que las 3 plantas 
presentaron el fenotipo alterado. En los tres casos se observa que el tallo floral es de 
mayor tamaño que la planta silvestre y que, como ya se mencionó, existe un mayor 
número de flores, vainas y tallos florales. Así mismo, en las mutantes no se observan 
hojas de gran tamaño en la roseta a diferencia de la silvestre. 
7 Resultados y Análisis 38 
 
Figura 7.4- Izquierda: Caracterización fenotípica Arabidopsis thaliana: posibles mutantes 
carentes de AtPPa5 (M5c, M5d, M5e) y planta silvestre (WT) a las 16 semanas de edad. 
Derecha arriba: PCR con los oligonucleótidos para amplificar el mRNA de AtPPa5 en el 
RNA extraído de las plantas de la izquierda. Derecha abajo: Electroforesis del RNA 
extraído de las plantas mutantes teñido con bromuro de etidio 
De las posibles mutantes AtPPa2 que fueron seleccionadas mediante su resistencia a 
BASTA®, no se encontró ninguna que fuera homóciga al gen que codifica para AtPPa2. 
Sin embargo, en las plantas heterócigas del gen que codifica para AtPPA2 se aprecia-
ron diferencias fenotípicas respecto al control y a mutantes AtPPa5. En la Figura 7.5 se 
pueden observar los resultados de los experimentos de RT-PCR. 
7 Resultados y Análisis 39 
 
Figura 7.5- Izquierda: Caracterización fenotípica Arabidopsis thaliana: posibles mutantes 
carentes de AtPPa2 (M2a, M2b) y planta silvestre (WT) a las 16 semanas de edad. Derecha 
arriba: PCR con los oligonucleótidos para amplificar el mRNA de AtPPa2 en el RNA 
extraído de las plantas de la izquierda. Derecha abajo: Electroforesis del RNA extraído 
de las plantas mutantes teñido con bromuro de etidio 
Una vez seleccionada la planta mutante a la proteína AtPPa5, se sembró la segunda 
generación (F2) a partir de las semillas producidas en medio control. Estas también 
fueron seleccionadas con BASTA® durante 3 semanas y, posteriormente, fueron tras-
plantadas a macetas con METROMIX-4. 
Para asegurar la ausencia del gen, se realizaron nuevamente extracciones de RNA y se 
hicieron mediciones de la presencia de ciertos mRNAs por medio de RT-PCR. Se reali-
zó un PCR con cada oligo de AtPPasa (1-6). Debido a la poca expresión de algunos 
mensajes para AtPPasa en la planta mutante, se realizó un PCR con el RNA previa-
mente amplificado por el RT- PCR para la planta mutante, la fotografía del gel se puede 
observar en la Figura 7.6. Es importante mencionar que cuando se realizan este tipo de 
experimentos, es posible, debido al gran número de amplificaciones realizadas, que se 
obtenga una amplificación espúrea causada por contaminación u otros artificios, como 
7 Resultados y Análisis 40 
es el caso de la M5c para AtPPa5 y AtPPa3. Sin embargo, tales experimentos son útiles 
porque revelan la baja o nula presencia de ciertos mensajes. Esas secuencias no apa-
recen en el primer experimento que se realizó a partir del mismo RNA como se puede 
observar en la Figura 7.7. Aún así, en el gel del segundo experimento se observa muy 
poca expresión para estas proteínas, lo que es esperado ya que la proteína AtPPa3 
tiene muy poca expresión en hojas como se puede ver en la Figura 3.3 y tanto en la 
control como en la mutante hay muy baja señal de amplificación. 
 
Figura 7.6- Gel de agarosa con PCR de la mutante a la proteína AtPPa5 (M5c) F2 y WT 
para los oligos de las 6 isoformas AtPPasas (AtPPa1-AtPPa6). Para la mutante M5c se 
realizó un PCR con el RNA previamente amplificado por RT-PCR, mientras que para WT 
se hizo un solo RT-PCR a partir del RNA total. 
 
Figura 7.7- Izquierda: RNA total de planta de Arabidopsis silvestres (WT) y mutantes F2 
carentes de AtPPa5 (M5c). Derecha: Amplificación por PCR de mRNA para AtPPa3 y 
AtPPa5 en la mutante (M5c) y la planta silvestre (WT) 
A diferencia de las posibles mutantes AtPPa2 y AtPPA5, la única posible mutante para 
AtPPa4 que fue resistente a la selección con BASTA®, mostró un crecimiento notable-
mente más lento y produjo una menor cantidad de flores y vainas. Estas últimas fueron 
de menor tamaño al control y estériles. Debido al poco tejido que se produjo, no fue 
posible hacer extracciones de RNA para esta planta. Tampoco fue posible seleccionar 
7 Resultados y Análisis 41 
otras posibles mutantes debido a que ésta planta no produjo semillas. 
En la Figura 7.8 se puede apreciar la notable diferencia en el tamaño de las vainas de 
esta posible mutante AtPPa4 respecto a la silvestre. 
 
 Figura 7.8- Comparación de tamaño de vainas de posible mutante AtPPa4 y WT 
7.1.2 Tratamientos con estrés abiótico 
Para los tratamientos con estrés