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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
DE MÉXICO 
 
! FACULTAD DE CIENCIAS 
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PERFIL DE EXPRESIÓN DE MICRORNAS EN 
CÉLULAS A549 INFECTADAS CON EL VIRUS DE 
INFLUENZA PANDÉMICA A/H1N1 Y EL VIRUS DE 
INFLUENZA ESTACIONAL A/PR/8/34 
 
 
 
 
 
 
 
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T E S I S 
 
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! QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: !
! BIÓLOGA !
! P R E S E N T A : !
! SARA ALEXANDRA GARCÍA MORENO DUEL 
 
 
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! 
 
 
DIRECTOR DE TESIS: 
DR. GUSTAVO RAMÍREZ MARTÍNEZ 
2013 
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UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
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1.!Datos!del!Alumno!
García!Moreno!
Duel!
Sara!Alexandra!
56525898!
Universidad!Nacional!Autónoma!de!México!
Facultad!de!Ciencias!
Biología!
304587164!
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2.!Datos!del!Tutor!
Dr.!
Gustavo!
Ramírez!
Martínez!!
!
3.!Datos!del!Sinodal!1!
Dra.!
Claudia!Andrea!
Segal!
Kischinevzky!
!
4.!Datos!del!Sinodal!2!
Dra.!
Tzvetanka!
Dimitrova!
Dinkova!
!
5.!Datos!del!Sinodal!3!
Dr.!!
Joaquín!Alejandro!
Zúñiga!
Ramos!
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6.!Datos!del!Sinodal!4!
Biol.!
Isis!
Trujillo!
González!
!
7.!Datos!del!trabajo!escrito!
Perfil!de!expresión!de!microRNAs!en!células!A549!infectadas!con!el!virus!de!influenza!
pandémica!A/H1N1!y!el!virus!de!influenza!estacional!A/PR/8/34.!
76!p.!
2013!
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A"mis"papás"y"a"mi"hermana"
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Antes!que!nada,!les!agradezco!a!mis!papás!todo!el!apoyo!y!amor!que!me!han!dado!a!lo!largo!
de!estos!años.!Gracias!a!ustedes!ahora!soy!bióloga!!Y!por!ustedes!seguiré!mi!formación!de!
científica.!Gracias!a!Rebecca,!por!las!horas!de!diversión!que!me!has!dado.!
!
Agradezco!a!mi!tutor,!Dr.!Gustavo!Ramírez!Martínez,!por!su!apoyo!y!dirección!a!lo!largo!de!
este!proyecto.!Sus!enseñanzas!me!han!encaminado!a!ser!una!mejor!científica,!alentándome!
a!seguir!mi!futuro!como!bióloga.!!
!
Agradezco!al!Dr.!Joaquín!Zúñiga!por!la!oportunidad!que!me!brindó!al!integrarme!a!su!grupo!
de!trabajo!en!el!Laboratorio!de!Genética!e!Inmunobiología!en!el!Instituto!Nacional!!de!
Enfermedades!Respiratorias.!La!confianza!que!me!tuvieron!Gustavo!y!tú!desde!el!principio!
ha!sido!mi!principal!motivación!para!mejorar!y!siempre!aspirar!más!alto.!Gracias!por!
involucrarme!de!manera!tan!plena!en!sus!proyectos,!!los!cuales!no!solo!enriquecen!mi!
currículum!sino!que!amplían!mi!experiencia!y!conocimiento!de!manera!invaluable.!!
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Agradezco!a!mis!sinodales!Dra.!Claudia!Andrea!Segal!Kischinevzky,!Dra.!Tzvetanka!
Dimitrova!Dinkova,!y!Biol.!Isis!Trujillo!González,!por!su!tiempo!y!sus!comentarios!que!
ayudaron!a!mejorar!este!proyecto!de!investigación.!Gracias!por!su!disposición!y!apoyo.!
!
Agradezco!a!mis!compañeros!de!laboratorio,!en!especial!al!M.!en!C.!Juan!Morán,!a!quien!le!
debo!gran!parte!de!mi!aprendizaje!en!el!laboratorio!y!por!su!amistad!que!alegró!mi!estancia!
en!el!INER.!
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Agradezco!al!Instituto!Nacional!de!Enfermedades!Respiratorias!y!al!Instituto!Nacional!de!
Medicina!Genómica!por!poner!a!mi!disposición!los!recursos!y!el!equipo!necesario!para!que!
este!proyecto!de!investigación!se!pudiera!llevar!a!cabo,!y!en!especial!a!Sandra!Romero!por!
su!ayuda!con!el!análisis!estadístico.!!
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Agradezco!a!mi!alma"mater,"la!Universidad!Nacional!Autónoma!de!México,!por!brindarme!la!
educación!que!me!ha!formado!como!profesional!y!por!sentar!las!bases!para!mi!futuro.!Me!
siento!orgullosa!de!ser!egresada!de!la!mejor!universidad!de!este!país.!!
!
Finalmente,!le!agradezco!a!todos!mis!amigos!su!amistad!y!compañía!que!fueron!
indispensables!en!mi!odisea!universitaria!y!formación!como!bióloga.!Gracias!a!mis!amigos!
de!la!prepa,!de!la!licenciatura!y!a!aquellos!amigos!cuyos!caminos!se!cruzaron!azarosamente!
con!el!mío,!por!dejarme!mostrarles!el!mundo!a!través!de!los!ojos!de!una!bióloga,!
inspirándome!y!emocionándome!una!y!otra!vez.!Por!ustedes!cada!instante!ha!sido!divertido!
y!memorable.!
Y!a!Dan,!por!todas!las!risas.!!
!
*!
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ÍNDICE!
!
I. RESUMEN…………………………………………………………………………………………p.1!
II. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………………….p.3!!!!!!!!!!!!!!
2.1 Epidemiología!del!virus!de!la!influenza!humana!A/H1N1………………p.3!
2.2 Orthomyxoviridae…………………………………………………………………………p.5!
2.2.1 Estructura!del!virus!de!la!influenza!A……………………………p.5!
2.2.2 Ciclo!biológico……………………………………………………………...p.7!
2.2.3 Evolución!de!la!influenza……………………………………………p.12!
2.3 El!virus!de!la!influenza!pandémica!A/H1N1………………………………...p.13!
2.3.1 Origen!y!estructura…………………………………………………….p.13!
2.3.2 Patogenicidad!y!cuadro!clínico……………………………………p.16!
2.4 MicroRNAs………………………………………………………………………………...p.18!
2.4.1 Descubrimiento………………………………………………………….p.18!
2.4.2 Generalidades…………………………………………………………….p.19!
2.4.3 Biogénesis………………………………………………………………….p.20!
2.4.4 Mecanismos!de!represión…………………………………………...p.23!
2.4.5 microRNAs!en!enfermedades……………………………………...p.24!
2.5 Células!A549!y!el!virus!estacional!A/PR/8/34……………………………..p.26!
2.5.1 Células!A549………………………………………………………………p.26!
2.5.2 A/PR/8/34………………………………………………………………...p.27!
III. JUSTIFICACIÓN………………………………………………………………………………p.28!
IV. HIPÓTESIS……………………………………………………………………………………..p.30!
!
V. OBJETIVOS……………………………………………………………………………………..p.31!
VI. MÉTODOS………………………………………………………………………………...…….p.32!
VII. RESULTADOS…………………………………………………………………………………p.39!
VIII. DISCUSIÓN…………………………………………………………………………….……….p.56!
IX. CONCLUSIÓN………………………………………………………………………………….p.64!
X. PERSPECTIVAS…………………………………………...………………………………….p.65!
XI. REFERENCIAS………………………………………………………………………………...p.66!
!
*!
! 1!
I. RESUMEN)
)
! El! virus!de! influenza!pandémica!A/H1N1!de!origen!porcino!del!2009!provocó!
más! de! 18,000!muertes! en! 214! países! en! el! transcurso! de! un! año.! Fue! declarado!
pandemia!a!los!dos!meses!de!ser!identificado!por!su!alta!capacidad!de!transmisión!
de!humano!a!humano.!A!diferencia!de! los! virus!de! influenza!de! tipo! estacional,! el!
virus! A/H1N1! pandémico! afectó! a! grupos! jóvenes! provocando! enfermedad!
pulmonar! aguda! severa! y! con! frecuencia! muerte.! Por! esto! se! considera! que! este!
virus! fue! y! sigue! siendo! un! riesgo! de! salud! pública! que! debe! ser! atendido.! En! un!
esfuerzo! por! comprender! la! elevada! patogenicidad! del! virus! A/H1N1! y! sus!
mecanismos!de!infección!se!elaboró!este!proyecto!cuyo!objetivo!fue!la!detección!de!
expresión!de!microRNAs!en!células!A549!infectadas!con!el!virus!pandémico!A/H1N1!
del!2009!e!infectadas!con!un!virus!H1N1!de!tipo!estacional!(A/PR/8/34).!Las!células!
A549!son!células!epiteliales!de!pulmón!derivadas!de!una!línea!celular!de!carcinoma!
de! humano! que! contienen! receptores! para! ambos! virus! y! que! permiten! crear! un!
modelo! in#vitro#semejante!al! tejido!pulmonar.!Los!microRNAs!son!pequeños!RNAs!
no! codificantes! de! 19! a! 22! nucleótidos! que! regulan! negativamente! la! expresión!
genética! al! unirse! a! mRNAs! blanco! y! degradar! o! inhibir! su! traducción.! Se! ha!
demostrado! que! regulan! la! mayoría! de! los! procesos! celulares! y! que! están!
expresados!de!manera!diferencial!en!diversas!enfermedades;!la!desregulación!de!su!
participación!en!diversas!vías!es!causa!de!estados!patológicos.!!
! En! este! proyecto! de! investigación! se! analizó! el! perfil! de! expresión! de!
microRNAs!en! células!A549!no! infectadas!en! relación! con! células!A549! infectadas!! 2!
con!el!virus!de!influenza!pandémica!A/H1N1!o!con!el!virus!de!influenza!estacional!
A/PR/8/34! durante! un! periodo! de! 24! horas.! Para! esto! se! utilizó! el! microarreglo!
GeneChip!2.0!de!Affymetrix.!Se!realizaron!comparaciones!entre! las!expresiones!de!
microRNAS! en! cada! condición! mediante! el! programa! de! acceso! libre! R.! En! cada!
condición! se! observaron! cambios! significativos! en! la! expresión! de! diversos!
microRNAs.! Esto! demuestra! que! los! virus! de! influenza! inducen! un! cambio! en! la!
expresión! de!microRNAs! celulares! y! que! los!microRNAs! expresados! son! distintos!
entre!ambas!cepas.!!
! Finalmente!se!realizó!el!análisis!bioinformático!de!microRNAs!diferencialmente!
expresados! de! manera! significativa! por! el! virus! de! influenza! pandémica! en! el!
programa! DIANA! mirPath.! Los! resultados! indican! que! la! vía! en! la! que! están!
involucrados! de! manera! principal! es! la! vía! del! TGF\β.! ! El! TGF\β! es! una! proteína!
multifuncional!que!regula!la!inmunidad!y!diversos!procesos!celulares.!Es!el!iniciador!
de!los!procesos!inflamatorios!y!se!ha!visto!que!brinda!protección!antiviral.!Esto!nos!
permite! concluir!que!un!posible!mecanismo!de! infección!por!el! virus!de! influenza!
pandémica!es!la!sobreexpresión!de!microRNAs,!en!especial!!de!miR\135a,!miR\655!y!
miR\384,! que! regulan! negativamente! la! vía! del! TGF\β! interfiriendo! así! en! los!
procesos!antivirales!y!provocando!una!infección!severa.!!
)
)
)
)
)
! 3!
II. INTRODUCCIÓN)
!
2.1$Epidemiología$del$virus$de$influenza$humana$A/H1N1$
$
A!finales!de!febrero!del!año!2009!en!La!Gloria,!Veracruz,!surgieron!varios!casos!
de!enfermedades!respiratorias!agudas!de!causa!desconocida!(Fraser!et!al.,!2009).!A!
lo! largo! del!mes! de!marzo! del!mismo! año! siguieron! apareciendo! casos! similares,!
hasta! que! el! 12! de! abril! se! presentaron! los! primeros! reportes! a! la! Organización!
Panamericana! de! la! Salud.! Para! el! 13! de! abril! de! 2009,! 616! casos! sospechosos!
habían!sido!documentados!en!La!Gloria;!los!más!afectados!eran!menores!de!15!años!
(CDC,!2009).!Ese!mismo!día,!!una!mujer!de!39!años!falleció!debido!a!una!neumonía!
atípica! severa!en!el! estado!de!Oaxaca! (Córdova\Villalobos!et! al.,! 2009).!Este!brote!
repentino!e! inesperado!de!enfermedades!respiratorias!en!varias!zonas!del!país!no!
coincidía! con! la! temporada!de! influenza!estacional! y! afectaba!a! grupos!de!adultos!
jóvenes.! Esto! provocó! una! alerta! nacional! en! la! cual! se! promovió! la! recolecta! de!
muestras!para!el!diagnóstico!de!los!pacientes,!y!se!solicitó!a!los!institutos!de!salud!
documentar! los! casos! sospechosos! (CDC,! 2009).! Las! muestras! recolectadas! se!
enviaron!a!los!Centros!para!la!Prevención!y!Control!de!Enfermedades!(CDC!por!sus!
siglas!en!inglés)!en!Estados!Unidos1!y!a!los!laboratorios!de!Winnipeg!en!Canadá,!los!
cuales!confirmaron!el!23!de!abril!que!la!causa!de!las!enfermedades!respiratorias!era!
un! virus! de! influenza! humana! A/H1N1! previamente! desconocido! y! de! origen!
porcino!(Córdova\Villalobos!et!al.,!2009)!.!!!
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
1!United!States!Centers!for!Disease!Prevention!and!Control!(CDC),!traducción!propia.!
! 4!
El!número!de!casos!aumentó!de!manera!descontrolada.!Tan!solo!un!día!después!
de! que! se! caracterizó! el! agente! infeccioso! se! decretó! el! cierre! de! escuelas! en! el!
Distrito!Federal.!A!pesar!del!intento!desesperado!por!frenar!la!propagación,!para!el!
4! de! mayo! de! 2009! la! influenza! porcina! ya! se! había! esparcido! por! todo! el! país,!
afectando! a! las! 32! entidades! federativas.! Para! esta! fecha! ya! había! 590! casos!
confirmados!en!el!laboratorio,!incluyendo!25!muertes!(WHO!update!13).!!
La! influenza! pandémica! cruzó! rápidamente! las! fronteras:! el! 24! de! abril! ya! se!
habían! confirmado!7! casos! en!Estados!Unidos! (WHO!update!1),! aumentando!a!40!
casos! para! el! 27! de! abril,! más! 6! casos! confirmados! en! Canadá! y! uno! en! España!!
(WHO!update!3).!El!4!de!mayo,!veintiún!países!alrededor!del!mundo!reportaban!un!
total!de!1085!casos!confirmados!!(WHO!update!13).!Poco!más!de!un!mes!después,!el!
11!de!junio!de!2009,!la!Dra.!Margaret!Chan,!directora!de!la!Organización!Mundial!de!
la!Salud!(WHO!por!sus!siglas!en!inglés),!anunció!el!comienzo!de!la!pandemia!por!el!
virus! de! influenza! porcina! A/H1N1,! con! 74! países! afectados,! 28,774! personas!
infectadas,!y!144!muertes!!(WHO!update!47).!Así,!el!mundo!se!enfrentó!a!la!primera!
pandemia!del!S.!XXI.!
Al! año! del! comienzo! de! la! pandemia,! el! virus! ya! había! llegado! a! 214! países,!
provocando!más!de!18,000!muertes!confirmadas.!El!10!de!agosto!de!2010!se!declaró!
finalmente! el! fin! de! la! pandemia! (WHO! update! 113).! Durante! ese! año! y! hasta! la!
fecha,! laboratorios! alrededor! del! mundo! llevaron! a! cabo! investigaciones! para!
descifrar! el! virus! que! causó! de!manera! repentina! e! inesperada! una! pandemia:! un!
virus! con! una! elevada! patogenicidad! y! de! fácil! contagio,! con! la! intención! de!
desarrollar!mejores!vacunas!y!poder!estar!mejor!preparados!para!una!pandemia!en!
! 5!
el!futuro.!Conocer!los!mecanismos!patogénicos!inherentes!del!virus!pandémico!y!en!
qué! difieren! del! virus! de! influenza! estacional! es! clave! para! la! salud! pública! del!
mundo.!
!
2.2$Orthomyxoviridae$
!
Los!virus!de!influenza!humana!forman!parte!de!la!familia!Orthomyxoviridae.#Esta!
familia! incluye!cinco!géneros:!A,!B,!C,!Thogotovirus!e!Isavirus,! los!cuales!se!definen!
por!tener!un!genoma!de!RNA!segmentado,!de!cadena!sencilla!y!sentido!negativo.!En!
humanos,! los! virus! de! influenza! A! y! B! son! de! alto! interés! epidemiológico! por! su!
capacidad!de!provocar!brotes!repentinos!y!enfermedades!respiratorias!severas.!El!
género! de! influenza! A! se! divide! en! subtipos! caracterizados! por! sus! antígenos! de!
superficie!hemaglutinina!(H1!a!H16)!y!neuraminidasa!(N1!a!N9).!!
#
2.2.1#Estructura#del#virus#de#influenza#A#
Los! virus! de! influenza! A! son! de! forma! esférica! de! aproximadamente! 100!
nanómetros!de!diámetro!(Fujiyoshi!et!al.,!1994).!Están!envueltos!por!una!membrana!
lipídica!procedente!de! la! célula! hospedera,! en! la! cual! se! encuentran! los! antígenos!
transmembranales!hemaglutinina!(HA)!y!neuraminidasa!(NA),!y!los!canales!iónicos!
(M2).!HA!es!la!proteína!de!envoltura!nuclear!más!abundante!con!un!80%,!seguido!de!
NA!con!un!aproximado!de!17%.!Ambas!se!encuentran!ancladas!a!balsas!lipídicas!en!
la! membrana,! con! grupos! de! NA! rodeados! por! HA.! M2! es! el! componente! menos!
! 6!
abundante,! con! tan! solo! 16! a! 20!moléculas! por! partícula! viral! y! no! se! encuentra!
asociado!a!balsas!lipídicas!(Nayak!et!al.,!2009).!
!Por! debajo! de! la! membrana! se! encuentran! las! proteínas! de! matriz! (M1)! las!
cuales!sostienen!al!núcleo!viral.!El!núcleo!viral!comprende!ocho!segmentos!de!RNA!
de! sentido! negativo.! Cada! segmento! se! enrolla! alrededor! de! proteínas! nucleares!
(NP)! y! de! pequeñas! cantidades! de! proteínas! de! exportación! nuclear! (NEP).! ! Al!
extremo!de!estas!estructuras!se!encuentra!un!complejo!de!polimerasa,!el!cual!está!
formado!por!tres!proteínas!de!polimerasa!(PB1,!PB2!y!PA).!Este!conjunto!de!RNA!y!
proteínas!forma!a!las!ribonucleoproteínas!virales!(vRNP).!Las!vRNPs!codifican!para!
once! proteínas! virales,! incluyendo! todas! las! anteriormente! mencionadas! más! las!
proteínas!no!estructurales!NS!y!PB1\F2!(Samji,!2009)!(Fig.1).!!
El! ciclo! de! replicación! viral! de! influenza! A! comienza! con! la! entrada! de! la!
partícula!viral!a!la!célula!hospedera,!seguida!por!la!entrada!de!las!vRNPs!al!núcleo,!
en!donde!se!lleva!a!cabo!la!transcripción!y!replicación!de!las!mismas,!y!finalmente!!
el!ensamblaje!y!la!liberación!de!nuevas!partículas!virales.!
!
! 7!
!
Figura) 1.) Estructura) del) virus) de) influenza) A.) Representación! esquemática! de!la! estructura! del! virus! de!
influenza!A.!La!membrana!viral!proviene!de!la!célula!hospedera!y!tiene!las!proteínas!membranales!NA,!HA,!y!M2,!
con!M1!formando!una!matriz!por!debajo.!Contiene!8!segmentos!de!RNA!en!el!núcleo!viral,! los!cuales!codifican!
para!once!proteínas.!Cada!segmento!se!encuentra!enrollado!alrededor!de!NPs,!y!están!unidos!a!un!complejo!de!
polimerasa!(PB1,!PB2!y!PA)!en!su!extremo,!formando!ribonucleoproteínas!virales!(vRNP).!Obtenido!de!(Medina!
and!García\Sastre,!2011)!
!
2.2.2#Ciclo#biológico#
La! entrada! a! la! célula! requiere! de! la! unión! de! HA! al! ácido! siálico! que! se!
encuentra! en! el! extremo! de! las! glicoproteínas! en! la! superficie! de! la! membrana!
celular.!El!ácido!siálico!se!une!de!dos!maneras!principales!a!los!carbohidratos!de!las!
glicoproteínas:! a! través! de! uniones! α2,6! y! α2,3.! ! Los! virus! de! influenza! A! que!
infectan!a!humanos!reconocen!preferencialmente!a!la!unión!α2,6,!mientras!que!los!
virus!de! influenza!aviar! reconocen!a! la!unión!α2,3.! Los!virus!de! influenza!porcina!
tienen!la!capacidad!de!reconocer!y!unirse!a!ambas!(Whittaker,!2004).!
Envoltura*viral*proveniente*
*de*la*célula*hospedera*
Proteínas*no*
estructurales*
RNP*viral*
Complejo*de*polimerasa*
! 8!
La! unión! de! HA! al! ácido! siálico! induce! la! endocitosis! del! virus,! el! cual! entra!
rodeándose!de!membrana!celular,! formando!un!endosoma.!Después,! la!membrana!
viral!se!fusiona!a!la!membrana!endosómica!para!liberar!las!vRNPs!al!citoplasma.!!
Ya!formado!el!endosoma,!el!precursor!de!la!hemaglutinina!viral!HA0!es!hendido!
en! las! subunidades! HA1! y! HA2.! La! subunidad! HA1! se! mantiene! anclada! a! la!
membrana!viral,!mientras!que!la!subunidad!HA2!corresponde!al!péptido!de!fusión.!
Este! cambio! conformacional! que! sufre! HA0! solo! puede! ocurrir! a! un! pH! bajo! de!
aproximadamente!5!a!6.! !Una!vez!que!el!péptido!de!fusión!HA2!queda!expuesto,!se!
inserta! a! la!membrana! endosómica,! mientras! que! la! subunidad! HA1! se!mantiene!
anclada!a!la!membrana!viral!a!través!de!su!dominio!transmembranal.!HA!comienza!a!
doblarse!acercando!a!ambas!membranas!hasta!tocarse,!y!se!crea!un!poro!de!fusión!
conectando!al!núcleo!viral!con!el!citoplasma!celular!(Cross!et!al.,!2001).!El!bajo!pH!
del! endosoma! también! es! importante! porque! activa! a! los! canales! iónicos!M2,! los!
cuales!acidifican!el!núcleo!viral!y! liberan!a! las!vRNPs!de! la!matriz! formada!por! las!
M1.!Una!vez!liberadas!las!vRNPs,!entran!al!citoplasma!a!través!del!poro!por!difusión!
(Fig.!2).!
Ya!en!el!citoplasma,!las!vRNPs!deben!entrar!al!núcleo!para!su!transcripción.!La!
entrada! al! núcleo! se! da! a! través! del! complejo! proteico! nuclear! (NPC)! que! se!
encuentra!en!la!membrana!nuclear!y!es!dependiente!de!GTP.!Todas!las!vRNPs!tienen!
en!su!extremo!a!las!proteínas!PA,!PB1,!PB2!y!NP,!y!cada!una!de!estas!proteínas!tiene!
una!señal!de!localización!nuclear!que!se!une!al!NPC!previo!a!la!internalización!(Wu!
et!al.,!2007).!
!
! 9!
!
Figura) 2.) Representación) de) la) hipótesis) del) talloFporo) para) la) fusión) membranal) mediada) por)
hemaglutinina)(HA))de)la)influenza.)(a))El!virus!entra!a!la!célula!por!endocitosis!mediado!por!HA!formando!un!
endosoma.!(b)!El!bajo!pH!del!endosoma!permite!un!cambio!conformacional!de!la!HA,!exponiendo!al!péptido!de!
fusión!HA2,!que!se!inserta!a!la!membrana!endosómica.!(c)!La!HA!sufre!un!doblamiento,!acercando!la!membrana!
endosómica!a!la!membrana!viral.!(d)!Al!tocarse,! la!capa!interna!de!la!membrana!endosómica!se!fusiona!con!la!
externa!de!la!viral!formando!una!estructura!de!“tallo”.!(e)!Se!sigue!doblando!la!HA,!ocasionando!que!se!junten!
más! las! membranas,! creando! un! diafragma! de! hemifusión,! el! cual! eventualmente! se! rompe! por! la! tensión,!
creando!así!el!poro!de!fusión!(f).!Obtenido!de!(Cross!et!al.,!2001)!
!
Al! interior!del!núcleo!ocurre!la!transcripción!y!replicación!del!genoma!viral.!Se!
llevan!a!cabo!tres!reacciones:!1)!a!partir!del!RNA!viral!de!sentido!negativo!(vRNA(\))!
se! genera! RNA! de! sentido! positivo,! el! cual! se! conoce! como! RNA! complementario!
(cRNA);!!2)!el!cRNA!funciona!como!plantilla!para!la!formación!de!más!vRNA(\);!3)!a!
a"Virus"del"influenza"internalizado"en"endosoma" b"Pép5do"de"fusión"insertado"en"membrana"endosómica"
Membrana"celular"endosómica" Citoplasma"celular" Membrana"celular"endosómica"
Trímero"de"HA"
Membrana"
viral"
Lumen"
endosómico"
Pép5do"de"fusión"HA2""
Pép5do"
transB
membrana"
HA1l""
Membrana"
viral"
Pép5do"de"
fusión"HA2""
c"Doblamiento"de"HA"aBhelices"" d"Formación"del"tallo"
Tallo"
e"Hemifusión" f"Formación"del"poro"de"fusión"
Diafragma"de"
hemifusión" Poro"
de"
Fusión"
Pép5do"de"fusión"HA2""
Pép5do"transBmembranal""
Hipótesis"del"talloBporo""para"la"fusión"membranal"mediada"por"la"hemaglu5nina"
(HA)"de"la"influenza"
! 10!
partir! del! vRNA(\)! se! produce! mRNA! viral! para! la! traducción! de! proteínas.! La!
formación!de!vRNA(\)!y!de!mRNA!viral!ocurren!de!manera!simultánea!en!la!célula.!
La! transcripción! y! replicación! del! vRNA! es! realizada! por! la! RNA! polimerasa! viral!
dependiente!de!RNA,!la!cual!está!constituida!por!las!proteínas!virales!PB1,!PB2!y!PA.!!
Los! segmentos! de! RNA! viral! tienen! complementariedad! invertida! en! sus!
extremos.!Esto!permite!que!se!doblen!sobre!si!mismos!formando!en!cada!extremo!
pequeñas! asas! de! cuatro! nucleótidos! con! tallos! de! dos! pares! de! bases.! Estas!
estructuras! funcionan!como!oligonucleótidos!para! la!RNA!polimerasa! (Crow!et!al.,!
2004).!A!partir!de!estos!segmentos!se!produce!el!cRNA,!que!es!a!su!vez!es!utilizado!
como!la!base!de!producción!de!más!vRNA(\).!Los!segmentos!vRNA(\)!replicados!en!
el! núcleo! se! exportan! en! forma! de! nuevos! vRNPs! (con! las! nuevas! proteínas!
derivadas!de!la!traducción)!gracias!a!la!unión!a!NEP!y!forman!los!componentes!de!
nuevas!partículas!virales.!
La!síntesis!de!mRNA!viral!a!partir!del!vRNA(\)!depende!de!la!actividad!de!la!RNA!
polimerasa! II! de! la! célula! hospedera.! El! vRNA(\)! tiene! una! cola! de! poli\T! (que! se!
transcribirá!en!una!cola!poliadenilada!en!el!mRNA!viral),!sin!embargo,!no!tiene!una!
estructura!de!cubierta!cap!metilado!en!su!extremo!5’.!Para!que!se!pueda!transcribir!
en!mRNA!viral!debe!de!obtener!una!estructura#cap!de!un!mRNA!celular.!Para!esto,!la!
PB2! de! la! polimerasa! se! une! al! cap! de! un! pre\mRNA! celular.! Luego! PB1! hace! un!
corte! a! unos! 10! a! 15! nucleótidos! de! la! unión! a! través! de! su! actividad! de!
endonucleasa.!El!cap!que!fue!“robado”!del!mRNA!celular!se!une!al!RNA!viral!(\)!y!se!
utiliza!como!primer!de! la! transcripción.!Después!de! la! transcripción!se!obtiene!un!
mRNA! viral! de! sentido! positivo! con! cola! poliadenilada! y! con! estructura! cap,!
! 11!
parecedio! a! un!mRNA! celular.! ! Este! es! exportado! al! citoplasma! celular! en! donde!
ocurre! la! traducción! y! producción! de! las! proteínas! virales! necesarias! para! la!
formación!de!nuevos!vRNPs!(Boivin!et!al.,!2010).!!!
Los!nuevos! componentes!virales!migran!hacia! la!membrana!apical!de! la! célula!
hospedera!en!donde!se!lleva!a!cabo!la!liberación!de!las!nuevas!partículas!virales.!El!
mecanismo!por!el!cual!migran!todavía!no!se!conoce!del!todo,!aunque!se!sabe!que!las!
proteínas!membranales!HA,!NA!y!M2!tienen!señales!de!migración!en!su!extremo,!y!
se! cree! que! las! demás! son! reclutadas! por! M1! (Palese! et! al.,! 2007).! Antes! de! la!
liberación! de! las! nuevas! partículas! virales,! y! para! que! estas! sean! infecciosas,! se!
deben!asociar!las!ocho!vRNPs!que!codifican!para!las!once!proteínas!virales.!Existen!
dos!modelos! que! proponen! el!mecanismo!de! asociación:! el! azaroso! y! el! selectivo.!
Aproximadamente,! sólo! el! 12%! de! las! partículas! virales! liberadas! son! infecciosas!
(Nayak!et!al.,!2009).!Una!vez!asociados!los!componentes!virales,!!la!acumulación!de!
M1! inicia! el! abultamiento! de! la! membrana! celular! y! la! extrusión! de! una! nueva!
partícula!viral,!la! cual! se!mantiene!anclada!a! la! célula!por! la!unión!de!HA!al!ácido!
siálico.! La! liberación!depende!de! la! actividad! enzimática! de! la!NA!que! corta! estas!
uniones!y!también!se!encarga!de!eliminar!el!ácido!siálico!de!las!glicoproteínas!de!la!
membrana!viral!para!evitar!que!las!partículas!virales!se!conjuguen!entre!ellas!(Fig.!
3).!!
La!liberación!de!nuevos!virus!completa!el!ciclo!biológico!del!virus!de!influenza!A.!
Las!partículas!virales! liberadas! infectan!a! las!células!aledañas!y!repiten!el!proceso!
de!infección,!creando!daño!tisular!y!sistémico.!
)
! 12!
)
Figura)3.)Representación)esquemática)del)ciclo)biológico)del)virus)de)influenza.!!La!HA!del!virus!se!une!al!
ácido! siálico! con!unión!α\2,6!o!α\2,3!y!entra!a! la! célula!por!endocitosis.!El!bajo!pH!del! endosoma!provoca!un!
cambio!conformacional!en!la!HA!que!expone!al!péptido!de!fusión!responsable!de!fusionar!la!membrana!viral!con!
la!del!endosoma.!El!ambiente!ácido!también!activa!a!las!proteínas!M2!que!acidifican!el!núcleo!viral,!liberando!a!
las!vRNPS!de!la!matriz!de!M1.!Las!vRNPs!entran!al!citoplasma!y!son!dirigidas!al!núcleo.!Dentro!del!núcleo!se!da!
la!replicación!y!traducción!a!través!de!la!RNA!polimerasa!dependiente!de!RNA.!A!partir!del!(\)vRNA!se!crea!RNA!
complementario! de! sentido! positivo! (+)cRNA! y!mRNA.! A! partir! del! cRNA! se! crea!más! (\)vRNA.! El! mRNA! se!
exporta! al! citoplasma! para! su! traducción.! Se! cree! que! el! (+)svRNA! es! el! mediador! entre! la! replicación! y! la!
traducción.! Las! proteínas! necesarias! para! la! replicación! y! traducción! entran! al! núcleo,! y! nuevas! vRNPs! se!
exportan! con! ayuda!de!M1!y!NEP.! Las! vRNPs!migran!hacia! la!membrana! celular! en!donde! se! ensamblan! y! la!
acumulación!de!M1!incita!la!extrusión!de!una!nueva!partícula!viral.!La!liberación!de!la!partícula!depende!de!la!
actividad! de! NA,! la! cual! corta! las! uniones! entre! HA! y! el! ácido! siálico! de! la! membrana! celular.! ! Obtenido! de!
(Medina!and!García\Sastre,!2011).!
!
2.2.3#Evolución#de#la#influenza#
Los!virus!de!influenza!se!clasifican!según!el!tipo!de!HA!o!NA!que!presentan!en!
su! superficie.! Estas! variaciones! antigénicas! son! producto! de! dos! procesos!
principales:!deriva!antigénica!y!rotación!antigénica.!Deriva!antigénica!es!el!proceso!
por!el!cual!cambios!en!aminoácidos!de!las!proteínas!de!HA!y!NA!son!seleccionados,!
creando! nuevas! cepas! virales! que! no! difieren! radicalmente! entre! ellas.! Por! lo!
general,!estos!cambios!son!los!responsables!de! la!generación!de!virus!estacionales!
con!nuevas!características!estructurales.!A!pesar!de!que!son!cambios!menores,!son!
Receptor(con(
α+2,3+SA(o(α+2,6+SA((
Núcleo(
Bajo(pH(
Traducción(
Apoptosis(
Endocitosis( Ensamblaje(
Procesamiento(
post+traduccional(
Respuesta( anCviral(
mediado(por(IFN(
Fusión(y(liberación(
de(vRNPs(
! 13!
suficientes!para!evadir!la!inmunidad!adquirida!y!vacunas!desarrolladas!en!contra!un!
virus!estacional!específico.!
!La! rotación! antigénica! es! un! proceso! más! drástico,! pues! se! refiere! a! la!
inserción!de!todo!un!segmento!de!RNA!de!un!virus!a!otro!(facilitado!por!el!genoma!
segmentado!del!virus)!creando!un!virus!recombinante!totalmente!nuevo!al!que!no!
se! tiene!previa! inmunidad.!La! inserción!de!un!nuevo! subtipo!de!HA!a!un!virus!de!
influenza!circulando!en!humanos!está!asociado!a!pandemias!(Gatherer,!2009).!!
En! el! caso! del! virus! pandémico! del! año! 2009,! la! adquisición! de! un! nuevo!
subtipo!de!HA!no!fue!necesaria!para!provocar!una!pandemia,!pues!el!H1!de!la!cepa!
pandémica! de! 2009! se! origina! de! la! cepa! pandémica! de! 1918! y! se! ha!mantenido!
“congelado”,! es! decir,! ha! sufrido! pocas!modificaciones! por! falta! de! selección! o! de!
deriva! antigénica! en! puercos.! Por! esto,! sólo! personas! de! edad! avanzada! podrían!
tener!algún!tipo!inmunidad!(Medina!and!García\Sastre,!2011).!!
$
2.3$El$virus$de$influenza$pandémica$A/H1N1$
$
2.3.1#Origen#y#estructura#del#virus#pandémico#A/H1N1#
En! 1918! surgió! una! epidemia! de! influenza! en! el! mundo! que! infectó!
aproximadamente! a! un! tercio! de! la! población! mundial,! y! se! calcula! que! provocó!
entre! 50! y! 100! millones! de! muertes.! Esta! pandemia! es! la! más! letal! que! se! ha!
registrado! en! la! historia! (Taubenberger! and! Morens,! 2008).! Todos! los! virus! de!
influenza!tipo!A!que!han!causado!pandemias!desde!ese!año,!como!el!virus!H1N1!de!
1977! (Taubenberger! and! Morens,! 2006),! el! virus! H1N1! de! 2009! (Sullivan! et! al.,!
! 14!
2010),!y! la!mayoría!de! las! infecciones!por! influenza!A!en!el!mundo!a!partir!de!ese!
año,! ! han! sido! descendientes! del! virus! pandémico! de! 1918! (Taubenberger! and!
Morens,!2006).!
Desde! la! gran! pandemia,! el! virus! A/H1N1! ha! prevalecido! en! el! mundo!
provocando! infecciones!estacionales,!desapareciendo!brevemente!en!1957!cuando!
surgió!el!virus!H2N2!(que!contenía! información!genética!aviar!con! la!del!H1N1)!y!
regresando!en!1977.!En!1998!apareció!una!cepa!triple\recombinante!en!puercos!en!
Estados! Unidos! que! contenía! 5! segmentos! de! la! cepa! clásica! A/H1N1! norte!
americana!y!polimerasas!tanto!aviares!como!humanas.!El!virus!pandémico!del!2009!
contiene!6!segmentos!de!este!virus!triple\recombinante!de!1998!y!2!segmentos!del!
virus! A/H1N1! euroasiático! porcino! (Sullivan! et! al.,! 2010)! (Fig.! 4).! Probablemente!
este!virus!se!originó!de!otros!que!llevaban!circulando!en!poblaciones!de!puercos!por!
aproximadamente!una!década!sin!ser!detectado.!
!
!
!
!
!
! 15!
!
)
Figura)4.)Origen)del)virus)pandémico)"antigénicamente)congelado")del)2009.)Virus!de!!influenza!similares!
al! virus! H1N1! pandémico! de! 1918! se! establecieron! en! puercos! domésticos! entre! 1918! y! 1920;! esta! cepa! es!
conocida!como!la!cepa!porcina!clásica.!En!1979,!un!virus!H1N1!euroasiático!similar!al!aviar!surgió!en!puercos!
europeos!y!desde!entonces!ha!circulado! junto!con!el!virus!porcino!clásico.!En!1990!surgieron!virus!de!origen!
porcino!triple\recombinantes!de!H1!con!diferentes!subtipos!(H3N2!y!H1N2)!y!predominaron!en!Norteamérica.!A!
partir!de!estos!virus!se!generó!el!virus!pandémico!H1N1!del!2009.!Este!está!compuesto!de!PB2!y!PA!de!los!virus!!
aviares!norteamericanos,!PB1!del!virus!H3N2!de!humano,!HA,!NP!y!NS!del!virus!H1N1!porcino!clásico,!!y!NA!y!M!
de!los!virus!porcinos!euroasiáticos!similares!al!aviar.! !Análisis!antigénicos!y!de!secuencia!demuestran!que!hay!
similitudes!entre! la!HA!del!virus!de!1918!y! la!HA!del!virus!pandémico!del!2009,!y!están! representados!como!
modelos!de!la!configuración!tridimensional!de!la!cabeza!de!HA!visto!desde!arriba.!Los!sitios!antigénicos!de!HA!
están!en!azul!claro,!mientras!que! los!sitios!no!antigénicos!están!representados!en!azul!oscuro.! !Los!sitios!que!
difieren!entre! las!HA!del!virus!de!1918!y!el!del!2009!están! representados!en! rojo.! !Obtenido!de! (Medina!and!
García\sastre,!2011))
AA"H1N1"
H"
H1N1"1918"
H1N1"porcino"clásico" Aviar"Norteamericano" H3N2"Humano"
H1N2"porcino"
norteamericano""
H3N2"porcino"
norteamericano"
H1N1"porcino"
euroasiá9co"
similar"al"aviar"
Emergencia"del"H1N1""
pandémico"
HA"del"H1N1"de"1918"
HA"del"H1N1"del"2009"
HA"an9génicamente"
similar""por"falta"de"
presión"selec9va"en"
puercos"y"de"deriva"
en"si9os"an9génicos"
específicos"
"al"puerco"
HA"“an9génicamente"
congelado”"capaz"de"causar"
una"nueva"pandemia"
! 16!
Las!HA!del!virus!de!influenza!humana!H1!y!H3!reconocen!preferencialmente!
a!las!uniones!α2,6!de!los!ácidos!siálicos,!éstos!se!encuentran!de!manera!abundante!
en! el! tracto! respiratorio! superior! del! humano.! En! cambio,! los! virus! de! influenza!
aviar! reconocen!principalmente! a! las!uniones!α2,3,! los! cuales! se! encuentran!en! el!
intestino!de!las!aves!y!en!el!tracto!respiratorio!inferior!de!los!humanos.!Los!puercos!
tienen!los!dos!receptores!en!la!tráquea!y!son!susceptibles!a!la!infección!por!ambos!
virus,!por!lo!que!se!propone!que!son!el!receptáculo!ideal!para!la!recombinación!de!virus! de! humano! y! aviares! por! rotación! antigénica! y! la! generación! de! nuevos!
potencialmente! pandémicos! (Medina! and! García\Sastre,! 2011).! El! virus! A/H1N1!
pandémico,!por!ser!triple!recombinante,!tiene!la!capacidad!de!unirse!tanto!a!ácido!
siálico!α2,3!como!al!α2,6!(Chan!et!al.,!2010),!por!lo!cual!infecta!a!células!alveolares!
epiteliales! en! el! tracto! respiratorio! tanto! superior! como! inferior! de! los! humanos!
(Wang!et!al.,!2011).!
!
2.3.2#Patogenicidad#y#cuadro#clínico#
Los! grupos! menores! de! 35! años! fueron! los! más! afectados! por! el! virus! de!
influenza!pandémica,!mientras!que!aquellos!mayores!de!65!años!tenían!anticuerpos!
en! su! suero! que! les! brindaba! protección! cruzada,! probablemente! por! haber! sido!
expuestos!al!virus!H1N1!de!1918!o!derivados!de!este.!Por!ser!tan!similares!el!virus!
de! 1918! y! el! del! 2009! en! ciertas! secuencias,! la! vacunación! en! contra! del! virus!
pandémico! del! 2009! también! podría! brindar! protección! contra! el! de! 1918.! Los!
grupos!con!el!mayor!riesgo!de!desarrollar!enfermedades!graves!o!de!muerte!eran!
mujeres! embarazadas,! niños!menores!de!dos! años,! o! aquellos! con! comorbilidades!
! 17!
como! enfermedades! respiratorias! crónicas,! obesidad! y! diabetes.! Sin! embargo,!
existieron! casos! de! infecciones! severas! y! muertes! en! jóvenes! sanos! (Medina! and!
García\Sastre,! 2011).! Los! síntomas! más! comunes! en! la! infección! con! el! virus!
pandémico! fueron! fiebre,! tos,! dolor! de! cabeza,! dolor!muscular,! dolor! de! garganta,!
obstrucción!nasal,!conjuntivitis,!dolor!abdominal!y!escalofríos!(Zepeda\Lopez!et!al.,!
2010).!
Una! parte! de! los! individuos! infectados! con! el! virus! pandémico! del! año! 2009!
desarrollaron! formas!graves!de!neumonía,!asociada,!en!muchos!casos,!a! la! falla!de!
otros!órganos,!principalmente!del!riñón.!La!severidad!de!la!infección!por!el!virus!de!
influenza! pandémica! respecto! a! la! influenza! estacional! se! ha! relacionado! con! la!
inducción!de!una!respuesta!pro\inflamatoria!exacerbada,!provocada!por!la!llamada!
“tormenta!de!citocinas”.!Se!ha!demostrado!que!pacientes!con! infección!pandémica!
severa!presentan!elevados!niveles!de!citocinas!IL\2,!IL\12,!IL\17,!IL\23!y!sobre!todo!
de!IL\6!e!IL\10!respecto!a!sujetos!sanos!y!pacientes!con!enfermedades!no!asociadas!
a!la!influenza!(Yu!et!al.,!2011).!También!se!ha!observado!que!los!niveles!de!citocinas!
de! la! inmunidad! adaptativa! Th1/Th17! se! encuentran! suprimidos! comparado! con!
infecciones! estacionales! (Lee! et! al.,! 2011).! ! Uno! de! los! mecanismos! que! ha! sido!
propuesto! para! la! inducción! de! esta! tormenta! de! citocinas! es! a! través! de! la!
inhibición! de! SOCS\1,! una! familia! de! proteínas! que! suprime! la! señalización! de!
citocinas! como! mecanismo! celular! antiviral! (Ramirez\Martinez! et! al,! 2012).! Sin!
embargo,!falta!mucho!por!conocer!sobre!los!mecanismos!que!determinan!la!elevada!
severidad!de!la!infección!del!virus!de!influenza!pandémica!del!2009.!!
!
! 18!
2.4 microRNAs$
$
2.4.1 Descubrimiento#
En! 1993,! mientras! se! investigaban! los! defectos! en! el! control! temporal! del!
desarrollo!post\embrionario!de!C.#elegans,!se!descubrió!que!el!gen!linK4!no!codifica!
para! una! proteína,! sino! que! produce! un! par! de! RNAs! pequeños:! uno! de! 22!
nucleótidos!de! longitud,!y!uno!de!61,!el!cual!parecía!ser!el!precursor!del!pequeño.!
Luego!se!demostró!que!los!RNAs!pequeños!de!linK4!tienen!complementariedad!con!
la!región!no!transcrita!del!extremo!3’!(3’!UTR)!del!gen! linK14.!Esta!región!se!había!
descrito! como!mediadora! de! la! represión! del! gen! a! través! del! producto! de! linK4.!
Finalmente,! se! demostró! que! la! regulación! de! linK14! a! través! del! RNA! pequeño!
(producto! de! linK4)! resulta! en! una! disminución! de! la! proteína! LIN\14,! pero! no! en!
una! disminución! de! su! mRNA.! Así,! se! propuso! un! modelo! de! regulación! post\
transcripcional!a!través!de!la!unión!del!RNA!pequeño!producido!por!linK4!al!mRNA!
de! linK14.! Esta! regulación! es! clave! para! el! paso! de! la! primera! etapa! larval! a! la!
segunda!durante!el!desarrollo!del!nemátodo!(Bartel!et!al.,!2004).!!
En!el!año!2000,!casi!siete!años!después!del!descubrimiento!de!linK4,!se!describió!
en! C.# elegans#a# letK7:! el! segundo!microRNA! (término! acuñado! hasta! el! año! 2001)!
descrito,!regulador!de!linK41!y!linK57.!Tanto!letK7!como!linK41!son!genes!ampliamente!
conservados!en!diferentes!especies!de!animales,!incluyendo!a!los!humanos.!Esto!dio!
pie!a! la!búsqueda!de!microRNAs!en!distintas!especies!y!vías!de! regulación!celular!
(He!and!Hannon,!2004).!
! 19!
A!la!fecha,!doce!años!después!del!descubrimiento!del!segundo!microRNA,!se!han!
descrito! 25,141! microRNAs! maduros! en! 193! especies! diferentes! (incluyendo!
plantas,! virus! y! bacterias),! de! los! cuales! 2042! se! encuentran! en! Homo# sapiens#
(miRBase!v.19,!2012).#
#
2.4.2#Generalidades#
Los! microRNAs! son! RNAs! pequeños! de! hebra! sencilla,! no\codificantes! y!
altamente! conservados! que! miden! aproximadamente! de! 19! a! 22! nucleótidos.! Su!
función!es!regular!la!expresión!de!genes!suprimiendo!la!producción!de!proteínas!al!
unirse!y!degradar!o!inhibir!la!traducción!del!mRNA!blanco.!Se!estima!que,!a!pesar!de!
que!sólo!1%!del!genoma!codifica!para!microRNAs,!aproximadamente!un!tercio!del!
genoma!humano!es!regulado!por!ellos!(Sun!et!al.,!2010).! !Estudios! indican!que! los!
microRNAs!están!involucrados!en!la!regulación!de!prácticamente!todos!los!procesos!
celulares,! y! que! cambios! en! su! expresión! están! asociados! a! estados! patológicos!
como!el!cáncer!(Filipowicz!et!al.,!2008).!!
Se!calcula!que! la!aparición!de! los!microRNAs!ocurrió! junto!con! los!grandes!
episodios!de!duplicación!del!genoma!que!coinciden!con!la!aparición!de!bilaterales,!
vertebrados! y!mamíferos.! Probablemente! estuvieron! involucrados! en! la! aparición!
de!estos!organismos!multicelulares!por!contribuir!a!la!complejidad!de!la!regulación!
genética!(Shomron!et!al.,!2009).!Ahora,! los!microRNAs!funcionan!como!represores!
del! genoma! de! todos! los! phyla! de! plantas! y! de! animales.! A! través! de! estudios!
bioinformáticos! se! ha! encontrado! que! de! 18! a! 30! familias! de! microRNAs! se!
encuentran!de!manera!conservada!en!todos!los!bilaterales,!tal!como!el!famoso!letK7.!!
! 20!
Sin!embargo,!estos!microRNAs!no!se!encuentran!en!plantas,!lo!cual!apoya!la!idea!de!
una!evolución!independiente!entre!los!microRNAs!de!plantas!y!animales!(Chen!and!
Rajewsky,!2007).!!
Los!microRNAs!provienen!de!un!transcrito!precursor!(pre\microRNA),!cuya!
longitud!es!de!aproximadamente!70!nucleótidos!(en!animales)!y! tiene! la! forma!de!
un! tallo! con! un! asa! terminal.! Tienen! estructuras! de! cubierta! cap! y! colas!
poliadeniladas.!La!mayoría!de!los!microRNAs!se!encuentran!codificados!en!regiones!
intergénicas,! aunque! se! han! encontrado! varios! posicionados! en! intrones! (≈25%).!
Pueden! clasificarse! según! su! localización:! microRNAs! exónicos,! microRNAs!
intrónicos! en! regiones! no\codificantes! y! microRNAs! intrónicos! en! regiones!
codificantes!para!proteínas.!Se!desconoce!si!en!este!último!caso!se!puede!codificar!
para! ambas! a! la! vez! o! se! deba! escoger! entre! uno! de! los! dos! productos.! Se! ha!
encontrado! que! aproximadamente! el! 50%! de! los! microRNAs! se! encuentran!
próximos!a!otros!formando!grupos,!los!cuales!se!transcriben!como!una!sola!unidad!
(Kim,!2005).!!
!
2.4.3#Biogénesis#
Los!genes!que!codifican!para!microRNAs!son!transcritos!por!la!enzima!RNA!
polimerasa! II,! formando! transcritos! primarios! denominadas! pri\microRNAs.! Estos!
pri\microRNAs! son! secuencias! de! varias! kilobases! de! longitud! que! dentro! de! su!
secuencia!contienen!una!estructura!con!forma!de!tallo\asa.!Esta!estructura!terciaria!
de! tallo\asa!es! reconocida!y!hendida!del! transcrito!primario!a! través!de! la!enzima!
RNasa!III!Drosha!que!actúa!a!aproximadamente!22!nucleótidos!del!asa!terminal.!Así!! 21!
se!libera!el!precursor!del!microRNA!maduro,!denominado!pre\microRNA.!Este!pre\
microRNA,! formado! por! un! “tallo”! de! doble! hebra! y! una! “asa”! terminal! de!
aproximadamente!10!nucleótidos,!tiene!en!total!de!60!a!80!nucleótidos!de!longitud.!!
La! formación! del! pri\microRNA! y! el! procesamiento! del! pre\microRNA!
ocurren! en! el! núcleo.! ! Posteriormente,! el! pre\microRNA!debe!de! ser! exportado! al!
citoplasma.!Esta!exportación!ocurre!a!través!de!poros!nucleares!y!es!mediado!por!la!
proteína!exportina\5,!que!se!une!al!cofactor!Ran\GTP.!Después!de!la!exportación,!se!
hidroliza!el!GTP!formando!GDP!y!se!libera!el!pre\microRNA!de!la!exportina\5!(Kim,!
2005).!!
Una!vez!en!el! citoplasma,! la!enzima!RNasa! III!Dicer!elimina!el!asa! terminal!
del! pre\microRNA! formando! un! micro\RNA! dúplex! de! aproximadamente! 22!
nucleótidos.!Este!dúplex!es!imperfecto!y!contiene!al!microRNA!maduro!y!a!su!hebra!
complementaria,! conocido! como! microRNA! estrella! (microRNA*).! Este! dúplex! no!
persiste!por!mucho! tiempo!en! la! célula,! ya! que!una!de! las! hebras! es! seleccionada!
como! el! microRNA!maduro! y! la! otra! hebra! es! degradada.! ! El! reconocimiento! del!
mRNA! blanco! y! la! eficiencia! del! microRNA! maduro! depende! de! que! éste! sea!
incorporado!al!complejo!de!silenciamiento!inducido!por!RNA!(RISC).!Se!ha!visto!que!
el!microRNA!que!es!seleccionado!para!entrar!al!RISC!es!aquel!que!tiene!una!mayor!
inestabilidad! en! su! extremo! 5’! por! la! facilidad! con! la! cual! se! puede! separar! del!
dúplex.!El!microRNA!estrella,! al!no!ser! incorporado!a!este!complejo,!es! fácilmente!
degradado.!En!los!raros!casos!en!los!que!la!inestabilidad!del!extremo!5’!sea!parecida!
en!ambas!hebras,!!la!frecuencia!con!la!cual!se!incorporan!al!RISC!es!similar!(He!and!
Hannon,! 2004).! En! humanos,! las! cuatro! proteínas! centrales! de! RISC! son! las!
! 22!
proteínas! Argonauta! (1\4).! La! represión! de! la! traducción! depende! de! la!
incorporación!del!microRNA!al!RISC!(Macfarlane!and!Murphy,!2010)!(Fig.!5).!
!
!
!
Figura) 5.) Representación) esquemática) de) la) biogénesis) de) los)microRNAs.)Los!genes!que!codifican!para!
microRNAs!se!transcriben!por!la!RNA!polimerasa.!Los!microRNAs!primarios!(pri\microRNAs)!resultantes!de!esa!
transcripción! son! hendidos! por! la! enzima!Drosha,! resultando! en! el! precursor! del!microRNA! (pre\microRNA)!
cuya!estructura!es!de!un! tallo!con!un!asa! terminal!de!aproximadamente!70!nucleótidos!de! longitud.!Este!pre\
microRNA!es!exportado!del!núcleo!por!la!proteína!nuclear!Exportina!5.!En!el!citoplasma,!la!enzima!Dicer!elimina!
el! asa! terminal! creando! un! microRNA! dúplex.! La! enzima! helicasa! abre! el! dúplex,! y! una! de! las! hebras,! el!
microRNA!maduro,!se!carga!al!complejo!RISC!mientras!que!su!hebra!complementaria!es!degradada.!!El!complejo!
RISC! dirige! los! microRNAs! a! su! mRNA! blanco.! Si! la! complementariedad! entre! el! microRNA! y! su! blanco! es!
perfecto,!el!mRNA!es!hendido.!Si!es!imperfecto,!la!traducción!es!reprimida.!Obtenido!de!(Yang!et!al.,!2011).!
!
!
#
#
Citoplasma*
Núcleo*
DNA$genómico$
Pri/microRNA$
Pre/microRNA$
Pre/microRNA$
microRNA$duplex$
microRNA$
maduro$
Complejo$RISC$
microRNA*$
Expor=na$5$
Degradación$
Degradación$
del$mRNA$
Represión$
traduccional$
! 23!
2.4.4#Mecanismos#de#represión#
Existen!dos!maneras!principales!por!las!cuales!los!microRNAs!pueden!inhibir!
la!traducción:!por!degradación!o!corte!del!mRNA,!o!por!inhibición!de!la!traducción.!
La!degradación!o!el!corte!del!mRNA!ocurre!cuando!existe!una!complementariedad!
perfecta!entre!los!primeros!2\8!nucleótidos!del!microRNA!(conocido!como!la!región!
semilla)!y!la!región!no\traducida!del!extremo!3’!de!su!mRNA!blanco.!La!degradación!
ocurre! a! través! de! la! des\adenilación! y! subsecuente! desintegración! del! mRNA,!
mientras! que! el! corte! es! mediado! por! la! proteína! Ago! 2! del! RISC.! Si! la!
complementariedad!no!es!perfecta,!la!traducción!es!inhibida!sin!afectar!la!integridad!
del! mRNA! (Bartel! et! al.,! 2004).! En! plantas,! los! microRNAs! y! sus! blancos! suelen!
unirse!por!complementariedad!perfecta.!En!animales,!la!mayoría!de!los!microRNAs!
no!son!perfectamente!complementarios!a!sus!blancos!(Ambros,!2004),!por!lo!que!la!
degradación!del!mRNA!es!menos! común.!Esta! complementariedad! imprecisa! es! la!
que!permite!que!un!mismo!microRNA!se!una!a!un!vasto!rango!de!mRNAs,!y!que!cada!
mRNA! sea! blanco! de! diversos!microRNAs,! provocando! un! efecto! regulatorio!muy!
amplio.!!
Existe! aún! mucha! discrepancia! sobre! el! mecanismo! de! inhibición! de! la!
traducción.! La! traducción! del! mRNA! se! puede! dividir! en! tres! etapas:! iniciación,!
elongación! y! terminación.! Se! han! propuesto! modelos! para! la! inhibición! de! la!
traducción! en! cada! una! de! estas! etapas.! En! la! iniciación,! las! subunidades! del!
ribosoma!no!son!reclutadas;!durante!la!elongación,!las!subunidades!del!ribosoma!se!
disocian;!o!no!pueden!desasociarse!al!término!de!la!elongación!(Sun!et!al.,!2010).!Lo!
más!probable!es!que!no!exista!un!solo!proceso!por!el!cual!ocurra!la!inhibición,!sino!
! 24!
que! sean! un! conjunto! de! procesos! que! actúan! en! diferentes! momentos,! lo! cual!
podría!explicar!una!regulación!más!rápida!y!precisa!de! la! traducción!(Gu!and!Kay,!
2010).!
!
2.4.5#microRNAs#en#enfermedades##
Cuando! se! comenzaron! a! mapear,! muchos! microRNAs! se! encontraron! en!
sitios!del!genoma!asociados!a! cáncer,! lo! cual! llevó!a!que!se!descubriera!que!están!
diferencialmente!expresados!en!células!cancerosas!respecto!a!células!sanas.!!Ahora!
son!ampliamente!utilizados!como!biomarcadores!para!el!diagnóstico!de!cáncer,!y!se!
han! encontrado! interfiriendo! en! las! vías! regulatorias! de!muchos! tipos! del!mismo!
(Yang!et!al.,!2011).!!Sin!embargo,!los!microRNAs!no!sólo!tienen!un!papel!importante!
en!el!cáncer.!!miR\133b!es!un!regulador!importante!de!neuronas!dopaminérgicas,!y!
su!deficiencia!está!relacionada!con! la!enfermedad!de!Parkinson.!miR\126! juega!un!
papel! importante! en! la! angiogénesis,! y! su! desregulación! provoca! problemas!
hematológicos!graves.!miR\21!está! involucrado!en!enfermedades!cardiovasculares,!
miR\15b!y!miR\16!están!expresados!a!la!baja!en!enfermedades!gastrointestinales,!y!
miR\375!afecta!la!producción!de!insulina!en!diabéticos!(Huang!et!al.,!2011).!
Los!microRNAs!también!están!involucrados!en!infecciones!virales.!Los!virus!
utilizan!a!los!microRNAs!para!controlar!a!su!célula!hospedera!y!la!célula!utiliza!a!los!
microRNAs!para!interferir!en!las!funciones!virales!(tanto!de!virus!de!RNA!como!de!
DNA).!El!primer!microRNA!que!se!encontró! involucrado!en!una! infección!viral! fue!
miR\S1,! el! cual! es! manipulado! por! el! virus! espumoso! de! primates! tipo! 1! para!
impedir!que!células!infectadas!sean!detectadas!por!el!sistema!inmune!(Huang!et!al.,!
! 25!
2011).!!El!virus!del!herpes!tipo!1!(HSV\1)!inhibe!la!apoptosis!de!células!infectadas!al!
inhibir! la!vía!del!TGF\β!a! través!de!microRNAs!(Song!et!al.,!2010).!Los!microRNAs!!
también! juegan! un! papel! importante! en! la! protección! de! la! célula! durante!
infecciones,! por! ejemplo!miR\122! inhibe! la! replicación! del! virus! de! la! hepatitis! C,!
mientras! que! mir\125b,! miR\223,! y! miR\198! atenúan! al! virus! de! la!
inmunodeficiencia!humana!(VIH).!!
Se! han! realizado! varios! estudios! que! vinculan! al! virus! de! influenza! A! con!
cambios! en! la! expresión! de!microRNAs! celulares.! La! sobreexpresión! de!miR\323,!
miR\491,! y! miR\654! tiene! un! efecto! antiviral! durante! el! proceso! de! infección! al!
regular! negativamente! a! PB1! e! inhibir! la! replicación! del! virus! H1N1! (Song! et! al.,!
2010).! Otro! estudio! demuestra! que! el! virus! de! influenza! A! de! 1918! y! el! virus!
estacional! A/Texas/36/91! pueden! alterar! la! expresión! de! microRNAs! (Li! et! al.,!
2010a).!En!un!tercer!estudio!se!infectaron!células!A549!con!dos!cepas!de!influenza!A!estacionales! (A/Udorn/72! y! A/WSN/33)! y! se! encontró! una! sobreexpresión! de!
microRNAs!involucrados!en!la!regulación!de!proteínas!de!señalización!importantes!
en! la! respuesta! celular! ante! una! infección! (miR\7,! miR\132,! miR\146a,! miR\187,!
miR\200c!y!miR\1275)!(Buggele!et!al.,!2012).!Esto!revela!la!capacidad!que!tiene!el!
virus!de!influenza!A!para!aumentar!la!expresión!de!microRNAs!celulares!de!manera!
selectiva.!No!se!conocen!microRNAs!cuya!expresión!sea!modificada!por!el!virus!de!
influenza!A/H1N1!pandémico!para!su!beneficio!y!su!búsqueda!es!el!objetivo!de!este!
proyecto,!por!la!relevancia!clínica!que!podría!tener.!!
!
!
! 26!
2.5$Células$A549$y$el$virus$de$influenza$estacional$A/PR/8/34$
!
2.5.1#Células#A549#
Las! células! A549! son! células! de! adenocarcinoma! pulmonar! humano.! Esta!
línea! celular! fue! iniciada!por!Gerard! et.! al.! en! 1972.! Tiene!propiedades! de! células!
alveolares!epiteliales!de!tipo!II!(Croce!et!al.,!1999).!Las!células!alveolares!epiteliales!
de! tipo! II! comprenden! el! 15%! del! total! de! las! células! pulmonares.! Son! células!
cuboides!cuya!función!principal!es!mantener!el!microambiente!alveolar!a!través!de!
varias!funciones!como!el!transporte!transepitelial!de!sodio,!homeostasis!de!fluidos!y!
la! proliferación! para! la!manutención! del! epitelio.! También! tienen! la! capacidad! de!
diferenciarse! a! células! alveolares! de! tipo! I,! células! que! recubren! el! 90%! de! la!
superficie! alveolar! y! se! encargan! principalmente! del! intercambio! gaseoso! con! la!
sangre! (Cosgrove!et!al.,!2009).!Son!células!adherentes!que!crecen!en!monocapa! in#
vivo#y!se!replican!cada!22!horas.!!
Las!A549!tienen!en!su!superficie!ácido!siálico!tanto!α2,3!como!α2,6!(Kumari!
et! al.,! 2007),! por! lo! que! se! utilizan! como! modelos! in# vitro! para! la! infección! con!
influenza,!ya!que!permiten!la!replicación!de!diversos!tipos!de!virus,!incluyendo!los!
virus!de!influenza!aviar!tipo!H5N2,!H5N3,!y!H1N1!(Sutejo!et!al.,!2012),!los!virus!de!
influenza! humana! H1N1! estacional! y! pandémico! (Mukherjee! et! al.,! 2011),! entre!
otros.! También! mantienen! las! propiedades! del! tejido! blanco! de! estos! virus,!
incluyendo!las!repuestas!inmunológicas!del!hospedero!en!contra!de!infecciones.!La!
ventaja!de!ser!un!modelo!in#vitro#es!que!se!pueden!monitorear!cambios!celulares!y!
moleculares! (tales! como! la! expresión! de!microRNAs)! ! en! etapas! tempranas! de! la!
infección!(Sutejo!et!al.,!2012).!
! 27!
2.5.2#A/PR/8/34,#el#virus#de#influenza#estacional#H1N1#
El! virus! de! influenza! estacional! A/PR/8/34! es! un! virus! de! influenza!
perteneciente! a! la! familia! Orthomyxoviridae! del! tipo! A/H1N1.! Fue! aislado! de! un!
paciente!en!Puerto!Rico!en!1934.!Es!comúnmente!utilizado!en!estudios!de!influenza!
A!por!estar!bien!caracterizado!y!tener!un!comportamiento!y!sintomatología!típica!de!
un!virus!estacional.!En!este!proyecto!se!utiliza!por!ser!el!mismo!subtipo!que!el!virus!
pandémico! (A/H1N1),! para! que! las! diferencias! de! expresión! de!microRNAs! no! se!
debieran!a!variaciones!estructurales.!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
! 28!
III. JUSTIFICACIÓN)
)
Varios! años! de! estudio! y!monitoreo! previos! para! evitar! una! posible! pandemia!
permitieron! la!detección!y! el!manejo! rápido!de! la!pandemia!del! año!2009.!Ahora,!!
conocer! cómo! surgió! esta! pandemia! y! en! qué! difiere! del! virus! de! influenza!
estacional,!nos!permitirá!estar!mejor!preparados!para!las!inevitables!pandemias!del!
futuro.! Se! requiere! de! mayor! investigación! para! mantener! al! día! vacunas! y!
tratamientos!antivirales,!y!reducir!al!máximo!el!riesgo!a!la!salud!pública.!
A!pesar!de!que!las!funciones!de!las!proteínas!virales!se!han!estudiado!a!fondo!en!
la!última!década,!muy!poco!se!conoce!sobre!los!factores!celulares!involucrados!en!el!
ciclo!de!vida!del!virus!de!influenza,!y!menos!sobre!el!virus!de!influenza!pandémica.!
Se! ha! descrito! que! el! virus! de! influenza! pandémica! A/H1N1! tiene! características!
más!patogénicas!como!una!mayor!capacidad!de!replicación!en!tejido!pulmonar!bajo,!
lesiones!más!graves!en!modelos!experimentales!y!una! fuerte!capacidad!de! inducir!
una! respuesta! inflamatoria! en! relación! a! las! cepas! de! virus! estacional.! Esta!
capacidad!de!inducir!una!respuesta!inflamatoria!exacerbada!ha!sido!demostrada!en!
diferentes! estudios,! en! donde! se! han! detectado! niveles! altos! de! IL\6,! IL\8! y! CCL2!
entre!otras!moléculas!inflamatorias,!en!pacientes!con!formas!severas.!Sin!embargo,!
los! mecanismos! por! los! cuales! el! virus! pandémico! A/H1N1! induce! una! mayor!
cantidad!de!mediadores! inflamatorios!y!una!enfermedad!más!grave!no!se!conocen!
con!claridad.!
Por! esta! razón,! este! proyecto! de! investigación! busca! ampliar! el! conocimiento!
sobre! los! factores! celulares! modificados! en! la! infección! por! el! virus! de! influenza!
! 29!
pandémica! respecto! a! la! infección! con! un! virus! de! influenza! estacional,!
específicamente! en! la! expresión! de! microRNAs,! ya! que! regulan! la! expresión! de!
cientos!de!genes!y!son!críticos!en!la!interacción!entre!el!virus!y!su!célula!hospedera.!
La!alteración!de!la!expresión!de!microRNAs!podría!ser!uno!de!los!mecanismos!por!el!
cual! el! virus! modifica! procesos! celulares! para! su! beneficio! y! aumenta! su!
patogenicidad.!!
!
!
!
!
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!
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!
! 30!
IV. HIPÓTESIS)
)
El!virus!de! influenza!pandémica!A/H1N1!inducirá!una!expresión!diferencial!de!
microRNAs! relacionados! a! la! regulación! de! la! respuesta! inflamatoria! en! células!
A549! en! comparación! con! células! infectadas! con! el! virus! de! influenza! estacional!
A/PR/8/34,! y! esta! expresión! diferencial! tendrá! una! relación! con! la! elevada!
patogenicidad!del!virus!pandémico.!!
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
! 31!
V. OBJETIVOS)
)
#Objetivos#generales#
Determinar! si! existe! una! expresión! diferencial! de!microRNAs! relacionados!
con! la! regulación! de! la! respuesta! inflamatoria! en! células! epiteliales! pulmonares!
A549!infectadas!con!el!virus!de!influenza!pandémica!A/H1N1!y!el!virus!de!influenza!
estacional!A/PR/8/34!a!las!24!horas!post\infección.!
!
#Objetivos#específicos#
• Determinar! qué! microRNAs! se! encuentran! diferencialmente! expresados!
entre! la! infección! con! el! virus! pandémico! A/H1N1! y! el! virus! estacional!
A/PR/8/34.!
• Determinar! qué! microRNAs! se! encuentran! diferencialmente! expresados!
entre! células! infectadas! con! el! virus! pandémico! A/H1N1! y! células! no!
infectadas.!
• Determinar! qué! microRNAs! se! encuentran! diferencialmente! expresados!
entre!células!infectadas!con!el!virus!A/PR/8/34!y!células!no!infectadas.!
• Determinar! en! qué! vías! de! señalización! están! involucrados! los!microRNAs!
diferencialmente!expresados!por!el!virus!A/H1N1!y!cuales!son!sus!posibles!
efectos! biológicos,! con! un! enfoque! especial! en! las! vías! de! regulación! de! la!
inflamación.!
!
!
! 32!
VI. MÉTODOS)
)
)
)
)
)
$
Cul$vo'celular'
de'células'A549'
Expansión'
celular'
Infección'celular'
con'la'cepa'
'A/H1N1'pandémica'
Infección'celular'
con'la'cepa'
'A/PR/8/34'
estacional'
'
24h' 24h'
Extracción'de'RNA'
total'
Extracción'de'RNA'
total'
Obtención'de'
células'
Obtención'de'
células'
Microarreglo'
GeneChip'2.0'
Affymetrix'
Procesamiento'
de'datos'en'
'R'
Análisis'de'datos'
en'DIANA'
mirPath'
Control'
Células'no'infectadas'
Obtención'de'
células'
24h'
Extracción'de'RNA'
total'
x2#
! 33!
Obtención$de$las$cepas$virales$
El!virus!de!influenza!pandémica!A/H1N1!fue!aislado!de!pacientes!con!neumonía!
grave! durante! la! epidemia! de! 2009! en! el! Instituto! Nacional! de! Enfermedades!
Respiratorias! en! México! D.F..! El! virus! de! influenza! estacional! A/PR/8/34! fue!
obtenido!de!ATCC!(no.!de!catálogo!CCL\185).!!
Cultivo$de$células$epiteliales$pulmonares$A549$
Las! células! epiteliales!pulmonares! se! obtuvieron! de! ATCC! (no.! de! catálogo!
CCL\185).!Los!crioviales!se!!introdujeron!en!baño!maría!a!37ºC!hasta!que!las!células!
se!descongelaran.!Posteriormente!se!transfirieron!a!un!tubo!Falcon!con!medio!F12!
suplementado!con!suero!fetal!bovino!(SFB)!al!10%,!y!se!centrifugaron!a!2,000!RPM!
durante!10!minutos.!El!sobrenadante!se!eliminó!y!el!pellet!de!células!se!resuspendió!
en!medio!F12!con!SFB!al!10%!para!que!la!suspensión!quedara!en!un!aproximado!de!
40%!de!células.!Se!transfirieron!5ml!de!la!suspensión!a!cajas!de!cultivo!celular!T25,!
y!se! incubaron!a!37ºC!y!5%!CO2.!Las!cajas!se!observaron!diario!y!se! les!cambió!el!
medio!cada!tercer!día!hasta!que!las!células!llegaran!a!un!100%!de!confluencia.!!
Expansión$de$células$A549$
$
Las!células!A549!tienen!la!característica!de!adherirse!a!las!placas!de!cultivo!
celular.!Al!llegar!al!100%!de!confluencia,!es!necesario!levantar!las!células!de!la!placa!
para!poder!sembrarlas!a!una!menor!densidad!en!más!cajas!de!cultivo,!permitiendo!
así! su!división!y!obteniendo!una!mayor!cantidad!de!células.!Para!esto! se!utiliza! la!
! 34!
tripsina,!polipéptido!de!la!familia!de!las!proteasas!S1!que!corta!uniones!adherentes!
entre!las!células,!y!entre!estas!y!la!caja!de!cultivo.!!
Se!decantó!el!medio!de!las!cajas!T25!y!se!hicieron!tres!lavados!con!PBS!estéril!
para!eliminar!restos!de!suero!que!interfiere!con!la!actividad!de!la!tripsina.!Se!agregó!
1!ml!de! tripsina!a!37ºC!a!cada!caja!de!cultivo!cubriendo! la!superficie.!Las!cajas!se!
incubaron!durante!5!minutos!o!hasta!que!las!células!se!desprendieran.!Se!les!agregó!
medio! F12! con! SFB! 10%! de! inmediato! para! detener! la! reacción! de! la! tripsina,!
aspirando! con! pipet! la! superficie! para! levantar! y! recuperar! todas! las! células.! El!
medio!se!transfirió!a!tubos!Falcon!que!se!centrifugaron!a!2000!RPM!por!10!minutos.!
Las! células! se! recuperaron! y! se! volvieron! a! cultivar! de! acuerdo! al! protocolo! de!
cultivo!celular!previamente!descrito.!La!expansión!celular!se!repitió!hasta!obtener!
suficientes!células!para!el!modelo!experimental.!
!
Infección$in)vitro)de$células$epiteliales$A549$con$el$virus$de$influenza$pandémica$
A/H1N1$o$el$virus$de$$influenza$estacional$A/PR/8/34$
Un!día!antes!de!a!la!infección,!las!células!se!levantaron!de!las!cajas!T25!y!se!
cultivaron! en! placas! de! 6! pozos! a! una! densidad! de! 1x106! células! por! pozo.! ! Se!
sincronizaron!por!24h!en!medio!F12!sin!suero!fetal!bovino.!
Se!hizo!una!dilución!de!cada!virus!en!medio!F12!a!una!concentración!de!1:1!
(partículas!virales!a!células),!tomando!en!cuenta!que!se!utiliza!un!mililitro!por!cada!
pozo.! Se! eliminó! el!medio! de! cada! uno! de! los! pozos! de! células,! y! en! seguida! se! le!
agregó!1ml!de!medio!con!H1N1,!1ml!de!medio!con!A/PR/8/34!o!1ml!de!medio!F12!
sin!carga!viral!para!los!grupos!control.!Las!placas!se!metieron!a!incubar!a!37ºC!!y!5%!
! 35!
de!CO2!durante!24!horas.!Cada!infección!se!hizo!por!duplicado.!Transcurridas!las!24!
horas!se!obtuvieron! los!sobrenadantes!de!cada!pozo!y!se!congelaron!a!\80ºC! !para!
una!posterior!extracción!de!proteínas.!!
Después! de! recuperado! el! sobrenadante,! cada! pozo! se! lavó! con! PBS! para!
eliminar!restos!de!suero,!y!las!placas!se!incubaron!durante!5!minutos!con!300μl!de!
tripsina!1x.!Una!vez!que!las!células!se!desprendieron!del!pozo,!se!les!agregó!1ml!de!
medio!complementado!para!parar!la!reacción!de!la!tripsina.!Se!lavó!la!superficie!de!
manera!rigurosa!para!levantar!y!recuperar!la!mayor!cantidad!de!células!posible.!Las!
células!se!recuperaron!!para!la!posterior!extracción!de!RNA.!!
!
Ensayo$de$Hemoaglutinación$
! Se! elaboró! un! ensayo! de! hemoaglutinación! para! determinar! el! título! de! los!
virus!A/H1N1!y!A/PR/8/34!a!los!30!minutos,!1,!2,!5,!10,!15,!y!24!horas.!
!
Extracción$de$RNA$total$
Se! extrajo! el! RNA! total! con! TRIZOL! de! las! células! A549! a! 24! horas! post\
infección!con!el!virus!pandémico!A/H1N1!o!el!virus!estacional!A/PR/8/34,!y!de!los!
grupos!control.!!
!
Protocolo#de#extracción#de#RNA#total#por#TRIZOL!
)
a)#Homogenización#
Las! células! de! cada! condición! se! recuperaron! en! sus! tubos! Ependorf!
correspondientes! (un! tubo!por! cada!pozo)! y! se! centrifugaron!a!300!X! g!durante!5!
! 36!
minutos.!Se!lavaron!las!células!una!vez!en!PBS!frío.!Se!le!agregó!1ml!de!TRIZOL!por!
cada! 5\10x106! células,! aspirando! con! pipet! rigurosamente! para! lisarlas! y!
homogeneizar! la! muestra.! Las! muestras! se! incubaron! a! temperatura! ambiente!
durante!5!minutos!para!permitir!la!disociación!de!los!complejos!nucleoprotéicos.!Se!
centrifugaron!a!300!X!g!durante!5!minutos!y!el!sobrenadante!se!recuperó!en!tubos!
nuevos.!
!
b)#Separación#de#fases#
!
A! cada! tubo! se! le! agregó! 0.2ml! de! cloroformo! por! cada! 1ml! de! TRIZOL!
utilizado.!Los!tubos!se!agitaron!rigurosamente!durante!15!segundos!y!se!incubaron!
a! temperatura! ambiente! de! 2! a! 3!minutos.! Se! centrifugaron! a! 12,000! X! g! por! 15!
minutos! a!4ºC! .! La!muestra! se! separó!en!3! fases:! la! fase! inferior! fenol\cloroformo!
(roja),!una!interfase,!y!la!fase!superior!acuosa!(transparente)!en!la!cual!se!encuentra!
exclusivamente!el!RNA.!La! fase!acuosa!(aproximadamente!60%!del!volumen!total)!
se!transfirió!con!cuidado!a!un!nuevo!tubo!sin!tomar!de!la!interfase.!!
!
c)#Precipitación#del#RNA#
A! cada! tubo! se! le! agregó! 0.5ml! de! alcohol! isopropílico! por! cada! 1ml! de!
TRIZOL!utilizado! inicialmente.!Las!muestras!se! incubaron!a!temperatura!ambiente!
durante!10!minutos!y!se!centrifugaron!a!12,000!X!g!por!10!minutos!a!4ºC.!El!RNA!
precipitó!formando!un!pequeño!pellet!con!aspecto!gelatinoso!en!la!pared!del!tubo.!
!
!
! 37!
!
d)#Lavado#del#RNA#
Se!eliminó!con!micropipeta!todo!el!sobrenadante!del!tubo!teniendo!cuidado!
de!no!tocar!el!pellet!de!RNA.!Se!agregó!1ml!de!etanol!al!100%!y!después!de!agitaron!
en! vortex,! las!muestras! se! centrifugaron! a! 7,500!X! g! durante! 5!minutos! a! 4ºC.! Se!
eliminó!todo!el!alcohol!con!sumo!cuidado.!!
!
e)#Redisolución#del#RNA#
Los! pellets! se! dejaron! secar! al! aire! libre! durante! 15!minutos! y! el! pellet! se!
disolvió! en! agua! estéril! libre! de! RNasas.! El! RNA! total! extraído! se! cuantificó! en! el!
nanodrop.! Se! ajustó! la! concentración! de! RNA! a! 1,500ng,! y! se! procesaron! para!
microarreglos!de!microRNAs.!
!
$Microarreglos$
Se! procesaron! 1,500ng! de! RNA! (cuantificado! en! el# Nanodrop)! extraído! de!
células! A549! infectadas! durante! 24h! con! el! virus! pandémico! A/H1N1,! 1,500ng! de!
RNA! extraído! de! células! A549! infectadas! durante! 24h! con! el! virus! estacional!
A/PR/8/34,! y! células! A549! no! infectadas! en! un! microarreglo! de! microRNAs!
GeneChip!2.0!de!Affymetrix,!cada!chip!con!sondas!para!15,644!microRNAs!maduros!
correspondientes! al! 100%! de! la! base! de! datos! mirBase! v15,! con! un! duplicado!
biológico!para!cada!condición.!
!
!
! 38!
!
Análisis$estadístico$
Los! datos! obtenidos! de! los!microarreglos! se! analizaron! en! el! programa! de!
fuente! abierta! R.! Los! datos! se! normalizaron! y! se! generaron! contrastes! entre! cada!
condición! para! obtener! los! microRNAs! diferencialmente! expresados,! tomando! un!
valor! de! p<0.05.! Finalmente! se! generaron! heatmaps! de! los! microRNAs! con!
expresiones!diferenciales!significativas.!!
A!partir!de! los!heatmaps,! se!eliminaron!aquellos!microRNAs!cuya!expresión!no!
coincidiera! entre! los! duplicados! biológicos,! manteniendo! aquellos! que! se!
respaldaran! para! obtener! un! máximo! de! confiabilidad.! Posteriormente,! los!
microRNAs!fueron!analizados!en!el!programa!DIANA!mirPath2.0,!el!cual!encuentra!
vías!celulares!que!están!siendo!afectadas!por!uno!o!más!de!los!microRNAs!de!interés.!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
! 39!
VII. RESULTADOS)
)
Tanto$ el$ virus$ de$ influenza$ estacional$ A/PR/8/34$ como$ el$ virus$ de$ influenza$
pandémica$A/H1N1$infectan$células$A549.$
! Para! probar!la! capacidad! de! infección! de! los! virus! de! influenza! pandémica!
A/H1N1!y!estacional!A/PR/8/34!en!células!pulmonares!A549,!se!hizo!un!ensayo!de!
hemoaglutinación.! El! ensayo! se! evaluó! en! sobrenadantes! de! células! sin! infectar!
(basal)! y! de! células! infectadas! durante! 30!minutos,! 1,! 2,! 5,! 10,! 15! y! 24! horas.! La!
gráfica!(Fig.!6)!muestra!el!cambio!del!título!viral!de!cada!virus!a!lo!largo!del!tiempo.!
La!dilución!del!virus!en!el!sobrenadante!aumenta!a!partir!de!las!10!horas!en!ambos!
casos,! lo! cual! indica!menor! cantidad! de! virus! en! el! sobrenadante! y! una! infección!
positiva! de! las! células.! El! virus! pandémico! tiene! una! dilución! más! alta! que! el!
estacional!a!las!15!y!24!horas,!lo!cual!podría!estar!indicando!una!mejor!capacidad!de!
infección.!
$
Figura) 6.) ) Ensayos) de) hemoaglutinación) para) medir) título) viral) en) sobrenadantes) de) células) A549)
infectadas)con)el)virus)A/PR/8/34))y)el)virus)A/H1N1.)#
0 
10 
20 
30 
40 
50 
60 
70 
30 min 1h 2 h 5h 10h 15h 24h 
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A/H1N1 
A/PR/8/34 
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%
! 40!
)
El$virus$de$influenza$estacional$A/PR/8/34$induce$una$expresión$diferencial$de$
microRNAs$en$$células$A549$a$las$24$horas$de$infección$con$respecto$a$células$no$
infectadas.$
52!microRNAs! resultaron! expresados! diferencialmente! (p<0.05)! en! células!
A549!infectadas!durante!24!horas!con!el!virus!de!influenza!estacional!(Est_24h)!!con!
respecto! a! células! no! infectadas! (Est_basal),! de! los! cuales! 32! coinciden! entre! los!
duplicados!(Fig.!7).!De!esos!32,!17!microRNAs!fueron!subexpresados!(denotado!por!
el! color! verde)! por! el! virus! de! influenza! estacional! y! 13! sobreexpresados! por! el!
mismo!(denotado!con!el!color!rojo).!!!
!
El$ virus$ de$ influenza$ pandémica$ H1N1$ del$ año$ 2009$ induce$ una$ expresión$
diferencial$ de$ microRNAs$ en$ $ células$ A549$ a$ las$ 24$ horas$ de$ infección$ con$
respecto$a$células$no$infectadas.$
46!microRNAs! resultaron! diferencialmente! expresados! (p<0.05)! en! células!
A549!infectadas!durante!24!horas!con!el!virus!de!influenza!pandémico!(H1N1_24h)!!
con!respecto!a!células!no!infectadas!(H1N1_basal),!de!los!cuales!27!coinciden!entre!
los!duplicados!(Fig.!8).!De!esos!27,!16!microRNAs!fueron!subexpresados!!por!el!virus!
de!influenza!pandémica!y!11!sobreexpresados!con!respecto!a!células!no!infectadas.!!!
!
!
! 41!
La$ expresión$ de$ microRNAs$ en$ células$ infectadas$ por$ el$ virus$ de$ influenza$
pandémica$H1N1$difiere$de$la$expresión$de$microRNAs$en$células$infectadas$por$
el$virus$de$influenza$estacional$A/PR/8/34$a$las$24$horas$de$infección.$)
45!microRNAs! resultaron! diferencialmente! expresados! (p<0.05)! en! células!
A549! infectadas! durante! 24! horas! con! el! virus! de! influenza! estacional! (Est_24h)!!
respecto! a! células! infectadas! durante! 24h! con! el! virus! de! influenza! pandémica!
(H1N1_24h),!de!los!cuales!29!coinciden!entre!los!duplicados!(Fig.!9).!De!esos!29,!16!
microRNAs! salieron! subexpresados! por! el! virus! de! influenza! pandémica! y! 13!
sobreexpresados!respecto!al!virus!estacional.!!!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
! 42!
!
!
!
!
Figura)7.)Heatmap$de)los)microRNAs)diferencialmente)expresados)con)un)valor)de)p<0.05,)entre)células)
A549)infectadas)con)el)virus)de)influenza)estacional)A/PR/8/34)(Estacional)24h))y)células)no)infectadas)
(Estacional) basal)) a) las) 24h) postFinfección.) Cada! columna! representa! una!muestra,! con! un! duplicado! por!!
condición.!Cada!fila!representa!un!microRNA,!el!verde!representa!una!expresión!disminuida!respecto!a! la!otra!
condición,!mientras!que!el!rojo!representa!una!sobreexpresión.))
!
!
!
!
!
!
!
! 43!
!
!
!
!
!
Figura)8.)Heatmap)de)los)microRNAs)diferencialmente)expresados)con)un)valor)de)p<0.05,)entre)células)
A549)infectadas)con)el)virus)de)influenza)pandémico)A/H1N1)(H1N1)24h))y)células)no)infectadas)(H1N1)
basal))a)las)24h)postFinfección.)
!
!
!
!
! 44!
!
!
!
!
!
Figura)9.)Heatmap)de)los)microRNAs)diferencialmente)expresados)con)un)valor)de)p<0.05,)entre)células)
A549)infectadas)con)el)virus)de)influenza)estacional)A/PR/8/34)(Estacional)24h))y)células)infectadas)con)
el)virus)pandémico)A/H1N1)(H1N1)24h))a)las)24h)postFinfección.)
!
$
$
$
! 45!
Los$ microRNAs$ miRS138S2,$ miRS135a,$ miRS655,$ miRS384$ y$ miRS551b$ son$
sobreexpresados$ en$ células$ infectadas$ con$ el$ virus$ de$ influenza$ pandémica.!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
Los!microRNAs!miR\138\2\star,!miR\135a\star,!miR\655,!miR\384!y!miR\551b!son!
sobreexpresados!en!células!infectadas!con!el!virus!pandémico,!tanto!con!respecto!a!
células!no!infectadas!como!a!células!infectadas!por!el!virus!de!influenza!estacional,!
sugiriendo!un!mecanismo!de!infección!específico!del!virus!pandémico.!!
!
!
!
!
Figura)10.)microRNAs)sobreexpresados)en)células)infectadas)con)A/H1N1)respecto)a)células)infectadas)
con) el) virus) estacional) y) a) células) no) infectadas) (basal)) a) las) 24) horas) postFinfección.) Los!microRNAs!
sobreexpresados!tienen!un!logFC>1!y!un!valor!de!p<0.05.!))
$
logFC Valor)de)p logFC Valor)de)p
miR013802 0.71 0.004 miR013802 0.79 0.002
miR0135a) 0.66 0.022 miR0135a) 0.85 0.006
miR0655 0.61 0.02 miR0655 0.66 0.014
miR0384 0.54 0.006 miR0384 0.4 0.026
miR0551b 0.43 0.027 miR0551b 0.5 0.014
H1N1$24h$vs.$Estacional$24h H1N1$24h$vs.$Basal
0"
0.01"
0.02"
0.03"
0.04"
0.05"
miR,138,2"miR,135a" miR,655" miR,384" miR,551b"
va
lo
r&d
e&
p&
microRNAs&sobreexpresados&por&H1N1&pandémico&
vs."Basal"
vs."Est."24h"
! 46!
miRS135a,$ miRS655$ y$ miRS384$ regulan$ de$ manera$ significativa$ la$ vía$ de$
señalización$del$TGFSβ.$
Para! determinar! qué! vías! son! reguladas! por! la! expresión! conjunta! de! los!
microRNAs! sobreexpresados! por! el! virus! de! influenza! pandémica,! se! utilizó! el!
programa! de! análisis! DIANAKmirPath# de! DNA# Intelligent# Analysis.# Este! es! un!
programa! computacional! que! se! encuentra! disponible! en! la! red! que! permite!
identificar! vías! moleculares! potencialmente! alteradas! por! la! expresión! de! uno! o!
muchos! microRNAs.! Utiliza! los! blancos! predichos! de! cada! microRNA! que! se!
encuentran!en! la!base!de!datos!de!DIANA\microT\CDS!y/o!en! la!base!de!datos!de!
TargetScan!v6,!cuyos!blancos!están!empíricamente!comprobados,!y#luego!hace!una!
jerarquización!de!las!vías!de!señalización!en!las!que!haya!mayor!interacción!de!los!
microRNAs!seleccionados!(http://www.microrna.gr/miRPathv2).!!
El!programa!permite!al!usuario!escoger!microRNAs!de!su!base!de!datos.!De!los!
cinco!microRNAs! sobreexpresados!por! el! virus!pandémico,! se! encontraron!a!miR\
135a,! miR\655! y! miR\384! en! la! base! de! datos.! Los! microRNAs! aparecen!
interaccionando! de! manera! significativa! en! primer! lugar! en! la! vía! del! cáncer!
pancreático,!en!segundo!en!la!vía!del!cáncer!renal!y!en!tercero!en!la!vía!del!TGF\β.!!
En! la! infección!por! el! virus!de! influenza,! las! vías! relacionadas! al! cáncer!no! tienen!
relevancia;! sin! embargo,! la! vía! del! TGF\β! sí! lo! tiene,! ya! que! esta! le! confiere!
propiedades!antivirales!a!las!células!hospederas.!Los!tres!microRNAs!se!encuentran!
participando! en! la! vía! de! manera! significativa! (Fig.! 11).! ! El! análisis! se! efectuó!
utilizando! tres! algoritmos! distintos! (DIANA!microT! 4.0,! TargetScan! 5! y! PicTar!4\
way),!obteniendo!los!mismos!resultados!en!cada!uno.!!
! 47!
!
!
!
!
Figura)11.))Vías)de)señalización)alteradas)de)manera)significativa)por)los)microRNAs)miRF135a,)miRF348)
y)miRF655.)Las!barras!rojas!representan!la!unión!de!todos!los!genes!blanco!regulados!por!cada!microRNA!por!
vía,!muestras!que!las!moradas!representan!el!número!de!genes!blanco!de!los!tres!microRNAs!analizados.!!
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Cáncer#
Pancreá5co##
Carcinoma#renal#
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Vía#de#señalización#
de#TGF%β#
Cáncer#
colorrectal##
Unión##
adherente##
Leucemia#
mieloide#aguda##
Leucemia#
mieloide#crónica##
Melanogénesis##
Vía#de#señalización#
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Vía#de#
señalización#Wnt##
Uniones#
focales##
Guía#axonal##
Cáncer#de#pulmón#de#
células#pequeñas##
Regulación#de#
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Vía#de#señalización#
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47
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Los$ microRNAs$ sobreexpresados$ por$ el$ virus$ estacional$ no$ regulan$ de$
manera$significativa$la$vía$del$TGFSβ.$
Para!determinar!si!la!regulación!de!la!vía!del!TGF\β!se!limita!a!la!infección!por!el!
virus!pandémico,! se!realizó!el!mismo!análisis!con! los!microRNAs!sobreexpresados!
por!el!virus!de!influenza!estacional.!Los!microRNAs!miR\219\1\3p,!miR\106a,!miR\
662!y!miR\940!se!encontraron!sobreexpresados!por!el!virus!de!influenza!estacional!
tanto!en! relación!a! células!no! infectadas!como!a!células! infectadas!con!el!virus!de!
influenza! pandémica.! ! Al! ser! analizados! en!DIANA\mirPath,! la! vía! en! la! que! estos!
microRNAs!participan!de!manera!más! significativa! es! en! la! vía!de! señalización!de!
Wnt!con! la! interacción!de!dos!de! los!cuatro!microRNAs,!y! la!vía!del!TGF\β,!que!se!
encuentra! en! onceavo! lugar! de! significancia! (Fig.! 12),! lo! cual! sugiere! que! la!
regulación!de! la!vía!de!TGF\β!es!un!mecanismo!utilizado!por!el!virus!de! influenza!
pandémica,!más!no!por!el!virus!de!influenza!estacional!A/PR/8/34.!
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Figura)12.)Vías)de)señalización)alteradas)por) los)microRNAs)miRF219F1F3p,)miRF106a,)miRF662)y)miRF
940.)
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Vía$de$señalización$
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Guía$axonal$$
Cáncer$
pancreá;co$$
Glioma$$
Vía$de$señalización$
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Leucemia$mieloide$
crónico$$
Vía$de$señalización$
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próstata$$
Vía$de$señalización$$
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célula$pequeña$$
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43
! 50!
Análisis$individual$de$miRS135a,$miRS384$y$miRS655.$
Para!profundizar!el!análisis!sobre! los!microRNAs!sobreexpresados!por!el!virus!
pandémico,!se!realizó!un!análisis! individual!de!miR\135a,!miR\384!y!miR\655!y!se!
observó!que!los!tres!microRNAs!están!involucrados!de!manera!significativa!en!la!vía!
del! TGF\β! (Fig.! 13).! Cada! microRNA! regula! a! varios! genes! blanco! en! diferentes!
niveles!de!la!vía!de!señalización!(Fig.!14).!!!
!
!
Figura) 13.) Análisis) individual) de) los) microRNAs) sobreexpresados) por) el) virus) pandémico.) Esta! tabla!
representa!la!participación!de!los!microRNAs!en!la!vía!del!TGF\β,!incluyendo!lugar!de!significancia,!el!número!de!
genes!blanco!involucrados!en!la!vía!con!sus!nombres,!y!el!valor!de!significancia!(\ln).!