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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
Clonación del gen de una porina/esterasa de membrana de 
Alicycliphilus sp. BQ1 en un vector de expresión, para la producción 
de proteína recombinante 
 
 
T E S I S 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
QUÍMICA DE ALIMENTOS 
 
PRESENTA 
Mariana Domínguez Cárdenas 
 
Asesora: Herminia de Jesús Loza Tavera 
 
 MÉXICO, D.F. 2013 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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Mariana Domínguez Cárdenas Tesis de Licenciatura 
 
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JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE: Dra. Herminia de Jesús Loza Tavera 
VOCAL: M. en B. Martha Giles Gómez 
SECRETARIO: Dra. Martha Patricia Coello Coutiño 
1er SUPLENTE: M. en B. Beatriz Ruíz Villafán 
2do SUPLENTE: Dr. Oscar Hernández Meléndez 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
FACULTAD DE QUÍMICA. DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA. CONJUNTO E, LABORATORIO 105. 
 
 
ASESOR DEL TEMA: 
Dra. Herminia de Jesús Loza Tavera ____________________ 
SUPERVISOR TÉCNICO: 
Dr. Martín P. Vargas Suárez ____________________ 
SUSTENTANTE: 
Mariana Domínguez Cárdenas ____________________ 
 
 
 
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ÍNDICE 
Resumen . . . . . . . . . . 1 
1. Introducción . . . . . . . . . . 3 
2. Antecedentes . . . . . . . . . . 6 
2.1 Degradación del poliuretano . . . . . . 6 
2.2 Alicycliphilus sp. BQ1 como microorganismo potencialmente degradador de PU 7 
2.3 Sistemas heterólogos de producción de proteína recombinante . . 8 
2.4 Generación de anticuerpos . . . . . . . 10 
3. Hipótesis . . . . . . . . . . 12 
4. Objetivos . . . . . . . . . . 12 
5. Estrategia Experimental . . . . . . . . 13 
6. Metodología . . . . . . . . . . 14 
6.1 Extracción de DNA genómico . . . . . . 14 
6.2 Electroforesis en gel de agarosa . . . . . . 15 
6.3 Clonación del gen de la porina . . . . . . 16 
6.3.1 Amplificación del gen de la porina . . . . 16 
6.3.2 Ensayos de restricción del DNA a clonar . . . . 18 
6.3.3 Ligación . . . . . . . . 18 
6.3.4 Transformación . . . . . . . 19 
6.4 PCR . . . . . . . . . 20 
6.5 Expresión de la proteína recombinante . . . . . 21 
6.6 Cuantificación de proteína . . . . . . . 22 
6.7 Electroforesis en SDS-PAGE . . . . . . 23 
6.8 Zimograma para actividad esterasa . . . . . . 24 
6.9 Purificación de la proteína recombinante . . . . . 25 
6.10 Electroelución . . . . . . . . 26 
6.11 Esquema de inmunización . . . . . . . 26 
6.12 Purificación de anticuerpos . . . . . . 28 
6.13 Western Blot . . . . . . . . 28 
7. Resultados y Discusión . . . . . . . . 31 
7.1 Obtención del DNA genómico . . . . . . 31 
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7.2 Preparación del inserto . . . . . . . 31 
7.3 Preparación del vector . . . . . . . 32 
7.4 Clonación del inserto en el vector . . . . . . 33 
7.5 Producción de proteína recombinante . . . . . 35 
7.6 Producción de anticuerpos . . . . . . . 40 
8. Conclusiones . . . . . . . . . 45 
9. Perspectivas . . . . . . . . . 45 
10. Referencias . . . . . . . . . . 46 
Anexos . . . . . . . . . . 49 
 
 
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ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS 
Tabla 1 Microorganismos y sus enzimas con capacidad degradativa de PU 7 
Tabla 2 Oligos utilizados para la amplificación del gen de la porina 17 
Tabla 3 Condiciones utilizadas para el uso del termociclador 17 
Tabla 4 Componentes para la reacción de PCR 18 
Tabla 5 Reacciones de restricción de DNA 18 
Tabla 6 Características de los vectores usados en la clonación 22 
Tabla 7 Curva patrón de BSA 22 
Tabla 8 Ejemplo de preparación de muestras por triplicado para cuantificación de 
proteína. 
23 
Tabla 9 Componentes y cantidades para preparar gel separador 23 
Tabla 10 Componentes y cantidades para preparar gel apilador 24 
Tabla 11 Esquema de inmunización de conejas 27 
Tabla 12 Amperaje y tiempos recomendados para llevar a cabo transferencia de 
proteínas. 
29 
Tabla 13 Eficiencia de transformación de células competentes 32 
Tabla 14 Estrategias utilizadas para el replegamiento de la porina recombinante. 37 
Tabla 15 Métodos utilizados en la purificación de la porina recombinante. 38 
 
Figura 1 Reacción de síntesis de poliuretano. 3 
Figura 2 Mecanismo de funcionamiento del sistema pET (pET System Manual, 2011). 11 
Figura 3 Región de multiclonación del vector pET-28a-c. 21 
Figura 4 Región de multiclonación del vector pET-22b. 21 
Figura 5 Acomodo de “sándwich” para la transferencia de proteínas. 29 
Figura 6 Amplificación del gen de la porina por PCR probando diferentes 
temperaturas de alineamiento de los oligos. 
32 
Figura 7 Plásmido pET-28b digerido con enzimas de restricción. 33 
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Figura 8 DNA digerido con enzimas de restricción. 33 
Figura 9 PCR de colonias transformadas con la reacción de ligación del inserto (gen de 
la porina) en el vector pET-28b. 
34 
Figura 10 Inducción de la proteína recombinante analizada por SDS-PAGE. 35 
Figura 11 Fraccionamiento celular de un cultivo de 1 h de la clona 2 
(pET28AliBQ1Por.2) de E. coli 
36 
Figura 12 Inducción de proteína recombinante madura, sin péptido señal (clona 22) con 
diferentes condiciones de tiempo y concentración de IPTG y determinación 
de actividad esterasa. 
39 
Figura 13 Purificación de porina recombinante madura (sin el péptido de tránsito) 
(clona 22). Inducción con 500 mM IPTG durante 4 h. 
41 
Figura 14 Purificación de la porina recombinante en condiciones BL21 a 37 °C con 1 
mM de IPTG para inducir la expresión de la porina recombinante 
desnaturalizantes (protocolo 2 tabla 15) (QIAexpressionist). 
41 
Figura 15 Prueba de Ouchterlony para anticuerpo generado en la coneja B después de 6 
semanas de la primera inmunización. 
42 
Figura 16 Determinación del título de los anticuerpos A y B empleando porina 
recombinante. 
43 
Figura 17 Determinación del título de los anticuerpos A y B en extractos celulares de 
BQ1. 
44 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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ABREVIATURAS 
BSA bovine serum albumin / albúmina sérica bovina 
dNTPs desoxiribonucleótidos fosfatados 
D.O. densidad óptica 
ECL enzymatic chemiluminiscence 
FT flowthrough / fracción no unida 
kb kilo pares de bases 
kDa kilo Daltones 
IPTG isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido 
LB medio Luria Bertani 
mA mili-Amper 
MM-PUh medio mínimo poliuretano (Hydroform®) 
MUF metilumbeliferil 
ON overnight / toda la noche 
PAGE polyacrylamide gel electrophoresis / electroforesis en gel de poliacrilamida 
PCR polymerase chain reaction / reacción en cadena de la polimerasa 
PU poliuretano 
SDS dodecil sulfato sódico 
SN sobrenadante 
PVDF polifluoruro de vinilideno 
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1 
 
RESUMEN 
En trabajos previos en nuestro laboratorio, se aisló una cepa bacteriana denominada BQ1, a partir 
de una selección en un medio de cultivo cuya única fuente de carbono era un barniz comercial de 
poliuretano base agua. Esta cepa fue identificada como miembro del género Alicycliphilus mediante la 
secuenciación del gen del 16S rRNA (Oceguera et al., 2007; Solís-González, 2008). Se detectó actividad 
enzimática de tipo esterasa en el sobrenadante del medio de cultivo inoculado con la cepa BQ1, después 
de 12 h de incubación. Una proteína, con actividad esterasa fue purificada de la fracción membranal de 
BQ1 y fue identificada como una porina, la cual mostró homología con los genes Alide_0807 y 
Alide2_0763 de Alicycliphilus denitríficans BC y K601 respectivamente (Sánchez-Tafolla, 2010). 
 
El objetivo del presente trabajo fue producir a la porina recombinante para su posterior caracterización 
bioquímica. Para ello se llevó a cabo la clonación del gen de Alicycliphilus sp. BQ1 (BQ1), que codifica a 
esta porina, en vectores de expresión de la serie pET. Con base en la secuenciación parcial del genoma de 
BQ1, se diseñaron primers (oligonucleótidos) para amplificar el gen por la técnica de PCR, empleando 
una Pfu DNA polimerasa. Los primers contenían además sitios de corte para enzimas de restricción que 
permitieron la clonación del amplicón en los vectores de expresión. 
Los productos de la ligación se transformaron en E. coli DH5DHpara su amplificación y posterior 
transformación de la cepa de expresión, E. coli BL21 (BL21) que en conjunto con el vector (de la familia 
pET) fungen como doble cierre para la transcripción del gen de interés, el cuál se encuentra bajo el control 
de un promotor inducible por IPTG. Los plásmidos empleados (pET-28 y pET-22) permiten el etiquetado 
de la proteína recombinante por medio de seis histidinas en el extremo carboxilo lo que facilita su 
purificación por cromatografía de afinidad utilizando una resina de Ni. 
Para identificar la actividad esterasa de la proteína recombinante se empleó la técnica de zimograma, para 
lo cual fue necesario resolver las proteínas de los extractos bacterianos en geles desnaturalizantes de 
poliacrilamida. Las proteínas de los geles se renaturalizan in situ y la actividad esterasa es revelada con 
butirato de metilumbeliferona, el cual fluoresce cuando su enlace éster es hidrolizado observándose una 
señal luminosa blanca en el gel, cuando éste se somete a luz UV. 
Se probaron varias estrategias para expresar y purificar a la porina recombinante con el objetivo de 
demostrar que presentaba una actividad esterasa. Primero se clonó el gen completo, después el gen de la 
proteína madura, se probó purificar en condiciones nativas y desnaturalizantes e incluso se intentó 
replegar a la proteína in vitro, con resultados infructuosos, no logramos demostrar que la porina presentara 
actividad esterasa. 
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2 
 
Al no poder encontrar actividad esterasa en la porina recombinante empleando diversas metodologías de 
purificación y de replegado de la proteína in vitro, y considerando los diversos factores que podrían estar 
involucrados en este resultado, se decidió generar anticuerpos específicos contra la porina con el objeto de 
emplearlos para identificar a esta proteína en extractos de Alicycliphilus sp. BQ1. Esto se llevó a cabo 
mediante la inoculación con la proteína porina recombinante purificada, de conejas a las cuales 
posteriormente se les extrajo el suero sanguíneo a partir de los cuales se purificaron los anticuerpos por 
precipitación. Finalmente, empleando estos anticuerpos, que presentaron un título muy alto, se realizaron 
pruebas de inmunodetección (Ouchterlony y Western Blot) para demostrar la presencia de la porina en 
extractos de BQ1. 
 
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1. INTRODUCCIÓN 
Los plásticos son compuestos químicos sintéticos que se desarrollaron como sustitutos de materiales 
naturales y que, debido a sus propiedades, se han vuelto indispensables para la vida cotidiana. La mayoría 
de los plásticos son fáciles de trabajar y moldear. La palabra plástico viene del griego plastikos que 
significa susceptible a ser moldeado en diferentes formas. Poseen un bajo costo de producción, suelen ser 
impermeables, aislantes eléctricos, acústicos e incluso térmicos; además poseen más y mejores 
propiedades físicas y químicas que otros materiales, son más sólidos, presentan mayor y mejor brillo, 
color, resistencia a líquidos, ácidos y álcalis. Los plásticos son polímeros que se clasifican de cuatro 
maneras diferentes: 1) de acuerdo a su monómero base, en naturales o sintéticos; 2) a su comportamiento 
frente al calor, en termoplásticos o termoestables; 3) a su estructura molecular, en amorfos, semi-
cristalinos o cristalinos; y, finalmente, 4) de acuerdo a su reacción de síntesis, en adición, condensación, o 
aquellos formados por etapas. 
El poliuretano (PU) es un tipo de plástico que en su cadena principal presenta enlaces uretano. Fue 
sintetizado en 1937 por el Dr. Otto Bayer y se obtiene a partir de una reacción de condensación entre un 
di-isocianato con un di-alcohol o un poli-isocianato y un poliol. Este último puede ser tipo poliéter o 
poliéster, generando ya sea, poliéster poliuretano (PS-PU) o poliéter poliuretano (PE-PU) (Figura 1). 
 
 
Figura 1. Reacción de síntesis de poliuretano (Moreno González, 2012). 
 
De acuerdo a las variaciones que se generan con las posibles substituciones entre las cadenas del polímero, 
se pueden producir PU lineales o ramificados y flexibles o rígidos. Los PU son utilizados para la 
fabricación de fibras, espumas, recubrimientos, agentes ligantes, etc., siendo las espumas las más 
producidas y utilizadas (revisado en Howard, 2012). Las variaciones en el grupo hidroxilo terminal son 
http://es.wikipedia.org/wiki/Permeabilidad
http://es.wikipedia.org/wiki/Aislante_el%C3%A9ctrico
http://es.wikipedia.org/wiki/Aislante_ac%C3%BAstico
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las responsables de la resistencia y elasticidad del producto final. El PU representa una clase de polímeros 
que ha encontrado un uso muy extendido en áreas médicas, automovilísticas y textiles, entre otras 
industrias. 
La palabra basura proviene del latín verrere que significa barrer y es a partir del siglo XII que recibe la 
acepción de desperdicio o inmundicia. Actualmente este concepto se ha ampliado, lo que ha llevado a 
hacer diversas clasificaciones de basura. La más elemental es orgánica e inorgánica. En junio de 2011 el 
gobierno del Distrito Federal emitió la disposición de la obligatoriedad de separar los residuos en 
orgánicos (desperdicios de alimentos, huesos, restos de carne, pollo o pescado, verduras, pan, cáscaras, 
sopa, cascarón de huevo, servilletas y filtros de papel, el café, heces animales, hojarasca, pasto seco, 
flores) e inorgánicos (plástico, vidrio, metales, utensilios de cocina, corcholatas, papel y cartón, pañales, 
toallas sanitarias, algodón, papel higiénico) para la recolección de basura, lo que implicó un cambio de 
hábitos para la sociedad en general. Uno de los beneficios del reciclaje es que todos los residuos orgánicos 
se pueden reutilizar, se convierten en composta y así se evita que al quedar bajo la tierra produzcan gas 
metano. No obstante, persiste el problema de la basura inorgánica que, de acuerdo a información 
proporcionada por la SEMARNAT en 2008, llega a tardar de 100 a 1000 años en degradarse –como es el 
caso de los plásticos- mientras que la basura orgánica tarda de 3 a 5 años en realizar el mismo proceso. 
Estas cifras alarmantes resaltanla problemática que implican actualmente los desechos plásticos que se 
han vuelto un problema por su acumulación, mismo que se ha agudizado debido al hecho de que después 
de 25 años de utilizar el basurero conocido como Bordo de Poniente, éste haya cerrado sus puertas en 
agosto de 2012. 
La sociedad consumista que se inició en EUA con las prácticas de “lo desechable” propuso el empleo de 
plásticos de todo tipo que inicialmente hicieron factible el transporte de alimentos, pero que se ha vuelto 
un problema, agudizado por los “trastes desechables”, ya que existe un escaso o nulo tratamiento de los 
mismos, ocasionando con ello la acumulación de grandes volúmenes de residuos. Por ejemplo, hasta hace 
pocos años, la cantidad de leche que una persona compraba, se vertía en un solo bote, pero en la 
actualidad cada litro ocupa un envase desechable. En 2006, el Instituto Nacional de Ecología (INE) 
reportó que se producen diariamente 20 mil toneladas de basura sólo en el Distrito Federal. Estos datos 
revelan una producción aproximada de 1.35 kg de basura per cápita diaria, de los cuales el 5% 
corresponde a plásticos dando un equivalente de 24 kg de plásticos anuales por habitante. En el año 2010 
se elaboró el llamado “Plan Verde” por parte del Gobierno del DF. Éste fue diseñado a mediano plazo (15 
años) para proponer estrategias y acciones para encaminar a la Ciudad de México hacia la sustentabilidad 
de su desarrollo, para que continúe siendo un espacio adecuado para sus habitantes, sin comprometer el 
patrimonio natural que la hace viable. 
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Otra de las características de los plásticos es su resistencia al ataque microbiano. Mueller –citado por 
Shah, 2008- sugiere que esto puede ser debido a que son moléculas que no existían anteriormente en los 
ecosistemas y a que los organismos no han desarrollado todavía sistemas eficientes para atacarlas 
químicamente con el fin de obtener moléculas para su metabolismo. Sin embargo, ya se han realizado 
investigaciones en donde se han estudiado tanto a los microorganismos como a sus enzimas capaces de 
atacar al PU (Howard, 2012). El presente proyecto, desarrollado en el Departamento de Bioquímica de la 
Facultad de Química de la UNAM, bajo la dirección de la Dra. Herminia Loza Tavera, estudia bacterias 
capaces de degradar poliuretano, y tiene como objetivo aportar una herramienta para que en algún futuro 
se pueda dar un enfoque ecológico al uso de estas bacterias y combatir el problema de la basura 
inorgánica, específicamente plástica. 
 
 
 
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2. ANTECEDENTES 
2.1 Degradación del poliuretano 
La degradación de los plásticos es un proceso muy lento que involucra factores ambientales que se han 
clasificado en: físicos, químicos, mecánicos y biológicos (Shah, 2008). Algunos de estos métodos, como 
el de la degradación química, suelen ser muy eficientes pero poco sustentables y muy contaminantes. Pero 
otros no son eficientes ni efectivos, como es el claro ejemplo de la degradación térmica del PU la cual 
genera compuestos tóxicos para el medio ambiente. (American Chemistry Council, 2008). 
En nuestro grupo de trabajo estamos enfocados en estudiar los mecanismos de biodegradación del PU. La 
biodegradación involucra la degradación de las macromoléculas que son los polímeros, a moléculas más 
pequeñas y utilizables por el microorganismo como fuente de carbono y energía (revisado en Loredo-
Treviño et al, 2012). 
Se han reportado varios microorganismos capaces de degradar PU. Entre ellos, podemos encontrar 
bacterias del género Corynebacterium sp. las cuales logran degradar el PU cuando se añade extracto de 
levadura al medio de cultivo (Kay et al., 1991). En trabajos posteriores se encontraron varias cepas de 
Corynebacterium sp. capaces de crecer en pintura con base poliuretano como única fuente de carbono y 
energía, y se demostró que hay enzimas de tipo esterasa, involucradas en este proceso, que se expresan de 
manera constitutiva (Kay et al., 1993). Se han caracterizado -física y bioquímicamente- otras esterasas, 
propuestas como participantes en el ataque al PU; un ejemplo de esto son las enzimas provenientes de 
Comamonas acidovorans cepa TB35. Esta bacteria es capaz de crecer en un medio de cultivo con sales y 
PU como única fuente de carbono (Akutsu et al., 1998). También se han reportado enzimas provenientes 
de géneros de Bacillus a las cuales llamaron de manera general “impranilasas” debido a que las bacterias 
crecen en Impranil DLN que es un PS-PU (Howard, 1998) y esterasas provenientes del género 
Pseudomonas con capacidades “poliuretanolíticas” (Howard, 2002). En las últimas dos décadas se han 
realizado múltiples trabajos que involucran el estudio de la biodegradabilidad de los plásticos y las 
posibles enzimas responsables de esta hidrólisis (Tabla 1). 
 
 
 
 
 
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Tabla 1. Microorganismos y sus enzimas con capacidad degradativa de PU. 
Microorganismo Enzima involucrada Referencia 
Corynebacterium sp. Esterasa Kay et al., 1991, 1993 
Comamonas acidovorans Esterasa Akutsu et al., 1998 
Pseudomonas fluorescens Proteasa, esterasa, impranilasa Howard et al.,1998 
Pseudomonas chlororaphis Proteasa, esterasa, impranilasa 
Howard et al., 1999; Ruiz et al., 
1999 
Bacillus subtillis Esterasa Rowe and Howard, 2002 
Bacillus pumilus Lipasa Nairet al., 2007 
Arthrobacter sp. AF11y 
Corynebacterium sp. AF12 
 
Esterasa Shah et al., 2007 
Alicycliphilus sp. BQ1 Esterasa Oceguera-Cervantes et al.,2007 
Pseudomonas aeruginosa Esterasa Mukherjee et al.,2010 
 
Las esterasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces tipo éster y constituyen una familia con un 
amplio poder catalítico para diferentes sustratos. La clasificación de estas enzimas no ha sido establecida, 
sin embargo existen componentes que se han encontrado en la mayoría de enzimas que este grupo, por 
ejemplo que están formadas por hojas  rodeadas de hélices y en su sitio activo se presentan tres 
residuos catalíticos: un residuo nucleofílico, un residuo ácido y un residuo de histidina (revisado en Jaeger 
et al., 1999). También se ha encontrado que en su mecanismo de catálisis está involucrada una triada 
catalítica formada por una serina (Ser), una histidina (His) y un ácido, ya sea glutámico (Glu) o aspártico 
(Asp). Se ha reportado que la actividad esterasa puede ser analizada utilizando sustratos colorimétricos 
compuestos por ésteres de p-nitrofenol como es el caso del butirato de p-nitrofenol que se valora 
espectofotométricamente a 410 nm donde una unidad de actividad se define como la cantidad de enzima 
capaz de liberar 1 μmol de p-nitrofenol por minuto (Wheelock et al., 2005; Calero, 2006). 
Otras técnicas analíticas, como el uso de espectros de infrarrojo, han servido para detectar cambios en la 
estructura de muestras de PU incubadas en medios inoculados con microorganismos capaces de crecer en 
este polímero como única fuente de carbono como es el caso de Alicycliphilus sp. BQ1. Las variaciones en 
las regiones que dan señal para éster y alcoholes terminales, sugirieron una hidrólisis de los enlaces éster 
del PU (Oceguera-Cervantes, 2007). Este descubrimiento llevó al grupo de la Dra. Loza-Tavera a la 
búsqueda de enzimas esterasas involucradas en la degradación del PU. 
 
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8 
 
2.2 Alicycliphilus sp. BQ1 como microorganismo potencialmente degradador de PU 
Alicycliphilus sp. es una bacteria Gram negativa de la familia Comamonadaceae que fue aislada de 
residuos de hule espumaen descomposición colectados en un basurero público, y que ha sido objeto de 
estudio de nuestro laboratorio. Fue aislada empleando un medio mineral cuya única fuente de carbono era 
un barniz comercial Hydroform
®
 hecho a base de PU en agua (MM-PUh) (Oceguera-Cervantes, 2007). 
Con ayuda de espectrometría de infrarrojo, se detectó que cuando se cultivaba a BQ1 en MM-PUh, la 
señal de los oxígenos de los enlaces éster del PU desaparecían y aparecían señales de grupos amida y 
carbonilo, como resultado de un rompimiento de los enlaces éster. Con esta información se propuso que 
una actividad enzimática que hidrolizara los enlaces éster, podría estar siendo responsable. Por lo tanto, en 
nuestro laboratorio se dieron a la tarea de buscar actividades esterasa que fueran expresadas por BQ1. 
Empleando un zimograma específico para esterasas, se identificó una actividad esterasa en la fracción 
membranal de cultivos de Alicycliphilus (Sánchez-Tafolla, 2010). 
La proteína con actividad esterasa tenía un tamaño de 31 kDa aproximadamente. Esta proteína fue 
purificada por cromatografía, mediante el uso de varias columnas, y por espectrometría de masas en 
tándem fue posible identificarla. La proteína llevó un tratamiento con proteasa para obtener las 
preparaciones peptídicas con lo que fue posible predecir la secuencia de aminoácidos más probable para la 
proteína ya que se compararon los fragmentos peptídicos con bases de datos que poseen información de 
las secuencias de aminoácidos de otros microorganismos. Esto se logra al ionizar a presión atmosférica un 
extracto de la muestra utilizando un electrospray que permite analizar, con gran sensibilidad, numerosos 
compuestos no volátiles y térmolábiles; la comparación de los resultados obtenidos fueron analizados con 
el programa Mascot (Matrix Science Ltd.) A partir de esta análisis se identificó a esta proteína como una 
porina (Sánchez-Tafolla, 2010). Las porinas son proteínas de la membrana externa que controlan la 
difusión de pequeñas moléculas hidrofílicas incluyendo toxinas, antibióticos, nutrientes y otras sustancias 
esenciales para el crecimiento, a través de la membrana (Fairman, 2011). La permeabilidad de la 
membrana externa depende del diámetro y número de porinas por célula. 
Con ayuda de BLASTp (Basic Local Alignment Search Tool: programa informático de alineamiento de 
secuencias de proteínas), fue posible identificar a otras porinas de A. denitrificans BC (Alide_0807) y A. 
denitrificans k601 (Alide2_0763) cuyas secuencias presentan una homología del 98% (vid. Anexo). Al 
comparar estas secuencias específicas, se observó que presentan firmas correspondientes a proteínas de la 
familia de esterasas GDSL, esto es de especial interés debido a que no se han reportado porinas con 
actividad esterasa (Sánchez-Tafolla, 2010). 
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Las diferencias corresponden a ocho aminoácidos de los cuales siete presentan una mutación silenciosa y 
el restante corresponde a una valina (aa apolar) en BQ1 mientras que en los otros dos casos se encuentra 
una fenilalanina (aa aromático). En los tres casos existe una secuencia que se detectó como un péptido de 
tránsito que probablemente dirige a la proteína a periplasma. La secuenciación del genoma completo de 
BQ1 se está llevando como parte de nuestra investigación. 
2.3 Sistemas heterólogos de producción de proteína recombinante 
Se considera proteína recombinante aquella cuya síntesis se realiza en un organismo distinto al nativo. 
Éstas son una herramienta de la biología molecular que se han desarrollado con el fin de aislar, producir y 
mejorar la expresión de las proteínas recombinantes en sistemas heterólogos que pueden ser cultivos 
celulares de bacterias, levaduras, hongos, mamíferos, plantas e insectos. Las proteínas tienen diferentes 
características determinadas por el tamaño, la localización intracelular, el método de secreción, la manera 
en que se pliegan y, finalmente, el patrón de glucosilación; dichas características deben ser tomadas en 
cuanta cuando se escoge un sistema hospedero para su producción. Actualmente los tres sistemas más 
utilizados en el campo de la investigación para la producción de péptidos y proteínas recombinantes son 
plantas, levaduras y bacterias (Parachin et al., 2012). 
Las plantas genéticamente modificadas han sido desarrolladas principalmente para la mejora de cosechas 
agrícolas, sin embargo se han desarrollado como alternativa para la producción de proteínas 
recombinantes ya que no necesitan controlar su expresión debido a que ésta dependerá del promotor 
escogido para tal labor, además presentan una habilidad intrínseca de generar altos niveles de expresión 
con plegamientos proteicos complejos. En el caso de las levaduras, los sistemas de expresión más 
utilizados son Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris, éstas presentan ventajas sobre otros sistemas 
ya que no necesitan de transportadores y son capaces de secretar a la proteína lo cual disminuye o elimina 
pasos de purificación y facilita el escalamiento de procesos a nivel industrial. Las bacterias, por su parte, 
se volvieron una herramienta conveniente para la producción de proteínas recombinantes, siendo E. coli la 
más utilizada ya que provee un adecuado costo-beneficio por su rápido crecimiento, además de que ha 
sido ampliamente estudiada permitiendo con ello trabajar con la extensa gama de vectores comerciales 
para su expresión y se han desarrollado diversos protocolos para la manipulación de su DNA. Es 
importante considerar los retos que el uso de bacterias pueden presentar para la producción de proteínas 
recombinantes, el primero de ellos es prevenir la toxicidad del péptido o proteína ya que esto puede 
afectar la viabilidad de la célula; en segundo lugar se presentan problemas de inestabilidad que se deben al 
tamaño y propiedades químicas intrínsecas a la proteína, por lo que se propone utilizar transportadores y/o 
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10 
 
etiquetas que no solo ayuden a neutralizar sino que permitan una rápida purificación por cromatografía de 
afinidad como es el caso de la glutatión-S-transferasa y la etiqueta de histidinas, respectivamente. 
En el presente proyecto y como respuesta al problema de la inestabilidad de la proteína originalmente 
purificada en el laboratorio (Sánchez-Tafolla, 2010), y para su posterior caracterización bioquímica, se 
procedió a generar esta proteína en un sistema recombinante utilizando E.coli BL21 como célula 
hospedera y vectores de la familia pET (Figura 2) como sistemas de expresión. El sistema pET permite 
que la proteína se exprese únicamente cuando se encuentran en una célula hospedera que contenga el gen 
que codifique para una T7 RNA polimerasa, ya que los genes que se clonen en esta familia de vectores se 
encuentran bajo el control de un promotor T7. 
La T7 RNA polimerasa es tan activa y selectiva que cuando es completamente inducida casi todos los 
recursos de la célula se destinan a la producción del gen de interés. Otro beneficio importante de este 
sistema es que mantiene apagada la transcripción de los genes cuando éstos no han sido inducidos. Esta 
propiedad se debe a un doble cierre que impide la transcripción de la T7 RNA polimerasa que es necesaria 
para la posterior transcripción del gen de interés. Éste es clonado inicialmente en un hospedero que 
carezca de los genes que codifiquen a la T7 RNA polimerasa con el fin de evitar la transcripción del gen 
de interés y con ello la posibilidad de generar proteínas potencialmente tóxicas para el mismo. Logrado 
esto, es posible transferir el plásmido a una célula hospedera que contenga una copia del gen de la T7 
RNA polimerasa y que a su vez se encuentre bajo el control del promotor lacque se induce al agregar 
IPTG o lactosa al medio celular. El IPTG se une al operador lac –el cual se encuentra río abajo 
[downstream] al promotor T7 evitando su transcripción- ya que presenta mayor afinidad por esta 
molécula que por el operador y al dejar “libre” al operador permite a la RNA polimerasa unirse y 
transcribir los genes de interés, primero al de T7 RNA polimerasa y luego al gen de la proteína 
recombinante (pET System Manual, 2011). 
Por secuenciación parcial del genoma de Alicycliphilus sp. BQ1 y una vez que se determinó que la 
actividad esterasa correspondía a una proteína identificada como porina, fue posible diseñar 
oligonucleótidos que fueron usados para amplificar al gen de la porina a partir del DNA genómico de la 
bacteria. Los oligonucleótidos diseñados incluyeron sitios de corte para enzimas de restricción que 
permiten la clonación del gen en un vector de expresión. Este vector debe poseer un origen de replicación, 
un marcador para seleccionar (generalmente un gen de resistencia a antibiótico), un promotor y un 
terminador transcripcional que posean entre ellos un sitio de clonación múltiple donde se inserta la copia 
del gen de interés. 
 
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11 
 
 
Figura 2. Mecanismo de funcionamiento del sistema pET (pET System Manual, 2011). 
 
2.4 Opciones para verificar especificidad (Generación de anticuerpos) 
El sistema inmune genera una respuesta ante la presencia de sustancias nocivas conocidas como antígenos, 
normalmente proteínas, que son identificadas como agentes “extraños” para los cuales se reconocen y se 
dan respuesta con la generación de otras moléculas conocidas como anticuerpos, de ahí el nombre que se 
ha asignado para esta respuesta como “antígeno-anticuerpo”. Los anticuerpos o inmunoglobulinas son un 
grupo de glicoproteínas heterogéneas presentes en el plasma y en los tejidos que poseen una especificidad 
de enlace para un antígeno particular. El método usual para producir anticuerpos policlonales 
experimentalmente consiste en la inoculación de animales, como conejos, cabras o ratones, con un 
antígeno purificado. La administración de un antígeno in vivo estimula diferentes células del sistema 
inmune dando origen a una población mixta de anticuerpos que si provienen del suero de un animal 
inmunizado, se conoce como antisuero policlonal, estos son particularmente valiosos como reactivos 
biológicos para el estudio de proteínas, células y tejidos cuando se utilizan en técnicas muy diversas, tales 
como: ELISA, inmunofluorescencia e inmunoidentificación (Western blot) (Antibodies: a laboratory 
manual, 1988). 
 
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12 
 
3. HIPÓTESIS 
En búsqueda de esterasas de Alicycliphilus sp. BQ1 capaces de atacar al PU, se purificó con base en 
esta actividad, una proteína que se identificó como una porina. Se propone que la producción de esta 
porina en un sistema heterólogo permitirá utilizarla para la caracterización de la actividad esterasa. 
 
4. OBJETIVOS 
Objetivo general 
Clonar el gen de la porina de 31 kDa de Alicycliphilus sp. BQ1 (homólogo a los genes 
Alide2_0763 de Alicycliphilus denitrificans K601 y Alide_0807 de Alicycliphilus denitrificans BC) en un 
vector de expresión, para la producción de proteína recombinante, con el objeto de tratar de demostrar que 
esta porina presenta actividad esterasa y para la generación de anticuerpos. 
Objetivos particulares 
1. Clonar el gen que codifica para la porina de Alicycliphilus sp. BQ1en un vector de expresión. 
2. Producir proteína recombinante de la porina en un sistema heterólogo (Escherichia coli). 
3. Demostrar que la porina recombinante presenta actividad esterasa. 
4. Generar anticuerpos en conejos contra la porina recombinante. 
5. Montar las condiciones para el ensayo de inmunodetección por Western blot 
6. Determinar la presencia de la porina en extractos celulares de BQ1. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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5. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL 
 
 
Clonación del gen de la porina/eterasa en 
el vector: 
- Ligación del inserto en el vector 
- Transformación del producto de ligación en 
células competentes 
- Identificación de clonas positivas (PCR) 
Preparación del inserto: 
- Amplificación del gen 
de la porina/esterasa por PCR 
- Digestión con enzimas de 
restricción 
- Purificación del gen 
amplificado a partir de gel de 
agarosa 
Obtención de DNA genómico: 
- Cultivo de BQ1 en medio 
Luria Bertani (LB) 
- Obtención de DNA genómico 
Preparación del vector: 
- Digestión con enzimas de 
restricción 
- Purificación del vector 
digerido a partir de gel de 
agarosa 
Inducción de expresión de proteína 
recombinante: 
- Detección de proteína por SDS-PAGE 
- Zimograma para esterasas 
Producción de anticuerpos: 
- Purificación proteína recombinante 
-Inoculación conejos 
-Ensayos de inmunodetección (Western 
Blot) 
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6. METODOLOGÍA 
6.1 Extracción de DNA genómico 
El DNA se extrajo con base en el protocolo descrito en Current Protocols in Molecular Biology Vol. 1 
Unidad 2.4. Suplemento 24 (1995). Dado que inicialmente no fue posible obtener DNA de una forma 
efectiva, fue necesario consultar otros protocolos y realizar varias pruebas hasta lograr montar una técnica 
reproducible. Finalmente la técnica modificada, con la cual fue posible la extracción de DNA de BQ1, es 
la siguiente: 
1. De un glicerol utilizado para preservar la viabilidad de las células (vid. Anexo), tomar una alícuota 
y se siembra por estría cruzada en medio Luria Bertani (LB) sólido para obtener colonias aisladas. 
Al siguiente día, inocular una colonia grande de la cepa BQ1 en 5 mL de medio LB y cultivar toda 
la noche (ON) 17 h a 37 °C con agitación vigorosa. Al día siguiente inocular estos 5 mL en 25 mL 
de medio LB (Abs660 aprox. 0.3-0.5). Incubar durante 4 horas a 37 °C con agitación vigorosa hasta 
obtener una Abs660 de 3. 
2. Transferir el cultivo a un tubo de centrifuga de 25 mL de teflón y centrifugar a 10,000 g en la 
centrífuga Sorvall RC-5B Refrigerated Superspeed Centrifuge rotor SS-34 durante 5 min. 
Decantar el sobrenadante (SN) y resuspender completamente el paquete celular por vórtex. 
Agregar 5 mL de buffer TE (Tris 50 mM y EDTA 20 mM, pH 8.0) estéril a cada tubo y 
centrifugar nuevamente a 5,000 g / 10 min para obtener una pastilla celular. 
3. Resuspender la pastilla celular (pellet) en 504 L de TE y transferir a un tubo de microcentrífiga. 
Agregar 40 L de lisozima (50 mg/mL, recién preparada) y 20 L de RNAsa (25 mg/mL, libre de 
DNAsa) (SIGMA R-4642) e incubar a 37 °C / 250 g por 60 min. La suspensión celular se clarifica 
y vuelve viscosa por la acción de la lisozima (Vol total 564 L. Concentraciones finales aprox: 
lisozima 1.7 g/L; RNAsa: 1 g/L). 
4. Agregar 30 L de SDS al 10% e incubar a 37 °C por 30 min, agitando regularmente. La formación 
de un moco blanco indica que las células se han lisado. 
5. Agregar 6L de proteinasa K (20 mg/mL) e incubar 30 min a 37 °C, agitando regularmente (Vol 
total 600 L. Concentraciones finales: SDS 0.5%; proteinasa 0.2 g/L). 
6. Adicionar 100 L de NaCl 5 M, agitar exhaustivamente por 30 seg o hasta que se observe 
homogeneidad en la mezcla, e incubar a 65 °C por 5 min. 
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15 
 
7. Agregar 80 L de solución CTAB/NaCl (CTAB 10% en NaCl 0.7 M), precalentada a 65 °C, e 
incubar por 10-20 min, hasta que se observe la formación de un precipitado blanco. Adicionar 1 
vol. (780 L) decloroformo:alcohol isoamílico (24:1) y agitar con ayuda del vortex. Centrifugar 
por 10 min en una microcentrífuga a 12,000 g a temperatura ambiente. 
8. Tomar el sobrenadante cuidadosamente, medirlo y pasarlo a un tubo limpio. Adicionar un 
volumen igual de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) (aprox. 0.7-0.8 mL). Agitar en 
vórtex por 5 min hasta formar una emulsión estable. Centrifugar 5 min a 14,000 g. 
9. Tomar el sobrenadante asegurándose de no llevarse la interfase de precipitado de proteína, pasarlo 
a un tubo limpio y medirlo. Adicionar un volumen de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1). Agitar 
por 3 min en vórtex, formando una emulsión estable. Centrifugar 5 min a 14,000 g. 
10. Tomar cuidadosamente la fase acuosa y pasarla a un tubo nuevo. Adicionar 0.6 volúmenes de 
isopropanol o 1 vol de etanol frío. Agitar el tubo por inversión (incubar unos minutos a 
temperatura ambiente). Se debe apreciar un precipitado fibroso de DNA claramente visible. 
Centrifugar a 10,000 g durante 10 min a temperatura ambiente. 
11. Retirar el sobrenadante y lavar la pastilla celular dos veces con 500 L de etanol al 70% frío. 
Centrifugar y decantar, retirando la mayor cantidad de alcohol posible. Evaporar el alcohol 
restante, dejando abierto el tubo frente al mechero, teniendo cuidado de que no se seque 
completamente la pastilla. Resuspender en 100 L de agua estéril. 
12. Correr una alícuota en un gel de agarosa al 1% para confirmar la calidad del DNA genómico y la 
ausencia de RNA contaminante. Determinar la concentración y pureza de la muestra determinando 
su absorbancia a una  230, 260, 280 y 320 nm. La concentración de DNA se calcula de acuerdo 
a la siguiente fórmula: Concentración (μg/ml) = (lectura a A260 – lectura a A320) x 50 FD (factor 
de dilución) 
Nota: Si existiera contaminación con RNA se recomienda incubar con más RNAsa y posteriormente 
extraer nuevamente con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1). 
6.2 Electroforesis en gel de agarosa 
La electroforesis en gel de agarosa es una de las herramientas más importantes en biología molecular ya 
que permite la identificación de moléculas DNA particulares de acuerdo a un patrón de banda específico. 
La electroforesis se refiere al movimiento de moléculas cargadas bajo un campo eléctrico, ésta se puede 
llevar a cabo usando geles de agarosa o poliacrilamida. Los geles de agarosa son porosos, su porosidad 
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16 
 
depende de la concentración de agarosa, y son usados para separar macromoléculas como el DNA las 
cuales están cargadas negativamente y se mueven hacia el ánodo (con carga positiva) cuando un campo 
eléctrico es aplicado. Este movimiento depende del tamaño, es decir, del peso molecular de los ácidos 
nucleícos. De manera similar, diferentes tipos de plásmidos son también separados por este método. Los 
geles se tiñen con Bromuro de Etidio (BrEt) el cual se intercala en el DNA y fluoresce en presencia de luz 
UV permitiendo la detección del DNA. 
1. En un matraz Erlenmeyer de 125 mL, colocar 30 mL de buffer TAE 1X (vid. Anexo soluciones 
sección gel de agarosa) y la concentración de agarosa al 1 o 1.5% según se requiera (lo cual 
dependerá del tamaño de la muestra que se desea observar). 
2. Se calienta la mezcla hasta que la agarosa se funda por completo y ya no se observe la presencia 
de cristales, es decir, hasta que la mezcla sea homogénea. Ésta se vacía en una cámara 
previamente equilibrada (con un nivel) y con los peines dispuestos para la formación de los pozos 
donde se agregan las muestras en el gel. Una vez gelificado el gel se retiran los peines y se coloca 
el gel en una cámara para electroforesis en gel de agarosa que contiene el buffer TAE. 
3. Las muestras se cargan con 2 L de buffer de carga (vid Anexo soluciones sección gel de agarosa) 
el cual ya presenta colorante y permite observar en el gel a qué altura están corriendo las 
muestras. Como marcador se utiliza DNA digerido con enzimas de restricción (de las cuales ya se 
conoce el patrón de bandas) que en este caso fue digerido con EcoRI y HindIII. El gel se corre 
en un equipo para electroforesis en gel de agarosa, en este caso se empleó una cámara Mini 
Horizontal Submarine Unit (Amershan Biosciences) con una corriente de entre 80 y 100 V 
durante 30 min aproximadamente. 
4. Se retira el gel y de coloca en un tupperware con una solución de BrEt (5 g/mL) para su tinción y 
posterior visualización en presencia de luz UV. 
6.3 Clonación del gen de la porina 
6.3.1 Amplificación del gen de la porina 
Se realizó una reacción de PCR con el DNA genómico extraído y purificado de Aliciclyphilus sp. BQ1. 
Para la amplificación del gen de la porina se utilizaron los primers FwdPoriBQ1ET28b y 
RevPoriBQ1ET28b cuyas secuencias se encuentran en la tabla 2, esto para el caso de la primera clonación 
realizada, en el pET-28b. El primer FwdPoriBQ1ET28b fue diseñado con una secuencia que permitiera 
digerirlo con la enzima Nco1 (CCATGG) mientras que el primer RevPoriBQ1ET28b contenía un sitio de 
reconocimiento para la enzima XhoI (CTCGAG). El oligo FwdPoriBQ1ET28b contiene la secuencia de 
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17 
 
inicio (ATG) de la transcripción. Para que esto no interfiriera en el marco de lectura del gen, se insertaron 
dos nucleótidos extra para que el gen entrara en fase, lo cual generó que la proteína madura contuviera una 
valina después de la metionina inicial. Finalmente el oligo Porfwsps fue diseñado para la clonación en el 
plásmido pET-22 y tiene una secuencia de reconocimiento para la enzima NdeI. 
 
Tabla 2. Oligos utilizados para la amplificación del gen de la porina 
Nombre 
oligonucleótidos 
Secuencia Sitio de corte 
FwdPoriBQ1ET28b TAT CCA TGG TGA AAA AAT CTC TGA TCG CCC TG NcoI 
RevPoriBQ1ET28b TAT CTC GAG TGA GAA GGA GTG GCG GAT AC XhoI 
Porfwsps ATC CAT ATG CAA TCC TCC GTG ACG CTG NdeI 
Nota: Las letras marcadas en negrita son los sitios de corte para las enzimas de restricción mencionadas a 
la derecha de la tabla. 
A partir del DNA extraído de Aliciclyphilus BQ1 y que fue cuantificado previamente (muestra 130911B2 
tiene una concentración de 2464.5 ng/L) se hizo una dilución de 1/10 debido a que el DNA molde que se 
necesita en la reacción debe estar entre 12 y 60 ng/L. Fue necesario probar distintas temperaturas de 
alineamiento (Tm) (55, 58, 60, 63, 65 y 68 °C) dependiendo de la Tm calculada y la Tm proporcionada 
por el proveedor de los oligos. Las condiciones seguidas para la amplificación son: 
 
Tabla 3. Condiciones utilizadas para el uso del termociclador 
Paso Temperatura Tiempo No. Ciclos 
Desnaturalización inicial 98 °C 30 segundos 1 
Desnaturalización 
Extensión 
Alineamiento 
98 °C 
55-68 °C 
72 °C 
10 segundos 
20 segundos 
30 segundos 
30 
Extensión final 72 °C 10 minutos 1 
De acuerdo con las características que presenta la DNA polimerasa utilizada (Phusion
® 
High-Fidelity 
DNA Polymerase), no fue necesario hacer pruebas de concentración de Mg
2+
 ya que el buffer 
correspondiente para la enzima ya contiene una concentración final de 1.5 mM. Esta enzima, es de muy 
alta fidelidad, evitando errores de apareamiento entre bases durante la amplificación. 
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18 
 
Se realizó una mezcla de los componentes que son utilizados para la reacción de PCR. Para una reacción 
de 12 L: 
 
Tabla 4. Componentes para la reacción de PCR 
Componente L 
Agua 7.64 
Buffer 5X Phusion HF 2.4 
dNTPs (10 M) 0.24 
Oligos F (20 M) 0.3 
Oligos R (20 M) 0.3 
DNA molde (12 – 60 ng) 1.0 
DNA pol Phusion HF 0.12 
Total 12 
 
6.3.2 Ensayos de restricción del DNA a clonar 
Los ensayos de restricciónse llevaron a cabo utilizando protocolos generales (Sambrook and Russel, 
2001) considerando las diferencias correspondientes para cada una de las distintas enzimas utilizadas en 
relación a los buffers de reacción, los tiempos y las condiciones requeridas. 
Tabla 5. Reacciones de restricción de DNA. 
Reactivo Rx con Nco1 Rx con XhoI 
Buffer de reacción (10x) 10L 10 L 
DNA 50 ng del gen de la 
porina 
50 ng del gen de la porina 
Enzima (XU/ml) 0.6 L (Invitrogen) o 
0.3L (New England) 
0.3 L 
Agua 100 - (la suma de lo 
demás) 
100 - (la suma de lo demás) 
Total 100 L 100 L 
 
6.3.3 Ligación 
Para la ligación de fragmentos de DNA se empleó la enzima T4 DNA ligasa (Thermo Scientific 
00103878) que es capaz de unir fragmentos romos o cohesivos de DNA digeridos con enzimas de 
restricción que generen secuencias compatibles. La proporción inserto/vector necesaria para la reacción de 
ligación fue determinada de acuerdo con la siguiente ecuación: 
 
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19 
 
Para corroborar la eficiencia de la ligación se realizó una reacción control empleando el vector pBS 
digerido en un solo sitio, logrado esto se realizó la reacción de ligación utilizando el plásmido pET. La 
proporción de inserto vector que resultó más eficiente fue de 1:5 vector:inserto respectivamente la cual 
contenía: 0.4 L de agua, 50 ng de vector (aprox. 5 L), 50 ng de gen de la porina (inserto) (aprox 3 L),1 
L de buffer ligasa 10X y 0.6 L T4 DNA ligasa (3U/L). 
6.3.4 Transformación 
(Protocolo estándar con modificaciones realizadas en el laboratorio de Víctor de Lorenzo, Centro 
Nacional de Biotecnología, CSIC, Madrid, España) 
1. Descongelar en hielo un tubo de células competentes (vid Anexo) 
2. Añadir DNA producto de la reacción de ligación (aproximadamente 100 ng) a las células 
competentes. 
3. Incubar en hielo de 15 a 30 min. 
4. Dar choque térmico, para ello poner a 42 °C de 1.5 a 2 min. 
5. Poner en hielo durante 5 min. 
6. Añadir 1 mL de LB, incubar a 37 °C durante 1 h. 
7. Plaquear en un medio sólido selectivo (antibiótico, sustratos, etc.), por el método de plaqueo en 
alícuotas de 50 L, 200 L y 750 L (los volúmenes mencionados se centrifugan para obtener la 
pastilla celular y posteriormente resuspenderla en 100 L de medio LB estéril y con ello 
plaquear). Incubar ON a 37 °C. 
Para la clonación de la proteína madura (porina sin péptido señal), se utilizó el vector pET-22 con los 
oligos Porfwsps y RevPoriBQ1ET28b para la amplificación del gen de la proteína. Las enzimas de 
restricción utilizadas fueron Nde1 y Xho1 con las que se digirieron tanto el inserto como el vector para 
después llevar a cabo la reacción de ligación y posterior transformación en células BL21. Una tercera 
clonación se llevó a cabo con la proteína con péptido señal en vector pET-20 el cual contiene una 
secuencia pelB que es reconocida en cepas de E. coli y dirige a la proteína a la fracción periplásmica. Los 
oligos utilizados fueron los mismos que en la primera clonación, así como las reacciones de ligación y 
transformación. Ambas clonaciones fueron realizadas por José Alberto Hernández Eligio, postdoctorado 
en el laboratorio de la Dra. Loza. 
 
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20 
 
6.4 PCR 
 
6.4.1 Amplificación del gen de interés (véase sección 6.3.1) 
Es una técnica de biología molecular que tiene como objetivo obtener un gran número de copias de un 
fragmento de DNA particular, partiendo del DNA original o molde. 
6.4.2 PCR de colonia 
Para verificar que las células transformantes contienen el inserto de interés, se realiza una reacción de 
PCR utilizando los oligos con los que se amplificó el inserto anteriormente. 
1. Se prepara la mezcla de reacción (todos los componentes menos el DNA), alicuotar en tubos para 
PCR 
2. Con un palillo estéril se toma una colonia, rayarla en una caja de medio LB con antibiótico 
correspondiente y colocar después el palillo en uno de los tubos con la mezcla de reacción 
3. Correr productos de reacción en un gel de agarosa mediante una electroforesis y analizar la 
presencia del gen de interés. 
 
6.4.3 Confirmación de presencia de inserto en clonas transformadas 
Para confirmar la presencia del inserto deseado en las células transformadas con los vectores 
recombinantes, se realizó un PCR de colonia siguiendo las condiciones descritas para la amplificación del 
fragmento. 
1. Preparar la mezcla de reacción y alicuotar en tubos de PCR, la cantidad dependerá de las colonias a 
analizar. 
2. Con un palillo estéril tomar una colonia perfectamente aislada (de las previamente rayadas en cajas 
Petri) y resuspenderla en el tubo conteniendo la mezcla de PCR, adicional a esto es necesario 
sembrarlas en una caja réplica de LB con el antibiótico correspondiente para un análisis posterior 
en caso de que la reacción de PCR resulte positiva. La aparición de una banda con tamaño 
semejante a la observada en la amplificación del gen confirmará la presencia del gen de la porina 
en el vector. Como control negativo se preparó un tubo conteniendo la misma mezcla de PCR pero 
sin DNA molde. 
 
 
 
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21 
 
6.5 Expresión de la proteína recombinante 
Para la expresión y purificación de la proteína recombinante se utilizaron los vectores de expresión pET-
28b y pET-22a (Figuras 3 y 4), empleando los protocolos recomendados por los proveedores Qiagen (The 
QIAexpressionist
TM
, 2003) y Novagen (pET System Manual, 2011). 
 
Figura 3. Región de multiclonación del vector pET-28a-c. 
 
Inicialmente se trabajó con el vector pET-28b ya que presenta la posibilidad de clonar al gen de interés (el 
gen de la porina) con una cola de histidinas ya sea en el extremo amino o en el extremo carboxilo. Esto es 
de especial relevancia debido a que la proteína se purificará por cromatografía de afinidad con ayuda de 
una resina de níquel. El gen de la porina se clonó en los sitios Nco1 y Xho1 con lo que se generará una 
proteína con etiqueta de histidinas en el extremo carboxilo. El vector tiene un cassette de resistencia a 
Kanamicina lo que permite emplearlo como marcador de selección. 
 
Figura 4. Región de multiclonación del vector pET-22b. 
 
El vector pET-22b también pertenece a la familia de los pET y comparte las características generales de 
estos vectores, sin embargo, presenta además, una secuencia de pelB en el extremo amino la cual permite 
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22 
 
la dirección de la proteína a la fracción periplásmica, facilitando con esto su localización. Por esta razón, 
el gen de la porina también fue clonado en este vector empleando los sitios Nde1 y Xho1. 
 
Tabla 6. Características de los vectores usados en la clonación 
Nombre del plásmido pET-28b pET-22b 
Resistencia antibiótico Kanamicina (30 mg/mL) Ampicilina (100 mg/mL) 
Inductor IPTG (500 mM) IPTG (500 mM) 
Permite complementación Sí Sí 
Presencia de péptido señal Sí No 
 
6.6 Cuantificación de proteína 
Para poder cuantificar la cantidad de proteína que hay en cada muestra, se utilizó el método de 
microensayos de Bradford (Bio-Rad) el cual se basa en la unión del colorante Azul de Coomassie a las 
proteínas. Ésta unión provoca diferencias de lectura en la absorción máxima del colorante desde 465 hasta 
595 nm. Este ensayo es muy efectivo y altamente reproducible, la unión del colorante se completa en dos 
minutos y es estable durante aproximadamente 1 h (Bradford, 1976). Es necesario hacer una curva patrón 
a partir de una solución de 1 mg/mL de BSA (albúmina sérica bovina), se sugiere hacer un stock de 8 mLde una solución que contenga 10 g de BSA y de ahí hacer diluciones. Tomar 100 L de la solución de 1 
mg/mL de BSA y aforar a 8 mL con agua desionizada. 
 
Tabla 7. Curva patrón de BSA 
 
 
Una vez preparada la curva patrón se procede a leerla en el espectrofotómetro (Ultrospec 2000) a 595 nm 
utilizando una celda de plástico de 1 mL. Con las absorbancias registradas en la curva patrón se procede a 
definir la ecuación de la recta correspondiente, que servirá de referente para así conocer la concentración 
de las muestras a analizar. La ecuación de la recta es: y = mx + b, donde “y” es el valor de la absorbancia, 
“x” es la concentración de proteína (g/L) y “b” corresponde a la ordenada al origen. 
Proteína (g) 
Solución stock de 
BSA (10 g/mL) 
(L) 
Agua desionizada 
(L) 
Reactivo de Bradford 
(L) 
0 0 800 200 
2 160 640 200 
4 320 480 200 
6 480 320 200 
8 640 160 200 
10 800 0 200 
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23 
 
Las muestras se preparan de igual manera que para realizar la curva patrón, se toman tres puntos por cada 
muestra y en diferente concentración para confirmar la linealidad de las mediciones. Un ejemplo es: 
Tabla 8. Ejemplo de preparación de muestras por triplicado para cuantificación de proteína. 
No. muestra L muestra Agua desionizada (L) Reactivo Bradford (L) 
1 
1 799 200 
3 797 200 
5 795 200 
6.7 Electroforesis en SDS-PAGE 
Esta técnica se utiliza para la separación y análisis de proteínas en geles de poliacrilamida. Se basa en 
hacer pasar a las proteínas a través de un soporte sólido, un gel, mediante un campo eléctrico que las 
separa de acuerdo con la carga y masa propias de cada proteína, en el caso específico del SDS-PAGE, las 
proteínas se encuentran cargadas negativamente por lo que corren al polo positivo. 
1. En un tubo Falcon de 15 mL se mezclan perfectamente los componentes para el gel de separación 
(vid. Anexo soluciones sección SDS-PAGE) y se vacía el contenido en los sándwiches de vidrio 
con grosor de 1 mm que previamente se verificaron que no presentaran fugas en la unión entre los 
vidrios (vaciar a aprox. ¾ partes del espacio total del vidrio) y se rellena con etanol la parte 
superior para que la poliacrilamida polimerice. 
Tabla 9. Componentes y cantidades para preparar gel separador 
Componente / % acrilamida 12% 15% 
No. Geles 1 2 1 2 
Agua (mL) 1.75 3.5 1.25 2.5 
Buffer separador (mL) 1.25 2.5 1.25 2.5 
Acrilamida (mL) 2.00 4.00 2.50 5.00 
Persulfato de NH4 al 20% 
(L) 
26.8 53.6 31.0 62.5 
TEMED (L) 1.7 5.4 3.1 6.25 
2. Una vez gelificado el gel separador, se retira el etanol y se vacía la mezcla para el gel apilador 
(vid. Anexo soluciones sección SDS-PAGE) e inmediatamente después se colocan los peines que 
se utilizan para formar los pozos donde se agregan las muestras. El peine que se utilice depende 
del volumen y cantidad de muestras que se vayan a analizar. 
 
 
 
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24 
 
Tabla 10. Componentes y cantidades para preparar gel apilador 
Componente 
No. geles 
1 2 
Agua (mL) 1.2 2.4 
Buffer apilador (L) 520 1040 
Acrilamida (L) 350 700 
Persulfato de NH4 al 20% (L) 20 30 
TEMED (L) 5 5 
 
3. Cuando ya haya gelificado el gel apilador se retiran los peines y se procede a alicuotear en tubos 
de microcentrífuga los volúmenes necesarios de cada muestra para tener la misma cantidad de 
proteína en cada carril (10 a 20 g). Es necesario que todos los carriles contengan la misma 
cantidad de proteína para poder hacer un análisis comparativo. Dicha uniformidad se espera ver 
después de terminar la tinción de los geles. Agregar a las muestras una concentración final de 1X 
de buffer de carga (vid. Anexo soluciones sección SDS-PAGE) y colocar los tubos en un baño de 
agua a ebullición durante 10 min. 
4. Colocar las muestras en un baño de hielo y cargar el gel con las muestras y un marcador de peso 
molecular. En este caso se corrieron los geles en un equipo Mini Protein III (Bio-Rad) con una 
corriente de entre 120 y 135 V durante 1 h 45 min. aproximadamente. 
5. Una vez que sale el frente de corrida (marcado por la banda azul lineal) se desconecta la cámara y 
se retiran los geles del sándwich. Si fuera necesario, se les hace algún tratamiento (ej. zimograma) 
previo a la tinción con azul de Coomasie (vid. Anexo soluciones sección SDS-PAGE). 
 
6.8 Zimograma para actividad esterasa 
Ésta técnica es utilizada para determinar la presencia de actividad enzimática de tipo esterasa en la 
proteína recombinante. Esta técnica permite observar la aparición de bandas fluorescentes cuando se 
expone al gel a luz UV en presencia de 4-metilumbeliferil butirato (MUF-butirato). Únicamente se podrán 
apreciar emisiones fluorescentes cuando el butirato es hidrolizado en su enlace éster y el MUF es liberado 
(Díaz et al., 1999). 
1. Cargar un gel de poliacrilamida al 15% con la misma cantidad de proteínas en cada carril (ya sea 
10 o 20 g). Colocar 5 L de marcador de peso molecular (Precision Plus Protein
TM
 Standards, 
Dual Colors de Bio-Rad) y 5L de un control positivo, en este caso una lipasa de Pseudomonas 
fluorescens (0.05 U Sigma, No. Cat. 95608). 
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25 
 
2. Una vez que el frente de corrida haya salido del gel, es necesario detener la corriente y colocar el 
gel en un recipiente con tapa para darle dos lavados de 20 min cada uno con 15 mL de Tritón X-
100 (Sigma, No. Cat. 9002-93-1) al 2.5% con el fin de eliminar el SDS. 
3. Posteriormente, se enjuaga el gel con buffer de fosfatos 20 mM pH 7 (vid. Anexo soluciones) 
durante 5 minutos. Al mismo tiempo se prepara una solución de 3 mL por gel, de MUF-butirato 1.6 
mM con etilenglicol como diluyente a partir de un stock concentrado (vid. Anexo soluciones 
sección zimograma) ya que ésta debe ser utilizada inmediatamente después de haber sido 
preparada. 
4. Retirar el buffer de fosfatos e incubar el gel con la solución de MUF-butirato 1.6 mM durante 25 
minutos en ausencia de luz. Pasado este tiempo, se observa el gel en un transiluminador de luz UV 
en el cual se presentarán bandas fluorescentes que indicarán la presencia de esterasas. 
5. Se toma una fotografía del gel en el equipo Kodak Image Station-Molecular Imaging System bajo 
la condición de luz UV. La presencia de intensas bandas blancas en un fondo negro indicará la 
existencia de actividad enzimática. 
 
6.9 Purificación de la proteína recombinante (Rogl et al., 1998) 
La proteína recombinante, la cual contenía una etiqueta de histidinas, se purificó empleando resina Ni-
NTA la cual posee una alta afinidad por la secuencia de seis histidinas. 
1. Se inocularon en un matraz de 2 L con 400 mL de medio LB con ampicilina, 5 mL de un cultivo 
ON de la clona 22 la cual posee el inserto sin péptido señal. Cuando este cultivo llegó a una D.O.600 
de entre 0.5 y 0.7 medido se añadió IPTG en una concentración final de 500 M y se dejó 
incubando 3 horas. 
2. La pastilla celular resultante se resuspendió en 5 mL de buffer de lisis “B” (vid Anexo soluciones 
sección purificación proteína) en condiciones desnaturalizantes. Esta suspensión se sometió a una 
disrupción celular con ayuda del sonicador marca Sonics (Vibra Cell
TM
) por 6 ciclos de 15 s de 
disrupción por 15 s de descanso a una amplitud de 21%. Esto se realizó en un tubo de plástico 
específico para sonicar dentro de un baño de hielo que sea lo suficientemente compacto para que no 
permita el movimiento del tubo. 
3. Se tomó una alícuota de 20 L del lisado y se conservó como fracción total que se analizará en el 
gel de SDS-PAGE. Lo que queda en el tubo se somete a centrifugación 12,000 g/4 °C/20 min y se 
separan la fracción soluble(sobrenadante) de la insoluble (pellet). 
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26 
 
4. La pastilla celular resultante se resuspende en 3 mL del mismo buffer de lisis “B”, de preferencia 
aquel donde se pre-equilibró la columna de níquel, y se coloca en agitación con ayuda de una barra 
magnética durante 30 min. 
5. Tanto la solución de pastilla celular y el sobrenadante iniciales se dejan 1 h en contacto con la 
resina de níquel que se calibró con el mismo buffer de lisis. Pasado este tiempo, la mezcla completa 
(ya sea de pastilla celular o de sobrenadante, por separado) se cargaron en una columna que 
permitiera el paso del líquido más no de la resina donde está pegada la proteína de interés y se 
recolectaron las fracciones que atravesaron la columna para corroborar en un gel SDS-PAGE que 
no se pierda la proteína, este líquido se conocerá como FT (flow through: fracción no unida). 
6. La columna se lavó 4 veces con 1.5 mL de buffer de lavado (vid Anexo soluciones sección 
purificación proteína) el cual contiene un pH más ácido y permitirá que las proteínas que no son de 
interés se vayan en el lavado, también se recupera cada fracción de líquido que salga para hacer el 
mismo análisis en el gel SDS-PAGE. 
7. Finalmente se eluye a la proteína con el mismo buffer de lisis (pH 8) pero utilizando diferentes 
concentraciones de imidazol (30, 60, 100, 200 y 300 mM). 
8. Las muestras se deben guardar a -20 °C o cuantificar y correr un gel SDS-PAGE. 
6.10 Electroelución 
Es una técnica que permite eluir a las proteínas que han sido separadas previamente en un gel de 
poliacrilamida SDS-PAGE. Consiste en colocar pedazos del gel con la proteína de interés en una cámara 
con una membrana especial por la que se hace pasar corriente para extraer del gel a la proteína de interés y 
que ésta no se difunda en el medio. Se utilizó el protocolo descrito por el proveedor BIO-RAD Modelo 
422 “Electro-Eluter, Instruction Manual, Cat. No. 165-2976 y 165-2977”. 
6.11 Esquema de inmunización 
Con el fin de obtener anticuerpos 
1.- Se emplearon dos conejas jóvenes (6 meses de edad) de raza Nueva Zelanda para realizar este 
trabajo. 
2.- Es necesario realizar una sangría control para obtener el suero pre-inmune. Para ello se tomaron (se 
utilizaron jeringas con aguja de calibre 22 de 5 mL) 3 a 5 mL de sangre del conejo antes de hacer la 
inmunización con la proteína recombinante. La sujeción del animal fue de manera manual sin el uso 
de anestésicos. Dejar coagular la sangre durante aproximadamente 30 min y posteriormente 
centrifugar a 10,000 g por 20 min para obtener el suero. 
Mariana Domínguez Cárdenas Tesis de Licenciatura 
 
27 
 
3.- El esquema de inmunización que se siguió se presenta en la tabla 11 donde se encuentran la 
cantidad de proteína inoculada, la vía y la fecha de dicha inoculación. La proteína recombinante se 
encuentra en una solución amortiguadora de fosfatos (PBS) que funge como suero fisiológico y 
medio se suspensión. La solución se inyectará (en esta y las siguientes ocasiones) con la ayuda de 
jeringas de 1 mL de capacidad calibre 23, 25 o 27 según convenga. 
4.- Es necesario realizar una sangría de prueba, para ello, se extrajeron 3 mL de sangre de cada coneja 
para obtener el suero correspondiente y con éste probar mediante la técnica de inmunodifusión de 
Ouchterlony si hay producción de anticuerpos contra dicha proteína. La prueba Ouchterlony se basa 
en la precipitación del complejo antígeno-anticuerpo sobre una placa de agarosa en la cual se. Las 
placas con diferentes diluciones de anticuerpo de incuban 12 h a 37 °C en cajas Petri con una cama 
de papel húmedo para evitar que la agarosa se seque. Si el título de anticuerpos es muy bajo o nulo, 
será necesario realizar otras sangrías hasta obtener un resultado que de positivo para la producción 
de anticuerpos. 
5.- Una vez verificada la producción de anticuerpos, se procede a cosechar la sangre de las conejas. 
Ésta se llevó a cabo por punción cardiaca con la suficiente precaución para que el animal quedara 
vivo. 
6.- Preparar el anticuerpo para utilizarlo en ensayos de inmunodetección. 
Tabla 11. Esquema de inmunización de conejas 
 
Coneja Semana 1 2 3 4 5 6 7 8 
A 
Prueba 
Sangría 
control 
(3 mL) 
--- 
Sangría 
de prueba 
(3 mL) 
--- --- 
Sangría de 
prueba 
(3 mL) 
--- 
Sangrado 
de 
conejas Inyecciones
/ Vía/ Fecha 
500 g/ 
Poplítea
/24072012 
500 g/ 
Poplítea/
30072012 
500 g/ 
Poplítea/ 
06082012 
500 g/ 
Poplítea
/1308012 
500 g/ 
Subcutánea/
20082012 
500 g/ 
Subcutánea/ 
27082012 
500 g/ 
Interperitoneal 
/ 03092012 
500 g/ 
Poplítea
/27072012 
500 g/ 
Poplítea/
03082012 
--- --- --- 
500 g/ 
Subcutánea/ 
30082012 
--- 
B 
Prueba 
Sangría 
control 
(3 mL) 
 
Sangría 
de prueba 
(3 mL) 
--- --- 
Sangría de 
prueba 
(3 mL) 
--- 
Sangrado 
de 
conejas Inyecciones
/ Vía/ Fecha 
500 g/ 
Poplítea
/24072012 
500 g/ 
Poplítea/
30072012 
500 g/ 
Poplítea/ 
06082012 
500 g/ 
Poplítea
/13082012 
500 g/ 
Subcutánea/
20082012 
500 g/ 
Subcutánea/ 
27082012 
500 g/ 
Interperitoneal/ 
03092012 
500 g/ 
Poplítea
/27072012 
500 g/ 
Poplítea/
03082012 
--- --- --- 
500 g/ 
Subcutánea/ 
30082012 
--- 
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28 
 
6.12 Purificación de anticuerpos 
Uno de los métodos más comúnmente usados para remover proteínas de una solución es la precipitación 
con sulfato de amonio. Dado que las proteínas poseen grupos polares expuestos, estos forman puentes de 
hidrógeno con el agua, sin embargo cuando se añaden a la solución moléculas pequeñas pero altamente 
cargadas –como el sulfato de amonio-, estas compiten con las proteínas por la unió al agua haciendo a las 
proteína menos solubles promoviendo su precipitación. 
La concentración de sulfato de amonio que se requiere para precipitar a los anticuerpos varía entre 
especies, por ejemplo la mayoría de los anticuerpos de conejo precipitan con una solución saturada de 
sulfato de amonio al 40% aunque se sabe que una solución al 50% es usada para más y mejores 
aplicaciones. Nosotros convenimos trabajar con una concentración final de 45% de sulfato de amonio. 
1.- Medir la cantidad de suero y centrifugar 30 min a 3,000 g 
2.- Transferir el sobrenadante a un vaso de precipitados y agitar con ayuda de una barra magnética, 
añadir solución de sulfato de amonio saturada hasta obtener una concentración final del 50% y 
dejar en agitación constante a 4 °C ON 
3.- Centrifugar el precipitado a 3,000 g por 30 min 
4.- Retirar el sobrenadante drenando cuidadosamente. Resuspender la pastillas celular en 0.3 
volúmenes de PBS del volumen inicial, evitar la formación de espuma. 
5.- Transferir la solución de anticuerpos a una membrana de diálisis con corte de 8 kDa (SpectraPor, 
Spectrum Laboratories Inc.) y dializar con tres cambios de PBS ON. 
6.- Transferir la solución de anticuerpos de la membrana a un tubo y centrifugar para retirar cualquier 
contaminación. 
 
6.13 Western Blot 
El término "blotting" se refiere a la transferencia de muestras biológicas de un gel a una membrana para la 
subsecuente detección de la misma en la membrana. El Western blot fue desarrollado en 1979 por Towbin 
et al. y es una técnica muy utilizada para el análisis de proteínas. La especificidad de los anticuerpos 
permite detectar a la proteína de interés dentro de una mezcla compleja de otras proteínas permitiendo que 
esta técnica sea altamente cualitativa. 
1. Separar las proteínas en un SDS-PAGE, desmontar el equipo y sin teñir el gel dejarlo durante 15 
minutos en buffer III para Western blot (vid. Anexo soluciones sección Western blot). 
2. Cortar una membrana de PVDF de igualtamaño que el gel separador y activarla con metanol 
durante 15 s (lavarla con agua destilada). Finalmente dejar a la membrana en buffer II para 
Western blot (vid. Anexo soluciones sección Western blot) durante 5 min. 
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29 
 
3. Cortar 6 pedazos (por gel) de papel filtro Whatman 3 MM con medidas iguales al gel 
(aproximadamente 6.5 x 8.5cm) que van a ser sumergidos en distintos buffers para realizar la 
transferencia. 
4. Acomodar los papeles, la membrana y el gel de la siguiente manera: 
 
 
 
Figura 5. Acomodo de “sándwich” para la transferencia de proteínas. 
Nota: es importante para lograr una correcta transferencia que no queden burbujas en el ensamblaje, por 
lo que se recomienda pasar un tubo de ensayo encima de la pila de papeles, ejerciendo un poco de 
presión para retirar posibles burbujas. 
 
5. El amperaje con el que se realiza la transferencia depende del tamaño de las membranas y el 
tiempo que se les vaya a dar: 
Tabla 12. Amperaje y tiempos recomendados para llevar a cabo transferencia de proteínas. 
Intensidad de corriente Tiempo límite 
0.8 mA/cm
2
 1 a 2 horas 
2.5 mA/cm
2
 30 a 45 minutos 
 
Ejemplo: si la membrana mide 8.5 x 6.5 cm = 55.25 cm
2
 considerando un tiempo de corrida de 40 
minutos, esto se multiplica por 2.5 mA dando: 138 mA que se deben aplicar para esta única 
membrana. 
6. Desmontar la electrotransferencia y dejar secar las membranas, en este momento se empiezan a 
apreciar las bandas con las proteínas transferidas y estas se deben marcar para identificar los 
carriles. Una vez secas, se vuelven a activar en metanol por 15 segundos y se lavan con suficiente 
agua para después bloquear durante una hora con una solución de TBS-T (vid. Anexo soluciones 
sección Western Blot) + 5% leche descremada en polvo (Svelty’s) 
7. Pasado este tiempo se realiza un lavado con TBS-T fuerte y rápido (30 s) para eliminar exceso de 
leche y luego se realizan dos lavados de 15 minutos cada uno con la misma solución. 
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30 
 
8. Dejar a la membrana incubando con el anticuerpo específico desarrollado contra la porina 
recombinante ON a 4 °C con agitación constante. Se probaron diferentes diluciones del anticuerpo 
disuelto en TBS-T + 5% leche en polvo. 
9. Lavar las membranas como se describió arriba, una vez rápido para quitar excedentes y luego dos 
lavados más de 15 minutos cada uno con solución TBS-T, con agitación lenta. 
10. Dejar incubando a las membranas con el segundo anticuerpo (Goat anti-Rabbit IgG, ZyMaxTM) a 
temperatura ambiente con agitación constante durante una hora, la dilución fue de 1:20,000 para 
fracción citoplásmica y 1:35,000 para la fracción membranal. 
11. Lavar nuevamente las membranas dos veces con TBS-T durante 15 minutos cada vez. 
12. Revelar de acuerdo con protocolos de ECL o fluorimétricos (como por ejemplo el 4-
metilumbeliferil-β-D-glucurónido) 
 
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31 
 
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
7.1 Obtención del DNA genómico 
Después de realizar la extracción del DNA genómico de Alicycliphilus sp. BQ1 en repetidas ocasiones, 
finalmente se obtuvieron preparaciones las cuales fueron analizadas espectrofotométricamente para 
determinar si eran de buena calidad. Para ello, alícuotas de la preparación se leyeron a cuatro diferentes 
longitudes de onda: 230, 260, 280 y 320 nm a fin de determinar la presencia de posibles contaminantes en 
la solución de DNA. La relación A260/A280 debe encontrarse entre 1.7 - 2.0; valores inferiores indican 
contaminación por proteína. La relación A260/A230 menor a 1.5, indica que hay contaminación por fenoles. 
En caso de que la preparación no cumpla con los parámetros de calidad puede dársele un segundo 
tratamiento ya sea realizando otra extracción con fenol-cloroformo para eliminar proteínas y otra 
precipitación con etanol para eliminar fenoles. Para fines de este trabajo, se utilizó la muestra que 
presentó mayor pureza en su obtención siendo ésta la llamada “130911B2” que presenta los valores de 
1.94 en la relación A260/A230 y 2.05 en la relación A260/A280. Haciendo la ecuación –mencionada en 
metodología- obtuvimos que la muestra presenta una concentración de DNA de 2464.5 [g/mL]. 
7.2 Preparación del inserto 
El gen de la porina se amplificó a partir del DNA genómico de BQ1 empleando los primers 
FwdPoriBQ1ET28b RevPoriBQ1ET28b diseñados ex-profeso, conteniendo sitios de restricción para NcoI 
y XhoI respectivamente. Se realizaron distintas PCRs para determinar la temperatura adecuada para el 
alineamiento de los oligos y con ello lograr la amplificación del gen de interés. Las temperaturas que se 
probaron fueron: 55, 58, 60, 63, 65 y 68 °C, observándose en un gel de agarosa el amplificación de un 
fragmento del tamaño e intensidad esperados en todos los casos (Figura 6) (Sánchez-Tafolla, 2010). 
 
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32 
 
 
 
 
Figura 6. Amplificación del gen de la porina por 
PCR probando diferentes temperaturas de 
alineamiento de los oligos. Electroforesis en gel 
de agarosa al 1.5%, corriente de 85 V durante 
35 min. Las temperaturas probadas fueron: 
carril 1: 55 °C; carril 2: 58 °C; carril 4: 60 °C; 
carril 5: 63 °C; carril 7: 65 °C; carril 8: 68 °C. 
Las reacciones control (sin DNA molde) 
también fueron probadas a dos diferentes 
temperaturas de alineamiento: carril 3: 60 °C; 
carril 6: 65 °C. Carril 9: marcador de peso 
molecular de 1 kb. 
Por lo anterior, se repitió el experimento a gran escala pero empleando una temperatura de alineamiento 
de 68 °C. Los productos de la PCR se analizaron en un gel de agarosa, a partir del cual se purificó el 
amplicón de interés empleando el High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) y se cuantificó su 
concentración para posteriormente realizar el ensayo de restricción. 
7.3 Preparación del vector 
Paralelamente a esto fue necesario generar células competentes capaces de aceptar DNA exógeno. Para 
ello, células de E. coli de las cepas BL21, XL1-Blue, XL-10Gold y DH5, fueron sometidas a un 
tratamiento con cloruro de calcio y un choque térmico, para que pudieran ser transformadas. Después de 
varias pruebas, fue posible lograr los valores de eficiencia de transformación que se presenta en la tabla 
13. Se procedió a generar bacterias competentes y a preparar gliceroles para futuras transformaciones. 
Tabla 13. Eficiencia de transformación de células competentes 
Células Eficiencia (UFC/g DNA) 
BL21 1.53 x 10
4
 
XL-10Gold 1.39 x 10
5
 
XL1-Blue 7.6 x 10
4
 
DH5 x 10
5
 
 
El pET-28b fue transformado en células XL1-Blue para aumentar la cantidad de plásmido. 
Posteriormente el plásmido se purificó empleando el GenElute
TM
 Plasmid Miniprep Kit (Sigma-Aldrich) 
y se cuantificó tanto en espectrofotómetro como en gel de agarosa al 1%. 
Una vez obtenido el pET-28b se digirió con las enzimas de restricción XhoI y NcoI. Sin embargo, para 
tener la seguridad de que las enzimas funcionaban correctamente, se realizaron reacciones individuales 
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33 
 
para cada enzima con las condiciones correspondientes descritas en la metodología. El análisis por 
electroforesis en gel de agarosa al 1.5% de los productos de las reacciones de restricción mostró que 
ambas enzimas funcionaban correctamente por separado (Figura 7) generando el plásmido linearizado del 
tamaño correspondiente (5.3 kb). Después de haber realizado las dobles restricciones, los plásmidos 
digeridos se purificaron directamente del gel