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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas 
 
 
Estudio de la función del sistema de dos componentes 
CbrA/CbrB en la síntesis de alginato y represión catabólica por 
carbono en Azotobacter vinelandii 
 
 
TESIS 
 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
 
Doctor en Ciencias 
 
PRESENTA: 
M. en C. Elva Yadira Quiroz Rocha 
 
 
TUTOR PRINCIPAL 
Dra. Cinthia E. Núñez López 
Instituto de Biotecnología 
 
 
MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR 
 
Dra. Rosa María Gutiérrez Ríos 
Instituto de Biotecnología 
 
Dr. Christian Sohlenkamp 
Centro de Ciencias Genómicas 
 
 
Cuernavaca, Morelos. Agosto, 2017 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
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El presente trabajo fue realizado en el Departamento de Microbiologia Molecular del 
Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional Autómona de México, bajo la tutoría 
de la Dra. Cinthia E. Núñez López. 
 
Durante el desarrollo del presente trabajo recibí financiamiento por parte del Consejo 
Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT), con número de becario 239995, así como 
apoyo de los proyectos PAPIIT-UNAM IN208514, CONACyT-CB 240095 e INFR 
253487. Así mismo, agradezco al Programa de Apoyo a los Estudios de Posgrado (PAEP) 
por el apoyo económico brindado durante mi estancia en el Centro Nacional de 
Biotecnología (CNB), en Madrid. España. Además del financiamiento para asistir a 
congresos nacionales e internacionales donde se presentó este trabajo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
A la Dra. Cinthia Núñez, gracias por la confianza que depositó en mí desde el inicio, por su 
apoyo, disponibilidad, paciencia y dedicación. Mil gracias por darme oportunidades únicas 
en la vida. Me siento muy afortunada y privilegiada de haber estado bajo su tutela. Porque 
además de ser una excelente jefa siento que encontré una gran amiga. 
 
A los Drs. Guadalupe Espín y Daniel Segura, gracias por los enriquecedores comentarios 
en el laboratorio y durante los seminarios de grupo. 
 
A los Drs. Rosa María Gutierrez y Christian Sohlenkamp por sus valiosas contribuciones, 
comentarios y sugerencias durante los tutorales, los cuales llevaron a una mejora del 
presente proyecto. 
 
A los miembros del Jurado Revisor; los Drs Baltazar Becerril, Guillermo Gosset, José Luis 
Puente, David Romero y Miguel Castañeda, gracias por el preciado tiempo y el esfuerzo 
invertido en leer y corregir el presente manuscrito. 
 
A los Drs Fernando Rojo y Renata Moreno además de los miembros del laboratorio 216 
(Luis Yuste, Emma, Dione, Sofia y Ruggero) del Departamento de Biotecnología 
Microbioana del Centro Nacional de Biotecnología (CNB), en Madrid, España. Gracias por 
su apoyo, gentileza y disponibilidad con la que me trataron durante la estancia, a pesar de 
estar poco tiempo con ustedes me hicieron sentir parte de su grupo. 
 
A las técnicas académicas del laboratorio Espín-Merino: Biol. Soledad Moreno, M. C. 
Josefina Guzmán y M. B. Maria Tabche. Gracias por el apoyo técnico brindado durante el 
desarrollo del presente proyecto, por tener siempre esa gran disponibilidad de enseñar, 
ayudar y permitir que el laboratorio esté en armonía, pero sobre todo gracias por su sincera 
e invaluable amistad. 
 
A Leonel gracias por tu apoyo, tu sinceridad y tu amistad, desde que llegaste al laboratorio 
has sido como mi hermano… al contrario de lo que te digo a veces… ¡te quiero mucho! 
 
A Claudia gracias por todos esos años que compartimos juntas, tanto en el laboratorio como 
en nuestra vida diaria, gracias por tu confiza, tu apoyo y tus consejos. 
 
A mi “familia académica”, mis amigos y compañeros del laboratorio; Julieta, Leidy, 
Marcela, Chantal, Leonel, Claudia, Libertad, Adán, Adriana, Luis Felipe, José Luis 
Rodríquez, José Luis Gama. Incluidos los que ya no están en el laboratorio pero siguien con 
nuestro grupo: Armando y Mikey. Gracias por hacer más llevaderas y agradables las 
interminables horas de trabajo en el laboratorio, realmente me siento muy afortunada de 
haber encontrado amistades tan sinceras y entrañables, por no solo compartir su experiencia 
y conocimiento, sino también por compartir gratos momentos he inolvidables vivencias. 
 
A la Dra. Sunana Brom, gracias por el invaluable apoyo, consejos y consideraciones que ha 
tenido con Luis Alfredo y conmigo. 
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DEDICATORIAS 
 
A Cristian, mi querido hermanito, gracias por esas maravillosas lecciones de fortaleza, 
tesón y amor por la vida, gracias por enseñarme que la verdadera felicidad se encuentra en 
los pequeños detalles que nos ofrece el día a día. Sabes que eres y serás mi mayor ejemplo 
de vida. 
 
A mis padres Oscar y Elva gracias porque siempre han estado incondicionalmente conmigo 
en cada uno de los pasos que he dado, por sus enormes sacrificios y sus sabios consejos, no 
me alcanzarían las palabras ni la vida para expresarles el inmenso amor, respeto y 
admiración que siento por ustedes. 
 
A mis hermanos Karina y Oscar, gracias por su cariño y apoyo, porque a pesar del paso de 
los años y las distancias que nos separan es sumamente reconfortante saber que siempre 
están ahí para darme aliento. 
 
 
A Luis Alfredo, este logro también es tuyo, gracias por estar ahí siempre, por tu amor, 
comprensión y apoyo, por permitirme compartir alegrías y tristezas, logros y fracasos, 
gracias por hacerme sentir segura y querida. 
 
 
ÍNDICE 
RESUMEN 7	
ABSTRACT 9	
1. INTRODUCCIÓN 11	
1.1 Generalidades de Azotobacter vinelandii 11	
1.2 Síntesis de Alginato, Poli-ß-hidroxibutirato (PHB) y Alquilresolcinoles (ARs) en A. 
vinelandii 12	
1.2.1 Síntesis de Alginato 12	
1.2.2 Síntesis de poli-β-hidroxibutirato (PHB) 13	
1.2.3 Síntesis de Alquilresolcinoles (ARs) 14	
1.3 Regulación de la expresión genes involucrados en la síntesis de polímeros 15	
1.4 Represión catabólica por carbono (CCR) 17	
1.4.1 Represión catabólica en Escherichia coli y Bacillus subtilis 18	
1.4.2 Represión catabólica en Pseudomonas 20	
1.5 El sistema de regulación global Crc-Hfq/CrcZ-CrcY 21	
1.6 El sistema de dos componentes CbrA/CbrB 24	
2. ANTECEDENTES 25	
2.1 Crecimiento diáuxico en A. vinelandii. � 26	
2.2. La mutación cbrA:: Tn5 aumenta la síntesis de alginato A. vinelandii 27	
2.3 La mutante cbrA es incapaz de consumir glucosa durante el crecimiento diáuxico en un 
medio suplementado con glucosa y acetato 28	
2.4 Genes relacionados con el transporte y metabolismo de glucosa que poseen posibles sitios 
CA 28	
3. HIPÓTESIS 30	
4. OBJETIVOS 31	
4.1 Objetivo General 31	
4.2 Objetivos particulares 31	
5. MATERIAL Y MÉTODOS 32	
 2 
5.1 Cepas bacterianas, plásmidos y oligonucleótidos usados en este estudio 32	
5.2 Condiciones de cultivo. 36	
5.3 Preinóculos para cinéticas de crecimiento 37	
5.4 Preparación de células competentes de A. vinelandii 38	
5.5 Transformación de A. vinelandii 38	
5.6 Preparación de células competentes de P. putida 38	
5.7 Electroporación de P. putida 39	
5.8 Manipulación a ácidos nucleicos 39	
5.9 Cuantificación de los niveles de RpoS mediante Western blot 39	
5.10 Construcción de plásmidos usados en este estudio 40	
5.10.1 Construcción del plásmido pEQ424P. 40	
5.11 Construcción de las mutantes de A. vinelandii 41	
5.11.1 Mutante AEalgD (algD::Km). 41	
5.11.2Constricción de la mutante AErpoS. 41	
5.11.3 Construcción de las cepas que portan las fusiones transcripcionales con el reportero gusA. 41	
5.11.4 Mutantes AE-Ygus y CbrA-Ygus. 42	
5.12 Construcción de la mutante de E. coli WHIPC. 42	
5.13 Síntesis de CrcZ y marcaje radiactivo de los RNAs. 43	
5.14 Ensayos EMSA con RNA y las proteínas Crc y Hfq. 44	
5.15 Ensayos de qRT-PCR 44	
5.16 Métodos analíticos 45	
5.16.1 Cuantificación de proteína 45	
5.16.2 Cuantificación específica de alginato por el método del carbazol. 45	
5.16.3 Cuantificación de la actividad de β-Glucuronidasa 46	
5.16.4 La actividad de ß-Galactosidasa 47	
5.16.5 Cuantificación de acetato y glucosa 48	
5.16.6 Cuantificación de ARs 48	
5.16.7 Cuantificación de PHB 49	
5.17 Análisis estadísticos. 49	
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 50	
6.1 Estudio del papel de los sistemas CbrA/CbrB y Crc-Hfq/CrcZ en el proceso de CCR, en 
particular sobre la asimilación y metabolismo de glucosa en A. vinelandii � 51	
6.1.1 Los sistemas CbrA/CbrB y Crc-Hfq de A. vinelandii operan de la misma manera que en 
especies de Pseudomonas � 51	
6.1.2 La HK CbrA es necesaria para el consumo de glucosa 58	
6.1.3 La sobre-expresión de Crc en trans disminuye el crecimiento en glucosa 59	
6.1.4 GluP es el transportador de glucosa en A. vinelandii 62	
6.1.5 La expresión de gluP se encuentra bajo el control de los sistemas CbrA/CbrB y Crc-Hfq 64	
6.1.6. Los mRNAs de gluP y eda-1 son blanco directo del sistema Crc-Hfq 66	
 3 
6.1.7. Las proteínas Crc y Hfq de P. putida reconoce al mRNA de gluP y eda-1 de A. vinelandii 68	
6.1.8 La proteína Crc de P. putida impide la traducción del mRNA de gluP 69	
6.2 DISCUSIÓN 71	
6.3 Efecto del sistema CbrA/CbrB sobre la síntesis de alginato en A. vinelandii 74	
6.3.1 Efecto de CbrA sobre la expresión de los genes de la biosíntesis de alginato 74	
6.3.2 El efecto del TCS CbrA/CbrB sobre la síntesis de alginato es a través de regular la expresión 
de RsmA 77	
6.3.3 La transcripción del gen rsmA se inicia a partir de un promotor RpoS. 79	
6.3.4 El TCS CbrA/CbrB regula positivamente la expresión de RpoS 80	
6.3.5 Las mutantes cbrA y cbrB son incapaces de acumular PHB 82	
6.3.6 El TCS CbrA/CbrB tiene un efecto negativo en la producción de Alquilresolcinoles (ARs) 84	
6.4 DISCUSIÓN 85	
6.5 Modelo propuesto de la regulación del TCS CbrA/CbrB sobre la represión catabólica por 
carbono y la síntesis de alginato en A. vinelandii 90	
7. CONCLUSIONES 91	
8. PERSPECTIVAS 92	
9. REFERENCIAS 93	
10. ANEXO, ARTÍCULOS 104	
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 4 
ÍNDICE DE FIGURAS 
Figura 1. Estructura de A. vinelandii en fase vegetativa y enquistamiento. ....................... 12	
Figura 2 Rutas de la Biosíntesis de alginato y PHB. ........................................................... 15	
Figura 3. Modelo de regulación de la expresión de los genes involucrados en la biosíntesis 
de los polímeros. ................................................................................................................... 16	
Figura 4. Modelo esquemático del transporte de glucosa (Glc) y represión catabólica en E. 
coli y B. subtilis .................................................................................................................... 19	
Figura 5. Modelo de represión catabólica en Pseudomonas spp.. ....................................... 24	
Figura 6. Crecimiento de A. vinelandii en cultivo en lote en una mezcla de acetato y 
glucosa. ................................................................................................................................. 26	
Figura 7. Crecimiento y consumo de glucosa en la mutante cbrA. ..................................... 28	
Figura 8. Contexto genómico, secuencia de nucleótidos y predicción de la estructura 
tridimensional del sRNA CrcZ de A. vinelandii. .................................................................. 52	
Figura 9. Contexto genómico, secuencia de nucleótidos y predicción de la estructura 
tridimensional del sRNA CrcY de A. vinelandii. ................................................................. 54	
Figura 10. Efecto de la HK CbrA en la expresión de los genes crcZ y crcY. .................... 55	
Figura 11. Las proteínas Crc-Hfq forman un complejo ribonucleoprotéico con CrcZ. ...... 57	
Figura 12. La HK CbrA es necesaria para la asimilación de glucosa. ................................ 59	
Figura 13. Efecto de la sobreexpresión de Crc en diferentes fuentes de carbono. .............. 61	
Figura 14. El gen gluP de A. vinelandii codifica un transportador de glucosa. .................. 63	
Figura 15. La expresión de gluP está bajo el control de los sistemas CbrA/CbrB y Crc-Hfq.
 .............................................................................................................................................. 65	
 5 
Figura 16. Las proteínas Crc y Hfq son capaces de formar un complejo ribonucleoproteíco 
con el sitio CA presente en el líder del mRNA de gluP y eda-1. ......................................... 67	
Figura 17. Las proteínas Hfq y Crc de P. putida son capaces de formar un complejo 
ribonucleoprotéico con los sitios CA presentes en los ribonucleótidos de gluP y eda-1. ... 69	
Figura 18. Efecto de la proteína Crc en la expresión de la fusión traduccional gluP´-lacZ en 
P. putida. ............................................................................................................................... 70	
Figura 19. Producción de alginato y cinética de crecimiento de diferentes cepas de A. 
vinelandii. ............................................................................................................................. 75	
Figura 20. Efecto de la HK CbrA en la expresión de los genes de la vía de la biosíntesis de 
alginato. ............................................................................................................................... 76	
Figura 21. Análisis de la expresión de rsmA en diferentes cepas. ....................................... 78	
Figura 22. La transcripción de rsmA es a partir de un promotor dependiente de RpoS. ..... 80	
Figura 23. Influencia del TCS CbrA/CbrB en la expresión de RpoS. ................................. 81	
Figura 24. Efecto del TCS CbrA/CbrB en la acumulación de PHB. ................................... 83	
Figura 25. Efecto del TCS CbrA/CbrB en la síntesis de Alquilresolcinoles. ...................... 85	
Figura 26. Modelo propuesto de regulación del TCS CbrA/CbrB sobre la síntesis de 
alginato y asimilación de glucosa en A. vinelandii. ............................................................. 90	
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 6 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ÍNDICE DE TABLAS 
 
 
Tabla 1. Genes de A. vinelandii involucrados en el transporte y catabolismo de glucosa que 
contienen posibles sitios de unión a Crc-Hfq. ...................................................................... 29	
Tabla 2. Cepas y plásmidos utilizadas en este trabajo ......................................................... 32	
Tabla 3. Oligonucleótidos usados en este trabajo ............................................................... 35	
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 7 
RESUMEN 
 
Azotobacter vinelandii es una bacteria de vida libre que pertenece a la familia 
Pseudomonadaceae. Es considerada un modelo de estudio interesante debido a que puede 
producir polímeros con aplicaciones biotecnológicas como el polisacárido alginato y el 
poliéster intracelular PHB. Al igual que en Pseudomonas spp., A. vinelandii prefiere el uso 
de ácidos orgánicos sobre los carbohidratos como la glucosa. Contrario a lo que sucede en 
E. coli, el proceso de Represión Catabólica por Carbono (CCR) en especies de 
Pseudomonas es controlado por el sistema de regulación post-transcripcional CbrA/CbrB-
Crc/Hfq. Las proteínas Crc-Hfq impiden la traducción de sus genes blanco, al unirse a 
secuencias ricas en adeninas(llamados motivos CA, AANAANAA) cerca del sitio de unión 
a ribosoma. Estas proteínas son antagonizadas por los pequeños RNAs CrcZ y CrcY, los 
cuales son activados por el sistema de dos componentes CbrA/CbrB. Así pues CbrA/CbrB 
encabeza la cascada de señalización para el control del la RCC, entre otros procesos 
celulares. En este trabajo se caracterizó la función del sistema CbrA/CbrB-Crc/Hfq en A. 
vinelandii. Nuestros resultados indican que la función del sistema CbrA/CbrB-Crc/Hfq está 
conservada entre Pseudomonas y A. vinelandii, pues la cinasa histidínica CbrA fue 
necesaria para la expresión de los sRNAs CrcZ/Y y para el consumo de glucosa, una fuente 
de carbono no preferida en A. vinelandii. De manera interesante, comprobamos, mediante 
ensayos tipo EMSA, que el principal blanco directo de regulación por las proteínas Hfq-Crc 
era el mRNA del gen gluP (Avin04150), el cual codifica un transportador de glucosa tipo 
simporter de la superfamilia de facilitadores mayores que no había sido reportado 
anteriormente en la familia Pseudomonadaceae. A pesar de que el gen gluP no esta 
presente en especies de Pseudomonas, comprobamos que las proteínas Hfq-Crc de 
Pseudomonas putida fueron capaces de reconocer la región líder del mRNA de gluP y que 
in vivo estas proteínas inhibieron la expresión de una fusión traduccional gluP-´lacZ, 
estableciendo que las proteínas Crc-Hfq de A. vinelandii y P. putida eran funcionalmente 
intercambiables. Originalmente, el TCS CbrA/CbrB fue identificado debido al efecto 
negativo que ejercía sobre la síntesis del polisacárido alginato. Así pues, en una segunda 
etapa de este trabajo nos enfocamos a establecer el mecanismo de regulación de dicho 
efecto. Un estudio de los patrones de expresión del gen clave de esta ruta biosintética, el 
 8 
gen algD, reveló que su traducción estaba desreprimida en la mutante cbrA. Mediante 
ensayos de qRT-PCR y Western blot logramos establecer que CbrA/CbrB regula la 
expresión de la proteína RsmA, cuyos homólogos en otras bacterias controlan el 
metabolismo de carbono. El efecto del sistema de dos componentes CbrA/CbrB sobre el 
gen rsmA fue indirecto pues el factor sigma RpoS era intermediario en este proceso. Todos 
estos resultados indicaron la existencia de la cascada de regulación CbrA/CbrB-RpoS-
RsmA para el control de la expresión de algD en la síntesis de alginato. En conjunto, la 
caracterización de la función del TCS CbrA/CbrB en A. vinelandii nos permitió 
identificarlo como un elemento clave en el control del metabolismo de carbono al controlar 
el fenómeno de CCR, por un lado, y la acumulación de RsmA para el control de las 
cantidades del polisacárido alginato. El control que CbrA/CbrB ejerce sobre la CCR y la 
expresión de genes (rsmA, rpoS) que regulan una gran variedad de vías, indica un papel 
central en la regulación del metabolismo en A. vinelandii 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 9 
ABSTRACT 
 
Azotobacter vinelandii is a free-living bacterium belonging to Pseudomonadaceae family. 
It has been considered a good source for the production of polymers of � biotechnological 
interest such as the exopolyssacharide alginate and the polyester PHB. As in Pseudomonas 
spp. A. vinelandii prefers the use of organic acids to carbohydrates such as glucose. Unlike 
E. coli, Carbon Catabolite Repression (CCR) in Pseudomonas species is controlled by the 
CbrA/CbrB-Crc/Hfq postranscriptional regulatory system. The Crc and Hfq proteins work 
together to inhibit the translation of some mRNAs that present an A-rich sequence (named 
CA motif) located close to the ribosome-binding site. However, the activity of the Crc/Hfq 
proteins is antagonized by the CrcZ and CrcY small RNAs (sRNA), which are activated by 
the two component system CbrA/CbrB. Therefore, CbrA/CbrB heads the CCR signaling 
pathway, and other cellular processes. In the present work we characterized the function of 
the CbrA/CbrB-Crc/Hfq system in A. vinelandii. Our results show that the function of the 
CbrA/CbrB-Crc/Hfq system is conserved between Pseudomonas and A. vinelandii. We 
found that the histidin kinase CbrA was necessary to activate the expression of CrcZ/CrcY 
sRNAs and glucose consumption, a non-preferred carbon source in this bacterium. 
Interestingly, EMSA assays demonstrated that the Crc-Hfq proteins, were capable of 
forming a complex with the leader region of the gluP mRNA (Avin04150), which encodes 
an H+-coupled glucose-galactose symporter� uncommon in the Pseudomonadaceae family. 
We found that expression of gluP was under catabolite repression control through the 
CbrA/CbrB and Crc/Hfq regulatory systems.� Crc and Hfq proteins, from either A. 
vinelandii or P. putida could form a stable complex with the CA motif present in the leader 
region of gluP mRNA. Moreover, in P. putida, the gluP CA motif was functional and 
promoted translational inhibition of a gluP-´lacZ translational fusion, implying that the 
Crc-Hfq proteins from A. vinelandii and P. putida are functionally interchangeable. The 
two-component system CbrA/CbrB was originally identified in A. vinelandii as a negative 
regulator of alginate synthesis. In a second stage of this work, we investigated the 
molecular basis of this this effect. We found that the expression of the algD gene, encoding 
a key enzyme in this biosynthetic pathway, was de-repressed, mainly at the translational 
level. Western blot and qRT-PCR assays showed that the two-component system 
 10 
CbrA/CbrB was necessary for full expression of the RsmA protein, its homologues in other 
bacteria control carbon metabolism. The effect of CbrA/CbrB on RsmA expression was 
indirect and the sigma factor RpoS was one of the intermediaries in this signalling cascade. 
Taken together these data revealed the existence of the regulatory �cascade CbrA/CbrB-
RpoS-RsmA for the control of algD expression in alginate production. In conclusion, our 
results clearly highlight the importance of the two-component system CbrA/CbrB in the A. 
vinelandii carbon metabolism, since it is a key element in the process of CCR and in the 
expression of the secondary metabolism regulatory proteins RsmA and RpoS. 
 
 Introcucción 
 
 11 
1. INTRODUCCIÓN 
1.1 Generalidades de Azotobacter vinelandii 
Azotobacter vinelandii es una gamma proteobacteria Gram negativa, de vida libre 
perteneciente a la familia Pseudomonadaceae. Son células pleomórficas y poliploides, 
dependiendo del medio y las condiciones de cultivo pueden alcanzar hasta 80 copias de su 
cromosoma. Su tamaño es de 2 µm o más de diámetro y 4 µm de longitud, son mótiles 
gracias a la presencia de flagelos perítricos. Es quimiorganotrófica, es decir, es capaz de 
utilizar ácidos orgánicos, carbohidratos, sales y alcoholes como fuentes de carbono 
(Kennedy et al., 2005). Es aerobia estricta, pero tiene la capacidad de fijar nitrógeno en 
aerobiosis debido a que posee tres complejos diferentes de nitrogenasa. Logra proteger este 
proceso tan sensible al oxígeno mediante un mecanismo conocido como “protección 
respiratoria”, el cual consiste en ajustar la velocidad de consumo de oxígeno, logrando 
mantener niveles bajos de éste en el citoplasma (Kennedy et al., 1986; Kennedy et al., 
2005). 
El genoma de la cepa DJ de A. vinelandii ya se encuentra secuenciado, su tamaño es de 5 
365 318 pares de bases (pb), y posee un contenido de GC del 65.7% (Setubal et al., 2009). 
Durante fase estacionaria tardía o bajo condiciones adversas, A. vinelandii, es capaz de 
sufrir un proceso de diferenciación, en el que forma quistes resistentes a la desecación, los 
cuales son células metabólicamente inactivas, constituidas por una estructura de forma 
ovalada, conocida como cuerpo central, que contiene numerosos gránulos de poli-ß-
hidroxibutirato (PHB). El cuerpo central está rodeado por una cápsula, la cual está 
compuesta por una capa externa laminada llama exinay una capa interna más compacta 
llamada intina. Ambas capas están compuestas del polisacárido extracelular alginato (Fig. 
1) (Sadoff, 1975). 
 
 Introcucción 
 
 12 
 
Figura 1. Estructura de A. vinelandii en fase vegetativa y enquistamiento. (a) célula de A. vinelandii en 
fase vegetativa. (b) Quiste de A. vinelandii, Cb, cuerpo central, In, intina, Ex, exina, phb, poli-β-
hidroxibutirato (Segura et al., 2014). 
 
 
Una de las características que hace de A. vinelandii un modelo interesante de estudio es su 
capacidad de producir polímeros de uso industrial como el polímero extracelular alginato, 
el poliéster intracelular PHB, además de unos lípidos fenólicos llamados Alquilresolcinoles 
(ARs) y Alquilpironas (APs) (Galindo et al., 2007). 
 
 
1.2 Síntesis de Alginato, Poli-ß-hidroxibutirato (PHB) y 
Alquilresolcinoles (ARs) en A. vinelandii 
1.2.1 Síntesis de Alginato 
Los alginatos son una importante familia de biopolímeros la cual posee un gran interés 
científico y biotecnológico. El alginato es un polisacárido lineal compuesto por residuos de 
ácido β-D-Manurónico (M) y su epímero el ácido α-L-gulurónico (G), unidos por enlaces 
β-1,4. El orden de estos monómeros resulta en alginatos con diferentes propiedades físicas 
y químicas (Galindo et al., 2007; Hay et al., 2013). Para A. vinelandii el alginato es esencial 
para la correcta biogénesis del quiste maduro; durante la fase vegetativa se ha propuesto 
n-butanol or b-hydroxybutyrate (BHB), the encystment is
synchronously induced (Lin and Sadoff, 1968; Sadoff,
1975).
Studies on the encystment process of Azotobacter under
transmission electron microscopy showed the morpholo-
gical changes occurring during this process. On encyst-
ment, a process that takes 3–5 days, the usually rod-shaped
vegetative cells terminate cell division and lose their flagella
(Sadoff, 1975; León and Espı́n, 2008). These large vegeta-
tive cells then enter a compaction stage 24–36 h after
initiation of encystment, starting to round up to a near
spherical shape. When the encystment is induced by
n-butanol or BHB, large inclusions of PHB are formed in
the cytoplasm at this stage. At 36 h, the bark-like coat
named exine starts forming around the periphery of the
central body and is clearly visible in the majority of cells at
48 h. Between the exine and the central body, the intine
layer is visible like an empty space at 36 h but at 48 h
becomes granular and starts to increase in size. During the
periodbetween 72and120 h, the cysts are in thematuration
stage, where the central body is reduced in size and the
intine increases, showing multiple layers. These mature
cysts can remain dormant for years ondry soil (Vela, 1974),
but under suitable conditions these dormant cells germi-
nate. In this process, the intine becomes less prominent, the
exine ruptures and a rod-shaped cell is liberated to rein-
itiate the vegetative phase of its life cycle. Germination
takes 6–12 h.
Besides the morphological differentiation described,
during encystment an ordered sequence of biochemical
changes also occur. On initiation of encystment, glucose-6-
phosphate dehydrogenase activity decreases immediately
to very low levels. It is followedbyan increase in the specific
enzymatic activities for BHB metabolism (BHB dehy-
drogenase), gluconeogenesis (fructose 1,6 diphosphate
aldolase and fructose 1,6 diphosphatase) and the glyox-
ylate shunt (isocitrate lyase andmalate synthase) (Hitchins
and Sadoff, 1973).Deoxyribonucleic acid (DNA) synthesis
stops just before the last cell division (within 4–6 h), but the
synthesis of ribonucleic acid (RNA) continues for 12 hafter
induction of encystment (Sadoff et al., 1971). Significant
changes in the respiratory activity are observed. The oxy-
gen uptake rate decreases 16-fold after 3 h and remains low
for the rest of the process (Stockall and Edwards, 1985).
This reduction is accompanied by a change in the amount
and nature of membrane cytochromes and by a 10-fold
reduction in the reduced nicotinamide adenine dinucleo-
tide dehydrogenase activity. The nitrogen fixation activity
is completely inhibited after 3 h due to a lack of respiratory
protection and the irreversible proteolysis of the nitro-
genase (Kossler and Kleiner, 1986). However, protein
synthesis takes place during encystment due to extensive
protein turnover. Pulse-chase experiments using (U-14C)
leucine demonstrated a protein turnover of 50%during the
first 30 h of encystment, indicating that encystment-specific
proteins are synthesised at the expense of nonessential
proteins,which are degraded toprovide aminoacids for the
synthesis of new proteins (Ruppen et al., 1983). Interest-
ingly, after 2 h of encystment, protein synthesis increases
and reaches a peak at approximately 12–18 h postinduc-
tion. Then, it gradually decreases over a 4-day period
(Su et al., 1987).
Some Properties of the Cysts
Cysts ofAzotobacter are not onlymorphologically but also
physiologically different from the vegetative cell. A soil
organismmust be able to dealwith changes in temperature,
nutrient levels, moisture content, light exposure and other
forms of stress. The developmental alternation between
two stages, each of which is adequate for survival under a
different circumstance, allows the organism to survive in
such a changing environment. Azotobacter cysts are
metabolically dormant cells that are considerably more
resistant to deleterious conditions than vegetative cells.
Desiccation resistance is one of the main characteristics of
the cysts, and it is used to distinguish between vegetative
cells and cysts. Dry cultures of A. vinelandii containing
cysts can survive formore than 10 years (Vela, 1974). Later
(a) (b) (c)
f
Cb Ex
In
phb
Figure 1 Electron micrographs of an A. vinelandii vegetative cell (a); a vegetative cell negatively stained for visualisation of flagella (b); a cyst (c). Ex, exine;
In, intine; Cb, central body; phb, polyhydroxybutyrate granules; f, flagella.
eLS & 2014, John Wiley & Sons, Ltd. www.els.net2
Azotobacter Cysts
n-butanol or b-hydroxybutyrate (BHB), the encystment is
synchronously induced (Lin and Sadoff, 1968; Sadoff,
1975).
Studies on the encystment process of Azotobacter under
transmission electron microscopy showed the morpholo-
gical changes occurring during this process. On encyst-
ment, a process that takes 3–5 days, the usually rod-shaped
vegetative cells terminate cell division and lose their flagella
(Sadoff, 1975; León and Espı́n, 2008). These large vegeta-
tive cells then enter a compaction stage 24–36 h after
initiation of encystment, starting to round up to a near
spherical shape. When the encystment is induced by
n-butanol or BHB, large inclusions of PHB are formed in
the cytoplasm at this stage. At 36 h, the bark-like coat
named exine starts forming around the periphery of the
central body and is clearly visible in the majority of cells at
48 h. Between the exine and the central body, the intine
layer is visible like an empty space at 36 h but at 48 h
becomes granular and starts to increase in size. During the
periodbetween 72and120 h, the cysts are in thematuration
stage, where the central body is reduced in size and the
intine increases, showing multiple layers. These mature
cysts can remain dormant for years ondry soil (Vela, 1974),
but under suitable conditions these dormant cells germi-
nate. In this process, the intine becomes less prominent, the
exine ruptures and a rod-shaped cell is liberated to rein-
itiate the vegetative phase of its life cycle. Germination
takes 6–12 h.
Besides the morphological differentiation described,
during encystment an ordered sequence of biochemical
changes also occur. On initiation of encystment, glucose-6-
phosphate dehydrogenase activity decreases immediately
to very low levels. It is followedbyan increase in the specific
enzymatic activities for BHB metabolism (BHB dehy-
drogenase), gluconeogenesis (fructose 1,6 diphosphate
aldolase and fructose 1,6 diphosphatase) and the glyox-ylate shunt (isocitrate lyase andmalate synthase) (Hitchins
and Sadoff, 1973).Deoxyribonucleic acid (DNA) synthesis
stops just before the last cell division (within 4–6 h), but the
synthesis of ribonucleic acid (RNA) continues for 12 hafter
induction of encystment (Sadoff et al., 1971). Significant
changes in the respiratory activity are observed. The oxy-
gen uptake rate decreases 16-fold after 3 h and remains low
for the rest of the process (Stockall and Edwards, 1985).
This reduction is accompanied by a change in the amount
and nature of membrane cytochromes and by a 10-fold
reduction in the reduced nicotinamide adenine dinucleo-
tide dehydrogenase activity. The nitrogen fixation activity
is completely inhibited after 3 h due to a lack of respiratory
protection and the irreversible proteolysis of the nitro-
genase (Kossler and Kleiner, 1986). However, protein
synthesis takes place during encystment due to extensive
protein turnover. Pulse-chase experiments using (U-14C)
leucine demonstrated a protein turnover of 50%during the
first 30 h of encystment, indicating that encystment-specific
proteins are synthesised at the expense of nonessential
proteins,which are degraded toprovide aminoacids for the
synthesis of new proteins (Ruppen et al., 1983). Interest-
ingly, after 2 h of encystment, protein synthesis increases
and reaches a peak at approximately 12–18 h postinduc-
tion. Then, it gradually decreases over a 4-day period
(Su et al., 1987).
Some Properties of the Cysts
Cysts ofAzotobacter are not onlymorphologically but also
physiologically different from the vegetative cell. A soil
organismmust be able to dealwith changes in temperature,
nutrient levels, moisture content, light exposure and other
forms of stress. The developmental alternation between
two stages, each of which is adequate for survival under a
different circumstance, allows the organism to survive in
such a changing environment. Azotobacter cysts are
metabolically dormant cells that are considerably more
resistant to deleterious conditions than vegetative cells.
Desiccation resistance is one of the main characteristics of
the cysts, and it is used to distinguish between vegetative
cells and cysts. Dry cultures of A. vinelandii containing
cysts can survive formore than 10 years (Vela, 1974). Later
(a) (b) (c)
f
Cb Ex
In
phb
Figure 1 Electron micrographs of an A. vinelandii vegetative cell (a); a vegetative cell negatively stained for visualisation of flagella (b); a cyst (c). Ex, exine;
In, intine; Cb, central body; phb, polyhydroxybutyrate granules; f, flagella.
eLS & 2014, John Wiley & Sons, Ltd. www.els.net2
Azotobacter Cysts
a b
 Introcucción 
 
 13 
que el alginato le sirve para formar películas de adherencia a superficies o que podría actuar 
como barrera contra la difusión de oxígeno o metales pesados (Lin & Sadoff, 1969). 
Azotobacter, junto con Pseudomonas son los dos géneros bacterianos en los que se ha 
demostrado la secreción de alginato (Hay et al., 2013). La ruta biosintética de este polímero 
es similar en ambas, y está descrita a detalle (Galindo et al., 2007). En estas bacterias los 
azúcares de 6 carbonos son degradados por la vía Entner-Doudoroff, cuyos productos 
finales son el Piruvato y el gliceraldehído-3P. El piruvato es posteriormente catabolizado a 
acetil-CoA, mientras que el gliceraldehído-3P es convertido en fructosa-6-fosfato (Conway, 
1992). 
En A. vinelandii la fructosa-6-fosfato en convertida mediante tres reacciones enzimáticas a 
GDP-Manosa la cual es oxidada, por la enzima GDP-manosa deshidrogenasa (GMD, 
codificada en el gen algD), a GDP-manurónico. Éste último es sustrato del complejo 
polimerasa Alg8-Alg44 para formar ácido polimanurónico, el cual está sujeto a 
modificaciones por la epimerasa (AlgG) y el complejo acetilasa (AlgI, AlgV, AlgF y 
AlgX). Finalmente, la exportación del polímero se lleva a cabo por la proteína de 
membrana interna AlgJ (Fig. 2) (Hay et al., 2010; Whitney et al., 2011). 
 
1.2.2 Síntesis de poli-β-hidroxibutirato (PHB) 
El poli-β-hidroxibutirato es un poliéster constituido por monómeros de β-hidroxibutirato, 
perteneciente a la familia de los poli-hidroxialcanoatos (PHAs), los cuales poseen un gran 
interés industrial debido a que presentan características muy similares a los plásticos 
derivados del petróleo (Chen, 2009; Lenz & Marchessault, 2005). El PHB es almacenado 
en forma de gránulos insolubles en el citoplasma, y se ha propuesto que es usado como 
fuente de carbono de reserva durante periodos de limitación de mutrimentos (Anderson & 
Dawes, 1990). 
La síntesis de PHB en A. vinelandii se produce principalmente durante la fase estacionaria 
del crecimiento. Inicia con la condensación de dos moléculas de acetil-CoA, por la enzima 
�-cetotiolasa (phbA), formando acetoacetil-CoA, el cual es reducido por la acetoacetil-
CoA reductasa (phbB), y finamente polimerizado por la PHB sintasa (phbC), (Segura et al., 
 Introcucción 
 
 14 
2003a)(Fig. 2). Los genes que codifican las enzimas para la síntesis de PHB, se encuentran 
organizados en el operón phbBAC, el cual se transcribe a partir de dos promotores; pB1 y 
pB2. Para la activación del pB1 es necesario el regulador PhbR, el cual se ha descrito como 
un activador transcripcional de la familia AraC/XylS, mientras que la transcripción del pB2 
es dependiente del factor sigma RpoS (Fig. 3) (Peralta-Gil et al., 2002). 
 
 
1.2.3 Síntesis de Alquilresolcinoles (ARs) 
Los ARs y las Alquilpironas (APs) son lípidos fenólicos producidos por A. vinelandii, los 
cuales son comunes en plantas pero su síntesis es rara en las bacterias (Bitkov et al., 1992; 
Reusch & Sadoff, 1979). En A. vinelandii se ha demostrado que reemplazan los 
fosfolípidos de la membrana de las células vegetativas cuando inicia el proceso de 
enquistamiento, constituyendo el 95% de los lípidos totales de la membrana del quiste 
(Reusch & Sadoff, 1983). Los ARs también se encuentran en la exina (Fig. 1) y poseen una 
función estructural, ya que las cepas incapaces de producir ARs presentan una exina 
desorganizada y se aglutinan entre ellas. A pesar de estos fenotipos, las cepas no 
productoras de ARs son resistentes a la desecación, lo cual indica que estos lípidos 
fenólicos no son esenciales para este proceso (Segura et al., 2009). Los principales ARs 
sintetizados son el 5-heneicosilresolcinol y 5-n-tricosilresolcinol (conocidos como AR1), 
las cuales son de 21 y 23 cadenas de carbono, respectivamente, además de sus derivados 
galactosidados (conocidos como AR2) (Reusch & Sadoff, 1983). 
Las enzimas que sintetizan estos compuestos están codificadas en el operón arsABCD. Las 
proteínas ArsB y ArsC son policétido sintasas de tipo III, las cuales sintetizan ARs y APs 
respectivamente, mientras que ArsA es una sintasa de ácidos grasos, responsable de la 
síntesis de ácidos grasos de 22 – 26 carbonos, los cuales junto con dos o tres moléculas de 
malonil-CoA, sirven como sustratos para ArsB y ArsC. Por otra parte, ArsD es una 4´-
fosfopantetenil transferasa, la cual catalizará la modificación post-traduccional de ArsA 
(Funa et al., 2006; Miyanaga et al., 2008). La expresión de estos genes se encuentra bajo el 
control del activador transcripcional ArpR (Romero et al., 2013). 
 Introcucción 
 
 15 
 
 
Figura 2 Rutas de la Biosíntesis de alginato y PHB. En verde y a la izquierda de la flecha de indican las 
enzimas que participan en ese paso de la ruta. En rojo y a la derecha de la flecha se indican los genes en los 
que se codifican dichas enzimas (Galindo et al., 2007). 
 
 
1.3 Regulación de la expresión genes involucrados en la síntesis de 
polímeros 
 
Se ha observado que diversos sistemas de regulación están involucrados en el control de la 
síntesis de estos polímeros (Fig. 3). Uno de estos reguladores es el factor sigma llamado 
AlgU o sigma E. La inactivación del gen algU afecta la síntesis de alginato, además de la 
formación dequistes. Se ha demostrado que este factor sigma es requerido para la 
expresión de los genes algD y algC (Campos et al., 1996; Moreno et al., 1998). 
Microbial Cell Factories 2007, 6:7 http://www.microbialcellfactories.com/content/6/1/7
Page 3 of 16
(page number not for citation purposes)
protein, a mannuronate polymerase (MP) [10]. The
resulting polymannuronic molecule is then modified by
an acetylase complex comprising AlgI, AlgV, AlgF proteins
(AlgI, AlgJ and AlgF for P. aeruginosa), and some of the
non-acetylated mannuronate residues are epimerized to
guluronate by a mannuronate epimerase (ME or AlgG)
and then exported through the outer membrane via the
pore-forming protein AlgE (AlgJ in A. vinelandii) (Figure
1).
In the case of A. vinelandii but not in that of the Pseu-
domonas species, the exported polymer is converted to the
final alginate by a family of seven homologous secreted
mannuronan C-5 extracellular epimerases (AlgE1-7)
[11](Figure 1). These epimerases are essential for the for-
mation of mature cysts, as a mutation which inactivates
the Type I secretion system responsible for the export of
the AlgE1-7 epimerases produced cysts lacking the intine
and exine coats and were therefore unable to survive des-
iccation. This suggests that the guluronic acid residues in
alginate are important for the formation of the alginate
coat surrounding the cysts [12]. It is thought that the AlgG
AlgK, AlgX and AlgL proteins form a scaffold which guides
the polymer through the periplasm, to then be secreted
across the outer membrane [13,14]. AlgL is also an algi-
nate lyase enzyme [15]. The idea that AlgL played a role in
Pathways for alginate and poly-β-hydroxybutyrate (PHB) biosynthesis and their metabolic relations in Azotobacter vinelandiiFigure 1
Pathways for alginate and poly-β-hydroxybutyrate (PHB) biosynthesis and their metabolic relations in Azotobacter vinelandii. 
Dashed arrows indicate multi-enzyme pathways; the enzyme names and their abreviations are indicated in green and the corre-
sponding genes are in red. PMI, phosphomannose isomerase; GMP, guanosine diphosphomannose pyrophosphorylase; PMM, 
phosphomannomutase; GMD, GDP-mannose dehydrogenase; MP, mannuronate polymerase; ME, mannuronate epimerase 
AlgG; MEs, mannuronate epimerases AlgE1 to 7.
 Introcucción 
 
 16 
Otro sistema de regulación que controla la producción de los polímeros es el sistema de 
dos componentes (TCS) GacS/GacA (Fig. 3). En las gama proteobacterias el sistema 
Gac/Rsm regula metabolismo primario y secundario (Romeo et al., 2013). Mutaciones en la 
Histidín Cinasa (HK) gacS o en el Regulador de Respuesta (RR) gacA, impiden la síntesis 
de alginato (Castañeda et al., 2000; Castañeda et al., 2001). Este sistema regula la 
producción de alginato mediante un control post-transcripcional del gen algD a través del 
sistema Rsm. Es decir, GacA activa la transcripción de varios RNAs pequeños (sRNAs) no 
codificantes de la familia RsmZ-Y (CsrB-C), los cuales antagonizan la actividad del 
represor traduccional RsmA (homóloga de la proteína CsrA de Escherichia coli). RsmA es 
capaz de unirse al RNA mensajero (mRNA) de algD impidiendo su traducción (Manzo et 
al., 2011). De igual manera El sistema Gac/Rsm controla síntesis de PHB, ya que RsmA 
también es capaz de unirse al mRNA de phbR, el cual codifica el activador transcripcional 
del operón biosintético de PHB (Hernández-Eligio et al., 2012) (Fig. 3). 
 
 
Figura 3. Modelo de regulación de la expresión de los genes involucrados en la biosíntesis de los 
polímeros. Líneas verdes: regulación positiva; líneas rojas: regulación negativa; los promotores están 
representados por rectángulos del mismo color del gen al que corresponden (Segura et al., 2014). 
 
 Introcucción 
 
 17 
 
Otra de las vías por la cual el sistema GacS/GacA regula la síntesis de alginato, PHB y ARs 
es a través de controlar la expresión del factor sigma alternativo de fase estacionaria RpoS, 
(Castañeda et al., 2001). RpoS es requerido para la expresión de genes de estas rutas 
biosintéticas (Fig. 3). RpoS reconoce un promotor del gen algD para inicio de su 
transcripción; por otro lado RpoS reconoce el promotor de arpR, el activador 
transcripcional de la síntesis de AR (Romero et al., 2013). Por otro lado, se ha demostrado 
que la síntesis de PHB también es regulada por RpoS, debido a que la transcripción del 
operón biosintético de PHB es a través de dos promotores, una de los cuales es dependiente 
de el factor sigma RpoS (Hernández-Eligio et al., 2011). 
 
 
1.4 Represión catabólica por carbono (CCR) 
Las bacterias de vida libre frecuentemente poseen un metabolismo versátil que les permite 
usar diferentes compuestos como fuente de carbono y energía. Esto facilita su 
supervivencia en diferentes hábitats y su adaptación a diversos cambios medioambientales. 
Por esta razón el metabolismo de las bacterias tiene que estar sometido a un control estricto 
(Rojo, 2010). La represión catabólica por carbono (CCR) es un mecanismo de regulación 
que permite la asimilación selectiva de compuestos preferidos entre una mezcla de diversas 
fuentes de carbono potenciales. Por lo tanto, es un proceso muy complejo que requiere, en 
muchos casos, la represión de un gran número de genes. Esta coordinación la proporcionan 
redes de regulación global, que a través de regladores, controlan la expresión de múltiples 
rutas metabólicas al mismo tiempo (Görke & Stülke, 2008; Rojo, 2010). 
Este proceso está muy extendido entre las bacterias, especialmente las de vida libre y con 
metabolismo versátil. Sin embargo, sus mecanismos moleculares parecen ser muy 
diferentes entre especies. En el género Pseudomonas, a diferencia de Escherichia coli y de 
Bacillus subtilis, las fuentes de carbono preferidas son los ácidos orgánicos y los 
aminoácidos sobre los carbohidratos como la glucosa (Rojo, 2010). 
 Introcucción 
 
 18 
1.4.1 Represión catabólica en Escherichia coli y Bacillus subtilis 
La represión catabólica ha sido estudiada principalmente en bacterias modelo como E. coli 
y B. subtilis, en las cuales la fuente de carbono preferida es la glucosa; de forma que, 
cuando en el medio existen otras fuentes de carbono además de la glucosa, ésta será la que 
se metabolice en primer lugar (Muñoz-Elias & McKinney, 2006). Éste azúcar es capaz de 
atravesar la membrana citoplasmática, a través de una variedad de sistemas de transporte, 
entre ellos, el principal es el sistema de Fosfotransferencia (PTS), el cual es capaz de 
acoplar la asimilación de glucosa y su fosforilación en un solo paso, dicha fosforilación 
también puede llevarse a cabo por la glucocinasa (Glk) (Görke & Stülke, 2008). El sistema 
PTS está compuesto de varias enzimas que transfieren el grupo fosfato desde el 
fosfoenolpiruvato (PEP) a la glucosa (Fig. 4A). Cuando la glucosa está presente en alta 
concentración la enzima EIIAGlc se encuentra en un estado no fosforilado ya que el grupo 
fosfato es rápidamente transferido a la glucosa para obtener la glucosa-6-fosfato. En este 
estado metabólico, la proporción entre el PEP y el piruvato es baja y la enzima EIIAGlc no 
fosforilada es capaz de inhibir a transportadores de otras fuentes de carbono no preferidas 
(como lactosa, maltosa o melibiosa) impidiendo el transporte de dichos compuestos 
(Bettenbrock et al., 2007; Park et al., 2006). Por otra parte, cuando la glucosa se encuentra 
en baja concentración, la proporción de PEP/piruvato hace que se incremente la forma 
fosforilada de la enzima EIIAGlc, lo cual libera la represión sobre los transportadores de las 
fuentes de carbono no preferidas, permitiendo de esta manera que dichos transportadores se 
expresen y por lo tanto la bacteria sea capaz de asimilar dichas fuentes de carbono. Este 
tipo de CCR es llamada exclusión del inductor (Bettenbrock et al., 2007; Görke & Stülke, 
2008; Hogema et al., 1998). 
La activación completa de las rutas parael metabolismo de las fuentes de carbono no 
preferidas también requiere de una activación transcripcional de dichas rutas metabólicas, 
la cual está dada por el complejo cAMP-CRP. Cuando la glucosa se ha consumido por 
completo, la forma fosforilada de la enzima EIIAGlc, es capaz de interaccionar con la 
adenilato ciclasa, estimulando su actividad para generar cAMP a partir de la hidrólisis de 
ATP (Bettenbrock et al., 2007; Park et al., 2006). El regulador CRP al asociarse con cAMP 
forma un dímero el cual es capaz de activar la transcripción de sus genes blanco (Fig. 4A) 
(Görke & Stülke, 2008). 
 Introcucción 
 
 19 
 
Figura 4. Modelo esquemático del transporte de glucosa (Glc) y represión catabólica en E. coli y B. 
subtilis. MC: membrana celular, PEP: fosfoenolpiruvato, Pir: piruvato. a. En E. coli, el responsable último de 
la represión catabólica es el estado se fosforilación de la proteína EIIAGlc, un componente de sistema PTSGlc. 
Cuando no está fosforilado (porque hay glucosa disponible) EIIAGlc interacciona con los transportadores de 
otros azúcares como lactosa (Lac) o maltosa (Mal), impidiendo su entrada. Cuando no hay glucosa, la forma 
predominante es P-EIIAGlc, que permite el trasporte de otros azúcares induciéndose las respectivas rutas 
catabólicas. Además, se estimula la síntesis de AMPc, que permite que la proteína CRP dimerice y estimule la 
inducción de rutas de degradación de azúcares alternativos a la glucosa. b. En B. subtilis, HPr es la 
responsable del fenómeno de represión catabólica. Cuando hay glucosa disponible, se fosforila en Ser-46, que 
interacciona con la proteína CcpA. Este complejo inhibe la transcripción de aquellas rutas metabólicas para la 
asimilación de azúcares alternativos que contengan la secuencia diana denominada cre (adaptado de Rojo, 
2010). 
 
 
Al igual que en E. coli, en B. subtilis la glucosa es la fuente de carbono preferida, y aunque 
el sistema PTS está implicado en la asimilación de glucosa de manera similar que en E. 
Introducción 
 20
estimulando la fosforilación de la proteína HPr en la serina 46 a través de la 
enzima HPr quinasa/fosforilasa (HPrK). HPr es un elemento del sistema PTS 
que, cuando está fosforilado en la serina 46, es capaz de unirse a la proteína 
CcpA. El complejo CcpA-P-Ser-HPr se une al ADN en las denominadas 
regiones cre (elementos de respuesta catabólica) reprimiendo la expresión 
de muchos genes catabólicos. Además de HPr, en Bacillus existe otra 
proteína similar denominada Crh que también interviene en represión 
catabólica así como otras proteínas de control catabólico independientes de 
CcpA (56). 
 
 
Figura 1. Modelo esquemático del transporte de glucosa (Glc) y represión catabólica 
en E. coli y B. subtilis (adaptado de Rojo, 2010 (129)). MC: membrana celular, PEP: 
fosfoenolpiruvato, Pir: piruvato. A) En E. coli, el responsable último de la represión 
catabólica es el estado se fosforilación de la proteína EIIAGlc, un componente del 
a. E. coli
b. B. subtilis
 Introcucción 
 
 20 
coli, el mecanismo molecular por el cual se lleva a cabo la CCR en B. subtilis es diferente. 
Las proteínas claves de la CCR en B. subtilis son la proteína HPr junto con el regulador 
transcripcional CcpA. En pocas palabras, durante una alta actividad glicolítica (altos 
niveles de glucosa), los niveles citoplasmáticos de fructosa-1,6-bifosfato aumentan. Esto 
causa la fosforilación de la proteína HPr, la cual en su estado fosforilado (P-Ser46-HPr) es 
capaz de asociarse con la proteína CcpA. El complejo CcpA/P-Ser46-HPr es capaz de 
unirse a unas secuencias en sus genes blanco, llamadas cre (catabolite responsive 
sequences), las cuales reprimen la transcripción de un gran número de vías catabólicas, 
además de limitar el transporte de la fuente de carbono no preferida (Fig. 4B). Bajo 
condiciones de limitación de nutrientes, la proteína HPr se encuentra en su estado no 
fosforilado, lo cual permite la liberación de la represión (Fig. 4B). En concreto, B. subtilis 
es capaz de regular su metabolismo al detectar los niveles de fructosa-1,6-bifosfato y el 
estado energético de la célula a través del estado de fosforilación de la proteína HPr (Görke 
& Stülke, 2008; Rojo, 2010). 
1.4.2 Represión catabólica en Pseudomonas 
Las Pseudomonas, es un género de bacterias muy extendido en diferentes y muy variables 
ecosistemas, como suelo o agua, asociadas a plantas, animales o incluso tejidos humanos 
(Palleroni & Moore, 2004) Una característica muy común ente las Pseudomonas es su gran 
versatilidad metabólica, ya que son capaces de asimilar una gran variedad de compuestos. 
Sin embargo, en Pseudomonas la glucosa no juega el mismo papel central que en E. coli y 
B. subtilis. De hecho las fuentes de carbono preferidas en las Pseudomonas son los ácidos 
orgánicos o los aminoácidos sobre la glucosa (Rojo, 2010). Por ejemplo, en presencia de 
succinato y glucosa la expresión de las enzimas de la vía catabólica de la glucosa como la 
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa o la 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolasa están 
reprimidas hasta que el succinato se ha consumido por completo. La expresión de genes 
para la asimilación de otros azúcares como gluconato, glicerol, fructosa y manitol también 
se inhiben en la presencia de succinato o acetato (Collier et al., 1996). 
En Pseudomonas la glucosa posee una influencia diferente en la CCR en comparación con 
E. coli y B. subtilis, pero además su transporte y metabolismo también presentan notables 
 Introcucción 
 
 21 
diferencias. Como ya se había mencionado anteriormente en las Enterobacterias y los 
Firmicutes, la glucosa es trasportada y fosforilada a través del sistema PTS. A diferencia de 
los géneros antes mencionados, en Pseudomonas spp la glucosa es transportada hacia el 
periplasma a través de la porina OprB-1, posteriormente ésta puede ser transportada 
directamente al citoplasma por el transportador tipo ABC GtsABC, o convertida en 
gluconato o 2-cetogluconato en el espacio periplásmico, compuestos que posteriormente 
son internalizados por transportadores específicos (del Castillo et al., 2007; Lessie & 
Phibbs, 1984; Schleissner et al., 1997). Una vez dentro de la célula, la glucosa, gluconato o 
2-cetogluconato son procesados para producir 6-fosfogluconato, el cual posteriormente es 
oxidado a través de la vía Entner-Doudoroff (del Castillo et al., 2007; Lessie & Phibbs, 
1984). 
Además de las diferencias en la jerarquía de asimilación de diversas fuentes de carbono, 
también se han descrito diferencias significativas en el mecanismo de represión catabólica 
en las Pseudomonas, ya que como se había mencionado anteriormente en E. coli, esta 
regulación ocurre a nivel transcripcional dependiente del complejo cAMP-CRP y del estado 
de fosforilación de la enzima EIIAGlc. Mientras que en Pseudomonas spp esta regulación se 
lleva a cabo principalmente a nivel traduccional gracias a la participación de la proteína 
Crc (Rojo, 2010). 
1.5 El sistema de regulación global Crc-Hfq/CrcZ-CrcY 
La proteína de Control de la Represión Catabólica (Crc), tiene un papel clave en la CCR en 
las Pseudomonas. Ésta es una proteína de 30 kDa (259 aminoácidos). Crc fue inicialmente 
identificada en cepas de P aeruginosa en donde la mutación en el gen crc mostró un 
incremento en el consumo de glucosa y manitol aún en presencia de succinato, junto con 
una mayor actividad de las vías catabólicas de dichas fuentes de carbono (Wolff et al., 
1991). Además de que análisis proteómicos y transcriptómicos de la mutante crc crecida en 
medio rico (LB), mostraron modificación en la expresión de al menos 134 genes, muchos 
de ellos involucrados en el transporte y metabolismo de aminoácidos o carbohidratos, pero 
también genes implicados en patogenicidad, formación de biofilm y swimming, entre otros 
procesos celulares (Moreno et al., 2009a). 
 Introcucción 
 
 22 
Cuando Pseudomonascrece en presencia de una fuente de carbono preferida, Crc favorece 
su asimilación impidiendo la expresión de genes involucrados en el transporte o asimilación 
de fuentes de carbono menos preferidas (Hernández-Arranz et al., 2013; Moreno et al., 
2009a; Moreno et al., 2010) (Fig. 5). La proteína Crc controla la expresión de sus genes 
blanco a nivel post-transcripcional, impidiendo la traducción de mRNAs, que contienen un 
sitio AAnAAnAA (donde “n” es cualquier nucleótido). Este sitio es conocido como de 
Actividad Catabólica (CA), el cual está presente cerca del sitio de unión al ribosoma (RBS) 
de los genes blanco (Fig. 5) (Moreno et al., 2007; Moreno & Rojo, 2008; Moreno et al., 
2009a; Sonnleitner et al., 2009; Yuste & Rojo, 2001). Aunque anteriormente se creía que 
Crc era capaz de reconocer y unirse directamente al sitio CA, descubrimientos recientes han 
demostrado que la proteína Crc purificada no tiene la capacidad de unirse al mRNA por sí 
sola (Moreno et al., 2015; Sonnleitner & Blasi, 2014), sino que requiere de la presencia de 
la chaperona de RNA Hfq, la cual es quien reconoce y se une al motivo CA de los mRNAs 
blanco, siendo el papel de Crc estabilizar dicha unión a través de un mecanismo que todavía 
no ha sido dilucidado (Madhushani et al., 2015; Moreno et al., 2015; Sonnleitner & Blasi, 
2014). 
Hfq es una proteína pequeña, homo-hexamérica, muy abundante y ampliamente distribuida 
entre los diferentes géneros bacterianos. Su función está relacionada a la regulación post-
transcripcional de expresión de genes blanco. En E. coli, Hfq puede facilitar el 
apareamiento de los RNAs pequeños (también llamados sRNA) con su mRNA blanco; este 
apareamiento cambia la estructura del mRNA de manera que puede ocultar el RBS, 
impidiendo la traducción de dicho mRNA, lo cual resulta en una regulación negativa por 
parte de Hfq. Sin embargo, existe evidencia que este cambio en la estructura secundaria del 
mRNA debido a la unión del sRNA y Hfq puede tener el efecto contrario, es decir, facilitar 
el acceso de los ribosomas al RBS, lo cual activa la traducción de estos mRNA. También se 
ha demostrado que Hfq es capaz de proteger a algunos sRNAs de la degradación por 
ribonucleasas, o por el contrario puede inducir la degradación de sRNAs o mRNAs blanco 
(Aiba, 2007; De Lay et al., 2013; Holmqvist & Vogel, 2013; Morita et al., 2005; Vogel & 
Luisi, 2011). 
La actividad de Crc/Hfq es mayor en las células durante el crecimiento exponencial en un 
medio rico en nutrientes tal como LB, pero desaparece cuando las células alcanzan la fase 
 Introcucción 
 
 23 
estacionaria de crecimiento. Sin embargo, la expresión del gen crc y los niveles de la 
proteína Crc cambian poco a lo largo del crecimiento en medio LB o en un medio mínimo 
que contiene succinato como fuente de carbono (Moreno et al., 2015; Ruiz-Manzano et al., 
2005; Yuste et al., 2006). Aunque la expresión de Crc es similar independientemente del 
medio y la fase de crecimiento, su actividad varía fuertemente de acuerdo con estos 
elementos (Fig. 5) pues esta actividad es antagonizada por uno o más RNAs pequeños 
(sRNAs) no codificantes. 
En Pseudomonas aeruginosa se ha identificado uno de estos sRNAs, el cual es llamado 
CrcZ, mientras que en Pseudomonas putida contiene, además de CrcZ, un homólogo 
llamado CrcY. En Pseudomonas syringae se ha identificado un tercer sRNA llamado CrcX, 
el cual parece ser específico de esta especie (Filiatrault et al., 2013). Estos sRNAs 
contienen en su secuencia varios sitios CA, lo cuales quedan expuestos en estructuras de 
tipo “asa” cuando se estructuran. Se ha propuesto que estos sRNAs son capaces de 
antagonizar la actividad de Crc-Hfq, secuestrándolas ya que sus secuencias CA mimetizan 
las de sus genes blanco (Fig. 5). Es decir, estos sRNAs modulan la disponibilidad de Hfq y 
de Crc, cuando sus efectos no se necesitan, por ejemplo cuando se ha agotado la fuente de 
carbono preferida y es necesario liberar la represión que Crc-Hfq ejercen sobre los genes de 
asimilación de fuentes de carbono menos preferidas (Moreno et al., 2012; Moreno et al., 
2015; Sonnleitner et al., 2009; Sonnleitner & Blasi, 2014). Los niveles de estos sRNAs 
fluctúan de acuerdo a la fuente de carbono y nitrógeno presente en el medio. Esto significa 
que durante condiciones de fuerte represión catabólica (por ejemplo durante la fase de 
crecimiento exponencial en LB), la cantidad de estos sRNAs es baja, lo que permite Crc-
Hfq estén libres e impidan la traducción de sus genes blanco. Posteriormente cuando se 
alcanza la fase estacionaria donde las fuentes de carbono preferenciales se ha consumido, 
los niveles de los sRNAs aumentan, de manera que antagonizan la actividad de las 
proteínas Crc-Hfq, liberando la represión catabólica, y permitiendo que las fuentes de 
carbono menos preferidas sean consumidas (Moreno et al., 2009a; Moreno et al., 2009b; 
Ruiz-Manzano et al., 2005; Sonnleitner et al., 2009). 
En P. putida los sRNAs CrcZ y CrcY tienen una longitud de 368 nucleótidos (nt) y 
contienen seis motivos CA (Fig. 5). Se ha demostrado que la transcripción de crcZ y crcY 
ocurre a partir de un promotor dependiente de RpoN, y requiere de la activación del 
 Introcucción 
 
 24 
Sistema de dos Componentes (TCS) CbrA/CbrB (Fig. 5) (Abdou et al., 2011; Moreno et 
al., 2012). 
 
 
Figura 5. Modelo de represión catabólica en Pseudomonas spp. EL TCS CbrA/CbrB activa la 
transcripción del sRNA CrcZ, el cual antagoniza la actividad de las proteínas Crc-Hfq quienes se unen a los 
mRNAs de sus genes blancos, impidiendo su traducción.(Moreno et al., 2012) 
 
1.6 El sistema de dos componentes CbrA/CbrB 
Los TCS poseen un papel clave en la adaptación de células bacterianas a factores como la 
disponibilidad de nutrientes, estrés, señales ambientales, osmolaridad, entre otros (Calva & 
Oropeza, 2006; Gao & Stock, 2009). El TCS CbrA/CbrB fue descrito por primera vez en P. 
aeruginosa. CbrA, es una histiín cinasa típica, localizada en membrana interna que tiene 
homología con a la familia de histidín cinasas NtrB, mientras que el regulador de respuesta 
CbrB es un activador transcripcional que pertenece a la familia de proteínas NtrC, el cual 
mediums tested (repressing or non-repressing), the simul-
taneous absence of both CrcZ and CrcY significantly
reduced growth rate under non-repressing conditions
when succinate, fumarate or glucose were provided as
the sole carbon source, and totally impaired growth if
citrate or benzoate was the sole carbon source available.
On the contrary, growth rate was not affected in LB
medium. This behaviour is consistent with a situation in
which Crc is deregulated and fully active when both CrcZ
and CrcY are absent. In LB medium, this should pose no
problems since Crc is performing its due task, helping
to co-ordinate the assimilation of the different carbon
sources available. However, the presence of abnormally
high levels of free Crc under conditions that should
otherwise be non-repressing can lead to a detrimental
repression of genes whose expression in needed for the
transport and/or assimilation of the compound being used
as the sole carbon source. For example, Crc inhibits the
expression of genes required for the transport and assimi-
lation of glucose (del Castillo and Ramos, 2007; Moreno
et al., 2009a; Browne et al., 2010) and benzoate (Moreno
and Rojo, 2008) under repressing conditions. If these
genes are repressed when glucose (or benzoate) is the
sole carbon source available because CrcZ and CrcY are
not present to antagonize Crc, then Crc becomes harmful
for growth. Similarly, binding sites for Crc are apparent
at the translation start sites of genes involved in the
transport of citrate (PP_2057) and C4-dicarboxylates
(PP_1169) (Browne et al., 2010), which could explain the
inability of the strain lacking both CrcZ and CrcY to use
citrate as the carbon source, and its difficulties to use
fumarate or succinate.CrcY appears to be present in the genome of all
sequenced P. putida and P. fluorescens strains available
at the http://www.pseudomonas.com database, but could
not be found in those of P. aeruginosa and P. mendocina.
However, CrcZ could be detected in all cases. Interest-
ingly, P. syringae has three sRNAs that show potential
binding sites for Crc and map immediately downstream of
RpoN dependent promoters (Filiatrault et al., 2010). Their
role in catabolite repression has not been investigated.
One of them, named Psr1, is located between the cbrB
and pcnB genes, a genomic context identical to that of
CrcZ in other pseudomonads. The second one, named
Fig. 9. Model showing how the co-ordinated action of the CrcZ and CrcY sRNAs can regulate the pool of free Crc protein. These sRNAs, the
levels of which vary according to growth conditions, trap Crc protein, thereby impeding its binding to target mRNAs to inhibit translation
initiation. The Crc binding site can be immediately upstream from the Shine-Dalgarno sequence, or overlapping the AUG initiation codon,
depending on the mRNA considered.
Pseudomonas putida CrcZ and CrcY small RNAs 35
© 2011 Blackwell Publishing Ltd, Molecular Microbiology, 83, 24–40
mediums tested (repressing or non-repressing), the simul-
taneous absence of both CrcZ and CrcY significantly
reduced growth rate under non-repressing conditions
when succinate, fumarate or glucose were provided as
the sole carbon source, and totally impaired growth if
citrate or benzoate was the sole carbon source available.
On the contrary, growth rate was not affected in LB
medium. This behaviour is consistent with a situation in
which Crc is deregulated and fully active when both CrcZ
and CrcY are absent. In LB medium, this should pose no
problems since Crc is performing its due task, helping
to co-ordinate the assimilation of the different carbon
sources available. However, the presence of abnormally
high levels of free Crc under conditions that should
otherwise be non-repressing can lead to a detrimental
repression of genes whose expression in needed for the
transport and/or assimilation of the compound being used
as the sole carbon source. For example, Crc inhibits the
expression of genes required for the transport and assimi-
lation of glucose (del Castillo and Ramos, 2007; Moreno
et al., 2009a; Browne et al., 2010) and benzoate (Moreno
and Rojo, 2008) under repressing conditions. If these
genes are repressed when glucose (or benzoate) is the
sole carbon source available because CrcZ and CrcY are
not present to antagonize Crc, then Crc becomes harmful
for growth. Similarly, binding sites for Crc are apparent
at the translation start sites of genes involved in the
transport of citrate (PP_2057) and C4-dicarboxylates
(PP_1169) (Browne et al., 2010), which could explain the
inability of the strain lacking both CrcZ and CrcY to use
citrate as the carbon source, and its difficulties to use
fumarate or succinate.
CrcY appears to be present in the genome of all
sequenced P. putida and P. fluorescens strains available
at the http://www.pseudomonas.com database, but could
not be found in those of P. aeruginosa and P. mendocina.
However, CrcZ could be detected in all cases. Interest-
ingly, P. syringae has three sRNAs that show potential
binding sites for Crc and map immediately downstream of
RpoN dependent promoters (Filiatrault et al., 2010). Their
role in catabolite repression has not been investigated.
One of them, named Psr1, is located between the cbrB
and pcnB genes, a genomic context identical to that of
CrcZ in other pseudomonads. The second one, named
Fig. 9. Model showing how the co-ordinated action of the CrcZ and CrcY sRNAs can regulate the pool of free Crc protein. These sRNAs, the
levels of which vary according to growth conditions, trap Crc protein, thereby impeding its binding to target mRNAs to inhibit translation
initiation. The Crc binding site can be immediately upstream from the Shine-Dalgarno sequence, or overlapping the AUG initiation codon,
depending on the mRNA considered.
Pseudomonas putida CrcZ and CrcY small RNAs 35
© 2011 Blackwell Publishing Ltd, Molecular Microbiology, 83, 24–40
Crc 
Crc 
Hfq 
Crc 
Crc 
Crc 
Hfq	
Hfq	
Hfq	
Hfq	
Hfq	
Pool of free Crc and 
Hfq proteins 
Hfq 
Crc 
Hfq 
Crc 
Crc 
 Introcucción 
 
 25 
reconoce promotores del tipo RpoN. Mutaciones en los genes cbrA o cbrB resultan en la 
incapacidad de la bacteria de usar como única fuente de carbono una variedad de 
compuestos como manitol, glucosa, piruvato, citrato y algunos aminoácidos (por ejemplo 
arginina, histidina y prolina). Además, estas mutaciones resultaron en una mayor resistencia 
hacia varios antibióticos (Polimixina B, Ciprofloxacino y Tobramicina) (Li & Lu, 2007; 
Nishijyo et al., 2001; Yeung et al., 2011). Adicionalmente, se ha propuesto que en las 
especies de Pseudomonas el sistema CbrA/B actúa coordinadamente con NtrB/C para 
mantener el balance carbono/nitrógeno, además de tener un importante papel en la 
tolerancia al estrés, formación de biopelícula y citotoxicidad (Abdou et al., 2011; Amador 
et al., 2010; Yeung et al., 2014; Zhang et al., 2015). 
Los genes cbrA-cbrB están localizados río arriba del gen crcZ, y como se había 
mencionado anteriormente el TCS CbrA/B es necesario para activar la transcripción de los 
sRNAs CrcZ y CrcY. En presencia de fuentes de carbono menos preferidas CbrA/B induce 
la transcripción de estos RNAs no codificantes, los cuales antagonizan la actividad de las 
proteínas Crc-Hfq, liberando represión sobre los mRNAs blanco, los cuales no solo están 
involucrados con el catabolismo de las fuentes de carbono menos preferidas, sino también 
en otros procesos como la virulencia, susceptibilidad a antibióticos y desarrollo del biofilm 
(Abdou et al., 2011; Garcia-Mauriño et al., 2013; Linares et al., 2010; Moreno et al., 2012; 
Sonnleitner et al., 2009; Yang et al., 2015) 
Tanto en P. aeruginosa como en P putida CbrB reconoce y se une a una secuencia 
palindrómica (TGTTAC-N14-GTAACA), localizada entre las posiciones -151 y -108 del 
inicio de la transcripción de crcZ, o crcY respectivamente, activando su expresión junto con 
el factor σ54 (Abdou et al., 2011; Garcia-Mauriño et al., 2013; Moreno et al., 2012). En P. 
aeruginosa las cepas mutantes cbrB y crcZ presentan fenotipos muy similares pero no 
idénticos, lo cual sugiere la presencia de otros blancos de CbrB que aun no han sido 
caracterizados (Sonnleitner et al., 2012).
Antecedentes 
 
 26 
2. ANTECEDENTES 
2.1 Crecimiento diáuxico en A. vinelandii. � 
A. vinelandii es capaz de usar carbohidratos, alcoholes y ácidos orgánicos como fuente de 
carbono (Kennedy et al., 1986). Esta bacteria presenta un crecimiento diáuxico cuando es 
cultivada en un medio con acetato y glucosa (Barnes, 1974; George et al., 1985; Tauchert et 
al., 1990). En esta condición el acetato es usado como fuente de carbono primaria, cuando 
éste se agota inicia el consumo de glucosa, indicando que la presencia de acetato en el 
medio reprime el sistema de transporte de glucosa. Aunado a esto, la presencia de 
intermediarios del ciclo de ácidos tricarboxílicos como citrato y 2-oxo-glutarato también 
impiden el consumo de glucosa (Fig. 6), (Tauchert et al., 1990), lo cual sugiere la 
existencia de un mecanismo de CCR en A. vinelandii, similar al que se ha descrito en 
especies de Pseudomonas. 
 
 
Figura 6. Crecimiento de A. vinelandii en cultivo en lote en una mezcla de acetato y glucosa. Se muestran 
las concentraciones de proteína celular (X), acetato (triángulos negros) y glucosa (triángulos blancos) 
(Tauchert et al., 1990). 
 
 
 
 
26 
2 ANTECEDENTES 
2.1 CRECIMIENTO DIÁUXICO EN A. vinelandii. 
 
Se ha reportado que A. vinelandii exhibe crecimiento diáuxico cuando se 
cultiva con suficientes concentraciones de más de una fuente de carbono 
como glucosa y acetato. El acetato es usado como la fuente de carbono 
primaria (George et al., 1985;Tauchert et al., 1990) y esto correlaciona con 
altos niveles de la enzima acetato cinasa. Figura 6) 
 
Figura 6. Crecimiento de A. vinelandii en cultivo en lote en una mezcla de acetato y 
glucosa. Se muestran las concentraciones de proteína celular (X), acetato 
(triángulos negros) y glucosa (triángulos blancos) (Tauchert et al., 1990). 
Posteriormente, una vez consumido el acetato hay un aumento de dos enzimas 
que intervienen en la glicólisis: la glucosa 6-P deshidrogenasa (Zwf) y la 
gliceraldehído 3-P deshidrogenasa, enzimas pertenecientes a la vía ED 
(Conway, 1992). 
Aunque los mecanismos moleculares de esta regulación se desconocen, se 
sabe que metabolitos derivados del acetato como acetil-CoA y acetil-fosfato 
inhiben la actividad de la glucosa 6-P deshidrogenasa (Tauchert et al., 1990) 
 
Antecedentes 
 
 27 
2.2. La mutación cbrA:: Tn5 aumenta la síntesis de alginato en A. 
vinelandii 
Con el fin de entender las redes de regulación de la producción de alginato en A. vinelandii, 
en nuestro grupo de investigación se generó un banco de mutantes por mutagénesis al azar 
con un miniTn5. En este banco se identificaron las candidatas que presentaron una 
morfología colonial hipermucoide, indicativo de un alto nivel del exopolisacárido alginato 
(Guzmán, 2001). Entre ellas, se identificó una llamada GG15, en la cual el mTn5 
interrumpió el gen ortólogo a cbrA de Pseudomonas spp (Serrano-Román, 2010). Río abajo 
de cbrA se localiza tanto el gen cbrB como el gen crcZ, por lo que el arreglo génico del 
locus cbrA-cbrB-crcZ se conserva entre Pseudomonas spp y A. vinelandii. 
En la caracterización fenotípica inicial de la mutante GG15, ésta mostró un incremento de 6 
veces en la producción de alginato con respecto a la cepa silvestre (AEIV) (620 vs 80 µg 
alginato/mg proteína, respectivamente) en cajas de medio mínimo Burk suplementado con 
sacarosa. Además la complementación genética de la mutante GG15 con una copia silvestre 
del gen cbrA restableció la producción de alginato a niveles silvestres (60 µg alginato/mg 
proteína) (Serrano-Román, 2010). Estos resultados indicaron claramente que la histidín 
cinasa CbrA ejerce un control negativo sobre la síntesis de alginato en A. vinelandii. 
Por otra parte al generar la mutante cbrB, esta también mostró un fenotipo hipermucoide 
con respecto a la cepa silvestre (1300 vs 120 µg de alginato/mg de proteína de la cepa 
silvestre). Sin embargo, su crecimiento tanto en medio sólido como en medio líquido se 
vio afectado, sugiriendo un papel importante de este regulador en el crecimiento vegetativo 
(Bonilla-Badía, 2010). Colectivamente estos resultados indicaron que el sistema CbrA/B 
regula negativamente la síntesis de alginato y que además es necesario para un óptimo 
crecimiento vegetativo de A. vinelandii. 
 
 
Antecedentes 
 
 28 
2.3 La mutante cbrA es incapaz de consumir glucosa durante el 
crecimiento diáuxico en un medio suplementado con glucosa y acetato 
La caracterización de la mutante cbrA de A. vinelandii demostró que la histidín cinasa 
CbrA era necesaria para el consumo de glucosa durante el crecimiento diáuxico acetato-
glucosa, pues la mutante cbrA fue incapaz de crecer a expensas de la glucosa una vez 
consumido el acetato del medio (Fig. 7A y 7B) (Hernández-Ortíz, 2014). Este resultado 
concuerda con la función del TCS CbrA/CbrB como un regulador maestro del proceso de 
CCR, en donde CbrA se necesita para contrarrestar el efecto de las proteínas Crc-Hfq 
durante la inhibición de la asimilación de fuentes de carbono preferidas. 
2.4 Genes relacionados con el transporte y metabolismo de glucosa que 
poseen posibles sitios CA 
En este contexto, resulta interesante que un análisis in silico de los genes relacionados con 
el transporte y metabolismo de glucosa en A. vinelandii identificó que varios de ellos 
presentan posibles sitios de reconocimiento de las proteínas Hfq-Crc (motivos CA) (Tabla 
1). En conjunto todos estos resultados sugirieron que CbrA regula la asimilación de glucosa 
a través del sistema Crc-Hfq/CrcZ-Y. 
 
Figura 7. Crecimiento y consumo de glucosa en la mutante cbrA. (a). La cepa silvestre AEIV es capaz de 
crecer a expensas del consumo de acetato y posteriormente el de glucosa (línea roja), mientras que la mutante 
cbrA, estaciona su crecimiento una vez que presumiblemente se ha agotado el acetato del medio (línea azul). 
(b). La cepa AEIV consume por completo la glucosa del medio (línea roja), mientas que la mutante cbrA no 
es capas de consumirla (línea azul) (Hernández-Ortíz, 2014). 
!
Crecimiento Consumo de glucosa b) a) 
Antecedentes 
 
 29 
 
 
 
Tabla 1. Genes de A. vinelandii involucrados en el transporte y catabolismo de glucosa 
que contienen posibles sitios de unión a Crc-Hfq. 
 
Secuencia Posición 
(Rel. Al ATG) 
Gen Clave Descripción 
ACAACAAGA -7 a -17 gluP Avin_04150 Transportador de glucosa/galactosa 
AAAGAAAAA -5 a -13 zwf-3 Avin_16620 Glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa 
AAAAAGAACAA -6 a -16 zwf-2 Avin_17630 Glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa 
AACAACAAA -18 a -26 eda-1 Avin_27250 
Aldolasa-
cetohidroxiglutarato/ 
Aldolasa-ceto-desoxi-
fosfogluconato 
AAAAACAACAA -16 a -26 kguT Avin_26900 Transportador de 2-cetogluonato 
AAGAACA +3 a +9 KguD Avin_26910 2-cetogluconato 6-fosfto reductasa 
AACAACAA +1 a -8 eno Avin_38790 Fosfopiruvato hidratasa (Enolasa) 
 
 
 
Debido a los múltiples reportes de que el TCS CbrA/CbrB encabeza la cascada para el 
control de la CCR en diversas especies de Pseudomonas, en este trabajo nos propusimos 
investigar el papel de este sistema en la CCR en A. vinelandii, además de establecer el 
mecanismo por el cual controla la síntesis de alginato, ya que hasta el momento no existen 
reportes previos de que éste TCS regule la producción de este polisacárido. 
Hipótesis 
 
 30 
 
 
 
 
 
3. HIPÓTESIS 
 
 
 
 
En A. vinelandii El TCS CbrA/CbrB controla negativamente la síntesis de alginato al 
afectar la expresión de reguladores clave en esta ruta biosintética (como el sistema Gac-
Rsm). Por otro lado, encabeza una cascada de regulación para el control del proceso de 
CCR para la asimilación de fuentes de carbono secundarias como glucosa. 
Objetivos 
 
 31 
 
4. OBJETIVOS 
 
 
4.1 Objetivo General 
 
Establecer el mecanismo molecular por el cual el sistema de dos componentes CbrA/CbrB 
controla negativamente la síntesis de alginato y la represión catabólica por carbono en A. 
vinelandii. 
 
 
 
4.2 Objetivos particulares 
 
. Determinar el papel del TCS CbrA/CbrB en el proceso de CCR en A. vinelandii. � 
. 
. Determinar el efecto de TCS CbrA/CbrB sobre la expresión de los genes alg para la 
biosíntesis de alginato. En particular algD, el gen clave de la ruta biosintética 
. � 
. Establecer si la HK CbrA posee un efecto sobre la actividad de los reguladores 
ya �conocidos (Sistema GacS/GacA y la proteína RsmA) que controlan la síntesis de 
alginato. � 
Material y Métodos 
 
 32 
5. MATERIAL Y MÉTODOS 
 
5.1 Cepas bacterianas, plásmidos y oligonucleótidos usados en este 
estudio 
 
Tabla 2. Cepas y plásmidos utilizadas en este trabajo 
 
Nombre Genotipo/Características relevantes Referencia 
 
Cepas 
A. vinelandii 
AEIV Cepa silvestre (Larsen & Haug, 1971) 
GG15 Derivada de la AEIV obtenida por mutagénesis al 
azar con un miniTn5, identificada por su fenotipo 
hipermucoide. cbrA::miniTn5, Spr 
(Quiroz-Rocha, 2012) 
EQR02 Derivada de la AEIV, porta una inserción del casete 
de Spr en el gen cbrA en dirección opuesta al sentido 
de la transcripción 
(Quiroz-Rocha, 2012) 
JS05 Derivada de la GG15, complementada con una copia 
silvestre de cbrA integrada en el cromosoma. Gmr 
(Serrano-Román, 2010) 
CFB03 Mutante cbrB::Sp derivada de la cepa AEIV (Bonilla-Badía, 2010) 
AEalgD Derivada de la cepa AEIV, porta una inserción del 
casete de Kmr en el región estructural del gen algD 
(Manzo et al., 2011)