Aseguramiento-de-la-calidad-en-los-ensayos-microbiologicos-cualitativos

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Ingeniería Fácil

14/7/2022

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO EN INGENIERÍA
INGENIERÍA DE SISTEMAS – SISTEMAS DE CALIDAD

ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD EN LOS ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS
CUALITATIVOS

T E S I S
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:

MAESTRO EN INGENIERÍA

P R E S E N T A:

I.Q. MARINA INÉS GASCA LEÓN

TUTOR PRINCIPAL

MA. DE LOS ÁNGELES P. OLVERA TREVIÑO, FACULTAD DE QUÍMICA

MÉXICO, D. F. JUNIO 2013
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fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el
respectivo titular de los Derechos de Autor.

JURADO ASIGNADO:

Presidente: DRA. WACHER RODARTE MARÍA DEL CARMEN

Secretario: M.C. ALPIZAR RAMOS MARÍA DEL SOCORRO

Vocal: DR. SAMANO CASTILLO JOSE SABINO

1 er. Suplente: DR. BARRAGAN OCAÑA ALEJANDRO

2 d o. Suplente: DRA. OLVERA TREVIÑO MA. DE LOS ÁNGELES P.

Lugar donde se realizó la tesis: UNIDAD DE METROLOGÍA DE LA FACULTAD
DE QUÍMICA

TUTOR DE TESIS:

DRA. OLVERA TREVIÑO MA. DE LOS ÁNGELES P.

--------------------------------------------------
FIRMA

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AGRADECIMIENTOS

Agradezco a DIOS y a la VIRGEN DE GUADALUPE por todo lo que me han
dado, fortaleza, persistencia, paciencia pero sobre todo porque en ningún
momento he dejado de sentir su presencia.

Agradezco y dedico esta tesis a mi hija FERNANDA por ser el motor de mi vida,
por impulsarme a seguir adelante y por enseñarme tantas cosas.

A JOSÉ JUAN MACIP OLVERA por estar presente en mi vida y por acompañarme
en este proceso, siempre animándome.

A mis papás porque aún en la distancia siempre me apoyan y confían en mí. Los
amo.

A mi hermana LUPE porque siempre está ahí para escucharme, entenderme,
aconsejarme, apoyarme en fin por seguir siendo mi mamá chiquita.

A mis amigos y compañeros de trabajo: Amalia, Javier, Inesita, Rosita, Lili, Paty
Mary, Elizabeth, Arabel, Georgi, Rosa Ana, Anita, Irazú y Elvia, por echarme
porras aún en los momentos difíciles.

A la Doctora ÁNGELES OLVERA, mi tutora, por el tiempo, la paciencia, el apoyo y
la dirección de esta tesis en todos estos años.

Al Dr. Víctor Ortiz, Dra. Patricia de Gortari, QFB. Guillermo Ordaz. Maestro René
Serrano, QBP. Héctor Sánchez por sus valiosos granitos de arena en la
realización de este trabajo.

A mis jefas Lic. Ma. Guadalupe Solís Díaz y M.E. Luz Elena Pale Montero por el
apoyo brindado en todos los aspectos para concluir este proceso.

A los miembros del jurado Dra. Carmen Wacher, M.C. Socorro Alpizar, Dr. José
Sámano, Dr. Alejandro Barragán por el tiempo dedicado y sus valiosos
comentarios.

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RESUMEN

Un laboratorio de ensayos microbiológicos debe tener como principales objetivos asegurar
la calidad del trabajo que realiza y de los resultados que se generan; esto se logra
mediante el uso de métodos exactos y confiables bajo la guía de un sistema de
aseguramiento de la calidad.
La primer fase de los sistemas de calidad es la normalización, en el caso de los
laboratorios de ensayos es la Norma Mexicana NMX-EC-17025-IMNC-2006 equivalente a
la internacional ISO/IEC 17025:2005 la que establece los lineamientos necesarios para
que éstos puedan demostrar que operan con un sistema de calidad, que son
técnicamente competentes y que son capaces de generar resultados técnicamente
válidos.
Para ensayos microbiológicos, además se ha desarrollado un documento de aplicación
que complementa los requisitos especificados en la norma.
Sin embargo, esta norma exige demostrar la seguridad del resultado de medir a través de
parámetros de tipo cuantitativo y por lo tanto aquellos métodos de ensayo microbiológico
de tipo cualitativo tales como en los que el resultado se expresa en términos de
detectado/no detectado presentan ciertas limitantes para cumplir con los requisitos de la
norma y demostrar la seguridad de los resultados obtenidos.
El objetivo de este trabajo fue comprobar mediante el análisis de documentos nacionales
e internacionales que los requisitos técnicos que plantea la norma y el documento de
aplicación son suficientes y pueden ser cumplidos por los laboratorios que realizan
análisis microbiológicos de tipo cualitativo y de esta manera asegurar la calidad de los
resultados obtenidos.
Para realizar el estudio se seleccionó la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) aplicada a la detección de microorganismos patógenos transmitidos por alimentos
ya que representa una valiosa alternativa para los métodos tradicionales de detección,
siendo la velocidad, el límite de detección, la selectividad, especificidad, sensibilidad y el
potencial para la automatización sus ventajas más importantes. Sin embargo, para
demostrar confiabilidad en los resultados de medir en los laboratorios que usan esta
técnica es muy difícil poder cumplir con los lineamientos que exige la normatividad.
Se analizaron y desarrollaron cada uno de los requisitos técnicos de la norma y se
propusieron alternativas para cumplir con aquellos requisitos que presentan limitantes por
la propia naturaleza del método de ensayo como fueron: la validación, la estimación de la
incertidumbre de medida y la determinación de la trazabilidad; generando como resultado
un plan integral de implementación de un esquema para dar cumplimiento a cada uno de
los requisitos de la norma con la técnica de PCR para la detección de patógenos
transmitidos por alimentos y que podrá servir como guía para que los laboratorios que
realizan análisis microbiológicos de tipo cualitativo a través de esta técnica puedan
asegurar la calidad de sus resultados.

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INDICE

RESUMEN
Pág.

INTRODUCCIÓN

1
PROBLEMÁTICA

3
I. ANTECEDENTES

5
I.1. Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo.

5
I.2. El laboratorio de ensayos microbiológicos y el aseguramiento de la
calidad de los resultados.

9
I.3. Documento de aplicación EA-4/10 “Accreditation for microbiological
laboratories”.

10
I.4. Enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) y los métodos de
Identificación de microorganismos.

14
I.5. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

18
HIPÓTESIS

24
OBJETIVO GENERAL

24
OBJETIVOS ESPECÍFICOS

24
II. REQUISITOS TÉCNICOS DE LA NORMA ISO/IEC 17025:2005 Y
LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) PARA
DETECCIÓN DE PATÓGENOS TRANSMITIDOS POR ALIMENTOS

25
II.1. Requisitos técnicos (5)

25
II.1.1. Generalidades (5.1)

25
II.1.2. Personal (5.2)

26
II.1.3. Instalaciones y condiciones ambientales (5.3)

26
II.1.4. Método de ensayo y validación del método (5.4)

27
II.1.5. Equipo y Reactivos(5.5)

30
II.1.6. Trazabilidad de la medición (5.6)

35
II.1.7. Muestreo (5.7) 35
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Pág.

II.1.8. Manejo de los ítems (elementos) de ensayo (5.8)

36
II.1.9. Aseguramiento de la calidad de los resultados de ensayo (5.9)

36
II.1.10. Informe de resultados (5.10)

38
III. VALIDACIÓN DEL MÉTODO DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR) PARA LA DETECCIÓN DE PATÓGENOS TRANS-
MITIDOS POR ALIMENTOS.

40
III.1 Método de PCR para la detección de patógenos transmitidos por alimentos
Validación (Demostración de buen funcionamiento o desempeño)

40
III.1.1 Cepas bacterianas de referencia (microorganismos objetivo)

42
III.1.2. Preparación de las muestras de ADN

43
III.1.3. Par de cebadores y PCR

43
III.1.4. Control de Amplificación Interno (CAI)

44
III.1.5. Determinación de la probabilidad de detección

44
III.1.6. Estudio Interlaboratorios usando el par de cebadores más selectivo

46
IV. ESTIMACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE DEL MÉTODO DE LA REACCIÓN
EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) PARA LA DETECCIÓN DE
PATÓGENOS TRANSMITIDOS POR ALIMENTOS

50
IV.1. Incertidumbre asociada con análisis microbiológicos

51
IV.2. Método de PCR para la detección de patógenos transmitidos por
Alimentos: Incertidumbre de medida

54
IV.2.1. Fuentes de incertidumbre

54
IV.2.2. Cuantificación de las fuentes de incertidumbre

55
IV.2.3. Incertidumbre en la toma de decisión

58
V. TRAZABILIDAD EN EL MÉTODO DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR) PARA LA DETECCIÓN DE PATÓGENOS TRANS-
MITIDOS POR ALIMENTOS

63
V.1. Trazabilidad

63
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Pág.

V.2. Trazabilidad en los laboratorios microbiológicos

64
V.3. Método de PCR para la detección de patógenos transmitidos por alimentos
Trazabilidad

65
V.3.1. Cepas de referencia

66
V.3.2. Micropipetas (pipetas de pistón)

67
V.3.3. Espectrofotómetro UV- Vis

71
V.3.4. Termociclador

74
RESULTADOS

Plan integral de implementación de un esquema para dar cumplimiento a los
Requisitos técnicos de la norma NMX-EC-17025-IMNC-2006 con la técnica de
PCR para la detección de patógenos transmitidos por alimentos

77
CONCLUSIONES

81
BIBLIOGRAFÍA

83
ANEXO A

87
Estándares concernientes al enriquecimiento de microorganismos (bacterias)

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1

INTRODUCCIÒN

Un laboratorio de ensayos microbiológicos es una instalación que cuenta con la capacidad
técnica, material y humana para efectuar las mediciones y análisis o determinar las
características microbiológicas de materiales, productos o equipos de acuerdo a
especificaciones establecidas. Debe tener como principales objetivos asegurar la calidad
del trabajo que se realiza y de los resultados que se generan, ya que en cualquier
momento del ensayo microbiológico se pueden cometer errores significativos y para
prevenirlos es importante identificar los puntos críticos y controlarlos paso a paso a lo
largo de todas las etapas del ensayo. Esto se logra mediante el uso de métodos exactos y
confiables bajo la guía de un Sistema de Aseguramiento de la Calidad planificado y
documentado.

Ahora bien, un Sistema de Aseguramiento de la Calidad se define como un conjunto de
actividades planificadas y sistemáticas, equipos, materiales, procesos, documentación y
personal requeridos para que las tareas y operaciones se desarrollen asegurando la
calidad en sus resultados, disminuyendo al mínimo los efectos de posibles fuentes de
error. La primera fase de los Sistemas de Calidad es la Normalización; en el caso de los
laboratorios de ensayos es la Norma Mexicana NMX-EC-17025-IMNC-2006 equivalente a
la internacional ISO/IEC 17025:2005 la que establece los lineamientos necesarios para
que éstos puedan demostrar que operan con un sistema de calidad, que son
técnicamente competentes y que son capaces de generar resultados técnicamente
válidos.

Debido a que los requisitos especificados en esta norma son enunciados en términos
generales y pueden ser aplicados a todos los laboratorios de ensayo y calibración, para
aplicaciones específicas como en el caso de la microbiología, surge la necesidad de
generar un documento de aplicación por separado según se establece en el Anexo B de
la norma.

El documento de aplicación para los ensayos microbiológicos ha sido elaborado
conjuntamente por Eurachem y EA como una forma de promover un enfoque armonizado
para la acreditación de los laboratorios, este documento complementa los requisitos
establecidos en la norma ISO 17025 con directrices específicas tanto para los auditores
como para los laboratorios que realizan análisis microbiológicos. Estas directrices son
aplicables a todo tipo de mediciones objetivas, ya sean o no rutinarias o como parte de
actividades de investigación y desarrollo. Aunque se han escrito pensando especialmente
en análisis microbiológicos de alimentos y medio ambiente, los principios generales
pueden aplicarse también a otras áreas como bioquímica, biología molecular y cultivos
celulares, aunque esos laboratorios pueden tener que cumplir otros requisitos adicionales.

A pesar que desde el punto de vista metrológico existen diversas guías orientadas hacia
el análisis microbiológico, aún deben hacerse más esfuerzos para proponer protocolos de
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2

control de los análisis más seguros, así como metodologías más robustas y eficaces que
permitan obtener resultados de forma rápida, segura e independiente.

Hoy en día cada vez más se implementan en el mercado metodologías para el control
microbiológico en el área de alimentos y se han publicado normas ISO como la 16140
que presenta un protocolo para validar métodos microbiológicos alternativos así como los
estándares internacionales ISO/FDIS 22174:2005 Microbiología de los alimentos para
consumo humano y animal. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la
detección de patógenos en los alimentos. Requisitos generales y definiciones; ISO/TS
20836:2005. Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) para la detección de patógenos en los alimentos. Prueba
de funcionamiento para termocicladores: ISO 20837:2006. Microbiología de los alimentos
para consumo humano y animal. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la
detección de patógenos en los alimentos. Requisitos para la preparación de la muestra
para la detección cualitativa e ISO 20838:2006 Microbiología de los alimentos para
consumo humano y animal. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la
detección de patógenos en los alimentos. Requisitos para la amplificación y detección
para métodos cualitativos, sin embargo se puede afirmar que aún no se ha alcanzado la
armonización global.

Obviamente la validación es una necesidad prioritaria para fabricantes y podría decirse
que una garantía y seguridad para el usuario pero la armonización global de la misma es
sumamente necesaria.

A través del análisis de los estándares antes mencionados se abordará la problemática de
la metrología del análisis microbiológico en alimentos mediante la determinación de
microorganismos en alimentos por la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR).

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3

PROBLEMÁTICA

Dado que las Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA) constituyen un importante
problema de salud pública debido al incremento en su ocurrencia, el surgimiento de
nuevas formas de transmisión, la aparición de grupos poblacionales vulnerables, el
aumento de la resistencia de los patógenos a los compuestos antimicrobianos y el
impacto socioeconómico que ocasionan; se requiere obtener de manera oportuna y eficaz
información sobre la presencia de estos microorganismos patógenos en los alimentos a
través de técnicas estandarizadas que permitan implementar la vigilancia y control de
dichos microorganismos.

Los métodos de ensayo microbiológico pueden ser de tipo cualitativo tales como en los
que el resultado se expresa en términos de detectado/no detectado e incluye los
procedimientos de confirmación e identificación y los de tipo cuantitativo que brindan
información numérica de los resultados. En general se considera que los análisis
microbiológicos incluyen pruebas de esterilidad, detección, aislamiento, recuento e
identificación de microorganismos (virus, bacterias, hongos y protozoarios) y sus
metabolitos en diferentes materiales y productos; o cualquier tipo de ensayo en el que se
utilicen microorganismos como parte de un sistema de detección.

El control de la calidad microbiológica de los alimentos, hasta la fecha, estaba relegado al
uso del método clásico de recuento en placa, sin embargo en rutina el uso de dicho
método no permite garantizar siempre una buena calidad metrológica de los resultados ya
que con frecuencia pueden producirse contaminaciones bacterianas o mutaciones no
controladas que son fuente de importantes errores. Además de que se requieren de varios
días a semanas antes de obtener resultados y de que las propiedades fenotípicas por las
cuales las bacterias son identificadas no siempre pueden ser expresadas y cuando son
expresadas puede ser difícil clasificarlas e interpretarlas.

Las normas NMX-EC-17025-IMNC-2006 (ISO/IEC 17025:2005) e ISO 10012:2003,
exigen demostrar la seguridad del resultado de medir a través de cuestiones de tipo
cuantitativo, sin embargo en pruebas microbiológicas cualitativas tan importantes en
donde se declara la presencia o ausencia de un microorganismo patógeno como lo es la
técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es muy importante demostrar la
seguridad de la determinación. EURACHEM propone para cumplir con esas
características metrológicas cualitativas que piden las normas como la incertidumbre de la
medición, estimarla sobre todo el equipo alrededor de la prueba, lo cual no resulta fácil
por la misma naturaleza del ensayo.

La introducción de la técnica de PCR representa una valiosa alternativa para los métodos
tradicionales de detección; velocidad, buen límite de detección, selectividad, especificidad,
sensibilidad y potencial para la automatización son sus ventajas más importantes. Sin
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4

embargo, para demostrar confiabilidad en los resultados de medir en laboratorios que
usan esta técnica es muy difícil poder seguir los lineamientos que exige la normatividad.

La presente tesis tiene como objetivo comprobar que los requisitos técnicos que plantea la
norma 17025 y el documento de aplicación son suficientes y pueden ser cumplidos por los
ensayos microbiológicos cualitativos para asegurar la calidad de los resultados obtenidos;
estableciendo de qué manera se pueden salvar las limitantes que se presentan por la
propia naturaleza de la técnica.

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CAPÍTULO I
ANTECEDENTES

I.1. REQUISITOS GENERALES PARA LA COMPETENCIA DE LOS LABORATORIOS
DE ENSAYO

La norma NMX-EC-17025-IMNC-2006 (ISO/IEC 17025:2005) constituye la base para que
los laboratorios de ensayo y calibración puedan demostrar que poseen un sistema de
gestión, que son técnicamente competentes y que son capaces de generar resultados
válidos. El capítulo 5 de la norma está conformado por los requisitos para la competencia
técnica en los tipos de ensayos o calibraciones que el laboratorio lleva a cabo. Además,
existen otros documentos nacionales e internacionales que proporcionan información
específica sobre ciertos requisitos técnicos y la manera en que se les puede dar
cumplimiento.

A continuación se abordan los requisitos técnicos que son la base de esta tesis;
considerando que son muchos los factores que determinan la exactitud y la confiabilidad
de los ensayos y calibraciones realizados por un laboratorio, entre los que se incluyen:
factores humanos, instalaciones y condiciones ambientales, los métodos de ensayo y
calibración, la validación de los métodos, el equipo, la trazabilidad de las mediciones y el
muestreo, entre otros.
El laboratorio debe considerar estos factores al desarrollar los métodos y procedimientos
de ensayo y de calibración, en la formación y calificación del personal, así como en la
selección y la calibración de los equipos utilizados.

En cuanto a los requisitos relacionados al personal, la dirección del laboratorio debe
asegurar la competencia de todos los que operen equipos o instrumentos de medición
específicos, realicen los ensayos o calibraciones, evalúen los resultados y firmen los
informes de los ensayos y los certificados de calibración. (Para mayor referencia consultar
NMX-EC-17025-IMNC-2006, 5.2 Personal).

Respecto a las condiciones ambientales debe asegurarse que no invaliden los resultados
ni comprometan la calidad requerida de las mediciones. Las instalaciones incluidas las
fuentes de energía e iluminación deben facilitar la realización correcta de los ensayos o
calibraciones.
Es conveniente que haya una separación entre las áreas en las que se realizan
actividades incompatibles. Esto ayudará a prevenir la contaminación cruzada. (Para
mayor referencia consultar NMX-EC-17025-IMNC-2006, 5.3 Instalaciones y condiciones
ambientales).

En relación a la selección del método de ensayo (método analítico) y la validación del
método resulta conveniente empezar por definir lo que es un método analítico, de
acuerdo con la Guía de Validación de Métodos Analíticos del Colegio Nacional de
Químicos Farmacéuticos Biólogos de México 2002, se define como la “Descripción de la
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secuencia de actividades, recursos materiales y parámetros que se deben cumplir para
llevar a cabo el análisis de un componente específico de la muestra”. Los métodos
analíticos se pueden clasificar en base a criterios como: su estado regulatorio, su
aplicación, la naturaleza de la respuesta analítica, su propósito analítico y la naturaleza
del sistema de medición. La Norma NMX-EC-17025-IMNC-2006 establece que se deben
utilizar preferentemente aquellos métodos publicados como normas internacionales,
regionales o nacionales y pueden ser complementados con detalles adicionales para
asegurar una aplicación coherente.
También se pueden utilizar métodos desarrollados o adoptados por el laboratorio y
métodos no normalizados siempre y cuando sean apropiados para el uso previsto y han
sido validados.
La validación de un método analítico es un requisito importante en la práctica del análisis
químico. En la literatura técnica existe información relacionada a la validación de métodos
especialmente en lo que concierne a métodos específicos. En algunos casos es vista
como algo que solo puede hacerse en colaboración con otros laboratorios; la definición
ISO de validación nos dice que es la “Confirmación mediante examen y suministro de
evidencia objetivade que se cumplen los requisitos particulares para un uso específico
previsto” (ISO 8402:1994) y se puede interpretar como el proceso de definir una
necesidad analítica y confirmar que el método en cuestión tiene capacidades de
desempeño consistentes con las que requiere la aplicación, está implícito que los estudios
para determinar los parámetros de desempeño se realizan usando equipos dentro de
especificaciones, que están trabajando correctamente y que están calibrados
adecuadamente. La validación del método permite demostrar que el método es adecuado
para su propósito”. (Eurachem, The fitness for purpose of analytical methods, 1998). Se
deben validar los métodos no normalizados, los diseñados o desarrollados y los métodos
normalizados utilizados fuera del alcance previsto. De tal manera que la exactitud de los
valores que se obtengan al emplear métodos validados responda a las necesidades de
los clientes. (Para mayor referencia consultar NMX-EC-17025-IMNC-2006, 5.4 Métodos
de ensayo y de calibración y validación de los métodos).
Si un método en proceso de desarrollo tendrá un amplio uso, quizá como un
procedimiento de referencia publicado, entonces el estudio de colaboración, involucrando
un grupo de laboratorios, es probablemente la forma más conveniente de llevar a cabo la
validación; sin embargo, esto no es siempre una opción adecuada para los laboratorios. El
laboratorio tiene que decidir cuáles de los parámetros de desempeño del método
necesitan caracterizarse con el fin de validar el método.
Algunos de los parámetros de desempeño de un método que se deben evaluar de
acuerdo con la Guía de EURACHEM para la validación de métodos y temas relacionados
son:
- Confirmación de la identidad y la selectividad/especificidad: La confirmación de la
identidad es cuando se establece que la señal producida en la etapa de medición
o alguna otra propiedad medida, la cual se atribuye al analito se debe únicamente
al analito y no a la presencia de algo química o físicamente similar o que surja
como una coincidencia.
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La selectividad y la especificidad son medidas que garantizan la confiabilidad de
las mediciones en presencia de interferencias. Estos parámetros se aplican a los
análisis tanto cualitativos como cuantitativos. Se pueden determinar analizando
una vez muestras y materiales de referencia mediante un método candidato y
otros métodos independientes. También analizar muestras que contengan varias
interferencias sospechadas en presencia del analito de interés.

- Límite de detección (LoD): Consiste en proporcionar un indicativo del nivel al cual
la detección resulta problemática. Para este propósito la aproximación “blanco +
3s” (s desviación estándar de la muestra) será suficiente.
Para mediciones cualitativas hay posiblemente un umbral de concentración por
debajo del cual la especificidad se vuelve poco confiable. Analizar blancos de
muestra con adición del analito en una gama de niveles de concentración. A cada
nivel de concentración será necesario medir aproximadamente 10 réplicas
independientes de manera aleatoria.

- Límite de cuantificación (LoQ): Es la concentración más baja del analito que puede
ser determinada con un nivel aceptable de precisión de repetibilidad y veracidad.
Analizar 10 blancos de muestra independientes medidos una vez cada uno,
expresar LoQ como la concentración del analito correspondiente a los valores del
blanco de muestra más: 5s, 6s o 10s (s desviación estándar de los blancos de
muestra).

- Exactitud: Expresa la cercanía de un resultado al valor verdadero (ISO 3534-
1:2006) . Se estudia en dos componentes: veracidad y precisión.
La veracidad (de un método) es una expresión de qué tan cercana se encuentra la
media de un conjunto de resultados (producidos por el método) respecto del valor
real. Normalmente se expresa en términos de sesgo. La precisión es una medida
de qué tan cercanos están los resultados unos con respecto a los otros y por lo
general se expresa mediante medidas como la desviación estándar la cual
describe la dispersión de los resultados. Las medidas de precisión más comunes
son la “repetibilidad” y la “reproducibilidad”. La repetibilidad es la clase de
variabilidad que se espera entre resultados cuando una muestra se analiza por
duplicado. Si la muestra se analiza por varios laboratorios para fines comparativos,
entonces una medida de precisión más significativa a usarse es la
reproducibilidad.
Puede ser que para algunos casos particulares sea más útil una medida
intermedia de la precisión (precisión medida entre diferentes analistas en periodos
de tiempo prolongados dentro de un solo laboratorio). Esto algunas veces se
conoce como “precisión intermedia”. La precisión se determina por lo general en
términos de la desviación estándar o la desviación estándar relativa. Para métodos
cualitativos la precisión no puede determinarse de esta manera pero puede
expresarse por medio de índices de verdadero y falso positivo (y negativo).
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- Sensibilidad: Es efectivamente la pendiente de la curva de respuesta, es decir, el
cambio en la respuesta del instrumento que corresponde a un cambio en la
concentración del analito. La sensibilidad es un parámetro útil para calcular y usar
en fórmulas de cuantificación.

- Robustez: Es una medida de la efectividad del método analítico, es decir, qué tan
buen desempeño se mantiene aún sin una implementación perfecta. Consiste en
aplicar variaciones deliberadas al método y estudiar el efecto resultante en el
desempeño. Las pruebas de robustez se aplican normalmente para investigar su
efecto sobre la precisión y la exactitud del método.

La Guía de Validación de Métodos Analíticos, 2002, editada por el Colegio Nacional de
Químicos Farmacéuticos Biólogos de México constituye también una herramienta de
apoyo y establece los parámetros de desempeño a evaluar en materia de validación de
métodos analíticos. Además, incluye los criterios de aceptación para cada parámetro de
desempeño.
Después de haber seleccionado y validado el método de ensayo es necesario estimar la
incertidumbre de la medición; en ocasiones la propia naturaleza del método no permite
realizar el cálculo riguroso, metrológicamente y estadísticamente válido de la
incertidumbre de medición. En estos casos al menos se debe tratar de identificar los
componentes de la incertidumbre y hacer una estimación razonable, asegurándose de
que la manera en la que se informa el resultado no de una impresión equivocada de la
incertidumbre. (Para mayor referencia consultar NMX-EC-17025-IMNC-2006, 5.4.6
Estimación de la incertidumbre de la medición).
Los equipos e instrumentos de medición y su software utilizados en los ensayos deben
permitir obtener la exactitud requerida y cumplir con las especificaciones concernientes a
los ensayos. Los equipos e instrumentos de medición deben ser verificados o calibrados
antes de su uso y deben protegerse contra ajustes que puedan invalidar los resultados.
(Para mayor referencia consultar NMX-EC-17025-IMNC-2006, 5.5 Equipos).
La verificación de instrumentos de medición es el conjunto de actividades que permiten
detectar la presencia o ausencia de un error atribuible en un instrumento utilizado dentro
de un sistema de medición. No debe confundirse la verificación del instrumento con la
calibración de instrumentos. La verificación consiste en ajustar el instrumento hasta
confirmar su correcto desempeño mediante la comparación del valor teórico de una
sustancia o material de referencia y el obtenido cuando esa misma sustancia o material
de referencia se mide con el instrumento calibrado. (Comisión Interinstitucional de Buenas
Práctica de Fabricación,cipam 2004).
La calibración es el conjunto de operaciones que determinan, bajo condiciones
especificadas, la relación entre los valores indicados por un instrumento o sistema de
medición, o los valores representados por una medición material y los valores conocidos
correspondientes a un patrón de referencia. (Colegio Nacional de Químicos
Farmacéuticos Biólogos, A.C. 2002).
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Se debe diseñar un programa de calibración de los equipos de tal manera que se pueda
asegurar que las mediciones hechas sean trazables al Sistema Internacional de Unidades
(SI). Cuando la trazabilidad de las mediciones a las unidades del SI no sea posible o no
sea pertinente, se deben exigir requisitos como materiales de referencia certificados,
métodos acordados o normas consensuadas para la trazabilidad. (Para mayor referencia
consultar NMX-EC-17025-IMNC-2006, 5.6 Trazabilidad de las mediciones).
Cuando se realizan actividades de muestreo deben hacerse de manera planeada y en
base a procedimientos en donde se registren los datos y las operaciones relacionados
con el muestreo. Los planes de muestreo deben estar basados en métodos estadísticos
cuando sea posible. (Para mayor referencia consultar NMX-EC-17025-IMNC-2006, 5.7
Muestreo).
La manipulación de los ítems (elementos) de ensayo o calibración incluye el transporte,
recepción, manipulación, protección, almacenamiento, conservación o disposición final. El
laboratorio debe tener procedimientos e instalaciones apropiadas para evitar el deterioro,
la pérdida o el daño del ítem de ensayo o calibración durante el almacenamiento, la
manipulación y la preparación. (Para mayor referencia consultar NMX-EC-17025-IMNC-
2006, 5.8 Manipulación de los ítems de ensayo o de calibración).
A través de procedimiento de control de calidad debe realizarse el seguimiento de la
validez de los ensayos y las calibraciones. Los datos resultantes deben registrarse de tal
manera que se detecten las tendencias y se puedan aplicar técnicas estadísticas para la
revisión de los resultados. El seguimiento puede incluir elementos como: el uso regular de
materiales de referencia, la participación en comparaciones interlaboratorios, la repetición
de ensayos o calibraciones utilizando el mismo método o métodos diferentes, entre otros.
(Para mayor referencia consultar NMX-EC-17025-IMNC-2006, 5.9 Aseguramiento de la
calidad de los resultados de ensayo y de calibración).
Finalmente los resultados de cada ensayo, calibración o serie de ensayos o calibraciones
deben informarse de manera clara, exacta, sin ambigüedades y objetiva, de acuerdo con
las instrucciones específicas de los métodos de ensayo o calibración, en un informe de
ensayo o un certificado de calibración que incluya toda la información requerida por el
cliente y necesaria para la interpretación de los resultados del ensayo o calibración, así
como toda la información requerida por el método utilizado. (Para mayor referencia
consultar NMX-EC-17025-IMNC-2006, 5.10 Informe de resultados).

I.2. EL LABORATORIO DE ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS Y EL ASEGURAMIENTO
DE LA CALIDAD DE LOS RESULTADOS

Un laboratorio de ensayos microbiológicos es una instalación que cuenta con la
capacidad técnica, material y humana para efectuar las mediciones y análisis o determinar
las características de materiales, productos o equipos de acuerdo a especificaciones
establecidas. En cualquier momento del ensayo microbiológico se pueden cometer
errores significativos y para prevenirlos es importante identificar los puntos críticos y
controlarlos paso a paso a lo largo de todas las etapas del ensayo.
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Dada la necesidad de asegurar la calidad del trabajo que realizan los laboratorios
microbiológicos se han desarrollado normativas y recomendaciones que tienden a
conseguir que los resultados obtenidos en estos laboratorios sean confiables y
comparables entre sí. (Uruburu, 1999).
Análisis Microbiológico de los Alimentos
Por lo general las bacterias presentes en el medioambiente son beneficiosas para los
organismos, animales y plantas, sin embargo algunas bacterias pueden ser la causa de
importantes enfermedades infecciosas, de ahí la necesidad de controlar su presencia. El
control de calidad microbiológico de los alimentos, hasta la fecha, estaba relegado al uso
del método clásico de recuento en placa. Como alternativa, en los últimos años se han
desarrollado diversos métodos de análisis basados en medidas instrumentales que
permiten obtener resultados de mayor calidad metrológica y con un tiempo de análisis
claramente inferior. En general estos métodos de análisis pueden dividirse en dos
grandes grupos: métodos directos y métodos indirectos. Los métodos indirectos se basan
en determinar la disminución o aumento de un compuesto debido al metabolismo
bacteriano, en cambio los métodos directos se basan en efectuar una medida analítica
directamente relacionada con el microorganismo.
Desde el punto de vista metrológico existen diversas guías orientadas hacia el análisis
microbiológico, sin embargo, aún deben hacerse más esfuerzos para proponer protocolos
de control de los análisis más seguros, así como metodologías más robustas y eficaces
que permitan obtener resultados de forma rápida, segura e independiente. Actualmente se
ha publicado la norma ISO 16140 que presenta un protocolo para validar métodos
microbiológicos alternativos, sin embargo, podría afirmarse que aún no se ha alcanzado
la armonización global. Así pues, se encuentran diferentes protocolos según se trate de la
norma ISO o de AOAC Internacional. Obviamente la validación es una necesidad
prioritaria y podría decirse que una garantía y seguridad para el usuario pero la
armonización global de la misma es también sumamente necesaria.(Simonet, 2005).

I.3. DOCUMENTO DE APLICACIÓN EA-4/10 “ACCREDITATION FOR
MICROBIOLOGICAL LABORATORIES”
Los laboratorios de análisis microbiológicos que deseen ser acreditados, deberán cumplir
los requisitos generales establecidos en la norma ISO/IEC 17025:2005 y tener en
cuenta las directrices contenidas en este documento de aplicación para los análisis
microbiológicos según se establece en el Anexo B de la norma. Este documento ha sido
elaborado conjuntamente por EURACHEM y EA para promover un enfoque armonizado
para la acreditación de laboratorios.
Los análisis microbiológicos incluyen pruebas de esterilidad, detección, aislamiento,
recuento e identificación de microorganismos (virus, bacterias, hongos y protozoos) y sus
metabolitos en diferentes materiales y productos; o cualquier tipo de ensayo en el que se
utilicen microorganismos como parte de un sistema de detección, así como la utilización
de microorganismos para ensayos ecológicos. Este documento puede servir también de
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orientación para los laboratorios que utilizan técnicas en áreas relacionadas con la
microbiología, como bioquímica, biología molecular y cultivos celulares, aunque esos
laboratorios pueden tener que cumplir otros requisitos adicionales.
Los análisis microbiológicos deben ser realizados o supervisados por personal calificado y
con experiencia en el área de la microbiología (manejo de técnicas básicas como
preparación de placas, recuento de colonias, técnicas asépticas, etc). En ocasiones es
más apropiado relacionar la competencia con una técnica, instrumento o equipo de
medición en particular, más que con métodos. (Para mayor referencia consultar
EURACHEM/EA Guide 04/10, 2 Personnel).
Para reducir el riesgo de contaminación cruzada el laboratorio debe tener áreas
separadas para realizaractividades como: recepción y almacenamiento, preparación,
análisis de las muestras, mantenimiento de microorganismos de referencia, preparación
de medios de cultivo y descontaminación, entre otras; y establecer un programa adecuado
de vigilancia de las condiciones ambientales.
Además se debe establecer un programa documentado de limpieza para las
instalaciones, instrumentos y equipos de medición y las superficies. El personal que
realiza ensayos microbiológicos debe utilizar la indumentaria apropiada (en caso
necesario, protector de cabello, barba, manos, pies, etc). El personal se despojará de
dicha indumentaria antes de abandonar el área. Esto es especialmente importante en el
laboratorio de biología molecular, donde, por ejemplo, el paso de un área con una elevada
carga de ADN a otra con una baja carga de ADN puede producir sin querer contaminación
cruzada. En muchos casos será suficiente con utilizar una bata de laboratorio. (Para
mayor referencia consultar EURACHEM/EA Guide 04/10, 3 Environment).
La validación de los métodos de ensayo microbiológico debe reflejar las condiciones
reales del ensayo ya sea utilizando productos contaminados naturalmente o inoculados
con un nivel conocido de microorganismos contaminantes; es necesario realizar paralela y
simultáneamente muestras sin inocular a fin de determinar posibles contaminaciones
ambientales.
Los métodos de ensayo microbiológicos cualitativos, tales como en los que el resultado se
expresa en términos de detectado /no detectado y los procedimientos de confirmación e
identificación, deber ser validados estimando, cuando sea apropiado, su especificidad,
exactitud relativa, desviación positiva, desviación negativa, límite de detección, efecto
matricial, repetibilidad y reproducibilidad. En el caso de los ensayos microbiológicos
cuantitativos, debe considerarse la especificidad, sensibilidad, exactitud relativa,
desviación positiva, desviación negativa, repetibilidad, reproducibilidad y el límite de
cuantificación dentro de una variabilidad establecida y, en caso necesario, determinar
cuantitativamente estos parámetros. Las diferencias debidas a las matrices deben tenerse
en cuanta al analizar diferentes tipos de muestras. Los resultados deben evaluarse
utilizando métodos estadísticos apropiados. (Para mayor referencia consultar
EURACHEM/EA Guide 04/10, 4 Validation of test methods).
A continuación se señalan algunas definiciones referentes a la validación
de métodos adaptadas al análisis microbiológico:
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Material de referencia certificado: Material de referencia, acompañado de un certificado,
en el cual uno o más valores de sus propiedades han sido certificados mediante un
procedimiento que establece su trazabilidad a una realización exacta de la unidad en la
que se expresan los valores de dichas propiedades. Cada valor certificado se acompaña
de una incertidumbre y el nivel de confianza correspondiente.
Límite de detección: Aplicado a los análisis microbiológicos cualitativos – Número mínimo
de microorganismos que pueden ser detectados, pero en cantidades que no pueden
estimarse con precisión.
Desviación negativa: Ocurre cuando el método alternativo da un resultado negativo sin
confirmación y el método de referencia da un resultado positivo. Esta desviación se
convierte en un resultado falso negativo cuando puede demostrarse que el resultado
verdadero es positivo.
Desviación positiva: Ocurre cuando el método alternativo da un resultado positivo sin
confirmación y el método de referencia da un resultado negativo. Esta desviación se
convierte en un resultado falso positivo cuando puede demostrarse que el resultado
verdadero es negativo.
Cultivos de referencia: Término colectivo que se refiere a cepas de referencia, cepas de
reserva y cultivos de trabajo.
Cepas de referencia: Microorganismos definidos por lo menos al nivel de género y
especie, catalogados y descritos según sus características y preferiblemente de origen
conocido. Normalmente obtenidos de una colección nacional o internacional reconocida.
Material de referencia: Material o substancia cuyas propiedades tienen uno o más valores
suficientemente homogéneos y claramente establecidos como para poder ser utilizados
en la calibración de un aparato, la evaluación de un método de medida o la asignación de
valores materiales.
Método de referencia: Método investigado a fondo, que describe con claridad y exactitud
las condiciones y los procedimientos necesarios para medir los valores de una o más
propiedades y que ha demostrado tener una exactitud y una precisión apropiadas para el
uso que pretende hacerse del mismo, de manera que puede utilizarse para evaluar la
exactitud de otros métodos empleados para realizar la misma medición y en particular
para caracterizar un material de referencia. En general se trata de un método normalizado
nacional o internacional.
Cepas de reserva: Cepas idénticas obtenidas mediante un único subcultivo de una cepa
de referencia.
Exactitud relativa: Grado de concordancia entre los resultados del método evaluado y los
obtenidos utilizando un método de referencia reconocido.
Sensibilidad: Fracción del número total de cultivos o colonias positivos que son asignados
correctamente con el método utilizado.
Especificidad: Fracción del número total de cultivos o colonias negativos que son
asignados correctamente con el método utilizado.
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Cultivo de trabajo: Subcultivo primario obtenido de una cepa de reserva.

Los ensayos microbiológicos no permiten realizar un cálculo riguroso metrológica y
estadísticamente válido de la incertidumbre de medida; la estimación de ésta puede
basarse en datos sobre repetibilidad y reproducibilidad exclusivamente, aunque lo ideal es
incluir los sesgos.
Deben identificarse los distintos componentes individuales de la incertidumbre y
demostrar que están bajo control y evaluar su contribución a la variabilidad de los
resultados. Algunos componentes (como los efectos del pipeteado, el pesado y las
diluciones) pueden medirse directamente y evaluarse para demostrar que realizan una
contribución insignificante a la incertidumbre global. (Para mayor referencia consultar
EURACHEM/EA Guide 04/10, 5 Uncertainty of measurement).
Como parte de su sistema de calidad el laboratorio debe implantar y documentar un
programa de mantenimiento, calibración y verificación del funcionamiento de sus
instrumentos y equipos de medición fundamentales para el ensayo. El mantenimiento
debe realizarse a los intervalos especificados dependiendo de factores como la frecuencia
de uso. La frecuencia de las calibraciones y verificaciones se establecerá en función de la
experiencia documentada y dependerán del uso, tipo y funcionamiento previo de los
instrumentos y equipos. Las calibraciones deben ser trazables a patrones nacionales o
internacionales. (Para mayor referencia consultar EURACHEM/EA Guide 04/10, 6
Equipment- maintenance, calibration and performance verification).
Al inicio y durante su periodo de validez debe verificarse la idoneidad de cada uno de los
lotes de reactivos críticos para el ensayo utilizando microorganismos de control positivo y
negativo que sean trazables a colecciones de cultivos nacionales o internacionales
reconocidas. También debe verificarse que los medios de cultivo, diluyentes y otras
suspensiones preparadas internamente tengan las características adecuadas con
respecto a: recuperación o supervivencia de los microorganismos de interés, inhibición o
supresión de los microorganismos no deseados, propiedades bioquímicas (diferenciales y
diagnósticas), propiedades físicas (por ejemplo pH, volumeny esterilidad). Los medios,
diluyentes y suspensiones que se suministren en forma directamente o parcialmente
utilizable deben ser validados antes de su utilización. (Para mayor referencia consultar
EURACHEM/EA Guide 04/10, 7 Reagents and culture media).
Los materiales de referencia y los materiales de referencia certificados proporcionan la
trazabilidad esencial en las mediciones y son utilizados, por ejemplo, para:
 Demostrar la exactitud de los resultados
 Calibrar equipos o aparatos
 Controlar la calidad del laboratorio
 Validar métodos de medición y
 Permitir la comparación de métodos (intercomparación)

En el área de la microbiología se utilizan para: Demostrar la sensibilidad de medios de
cultivo, llevar a cabo controles ambientales y evaluar los procesos de esterilización, entre
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otros. Deben reunir características como: ser estables, homogéneos, tener valores
asignados a algunas de sus propiedades y presentar las incertidumbres asignadas a
esos valores.
Para seleccionar un material de referencia se debe tener en cuenta el propósito al cuál
será destinado.(Pérez, 2001).
El cultivo de un microorganismo que se vaya a utilizar como inóculo en una validación
debe proceder de una cepa que no haya sido subcultivada más de 5 veces desde la cepa
de referencia original. Un subcultivo se define como la resiembra del microorganismo a
partir de un cultivo a medio fresco estéril. En el caso de microorganismos que se
conservan congelados cada ciclo de congelación, descongelación y reactivación se
considera un subcultivo. (Para mayor referencia consultar EURACHEM/EA Guide 04/10,
8 Reference materials and reference cultures).

Finalmente para supervisar la validez de los ensayos y/o calibraciones se deben incluir
algunos controles internos como: el uso de muestras inoculadas, recuentos cruzados
entre analistas, uso de réplicas y el uso de materiales de referencia y controles externos
como la participación regular en ensayos de aptitud, dando preferencia a los programas
de ensayos de aptitud que utilicen matrices apropiadas. (Para mayor referencia consultar
EURACHEM/EA Guide 04/10, 12 Quality assurance of results/quality control of
performance).

I.4. ENFERMEDADES TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS (ETA) Y LOS MÉTODOS
DE IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS
Las enfermedades transmitidas por los alimentos (ETA) se producen por la ingestión de
alimentos y/o bebidas contaminados con microorganismos patógenos que afectan la salud
del consumidor en forma individual o colectiva. Sus síntomas más comunes son diarreas y
vómitos, pero también se pueden presentar otros como choque séptico, hepatitis,
cefaleas, fiebre, visión doble, etc.
Hasta la fecha se han descrito más de 250 ETA. La mayoría son infecciones ocasionadas
por distintas bacterias, virus y parásitos. Entre las bacterias comúnmente reconocidas
como causantes de ETA se encuentran especies de los géneros Campylobacter y
Salmonella, así como la cepa O157:H7 de la enterobacteria Escherichia coli. (González,
2005).
Las ETA constituyen un importante problema de salud pública debido al incremento en su
ocurrencia, el surgimiento de nuevas formas de transmisión, la aparición de grupos
poblacionales vulnerables, el aumento de la resistencia de los patógenos a los
compuestos antimicrobianos y el impacto socioeconómico que ocasionan. La incidencia
de estas enfermedades es un indicador directo de la calidad higiénico-sanitaria de los
alimentos y se ha demostrado que la contaminación de éstos puede ocurrir durante su
procesamiento o por el empleo de materia prima contaminada, pues algunas bacterias
patógenas para el hombre forman parte de la flora normal de aves, cerdos y ganado.
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El control de los microorganismos causantes de ETA, por parte tanto de las autoridades
sanitarias como de las plantas procesadoras de alimentos, depende en cierta medida del
método analítico que se utiliza para su detección.
La detección y la investigación de los brotes de ETA constituye uno de los principales
retos para el Sistema de Salud Pública, pues requiere obtener, de manera oportuna y
eficaz información médica (datos personales, síntomas, etc.) y análisis de laboratorio de
los restos de alimentos o de las materias primas empleadas en su elaboración e incluso,
de las manos de las personas involucradas en la manipulación del alimento. (González,
2005).
Un alto porcentaje de los casos de ETA no puede asociarse con algún alimento en
particular o no es factible identificar al patógeno responsable, debido, fundamentalmente,
a que los resultados de los análisis bacteriológicos demoran; asimismo, el vehículo
alimentario implicado ya no se encuentra disponible para su análisis, lo que sugiere la
necesidad de establecer métodos rápidos y eficientes de detección del agente causal.
Dada la gran importancia de los microorganismos para el ser humano, se han
desarrollado una serie de metodologías para poder diferenciar un microorganismo de otro.
Estas metodologías se han basado tradicionalmente en la observación de los síntomas
que presentan los hospederos, en la observación macro o microscópica del
microorganismo o bien de las estructuras reproductivas de los microorganismos, del
desarrollo del patógeno en un medio de cultivo específico, de la tinción producida al
aplicar algunos colorantes sobre el tejido infectado o bien, sobre el patógeno y la reacción
de un anticuerpo a la presencia de un patógeno. (Rodríguez, et. al. 2009).
La identificación de un microorganismo (patógeno) basado en la sintomatología presenta
varias desventajas como por ejemplo, los síntomas son muy variados y numerosos;
dependen del hospedero del patógeno e incluso, de los factores del medio ambiente en el
que se desarrolla el proceso patológico. Por tales motivos puede dar origen a errores
graves en el diagnóstico de una enfermedad.
La detección de un microorganismo basada en la observación macro o microscópica es
más eficiente que la identificación basada solo en los síntomas. La observación a nivel
macro o microscópico es un procedimiento simple, es una detección directa de patógenos
y puede diferenciar organismos distintos morfológicamente. Presenta las siguientes
desventajas: Es un procedimiento lento, laborioso y tedioso dado que se tiene que aislar
el microorganismo (lo cual no en todos los casos es posible) y desarrollarlo en un medio
de cultivo hasta que se alcance una etapa de crecimiento adecuada para su identificación.
La identificación en forma microscópica solo es posible en casos muy específicos, es de
baja sensibilidad y se requiere contar con equipo muy especializado en el caso de
algunos microorganismos. La estructura de un microorganismo puede cambiar debido a la
influencia del medio ambiente y se requiere de una gran experiencia para poder
diferenciar una especie de otra a nivel microscópico. (Rodríguez, et.al. 2009).
La identificación de patógenos por medio de técnica de Gram, pruebas bioquímicas o del
desarrollo del patógeno en un medio de cultivo específico pueden detectar un amplio
rango de variantes, no requieren de equipo muy sofisticado, son pruebas fáciles de
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realizar; sin embargo, presenta las desventajas de que el tiempo para identificar un
microorganismo puede ser muy largo (en algunos casos hasta de 25 días), además se
requieren un gran número de pruebas para estar seguro de la identificación del patógeno
(una sola prueba no es suficiente en la mayoría de los casos); por usarse diferentes
pruebas, se utiliza una amplia gama de reactivos, lo cualincrementa el costo de la prueba
significativamente. Por otro lado, se ha demostrado que algunas células bacterianas
pueden entrar en un estado viable pero no cultivable (VPNC), debido al procesamiento al
que se sujeta el alimento, lo que imposibilita el uso de los métodos de cultivo como
herramienta de diagnóstico.
El uso de anticuerpos para la identificación de microorganismos se ha empleado por ser
una técnica simple y rápida. Se puede automatizar y puede ser usada para trabajar con
varias muestras al mismo tiempo. Sin embargo la detección no puede ser precisa cuando
existen cantidades mínimas de microorganismos, en el caso de patógenos no distingue
entre infecciones activas y latentes. Además, carece de anticuerpos y antígenos para
muchos microorganismos y en algunos casos la detección no es precisa por la nula
especificidad de algunos anticuerpos. Otras desventajas son que los anticuerpos tienen
un costo muy elevado o bien en algunos casos pueden ofrecer falsos positivos.
(Rodríguez, et.al. 2009).
Las técnicas moleculares para la identificación de microorganismos se basan en el
análisis de los ácidos nucleicos extraídos de los microorganismos en forma directa o bien
de una muestra conteniendo el microorganismo en cuestión. En la actualidad estas
técnicas están teniendo un auge muy importante debido a su: especificidad (pueden
detectar solo la molécula o microorganismo de interés), sensibilidad (son capaces de
detectar la presencia de un solo microorganismo), rapidez (se puede identificar un
microorganismo en menos de 24 horas) y pueden ser automatizadas (permiten tener un
diagnóstico en un menor tiempo y reducir los costos). El uso de técnicas moleculares ha
permitido identificar nuevos microorganismos, de los cuales no había sido posible su
cultivo e identificación por técnicas tradicionales; además, permiten estudiar las
poblaciones microbianas sin hacer aislamientos, por lo tanto se evitan los sesgos que
pueden surgir con el cultivo de microorganismos. Así mismo, estas técnicas permiten la
detección de microorganismos altamente patógenos, los cuales pueden ser identificados
muertos evitando así los riesgos de infección del analista. Las técnicas moleculares han
demostrado ser muy útiles en situaciones clínicas donde los métodos convencionales
presentan poca sensibilidad, son muy lentos o muy complicados para ser usados a gran
escala. Otra aplicación importante es en el monitoreo del surgimiento de mutaciones en el
genoma.
Algunas de las desventajas asociadas a las técnicas moleculares son: por lo general no
distinguen entre organismos vivos y muertos, aunque algunas veces esto no es
precisamente una desventaja, se tiene que contar con conocimientos de secuencias de
nucleótidos específicas del patógeno a diagnosticar, se requiere de personal altamente
capacitado para el desarrollo de las pruebas de identificación, se requiere equipo más
específico para el diagnóstico lo cual eleva la inversión inicial y se desarrollan
procedimientos con múltiples etapas lo que incrementa la posibilidad de errores, además
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de la posibilidad de obtener falsos positivos y falsos negativos. El alto costo de las
técnicas moleculares tenderá a bajar a medida que se incremente el uso de estas
técnicas; por otra parte, el problema de falsos positivos y negativos se puede solucionar si
se incluye en cada análisis un testigo positivo y uno negativo. (Rodríguez, et.al. 2009).
Se han propuesto una gran variedad de técnicas moleculares para la detección de
microorganismos, describir cada una de las técnicas propuestas escapa del alcance de
esta tesis por lo que solo se mencionarán las más usadas comercialmente haciendo
énfasis en la que es de interés para este trabajo de investigación. La mayoría de las
técnicas moleculares se basan en la hibridación de los ácidos nucleicos o bien en la
reacción en cadena de la polimerasa.

a) Técnicas basadas en hibridación de ADN: estas técnicas se desarrollaron a partir
del conocimiento de que dos cadenas sencillas de ácido nucleico que tengan
secuencias complementarias se pueden unir o hibridar para formar una cadena
doble. Las cadenas sencillas pueden ser de ADN o ARN, o bien una de ADN y otra
de ARN. Dentro de estas técnicas de hibridación más utilizadas están los
fragmentos de restricción de longitud polimórfica (RFLP’s); transferencia por
aplastado (squash blot) y ARN de cadena doble.

b) Técnicas basadas en PCR: la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la
amplificación enzimática in vitro de un segmento de ADN específico del
microorganismo blanco. Incluyen: RT-PCR (amplificación de un segmento de ADN
previamente formado a partir de ARN); PCR anidada (amplificación enzimática de
un segmento de ADN interno de otro segmento de ADN previamente amplificado);
RAPDs o polimorfismo del ADN amplificado al azar; Inmuno-PCR (unión de un
microorganismo a un soporte sólido utilizando un anticuerpo y una posterior
amplificación de ADN por PCR); PCR- Inmunomagnético (similar a la anterior, en
este caso el soporte es una esfera magnética, la cual es removida de la muestra
con un magneto y posteriormente se realiza la PCR); PCR-múltiple (permite la
detección de diferentes moléculas o microorganismos de interés en una sola
reacción); entre otras técnicas. La flexibilidad, automatización, rapidez y
confiabilidad de las técnicas moleculares basadas en PCR son las técnicas
moleculares con más aceptación en la actualidad para la detección de
microorganismos en general. (Rodríguez, et.al. 2009)
La introducción de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en diagnósticos
microbianos se ha establecido en laboratorios de investigación como una valiosa
alternativa para los métodos tradicionales de detección. Rapidez y buen límite de
detección, selectividad, especificidad, sensibilidad y potencial para la automatización son
en general sus ventajas más importantes. El éxito en la implementación de la PCR para
la identificación de microorganismos causantes de ETA depende entre otros factores de la
elección correcta de la secuencia blanco, la cual debe permitir la identificación del
microorganismo de interés, independientemente de la presencia de otras fuentes de ADN
procedente de microorganismos concomitantes o de la muestra misma. (Malorny, et.al.
2003 a).
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Las regiones genómicas más comúnmente empleadas en el diseño de cebadores para la
identificación de microorganismos patógenos son las relacionadas con los genes que
codifican para toxinas y proteínas antigénicas específicas.
En la práctica, cuando se aplican las técnicas de PCR al análisis de ácidos nucleicos en
matrices complejas como los alimentos, la eficiencia de la amplificación puede reducirse
significativamente por la presencia de sustancias inhibidoras como la hemoglobina, la
lactoferrina, los polisacáridos, las grasas o las proteínas. La repercusión de estos
compuestos en la obtención de resultados falso-negativos puede eliminarse empleando
pasos de pre enriquecimiento o polimerasas apropiadas, así como membranas selectivas.
(González, 2005)

I.5. LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
En 1983 Kary Mullis desarrolló una nueva técnica que hizo posible la síntesis de grandes
cantidades de un fragmento de ADN sin tener que clonarlo: la reacción en cadena de la
polimerasa (conocida como PCR por sus siglas en inglés). Esta técnica es considerada la
más revolucionaria del último cuarto del siglo XX. Con ésta se consigue copiar millones de
veces, en un par de horas, una secuencia predeterminada, dentro de una mezcla de ADN
tan compleja como el propio genoma humano, donde la secuencia de interés representa
tan sólo una diezmillonésimaparte. (Rodríguez, 2004)
La PCR es un método in vitro de síntesis de ADN en el que un segmento particular de
éste es específicamente amplificado al ser delimitado por un par de cebadores o
iniciadores (ADN sintético de hebra sencilla) que lo flanquean. Su copiado se logra en
forma exponencial a través de ciclos repetidos de diferentes periodos y temperaturas de
incubación en presencia de una enzima ADN polimerasa termoestable. Así se obtienen en
cuestión de horas, millones de copias de la secuencia deseada del ADN.
Al principio, su inventor enfrentó dos problemas fundamentales: uno era que en cada ciclo
había que añadir la enzima ADN polimerasa, ya que ésta se inactivaba con las
temperaturas tan altas demandadas para desnaturalizar el ADN y exponer las bases
nitrogenadas de sus nucleótidos. Otro inconveniente era que había que hacerlo
manualmente en tres baños mantenidos a las diferentes temperaturas requeridas,
pasando rápidamente la muestra de un baño al otro y luego al último, repitiendo esto
varias decenas de veces. (Rodríguez, 2004)
El descubrimiento de una bacteria (Thermus aquaticus) que vive en aguas termales junto
a geiseres a 75°C, la cual tiene una ADN polimerasa que funcionaba bien a altas
temperaturas (72°C) e incluso es estable a 94°C, representó un gran avance, ya que sólo
tenía que ser añadida al principio y se mantenía activa durante todo el proceso. Esto,
junto con el diseño de los temocicladores o aparatos que consisten en un bloque que
puede ser programado para calentarse y enfriarse rápidamente en determinados tiempos,
condujo a la automatización total del proceso.
La reacción consta, por lo regular, de una treintena de ciclos repetitivos conformados cada
uno de tres pasos: el primero consiste en la ruptura de los puentes de hidrógeno del ADN
para desnaturalizarlo, el cual se realiza a una temperatura de alrededor de 95°C por un
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minuto. Este paso expone las bases nitrogenadas del ADN blanco. En el segundo paso
ocurre la hibridación de las cadenas desnaturalizadas del ADN blanco con los
denominados cebadores o iniciadores, a una temperatura que facilita el apareamiento de
las bases nitrogenadas complementarias de ambas clases de ADNs. Esta temperatura
depende de la temperatura de fusión (Tm) de los iniciadores, que generalmente oscila
entre 50 y 60°C. El tercer paso se efectúa a 72°C, temperatura a la que la polimerasa
extiende la longitud de los cebadores, añadiendo los diferentes nucleótidos libres en el
orden que le va dictando la secuencia de nucleótidos de la cadena que actúa como
molde. (Rodríguez, 2004)
Para realizar una PCR se necesita mezclar en un tubo el ADN que contiene la secuencia
a amplificar, ambos cebadores que se alinearán a las cadenas simples del ADN, la
mezcla de los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTPs) en cantidades
suficientes, la solución amortiguadora de reacción para la polimerasa, agua grado biología
molecular libre de pirógenos y de nucleasas para completar el volumen final de reacción
(que normalmente oscila entre 20 y 100 µl) y como ingrediente final crucial para la
reacción, la enzima ADN polimerasa termoestable.
Solución amortiguadora: La solución amortiguadora para la reacción se emplea,
comúnmente, concentrada diez veces y por lo general incluye Tris-HCl (pH= 8.4 a
temperatura ambiente), KCl y MgCl2.
Algunos autores recomiendan el uso de adyuvantes, los cuales en la práctica aumentan la
especificidad y fidelidad de la reacción, tales como el dimetilsulfóxido (DMSO) añadido
para disminuir la estructura secundaria del ADN, detergentes como el tween 20 o el Tritón
X-100, que ayudan a estabilizar la enzima y finalmente el polietilenglicol de elevado peso
molecular (PEG 8000, 6000,entre otros), el glicerol, la formamida o la seroalbúmina
bovina, entre otros; aunque en ningún caso estos últimos son imprescindibles.
Magnesio: Tanto el ión magnesio como el manganeso tienen una función crítica en la
reacción, ya que son cofactores de la ADN polimerasa, requiriéndose a una concentración
que oscila regularmente entre 0.5 y 2.5mM. La concentración de MgCl2 debe optimizarse
para cada ensayo en particular, ya que puede tener efecto tanto en la especificidad como
en el rendimiento de la reacción. En general, concentraciones insuficientes de Mg+2 dan
lugar a bajo rendimiento, mientras que en exceso se obtienen amplificaciones
inespecíficas.
Desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTPs): Los cuatro dNTPs (dATP, dTTP, dCTP y
dGTP; distinguibles por sus bases nitrogenadas) son los ladrillos con los que se
construyen las nuevas cadenas de ADN.
La variación en su concentración afecta la especificidad y fidelidad de la reacción.
Concentraciones altas de los mismos hacen disminuir la fidelidad con la que la polimerasa
efectúa su trabajo e incluso pueden llegar a inhibir su actividad. También afecta a la
fidelidad de la reacción el uso de concentraciones desbalanceadas de estos cuatro
ingredientes, siendo las concentraciones usuales, en la mayoría de los casos, entre 0.2 a
1 mM.
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Los dNTPs pueden captar iones de magnesio por lo que las concentraciones de ambos
componentes deben guardar siempre la misma relación, aconsejándose que la
concentración de Mg+2 sea 0.5 a 1 mM superior a la concentración de los dNTPs.
Cebadores o iniciadores: Éstos son el componente más sensible que determina el éxito
de un ensayo de PCR. Su longitud suele estar entre 18 y 30 nucleótidos y su contenido en
G+C entre 40-75%. La concentración a la que suelen emplearse en una PCR está en el
intervalo de 0.1-0.5 µM. Los iniciadores normalmente se diseñan para ser exactamente
complementarios a las secuencias que flanquean el segmento del molde de ADN que se
desea amplificar.
Los cebadores ideales deben carecer lo más posible de estructuras secundarias, así
como de complementariedad entre sí. La complementariedad en el extremo 3’ induce a
que ambos iniciadores se traslapen en dicho extremo y sirvan de templados y a su vez de
iniciadores entre sí, para que la polimerasa los extienda y genere así pequeños
amplicones (conjuntos de moléculas de ADN idénticas que resultan de una reacción de
PCR) referidos como dímeros de cebadores. Estos dímeros son productos cortos que se
amplifican de manera eficiente, reduciendo la cantidad de cebadores disponibles en la
reacción y provocando un menor rendimiento del amplicón de interés.
Ambos iniciadores deben tener una temperatura de fusión o Tm similar y por ende, un
contenido semejante en G+C. La fórmula más utilizada para calcular la Tm de un iniciador
es: Tm=(2°C) (# de A+T) + (4°C) (# de G+C).
La distancia que separa los sitios donde se aparean los cebadores dentro del ADN molde
determina el tamaño del producto de amplificación. El tamaño ideal depende de la
aplicación: los productos largos se amplifican con menor eficiencia, mientras que los
productos muy cortos pueden confundirse con dímeros de los iniciadores y limitan mucho
la posibilidad de caracterizarlos posteriormente.
Existen diferentes programas computacionales que ayudan en el diseño de cebadores y
calculan sus Tms, estructuras secundarias y posibles interacciones entre ellos.
Los cebadores se sintetizan en el laboratorio mediante un proceso escalonado en el que
se van añadiendo nucleótidos libres al extremo de la cadena en crecimiento. El extremo 3’
del nucleótido iniciador de la futura cadena se fija a un soporte sólido como una partícula
de gel de sílice. Un sintetizador de ADN realiza la síntesis en fase sólida, añadiendo paso
a paso cada nucleótido en una serie de etapas. Al final de cada ciclo de adición, la cadena
en crecimiento se separa de la mezcla de reacción mediante filtracióno centrifugación. A
continuación se repite el procedimiento para unir otro nucleótido. Se invierten
aproximadamente 40 minutos en añadir un nucleótido a la cadena y es posible sintetizar
cadenas con una longitud de hasta 100 nucleótidos. (Rodríguez, 2004)
Diseño de los cebadores: Deben evitarse tramos largos de una sola base y que el
extremo 3’ tenga una estructura secundaria importante. También se debe procurar en lo
posible que las últimas bases del extremo sean G o C, para que le brinden mayor
estabilidad al punto de inicio de la etapa de extensión.
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Normalmente deben tener un tamaño de 18-30 nucleótidos y que éste sea similar para
ambos cebadores. La temperatura de hibridación de los cebadores al molde se ajusta
para que sea, cuando mucho 5°C menor que la temperatura calculada según la fórmula
arriba citada.
Enzima: Sólo pueden utilizarse polimerasas que sean capaces de actuar a las altas
temperaturas empleadas en la reacción. En la actualidad la mayoría de las polimerasas
que se suministran comercialmente son versiones recombinantes e incluso mejoradas por
ingeniería genética.
Las enzimas ADN polimerasas comúnmente utilizadas son la ADN polimerasa Taq,
proveniente de la bacteria termofílica Thermus aquaticus y la Vent de la bacteria
Thermococcus litoralis. Sus temperaturas óptimas de catálisis oscilan alrededor de los
72°C, temperatura a la cual incorporan aproximadamente 100 nucleótidos por segundo,
siendo estables a altas temperaturas, incluso por encima de los 92°C.
De las dos enzimas señaladas, la popularidad alcanzada por la Taq rebasa por mucho y
en diferentes aspectos a otras polimerasas. Esta enzima es una proteína que consta de
una sola cadena polipeptídica con un peso molecular de aproximadamente 95 kDa,
cuenta con actividad de exonucleasa 5’ → 3’. Y su fidelidad de replicación depende de la
concentración del ión Mg+2 y de los dNTPs, así como del que exista o no balance en la
concentración de estos últimos.
Existen otras enzimas que se usan también aparte de la Taq y la Vent, en donde se
requiere actividad correctora para mayor fidelidad de copiado, como la Pfu, extraída
originalmente de Pyrococcus furiosus o la UITma, proveniente de Thermotoga maritima,
la cual también tiene actividad de transcriptasa reversa, lo que les permite catalizar tanto
una transcripción reversa (conversión de ARN a ADN), como la propia PCR, como es el
caso de la enzima Thermus thermophilus, ya fabricada por ingeniería genética y
simplemente conocida como rTth. (Rodríguez, 2004)
ADN: La cantidad de ADN molde puede ser de tan sólo 1 ng en el caso de material
genético clonado (en virus o plásmidos), o de un mínimo de 20 ng, cuando se utiliza ADN
genómico proveniente de células eucariotas. De hecho, como se ha mencionado arriba, el
molde puede ser también ARN el cual debe ser previamente transformado a ADN
complementario (ADNc) mediante transcripción reversa. Hay muchas formas posibles de
preparar el molde para PCR.
En general, no es necesario purificar el molde, porque la reacción puede tolerar la
presencia de impurezas, pero hay que tener mucho cuidado de eliminar, lo más posible, la
presencia de inhibidores de la polimerasa, sobre todo en las muestras clínicas. Si el
material son suspensiones celulares, puede ser suficiente con romper las células por
calor.
Agua: El agua se usa como solvente del resto de los ingredientes y se requiere agua
grado biología molecular.

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Etapas de un Ciclo de Reacción
Tres son los pasos a seguir y a repetir por cada ciclo de la PCR. A éstos comúnmente se
les refiere como desnaturalización, alineamiento y extensión.
Desnaturalización
El sustrato de la enzima de la PCR es el ADN de simple cadena que actúa como molde
para la síntesis de su nueva cadena complementaria. Mediante un calentamiento a 94°C,
el ADN de doble cadena logra que sus cadenas se separen o desnaturalicen.
Ésta es una etapa crítica, ya que es muy importante que el ADN molde se desnaturalice
completamente, lo que se consigue a temperaturas de 94°C, durante por lo menos un
minuto. Si la muestra tiene alto contenido de G+C, se recomienda aumentar de
preferencia el tiempo.
Sin embargo, hay que tener en cuenta que la actividad de la enzima decrece de manera
muy rápida a partir de los 95°C= 40 min. y a 97.5°C = 5 min.), por lo que a estas
temperaturas o superiores es aconsejable disminuir el tiempo de incubación. En la
práctica se suele empezar con un período de desnaturalización prolongado (cinco minutos
a 94°C), para asegurarse que la desnaturalización se lleve a cabo a lo largo de toda la
molécula del ADN. (Rodríguez, 2004)
Alineamiento
La enzima, como todas las ADN polimerasas, necesita del grupo OH- libre en el extremo
3’ del iniciador ya apareado al sitio blanco de la amplificación, a partir de donde iniciar la
síntesis. Este punto constituye el sitio de crecimiento de la cadena complementaria al
molde.
Mientras que un cebador (referido como el 5) es complementario a la secuencia del
extremo 5’ de la región del ADN molde a amplificar, el otro es al extremo 3’ de la misma,
pero en la cadena opuesta.
El alineamiento específico de ambos cebadores se produce a una temperatura
determinada por composición de bases y oscila entre 40 y 72°C. Ambas cadenas
originales del ADN sirven simultáneamente como moldes para sintetizar sus respectivas
cadenas complementarias nuevas.
Un aumento de temperatura favorece la especificidad, ya que disminuye las uniones
incorrectas de los cebadores con sitios apócrifos del ADN molde. (Rodríguez, 2004)
Extensión
Con el ADN molde de cadena sencilla, excepto en los sitios donde los iniciadores se
aparean, la polimerasa empieza a copiar la hebra, incorporando desoxirribonucleótidos
trifosfatados en dirección 5’ → 3’. Esta etapa debe realizarse a una temperatura alta, que
es la que coincide con la máxima actividad de la polimerasa (72°C) para evitar
alineamientos inespecíficos de los iniciadores.
El tiempo de extensión depende del tamaño de la amplificación, debiendo estimar 1 min.
para alargar 1000 nucleótidos. Es común que al finalizar todos los ciclos se realice un
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último alargamiento por 5 min. a 72°C, para asegurarse que todos los productos de
amplificación estén completamente terminados y tengan, por ende, exactamente la misma
longitud. (Rodríguez, 2004)
Naturaleza Exponencial de los Ciclos
Al final del primer ciclo, ambas hebras de una molécula bicatenaria de ADN a las que se
les hayan apareado los iniciadores han sido copiadas para generar dos nuevas cadenas
bicatenarias.
Cuando se repite por segunda ocasión el ciclo de tres pasos, las dos moléculas del primer
ciclo se copian para producir ahora cuatro moléculas. El tercer ciclo genera ocho
moléculas.
En teoría, 20 ciclos producirán aproximadamente un millón de copias de la molécula
molde de ADN y 30 ciclos generarán alrededor de mil millones de copias de ésta.
Pero en la práctica, el proceso no es tan eficiente. El número de ciclos que se utiliza
adquiere gran relevancia a la hora de optimizar una PCR. Este número depende de la
cantidad de ADN que existe en la muestra una vez que el resto de factores han sido
optimizados (normalmente de manera empírica).
Es importante evitar un número alto de ciclos, ya que puede dar lugar a la amplificación
de productos no deseados originados por hibridaciones inespecíficas.
Hay que tener en cuenta que la enzima sufre el efecto meseta que describe la atenuación
en la tasa de la acumulación del producto, reflejándose esto en que después