Purificacion-e-inmovilizacion-de-la-endoinulinasa-NOVO-960-por-atrapamiento-en-geles-de-PVA-PEG

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PURIFICACIÓN E INMOVILIZACIÓN DE LA ENDOINULINASA (NOVO 
960) POR ATRAPAMIENTO EN GELES DE PVA-PEG 
 
 
 
 
 
TESIS 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
 
INGENIERA QUÍMICA 
 
 
 
 
 
PRESENTA 
 
NATALY MIROSLAVA FRÍAS IERÁN 
 
 
 
 
 
CIUDAD UNIVERSITARIA, CD. MX., 2018 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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1 
 
 
 
JURADO ASIGNADO 
 
PRESIDENTE: EDUARDO BÁRZANA GARCÍA 
VOCAL: MIREYA RODRÍGUEZ PENAGOS 
SECRETARIO: CARMINA MONTIEL PACHECO 
1er. SUPLENTE: FRANCISCA MORAYNA GUTIÉRREZ LUNA 
2do. SUPLENTE: SARA MARGARITA GARZA AGUILAR 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: LABORATORIO 314, EDIFICIO E, 
FACULTAD DE QUÍMICA, UNAM 
 
ASESOR DE TEMA: 
 
Dra. CARMINA MONTIEL PACHECO 
 
ASESOR TÉCNICO 
 
Q.A. JONATHAN TRAPALA REYNA 
 
SUSTANTE: 
 
NATALY MIROSLAVA FRÍAS IERÁN 
2 
 
Agradezco el financiamiento otorgado para la realización de este trabajo a: 
 
CONACyT proyecto CB 2011/167507 
DGAPA proyecto PAPIIT IA204415 
FACULTA DE QUIMICA PAIP 5000-9153 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 
 
 
Abreviaturas .............................................................................................. 6 
RESUMEN ................................................................................................... 7 
1. ANTECEDENTES .................................................................................. 9 
1.1 Fructanos ............................................................................................ 9 
1.2 Inulina ................................................................................................ 12 
1.2.1 Inulina de achicoria ..................................................................... 12 
1.2.2 Producción industrial de inulina. .................................................. 13 
1.3 Fructooligosacáridos (FOS) .............................................................. 14 
1.4 Inulinasas .......................................................................................... 16 
1.4.1 Producción de inulinasas............................................................. 18 
1.5 Purificación de proteínas ................................................................... 19 
1.5.1 Cromatografía ............................................................................. 19 
1.5.1.1 Cromatografía de intercambio iónico ........................................ 20 
1.5.1.3 Cromatografía por exclusión molecular .................................... 20 
1.6 Inmovilización de enzimas ................................................................ 21 
1.6.1 Inmovilización química ................................................................. 22 
1.6.1.1 Unión covalente ...................................................................... 22 
1.6.1.2 Entrecruzamiento ................................................................... 22 
1.6.2 Inmovilización física ..................................................................... 22 
1.6.2.1 Adsorción ................................................................................. 22 
1.6.2.2 Atrapamiento .......................................................................... 23 
1.5.4 Criogel PVA-PEG ........................................................................ 24 
4 
 
2. HIPÓTESIS ............................................................................................ 26 
3. OBJETIVOS ........................................................................................... 26 
3.1 Objetivo general ................................................................................ 26 
3.2 Objetivos particulares ........................................................................ 26 
4. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................. 27 
4.1 Determinación de la actividad enzimática ......................................... 27 
4.2 Cuantificación de azúcares reductores por DNS .............................. 27 
4.3 Efecto de la temperatura y pH sobre la actividad enzimática ........... 28 
4.4 Identificación de los productos por TLC ............................................ 28 
4.5 Diálisis de la mezcla de enzimas Novo 960 ...................................... 28 
4.6 Purificación por intercambio aniónico ................................................ 29 
4.7 Purificación por exclusión molecular ................................................. 29 
4.8 Cuantificación de proteína ................................................................. 29 
4.9 Seguimiento de la pureza de la proteína por SDS-PAGE ................. 29 
4.10 Inmovilización de la endoinulinasa por atrapamiento ...................... 30 
4.11 Actividad de la enzima inmovilizada ................................................ 31 
4.12 Evaluación de ciclos de reúso ..................................................... 31 
4.13 Evaluación de la estabilidad térmica y desprendimiento de la enzima
 31 
5 
 
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .............................................................. 32 
5.1 Efecto de la temperatura sobre la actividad de la enzima NOVO 960
 32 
5.2 Efecto del pH sobre la actividad de NOVO 960. ............................... 33 
5.3 Purificación de la enzima .................................................................. 34 
5.4 Diálisis ............................................................................................... 34 
5.5 Cromatografía por intercambio aniónico ........................................... 35 
5.6 Exclusión molecular .......................................................................... 38 
5.7 Tabla de purificación ......................................................................... 40 
5.8 Gel SDS-PAGE ................................................................................. 40 
5.9 Inmovilización .................................................................................... 41 
5.10 Comparación de la actividad de la enzima libre con la enzima 
inmovilizada ............................................................................................ 42 
5.11 Cromatografía por capa fina ............................................................ 43 
5.12 Ciclos de reúso................................................................................ 44 
6. CONCLUSIONES .................................................................................. 45 
Perspectivas y sugerencias para trabajo a futuro ................................... 46 
7.BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................... 47 
 
6 
 
Abreviaturas 
 
 
FOS 
PEG 
PVA 
A.R 
1-SST 
1FFT 
6SFT 
G6-FFT 
DEAE 
SDS-PAGE 
TLC 
DNS 
M3 
M4 
M5 
M6 
M7 
FRU 
SACA 
CI 
CN 
MP 
NOVO 
D 
INT 
Frutooligosacáridos 
Polietilenglicol 
Alcohol polivínilico 
Azúcares reductores 
Sacarosa 1-fructosiltransferasa 
Fructano fructosiltransferasa 
Fructano 6-fructotransfersas 
Fructano 6G-fructosiltransferasa 
Diethylaminoethanol 
Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide 
THIN LAYER CHROMATOGRAPHY 
Dinitrosalicylic 
Maltotriosa 
Maltotetrosa 
Maltopentosa 
Maltohexosa 
MaltoheptosaFructosa 
Sacarosa 
Control de inulina 
Control NOVO 
Marcador de pesos moleculares 
Mezcla de enzimas NOVO 960 
Diálisis 
Purificación por intercambio aniónico 
7 
 
 
RESUMEN 
Los fructooligosacáridos (FOS) son importantes en la industria alimenticia por sus 
aplicaciones como prebióticos, edulcorantes, modificadores de textura, entre otros. 
Pueden obtenerse a partir de la hidrólisis química de la inulina de achicoria. Sin embargo, 
estas reacciones usan ácidos y altas temperaturas generando subproductos no 
deseados y además el producto requiere de su posterior purificación. La hidrólisis 
enzimática representa una alternativa debido a que no genera subproductos y además 
no requiere las condiciones drásticas antes mencionadas. Para llevarla a cabo el pH y la 
temperatura que se utilizan son relativamente suaves (50ºC y pH 5). 
En la naturaleza, existen cinco tipos de fructanos: inulina, levana, mezclas de fructanos 
ramificados, neoseries de inulina, y neoseries de levana. Los fructanos son derivados de 
la molécula de sacarosa (glucosa y fructosa), provienen de las plantas y están 
constituídos por diferentes ramificaciones y longitudes de cadena. A los fructanos con un 
grado de polimerización de 2 a 10, se les conoce como FOS. 
La inulina es un biopolímero de fructosa unido a una glucosa terminal por enlaces β (2-
1) en el carbono 1 de la glucosa. Es usada para la producción de fructosa y FOS. En 
particular, los FOS son prebióticos que tienen una serie de beneficios para la salud, como 
son: la biodisponibilidad de los minerales, previene la carcinogénesis del colon, entre 
otros. 
Las inulinasas son enzimas de la familia de las fructosilhidrolasas que hidrolizan los 
enlaces β (2-1) y existen dos tipos: la exoinulinasa y endoinulinasa. La primera hiodroliza 
8 
 
los enlaces en los extremos de la inulina produciendo fructosa, mientras que la 
endoinulinasa rompe enlaces intermedios produciendo FOS de diferentes tamaños. 
La inmovilización de enzimas, ya sea física o química en soportes de diferente naturaleza 
(orgánica o inorgánica), permite recuperarlas y reutilizarlas, y en ocasiones estabilizarlas 
frente a la temperatura y pH. Uno de los métodos de inmovilización es el atrapamiento, 
consiste en retener a la enzima en las cavidades interiores de una matriz porosa, en este 
caso de polivinil alcohol-polietilenglicol (PVA-PEG). Esta técnica requiere poca cantidad 
de enzima, además de que la enzima no sufre ninguna alteración en su estructura. Al 
inmovilizar a la endo-inulinasa, se obtendrá un biocatalizador que además de poder 
reusarse, será estable. 
Los objetivos del presente trabajo son: estudiar el comportamiento de la mezcla 
comercial exo- y endoinulinasa de Novozyme (Novo 960) a diferentes valores de pH y 
temperatura. Purificar a la endoinulinasa de la mezcla Novo 960 empleando técnicas 
cromatográficas para posteriormente inmovilizarla en diferentes proporciones de PVA-
PEG y finalmente caracterizar a los inmovilizados. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
9 
 
1. ANTECEDENTES 
 
1.1 Fructanos 
 
Los fructanos se encuentran en la naturaleza en varios alimentos como: cebolla, ajo, 
banana, alcachofa de Jerusalén y en algunos cereales, entre otros (Kaur & Gupta, 2002; 
Singh, et al., 2016b; Van Loo, et al., 1995). 
Son considerados como representantes típicos de los prebióticos, los cuales poseen un 
efecto bifidogénico comprobado en animales y humanos. Estos azúcares tienen un bajo 
contenido calórico y altas propiedades de fibra dietética soluble debido a que los enlaces 
β-fructosídicos no pueden ser hidrolizados por las enzimas digestivas en la parte superior 
de la vía gastrointestinal humana. Una vez en el colon, los fructanos son metabolizados 
selectivamente por bacterias residentes incluyendo bifidobacterias y lactobacilos que 
producen β-fructofuranosidasas. La proliferación de bifidobacterias da como resultado la 
exclusión competitiva de patógenos como Escherichia coli, Clostridium sp. y Salmonella 
sp. Además, los ácidos grasos de cadena corta y el ácido láctico producido por las 
bifidobacterias y los lactobacilos, aportan otros beneficios importantes para la salud 
como: la reducción del colesterol sérico, un aumento de la absorción de calcio y 
magnesio, la prevención del cáncer de colon y la producción de vitaminas B (Banguela 
& Hernández, 2006). 
1.1.2. Estructura química 
Los fructanos son derivados de la sacarosa, consisten en varias unidades de fructosa y 
una glucosa residual (Banguela & Hernández, 2006). Se clasifican dependiendo del tipo 
de enlace predominante y del tamaño de la cadena, entre estos se encuentran (Figura 
1): 
10 
 
• La inulina: consiste en materiales que poseen la mayoría o exclusivamente 
enlaces β (2-1) fructosil-fructosa. 
• La levana: cualquier material que contenga mayoritariamente o exclusivamente 
enlaces β (2-6) fructosil-fructosa. 
• El grupo ramificado: contiene enlaces β (2-1) y β (2-6) fructosil-fructosa en 
grandes cantidades (Benkeblia, 2013). 
• Las neoseries de inulina: contienen un residuo de fructosa tanto en el carbono 6 
como en el carbono 1 de la molécula de glucosa, produciendo un polímero con 
enlaces β (2-1) con residuos de fructosa enlazados en cada extremo de la 
molécula de la glucosa. (Suzuki, et al., 2013; Vijn et al., 1997) 
• Las neoseries de levana: son polímeros de sacarosa en donde predomina el 
enlace β (2-6) en cualquier extremo de la molécula de glucosa (Pavis et al., 2001; 
Vijn & Smeekens, 1999). 
 
Figura 1. Tipos de Fructanos. Modificada de: (Benkeblia, 2013). 
11 
 
Los fructanos pueden producirse de tres maneras (Rastall, 2010; Singh et al., 2016b): 
1. Extracción de plantas ricas en inulina como son: bulbos, raíces de achicoria, corazón 
de alcachofa, piña y raíces del agave. 
2. Por síntesis enzimática a partir de la sacarosa (Figura 2). Las fructosiltransferasas 
son las enzimas que llevan a cabo la síntesis de fructanos, éstas a su vez se dividen 
en cuatro, de acuerdo a su especificidad: 1-SST (sacarosa: sacarosa 1-
fructosiltransferasa), 1-FFT (fructano: fructano 6G-fructosiltransferasa), 6SFT 
(sacarosa: fructano 6-fructotransaferasa) y G6-FFT (fructano: fructano 6G-
fructosiltransferasa) (Spohner & Czermak, 2016). 
 
Figura 2. Síntesis enzimática de los fructanos a partir de la sacarosa. Modificada de: 
(Spohner & Czermak, 2016) 
 
3. Hidrólisis enzimática de la inulina usando endo- y exoinulinasas (Singh et al., 2017). 
12 
 
1.2 Inulina 
La inulina es un polifructano, que está constituido por moléculas de fructosa y una 
glucosa terminal, unidos por enlaces β (2-1) (Barclay et al, 2012; Mensink et al, 2015; 
Shoaib et al., 2016). 
La inulina actúa de manera similar a las fibras dietéticas y contribuye a mejorar las 
condiciones del sistema gastrointestinal como se ha explicado anteriormente. Otra de las 
aplicaciones que tiene la inulina es la farmacéutica, ya que al ser administrada de manera 
oral se dirige al colon para retrasar la absorción de fármacos en el estómago (Apolinário 
et al., 2014; Barclay et al., 2012). 
La inulina puede obtenerse de fuentes como: puerro, cebolla, ajo, espárragos, alcachofa 
de Jerusalén, dalia, achicoria y yacón, entre otros. 
1.2.1 Inulina de achicoria 
La achicoria (Cichorium intybus) es una planta perenne de la familia de las asteráceas 
que proviene de Europa (Taylor et al., 2001). Es de raíz profunda, única, cónica, gruesa 
y pivotante (Figura 3 A). En la raíz, la planta almacena los carbohidratos como fuente de 
reserva, en forma de inulina. La raíz puede contener del 15 al 20% de su peso seco de 
inulina (Shoaib et al., 2016). 
La inulina de achicoria es un fructano lineal compuesto de una mezcla de oligosacáridos 
y polisacáridos de fructosa unidos por enlaces β (2-1). El grado de polimerización que 
presentan estos compuestos va de 2 a 60 unidades, con un promedio de 12 (Figura 3 B) 
(Franck, 2006).13 
 
 
Figura 3.A. Raíces de achicoria. B. Molécula de la inulina. Tomada de: http://www.flordeplanta.com.ar/wp-
content/uploads/2014/09/achicoria-raiz.jpg 
1.2.2 Producción industrial de inulina. 
Comercialmente, la inulina es producida a partir de la achicoria, sin embargo, la dalia y 
la alcachofa de Jerusalén, también son utilizados por considerarse buenos productores 
de este compuesto. 
El proceso de extracción de inulina consiste en rebanar las raíces de achicoria, 
posteriormente, se calientan agua a una temperatura de 80-90°C, con lo que se obtiene 
el jugo de inulina de achicoria, para su posterior purificación. Esta purificación es 
realizada en tres pasos: preencalado, encalado y carbonatación. Después de estos 
pasos se filtra la inulina y se seca para obtener el polvo (Shoaib et al., 2016) (Figura 4). 
 
 
 
 
 
 
A B 
14 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Producción de la inulina. Modificada de Shoaib et al., 2016. 
 
1.3 Fructooligosacáridos (FOS) 
Los FOS son carbohidratos no digeribles que benefician al huésped estimulando 
selectivamente el crecimiento y/o actividad de bacterias en el colon (Ávila et al, 2011; 
Gibson & Roberfroid, 1995). 
Raíces de 
achicoria 
Rebanado de las raíces 
Calentamiento con 
agua a 80-90° C 
Preencalado 
Encalado 
Carbonatación 
Filtración 
Desmineralización 
Secado por 
aspersión 
Inulina en polvo 
15 
 
En la naturaleza son extensamente distribuidos en plantas y están presentes en 
monocotiledóneas, dicotiledóneas y algas verdes. Dependiendo del origen, los FOS y 
fructanos difieren en su peso molecular y estructura. 
Los FOS tienen un grado de polimerización menor o igual a 10 y debido a sus 
propiedades prebióticas, son considerados ingredientes importantes en la formulación 
de alimentos. Estos compuestos se pueden producir a través de una hidrólisis química 
parcial de la inulina de achicoria. Sin embargo, la producción empleando esta vía, genera 
subproductos no deseados, como el hidroximetil furfural, o bien una distribución de 
tamaños y pesos moleculares muy amplia. Los FOS también se pueden sintetizar vía 
enzimática usando sacarosa como sustrato y las enzimas fructosiltransferasas 
provenientes de hongos como catalizadores. Otro método de obtención de FOS es 
usando endoinulinasas, la acción hidrólitica de estas enzimas sobre los enlaces internos 
(2-1) de la molécula lineal de inulina, permite producir FOS bajo condiciones suaves de 
reacción (50ºC y pH 5) (Ávila-Fernández et al., 2011). 
La producción a escala industrial de FOS se realiza extrayéndolos de plantas. Sin 
embargo, este método no resulta económicamente viable, debido a los costos elevados 
y bajos rendimientos. También pueden producirse a partir de la glicosidación de la 
glucosa, pero esto es demasiado laborioso y costoso, además de bajo rendimiento. 
Estos procesos no son factibles para la producción de FOS. La producción enzimática 
resulta conveniente y de menor costo. Así, los FOS se producen enzimáticamente 
mediante la hidrólisis controlada de la inulina o a partir de la sacarosa usando 
fructosiltransferasas (Díez-Municio et al., 2013; Singh et al, 2016). 
16 
 
1.4 Inulinasas 
Las inulinasas pertenecen a la familia de las glucosilhidrolasas (GH32). En la figura 5 se 
muestra la estructura de la inulinasa de Aspergillus ficuum. La estructura tridimensional 
de estas enzimas está organizada principalmente por dos dominios. El primer dominio 
se encuentra en el extremo amino terminal y está constituido por cinco hojas beta que 
forman un β propela que está presente tanto en la familia GH32 como la GH38. El 
segundo dominio se le denomina β-sandwich, se encuentra en el extremo carboxilo 
terminal y está formado por dos hojas beta que solo se encuentra en la familia GH32 
(Figura 5). 
Las inulinasas hidrolizan los enlaces β (2-1) de la inulina, produciendo fructosa y FOS. 
Existen dos tipos de inulinasas: exoinulinasa y endoinulinasa. La exoinulinasa (EC 
3.8.1.80 Fructano β-fructosidasa) corta enlaces en los extremos no reductores de la 
inulina produciendo unidades de fructosa, mientras que la endoinulinasa (EC 3.2.1.7 β 
(2-1) -D-fructano-fructanohidrolasa), rompe a la inulina al interior para producir FOS de 
diferente tamaño de cadena (Figura. 6) (Singh et al., 2017). 
Las inulinasas han sido caracterizadas a partir de tejidos de plantas y una gran cantidad 
de microorganismos (hongos y bacterias) (Tabla 1), siendo los microorganismos los 
mayores productores de estas enzimas. (Singh & Singh, 2010). 
17 
 
 
Figura 5. Modelo de la endoinulinasa de A. ficuum Modificada de (Pouyez et al., 2012). 
 
 
 
Figura 6. Reacción de las enzimas endoinulinasa y exoinulinasa. Tomada de: (Singh et al., 2017). 
 
18 
 
1.4.1 Producción de inulinasas 
Las inulinasas tanto las exo como las endo, pueden ser producidas por bacterias, hongos 
y levaduras. Algunos ejemplos se pueden observar en la tabla 1. 
Los hongos son los mayores productores de inulinasas (Gráfica 1), entre ellos destacan 
Aspergillus sp y Penicillium sp como buenos productores de endoinulinasas (Singh et al., 
2016). Mientras que Kluyveromyces marxianus y Pichia guillermondii son entre las 
levaduras, las mejores en la producción de exoinulinasas. (Rawat et al, 2016). 
Tabla 1. Microorganismos productores de las inulinasas. Modificada de Chi et al, 2009). 
 
Inulinasas Microorganismos 
productores 
Actividad inulinasa 
Exo- C.aureus G7a 85 ± 1.1 U/mL 
Exo- P. guilliermondii 61.5 ± U/mL 
Exo- Mutant M-30 P. guilliermondii 127.7 ± 0.6 U/mL 
Exo- K marxianus (A1-A2) menor que 32 U/mL 
Exo- K marxianus ATCC 16045 121 U/mL 
Exo- Kluyveromyces sp. Y-85 59.5 U/mL 
Exo- K. marxianus YS-1 55.4 U/mL 
Exo- K. marxianus var. Bulgaricus 107 U/mL 
Exo- K. marxianus NRRL Y-7571 391 U/g peso seco de bagazo 
fermentado 
Exo- Kluyveromyces S120 409.8 U/g peso seco inicial de 
sustrato 
Endo- Penicillium sp. TN-88 9.9 U/mL 
Exo- A. niger NK-126 55 U/mL 
19 
 
 
 
 
 
 
Gráfica 1. Producción de inulinasas a partir de hongos y de bacterias. Toma de Ram Sarup Singh et al., 
2017) 
1.5 Purificación de proteínas 
La purificación de proteínas tiene como objetivo asilar una determinada proteína con el 
mejor rendimiento posible. Además, el producto de la purificación, debe tener la máxima 
pureza, esto es, no estar contaminado con otras enzimas o macromoléculas. 
1.5.1 Cromatografía 
 
La cromatografía es una técnica que permite la separación de diferentes moléculas 
presentes en una mezcla. El método está basado en la distribución de las moléculas 
entre dos fases, una estacionaria y otra móvil (Real Academia Española, 2001). Existen 
diferentes tipos de cromatografías, que dependiendo de las propiedades (tamaño, punto 
isoeléctrico, hidrofobicidad o afinidad) de las sustancias a separar se pueden emplear en 
un proceso de purificación de proteínas. 
HONGOS
63%
BACTERIAS
37%
Exo- Streptomyces sp. GNDU 1 0.552 U/mL 
Exo- Staphylococccus sp 107.6 U/g pesos seco de sustrato 
fermentado 
20 
 
1.5.1.1 Cromatografía de intercambio iónico 
 
En este proceso de intercambio iónico, los iones que están unidos en forma electrostática 
a una matriz insoluble y químicamente inerte se reemplazan de manera reversible por 
los iones de la solución. Dependiendo del tipo de iones estas se pueden clasificar en 
intercambio catiónico e intercambio aniónico. 
Las resinas de intercambio aniónico son portadoras de grupos con cargas positivas que 
unen aniones de forma reversible, mientras que las resinas de intercambio catiónico unen 
a cationes. Para las proteínas con carga negativa se usa una resina con carga pasitiva, 
por ejemplo la resina DEAE- Sepharose (dietilaminoetil- sefarosa), mientras que para la 
de intercambio catiónico se usa una resina con carga negativa por ejemplo la resina de 
carboximetil celulosa. En el proceso de separación por intercambio iónicolas moléculas 
se mueven a través de la columna quedando unidas a la resina dependiendo de la fuerza 
de su unión y de la densidad de carga que tengan. De esta manera las moléculas con 
menos densidad de carga eluirán primero y las proteínas que quedan retenidas en la 
resina se eluirán haciendo pasar una solución con alta concentración de sal (aprox.1 M). 
1.5.1.3 Cromatografía por exclusión molecular 
La cromatografía de exclusión molecular (a menudo también llamada filtración en gel o 
de tamiz molecular) es una de las técnicas más sencillas empleada en la separación de 
proteínas y ácidos nucleicos (Arderiu, 1998). 
Cuando se hace pasar una mezcla de moléculas de distinto tamaño, a través de una 
columna de filtración en gel; aquellas moléculas con un tamaño mayor que el diámetro 
de los poros de las partículas, sólo podrán moverse en su camino a través de la fase 
estacionaria, en el espacio que queda entre las partículas; y, por lo tanto, no se verán 
21 
 
retrasadas en su descenso. En cambio, aquellas moléculas capaces de penetrar en las 
partículas se verán retrasadas por la fase estacionaria; cuanto menor sea su tamaño 
eluirán al final de la cromatografía. Por lo tanto, las moléculas eluyen en este tipo de 
cromatografía por orden decreciente de tamaño molecular (Arderiu, 1998). 
1.6 Inmovilización de enzimas 
Para mejorar los procesos enzimáticos, así como la estabilidad de las enzimas se han 
realizado por varios años investigaciones sobre metodologías que permitan el uso 
continuo y la recuperación del biocatalizador. En el proceso de inmovilización de enzimas 
se fijan, ya sea mediante interacciones electrostáticas o bien por enlaces químicos con 
un material inerte formando una fase sólida en el medio de reacción. La inmovilización 
enzimática presenta las siguientes ventajas y desventajas (Arroyo,1998). 
Ventajas: 
• Pueden incrementar la resistencia de la enzima frente a la posible 
desnaturalización por cambios de pH o de temperatura. 
• Posible reutilización del derivado, lo que disminuye los costos del proceso. 
• La posibilidad de diseñar un reactor enzimático de tipo lecho empacado y de fácil 
manejo y control, adaptado a la aplicación de la enzima inmovilizada. 
Desventajas: 
• Alteración de la conformación de la enzima respecto a su estado nativo. 
• La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir 
distintas fracciones de proteínas inmovilizadas con diferente número de uniones 
al soporte. 
• Siempre existe una pérdida de la actividad de la enzima durante la inmovilización. 
22 
 
• El biocatalizador es más caro que la enzima nativa. 
1.6.1 Inmovilización química 
 
1.6.1.1 Unión covalente 
 
Este método depende de la formación de un enlace covalente entre la enzima y el 
material usado como soporte. El enlace covalente formado entre la enzima y la matriz 
ocurre entre un aminoácido con carga neta como la histidina, arginina, ácido aspártico y 
especialmente lisinas y un grupo funcional como un grupo carboxilo, un imidazol, un 
indol, un fenol, un sulfhídrilo, un tiol o un hidroxilo (Sirisha et al, 2016). 
Debido a la unión soporte-enzima, el biocatalizador heterogéneo resultante es mucho 
más estable que una inmovilización física (Lalonde & Margolin, 2008). 
1.6.1.2 Entrecruzamiento 
 
Es un método irreversible que no requiere un soporte. La enzima actúa como su propio 
soporte, eliminando así las ventajas y desventajas que tiene la unión enzima-soporte. 
Técnicamente está basado en la formación de enlaces entre las moléculas de la enzima 
(Royhaila et al., 2015). 
1.6.2 Inmovilización física 
 
1.6.2.1 Adsorción 
 
La adsorción usa las interacciones físicas generadas entre el soporte y la enzima e 
incluyen fuerzas de Van der Walls, interacciones iónicas y puentes de hidrógeno. La 
unión es débil y, lo que es importante, no cambia la estructura de la enzima (Jesionowski 
et al, 2014) . Las enzimas adsorbidas están protegidas de la proteólisis y de la interacción 
con interfaces hidrofóbicas (Spahn & Minteer, 2008). Los factores que pueden influir en 
la adsorción son los siguientes: 
23 
 
1. El pH del medio de reacción, que influye en el número y la naturaleza de las 
cargas que presenta la superficie de la proteína y del soporte. 
2. La fuerza iónica que, al incrementarse produce la desorción de la enzima, 
porque los iones inorgánicos compiten con la proteína por la unión al soporte. 
3. El diámetro de poro y el área superficial específica del soporte. 
4. Tiempo de incubación durante la adsorción. 
5. Temperatura de adsorción. 
 
1.6.2.2 Atrapamiento 
 
Otro método de inmovilización de enzimas es el atrapamiento que consiste en la 
retención física de la enzima en las cavidades interiores de una matriz sólida porosa 
constituída generalmente por prepolímeros fotoentrucruzables o polímeros del tipo de 
poliacrilamida, colágeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano. El proceso de 
inmovilización se lleva a cabo mediante la suspensión de la enzima en una solución del 
monómero. Seguidamente se inicia la polimerización por un cambio de temperatura o 
mediante la adición de un reactivo químico. El atrapamiento puede ser en geles o en 
fibras, estas últimas que suelen ser más resistentes que los geles. En el primer caso, la 
enzima queda atrapada en el interior del gel, mientras que en el segundo caso la enzima 
se encuentra ocluida dentro de las micro cavidades de una fibra sintética. El atrapamiento 
es de gran sencillez desde el punto de vista experimental y requiere poca cantidad de 
enzima para obtener derivados activos. Como ventaja adicional, la enzima no sufre 
ninguna alteración en su estructura. De todas formas, el atrapamiento requiere un control 
riguroso de las condiciones de polimerización, así como la comprobación de que la 
24 
 
naturaleza química del proceso no altera los grupos reactivos de la proteína (Arroyo, 
1998). 
En la tabla 2 se presentan las ventajas y desventajas de los métodos de inmovilización. 
Tabla 2. Ventajas y desventajas de la inmovilización enzimática. 
Modificada de Lalonde & Margolin, 2008 
Método de 
inmovilización Ventajas Desventajas 
Adsorción 
Es un método 
simple Unión débil 
No hay 
modificación de la 
enzima 
Poca estabilización 
Es reversible Pocos problemas de transferencia de masa 
Poco costoso Unión no específica 
Unión covalente 
Unión firme Modificación química de la enzima 
Variedad de 
soportes 
Costoso y la actividad se ve 
afectada por el soporte 
Atrapamiento 
No hay 
modificación de la 
enzima 
Poca estabilización 
Procesamiento 
simple 
Problemas de transferencia 
de masa 
Entrecruzamiento 
Alta actividad 
volumétrica 
Modificación química de la 
enzima 
Compatible con 
temperaturas altas 
y solventes 
orgánicos 
Problemas de transferencia 
de masa 
Unión firme y no 
requiere soporte 
Poco control de las 
propiedades de las partículas 
 
1.5.4 Criogel PVA-PEG 
El gel de PVA-PEG (Alcohol Polivinílico-polietilenglicol) es un sistema macroporoso de 
redes interpenetradas estabilizadas por interacciones físicas (Figura 7). El gel de PVA-
PEG se obtiene de un proceso de ciclos de congelado y descongelado en el cual las 
condiciones para la formación de la estructura y la transición al gel son establecidas 
25 
 
mediante la introducción de polietilenglicol (Mentrangolo-Ruíz de Temiño et al., 2005). La 
finalidad de generar un gel de redes interpenetradas es mejorar las propiedades físicas, 
mecánicas y de estabilidad térmica del material. 
 
Figura 7. Estructura química del copolímero PVA-PEG. Tomado de: 
(Suhrenbrock et al, 2011) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
26 
 
2. HIPÓTESIS 
La purificación e inmovilización de la endoinulinasa de aspergillus niger (NOVO 960) en 
la matriz PVA-PEG permitirá obtener un biocatalizador estable y reutilizable capaz de 
hidrolizar a la inulina de achicoria para la producción de FOS. 
3.OBJETIVOS 
3.1 Objetivo general 
Obtener un biocatalizador estable y reutilizable de la endoinulinasa de la mezcla NOVO 
960 inmovilizada en matrices de PVA-PEG 
 
3.2 Objetivos particulares 
• Caracterizar a la enzima libre a partir de una mezcla comercial, para obtener las 
mejores condiciones de temperatura y pH para la síntesis enzimática de los FOS. 
• Purificar a la enzima endoinulinasa de una mezcla comercial NOVO 960 por medio 
de una cromatografía de intercambio aniónico y de una de exclusión molecular. 
• Inmovilizar a la endoinulinasa en las matrices PVA-PEG variando la relación de 
los polímeros. 
• Determinar el número de reusos de cada enzima inmovilizada. 
• Comparar la actividad enzimática entre la enzima libre y la inmovilizada. 
 
 
 
 
27 
 
4. MATERIALES Y MÉTODOS 
Los reactivos: Solución de Bradford, PEG PM. 1000, PVA PM. 61,000, fueron obtenidos 
de Sigma-Aldrich. 
El aceite de silicón de la marca CONQUIMEX, la mezcla de enzimas NOVO 960 
amablemente donada por NOVOZYME Brasil, ácido acético REPROQUIFIN, acetato de 
sodio, citrato de sodio y el fosfato de potasio dibásico proporcionados por JT BAKER, 
ácido cítrico MEYER, fosfato de potasio monobásico Mallinckrodt y cloruro de sodio. La 
inulina de achicoria fue donada amablemente por la compañía Orafti. 
Las cromatoplacas provenientes de Analytical Chromatography Alemania. 
4.1 Determinación de la actividad enzimática 
 
La actividad de la mezcla de inulinasas NOVO 960 se determinó en un volumen total 0.5 
mL. El medio de reacción contenía un buffer de acetatos pH 5 con una concentración de 
50 mM, inulina de 0.5% m/v, y se midió a 50ºC y 500 rpm de agitación. Para iniciar la 
reacción se agregaron 5 μL de enzima, posteriormente la reacción se detuvo a los 20 
min mediante calentamiento a 90ºC; los productos de reacción se cuantificaron mediante 
la técnica de DNS. 
4.2 Cuantificación de azúcares reductores por DNS 
 
La determinación de la concentración de azúcares reductores (FOS y fructosa) se realizó 
por el método de DNS. En tubos de ensayo se agregaron 0.1 mL de muestra, 0.2 mL de 
buffer de acetatos 50 mM pH 5 y 0.6 mL de reactivo DNS. Los tubos se colocaron en un 
baño maría a 90 °C por 5 min, posteriormente se colocaron en hielo 20 min para detener 
la reacción. Se agregaron 4 mL de agua y se midió la absorbancia en espectrofotómetro 
28 
 
Genesys 10S UV-Vis Thermo a una longitud de onda de 540 nm, con un blanco de buffer 
de acetatos 50 mM pH 5. 
4.3 Efecto de la temperatura y pH sobre la actividad enzimática 
 
Se estudio el efecto de diferentes valores de pH (3, 4, 5, 7 y 10) y de temperatura (30, 
45, 50, 55 y 65 °C) sobre la actividad de la mezcla de inulinasas 960. Para evaluar el 
efecto del pH las reacciones se llevaron a cabo en un volumen total de 0.5 mL y con un 
tiempo de reacción de 20 min, en una solución de inulina 0.5% m/v, a una temperatura 
50ºC, mientras que para evaluar el efecto de la temperatura se empleó el valor al cual se 
presenta mayor actividad, que fue de 5. La reacción se inició con la adición de 5μL de la 
mezcla de enzima. Los efectos de temperatura y de pH se evaluaron con la producción 
de azúcares reductores en la reacción de hidrólisis. 
4.4 Identificación de los productos por TLC 
 
Los productos de reacción se identificaron mediante cromatografía de capa fina (TLC por 
sus siglas en inglés). Para llevar a cabo las TLC, se emplearon cromatoplacas 
comerciales como fase estacionaria, mientras que como fase móvil (eluyente) se usó una 
mezcla de butanol-metanol-agua (3:2:1). Para revelar los productos de reacción, así 
como la inulina que no reaccionó, se usó una solución de orcinol en ácido sulfúrico al 5% 
aplicándola con un aspersor y calentado la TLC en una parrilla hasta la aparición de los 
productos. 
4.5 Diálisis de la mezcla de enzimas Novo 960 
 
Con la finalidad de eliminar el glicerol y sales con las que se protege la mezcla de 
enzimas, se realizó una diálisis por 24 h a 4ºC de 20 mL de enzima en 1L de amortiguador 
de fosfatos pH 5.0. Se empleó una membrana de 12000 Da. 
29 
 
4.6 Purificación por intercambio aniónico 
 
Para purificar la enzima se usó un equipo FPLC Purifier marca Äkta, equipado con una 
columna de intercambio aniónico (DEAE) de GE de 24 mL. Las condiciones de la 
columna que se usaron fueron: un buffer de fosfatos a pH 7.2, presión de 0.8 MPa y la 
detección a 280 nm. Se inyectaron 5 mL de la muestra previamente dializada, y la 
presencia de la enzima se detectó mediante su actividad sobre la inulina de achicoria. 
4.7 Purificación por exclusión molecular 
 
Se usó una columna de exclusión molecular (Superdex 200) de GE de 24 mL. Las 
condiciones de la columna que se usaron fueron: un buffer de fosfatos pH 7.2 50mM más 
0.5 M de NaCl. Se inyectaron 500 μL de solución y se operó a una presión de 1 MPa. 
4.8 Cuantificación de proteína 
 
Para cuantificar la cantidad de proteína en cada paso de purificación; diálisis, intercambio 
aniónico y exclusión molecular, se usó el método de Bradford. Se realizó una curva patrón 
con albúmina bovina sérica a partir de una solución stock de 0.1 mg BSA/mL. Para cada 
muestra se colocaron 500 μL de reactivo Bradford y 500 μL de muestra; se midió la 
absorbancia de las muestras en el espectrofotómetro a 590 nm y se usó como blanco 
agua. 
4.9 Seguimiento de la pureza de la proteína por SDS-PAGE 
 
Para dar seguimiento de la enzima en cada etapa de purificación se realizó una 
electroforesis SDS-PAGE. 
La electroforesis se llevó a cabo utilizando minigeles al 10% de acrilamida (Tabla 3), 
siguiendo la metodología reportada por Laemmli (Laemmli, 1970). Los geles fueron 
30 
 
preparados con 1.5 mm de espesor como se muestra posteriormente, utilizando una 
cámara electroforesis vertical (Mini-PROTEAN Tetra Cell System, BIO-RAD). Una vez 
preparados los geles, las muestras se cararon volúmenes de 40 L. La electroforesis se 
llevó a cabo a un voltaje constante de 100 volts, terminada la electroforesis, se 
desprendieron los geles de las placas y se tiñeron con azul de Coomasie R-250 al 0.1% 
en 50% de metanol y 10% de ácido acético durante 1 h a temperatura ambiente. Los 
geles fueron desteñidos con una solución metanol:ácido acético:agua (5:5:1). El peso 
molecular fue estimado comparando con un marcador de peso molecular (ColorBurst 
Electrophoresis Marker M.W. 8,000- 220,000, SIGMA). 
Tabla 3. Reactivos usados para la electroforesis. 
 
4.10 Inmovilización de la endoinulinasa por atrapamiento 
 
Se inmovilizó a la enzima en matrices de polietilenglicol y polivinilalcohol (PEG-PVA) de 
diferentes porcentajes. Primero se pesaron ambos reactivos 10-10%,10-15% y 15-10% 
m/v respectivamente, y se disolvieron en 20 mL de agua. La disolución se calentó a 90 
°C hasta que los reactivos se disolvieran completamente, evitando la formación de 
burbujas. Se disminuyó la temperatura hasta 40 °C paulatinamente y se agregó 1 mL de 
NaOH 7 M y se dejó reaccionando durante 30 min. Posteriormente se ajustó el pH de la 
31 
 
reacción hasta 5 para agregar 35 mg de endoinulinasa y se dejó mezclando durante 10 
min. La mezcla del copolímero se goteó en silicón a -70 °C, se almacenaron las partículas 
formadas a 8 °C durante 24 h, se lavaron una vez con hexanos para eliminar el aceite de 
silicón sobrante y dos veces con buffer de acetatos pH 5 50 mM. Se almacenaron para 
su posterior uso. 
4.11 Actividad de la enzima inmovilizada 
 
Se colocaron 5 esferas de biocatalizador (cada esfera contiene alrededor de 0.034 mg 
de enzima) en un Eppendorf con 0.5 mL de una disolución de inulina de achicoria (0.5% 
m/v) en buffer de acetatos pH 50 mM, la reacción se llevó a cabo a una temperatura de 
50ºC con una agitación de 500 rpm en un Thermomixer C marca Eppendorf y los 
azúcares reductores producto de la reacción se cuantificaron por DNS: 
4.12 Evaluación de ciclos de reúso 
 
Se evaluaron los ciclos de reúso con un mediode reacción de 0.5 mL de inulina a 0.5% 
(m/v) añadiendo 5 esferas de inmovilizado. La reacción tuvo una duración de 20 min, al 
término de los cuales se extrajo el medio de reacción, lavando con buffer de acetatos 
50mM y a pH 5 las esferas y agregando de nuevo 0.5 mL de inulina al 0.5% a 20 min al 
inmovilizado. Se realizaron 6 ciclos de reúso para cada inmovilizado. 
4.13 Evaluación de la estabilidad térmica y desprendimiento de la enzima 
Se colocaron 5 esferas de PVA-PEG en un Eppendorf con una solución de buffer de 
acetatos pH 50mM y se dejó agitando durante 24 h a 50°C. Posteriormente se midió el 
sobrenadante por el método de Bradford, se tomó 20μL del sobrenadante para realizar 
una reacción de hidrólisis enzimática de la inulina y se cuantificaron los productos por 
medio del método de DNS. 
32 
 
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
5.1 Efecto de la temperatura sobre la actividad de la enzima NOVO 960 
Se usó una curva patrón de azúcares reductores (A.R.) para determinar la cantidad de 
productos en cada experimento efectuado (gráfica 2). 
 
 
Gráfica 2. Curva patrón de azúcares reductores. 
 
Con la finalidad de establecer la mejor condición de temperatura para llevar a cabo la 
hidrólisis de la inulina de achicoria, se determinó la actividad de la enzima usando 
diferentes temperaturas (30ºC ,40°C, 50°C, 55°C y 65 °C) a un tiempo de 20 min. Los 
productos de la reacción se cuantificaron mediante los azúcares reductores producidos, 
por el método de DNS. 
y = 1.3016x + 0.0171
R² = 0.9968
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
A
b
s
conc. mg/mL de A.R.
33 
 
 
Gráfica 3. Caracterización de la enzima NOVO 960 a diferentes temperaturas. Condiciones de reacción: 
buffer de acetatos 50 mM pH 5, tiempo de reacción 20 minutos, volumen total de reacción 500L. La 
reacción se inició con 5 L de enzima 
 
Se observó (Gráfica 3) que la mejor temperatura de reacción era de 50ºC y que la enzima 
es activa a temperaturas menores a 50ºC, pero con un 55% menos de actividad. 
5.2 Efecto del pH sobre la actividad de NOVO 960. 
 
Una vez determinada la mejor temperatura a la cual se lleva a cabo la reacción y dado 
que la actividad enzimática también se ve afectada por el pH, se evaluó la actividad de 
la enzima a diferentes valores de pH (Gráfica 4). La producción de azúcares reductores 
se cuantificó por el método de DNS y con ayuda de una curva patrón de fructosa. 
0.0000
0.0020
0.0040
0.0060
0.0080
0.0100
0.0120
0.0140
30 40 50 55 65
m
g 
A
.R
/m
in
 
Temperatura (°C)
34 
 
 
Grafica 4. Caracterización de la enzima endoinulinasa a diferentes valores de pH. Condiciones de 
reacción: buffer de acetatos 50 mM temperatura 50°C, tiempo de reacción 20 minutos, volumen total de 
reacción 500L. La reacción se inició con 5 L de enzima 
 
Puede observarse que a pH 5 la enzima tiene una mayor producción de azúcares 
reductores y que la actividad decae notablemente a valores de pH diferentes a 5. 
Por lo anterior, para la mezcla de enzimas comerciales se seleccionó las mejores 
condiciones de reacción que fueron: temperatura 50°C y pH 5. 
5.3 Purificación de la enzima 
 
Dada la importancia de la producción de FOS en el mercado, el contar únicamente con 
una endoinulinasa, permite la producción únicamente de FOS. Por tal razón es de suma 
importancia separar a la exoinulinasa de la mezcla para poder realizar un estudio más 
detallado de la endoinulinasa. 
5.4 Diálisis 
Para iniciar la purificación de la endoinulinasa, el primer paso fue dializar la mezcla 
NOVO 960, ya que esta cuenta con una gran cantidad de glicerol y sales que pueden 
0.0000
0.0020
0.0040
0.0060
0.0080
0.0100
0.0120
0.0140
0.0160
3 4 5 7 10
m
g 
A
.R
 /
m
in
pH
35 
 
interferir en los pasos siguientes de la purificación. En la figura 8 se puede observar el 
proceso de diálisis. Se llevó a cabo durante 24 h con 2 cambios de buffer de acetatos pH 
5 50mM y a una temperatura de 4°C para evitar que la enzima se desnaturalice o pierda 
actividad. De este proceso de diálisis la enzima conservó el 100% de actividad y alcanzó 
una concentración de 0.030 mg/mL. 
 
Fig. 8 Diálisis de la proteína NOVO 960 
5.5 Cromatografía por intercambio aniónico 
 
El punto isoeléctrico es una las propiedades de las proteínas de gran utilidad para poder 
purificarlas. La endoinulinasa de Aspergilus niger, que se encuentra en la mezcla 
comercial de NOVO 960, tiene un punto isoeléctrico de 3-3.85 (Skowronek & Fiedurek, 
2006; Volkov et al., 2012). Este dato fue de gran utilidad para definir el uso de una 
columna de intercambio aniónico (DEAE Sepharose), cuya función es atraer las 
moléculas cargadas negativamente. Se empleó un pH de 7.2 con la finalidad de que la 
endoinulinasa tuviera carga negativa y que ésta pudiera unirse a la resina. La enzima se 
eluyó con un gradiente de concentración de NaCl. La endoinulinasa se obtuvo a una 
concentración del 20% m/v de NaCl (gráfica 5 línea verde). Además de observar el 
gradiente salino, en la gráfica 5 se puede ver el perfil de elución de la proteína (línea 
36 
 
azul). Para identificar la actividad endoinulinasa en cada una de las fracciones se realizó 
la hidrólisis, de la inulina de achicoria. Las fracciones que mostraron actividad estan en 
el intervalo de 36-38. 
 
 
Gráfica 5. Cromatograma de la purificación por intercambio aniónico 
Una vez obtenidas las fracciones que mostraron actividad hidrolítica sobre la inulina de 
achicoria, se identificaron los productos de la hidrólisis enzimática con la finalidad de 
definir qué enzima está en qué fracción. Para ello, se realizó una TLC (Figura 9B) en la 
cual se puede observar que la fracción 36 es donde se encuentra la endoinulinasa ya 
que la producción de FOS es mayor en esta fracción. En la figura 9A se muestra la TLC 
con estándares de Maltotriosa (M3), maltotetrosa (M4), maltopentosa (M5), maltohexosa 
(M6), maltoheptosa (M7), fructosa (FRU) y sacarosa (SACA) Figura 9A. Con esto 
podemos suponer que los productos de la reacción van de M3 a M5. 
36 37, 38 
Fracciones que presentaron 
actividad sobre inulina de achicoria 
 P
or
ce
nt
aj
e 
de
l 
gr
ad
ie
nt
e 
de
 s
al
 (N
aC
l) 
80% 
 
 
60% 
 
 
 
40% 
 
 
20% 
 
# de Fracción 
37 
 
 
Figura 9. A TLC de los estándares de Maltotriosa (M3), maltotetrosa (M4), maltopentosa (M5), 
maltohexosa (M6), maltoheptosa (M7), fructosa (FRU) y sacarosa (SACA). 
 B de izquierda a derecha se muestran: control de inulina(CI), control de NOVO 960 (CN), F.34, F.36 y 
F.36* (duplicado). 
 
Para cada una de las fracciones obtenidas se cuantificaron los azucares reductores 
presentes en la reacción por el método de DNS (tabla 4). Como se puede observar la 
fracción 36 es la que contiene una mayor cantidad de FOS. Cabe señalar que estos 
únicamente se cuantificaron como azúcares reductores. 
Tabla 4. Muestra la cantidad de azúcares reductores que se produce con las fracciones 34 y 36, en la 
cromatografía por intercambio aniónico. 
 
 
 
 
 
 
 
Fracción A.R mg/mL 
F.34 0.167 
F.36 0.189 
F.36* 0.187 
CI 0.057 
CN 0.267 
A B 
38 
 
5.6 Cromatografía de exclusión molecular 
 
Después de la purificación por intercambio aniónico, la endoinulinasa no se encontró 
pura como se puede observar en el gel SDS-PAGE de las fracciones obtenidas de esta 
cromatografía (Figura 10). 
Para eliminar las proteínas que contaminan la muestra y que pudieran tener la misma 
carga eléctrica que la endoinulinasa, se realizó una segunda purificación por exclusión 
molecular de la fracción de 36 obtenida en el intercambio aniónico, separando a la 
proteína por medio de su peso molecular de la enzima. 
 
 
Figura 10. Gel SDS-PAGE de la purificación por intercambio aniónico, de izq.-der. marcador de pesos 
moleculares (MP), enzima NOVO 960 (NOVO), diálisis (D) y la purificación por intercambio aniónico 
(INT). 
En la gráfica 6 semuestra el cromatograma obtenido de la cromatografía de exclusión 
molecular, donde se obtuvieron 3 fracciones (14,15 y 16) en las cuales podría 
encontrarse la endoinulinasa purificada. Además de estas fracciones, se obtuvieron 4 
más que no presentaron actividad inulinasa. 
 
kDa MP NOVO D INT 
250 
150 
100 
39 
 
 
Gráfica 6. Cromatograma de la purificación por exclusión molecular. 
 
Tabla 5. Medición de azucares reductores por el método de DNS para las fracciones obtenidas del 
método de exclusión molecular. 
 
DNS FOS mg/mL 
CI 0.054 
CN 0.245 
F10 0.041 
F14 0.079 
F19 0.047 
 
Al igual que en el caso del intercambio aniónico se realizaron mediciones de la actividad 
de la endoinulinasa para verificar que esta encontrara en la fracción 14. Para ello, se 
cuantifico la producción de azúcares por medio del método de DNS. En la tabla 5 puede 
observarse la producción de azúcares reductores por varias fracciones en el último paso 
de purificación. Se determinó que la fracción 14 es la que contiene mayoritariamente a 
la enzima endoinulinasa ya que presenta la mayor cantidad de azúcares reductores 
producidos por la hidrólisis de la inulina de achicoria. 
F14 
F10
 
F19 
# de Fracción 
40 
 
5.7 Tabla de purificación 
Para resumir los pasos de purificación de todo el proceso, se elaboró una tabla de 
purificación (tabla 6). En esta tabla se presentan las etapas de purificación, la 
concentración de proteína por mililitro, la cantidad de proteína total, la actividad en 
unidades por mililitro, la actividad específica, el rendimiento y el grado de purificación. Se 
puede observar que la concentración de proteína disminuye debido a la pérdida de 
proteína en cada paso, esta pérdida de proteína es normal puesto que además de la 
proteína de interés existen otras en la mezcla. Esta tendencia también se observa en la 
actividad volumétrica, la actividad total y el rendimiento, sin embargo, la actividad 
específica aumenta en cada paso de purificación ya que la endoinulinasa se tiene más 
pura y el grado de purificación aumenta ligeramente. 
 Tabla 6. Tabla de purificación 
 
 
 
 
 
 
5.8 Gel SDS-PAGE 
En la figura 9 se muestra el gel SDS-PAGE que abarca todas las etapas del proceso de 
purificación de la endoinulinasa. Se puede observar que después de la cromatografía de 
exclusión molecular, la única banda visible es la de inulinasa. De acuerdo al gel esta 
enzima como monómero, tiene un peso molecular de aproximadamente 100 kDa. 
Con la finalidad de hacer más eficiente el proceso de purificación se eliminó el paso de 
intercambio iónico por lo que la mezcla de proteínas después de la diálisis se introdujo a 
la columna de exclusión molecular, el resultado se puede observar en la columna R15 
Etapa Volumen total mL proteína 
Proteína total 
(mg)
Actividad 
(mg/min) U/mL U totales
Actividad 
especifica(U/mg 
proteina) % Rendimiento
Grado de 
purificación
Diálisis 10 0.0302 0.302 0.0052 1.03 10.33 34.16 100.00 1.00
Intercambio 6 0.0234 0.141 0.0067 1.34 8.06 57.34 78.07 1.68
Exclusión 4 0.0072 0.029 0.0028 0.56 2.26 77.94 21.85 2.28
41 
 
de la Figura 11. Por tal razón se propone que para las próximas purificaciones se emplee 
únicamente la diálisis y la exclusión molecular. 
 
 
Figura 11. Gel de purificación, de izquierda a derecha se muestra R15 (muestra de diálisis a exclusión 
molecular), exclusión molecular, intercambio aniónico y el marcador de pesos moleculares. 
 
5.9 Inmovilización 
Una vez purificada la enzima, ésta se inmovilizó en PVA-PEG. Para ello se probaron 
diferentes relaciones PVA-PEG (10-15%, 10:10% y 15:10% m/v). El inmovilizado de 15-
10% m/v PEG-PVA tiene una superficie irregular respecto a los otros 3 inmovilizados, 
mientras que la relación de 10-15% m/v presenta mayor dureza. La cantidad de enzima 
usada en cada inmovilizado fue de 35 mg de endoinulinasa. 
 
 
 
Figura 12: Inmovilizados de la enzima endoinulinasa en matrices de PVA-PEG 
10-10% Ex 10-10% INT 10-15% INT 15-10% INT 
250 
150 
100 
42 
 
 
En la figura 12 se muestran los inmovilizados de la endoinulinasa en diferentes 
porcentajes de matrices de PVA-PEG. De izq.-der. (PEG-PVA) 10-10% por exclusión, 10-
10% por intercambio aniónico, 10-15% por intercambio aniónico y 15-10% por 
intercambio aniónico. 
5.10 Comparación de la actividad de la enzima libre con la enzima 
inmovilizada 
 
Con el fin de comparar la actividad de la enzima inmovilizada con la enzima libre se 
realizaron reacciones en Eppendorf correspondientemente de 20 min, 2h, 4h y 6h con un 
volumen de 0.5 mL a 50ºC en buffer de acetatos 0.5 mM pH 5 a cada una de las 
reacciones. En la gráfica 7 se presentan los porcentajes de producción de azúcares 
reductores respecto a la enzima libre contra los diferentes inmovilizados y su tiempo de 
reacción. Se presentan los valores de los cuatro inmovilizados realizados a diferentes 
porcentajes de PEG-PVA y a diferentes tiempos. Puede observase que para el caso del 
inmovilizado 10-10% de PEG-PVA de la enzima proveniente de exclusión molecular, la 
mayor actividad se observó en un tiempo de 6h, alcanzándose más del 60%. Para el 
siguiente inmovilizado de 15-10% con la enzima purificada por intercambio iónico se 
obtuvo el mayor porcentaje de conversión a las 6h con más del 90% de producción. En 
el tercer inmovilizado se alcanza el 90% de producción, al igual que en el inmovilizado 
anterior en 6h, notablemente el inmovilizado de 10-10% por intercambio aniónico 
presenta más del 80% de producción en solo 20 min, por lo que se seleccionó a éste 
como el mejor inmovilizado, ya que alcanza en menor tiempo el máximo de producción. 
Esto es un indicativo de que existen problemas difusionales en los geles del 10:15 y 
15:10 que impiden que el sustrato o los productos se difundan con facilidad. 
43 
 
 
 
Grafica 7. Porcentaje de producción de azúcares reductores, izq.-der. Exclusión molecular 10-10%, 
intercambio aniónico 15-10%, 10-15% intercambio aniónico y 10-10% intercambio aniónico. El color azul 
representa el tiempo a 20 min, el naranja 120 min, el gris 240 min y amarillo 360 min. 
 
5.11 Cromatografía por capa fina 
 
Para saber qué clase de azúcares producían los inmovilizados, se realizaron reacciones 
de 20 min, buffer de acetatos pH 5 con una concentración de 50mM, y se compararon 
con controles como: son la enzima NOVO 960, el control de inulina, enzima libre tanto 
de intercambio aniónico y de exclusión molecular. 
Comparando la figura 13a con la 13b y 13c se puede ver qué tipo de FOS se han 
producidos, ya que pueden ser: fructosa, sacarosa, maltotriosa, maltotetrosa, 
maltopentosa, maltohexosa y maltoheptosa. En comparación con la figura 13b y la 13c 
existe una menor concentración de los productos en la 13b ya que la inmovilización 
reduce la actividad de la enzima y existen problemas de transferencia de masa debido al 
atrapamiento en el copolímero de PVA-PEG. 
 
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
10-10 exclusión 15-10 int 10-15 int 10-10 int
p
o
rc
en
ta
je
 % min
20
120
240
360
Ac
tiv
id
ad
re
si
du
al
Relación PVA-PEG 
44 
 
 
Figura 13. a) TLC de los estándares de azúcares reductores. b) TLC de las reacciones realizadas con los 
inmovilizados de izq.-der. 10-10% de la purificación por exclusión molecular, 10-10%, 10-15% y 15-10% 
por la purificación por intercambio aniónico. c) TLC de los controles y la enzima libre, de izq.-der. Control 
de inulina (CI), control de NOVO 960 (CN), enzima libre de intercambio aniónico (INT) y enzima libre por 
exclusión molecular (EX). 
 
5.12 Ciclos de reuso 
Se realizaron ciclos de reuso para determinar la cantidad de veces que el biocatalizador 
puede ser reutilizado. Estos ciclos de reúso se evaluaron mediante la producción de 
azúcares reductores en la reacción de hidrólisis de la inulina y se cuantificaron por el 
método de DNS en un buffer de acetatospH 5 50mM con una concentración de inulina 
de achicoria al 0.5% m/v. 
En la gráfica 8 se muestra que los 4 inmovilizados tienen aún actividad después de 6 
ciclos de reúso. Por su parte, el inmovilizado de 10-10% de intercambio aniónico muestra 
que tiene más del 35% de actividad después del sexto ciclo, mientras que el inmovilizado 
15-10% PEG-PVA conserva más del 25% de actividad al igual que los inmovilizados 
restantes. 
 
a b c 
45 
 
 
Gráfica 8. Producción de azúcares reductores vs los ciclos de reúso. 
6. CONCLUSIONES 
 
Se caracterizó a la enzima endoinulinasa a partir de una mezcla comercial obteniéndose 
las siguientes condiciones óptimas de reacción: pH 5 y temperatura de 50°C. 
Se purificó parcialmente a la enzima a partir de la mezcla comercial NOVO 960 por 
intercambio aniónico con un rendimiento del 78%, mientras que para la purificación por 
exclusión molecular se obtuvo un rendimiento de 21%, sin embargo, se encontró que es 
te método de purificación hace perder actividad a la endoinulinasa. 
La enzima endoinulinasa se inmovilizó en tres matrices de geles de PVA-PEG con la 
enzima purificada por intercambio aniónico o por un inmovilizado por exclusión molecular. 
El inmovilizado que se seleccionó como el mejor fue el correspondiente a una proporción 
10-10% m/v con la enzima purificada por intercambio aniónico. 
Todos lo inmovilizados conservan actividad después de 6 ciclos de reúso, notablemente 
el inmovilizado 10-10% m/v de la purificación por intercambio aniónico conserva más del 
35% de actividad. 
0.000
0.020
0.040
0.060
0.080
0.100
0.120
0.140
0.160
1 ciclo 2 ciclo 3 ciclo 4 ciclo 5 ciclo 6 ciclo
m
g 
A
.R
.m
L 
ciclos de reúso
10-10 ex
15-10 int
10-15 int
10-10 int
46 
 
Perspectivas y sugerencias para trabajo a futuro 
 
Se deberá realizar la diálisis y seguidamente la purificación por exclusión molecular. 
Realizar una inmovilización por unión covalente para comparar la estabilidad de la 
enzima en cada método de inmovilización, así como los ciclos de reuso y la actividad de 
la enzima inmovilizada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
47 
 
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	Portada
	Índice
	Resumen
	1. Antecedentes
	2. Hipótesis 3. Objetivos
	4. Materiales y Métodos
	5. Resultados y Discusión
	6. Conclusiones
	7. Bibliografía