Analisis-estadstico-de-la-hidrolisis-acida-del-olote-para-la-obtencion-de-xilosa-fermentable

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
 
 
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA HIDROLISIS ÁCIDA DEL OLOTE 
PARA LA OBTENCIÓN DE XILOSA FERMENTABLE 
 
 
 
TESIS 
PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
INGENIERO QUÍMICO 
 
 
 
PRESENTA 
DANIEL CAMACHO SUÁREZ 
 
 
CD MX 2018 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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JURADO ASIGNADO: 
PRESIDENTE: Rogelio Rodríguez Sotres 
VOCAL: Oscar Hernández Meléndez 
SECRETARIO: Irma Ofelia Bernal Lugo 
1er. SUPLENTE: Hugo Ortiz Moreno 
2° SUPLENTE: Anna Kozina 
 
Sitio donde se desarrolló el tema: 
Laboratorio 104, departamento de Bioquímica, Facultad de Química, Edificio E. 
 
 
________________________________________ 
Dra. Irma Ofelia Bernal Lugo 
Asesor de Tema 
 
 
 
________________________________________ 
Daniel Camacho Suárez 
Sustentante 
 
Índice 
 
Resumen ................................................................................................................ 1 
Introducción ........................................................................................................... 2 
Objetivos ................................................................................................................ 5 
Capítulo 1 Antecedentes..................................................................................... 6 
1.1 Biomasa .................................................................................................... 6 
1.2 Materiales Lignocelulósicos. .................................................................. 7 
1.3 Pretratamientos de lignocelulosa. ........................................................ 12 
1.3.1 Pretratamientos físicos. ...................................................................... 13 
1.3.2 Pretratamientos biológicos. ................................................................ 14 
1.3.3 Pretratamientos químicos. .................................................................. 15 
1.2 Formación de inhibidores ..................................................................... 17 
1.3 Xilosa y su importancia ......................................................................... 20 
1.4 Métodos utilizados para la obtención de hemicelulosas y sus 
azúcares. ........................................................................................................... 21 
Capítulo 2 Material y métodos .......................................................................... 27 
2.1 Composición del material lignocelulosico ........................................... 27 
2.1.1 Preparación de material lignocelulósico ........................................... 27 
2.1.2 Determinación del contenido de humedad de la harina de olote .... 27 
2.1.3 Composición química de la harina de olote ...................................... 28 
2.1.4 Cuantificación de azúcares por diversos métodos. ......................... 28 
2.2 Determinación de las mejores condiciones de reacción .................... 30 
2.2.1 Determinación de la relación sólido:líquido óptima para la hidrólisis 
ácida del xilano ............................................................................................. 30 
2.2.2 Cuantificación de reductores totales ................................................. 31 
2.2.3 Determinación de las condiciones de hidrólisis ácida de la 
hemicelulosa de olote utilizando el método de Box-Wilson ..................... 31 
2.2.4 Cuantificación de hidroximetilfurfural y furfural ............................... 35 
2.2.5 Método de crecimiento de levadura ................................................... 36 
2.2.6 Fermentación de la xilosa ................................................................... 37 
 
Capítulo 3 Resultados y discusión .................................................................. 39 
3.1 Composición química del olote ............................................................ 39 
3.2 Determinación de las mejores condiciones de la hidrólisis de olote 40 
3.2.1 Determinación de la relación líquido: sólido, para la hidrólisis de la 
hemicelulosa ................................................................................................. 40 
3.2.2 Determinación de las condiciones de hidrólisis de la biomasa por el 
método Box-Wilson ...................................................................................... 41 
3.3 Crecimiento de levadura en el hidrolizado .......................................... 45 
Conclusiones ....................................................................................................... 47 
Perspectivas ........................................................................................................ 48 
Referencias .......................................................................................................... 51 
Anexo de métodos .............................................................................................. 55 
 
 
1 
 
Resumen 
 
 
Utilizando la estrategia del método estadístico Box-Wilson se determinaron las 
condiciones óptimas para la obtención de xilosa por digestión química de olote de 
maíz. Las variables consideradas fueron la concentración de ácido sulfúrico, 
temperatura y tiempo de residencia. La recuperación de xilosa en las óptimas 
condiciones (concentración de ácido sulfúrico 1.5 %, temperatura de 135 °C y 21.4 
min de tiempo de residencia) fue del 92 % respecto del contenido total en el 
material original. Sin embargo, la cantidad de inhibidores del crecimiento de la 
levadura Pichia spitis (ATCC 58785) producida en estas condiciones fue mayor 
que la generada en las condiciones basales donde solo se produjo un 82 % de 
xilosa, pero 50 % menos inhibidores que en el caso de las condiciones óptimas. 
Por lo anterior, se optó en utilizar como medio de cultivo el hidrolizado producido 
en 1.5 % de ácido sulfúrico, temperatura de 130 °C y 20 min de tiempo de 
residencia. La cantidad de inhibidores generados en estas condiciones, también 
impidió el crecimiento de la levadura. Esta inhibición se revirtió eliminándolos del 
hidrolizado, mediante un tratamiento con carbón activado, previo al crecimiento del 
microorganismo. 
 
 
2 
 
Introducción 
 
 
Las biorefinerías son un concepto análogo a las refinerías convencionales; donde 
las primeras en lugar de usar el petróleo como materia prima para su refinación en 
la obtención de diversos productos derivados del mismo, utilizan biomasa 
lignocelulósica para la producción de productos químicos derivados de esta, 
combustibles y electricidad. Por eso, las biorefinerías están siendo objeto de 
investigación como sistemas que contribuyan a incrementar la participación de la 
biomasa dentro del mercado; no solo energético sino de productos derivados, 
incluso llegando a jugar un mayor papel que las refinerías convencionales dentro 
de la industria química y energética. Es de gran interés el desarrollo de las 
biorefinerías dado que, los recursos no renovables, como su nombre lo dice, son 
finitos, lo cual actualmente ha llevado a diversos conflictos dadasu escasez, 
aunado al problema de contaminación que el uso del petróleo y sus derivados 
conlleva. Estas problemáticas pueden llevar a distintos conflictos en un futuro si no 
se buscan alternativas sustentables. 
Las biorefinerías al procesar biomasa para convertirla en una amplia gama de bio-
productos (como lo son alimentos, productos químicos de especialidad, 
precursores químicos, etc.) y bioenergía (como biocombustibles, electricidad o 
calor), son una alternativa sustentable viable para abastecer la demanda futura de 
energéticos y productos químicos. 
La biomasa se define como materia orgánica derivada de criaturas vivas o de 
organismos que estaban recientemente vivos, aunque usualmente el término de 
biomasa en el contexto de energía y producción química, es usado para referirse 
al material orgánico derivado de plantas. Aunque el término de biomasa sea 
relativamente nuevo, el hombre la ha usado desde el descubrimiento del fuego 
hace muchos años, como combustible para obtener energía calorífica. 
3 
 
Actualmente, la biomasa aún es la fuente primaria de combustible para uso 
doméstico en muchos países en vía de desarrollo, siendo la madera la principal 
fuente de biomasa para su uso en el contexto energético. 
Si bien, se ha enfocado mayoritariamente a la investigación y desarrollo de 
procesos de conversión de biomasa en biocombustibles, por los intereses 
mundiales actuales, la conversión de la biomasa a bioproductos (como productos 
químicos de alta especialidad, polímeros, precursores químicos, etc.) tiene un 
papel importante dentro de la industria química, aunque los procesos que 
facilitarían la obtención de azúcares a partir de la biomasa para estos procesos se 
han estudiado muy poco. 
Los desechos industriales o agrícolas (como residuos de agave, olote, desechos 
de pastos, aserrín, residuos de madera, desechos de papel, etc.) son una gran 
fuente de biomasa lignocelulósica, con alto potencial para ser la materia prima que 
proporcione azúcares, como la glucosa para producir bioenergía, como la xilosa 
para su posterior conversión en productos químicos de especialidad; 
incrementando el valor agregado de los materiales lignocelulósicos, sin contribuir a 
la producción de gases de invernadero y otros contaminantes. 
Los residuos lignocelulósicos, o biomasa están compuestos por celulosa, 
hemicelulosa y lignina, mayoritariamente, así como por otros componentes 
menores. Tanto la celulosa como la hemicelulosa son polímeros de azúcares, por 
lo que son una gran fuente potencial de azúcares fermentables que, a su vez, 
pueden convertirse por medio de diversos procesos en otros productos de interés. 
La hemicelulosa puede ser hidrolizada dentro de condiciones suaves ácidas y 
básicas, mientras que la celulosa al ser más resistente necesita métodos más 
agresivos para hidrolizarla y obtener glucosa. En estas condiciones, la 
hemicelulosa se convierte en subproductos no deseados. Actualmente, en la 
industria se utilizan, mayoritariamente, los azúcares provenientes de la celulosa 
(glucosa principalmente) para su conversión en combustibles como bio-etanol; 
perdiendo en el proceso gran parte de la fracción de hemicelulosa y lignina. 
4 
 
El contenido de cada uno de los polímeros principales que conforman la 
lignocelulosa (celulosa, hemicelulosa y lignina) depende del origen de la biomasa, 
edad y clima en que se desarrolló. Lo anterior determina el tipo de pre-tratamiento 
al que hay que someter a los diversos residuos lignocelulósicos para aislar cada 
uno de los polímeros y su posterior utilización. 
El interés principal de este trabajo fue la elección de las mejores condiciones de 
reacción para la hidrólisis ácida del olote a nivel laboratorio para promover una 
mayor obtención de pentosas (centrando el pre-tratamiento en la accesibilidad de 
la hemicelulosa y no en la celulosa del olote para su consecuente hidrólisis), 
principalmente xilosa fermentable para su posible conversión a distintos productos 
químicos de especialidad para hacer económicamente viable el proceso y que en 
un futuro pueda escalarse a nivel biorefinería. 
 
 
5 
 
Objetivos 
 
 
Objetivo general 
Determinar las condiciones óptimas de hidrólisis del olote de maíz para la 
obtención de un hidrolizado rico en xilosa que pueda ser utilizado para la 
producción de diversos productos químicos. 
 
Objetivos particulares 
 Identificación y cuantificación de azúcares por HPLC 
 Cuantificación de hidroximetilfurfural y furfural. 
 Determinar la mejor relación líquido sólido para la mayor producción de 
xilosa, utilizando las condiciones basales de temperatura, concentración de 
ácido sulfúrico, y tiempo de hidrólisis. 
 Diseñar una tabla factorial de acuerdo al método estadístico de Box-Wilson. 
 Realizar los experimentos del diseño factorial. 
 Cuantificar los azúcares en el hidrolizado de cada uno de los experimentos 
contemplados en el diseño factorial. 
 Obtener los coeficientes de regresión para cada una de las variables 
estudiadas. 
 Utilizando los coeficientes de regresión, planear y realizar los nuevos 
experimentos para alcanzar la mayor de la producción de xilosa con las 
mejores condiciones y restricciones de inhibidores. 
 
 
6 
 
Capítulo 1 
Antecedentes 
 
1.1 Biomasa 
El diccionario de la real academia, considera dos definiciones del término 
biomasa: (1) materia total de los seres que viven en un lugar determinado, 
expresada en peso por unidad de área o de volumen; (2) materia orgánica 
originada durante un proceso biológico , espontáneo o provocado, utilizable como 
fuente de energía.1 En este trabajo se utiliza la segunda definición de biomasa. 
La biomasa es toda la materia orgánica procedente de plantas y animales que a lo 
largo de la historia ha sido utilizada para producir energía en forma de calor o luz.2 
En la actualidad, estas fuentes de energía renovable son utilizadas para la 
fabricación de productos químicos. Entre las ventajas de su utilización está el que 
la producción de estos, usando biomasa, no aumenta la huella de carbono. 
Considerando las fuentes de donde proviene la biomasa, esta puede considerarse 
como biomasa de origen primario o biomasa de origen secundario. La biomasa de 
origen primario es la obtenida de los cultivos energéticos y de la biomasa forestal. 
Los primeros son cultivos orientados a la producción de energía. En la biomasa de 
origen secundario, se incluyen subproductos agrícolas, forestales e industriales.3 
También, la biomasa puede clasificarse según el tamaño y la rigidez de su tallo y 
ramas, por lo que la biomasa puede provenir de árboles, arbustos y plantas 
herbáceas. Al primer tipo de biomasa se le considera leñosa y a los otros dos son 
biomasa no leñosa, dentro de la cual se encuentra la biomasa herbácea 
proveniente de los cultivos agrícolas, los residuos de cultivos y los residuos 
procesados y desechos de animales.4 
7 
 
Existen diversos tipos de tecnologías para aprovechar el potencial energético de la 
biomasa, las más utilizadas son las siguientes: 
 Combustión: Se utiliza para producir energía a partir de la biomasa 
quemando ésta para la obtención de energía. Comúnmente en la industria 
la quema de biomasa se realiza en una cámara de combustión, para poder 
producir electricidad por medio de una turbina de vapor. También, se puede 
aprovechar directamente el calor para hornos o incluso domésticamente 
para la calefacción o la cocción de los alimentos. 
 Co-combustión: En este caso, la biomasa se puede mezclar en diferentes 
proporciones con carbón principalmente u otro tipo de combustibles fósiles, 
para la producción de energía. 
 Gasificación: La gasificación es la mayor alternativa de la combustión, 
para el uso de la biomasa. La gasificación es un proceso endotérmico, en el 
cual, el material sólido se convierte en un combustible gaseoso. La 
importancia deeste proceso radica en que se puede hacer uso de turbinas 
y generadores de vapor más avanzados y por lo cual se puede tener una 
mayor eficiencia energética. 
 Pirólisis: Existe un gran interés en la pirólisis debido a la gran cantidad de 
productos que se puede obtener de este tipo de tecnología. Por ejemplo, se 
pueden obtener combustibles líquidos y una gran cantidad de productos 
químicos. De ahí, que haya una gran cantidad de trabajos de investigación 
dedicados al estudio de procesos de pirólisis.4 
 
 
1.2 Materiales Lignocelulósicos. 
La biomasa, materiales lignocelulósicos o residuos lignocelulósicos, -en este 
trabajo se referirán como sinónimos- están formados por tres tipos diferentes de 
polímeros: celulosa, hemicelulosa y lignina. Tanto la celulosa como la 
hemicelulosa son polímeros conformados por azúcares, y de ahí su potencial no 
sólo como fuente de combustible, sino también como fuente de azúcares 
8 
 
fermentables, que al igual que la lignina pueden ser usados para la producción de 
distintos productos químicos.5 
La composición y porcentajes de los polímeros presentes en los residuos 
lignocelulósicos varían dependiendo de la especie de la planta, la edad y la etapa 
de crecimiento. En el cuadro 1.1 se muestra la composición química de diversos 
residuos lignocelulósicos. En la mayoría de los residuos ahí enumerados, la 
celulosa es el mayor componente, seguido de las hemicelulosas y el contenido de 
lignina varía dependiendo del residuo lignocelulósico de que se trate. Solamente 
las hojas y la paja de trigo contienen mayor cantidad de hemicelulosas que de 
celulosa. 
Cuadro 1.1. Composición de lignocelulosa de diversas fuentes en base seca.8 
 
La celulosa es el mayor componente estructural de las paredes celulares, principal 
estructura anatómica de los residuos lignocelulósicos (Figura 1.1). Se conforma de 
polímeros con estructuras tanto cristalinas como amorfas, dando así fuerza 
mecánica y estabilidad química a las plantas.5 Dentro de la estructura de las 
plantas, se unen capas de celulosa y forman estructuras que se llaman fibrillas de 
9 
 
celulosa o paquetes de celulosa, estas son en su mayoría estructuras 
independientes que se unen débilmente por enlaces de hidrógeno.6 
Los polímeros de celulosa se forman mediante dos tipos de enlaces: 
 El enlace glucosídico es una de las formas iniciales de la cadena 
polimérica. Consiste en un enlace 1-4 β D-glucosídico que conecta las 
unidades de glucosa, este enlace puede ser considerado también como un 
enlace tipo éter. 
 El enlace de hidrógeno, el cual se considera responsable de la estructura 
cristalina en las fibras de celulosa. El arreglo de las cadenas de polímeros 
en largas cadenas paralelas, con los grupos hidroxilos que se distribuyen a 
ambos lados del monómero de la glucosa, permitiendo así los enlaces de 
hidrógeno entre dos grupos hidroxilos de diferentes cadenas poliméricas.5 
Las microfibrillas de celulosa se unen entre sí por enlaces de hidrógeno6, 
formando paquetes de fibras de celulosa. 
La hemicelulosa está compuesta principalmente por aldopentosas (arabinosa, 
xilosa), y en una menor cantidad por hexosas como glucosa y galactosa.7 La 
hemicelulosa posee un peso molecular más bajo que la celulosa, con cadenas 
laterales cortas fáciles de hidrolizar. La hemicelulosa actúa como un aglutinante 
que une a la lignina y a las fibras de celulosa, confiriendo estabilidad a la planta 
(Figura 1.1).6 La hemicelulosa no se encuentra en forma cristalina, debido 
principalmente a su estructura ramificada, y a la presencia de grupos acetilo 
unidos a la cadena de polímeros. Una de las diferencias principales entre la 
celulosa y la hemicelulosa consiste en que los enlaces de hidrógeno entre las 
cadenas de hemicelulosa se encuentran ausentes.5 
La lignina se compone de redes complejas de compuestos aromáticos, se 
encuentra en una estructura amorfa. Después de la celulosa, la lignina es el 
compuesto natural más abundante.7 La lignina se encuentra en la pared celular 
secundaria, el objetivo principal de ésta es dar a la planta soporte estructural, 
impermeabilidad y resistencia contra ataques microbianos y estrés oxidativo.6 
10 
 
Dentro de la estructura de la lignocelulosa, el mayor tipo de enlaces que se 
encuentran en el polímero de la lignina son enlaces tipo éter y carbono-carbono 
entre anillos aromáticos o entre un carbono aromático y uno alifático. De estos, el 
70% de los enlaces pertenece al primer tipo, mientras el 30% sería del tipo 
carbono-carbono.5 
Aparte de estos tres componentes principales, los residuos lignocelulósicos 
también contienen agua y cantidades pequeñas de proteínas, minerales y trazas 
de otros componentes. Estos últimos componentes no juegan un papel 
significativo en la estructura de la lignocelulosa. 
Al tratar de aislar cada uno de los polímeros que forman los materiales 
lignocelulósicos su estructura original se modifica, por lo que aún no se definen 
claramente los enlaces que unen las tres estructuras (Figura 1.1). Aún así, se 
tienen identificados la existencia de enlaces de hidrógeno entre la estructura de la 
celulosa y la hemicelulosa, así como la existencia de enlaces covalentes entre la 
lignina y los polisacáridos. 5,9 
 
Figura 1.1. Representación de la estructura de la pared celular en la lignocelulosa.19 
11 
 
Los procesos para aprovechar el material lignocelulósico en su conversión a 
azúcares fermentables consiste en dos pasos: 
 Un pretratamiento inicial, en el cual los polímeros de la celulosa se 
hacen accesibles para su posterior hidrólisis. En este proceso, la 
hidrólisis de la hemicelulosa puede ocurrir, así como la separación de la 
fracción de lignina, dependiendo del proceso aplicado. 
 La hidrólisis enzimática de la celulosa para su conversión en azúcares 
fermentables.5 Esta hidrólisis, en muchos casos, se realiza en presencia 
de hemicelulosa hidrolizada y lignina modificada. Lo que disminuye la 
disponibilidad de celulasas para la hidrólisis; ya sea por unión especifica de 
celulasas con lignina o porque los oligosacaridos provenientes de las 
hemicelulosas inhiben la acción de la celulasa. 
Debido a que la estructura y composición química de cada material es diferente 
se ha hecho un gran énfasis en la búsqueda de las mejores condiciones de 
reacción de estos procesos para cada material lignocelulósico, ya que cada 
tratamiento tiene sus limitantes y esto puede afectar de manera negativa los 
distintos productos que se deseen obtener.5 Por ejemplo, en algunos casos la 
separación de la celulosa y la lignina puede ser deficiente; en otros, se forman 
productos secundarios de los azúcares hemicelulósicos como furfural o 
hidroximetilfurfural (HMF) que inhiben la etapa de la fermentación en la producción 
del bio-etanol; o bien, se quieren utilizar los azúcares lignocelulósicos en la 
obtención de compuestos químicos especiales, pero en la mayoría de los 
pretratamientos antes mencionados los azúcares de la hemicelulosa se 
encuentran junto con la lignina o con la lignina y la celulosa, por lo que su 
purificación no es rentable económicamente. 
 
 
 
12 
 
1.3 Pretratamientos de lignocelulosa. 
El pretratamiento de la lignocelulosa es una parte crucial de su conversión a los 
diversos productos deseados. En él se altera la estructura de la biomasa para 
hacer más accesible la celulosa y hemicelulosa a la hidrólisis enzimática (Figura 
1.3). Algunos de los posibles objetivos del pre-tratamiento incluyen la remoción de 
la lignina y la alteración de la estructura cristalina de la celulosa y una 
despolimerización parcial de la hemicelulosa (Figura 1.3).5 Para aplicaciones 
industriales, los pre-tratamientos deben ser efectivos, económicamente viables, 
ambientalmente seguros y fáciles de usar. 
 
Figura 1.3. Representación de los efectos del pre-tratamiento en la lignocelulosa.10 
Variosde los criterios que se deben tomar en cuenta para que un pre-tratamiento 
se considere efectivo es evitar reducir el tamaño de partícula de la biomasa, 
preservar las fracciones de hemicelulosa, limitar al máximo la formación de 
inhibidores, minimizar el gasto energético y ser económicamente rentable.11 
De acuerdo al tipo de pre-tratamiento, las técnicas se dividen generalmente en 
tres distintas categorías, pre-tratamientos físicos, químicos y biológicos. Es común 
que se combinen dos o más técnicas de pre-tratamiento para una mejor 
descomposición del material lignocelulósico. A pesar de que se han estudiado 
muchas tecnologías para el tratamiento de los materiales lignocelulósicos no se 
13 
 
puede decir que alguna de ellas sea definitiva ya que cada una tiene sus ventajas 
y desventajas. A continuación, se mencionan algunos de los pre-tratamientos más 
comunes para aislar y utilizar la celulosa. 
 
1.3.1 Pretratamientos físicos. 
 
 Fragmentación mecánica: 
La reducción del tamaño de partícula es necesaria para un mejor manejo 
del material, así como para aumentar la superficie de contacto. La 
reducción puede ser hecha por molienda o cortando la biomasa. Este 
proceso se realiza con el propósito de alcanzar el tamaño de partícula 
deseado para el mejor acceso de los siguientes pretratamientos a la 
estructura de la lignocelulosa.5 
 Explosión de vapor. 
También se le llama autohidrólisis, es un método donde solo se utiliza agua. 
Es uno de los pretratamientos mas comunes para el tratamiento de 
biomasa lignocelulósica. En este método las partículas de biomasa se 
calientan rápidamente con vapor saturado a alta presión, por un periodo de 
tiempo que pueda promover la hidrólisis de la hemicelulosa. Al final, se 
libera súbitamente la presión. En este proceso la hidrólisis de la 
hemicelulosa se cataliza en el medio ácido que se forma por el ácido 
acético removido de este mismo polímero y por las propiedades ácidas que 
adquiere el agua, a altas temperaturas.11 La lignina se modifica y se 
solubiliza parcialmente. 
 Pretratamiento de agua líquida a alta temperatura. 
En este pretratamiento se utiliza la presión para mantener el agua a alta 
temperatura en un estado líquido. Este método tiene potencial para 
aumentar la digestibilidad de la celulosa, la extracción de azúcares y la 
recuperación de pentosas, con la ventaja de producir prehidrolizados con 
poco o nada de contenido de inhibidores. En este proceso no se necesita la 
14 
 
neutralización de los hidrolizados, ni la reducción de partículas de la 
biomasa, porque las partículas se rompen durante el pre-tratamiento.11 
 Irradiación. 
Se puede irradiar con rayos gama, electrones o microondas para aumentar 
la hidrólisis enzimática en la lignocelulosa y aún más si se combina con otro 
tipo de tratamientos, como la hidrólisis ácida. La irradiación aumenta la 
degradación enzimática de la celulosa en glucosa. Aunque mejoran la 
remoción de la lignina y la descomposición de los polisacáridos, es un 
método costoso y tiene dificultades a la hora de la aplicación industrial. 
También, se puede usar ultrasonido en pre-tratamiento para la producción 
de biogás, en la desintegración de lodos y materiales de desecho 
acuosos.13 
 
 
1.3.2 Pretratamientos biológicos. 
Los pretratamientos biológicos emplean microorganismos capaces de degradar la 
madera o material lignocelulósico, como lo son hongos y bacterias que modifican 
la composición química y la estructura de la biomasa lignocelulósica, para que así 
pueda ser más factible usar la digestión enzimática. Los métodos biológicos 
parecen ser una alternativa bastante prometedora, ya que tiene varias ventajas, 
como el que no requiere sustancias químicas, se requiere poca energía, por lo que 
son amigables con el medio ambiente. Sin embargo, es un proceso lento y 
requiere un cuidadoso control de las condiciones de crecimiento; además de 
amplio espacio para llevar a cabo el tratamiento, uno de los inconvenientes que 
presenta es que muchos organismos no solo consumen la lignina si no también la 
celulosa y la hemicelulosa, por lo que comercialmente es poco atractivo.11 
 
 
15 
 
1.3.3 Pretratamientos químicos. 
 
 Explosión de fibras con solución de amoniaco (AFEX, por sus siglas en 
inglés) 
En este pretratamiento aumenta significativamente la sacarificación de los 
sustratos lignocelulósicos que se tratan con amoniaco a alta temperatura y 
presión, el concepto es muy similar a la explosión de vapor. Las ventajas 
que tiene este tratamiento es que en los sustratos con poca lignina logra 
hasta un 90% de hidrólisis de la celulosa y hemicelulosa, además de que no 
se producen inhibidores ni se requiere que la biomasa lignocelulósica sea 
triturada.12 
 Líquidos iónicos. 
Los líquidos iónicos son sales que se encuentran en estado líquido a 
temperatura ambiente. Estas sales suelen abarcar aniones inorgánicos y 
cationes orgánicos en una estructura molecular heterogénea. Aún no 
existen aplicaciones industriales con este tipo de líquidos, pero debido a 
sus propiedades, pueden ser usados como disolventes selectivos de la 
lignina o la celulosa, lo que resulta en una separación de la lignina y 
aumento de la accesibilidad de la celulosa bajo condiciones suaves, 
además de que no se producen inhibidores. A pesar de estas ventajas, aún 
no se han estudiado a profundidad este tipo de pretratamientos, debido al 
problema que representa la recuperación de los líquidos iónicos y el alto 
costo de los mismos.5 
 Explosión de vapor catalizada. 
Este pretratamiento es parecido al descrito en los tratamientos físicos, con 
la diferencia que la biomasa se impregna con H2SO4, SO2 o CO2 previo a 
aplicar la corriente de vapor para así mejorar la hidrólisis, y promover una 
completa remoción de la hemicelulosa. Las limitaciones de este método 
incluyen una destrucción de la fracción de xilano, una incompleta 
separación de la lignina y la matriz de carbohidratos, además de la 
generación de compuestos inhibidores para el paso de la fermentación. 
16 
 
 Ozonólisis. 
El ozono puede ser usado para degradar la lignina y hemicelulosa en 
muchos de los materiales lignocelulósicos. La ozonólisis retira 
efectivamente la lignina y no produce residuos tóxicos o inhibidores y puede 
ser llevada a cabo a temperatura y presión ambiente. Sin embargo requiere 
una gran cantidad de ozono, lo que lo vuelve un proceso costoso.12 
 Organosolventes. 
En este proceso se utiliza uno o mas disolventes orgánicos en agua para 
remover la lignina antes de la hidrólisis enzimática de la celulosa. 
Disolventes comunes para este proceso suelen ser etanol, metanol, 
acetona y etilen-glicol, a temperaturas de proceso de 200°C, aunque 
temperaturas inferiores pueden ser suficientes dependiendo del tipo de 
biomasa que se utilice. El problema es que el mismo disolvente puede ser 
un inhibidor para el proceso de hidrólisis enzimática, así como para la 
fermentación, por lo que debe ser removido y recuperado.5 
 Hidrólisis ácida. 
Se pueden usar ácidos concentrados como H2SO4 y HCl para el tratamiento 
de la biomasa lignocelulósica. Aunque estos compuestos son agentes con 
gran capacidad de hidrólisis para la celulosa, son agentes altamente 
tóxicos, corrosivos y peligrosos que requieren reactores resistentes a la 
corrosión, además de que el ácido debe ser recuperado después de la 
hidrólisis para hacer el proceso económicamente viable. La hidrólisis con 
ácido diluido ha mostrado ser un buen pretratamiento para los materiales 
lignocelulósicos. A altas temperaturas se favorece la hidrólisis de la 
celulosa. Hay dos tipos principales de hidrólisis con ácido diluido, a altas 
temperaturas, mas de 160°C con flujo continuo, y a bajas temperaturas en 
proceso discontinuo. El problema de este proceso es que es un poco mas 
costoso que otros procesos y se requiere la neutralizacióndel hidrolizado.12 
 Hidrólisis básica. 
Algunas bases pueden ser usadas para el pretratamiento de material 
lignocelulósico, dependiendo de la cantidad de lignina presente en el 
17 
 
material. Para estos procesos se puede usar NaOH, Ca (OH)2 y amoniaco. 
Uno de los mayores efectos que tiene este tipo de pretratamiento es que se 
remueve la lignina de la biomasa y eso mejora la reactividad de los 
polisacáridos sobrantes. Además, se retira con este proceso el grupo 
acetilo y varios ácidos que se forman como productos de la reacción.5 
 
 
1.2 Formación de inhibidores 
Durante los pretratamientos para la obtención de azúcares simples a partir de los 
polímeros que conforman la lignocelulosa, especialmente en medio ácido y alta 
temperatura, se realizan reacciones de deshidratación de los azúcares producidos. 
Estos aductos son tóxicos para los microorganismos en la etapa de fermentación 
ya que reducen la producción del metabolito deseado y limitan el crecimiento del 
microorganismo.5 El tipo de inhibidores que se forma y su concentración en el 
hidrolizado dependen tanto de la procedencia del material lignocelulósico como 
del tratamiento al que se halla sometido. Los compuestos tóxicos pueden dividirse 
principalmente en cuatro grupos, los productos de degradación de azúcares, los 
productos de degradación de la lignina, los compuestos derivados de la estructura 
de la lignocelulosa y los iones de metales pesados (Figura 1.4).14 Existen distintas 
variables en el proceso de fermentación, como las condiciones fisiológicas de las 
células, el oxígeno disuelto en el medio y el pH, las cuales pueden acentuar o no 
el efecto tóxico de estos compuestos.14 Estos inhibidores actúan en los 
organismos fermentadores, reduciendo así su producción y crecimiento. Algunos 
de estos organismos fermentadores pueden ser hasta cierto punto resistentes a 
los inhibidores o adaptarse a su presencia; aún así, lo mas deseable es la 
producción mínima de estos, para que no interfieran con el proceso de 
fermentación, ya que el efecto inhibidor aumenta cuando estos compuestos se 
presentan juntos debido a un efecto sinérgico.5 
18 
 
 
Figura 1.4. Principales tipos de inhibidores y su estructura química, formados 
durante el pretratamiento de materiales lignocelulósicos.5 
Durante la mayoría de los pretratamientos antes mencionados, la hemicelulosa se 
hidroliza parcial o totalmente, dependiendo de las condiciones de pH, temperatura 
y tiempo de residencia. Cuando la hidrólisis de la hemicelulosa es total se 
producen los monómeros que la constituyen, azúcares de cinco carbonos como 
son: xilosa y arabinosa. También, se producen azúcares de seis carbonos en 
menor cantidad como son la manosa y la glucosa, etc. las pentosas pueden sufrir 
una deshidratación formando furfural (Figura 1.4). Así mismo con las hexosas 
puede suceder el mismo proceso transformando estos azúcares en 
hidroximetilfurfural (HMF), (Figura 1.4). Ambos compuestos son inhibidores del 
crecimiento y actividad de las levaduras fermentadoras.5 El HMF es menos tóxico 
que el furfural y su concentración en los hidrolizados de hemicelulosa es 
normalmente bajo debido a la baja cantidad de hexosas en la hemicelulosa, las 
condiciones usadas para la hidrólisis normalmente no degradan la hexosa en 
grandes cantidades. Se ha encontrado que cierta concentración de furfural 
(concentraciones menores a 0.5 g/l) tienen un efecto positivo en el crecimiento de 
las células, mientras que concentraciones mayores (de 2 g/l) pueden inhibir 
completamente el crecimiento de las células14. El HMF se ha reportado que tiene 
efectos inhibidores parecidos al furfural, causando un mayor retardo en el 
crecimiento de las células.14 
La degradación de la lignina produce la liberación de varios compuestos 
inhibidores como lo son fenoles, compuestos aromáticos, poliaromáticos, y 
19 
 
aldehídos.14 Estudios cinéticos han demostrado que la producción de estos 
inhibidores aumenta considerablemente a mayor temperatura y tiempo de 
reacción.5 Los compuestos fenólicos, tienen un efecto inhibidor considerable en la 
fermentación del hidrolizado, siendo los de menor peso molecular los que 
presentan una mayor toxicidad. Estos compuestos son incluso mas tóxicos que el 
furfural y el HMF incluso cuando sus concentraciones pueden ser más bajas.14 
Existen otros compuestos inhibidores como lo es el ácido acético, resinas ácidas, 
y ácido terpénico proveniente de los materiales extractivos que se encuentran en 
la materia lignocelulosica, derivados de los grupos presentes en la hemicelulosa y 
que se liberan durante el proceso de hidrólisis.14 Las propiedades tóxicas del ácido 
acético varían de acuerdo a las condiciones de fermentación, y dado que la 
formación de ácido acético es inherente a la hidrólisis de la hemicelulosa, su 
formación no puede ser evitada, pero una fermentación a un pH alto puede reducir 
sus efectos o el ácido puede ser neutralizado en el hidrolizado.5 Se pueden formar 
iones metálicos por la corrosión del equipo y su toxicidad puede inhibir las 
enzimas de los microorganismos en sus rutas metabólicas. 14 
Se puede mejorar la actividad metabólica de los microorganismos fermentadores 
ya sea intentando evitar la formación de inhibidores durante la hidrólisis, la 
desintoxicación del hidrolizado antes de la fermentación, desarrollando 
microorganismos resistentes a los inhibidores o convertir los productos tóxicos en 
productos que no interfieran con la fermentación.14 
Los pretratamientos antes mencionados todos son aplicables al aislamiento y 
purificación de la celulosa presente en los materiales lignocelulósicos, la cual es 
enzimáticamente hidrolizada para su posterior fermentación a bioetanol, 
principalmente. El resto de la biomasa es utilizada como fuente de energía para el 
mismo proceso de producción de bioetanol. Sin embargo, el costo del bioetanol es 
bajo por lo que si este es el único producto industrial obtenido de la biomasa, el 
proceso no es económicamente rentable, por lo que los pretratamientos antes 
descritos deben ser modificados para aislar y purificar los otros polímeros como 
20 
 
son la hemicelulosa y la lignina. Debido a que el objetivo de este trabajo es buscar 
las mejores condiciones de reacción de un pretratamiento que permita el 
aislamiento y utilización de la xilosa, componente principal de la hemicelulosa de 
gramíneas, a continuación se describirá la importancia de este azúcar, para la 
producción de compuestos especiales y así adicionar coproductos que al ser 
comercializados mejoren el beneficio económico de la bioconversión de la 
biomasa. 
 
1.3 Xilosa y su importancia 
La xilosa y su alcohol derivado, el xilitol, se han estudiado ampliamente, teniendo 
ambos gran importancia en la industria hoy en día. El xilitol es un polialcohol con 
muchas aplicaciones en la industria alimenticia, farmacéutica y de cuidado dental 
debido a su sabor dulce, convirtiéndolo en un gran edulcorante, además de sus 
propiedades anti-cancerígenas. El xilitol es usado como un azúcar substituto para 
los diabéticos.16 
La xilosa corresponde a un tercio del total de azúcares que se encuentra en toda 
la materia lignocelulosica, por lo que la extracción de ésta es redituable 
económicamente para su producción a escala industrial debido a sus diversos 
usos. La xilosa se puede usar como un endulzante en diversas bebidas, así como 
en bebidas bajas de glucosa, como un intermediario en la producción de fármacos, 
como humectante en diversos cosméticos, y como intermediario para la 
producción de distintos productos como xilitol, etanol, furfural, butanodiol y 
diversos productos orgánicos así como biocombustibles, los cuales tienen mucha 
demanda a nivel mundial para diversos aspectos de la industria. Por todo esto, 
resulta bastante atractiva su producción. Además de sus diversos usos, tiene gran 
versatilidad paraconversión a otros productos químicos y es de gran abundancia 
en la naturaleza como lo es en el caso del olote.17 
21 
 
1.4 Métodos utilizados para la obtención de hemicelulosas y sus 
azúcares. 
La hemicelulosa como ya se mencionó, tiene un gran potencial para su utilización 
comercial en biorefinerías dada la composición de su cadena polimérica, a pesar 
de eso aún es bajo el porcentaje de la utilización de las hemicelulosas a escala 
industrial para su conversión a distintos productos químicos. Existen diversos pre-
tratamientos que se han desarrollado enfocados a la extracción de la hemicelulosa 
como la extracción alcalina, extracción alcalina con peróxido, explosión de vapor, 
etc. La hemicelulosa y la celulosa son insolubles en agua a baja temperatura dada 
su estructura química. La hidrólisis de la hemicelulosa empieza a temperaturas 
mas bajas que la hidrólisis de la celulosa.5 Por eso se utilizan varios 
pretratamientos tanto para la extracción de la hemicelulosa como de la celulosa, 
con la diferencia que los pretratamientos enfocados a obtener hemicelulosa 
operan a condiciones mas suaves que las usadas para el tratamiento de la 
celulosa, ya que esta última es de más difícil acceso y con una estructura más 
estable, por lo que necesita condiciones más agresivas para ser extraída. Sin 
embargo, estos métodos enfocados a la extracción de hemicelulosa también 
extraen parcialmente otros componentes de la biomasa lignocelulósica como 
lignina o celulosa y producen la degradación parcial de la hemicelulosa durante el 
proceso, de ahí la importancia del estudio de pretratamientos enfocados a una 
extracción mas efectiva de la hemicelulosa. 
Dependiendo del proceso y las condiciones usadas durante el pretratamiento, los 
azúcares de la hemicelulosa se pueden degradar en ácidos débiles (como ácido 
acético), en derivados de furanos y de fenoles. Estos compuestos son inhibidores 
del proceso de fermentación lo cual disminuye el porcentaje de conversión.18 A 
continuación, se presentan algunos de los pretratamientos para la extracción de 
hemicelulosa: 
 Autohidrólisis: 
22 
 
La autohidrólisis usa agua caliente a altas temperaturas para hidrolizar la 
hemicelulosa en minutos. El porcentaje de recuperación de hemicelulosa es 
alto y no se necesita catalizador para el pretratamiento. Una ventaja de este 
tratamiento es que no se solubiliza una gran cantidad de lignina ni tampoco 
se descompone un alto porcentaje de azúcares, lo que previene que haya 
gran cantidad de inhibidores en el hidrolizado. Sin embargo, la hemicelulosa 
solubilizada aparece en su mayoría en forma de oligosacáridos. Entre las 
ventajas de este pretratamiento, está que al usar pH neutro los problemas 
de corrosión se reducen, así como los procesos subsecuentes para retirar 
el catalizador y precipitados.15 
 Explosión de vapor. 
En este proceso, el material lignocelulósico es calentado usando vapor de 
alta presión por un corto periodo de tiempo. El vapor se condensa bajo gran 
presión humedeciendo el material, después el material es expulsado del 
reactor por una boquilla por la fuerza inducida de la presión. Debido a la 
disminución súbita de la presión, la humedad condensada se evapora y 
degrada la matriz de la lignocelulosa rompiendo los enlaces inter e intra 
moleculares. Este proceso produce una alta solubilidad de la hemicelulosa, 
la mayoría en forma de oligosacáridos, junto con una baja solubilidad de la 
lignina, con una recuperación de azúcares entre un 45-65%. Este proceso 
también se puede usar utilizando H2SO4 o SO2, o incluso variantes usando 
explosión de CO2 y amoniaco, siendo la de CO2 mas efectiva previniendo la 
formación de inhibidores.18 
 Oxidación húmeda. 
En la oxidación húmeda, la hidrólisis ocurre en presencia de oxígeno, 
Na2CO3 o aire como catalizador lo que permite reducir las temperaturas y 
tiempos de reacción. Una desventaja de este pretratamiento es que es mas 
costoso debido al equipo usado para altas presiones. El catalizador mas 
usado es Na2CO3, porque en medios alcalinos es posible obtener mejores 
rendimientos de monosacáridos en condiciones moderadas.18 
 Pretratamientos de deslignificación 
23 
 
Los métodos para deslignificación incluyen tratamientos de organosolv, 
donde la lignina se remueve usando disolventes orgánicos (etanol, metanol, 
acetona, acido acético, etc.) para solubilizar la lignina e hidrolizar la 
fracción de hemicelulosa. Cuando se usan catalizadores (ácidos, 
antraquinona o sales) se puede alcanzar una deslignificación más selectiva. 
El problema de esto es la recuperación de los disolventes aumentando el 
costo del proceso. En algunas ocasiones se utilizan pretratamientos 
biológicos junto con el de deslignificación.15 
 Pretratamiento con NaOH y Ca(OH)2 
Los pretratamientos con catalizadores como hidróxido de sodio y calcio son 
usados comúnmente en procesos discontinuos, o como tratamientos 
subsecuentes a hidrólisis ácida. Se da a temperaturas de 30 a 130°C, con 
tiempos de reacción de 10 min a 18 horas. Dependiendo de la materia 
prima y las condiciones de operación, la recuperación de azúcares puede 
ser de hasta un 60%. Una de las ventajas es el uso de bajas temperaturas y 
presiones para el proceso.17 
 Peróxido alcalino 
En este pretratamiento se agrega un agente oxidante (aire, oxígeno o 
peróxido) a los pretratamientos alcalinos (como el mencionado 
anteriormente) mejorando la remoción de lignina. Estos tratamientos se 
pueden aplicar a procesos discontinuos a explosión de vapor, o los 
procesos hidrotérmicos. Este pretratamiento no es tan efectivo teniendo un 
bajo rendimiento, pero presenta una mayor deslignificación. Los 
pretratamientos de peróxido alcalino tienen una cinética mayor a bajas 
temperaturas en comparación con los otros pretratamientos, siendo este 
tipo de pretratamientos (peróxido alcalino) usado mas como un proceso de 
apoyo a los otros procesos como explosión de vapor o pretratamientos 
hidrotérmicos para obtener un mejor rendimiento.18 
 Explosión de fibra por Amonio 
La explosión de fibra por amonio puede ser presentada como la 
combinación de explosión de vapor combinada con un pretratamiento 
24 
 
alcalino. La biomasa es tratada en un reactor discontinuo con amoniaco 
anhidro líquido a temperaturas moderadas y presiones altas durante un 
tiempo corto (unos cuantos minutos) para liberar después la presión 
rápidamente, produciendo una combinación de efectos químicos y físicos 
que modifican la matriz de la biomasa lignocelulosica, hidrolizando la 
hemicelulosa y modificando la estructura cristalina de la celulosa, lo cual 
aumenta el área de superficie para una mejor conversión enzimática de los 
azúcares. Este pretratamiento ha mostrado buenos resultados en residuos 
herbáceos y agrícolas, pero es moderadamente efectivo sobre maderas 
duras y poco efectivo sobre maderas suaves. Aunado a que es un proceso 
costoso por la recuperación del amoniaco, pero esto se ve equilibrado por 
el gran porcentaje de recuperación de azúcares sin la presencia de 
inhibidores.15 
 Filtración de reciclado de amonio (ARP). 
En este pretratamiento se usa amoniaco en solución acuosa en procesos 
de flujo continuo usando reactores de columna que contienen a la biomasa. 
Se utilizan como condiciones de reacción amoniaco en solución acuosa 
concentrada de 2.5-20%, tiempos de reacción de mas de 90 minutos, 
porcentaje de sólido 15-30% (w/w), temperaturas de 140 – 210°C y flujo de 
5 ml/min. Este proceso ha probado ser efectivo para remover la lignina y 
solubilizar la hemicelulosa y dejar la fracción de celulosa intacta. Una gran 
desventaja es que es un proceso costoso.18 
Existen diversos pretratamientos tanto para la hidrólisis de celulosa como de 
hemicelulosa para la obtención de sus azúcares como se menciona anteriormente, 
cada uno con sus ventajas y desventajas. El presente trabajo se enfoca enla 
hidrolisis ácida diluida la cual se explica a continuación: 
Para la hidrólisis ácida se utilizan dos tratamientos, hidrolisis ácida concentrada, e 
hidrolisis ácida diluida. La hidrólisis ácida concentrada es un proceso costoso por 
el tipo de materiales a usar por la corrosión del ácido causando problemas 
operacionales. Para este pretratamiento se puede usar como catalizador ácido 
25 
 
sulfúrico (el más usado industrialmente), ácido clorhídrico, ácido nítrico y ácido 
trifluoroacético (TFA).18 En este proceso se remueve la mayoría de la celulosa y 
hemicelulosa, quedando una fase sólida rica en lignina. El uso de ácidos 
concentrados permite operar a temperaturas y presiones bajas/medias. Una de las 
desventajas que existe es que se necesita un control preciso de temperatura para 
producir pocos inhibidores, ya que con pequeños cambios de temperatura, los 
productos de degradación aumentan considerablemente, así como el proceso de 
neutralización del hidrolizado aumenta por el ácido concentrado así como los 
problemas de corrosión en los equipos.18 
Para la hidrolisis con ácido diluido, existen dos variantes de pretratamiento. El que 
se da a altas temperaturas (más de 160°C) que consiste en un proceso continuo 
para cargas de sólido bajas y a temperatura baja (menor de 160°C) con procesos 
por lotes para grandes cargas.15 Los hidrolizados provenientes de este 
pretratamiento, contienen principalmente xilosa, arabinosa, glucosa y galactosa, 
con algunos inhibidores provenientes de la descomposición parcial de la pared 
celular tales como furfural, compuestos fenólicos, ácidos débiles entre otros. 
Aparte de la temperatura, el tiempo de reacción y la concentración del ácido son 
factores que intervienen en la capacidad de hidrólisis de este pretratamiento. La 
concentración del ácido es considerada uno de los factores mas importantes para 
la producción de azúcares, ya que grandes concentraciones de ácido pueden 
descomponer la hemicelulosa y producir una mayor cantidad de inhibidores, 
además de dañar el equipo usado. El efecto de la temperatura afecta también 
directamente a la degradación de los azúcares en inhibidores. Se ha visto que una 
temperatura media da una recuperación significativa de azúcares, mientras que 
mayores temperaturas causan mayor formación de inhibidores, pero estas 
condiciones cambian respectivamente dependiendo el origen del material 
lignocelulósico que se esté usando, debido a que cambia su composición para 
cada especie.16 
Existen dos fases involucradas en la hidrólisis con ácido diluido, la fase sólida (la 
lignocelulosa) y la fase líquida (el ácido diluido). Los modelos cinéticos propuestos 
26 
 
en la literatura de esta reacción es de un modelo irreversible pseudohomogéneo 
de primer orden. Este modelo está basado en la conversión de la celulosa en 
glucosa y su posterior conversión en los productos de descomposición 
(inhibidores), modelo que también puede ser usado para la hidrólisis de la 
hemicelulosa.16,36 
Aunque el pretratamiento con ácido diluido puede mejorar significativamente la 
hidrólisis de la celulosa y hemicelulosa, su costo suele elevarse mas que ciertos 
procesos, como la explosión de vapor o el AFEX debido a que se necesita una 
neutralización del pH en el hidrolizado para que se pueda llevar a cabo el proceso 
de fermentación debido a la sensibilidad de los organismos fermentadores, así 
como el costo de los materiales, por el carácter corrosivo del ácido, las altas 
presiones y producción de inhibidores.15 A pesar de eso, es un proceso 
ampliamente usado por la relativa sencillez del proceso y control de condiciones 
de reacción arrojando buenos resultados en recuperación de los azúcares. 
 
 
 
 
27 
 
Capítulo 2 
Material y métodos 
 
2.1 Composición del material lignocelulosico 
 
2.1.1 Preparación de material lignocelulósico 
En este trabajo se utilizó olote húmedo de maíz recolectado en las tortillerías del 
mercado de Jamaica, Ciudad de México. El olote se molió en licuadora de 
laboratorio (marca waring) y se secó en un horno al vacío y 60°C por una semana. 
El olote molido se tamizó por malla 650 μm y se guardó en frascos a 4°C hasta su 
uso. 
 
2.1.2 Determinación del contenido de humedad de la harina de olote 
Se pesaron 0.3 g de harina de olote guardado a 4°C en cajas de aluminio, 
previamente pesadas y se colocaron a 60 °C en un horno al vacío por 24 hs. 
Pasado este tiempo se apaga el horno. Una vez alcanzada la temperatura del 
ambiente, la caja con la harina se pesa. El proceso se repite hasta alcanzar peso 
constante. Para calcular el contenido de humedad en % se utilizó la fórmula 1. 
 
 
 
 
 
Donde PH fue el peso inicial de la caja de aluminio con harina y Pf el peso 
constante de la caja junto con la harina de olote y PC es el peso de la caja de 
aluminio sin la harina de olote. 
28 
 
2.1.3 Composición química de la harina de olote 
En un matraz de 50 ml se colocaron 0.3 g de harina de olote. Se le agregaron 3 ml 
de ácido sulfúrico al 72 %. Estos matraces se taparon con papel aluminio y se 
incubaron en baño maría a 30 °C por 1h, con agitación manual cada 15 min. 
Transcurrido este tiempo, la mezcla se trasvasó aun matraz de 125 ml utilizando 
84.5 ml de agua bidestilada. Con esta dilución, la concentración de ácido sulfúrico 
fue del (4%), incubándolo por 1h en una autoclave. Para separar el hidrolizado 
del material insoluble, el contenido del matraz se filtra al vacío. Previo a ser 
utilizado, al crisol se le colocó un papel filtro n° 1 y se pesó. Al filtrado ácido se le 
determina el volumen total y se guardó a 4°C hasta su utilización para cuantificar 
azúcares o reductores totales. El residuo sólido se lavó dos veces con 5 ml de 
agua bidestilada cada vez. Este filtrado se desechó. Los sólidos insolubles en 
ácido y lavado con agua constituyen la lignina insoluble, los cuales se pusieron a 
secar hasta peso seco. 
 
2.1.4 Cuantificación de azúcares por diversos métodos. 
En un vaso de precipitados de 25 ml se colocaron 20 ml del filtrado ácido y su pH 
se ajustó entre 6-7, con carbonato de sodio al 20 %. El pH no debe ser mas ácido 
porque interfiere con los sistemas de cuantificación de azúcares, por ejemplo 
dañaría las columnas usadas en el HPLC, o interferiría con los kit químicos y 
tampoco debe sobrepasar la neutralidad porque los azúcares se descomponen. 
Posteriormente, se midió el volumen de la muestra neutralizada. 2 ml del líquido 
neutralizado se pasaron a través de un filtro de 0.45 μm. La fase líquida se guardó 
en un tubo de 2 ml. Este filtrado se utilizó para cuantificar azúcares por HPLC, 
azúcares reductores por el método de Miller (1959) y glucosa por medio 
enzimático (Glucose LQ, SPINREACT). 
 
29 
 
Para la cuantificación de azúcares por HPLC, se utilizaron dos protocolos: 
Protocolo A, desarrollado en USAI, Facultad de Química, UNAM por el Dr. Víctor 
Zaldívar Machorro en un HPLC con un detector de arreglo de diodos. Los 
azúcares se separaron en una columna Hi-PlexH (Agilent, 7.7 X 300 mm) 
utilizando agua como fase móvil con flujo de 0.6 ml/min y temperatura de 65 °C. El 
tiempo de corrida fue de 20 min. 
Protocolo B se desarrolló en el laboratorio 104 del departamento de Bioquímica, 
por el alumno. Se utilizó un HPLC (Waters) con un detector de índice de 
refracción. Los azúcares se separaron en una columna High performance 
carbohydrate (Waters 4.6 x 250 mm) utilizando como fase móvil acetonitrilo-agua 
(90:10) con flujo de 1.6 ml y temperatura de 30 °C. EL tiempo de corrida fue de 45 
min. 
Cuantificación de glucosa por método enzimático. 
Para esta determinación se siguieron las especificaciones del productor del Kit 
utilizado (Glucose LQ, SPINREACT). El método consiste en la oxidación de 
glucosa por la glucosa oxidasa (GOD). El peróxido de hidrogeno (H2O2) formado 
se detectautilizando peroxidasa (POD) para oxidar a la 4-aminofenazona (4-AP) 
que forma un compuesto colorido en presencia de fenol. La intensidad del color 
formado es proporcional a la concentración de glucosa en la muestra. 
β-D-Glucosa + O2+ H2O Ácido glucónico + H2O2 
Ácido glucónico +H2O2 + Fenol + 4-AP Quinona + H2O 
 
Cuantificación de azúcares reductores 
El método utilizado fue el método colorimétrico del ácido 3,5-dinitrosalicilico (DNS). 
Este reactivo se preparó de acuerdo a lo reportado por Miller (1959). La técnica 
consiste en colocar 125 μl de la muestra en un tubo de ensaye, añadiéndole 175 
GOD 
POD 
30 
 
μl del reactivo de DNS, se agita y se incuba en baño de agua hirviendo durante 5 
min. Se enfría y se le agregan 2.5 ml de agua. Se lee la absorbancia a 540 nm en 
un espectrofotómetro (UV-1601, Shimadzu) contra un blanco en el cual en lugar 
de muestra se colocan 125 μl de agua bidestilada y se sigue el procedimiento 
descrito para la muestra. La concentración de azúcares reductores se obtuvo por 
la comparación con una curva patrón de glucosa realizada en el rango de 0 a 1.0 
mg/ml. 
 
2.2 Determinación de las mejores condiciones de reacción 
 
2.2.1 Determinación de la relación sólido:líquido óptima para la hidrólisis 
ácida del xilano 
En tres series de matraces A, B, C, de 50 ml se colocaron 0.5 g de olote molido; 
previamente tamizado a través de una malla 20 y retenido en una malla 40 (650 
μm>partícula> 415 μm). Los matraces de la serie A fueron adicionados con 4 ml, 
los de la serie B con 5 ml y los de la serie C con 6 ml de H2SO4 1.5 % (v/v). De 
forma tal que la relación peso a volumen de la serie A fue de 1:8. Mientras que 
para la B y la C fue de 1:10 y 1:12, respectivamente. Los experimentos se 
realizaron por duplicado. Los matraces se introdujeron en un autoclave y cuando 
el autoclave alcanzó 120°C se incubaron a esta temperatura durante 20 minutos. 
Pasado este tiempo los matraces se retiraron del autoclave, se dejaron enfriar y se 
filtraron con papel filtro Whatman n° 1, previamente pesados, utilizando filtros 
Büchner de 8 cm. El residuo sólido se lavó con agua bidestilada (20 ml), se colocó 
en una caja de Petri y se llevó a sequedad. Tanto el hidrolizado como el agua de 
lavado se reunieron en una probeta de 50 ml y el volumen se anotó. Éste se 
neutralizó hasta un pH 6-7 usando Na2CO3 al 20% (w/v), midiendo el volumen total 
neutralizado. El hidrolizado neutralizado se utilizó para cuantificar xilosa mediante 
la cuantificación de reductores totales. 
 
31 
 
2.2.2 Cuantificación de reductores totales 
En tubos de ensaye de 100 x 15 mm, se colocaron 0.125 ml de los hidrolizados 
neutralizados y 0.175 ml del reactivo de DNS (Miller 1959), se agitaron y se 
incubaron por 5 min en un baño de agua en franca ebullición. Después de este 
tiempo, se enfriaron a temperatura ambiente y se les agregaron 2.5 ml de agua y 
se agitaron. De cada tubo de ensaye se transfirió 1 ml, a celdas de plástico de 45 
X 10 mm, para cuantificar la absorción de cada muestra en un espectrofotómetro 
(Shimadzu UV- 1601) a una longitud de onda de 540 nm. La cantidad de xilosa en 
cada muestra se calculó contra una curva patrón de xilosa realizada en 
condiciones similares a las muestras. El rango lineal de la curva patrón fue de 0-
0.2 mg. En algunos casos las muestras de hidrolizado tuvieron que ser diluidas 
1:10. 
 
 
 
 
* 0.197 mg es la cantidad de reductores que absorben 1 unidad de densidad 
óptica. 
 
2.2.3 Determinación de las condiciones de hidrólisis ácida de la 
hemicelulosa de olote utilizando el método de Box-Wilson 
Este método es una modificación del diseño factorial 2n, se utiliza cuando se 
desea optimizar un medio de cultivo, o las condiciones para producir un 
metabolito. En este método se estudian X número de variables a dos niveles, un 
nivel inferior y un nivel superior. Los resultados del diseño factorial, se utilizan para 
encontrar los componentes o condiciones que más afectan los resultados de la 
variable independiente, que en este caso sería la cantidad de xilosa, y así 
proponer una nueva serie de experimentos en donde, algunos componentes se 
incrementan y otros se disminuyen hasta llegar al nivel óptimo de cada 
componente.22 En este caso se utilizaron como variables el tiempo de residencia, 
32 
 
temperatura y concentración de ácido sulfúrico. Los valores iniciales de estas 
variables fueron tomadas de la literatura20. En la tabla 2.1 se muestran los niveles 
máximos y mínimos de cada variable. Para calcular lo anterior se consideró que la 
variación en cada componente debe ser de entre 10-30 % respecto al valor total 
de las variables en el nivel basal. 
Tabla 2.1 Niveles máximos y mínimos de los componentes 
 
 
 
 
El diagrama de diseño factorial se diseñó tomando en cuenta los niveles inferiores 
y superiores, para cada componente (Tabla 2.2). Cada experimento se realizó por 
triplicado, con un modelo aleatorio. El máximo de variación es 30%, pero en la 
concentración del ácido se excede por 3.3% de variación, esto es debido a que 
una variación de 30% daría como variación de 0.45 en la concentración del ácido 
dando el nivel superior 1.95 y el inferior 1.45 y para un mejor control se redondeó 
a 0.5 de variación en la concentración. También, en los trabajos consultados20,21 
las concentraciones de 1, 1.5 y 2% han mostrado ser eficientes para la conversión 
hidrólisis ácida. 
 
Tabla 2.2 Diagrama de experimentos considerando valores máximos y 
mínimos para cada componente. 
 
Tratamientos 
Variables* 
T (°C) t (min) [H2SO4] 
1 + + + 
2 + - - 
3 + - + 
4 + + - 
5 - - - 
6 - - + 
7 - + - 
8 - + + 
Variable N. basal N. inferior N. superior % variación 
Tiempo (min) 20 14 26 30 
Temperatura (°C) 130 120 140 7.7 
[H2SO4] (%(v/v)) 1.5 1 2 33.3 
33 
 
* En el diagrama anterior los símbolos “+” representan el valor máximo 
o nivel superior, los símbolos “-“, representan el valor mínimo o nivel 
inferior, determinados en la Tabla 2.1. Cada uno de los tratamientos 
representa la combinación entre los valores máximos y mínimos de 
las tres variables para determinar los experimentos necesarios. 
Con los resultados obtenidos de cada uno de los tratamientos respecto a la 
cantidad de xilosa obtenida en el hidrolizado en cada tratamiento, se calcularon los 
coeficientes de regresión para cada componente, conservado el signo de cada 
sumatoria y las unidades respectivas. 
 
 
 
Calcular la variación de cada componente, considerando el componente con el 
mayor valor absoluto, para determinar el cambio de los otros componentes con 
respecto a éste. Se debe de mantener el signo al calcular cada coeficiente.22 
Con los resultados anteriores se sugieren una nueva serie de experimentos 
aumentando o disminuyendo cada componente (tiempo y temperatura de 
reacción, concentración de ácido), dependiendo del signo y de la magnitud 
obtenida para su incremento o disminución. Este proceso se repetirá una vez 
alcanzado un máximo, y se observe una disminución en los rendimientos de 
obtención de xilosa. En ese punto será la indicación de que se ha llegado al punto 
final deseado. 
Las unidades experimentales se diseñaron de la siguiente manera: en viales de 25 
ml, especiales para altas temperaturas, se colocaron aproximadamente 0.5 g de la 
biomasa de olote y se sumergieron en un baño de hielo. A cada vial se le 
adicionaron 5 ml de ácido sulfúrico (Ver preparación en anexo 1), manteniéndose 
en el baño de hielo hasta que la temperatura de cada unidad experimental alcanzó 
la temperatura de 4 °C. Posteriormente, se incubaron a las diferentes 
temperaturas, por los diferentes períodos de estancia, en un bañode aceite con 
una placa de calentamiento acoplada a un sensor de temperatura. Pasado el 
tiempo de incubación, las unidades experimentales se incubaron en un baño de 
34 
 
hielo para evitar la degradación de la biomasa y el manejo seguro del hidrolizado. 
Una vez frías se separó el líquido del sólido por filtración al vacío en papel 
Whatman n° 1. El papel filtro se pesó previamente. El sólido se lavó tres veces 
con 10 ml de agua bidestilada cada vez. 
El volumen del hidrolizado recolectado se anotó. Posteriormente, éste se 
neutralizó (pH 6-7) usando Na2CO3 20% (w/v), midiendo el volumen resultante 
después de neutralizado. Para medir el pH se utilizó un potenciómetro Hanna pH 
211. En este filtrado neutralizado se cuantificó la xilosa y la glucosa. 
Los resultados de la cuantificación de xilosa en cada tratamiento se utilizaron para 
calcular los coeficientes de regresión indicados en el método de Box-Wilson, y así 
obtener las variaciones que hay que aplicar a cada variable independiente para 
alcanzar su valor ideal. De acuerdo a los cálculos realizados se obtuvieron los 
nuevos valores de las variables independientes (Tabla 2.3). 
Tabla 2.3 Nuevos valores de condiciones de hidrólisis 
 
T(°C) t (min) [H2SO4] Masa (g) ml H2SO4 
132 20.6 1.5 0.5 5 
135 21.4 1.5 0.5 5 
 
Estos experimentos se realizaron por triplicado, siguiendo la metodología descrita 
anteriormente. 
Con la finalidad de contar con suficiente hidrolizado ácido de olote, para una 
posterior fermentación, se realizó un experimento en condiciones basales, 
utilizando 20 g de biomasa y 200 ml de H2SO4. Este hidrolizado se filtró en 
condiciones estériles y se congeló hasta su utilización. 
 
 
35 
 
2.2.4 Cuantificación de hidroximetilfurfural y furfural 
Estos compuestos fueron detectados y cuantificados por dos métodos: Uno 
cromatográfico y el otro espectrofotométrico. El primero tiene la ventaja que los 
separa y los cuantifica independientemente pero otros compuestos como la lignina 
soluble interfieren en la medición. El segundo aunque no los cuantifica por 
separado, la mezcla de los diversos compuestos inhibidores (furfural, 
hidroximetilfurfural, lignina soluble, etc.) no afecta en la medición de los mismos. 
Método cromatográfico 
El sistema de HPLC estaba equipado con una columna Waters de fase reversa 
(WAT046980), un detector de UV y un horno de columna. La columna y el detector 
se estabilizaron a una temperatura de 30 °C con una fase móvil de agua-metanol 
(85:15) y un flujo de 0.5 ml/min. 
Para la cuantificación se construyó una curva patrón de cada compuesto, con las 
siguientes concentraciones: 0.4, 0.2, 0.05 y 0.03 (mg/ml). El furfural se leyó a 277 
nm y el hidroximetilfurfural a 285 nm. 
Las muestras de la curva patrón, así como las de los hidrolizados se filtraron por 
filtros de 0.45 micras, antes de inyectarse en la columna. Los hidrolizados se 
cuantificaron tanto a 277 nm como a 285 nm. 
Método espectrofotométrico 
 En este método ambas moléculas se cuantificaron como furfural. Las muestras 
del hidrolizado se diluyeron 1:100. De estas diluciones se transfirió 1 ml a celdas 
de cuarzo y se leyeron a 277 nm. El blanco del equipo se ajustó con agua. Para 
calcular la concentración de furfural en cada muestra se utilizó un coeficiente de 
extinción molar de 16800 M-1. 
 
36 
 
2.2.5 Método de crecimiento de levadura 
Se utilizaron dos métodos de crecimiento para la levadura Pichia spitis (ATCC 
58785), ambos medios de YPD uno líquido y otro sólido en Agar. 
Crecimiento en medio líquido YPD 
Este método se utilizó para el crecimiento inicial de la levadura, la cual se 
encontraba guardada en estado de latencia por refrigeración, para comprobar que 
esta cepa aun estaba viable, se sembraron en medio YPD. 
Para esto se prepararon 325 ml de medio YPD en un vaso de precipitado de 250 
ml. Se adicionaron 200 ml de agua bidestilada y se colocaron en una parrilla con 
agitación una barra magnética para mezclar los materiales homogéneamente. Se 
agregaron 6.5 g de dextrosa, 3.25 de extracto de levadura y 6.5 g de peptona, se 
esperó hasta que se disolvieron completamente. Una vez disuelto todo se midió el 
pH con un potenciómetro y se ajusto el PH a 5.6 con NaOH 4 M, en caso de que 
fuera ácido, o con HCl 4M si era básico. Con el pH ajustado se pasó a una probeta 
de 500 ml y se ajusto el nivel hasta 325 ml con agua bidestilada. Posteriormente, 
se agitó hasta obtener la homogenización. En 3 matraces de 250 ml se colocó 100 
ml de la solución en cada uno y se taparon con papel aluminio para esterilizar 
durante 15 minutos en la autoclave a 9.65 kPa (1.4 psi). Una vez esterilizado se 
puso en refrigeración. 
De un matraz se tomaron 40 ml y se colocaron en 2 tubos de ensayo 20 ml en 
cada uno de la solución. Se tomó un poco de levadura que se encontraba en 
refrigeración y se colocó en los tubos de ensayo para su crecimiento, y se 
incubaron durante 72 horas a 200 rpm a 37°C. Una vez pasado ese tiempo se 
tomaron 2 muestras de cada tubo de ensaye en tubos Eppendorf y se puso a 
centrifugación pesando el precipitado. Se comprobó el crecimiento de la levadura 
por gravimetría del precipitado (la levadura) y por un conteo de levaduras totales 
por microscopio. Una vez comprobado el crecimiento se guardaron los matraces y 
tubos de ensayo en refrigeración. 
37 
 
Crecimiento en medio YPD en Agar 
Este método se empleó para hacer crecer colonias de la levadura obtenidas en el 
caldo del método anterior. 
En un matraz de 500 ml se vertió 200 ml de agua bidestilada y se colocó en una 
parrilla con agitación una barra magnética para mezclar los materiales 
homogéneamente. Se agregó 2 g de extracto de levadura, 4 g de peptona, 4 g de 
dextrosa y 3 g de Agar. Se pusieron en agitación con calentamiento a temperatura 
media y se esperó a que empezara el primer hervor. Una vez disueltos 
completamente y con el primer hervor, se introdujo el frasco tapado al autoclave 
durante 30 minutos a una presión de 89.63 kPa (1.3 psi). Terminado la 
esterilización se sacaron los matraces y se dejaron enfriar hasta 50°C. Una vez 
alcanzada esta temperatura, se vació 30 ml del medio a cajas estériles (cuatro en 
total) y se colocaron en refrigeración previamente selladas. 
Para sembrar la levadura en las placas se dividió en cuatro partes cada placa y se 
sembró en cada cuarto el inóculo tomado de los cultivos crecidos en el medio 
líquido. Se introdujo el asa de siembra (previamente esterilizada) en el tubo con el 
cultivo y se tomó una gota del inóculo que se extendió sobre el agar de la placa, 
deslizando el asa en la superficie en zig-zag. Se repitió la operación hasta que se 
sembró la levadura en todas las placas. Posteriormente, se dejó en un horno a 
30°C durante 7 días para el crecimiento de la levadura. 
 
2.2.6 Fermentación de la xilosa 
Una vez que crecieron las colonias de levadura dentro del medio con Agar se 
prepararon 3 experimentos por duplicado. Para el primer experimento se preparó 
un medio de xilosa pura, en el segundo se utilizó un hidrolizado donde éste fue 
tratado con carbón activado para disminuir o eliminar los inhibidores20 y, en el 
último, se utilizó un hidrolizado donde se mantuvieron los inhibidores en el 
38 
 
hidrolizado. Los tres medios contenían la misma concentración de xilosa, 17 mg 
de xilosa/ml. 
Se tomaron tres colonias de los medios de YPD en Agar, para cada uno de los 
medios de cultivo antes descritos. El crecimiento de la levadura se incubó a una 
temperatura de 30°C, durante 72 horas con una agitación de 200 revoluciones por 
minuto. Después se midió el crecimiento de las levaduras en los medios, por 
centrifugación y gravimetría del precipitado, en alícuotas de 1 ml. 
 
39 
 
Capítulo 3 
Resultados y discusión 
 
3.1 Composición química del olote 
El contenido de humedad, azúcares y lignina fueron determinados en harina de 
olote demaíz. Las siguientes proporciones de cada uno de estos componentes se 
muestran en la tabla 3.1. 
Tabla 3.1 Composición Química de Olote de maíz 
 
Componente Hidrolizado ácido [mg/g] 
Humedad 4.82 ± 3.50 
Glucosa 352.33 ± 25.38 
Xilosa 368.54 ± 42.63 
*Arabinosa 92.21 ± 10.55 
Lignina 149.53 ± 3.50 
Recuperación de biomasa % 92.60 ± 3.34 
*Calculada de acuerdo a la composición química reportada para el arabino-xilano 
de olote de maíz24,25 
 
El contenido de pentosas (xilosa más arabinosa) fue 24 % mayor que el de 
glucosa. Debido a que el olote es utilizado principalmente como forraje26,27 la 
composición química del olote se reporta de acuerdo a los polisacáridos que la 
forman27,20,21. Debido a lo anterior, los azúcares en la Tabla 3.1 se transformaron 
en polisacáridos utilizando el factor de 0.9 (162/180) para las hexosas y de 0.88 
(132/150) para las pentosas. Estos factores provienen de la relación entre el peso 
molecular que el residuo presenta en el polímero y el que adquiere cuando se 
libera como monómero. Los resultados de estos cálculos se muestran en la tabla 
3.2. 
 
40 
 
Tabla 3.2 Comparación del contenido de polisacáridos y lignina del olote del 
presente estudio con datos reportados por otros autores. 
 
Componente (%) Olote* 
Garrote et al., 
(2007)28 
Rivas et al., 
(2004)29 
Thompson 
(1995)30 
Celulosa 31.7 31.1 39.0 33.7- 41.2 
Hemicelulosa 40.5 34.3 34.3 30.0 - 41.7 
Lignina 14.9 18.8 14.4 4.5 -15.9 
*Este trabajo. 
El contenido de cada uno de los componentes estructurales del olote utilizado en 
este trabajo fue similar a lo reportado por otros investigadores (Garrote et al. 2007; 
Rivas et al. 2004; Thompson1995)28,29,30. Se presentó casi un 15 % de pérdida de 
la biomasa inicial en el presente trabajo (Tabla 3.2), esto podría deberse a los 
componentes que no fueron cuantificados como las cenizas, el contenido de 
humedad y los compuestos insolubles en agua. En algunos reportes, la suma de 
éstos llega a ser hasta de un 10 %.21 
3.2 Determinación de las mejores condiciones de la hidrólisis de olote 
 
3.2.1 Determinación de la relación líquido: sólido, para la hidrólisis de la 
hemicelulosa 
Para determinar la mejor relación líquido:sólido (L:S) y para lograr una adecuada 
hidrólisis de la hemicelulosa del olote, se realizaron experimentos de hidrólisis 
ácida con relaciones variables de líquido a sólido. Las relaciones utilizadas fueron 
de 8:1, 10:1 y 12:1, cada experimento se realizó por duplicado. 
Tabla 3.3 Contenido de diversos azúcares en el hidrolizado ácido de la 
biomasa, cuantificados por HPLC 
 
Relación L:S 
Glucosa 
(mg/g) 
Xilosa 
(mg/g) 
Arabinosa 
(mg/g) 
Azúcares 
(mg/g) 
 8:1 34.21 272.57 32.87 339.65 
10:1 28.57 258.58 33.28 320.43 
12:1 30.50 272.72 34.62 303.22 
 
41 
 
Para determinar la composición del hidrolizado este fue fraccionado por HPLC 
para cuantificar los azúcares presentes (Ver anexo 2). 
Se obtuvo una mayor cantidad de xilosa en las relaciones L:S de 8:1 y 12:1, pero 
se escogió la relación 10:1. Se eligió esta relación porque a comparación de la 
relación L:S de 8:1, el volumen del ácido cubría mejor el volumen de la biomasa, 
además que la glucosa interfiere con la fermentación de xilosa, por lo que se 
requiere una menor producción de glucosa en el hidrolizado31,32. Aunque la 
relación 12:1 muestra una mayor obtención de xilosa con una relativa baja 
producción de glucosa, esta producción no es tan significativa a comparación de la 
relación L:S 10:1, además de que la relación 12:1 produciría una mayor cantidad 
de inhibidores los cuales interfieren con el crecimiento de las levaduras 
fermentadoras, debido a esto la relación L:S de 10:1 fue la opción electa. Esta 
relación de 10:1 (L:S) fue utilizada como la mejor opción de la hidrólisis en los 
experimentos posteriores. 
 
3.2.2 Determinación de las condiciones de hidrólisis de la biomasa por el 
método Box-Wilson 
Como se explicó en la sección de material y métodos, se realizaron 9 tratamientos, 
en uno de ellos se exploraron las condiciones basales. En los 8 tratamientos 
restantes, se utilizaron el menor y el mayor valor de las variables (Tabla 2.1) 
propuestos para la elección de las mejores condiciones de hidrólisis del xilano del 
olote. Cada uno de los tratamientos fue realizado por triplicado. 
Inicialmente, los experimentos de hidrólisis a 120°C se realizaron en autoclave y 
aunque las especificaciones del equipo indicaban que la temperatura de 140 °C 
también podía ser alcanzada, el control de la misma no fue adecuado, esta 
temperatura (140 °C) no fue alcanzada y el control de la temperatura máxima 
alcanzada fue inestable proporcionando una inexacta lectura de las condiciones 
42 
 
de la temperatura de reacción. Finalmente, los experimentos se realizaron en un 
baño de aceite por el mejor control de temperatura. 
En la Tabla 3.4, se observa que en los tratamientos que se sometieron a una 
temperatura de 140°C (los tratamientos del 1 al 4) se produjo una mayor cantidad 
de azúcares totales, en comparación con los tratamientos realizados a menor 
temperatura (120°C, tratamientos del 5 al 8). 
Tabla 3.4 Componentes analizados mediante cromatografía. (Promedio de 
componentes de los experimentos por triplicado) 
 
[mg de Componentes / g de biomasa] 
Tratamiento Xilosa Glucosa Arabinosa Inhibidores 
1 235.67 5.2175 12.1031 5.7146 
2 249.10 9.6976 13.3549 8.9178 
3 262.59 10.5000 13.9412 8.7676 
4 250.82 12.5361 15.1679 8.1877 
5 142.72 0.5747 6.9412 3.8254 
6 202.97 2.2041 14.1608 4.3706 
7 192.89 1.4368 9.1201 3.9243 
8 218.25 3.6577 9.9034 5.0819 
Basal 202.99 3.6856 7.7220 4.6018 
De acuerdo con la composición química del olote (Tabla 3.1) la recuperación de 
xilosa en las condiciones basales fue de solo 60 % del total (Tabla 3.4, renglón 1). 
Mientras que el mejor rendimiento de xilosa, 96 %, fue el obtenido con el 
tratamiento tres de la Tabla 3.4 (3° renglón, con condiciones de reacción de 
140°C, 14 minutos y ácido sulfúrico al 2 % v/v), aunque la cantidad de inhibidores 
en este último fue un 52.6 % mayor que en el tratamiento basal (Tabla 3.4). 
Debido a que al método utilizado para la cuantificación de los inhibidores fue la 
absorción del hidrolizado en el UV, estos inhibidores comprenden lignina, o sus 
componentes, solubilizada durante el tratamiento, así como el furfural y el 
metilfurfural. Estos últimos se forman por deshidratación tanto de las pentosas, 
especialmente de xilosa, y de la glucosa respectivamente durante la hidrólisis de 
la biomasa34. 
43 
 
En la Tabla 3.5 se expresa el diagrama de la matriz del diseño 23 con los 
resultados promedio de los tratamientos realizados. Estos datos fueron usados 
para realizar la optimización estadística por el método Box-Wilson22 y poder 
determinar las condiciones de los nuevos tratamientos. 
Tabla 3.5. Diagrama de diseño factorial completo 
Método Box-Wilson 
Tratamientos Variables* mg de xilosa 
(promedio) T (°C) t (min) [H2SO4] 
1 + + + 235.6707 
2 + - - 249.1055 
3 + - + 262.5906 
4 + + - 250.8239 
5 - - - 142.7200 
6 - - + 202.9714 
7 - + - 192.8921 
8 - + + 218.2564 
* En el diagrama anterior los símbolos “+” representan el valor máximo o nivel 
superior, los símbolos “-“, representan el valor mínimo o nivel inferior, determinados en 
la Tabla 2.1. Cada uno de los tratamientos representa la combinación entre los valores 
máximos y mínimos de las tres variables para determinar los experimentos necesarios 
y también se muestran los mg de xilosa producidos por cada tratamiento. 
Con el cálculo de las unidades de variación o coeficientes, se determinó cuánto se 
pueden variar las condiciones de reacción, para obtener un mayor rendimiento de 
xilosa. 
Tabla 3.6 Determinación de medios en condiciones de reacción mejoradas 
 
Temperatura (°C) Tiempo (min) [H2SO4] (%(w/v)) 
Basal 130 20 1.500 
U. de variación 1 0.1 0.017 
Medio 9 132 20.6 1.500