anexo viral

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Microscopía	
  de	
  Campo	
  Claro	
  
DEFINICIÓN:	
  
En	
  campo	
  claro	
  toda	
  la	
  luz	
  desde	
  el	
  
espécimen	
  y	
  sus	
  alrededores	
  es	
  colectada	
  
por	
  el	
  obje6vo	
  para	
  formar	
  una	
  imagen	
  
contra	
  un	
  fondo	
  brillante.	
  
TECNOLOGÍA:	
  
El	
  campo	
  claro	
  es	
  la	
  forma	
  más	
  simple	
  de	
  
microscopía	
  donde	
  la	
  luz	
  pasa	
  a	
  través	
  de	
  o	
  
reflejada	
  del	
  espécimen.	
  La	
  iluminación	
  no	
  se	
  
altera	
  por	
  aditamentos	
  que	
  cambien	
  las	
  
propiedades	
  de	
  la	
  luz	
  (como	
  polarizadores	
  o	
  
filtros).	
  
Microscopía	
  de	
  fluorescencia	
  
La	
  fluorescencia	
  es	
  el	
  resultado	
  de	
  un	
  
proceso	
  de	
  tres	
  etapas:	
  (1)	
  el	
  fluoróforo	
  se	
  
excita	
  con	
  una	
  long.	
  de	
  onda	
  específica,	
  pasa	
  
de	
  S0	
  a	
  S1’,	
  (2)	
  permanece	
  excitado	
  (1-­‐10	
  
nanosegundos)	
  y	
  	
  decae	
  (3)	
  emi6endo	
  
fluorescencia	
  volviendo	
  al	
  estado	
  basal	
  S0.	
  	
  	
  
Accesorio	
  para	
  
fluorescencia	
  
Ej.:	
  GFP	
  absorbe	
  luz	
  a	
  395	
  nm	
  (azul)	
  y	
  emite	
  luz	
  
verde	
  a	
  509	
  nm	
  de	
  longitud	
  de	
  onda.	
  
Cómo	
  es	
  el	
  plásmido	
  de	
  transferencia?	
  
Izquierda	
   Derecha	
  Promotor	
   Reportero	
  
Plásmido	
  de	
  transferencia	
  
Secuencias	
  homólogas	
  específicas	
  (flanqueantes)	
  
	
  y	
  gen	
  reportero	
  
Flanqueantes	
  izquierdo	
  y	
  derecho,	
  son	
  
secuencias	
  homólogas	
  al	
  genoma	
  viral,	
  que	
  son	
  
con6guas	
  (izq.	
  y	
  der.)	
  al	
  gen	
  (o	
  región	
  de	
  
genoma)	
  que	
  deseo	
  reemplazar,	
  al	
  ocurrir	
  la	
  
recombinación	
  homóloga,	
  estas	
  secuencias	
  
quedan	
  intactas	
  en	
  el	
  genoma	
  y	
  sólo	
  se	
  
modifica	
  lo	
  que	
  está	
  entre	
  ellas	
  (gen	
  target).	
  
	
  
Gen	
  reportero,	
  es	
  el	
  gen	
  que	
  cuando	
  se	
  exprese	
  
en	
  el	
  virus	
  recombinante,	
  va	
  a	
  permi6r	
  que	
  sea	
  
iden6ficada	
  la	
  placa	
  de	
  lisis	
  que	
  genere.	
  
Puede	
  codificar	
  para:	
  una	
  proteína	
  fluorescente	
  
observable	
  por	
  microscopía	
  de	
  fluorescencia	
  (ej.	
  
GFP),	
  o	
  una	
  enzima	
  detectable	
  por	
  medio	
  de	
  
6nción	
  específica	
  (ej.:	
  beta-­‐galactosidasa)	
  
	
  
Cómo	
  construyo	
  un	
  plásmido	
  de	
  transferencia?	
  
Una	
   forma	
   es	
   hacerlo	
   mediante	
   diges6ón	
   del	
   genoma	
   viral	
   y	
  
recuperación	
   de	
   segmentos	
   que	
   flanquean	
   al	
   gen	
   deseado,	
   y	
  
luego	
   se	
   realiza	
   el	
   clonado	
  molecular	
   del	
   reportero	
   entre	
   ésos	
  
fragmentos.	
  
Otra	
   forma,	
   técnicamente	
  más	
   sencilla,	
   es	
  mediante	
   diseño	
   de	
  
primers	
   específicos	
   para	
   amplificar	
   las	
   regiones	
   flanqueantes,	
  
que	
  permitan	
   la	
   recombinación	
  homóloga	
  en	
  el	
   lugar	
  adecuado	
  
del	
   genoma	
   viral,	
   y	
   posterior	
   inserción	
   del	
   gen	
   reportero	
   entre	
  
ellas.	
  
Ambas	
   estrategias	
   se	
   hacen	
   por	
   biología	
   molecular	
   en	
   el	
  
laboratorio.	
  
No	
  se	
  precisa	
  saber	
  cómo	
  hacer	
  esto	
  en	
  detalle,	
  sí	
  se	
  debe	
  saber	
  
que	
   función	
   6ene	
   cada	
   parte	
   principal	
   del	
   plásmido,	
   para	
   la	
  
modificación	
  del	
  genoma	
  viral.	
  
Generación	
  de	
  virus	
  ADN	
  recombinante:	
  Plásmido	
  de	
  transferencia	
  y	
  
obtención	
  de	
  clones	
  recombinantes	
  	
  
Primera	
  etapa	
  (PLACA	
  DE	
  CULTIVO	
  1):	
  
Transfecto	
  el	
  plásmido	
  de	
  transferencia	
  e	
  infecto	
  con	
  virus	
  Tpo	
  salvaje	
  (wt)	
  
Placa	
  de	
  cul6vo	
  +	
  monocapa	
  de	
  
cul6vo	
  celular	
  (células	
  eucariotas)	
  
Plásmido	
  de	
  
transferencia	
  
(tranfección)	
  
Virus	
  6po	
  
salvaje
(infección)	
  
En	
   ESTA	
   placa,	
   las	
   células	
   reciben	
   ADN	
   plasmídico	
   (por	
  
transfección)	
  y	
  genoma	
  viral	
  (por	
  infección).	
  
Después	
   de	
   cierto	
   6empo,	
   espero	
   que	
   haya	
   recombinación	
  
homóloga	
  entre	
  plásmido	
  de	
  transferencia	
  y	
  genoma	
  viral.	
  
	
  
Va	
   a	
   haber	
   expresión	
   del	
   reportero	
   en	
   células	
   donde	
   ingresó	
  
plásmido?	
  
La	
   respuesta	
   es	
   “SI”,	
   el	
   gen	
   reportero	
   se	
   va	
   a	
   expresar	
  
independientemente	
  de	
  si	
  está	
  ya	
  inserto	
  en	
  el	
  genoma	
  viral,	
  o	
  
si	
   se	
   encuentra	
   en	
   las	
   moléculas	
   plasmídicas,	
   porque	
   el	
  
reportero	
  está	
  bajo	
  el	
  control	
  de	
  un	
  promotor	
  eucariota.	
  
	
  
Si	
   el	
   reportero	
  es	
  GFP,	
   y	
  observo	
  el	
   cul6vo	
   tratado	
   (PLACA	
  DE	
  
CULTIVO	
  1)	
  por	
  microscopía	
  de	
  fluorescencia,	
  veré	
  expresión	
  de	
  
GFP,	
  pero	
  no	
  puedo	
  decir	
   si	
  está	
   inserto	
  en	
  el	
  genoma	
  viral,	
  o	
  
aún	
  se	
  encuentra	
  en	
  el	
  plásmido.	
  
Supongamos	
  que	
  el	
  efecto	
  citopá6co	
  del	
  virus	
  aparece	
  a	
  las	
  48	
  
horas	
  y	
  lo	
  observamos	
  a	
  las	
  24h	
  post	
  infección,	
  SE	
  OBSERVARÁ	
  
expresión	
   de	
  GFP	
   (imagen	
   1),	
   pero	
  NO	
   veré	
   efecto	
   citopá6co	
  
(imagen	
  2).	
  
Izq.	
  
Der.	
  
Promotor	
   Reportero	
  
Microscopía	
  de	
  
fluorescencia,	
  veo	
  expresión	
  
de	
  GFP	
  (reportero)	
  
Microscopía	
  de	
  campo	
  
claro,	
  aún	
  no	
  hay	
  efecto	
  
citopá6co	
  
PLACA	
  DE	
  CULTIVO	
  1	
  
PLACA	
  DE	
  CULTIVO	
  1	
  
Esta	
   placa	
   de	
   cul6vo	
   es	
   la	
   que	
   transfectamos	
   e	
  
infectamos	
   (diaposi6va	
   anterior),	
   esperamos	
   48h	
   y	
  
recuperamos	
   parfculas	
   virales	
   liberadas	
   al	
   medio,	
  
para	
  infectar	
  la	
  PLACA	
  DE	
  CULTIVO	
  2.	
  
Segunda	
  etapa	
  (PLACA	
  DE	
  CULTIVO	
  2)	
  
Con	
  las	
  par[culas	
  virales	
  recuperadas	
  a	
  parTr	
  de	
  la	
  PLACA	
  DE	
  CULTIVO	
  1,	
  se	
  infecta	
  una	
  NUEVA	
  placa	
  de	
  culTvo,	
  para	
  
realizar	
   la	
   selección	
   de	
   virus	
   recombinantes	
   (que	
   incorporaron	
   por	
   recombinación	
   homóloga	
   GFP),	
   también	
   hay	
  
presencia	
  de	
  virus	
  Tpo	
  salvaje	
  (que	
  no	
  incorporaron	
  GFP).	
  
UTlizando	
   la	
   progenie	
   viral	
   de	
   las	
   placas	
   de	
   lisis	
   fluorescentes	
   (en	
   la	
   PLACA	
   DE	
   CULTIVO	
   2)	
   puedo	
   aislar	
   el	
   virus	
  
recombinante	
   que	
   lleva	
   el	
   reportero	
   GFP	
   en	
   el	
   genoma,	
   en	
   la	
   posición	
   en	
   la	
   que	
   ocurrió	
   la	
   RECOMBINACION	
  
HOMOLOGA	
  específica.	
  
	
  
PLACA	
  DE	
  CULTIVO	
  2	
  
Luego	
  de	
  un	
  determinado	
  6empo	
  de	
   infección	
   (con	
  
las	
  parfculas	
  obtenidas	
  de	
   la	
  PLACA	
  DE	
  CULTIVO	
  1),	
  
se	
  formarán	
  placas	
  de	
  lisis,	
  las	
  cuales	
  las	
  observaré	
  al	
  
microscopio	
   para	
   determinar	
   si	
   ocurrieron	
   eventos	
  
de	
  RECOMBINACIÓN	
  HOMÓLOGA	
  	
  
UTlizo	
  las	
  par[culas	
  virales	
  generadas	
  en	
  PLACA	
  
DE	
  CULTIVO	
  1	
  para	
  INFECTAR	
  PLACA	
  DE	
  CULTIVO	
  2	
  
(a	
  parTr	
  de	
  este	
  momento	
  sólo	
  trabajo	
  con	
  virus)	
  
En	
  microscopía	
   de	
   campo	
   claro,	
   observo	
   TODAS	
   las	
   placas	
   de	
  
lisis	
  sin	
  dis6nguir	
  las	
  que	
  6enen	
  reportero,	
  por	
  lo	
  tanto	
  no	
  puedo	
  
diferenciar	
  las	
  placas	
  de	
  lisis	
  ocasionada	
  por	
  virus	
  de	
  6po	
  salvaje,	
  
de	
  las	
  originadas	
  por	
  virus	
  recombinante	
  (GFP+)	
  
En	
  microscopíade	
   fluorescencia,	
   observo	
   SÓLO	
   las	
   placas	
   de	
  
lisis	
   fluorescentes	
   y	
   puedo	
   determinar	
   fácilmente	
   cuáles	
   son	
  
generadas	
  por	
   virus	
   recombinante	
   (GFP+)	
  de	
   las	
   generadas	
  por	
  
virus	
  de	
  6po	
  salvaje	
  (no	
  6enen	
  GFP).	
  
PLACA	
  DE	
  CULTIVO	
  2	
  
Luego	
   de	
   un	
   determinado	
   6empo	
   de	
  
infección	
   (con	
   las	
   parfculas	
   obtenidas	
  de	
   la	
  
PLACA	
  DE	
  CULTIVO	
  1),	
  se	
  formarán	
  placas	
  de	
  
lisis,	
   las	
   cuales	
   las	
   observaré	
   al	
  microscopio	
  
para	
   determinar	
   si	
   ocurrieron	
   eventos	
   de	
  
RECOMBINACIÓN	
  HOMÓLOGA	
  	
  
Observación	
  (en	
   la	
  PLACA	
  DE	
  CULTIVO	
  2)	
  de	
  
placas	
  de	
  lisis	
  ocasionadas	
  en	
  cul6vo	
  celular,	
  
por	
  parfculas	
  virales	
  de	
  6po	
  salvaje	
  (GFP-­‐)	
  y	
  
por	
  parfculas	
  virales	
  recombinantes	
  (GFP+).	
  
Las	
   figuras	
   de	
   la	
   derecha	
   corresponden	
   la	
   mismo	
   campo	
   de	
   un	
  
culTvo	
   infectado	
   con	
   par[culas	
   virales	
   obtenidas	
   de	
   la	
   placa	
   de	
  
culTvo	
  1.	
   	
  Observe	
  las	
  placas	
  que	
  dejan	
  de	
  verse	
  en	
  fluorescencia	
  
(virus	
  sin	
  GFP)	
  y	
   las	
  placas	
  que	
  se	
  ven	
  en	
  ambas	
  fotos,	
  clones	
  de	
  
virus	
  recombinante	
  (GFP+).	
  
Placas	
  de	
  lisis	
  generadas	
  por	
  
virus	
   recombinante	
   (GFP+),	
  
sólo	
   se	
   señalan	
   3	
   a	
   modo	
  
ilustraTvo.	
  
Placas	
   de	
   lisis	
   generadas	
  
por	
   virus	
   Tpo	
   salvaje	
  
(GFP-­‐),	
   no	
   las	
   veo	
   en	
  
fluorescencia.	
   Sólo	
   se	
  
s e ñ a l a n	
   3 	
   a 	
   m o d o	
  
ilustraTvo.	
  
PLACA	
  DE	
  CULTIVO	
  2	
  
Luego	
   de	
   un	
   determinado	
   6empo	
   de	
  
infección	
   (con	
   las	
   parfculas	
   obtenidas	
  de	
   la	
  
PLACA	
  DE	
  CULTIVO	
  1),	
  se	
  formarán	
  placas	
  de	
  
lisis,	
   las	
   cuales	
   las	
   observaré	
   al	
  microscopio	
  
para	
   determinar	
   si	
   ocurrieron	
   eventos	
   de	
  
RECOMBINACIÓN	
  HOMÓLOGA	
  	
  
Tercera	
  etapa	
  (PLACA	
  DE	
  CULTIVO	
  3)	
  
Aislamiento	
   de	
   virus	
   recombinante	
   (GFP+).	
   Se	
   mulTplican	
   en	
   PLACAS	
   DE	
   CULTIVO	
  
diferentes	
  par[culas	
  virales	
  que	
  pertenecen	
  a	
  una	
  única	
  placa	
  de	
  lisis,	
  de	
  esta	
  manera	
  se	
  
puede	
  tener	
  una	
  población	
  homogénea	
  de	
  virus	
  recombinante.	
  
La	
  determinación	
  de	
  la	
  iden6dad	
  de	
  los	
  virus	
  recombinantes	
  que	
  se	
  ob6enen	
  se	
  determina	
  
por	
   diferentes	
   técnicas	
   de	
   biología	
   molecular,	
   ver	
   diaposi6vas	
   de	
   clase	
   de	
   biología	
  
molecular	
  y	
  de	
  vectores	
  virales.	
  
PLACA	
  DE	
  CULTIVO	
  3	
  
U6lizando	
  virus	
  obtenido	
  de	
  una	
  placa	
  de	
  lisis	
  posi6va	
  
para	
  el	
  reportero	
  (en	
  el	
  ejemplo,	
  las	
  que	
  son	
  GFP+),	
  se	
  
infecta	
   de	
   una	
   nueva	
   PLACA	
   DE	
   CULTIVO	
   3,	
   y	
   se	
  
amplifica	
  sólo	
  ese	
  virus	
  recombinante	
  (proveniente	
  de	
  
una	
  ÚNICA	
  PLACA	
  DE	
  LISIS).	
  Esta	
  3era	
  etapa	
  se	
  repite	
  
hasta	
   estar	
   seguro	
   de	
   que	
   se	
   está	
   amplificando	
   un	
  
único	
  clon	
  de	
  virus	
  recombinante.	
  
Tomo	
  una	
  única	
  placa	
  de	
  
lisis	
  e	
  infecto	
  una	
  nueva	
  
monocapa	
  de	
  células	
  
eucariotas