ARN pol

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VIRUS ARN MONOCATENARIOS, 
POLARIDAD NEGATIVA
Regla nemotécnica de Flor:
Ortho ̶ Para ̶ Rab ̶ Ar ̶ Bun
(Los importantes son los primeros tres. Yo los pongo en orden de prioridad).
RHABDOVIRUS
Esta familia comprende virus con forma alargada, con ambos extremos redondeados o un extremo redondeado y el otro recto (forma de bala). Tienen ARN de cadena simple y polaridad negativa dispuesto en hélice, rodeado de subunidades proteicas que siguen su disposición, generando una nucleocápside con simetría helicoidal. Son envueltos, las espículas le dan a la superficie forma de panal de abejas. Miden 180 x 80 nm, se replican en citoplasma y salen de la célula por gemación.
Hay dos géneros que nos importan: Lyssavirus (Serotipo 1 = virus de la rabia que afectan caninos; ST 2-6: productores de encefalitis en animales y hombre*) y Vesiculovirus (virus de la estomatitis vesicular).
*Dato de Gere: ST 1 y 2 afectan caninos y son lo que más nos preocupa cuando hacemos el diagnóstico. ST 3 afectan a Desmodus rotundus (vampiro, murciélago hematófago). ST 4 y 6 afectan a murciélagos insectívoros. Estas cosas son de epidemio, pero capaz les parecía interesante xD. 
VIRUS DE LA RABIA:
Tiene forma de bala, la proteína de la nucleocápside se denomina N y la proteína NS es otra no estructural. Además se encuentra la proteína L, que es la ARN polimerasa ARN dependiente, la cual le permite replicarse en el citoplasma celular, al transcribir la cadena complementaria de polaridad +.
La envoltura no cubre completamente el extremo recto del virión. En la superficie de la envoltura hay espículas formadas por la proteína G. 
Para ser infeccioso, el virión debe estar completo, por lo que cualquier elemento que degrade la envoltura evita la infecciosidad. Este virus resiste pH entre 5 y 10ºC, siendo termolábil pero resistiendo el frío. Se inactiva con luz ultravioleta, bietilenamina y β- propiolactona.
· REPLICACIÓN VIRAL:
La forma habitual más efectiva de multiplicar el virus de la rabia es la inoculación intracerebral, ya que es neurotrópico. Sin embargo también puede replicarse, aunque en menor grado, en células musculares estriadas y en glándulas salivales. Como medios de cultivo pueden utilizarse embriones de pollo y células de cultivo in vitro, lo cual no es muy utilizado en diagnóstico pero sí para producción de vacunas, ya que una cepa calle no está adaptada y puede no crecer bien. Se usan las líneas BHK y Vero. 
El virus se adosa a los receptores celulares debido a la proteína G. Una vez fijado a las células, el virión penetra por endocitosis y la membrana viral se fusiona con la lisosomal, liberándose la nucleocápside al citoplasma, donde se multiplicará. Así empieza a trabajar la proteína L o ARN polimerasa viral que, luego de producir una cadena positiva, sintetizará las cadenas de ARN viral (polaridad −). En un virus calle, se producen acúmulos en determinadas zonas del citoplasma neuronal, estos son los cuerpos de inclusión que se utilizan para diagnóstico: los Corpúsculos de Negri. Son acidófilos, elipsoidales y miden 1-10 µm. 
En los virus adaptados o fijos, la multiplicación es más rápida y ocurre en todo el citoplasma, con lo que NO SE FORMAN estos corpúsculos, o son mininos y no cuentan.
Las células infectadas pueden mantenerse un cierto tiempo sin evidenciar alteraciones citopáticas, aunque luego de varios ciclos replicativos se alteran y mueren.
· PATOGÉNESIS
La mordedura coloca el virus (presente en la saliva del animal eliminador) en el tejido celular subcutáneo y en los músculos. Este permanece un lapso variable en el lugar de entrada, pudiendo multiplicarse en las células musculares estriadas. Luego, siguiendo el trayecto de los nervios periféricos que inervan la región, avanza en forma centrípeta hacia el sistema nervioso central a razón de 3 mm por día. El virus alcanza las neuronas, se introduce en el citoplasma y comienza a replicarse. Desde el SNC se produce luego una diseminación centrífuga. Al tiempo que el virus alcanza el SN, llega también a las glándulas salivales, multiplicándose en las células secretoras de las mismas y apareciendo en la saliva, lo cual habitualmente se produce unos días antes (hasta 10 días) de que la infección neuronal se traduzca en sintomatología. El tiempo que el virus tarda en llegar hasta las neuronas (células en las cuales su acción se traduce en sintomatología) justifica la duración del período de incubación y la posibilidad de crear protección inmunológica por vacunas o anticuerpos pasivos antes de que el virus llegue a SNC.
El virus rábico NO ES LÍTICO, pero su multiplicación altera las neuronas y produce disturbios en su actividad, con los clásicos fenómenos excitativos y alteraciones nerviosas características de la enfermedad. Luego de algunos ciclos de replicación, las células nerviosas mueren ocasionando la parálisis de la zona o función que comandaba.
· RESPUESTA INMUNE:
Los Lyssovirus tienen en común el antígeno N o nucleoproteína de la nucleocápside. El virus de la rabia difiere de otros Lyssavirus por el antígeno G (glucoproteína) de la envoltura. Esta induce la producción de anticuerpos neutralizantes, capaces de evitar la infección por el virus rábico. Actúa como blanco para las células T “helper” y para las células T citotóxicas. Además, el antígeno N induce anticuerpos precipitantes y detectables por inmunofluorescencia que revisten importancia diagnóstica.
· DIAGNÓSTICO VIROLÓGICO
Los hay postmortem e intra vitam. 
El primero se emplea sobre muestras de encéfalo de animales muertos con síntomas compatibles con la enfermedad, o cuando antes de la muerte han mordido humanos; mientras que el segundo se efectúa para comprobar rabia en un paciente vivo con sintomatología y anamnesis que hagan sospechar la enfermedad.
· Muestras
· Posmortem: Porciones de ambos cuernos de Ammon, corteza cerebral de ambos lados, cerebelo y bulbo raquídeo. Se busca la presencia del virus rábico y sus antígenos. También pueden usarse glándulas salivales, ganglios nerviosos, ojos y anexos, piel y folículos pilosos, etc.
· Intra vitram: Improntas corneales, biopsias de piel y folículos pilosos del cuello, muestras de saliva e hisopado faríngeo para investigar la presencia del virus y sus antígenos, y muestras periódicas de sangre para determinar la aparición o aumento del título de anticuerpos antirrábicos en suero sanguíneo (seroconversión) ya que los anticuerpos aparecen y aumentan en forma apreciable en la fase final de la sintomatología.
· Toma y transporte de muestra
· Encéfalo: se toma durante la necropsia y se transporta refrigerada (3º a 5º). 
· Saliva: puede tomarse con una jeringa estéril sin aguja o con un catéter en el extremo, o se emplea un hisopo para recoger muestras de zona bucal y faríngea. Este tipo de muestra debe tomarse inmovilizando al paciente y utilizando guantes, barbijo y anteojos, ya que la saliva es potencialmente muy infecciosa y puede ser proyectada hacia la cara del operador. 
· Sangre: debe tomarse inmediatamente después del ingreso del paciente sospechoso y permitirá conocer si tiene o no anticuerpos antirrábicos en el suero sanguíneo. Una segunda muestra se tomará por lo menos 5 a 7 días después y en caso de presentar anticuerpos (si la primera no tenía) o de presentar un título más alto que la primera, confirma la presencia de rabia. Los anticuerpos pueden investigarse también en líquido cefalorraquídeo. 
Las muestras de suero, LCR y saliva, se colocan en tubos estériles y se transportan congelados a –20 ºC o refrigerados. El envío se acompañará de un protocolo detallado del caso.
· Procesamiento
Investigación de corpúsculos de Negri:
Se realizan improntas y se tiñen con colorante de Sellers. La presencia de cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos, elipsoidales, de color violáceo rojizo, con finas granulaciones más azuladas, de bordes lisos y de 1 a 10 µm es confirmatorio del diagnóstico*, ya que su hallazgo es sinónimo de rabia. La ausencia de los mismos no permite excluirla.
Inmunofluorescencia directa:
Una IF positiva confirmarabia con seguridad*, pero si es negativa, aunque el margen de duda sea muy escaso, no permite descartarla y se debe hacer la prueba de inoculación intracerebral a ratones.
Prueba de inoculación intracerebral a ratones:
Se suspenden porciones del cuerno de Ammon, cerebro, cerebelo y bulbo del encéfalo problema en una concentración del 20% en un diluyente constituido por agua destilada con 2% de suero normal equino inactivado como estabilizante y antibióticos, se homogeinizan y se inoculan por vía intracerebral a ratoncitos albinos lactantes. El virus de la rabia, si está presente, los matará entre 7 y 21 (según Flor, de 5 a 7 días) días con síntomas encefalíticos. Luego de los 21 (o 7, según Flor) días se eutanasia uno por día y se buscan corpúsculos de Negri. Si la inoculación resulta positiva y confirmada, el diagnóstico es rabia. Si resulta negativa y la IF del material original era negativa, no se trata de rabia.
Aislamiento de virus en células de neuroblastoma de ratón:
Se realiza una prueba de inmunofluorescencia a los 4 días sobre la monocapa inoculada con la muestra para comprobar si está presente el virus rábico, en cuyo caso habrá fluorescencia en el pocillo al mirar con un microscopio de fluorescencia.
Para determinar anticuerpos se utilizan las pruebas de seroneutralización en ratones, de inhibición de foco fluorescente sobre cultivos celulares, de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA) utilizando como antígeno la glucoproteina y las técnicas de inmunofluorescencia indirecta.
* Según Flor, se hacen TODAS las pruebas para confirmar rabia, sin importar el resultado individual sino el global. Mis apuntes del año pasado concuerdan con el Stanchi, así que no sé qué decirles :/ En la comisión 4 también dijeron como en el Stanchi, y la verdad es que tiene lógica. Así que les mando cuadrito:
	Prueba
	Resultado
	Interpretación
	Corpúsculos de Negri
	+
	Rabia
	
	−
	No se puede descartar Rabia
	IF
	+
	Rabia
	
	−
	No se puede descartar Rabia
	Inoculación IC a ratones
	+
	Rabia
	
	−
	(Si la IF original fue −)
No es Rabia
· PROFILAXIS:
· Vacunación de los animales domésticos involucrados en la transmisión.
· Control de animales transmisores.
· A nivel humano se debe considerar la inmunización en profesiones habitualmente expuestas a la rabia: veterinarios, personal de perreras, productores de vacunas y laboratoristas de diagnóstico.
· Control veterinario de animales que hayan provocado mordeduras. 
· Consulta médica antirrábica ante la exposición por mordeduras y tratamiento antirrábico de los afectados.
· Vacunación animales silvestres.
· Control de transmisores en los brotes.
	Características
	Virus calle
	Virus fijo
	Origen
	Causante de casos clínicos de rabia, patógenos naturales.
	Logrado por Pasteur en el lab mediante pasajes intracerebrales del virus calle en conejos.
	Importancia
	Patógeno por vía periférica: alcanza el SNC y provoca encefalitis rábica mortal
	Es prácticamente apatógeno por vía periférica: Cepa vacunal
	Distinción
	Provoca aparición de Cuerpos de Negri en soma neuronal infectado.
	No produce Cuerpos de Negri en las neuronas.
	Período de Incubación
	Inoculado vía intracerebral a ratones adultos, los mata entre 7-21 días.
	Inoculado vía intracerebral a ratones adultos, los mata en 7 días (a los lactantes, en 5).
Género Vesiculovirus
La estructura es como el de la rabia. Existen tipo Indiana y tipo New Jersey, más virulento. El tipo Cocal es el agente causal de la estomatitis vesicular, una enfermedad en general benigna caracterizada por la aparición de vesículas en la cavidad bucal, bordes ungueales de las extremidades y mamas en los equinos, bovinos y cerdos. Se transmite por contacto, con puerta de entrada digestiva y respiratoria: además puede transmitirse e infectar artrópodos. ¿Qué mierda me importa este género? Que hay que diferenciarlo de la fiebre aftosa. Fin.
ORTHOMYXOVIRIDAE
(Este es el moco derecho)
Incluye los géneros: Influenza A, B, C, Thogotovirus e Isavirus. Los primeros tres causan gripe, el cuarto se transmite por garrapatas y el último causa anemia grave, leucopenia, asctis, necrosis hemorrágica y petequias en salmones (E’te e’ jodido, viteh).
Los virus de la Influenza tienen un genoma de ARN de polaridad negativa y dividido en 8 segmentos lo que facilita la recombinación viral y los fenómenos de reactivación. La replicación es NUCLEAR. Los viriones tienen simetría helicoidal y son envueltos por una cubierta lipídica proveniente de la célula huésped. Son esféricos (50-120 nm) pero también pueden observarse formas filamentosas al MET. 
En íntima relación con el AN se encuentra la nucleoproteína (NP), que es específica de tipo viral, es decir, constituye la base inmunológica. Los otros dos componentes son espículas que pueden identificarse con serología: la hemaglutinina es la glicoproteína principal, la cual es altamente inmunogénica, y está intercalada irregularmente con la neuroaminidasa, que tiene actividad enzimática. La relación HA/NA es de 4-5 a 1. Los antígenos de superficie experimentan en forma independiente variaciones genéticas.
Hay dos tipos fundamentales de cambios genéticos: a) “Drift o deriva antigénica”, que son modificaciones menores al genoma que ocurren muy gradualmente en los miembros de un mismo subtipo. Y b) “Shift antigénico”, que son cambios mayores del genoma por recombinación de alta frecuencia o intercambio completo de segmentos. Estos cambios, por lo general, son de aparición brusca y caracterizan las cepas pandémicas.
REPLICACIÓN VIRAL:
Una partícula de virus de la influenza se une a la célula por interacción entre la HA viral y una molécula de ácido siálico de una glicoproteína receptora en la superficie de la célula. A continuación hay endocitosis; el bajo pH del endosoma produce un cambio conformacional en la molécula de HA que facilita la fusión de las membranas, permitiéndole al virión liberar su contenido en el citoplasma celular. La NC migra al núcleo y la polimerasa que lleva asociada comienza la transcripción primaria del ARNm viral. Estos transcriptos son usados para la traducción de proteínas virales tempranas NP y NS1 (prot. no estructural)
La traducción del ARN mensajero celular es bloqueada. El acúmulo de NP produce un cambio en el genoma celular infectado que dispara la síntesis de ARN viral. Éste es encapsidado por la NP en el núcleo y funciona como molde para la transcripción secundaria del ARNm (¿?). Los principales productos de traducción tardía sin las proteínas M1, HA y NA. Estas dos últimas son procesadas y transportadas a la superficie donde se integran a la membrana celular. El ensamble de las nuevas partículas es en el citoplasma. La NC es “encerrada” por una cubierta de M1 y brota fuera de la célula usando la membrana celular como parte de su envoltura de superficie. La actividad de la NA produce la liberación de los viriones de la célula hospedadora.
DIAGNÓSTICO:
Se basa en el aislamiento viral a partir de las secreciones respiratorias durante la fase aguda de la enfermedad. Las muestras se inoculan en HE o línea celular MDCK. Para el diagnóstico rápido se usa inmunofluorescencia directa, ELIS y PCR. Las pruebas serológicas como la IHA que comparan sueros de la fase aguda y convaleciente, denominados muestras pareadas obtenidas con un intervalo de 15 o 20 días entre sí, confirman el diagnóstico de infección cuando existe como mínimo una diferencia de cuatro diluciones entre la primera y segunda muestra.
Por si acaso: aparte de la gripe común, nos importa el virus de la Influenza Equina, que es de alta morbilidad y baja mortalidad; se transmite porque los caballos tosen. Y todos los años hay que vacunar. 
PARAMYXOVIRIDAE
(Para-Miru-Variedades XD) 
Son ARN monocatenarios, polaridad negativa. La subfamilia Paramixovirinae se subdivide en tres géneros: Respirovirus, Morbillivirus y Rubulavirus y la subfamilia Pneumovirinae, en dos géneros: Pneumovirus y Metapneumovirus.
Los virus de esta familia tienen morfología pleomórfica, desde esféricos hasta filamentosos. El tamaño varíaentre 150 y 300 nm. Tienen una matriz lipídica que protege la nucleocápside y deriva de la membrana plasmática huésped. Contienen 2-3 glicoproteínas transmembrana (peplómeros). La nucleocápside viral consiste de una cadena única de ARN con proteínas asociadas, de simetría helicoidal.
Codifican 8-12 proteínas: Nucleocápside (NP), la fosfoproteína (F), la proteína polimerasa mayor (L), la proteína rica en cisteína (V), la proteína hidrofóbica pequeña (SH) y la que más nos importa: la Hemaglutinina/Neuroaminidasa. Morbillivirus tiene hemaglutinina pero no neuroaminidasa. 
REPLICACIÓN VIRAL:
La mayoría de los miembros de Paramixoviridae se cultivan generalmente en varios tipos de células y, en particular, en células homólogas. Todos aquellos pueden cultivarse también en huevos embrionados. Las partículas virales se replican en el citoplasma y por lo general la replicación es lítica. La formación de sincitios es una característica particular, al igual que la formación de cuerpos de inclusión acidófilos en el citoplasma, a excepción del género Morbillivirus que producen cuerpos de inclusión intranucleares. La hemoadsorción se da por virus parainfluenza.
Los virus se adhieren a receptores celulares (sialoglicoproteinas o glicolípidos) mediante la proteína HN. La proteína F media la fusión de membrana viral con la membrana plasmática en un pH fisiológico. Las nucleocápsides libres e intactas con sus tres proteínas asociadas (N, P y L) son necesarias para la transcripción de la polimerasas viral ARN dependiente (transcriptasa). El genoma completo, de polaridad positiva, se sintetiza y sirve como “patrón” para la replicación de un genoma de polaridad negativa (el posta). El control del proceso se da a nivel de la transcripción.
Mientras la mayoría de los genes codifican para una sola proteína, el genoma de la proteína P de la subflia Paramixovirinae codifica otras proteínas distintas (P/V/C y en algunos casos, también D), involucrando la inserción extra de uno o dos nucleótidos G en su ARNm mediante un proceso de edición (es re capo este).
La maduración de los viriones involucra: 1) la incorporación de glicoproteínas virales en la membrana plasmática del hospedador, 2) la asociación de la proteína matriz (M) y de otra proteína no glicosilada con la membrana modificada del hospedador, 3) el alineamiento de la nucleocápside con la proteína M y 4) la formación y liberación por gemación de los viriones maduros.
PERSISTENCIA VIRAL:
Una infección no citolítica de los macrófagos alveolares del pulmón de terneros infectados indica que dichas células pueden producir y liberar virus incompletos cuando el animal se expone a bajas temperaturas. También hay persistencia viral en el distemper canino (moquillo del perro).
DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO:
El aislamiento del virus se da a partir de secreciones nasales y de necropsia de pulmón. También se usa inmunofluorescencia, hemaglutinación, inhibición de hemaglutinación, virus neutralización y ELISA. En muchos casos es necesario realizar diagnóstico serológico basado en muestras pareadas para determinar una infección activa. La seroconversión de animales negativos a positivos o un incremento significativo de títulos en la inhibición de la hemaglutinación (por lo menos 4 veces más alto) es una indicación de infección.
ENFERMEDADES DE MAYOR IMPORTANCIA EN VETERINARIA:
· En aves es la enfermedad de Newcastle (NDV) del género Rubulavirus. Tras inhalarse se replica en epitelio del tracto respiratorio superior. El virus se aísla a partir de muestras a partir de la tráquea, heces, intestino, cerebro. Se pueden hacer pruebas serológicas: HI, ELISA, VN, etc. Es zoonosis, es exótica y en huevo embionado CAUSA MUERTE Y EMBRIÓN HEMORRÁGICO ( importante).
· En perros, el distemper canino o moquilo, del género Morbillivirus. Afecta a perros jóvenes, Jenner la descubrió en 1809. La infección se da a partir de inhalación de partículas virales y produce encefalitis (afecta SNC). En animales vivos se hacen improntas de secreciones nasales o de conjuntivas o leucocitos para observar en las células cuerpos de inclusión acidófilos. El aislamiento es en cultivos celulares durante la fase aguda de la enfermedad, sino, PCR.
LO QUE IMPORTA:
	Orthhomyxoviridae
	Paramyxoviridae
	ARN mc, polaridad ̶ , 8 SEGMENTOS
	ARN mc, polaridad ̶ , LINEAL
	Helicoidal, esférico o filamentoso.
	Helicoidal, pleomórfico o filamentoso.
	50- 120 nm
	150-300 nm (casi visible al MO!)
	Envuelto
	Envuelto
	HA y NA en distintas espículas (5/1)
	HA y NA en la misma espícula
	Se replica en NÚCLEO de epitelio respiratorio
	Se replica en CITOPLASMA, pantótropo
	Virus de la influenza aviar, porcina y EQUINA.
	Moquillo canino, peste bovina, NEWCASTLE
	Drift y shift debido al AN segmentado