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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE CIENCIAS ACTIVIDAD ANTIAMIBIANA DE LA ASOCIACIÓN DEL ZINC-METRONIDAZOL T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: BIÓLOGO P R E S E N T A : MARIO NEQUIZ AVENDAÑO DIRECTOR DE TESIS: DRA. GLORIA BERTHA VEGA ROBLEDO 2010 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. AGRADECIMIENTOSAGRADECIMIENTOSAGRADECIMIENTOSAGRADECIMIENTOS A la A la A la A la Universidad Nacional Autónoma de México por mi formación académica.Universidad Nacional Autónoma de México por mi formación académica.Universidad Nacional Autónoma de México por mi formación académica.Universidad Nacional Autónoma de México por mi formación académica. A la Facultad de Ciencias porque me abrió las puertas al conocimiento de la Biología.A la Facultad de Ciencias porque me abrió las puertas al conocimiento de la Biología.A la Facultad de Ciencias porque me abrió las puertas al conocimiento de la Biología.A la Facultad de Ciencias porque me abrió las puertas al conocimiento de la Biología. A la Doctora Gloria Vega Robledo por su paciencia y excelente asesoría en la realización de este traA la Doctora Gloria Vega Robledo por su paciencia y excelente asesoría en la realización de este traA la Doctora Gloria Vega Robledo por su paciencia y excelente asesoría en la realización de este traA la Doctora Gloria Vega Robledo por su paciencia y excelente asesoría en la realización de este trabajo.bajo.bajo.bajo. A la Doctora Guadalupe Rico por sus consejos y apoyo en la redacción de esta tesis.A la Doctora Guadalupe Rico por sus consejos y apoyo en la redacción de esta tesis.A la Doctora Guadalupe Rico por sus consejos y apoyo en la redacción de esta tesis.A la Doctora Guadalupe Rico por sus consejos y apoyo en la redacción de esta tesis. Al Laboratorio de Infectología del Departamento de Medicina Experimental, Facultad de Medicina, Al Laboratorio de Infectología del Departamento de Medicina Experimental, Facultad de Medicina, Al Laboratorio de Infectología del Departamento de Medicina Experimental, Facultad de Medicina, Al Laboratorio de Infectología del Departamento de Medicina Experimental, Facultad de Medicina, UNAM, por permitir la realización experimental de este trabajo.UNAM, por permitir la realización experimental de este trabajo.UNAM, por permitir la realización experimental de este trabajo.UNAM, por permitir la realización experimental de este trabajo. Al Al Al Al técnico Marco Elias Gudiño Zayas por su apoyo técnico y digitalización de imágenes de esta tesis.técnico Marco Elias Gudiño Zayas por su apoyo técnico y digitalización de imágenes de esta tesis.técnico Marco Elias Gudiño Zayas por su apoyo técnico y digitalización de imágenes de esta tesis.técnico Marco Elias Gudiño Zayas por su apoyo técnico y digitalización de imágenes de esta tesis. Al Doctor Alfonso Olivos García por proporcionarme los trofozoítos de Al Doctor Alfonso Olivos García por proporcionarme los trofozoítos de Al Doctor Alfonso Olivos García por proporcionarme los trofozoítos de Al Doctor Alfonso Olivos García por proporcionarme los trofozoítos de Entamoeba histolytica y por sus Entamoeba histolytica y por sus Entamoeba histolytica y por sus Entamoeba histolytica y por sus consejos.consejos.consejos.consejos. DEDICATORIAS DEDICATORIAS DEDICATORIAS DEDICATORIAS A mis padresA mis padresA mis padresA mis padres Juan Nequiz Alfaro y Margarita Avendaño Ochoa por su inmenso apoyo y base de todos Juan Nequiz Alfaro y Margarita Avendaño Ochoa por su inmenso apoyo y base de todos Juan Nequiz Alfaro y Margarita Avendaño Ochoa por su inmenso apoyo y base de todos Juan Nequiz Alfaro y Margarita Avendaño Ochoa por su inmenso apoyo y base de todos mis logros. mis logros. mis logros. mis logros. A mi Tía María Luisa Nequiz Alfaro por ser mi segunda Madre.A mi Tía María Luisa Nequiz Alfaro por ser mi segunda Madre.A mi Tía María Luisa Nequiz Alfaro por ser mi segunda Madre.A mi Tía María Luisa Nequiz Alfaro por ser mi segunda Madre. A mi Esposa Juana Salazar Torres por ser mi gran compañera, por su paciencia y su gran cariño qA mi Esposa Juana Salazar Torres por ser mi gran compañera, por su paciencia y su gran cariño qA mi Esposa Juana Salazar Torres por ser mi gran compañera, por su paciencia y su gran cariño qA mi Esposa Juana Salazar Torres por ser mi gran compañera, por su paciencia y su gran cariño que es la ue es la ue es la ue es la fuente de mi fortaleza y por darme tres grandes motivos para seguir adelante. Te amo.fuente de mi fortaleza y por darme tres grandes motivos para seguir adelante. Te amo.fuente de mi fortaleza y por darme tres grandes motivos para seguir adelante. Te amo.fuente de mi fortaleza y por darme tres grandes motivos para seguir adelante. Te amo. A mis hijas Araceli y Yazmin por su alegría y su buen humor que siempre me motivaron.A mis hijas Araceli y Yazmin por su alegría y su buen humor que siempre me motivaron.A mis hijas Araceli y Yazmin por su alegría y su buen humor que siempre me motivaron.A mis hijas Araceli y Yazmin por su alegría y su buen humor que siempre me motivaron. A mi hijo Mayito por su gran fuerza de voluntad de salir adelante.A mi hijo Mayito por su gran fuerza de voluntad de salir adelante.A mi hijo Mayito por su gran fuerza de voluntad de salir adelante.A mi hijo Mayito por su gran fuerza de voluntad de salir adelante. A misA misA misA mis hermanos Paty, Rafael, Faustino y Lilia por la fortuna de contar con ellos.hermanos Paty, Rafael, Faustino y Lilia por la fortuna de contar con ellos.hermanos Paty, Rafael, Faustino y Lilia por la fortuna de contar con ellos.hermanos Paty, Rafael, Faustino y Lilia por la fortuna de contar con ellos. A mis compañeros Adriana, Lolita, Mari, Catalina, Mariana, Carlos, Víctor, Sergio, Espiridión, Omar, A mis compañeros Adriana, Lolita, Mari, Catalina, Mariana, Carlos, Víctor, Sergio, Espiridión, Omar, A mis compañeros Adriana, Lolita, Mari, Catalina, Mariana, Carlos, Víctor, Sergio, Espiridión, Omar, A mis compañeros Adriana, Lolita, Mari, Catalina, Mariana, Carlos, Víctor, Sergio, Espiridión, Omar, Eusebio, Ricardo y Daniel.Eusebio, Ricardo y Daniel.Eusebio, Ricardo y Daniel.Eusebio, Ricardo y Daniel. Hoja de Datos del Jurado 1. Datos del alumno Nequiz Avendaño Mario 56232664 UNAM Facultad de Ciencias Biología 8919394-3 2. Datos del tutor Vega Robledo Gloria Bertha 3. Datos del sinodal 1 Dra. Rosaura Mayén Estrada 4. Datos del sinodal 2 Dra. María Guadalupe Trinidad Rico Rosillo 5. Datos del sinodal 3 Dra. Gloria Bertha Vega Robledo 6. Datos del sinodal 4 Dr. Alfonso Olivos García 7. Datos del sinodal 5 Biol. Itzel Sigala Regalado INDICEPágina 1. Introducción……………………………….………………….........1 1.1 Historia……………………………………………………........1 1.2 Serología………………………………………………………..1 1.3 Clasificación taxonómica………………………………………2 1.4 Ciclo de vida…………………………………………………....2 1.5 Trofozoíto………………………………………………………4 1.6 Quiste…………………………………………………………...6 1.7 Metabolismo…………………………………………………....8 1.8 Epidemiología………………………………………………….10 1.9 Amibiasis……………………………………………………….12 1.10 Amibiasis intestinal…………………………………………...12 1.11 Amibiasis extraintestinal……………………………………...13 1.12 Factores de virulencia………………………………………....14 2. Inmunología de la Amibiasis………………………………....……...15 2.1 Inmunidad innata………………………………………………...15 2.2 inmunidad humoral………………………………………………21 2.3 Inmunidad celular………………………………………………..22 2.4 Tratamiento………………………………………………………25 3. Hipótesis………………………………………………………….….33 4. Objetivos………………………………………………………….…33 4.1 General…………………………………………………………...33 4.2 Particulares……………………………………………………….33 5. Materiales y Métodos…………………………………………..…….34 5.1 Preparación del medio de cultivo TYI-S-33……………………..34 5.2 Parásitos…………………………………………………………..34 5.3 Curvas de viabilidad y proliferación……………………………..34 5.4 Microcultivos……………………………………………………..35 5.5 Análisis estadístico………………………………………………..35 6. Resultados…………………………………………………………….36 6.1 Viabilidad…………………………………………………………36 6.2 Proliferación………………………………………………………40 6.3 Morfología……………………………………………………….. 44 7. Discusión…………………………………………………………….. 47 8. Conclusiones……………………………………………………….….53 9. Referencias………………………………………..…………………...54 1 1. Introducción 1.1 Historia La amibiasis es una enfermedad producida por el protozoario denominado Entamoeba histolytica. Este parásito fue descubierto por el ruso Fedor Aleksandrevitch Lösch en 1875, en la materia fecal de un enfermo en San Petersburgo, Rusia. Se trataba de un caso típico de disentería amibiana con moco, sangre y amibas móviles con eritrocitos en su interior (Stanley 2003). Louis Diamond en 1961 desarrolló el cultivo axénico para E. histolytica y posteriormente, en 1968, lo modificó (Diamond, 1968). En 1978, Diamond publicó un nuevo medio de cultivo axénico (Diamond y col., 1978) y pronto se idearon métodos de cultivo en masa para distintas cepas de E. histolytica y de otras amibas similares, para la realización de investigaciones fisiológicas, patogénicas e inmunológicas. 1.2 Serología Los estudios serológicos para el diagnóstico de la amibiasis invasora, pusieron de manifiesto que los anticuerpos aparecen solamente cuando ésta ha traspasado la pared intestinal y circula por el huésped. Los resultados son negativos cuando el parásito se encuentra en la luz intestinal (Martínez-Palomo, 1988). 2 1.3 Clasificación Taxonómica Imperio Eucarya Reino Protista Super grupo Amoebozoa Primer rango Entamoebida Orden Endamoebida Familia Endamoebidae Género Entamoeba Especie Entamoeba histolytica (Adl y col., 2005) 1.4 Ciclo de Vida El ciclo de vida de E. histolytica consiste en tres estados que son: trofozoíto, quiste y metaquiste (Figura 1) (Martínez-Palomo, 1988). La infección se inicia con la ingestión de quistes presentes en el agua o alimentos contaminados con materia fecal, los cuales a su paso por el estómago son capaces de resistir la acción de los jugos gástricos, gracias a la pared de quitina. Sin embargo, es posible que el ácido gástrico debilite la pared del quiste confiriéndole mayor actividad (Martínez-Palomo y Espinosa-Cantellano, 1998). Posteriormente pasa al intestino delgado, donde ocurre la exquistación, que es la pérdida de la cubierta de quitina por efecto de las enzimas contenidas en el jugo intestinal. Asimismo, los cuatro núcleos del quiste se dividen y dan lugar a ocho núcleos, por lo que se le denomina metaquiste, al continuar las divisiones emergen ocho trofozoítos metaquísticos. Éstos, migran hacia el intestino grueso para colonizarlo, reproduciéndose en forma activa 3 por fisión binaria; se adhieren a la mucosa intestinal por medio de la lectina o se alojan en las criptas glandulares, donde se alimentan de bacterias y restos celulares. Los trofozoítos pueden emigrar por vía porta e instalarse en diferentes órganos como hígado, pulmón, cerebro y piel. Finalmente, estos trofozoítos pueden enquistarse, completando el ciclo de vida (Ravdin, 1995). Figura 1. Ciclo de vida de E. histolytica (www.monografias .com). Enfermedad extraintestinal Quiste maduro Desenquistamiento Ingestión Trofozoíto Quiste Trofozoíto Heces Estadio infectivo Estadio de diagnóstico Colonización no invasiva Enfermedad intestinal Enfermedad extraintestinal 4 1.5 Trofozoíto El trofozoíto es la forma móvil de E. histolytica; mide de 10-40 µm de diámetro, es altamente dinámico y pleomórfico, su movimiento se genera mediante proyecciones citoplasmáticas llamadas pseudópodos, inicialmente generados por el ectoplasma. En el trofozoíto puede diferenciarse, además, una parte denominada uroide, donde se concentran vesículas que descargan su contenido al exterior (León y col., 1997). El citoplasma posee un ectoplasma hialino y un endoplasma granular con numerosas vacuolas que miden de 0.5 a 9.0 µm de diámetro y que incluyen tanto a las fagocíticas, macropínocíticas y micropinocíticas así como a los lisosomas, cuerpos residuales y gránulos electro-densos (León y col., 1997). Este organismo carece de organelos tales como mitocondrias, aparato de Golgi y retículo endoplásmico. Sin embargo, estudios recientes han descrito la presencia de vesículas que pueden ser inmunolocalizadas usando anticuerpos contra proteínas del aparato de Golgi de mamífero tales como la proteína de membrana (εCOP) y el factor de ADP-ribosilación (ARF) de la familia de las GTPasas, que pueden corresponder al retículo endoplásmico y a un sistema como el aparato de Golgi (Bredeston y col., 2005). Recientemente, se ha demostrado en E. histolytica un organelo cilíndrico corto, derivado de un mitocondrión, que en la amiba recibe el nombre de criptón y es por la presencia de genes que codifican para la proteína de 60 kDa, Hsp 60, proteína mitocondrial con actividad de chaperona, similar a la de otras eucariotas (Mai y col., 1999; Avila y Tovar, 2004). El núcleo tiene de 4-7 µm de diámetro, cromatina periférica fina y un cariosoma o endosoma localizado en su parte central, el tamaño del genoma nuclear de E. histolytica es aproximadamente de 0.033 pg de DNA, es decir, son 3.2 x 107 pb (Loftus y col., 2005). La membrana plasmática mide 10 nm y con una superficie uniforme 5 principalmente de glicoproteínas, cuya unión a lectinas (Con A), sugiere la presencia de un alto contenido de residuos de azúcares como manosa y glucosa. En la superficie se puede observar el fenómeno de capping, originado por una rápida redistribución de ciertos componentes, se ha sugerido que éste es un mecanismo utilizado por la amiba para remover los antígenos de la superficie o bien desprender porciones en los que se encuentran anticuerpos unidos a estos antígenos y así eludir al sistema inmune. En este estadio, el parásito presenta una gran cantidad de enzimas con las cuales se ha establecido un patrón de tipo isoenzimático, que ha servido para clasificarlo en cepas patógenas y no patógenas (Tannich, 1998). La amiba se alimenta por la fagocitosis de nutrientes, tales como bacterias y células del hospedero y habita en el lumen del tracto gastrointestinal humano (Martínez-Palomo y Espinosa-Cantellano, 1998). 6 Figura 2. Trofozoítos de E. histolytica campo claro (40x). 1.6 QuisteLos quistes son formas esféricas u ovaladas de 8 a 20 µm de diámetro, presentan un solo núcleo, son inmóviles y constituyen la forma infectiva de E. histolytica. El quiste se forma cuando las condiciones ambientales en el intestino grueso se vuelven adversas para el trofozoíto. Inicialmente se inmoviliza, pierde su material citoplásmico, se condensa en 30 µµµµm una masa de forma redonda que constituye el prequiste e membrana doble que lo recubre totalmente y mide entre 125 y 150 nm d formada por elementos fibrilares de quitina de 2 a 3 nm de diámetro los que dispuestos en capas concéntricas, integran Palomo, 1988), así queda formado el prequiste con glucógeno, cuerpos alargados muy refringentes de extremos redondeados denominados cuerpos cromatoidales y cuatro núcleos, que son el resultado de dos divisiones mitóticas consecutivas del núcleo del quiste inmaduro. Durante este consume el glucógeno (Martí Los quistes no se pueden desarrollar dentro de los tejidos. Así los quistes constituyen la forma infectiva y de resistencia de huésped por semanas o meses en cualquier ambiente (Martínez Figura 3. Quistes de una masa de forma redonda que constituye el prequiste el cual inicia la síntesis de una membrana doble que lo recubre totalmente y mide entre 125 y 150 nm d formada por elementos fibrilares de quitina de 2 a 3 nm de diámetro los que dispuestos en capas concéntricas, integran una red compacta que le proteja del hospedero (Martínez queda formado el prequiste. Cuando el quiste madura, c cuerpos alargados muy refringentes de extremos redondeados denominados cuerpos cromatoidales y cuatro núcleos, que son el resultado de dos divisiones mitóticas consecutivas del núcleo del quiste inmaduro. Durante este proceso de maduración se (Martínez-Palomo y Espinosa-Cantellano, 1998). Los quistes no se pueden desarrollar dentro de los tejidos. Así los quistes constituyen la forma infectiva y de resistencia de E. histolytica, ya que pueden sobrevivir fuera del huésped por semanas o meses en cualquier ambiente (Martínez-Palomo 1988). Figura 3. Quistes de E. histolytica (tomado de Martínez-Palomo, 1988) 7 inicia la síntesis de una membrana doble que lo recubre totalmente y mide entre 125 y 150 nm de grosor, está formada por elementos fibrilares de quitina de 2 a 3 nm de diámetro los que dispuestos en del hospedero (Martínez- dura, contiene vacuolas cuerpos alargados muy refringentes de extremos redondeados denominados cuerpos cromatoidales y cuatro núcleos, que son el resultado de dos divisiones mitóticas proceso de maduración se . Los quistes no se pueden desarrollar dentro de los tejidos. Así los quistes constituyen la sobrevivir fuera del Palomo 1988). 1988). 8 1.7 Metabolismo E. histolityca es amitocondriado y también carece de un hidrogenosoma, además no presenta el ciclo del ácido tricarboxílico y la fosforilación oxidativa propios de eucariontes aerobios. Su metabolismo es anaerobio fermentativo y genera energía principalmente por fosforilación del sustrato, esta fuente es la glucosa y en menor proporción la galactosa; la glucosa entra por medio de un sistema específico de transporte que la ingresa en una proporción 100 veces mayor a la incorporada por endocitosis (Martínez-Palomo y Espinosa-Cantellano, 1998). En la glicólisis, la glucosa es degradada a piruvato por la vía clásica de Embden-Meyerhof, un aspecto importante en E. histolityca es la utilización de pirofosfato inorgánico (PPi), un compuesto de alta energía utilizado en diferentes reacciones de la glicólisis. Se ha identificado la enzima fosfofructoquinasa dependiente de pirofosfato (PFK-PPi), esta enzima fosforila la fructosa 6 fosfato a fructosa 1, 6 bifosfato, así como la enzima piruvato fosfato dicinasa dependiente de pirofosfato (PPD-PPi), aquí la fosfoenolpiruvato (PEP) se hidroliza y forma piruvato. Además se ha identificado la estructura primaria de la enolasa, la cual cataliza la conversión (deshidrata) de 2- fosfoglicerato a fosfoenolpiruvato (Anderson y Loftus, 2005; Loftus y col., 2005). En la amiba el piruvato es convertido en Acetil-CoA por la piruvato ferrodoxina óxido- reductasa (PFOR) por descarboxilación oxidativa, esta enzima utiliza una proteína que contiene Fe-S y ferrodoxina como aceptores de electrones (Espinosa y col., 2004). En los trofozoítos amibianos los productos finales de la degradación del piruvato dependen del grado de anaerobiosis: en condiciones aeróbicas (5% de oxígeno) se forman acetato, etanol y CO2, mientras en un ambiente anaerobio sólo se produce etanol y CO2, la formación del etanol se lleva a cabo por la enzima alcohol deshidrogenasa (ADH) a partir de acetaldehído. 9 Las enzimas involucradas en estos procesos son la piruvato sintasa y la aldehído deshidrogenasa (ALDH), así como el dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD) y dinucleótido de fosfato de nicotinamida y adenina (NADP+) vinculados con la ADH. En los trofozoítos amibianos, se ha sugerido que durante la aerobiosis los electrones son transferidos por sustratos reducidos en una vía de transportadores, que incluyen flavinas, ferrodoxinas, proteínas Fe-S y ubiquinonas donde el oxígeno molecular es reducido a H2O (Martínez-Palomo y Espinosa-Cantellano, 1998; Espinosa y col., 2004). El metabolismo de los aminoácidos parece ser el generador de ATP, ya que la glucosa en condiciones anaerobias es ineficaz para generarlo. Se han encontrado enzimas que degradan a los aminoácidos aspartato, asparagina, triptofano, treonina y metionina, en piruvato o 2-oxobutanoato que al degradarse pueden generar ATP, mismo que puede obtenerse también a través de la enzima PFOR y Acetil-CoA sintasa. El metabolismo de los ácidos nucleicos es poco conocido, sin embargo aunque los trofozoítos carecen de síntesis de purinas, pueden ser capaces de sintetizar pirimidinas a través de una vía inusual ya que en estudios recientes se han identificado dos enzimas catabólicas: dihidropirimidina deshidrogenasa y dihidropirimidasa de timina y uracilo (Anderson y Loftus, 2005). La amiba carece de glutatión o de enzimas dependientes de glutatión, ésta molécula es importante en eucariontes para protección contra la toxicidad del oxígeno. Se ha identificado un gen que codifica una proteína homóloga en procariontes, la disulfido óxido- reductasa que une dinucleótido de flavina y de adenina (FAD) como un cofactor y puede reducir alkil hidroperóxidos y peróxido de hidrogeno (H2O2) a través de NADH o NADPH como protección contra el daño de agentes oxidantes. Recientemente se ha identificado una proteína llamada Eh29 que tiene la función de catalasa que descompone el H2O2 en agua (Martínez-Palomo y Espinosa-Cantellano, 1998; Nixon y col., 2002). 10 1.8 Epidemiología La amiba E. histolytica es cosmopolita, no obstante, se presenta con mayor frecuencia en las regiones tropicales y subtropicales. La prevalencia de este parásito es elevada en el mundo, excepto China. Este parásito infecta en todo el mundo alrededor de 50 millones de personas al año, de las cuales 38 millones desarrollan colitis amibiana o absceso hepático, lo que provoca entre 40,000 y 100,000 muertes al año, por lo que se le considera como la tercera causa de muerte entre las enfermedades parasitarias en el mundo, solamente superada por la malaria y la esquistosomiasis (Walsh, 1986). La amibiasis es un problema social y de salud importante en ciertas áreas de África, Asia y América Latina, generado por inadecuadas condiciones sanitarias, mal nutrición y la presencia de cepas altamente virulentas de E. histolytica, que se pueden combinar para sostener una alta incidencia de amibiasis intestinal y abscesos hepáticos amibianos (Martínez-Palomo, 1987). La propagación de esta enfermedad, también está relacionada con la migración de personas de una zona endémica aotra con menos incidencia y puede favorecerse por tratamientos terapéuticos inadecuados. Igualmente, puede haber alta incidencia en ciertos grupos de inmigrantes, y pueden ocurrir brotes epidémicos en instituciones escolares y psiquiátricas (Martínez-Palomo y Martínez-Baez, 1983). En estudios seroepidemiológicos realizados en 1974, en 776 niños de la Ciudad de México, se reportó una seropositividad de 3.9 %. En sueros de 20 x 103 adultos, de 46 regiones del país, el promedio de seropositividad fue de 5.9 % (Gutiérrez, 1986). En una revisión seroepidemiológica de los 32 estados de la República Méxicana, con 68 x 103 muestras de individuos con representación poblacional, en términos de edad, estatus socioeconómico y origen urbano o rural, en los anticuerpos anti-E. histolytica detectados 11 por hemaglutinación indirecta, la seroprevalencia fue 8.46% de la población total; en la región del Pacífico Sur fue de 9.80% y en la Noroeste de 6.26%. Se presentó una mayor prevalencia en zonas rurales (9.86%) que urbanas (7.93%) y la incidencia fue mayor durante la primera década de vida principalmente entre los 5 y 9 años de edad, y en mujeres (9.34%) que en hombres (7.09%). Fue evidente la relación entre la alta prevalencia y los niveles de educación y socioeconómicos, así como las inadecuadas condiciones de la vivienda (Caballero y col., 1994). En México se estima que la amibiasis afecta a 27% de la población y ocupa el quinto lugar como causa de muerte (Gutiérrez, 1986). La susceptibilidad del humano es muy importante, así, hay personas asintomáticas o con síntomas, y otras más que pueden curarse espontáneamente. Los portadores asintomáticos, pudieron haber estado infectados con la amiba que presenta morfología similar a la E. histolytica, la llamada E. dispar, pero que se considera no patogénica. Diversas investigaciones indican una diferencia tanto genética como antigénica entre estas dos especies (Ravdin, 1995). Hay pocos estudios epidemiológicos relacionados con la incidencia de amibiasis invasiva. En México la invasión intestinal se ha registrado en un rango de 2.2% a 6.2%, en pacientes con diarrea o disentería aguda (Muñoz y col., 1986). La frecuencia de absceso hepático amibiano (AHA) se puede obtener clínicamente y por el laboratorio o a través de estudios post-mortem y se ha evidenciado en 2% en adultos con amibiasis en áreas endémicas (Sepúlveda, 1982 a b). Al tabular la distribución geográfica mundial de pacientes con AHA, se concluye que la mayor prevalencia se ubica en el Este y Sureste de África, Sureste de Asia, México y la región Oeste de Sudamérica (Elsdon, 1968). 12 1.9 Amibiasis La Organización Mundial de la Salud, define a la amibiasis como la condición de portar el parásito E. histolytica con o sin manifestaciones clínicas (WHO Bulletin, 1969). La amibiasis puede ser clasificada como asintomática y sintomática, con o sin evidencia de invasión tisular (Ortíz-Ortiz, 1994). La amibiasis puede ser catalogada además como intestinal y extraintestinal. 1.10 Amibiasis Intestinal La amibiasis intestinal se presenta en cuatro formas clínicas de invasión, generalmente agudas: (a) disentería o diarrea sanguinolenta, (b) colitis amibiana fulminante, (c) apendicitis amibiana y (d) ameboma del colon. Los síndromes diarreicos o disentéricos son los más frecuentes en los casos de amibiasis intestinal invasiva y se presentan en casi el 90% de ellos. Las manifestaciones clínicas van a depender de la localización de la lesión en el intestino grueso, que es principalmente en el rectosigmoides, y se caracterizan por evacuaciones sanguinolentas, cólicos y tenesmo rectal, que pueden desaparecer rápidamente con tratamiento (Martínez- Palomo, 1993; Brooks y col., 1999). La colitis amibiana fulminante, en contraste con el síndrome disentérico, es extremadamente severa y evoluciona rápidamente con lesiones ulcerosas necróticas en amplias áreas del colon, hay evacuaciones abundantes y materia fecal con sangre o sólo sangre. Las manifestaciones clínicas son: malestar abdominal, anorexia, náusea, fiebre alta y deshidratación que puede llevar a shock. Una complicación común es la peritonitis, por la perforación de la pared intestinal (Martínez-Palomo, 1993; Brooks y col., 1999). 13 La apendicitis amibiana se manifiesta por dolor agudo, rigidez en el cuadrante inferior del abdomen, fiebre, taquicardia y náusea; en algunos casos hay úlceras en la región cecal. Si hay diarrea, puede haber sangre (Martínez-Palomo, 1993; Brooks y col., 1999). El ameboma se presenta como una formación nodular, de consistencia relativamente firme con cubierta externa fibrosa, bajo una mucosa edematizada. En la zona granular intermedia hay eosinófilos, linfocitos y algunos fibroblastos, con uno o varios abscesos internos que contienen tejido necrótico y trofozoítos. Puede observarse sólo o formar múltiples masas en el segmento vertical del intestino grueso, así como en la región cecal, en el rectosigmoideo en el colon ascendente y en el ángulo hepático y esplénico del colon. Se manifiesta por disentería, dolor abdominal y una masa palpable en el área abdominal (Martínez-Palomo, 1993; Brooks y col., 1999). 1.11 Amibiasis Extraintestinal En la amibiasis extraintestinal se pueden infectar, entre otros órganos, el hígado, el pulmón, el cerebro y la piel. El absceso hepático amibiano (AHA) resulta de la migración de trofozoítos de E. histolytica del colon al hígado por el sistema porta los cuales se alojan en las ramas más pequeñas de la porta o en las venas intralobulillares, se producen trombos compuestos por filamentos de fibrina y leucocitos, las amibas producen necrosis lítica de la pared vascular, penetran en los sinusoides periportales y se dirigen al interior de los lobulillos. En esta etapa hay reacción inflamatoria y se produce la necrosis lítica del tejido hepático con infiltración leucocitaria, al aumentar las lesiones se origina el denominado AHA. Inicialmente son pequeños, de unos milímetros de diámetro, de color blanco y consistencia 14 sólida, crecen con rapidez y forman un líquido de color rojo oscuro, compuesto por células hepáticas autolisadas, glóbulos rojos, grasa y otros elementos tisulares. El AHA puede ser único o múltiple, agudo o crónico (Brooks y col., 1999; Salles y col., 2003). El AHA se ha reportado en pacientes de todas las edades, predomina en adultos de entre 20 y 60 años, hay una marcada preferencia por el lóbulo derecho del hígado y es más frecuente en varones que en mujeres (Martínez-Palomo, 1993). 1.12 Factores de Virulencia Los mecanismos citopatogénicos de la virulencia de E. histolytica, han sido bien estudiados in vivo e in vitro y dependen de la capacidad de reconocimiento de sus receptores. El primer paso de este proceso es la penetración a la mucosa intestinal por acción de la hialuronidasa, que facilita el paso a la célula blanco. Investigaciones recientes señalan que la matriz extracelular juega un papel importante en la amiba, ya que al degradarla, los trofozoítos activan vías de señalización, útiles para el subsecuente ataque a la célula blanco (Meza, 2000; Moncada y col., 2005). La adherencia de los trofozoítos a las células, desempeña un papel clave en la patogenicidad de E. histolytica así como en la citólisis mediada por contacto y la fagocitosis, por lo que se le considera como un primer paso, obligatorio para el proceso de colonización e infección (McCoy y Mann, 2005). La adherencia está mediada por una molécula de superficie, la lectina N-acetil-D-galactosamina (GalNac) que es una glicoproteína heterodímera de 260 kDa, compuesta por dos subunidades una pesada de 170 kDa y otra ligera de 35 kDa (Petri Jr. y col., 2002). Se ha demostrado que la lectina está involucradaademás de la adhesión a la célula blanco en la citotoxicidad, resistencia a 15 complemento, inducción del enquistamiento y generación de la pared del quiste. Hay otra lectina de 220 kDa y una adhesina de 112 kDa (Frederick y Petri, 2005). Después del contacto con la amiba y antes de ser destruida, en la célula blanco aumenta irreversiblemente el calcio, en el parásito este aumento es discreto. El calcio se requiere para el movimiento de microfilamentos y la formación de canales celulares (Lynch y col., 1982). La citólisis de la célula blanco se logra con la participación activa de otros elementos tales como la fosfolipasa A, enzima que al hidrolizar diacil-fosfolípidos, genera lisomonoacilfosfolípidos y es tóxica para las membranas celulares (Long y col., 1985). Otra enzima amibiana es la colagenasa que digiere colágena tipos I y III (Tsutsumi y col., 1992). Las proteasas de cisteína son las más abundantes, se encuentran en la superficie de la amiba y son enzimas proteolíticas que tienen como sustrato a colágena tipos I, IV y V, laminina, fibronectina (Avila y Calderón, 1993) y hemoglobina (Serrano y col., 1998). El amebaporo que se inserta en la membrana del hospedero, es un péptido de 77 aminoácidos con una masa molecular de 8.244 kDa, y 6 residuos de cisteína que le dan una estructura rígida. En el extremo C-terminal los residuos de lisina e histidina son críticos para la actividad formadora de poros. Hay tres isoformas de amebaporos, designados como amebaporo A, B y C, el A representa el 80% (Leippe, 2000; Leippe y col., 2005). 2. Inmunología de la Amibiasis 2.1 Inmunidad Innata En la amibiasis la primera línea de defensa es la pared intestinal, la interacción del 16 trofozoíto con las células del epitelio intestinal activan la respuesta inmune innata donde se inicia una inflamación que causa un daño al tejido invadido. En un modelo de colitis amibiana en ratones SCID-HU-INT, los trofozoítos utilizan los factores de transcripción del factor nuclear (NF)-κB, para regular genes involucrados en la respuesta inflamatoria, este factor controla la expresión de los genes de las citocinas proinflamatorias: IL-1(α y β), IL- 6, IL-8 y TNF-α y antiinflamatorias. Cuando se bloquea con un antisentido la subunidad p65 del factor nuclear disminuyen los niveles de IL-Iβ e IL-8, así como el infiltrado de células inflamatorias y la permeabilidad intestinal, esto señala la importancia de estas citocinas en la respuesta inflamatoria a la infección amibiana (Stanley, 2001). En cocultivos de trofozoítos en contacto directo con células epiteliales humanas, también se liberan IL-8, GMCSF, IL-1α e IL-6. La IL-8 también puede ser secretada sin contacto directo con la amiba, esto quiere decir que su liberación puede estimularse, por proteínas solubles amibianas o productos secretados por el parásito. Cuando la amiba daña a la célula, esta libera IL-1α, posteriormente migra a zonas distales de la lesión e induce la producción de IL-8; la respuesta inflamatoria ocasiona daño a la mucosa lo que facilita la invasión amibiana (Chaudhry y Petri, 2005). En intestino, la inflamación puede medirse indirectamente por los niveles de mieloperoxidasa (enzima participante en el proceso de fagocitosis) (Stanley, 2001). Otro mecanismo involucrado en la inflamación es la producción de los metabolitos de ácido araquidónico principalmente leucotrienos (LT) C4 (LTC4) y B4 (LTB4) en mayor concentración y prostaglandinas (PG) E2 (PGE2). En el daño de células epiteliales del intestino hay formación de ciclooxigenasa (COX) principalmente COX-2, enzima participante en la vía de producción de prostaglandinas, la producción de COX-2 también 17 es inducida por la amiba en macrófagos polimorfonucleares durante la formación del absceso hepático amibiano (AHA) y puede ser regulada por algunas citocinas liberadas por estos macrófagos activados como IFN-γ y TNF-α (Sánchez y Talamás, 2002; Sánchez y col., 2004). En modelos animales, por ejemplo en los ratones SCID-HU-INT infectados con trofozoítos amibianos, se incrementan la COX-2 y la PGE2 no solo en zonas de lesión, por lo que se ha propuesto que la IL-1 de las células dañadas estimula la producción de COX-2 en otros sitios. En estos ratones, el infiltrado de neutrófilos está mediado en parte por la PGE2, producida por COX-2, por lo que se considera un mediador inflamatorio quimioatrayente además de tener un efecto en la secreción de citocinas provenientes de linfocitos TH1 y TH2 (Sánchez y Talamás, 2002; Sánchez y col., 2004). La PGE2 está involucrada en la supresión de la producción de IL-1 y del TNF-α así como en la regulación de la expresión de óxido nítrico sintetasa inducible (iNOS) de una manera dosis dependiente (Chaudhry y Petri, 2005). Los neutrófilos participan en la resistencia del hospedero contra diferentes infecciones; al ser activados, secretan una gran gama de moléculas que incluye especies reactivas de oxígeno y enzimas proteolíticas con las que dan muerte a los microorganismos invasores y causan un daño local al tejido. Estas células son importantes en la inflamación y son atraídas al sitio de la lesión, por citocinas y quimiocinas producidas por el estímulo amibiano (IL-8 e IL-1β). En estudios in vitro, los neutrófilos pueden contribuir al daño de hepatocitos y células epiteliales, ya que al agregarlos a los cocultivos de líneas celulares con trofozoítos aumenta el daño de estas células posiblemente por la lisis y liberación de mediadores inflamatorios de los neutrófilos inducida por los trofozoítos. En la patogenia de la colitis amibiana se ha propuesto que los neutrófilos localizados en los bordes de las 18 úlceras amibianas incrementan la destrucción epitelial y la permeabilidad (Sim y col., 2004; Asgharpour y col., 2005). En modelos animales de infección hepática o intestinal, los neutrófilos pueden eliminar a los trofozoítos si son estimulados con IFN-γ y TNF-α. Los macrófagos activados por IFN-γ, TNF-α y CSF-1, muestran una potente actividad amebicida dependiente de contacto; esta actividad puede estar mediada por mecanismos oxidativos (especies reactivas de oxígeno) y no oxidativos (proteasas citolíticas), aunque se ha demostrado que la principal molécula involucrada en la citotóxicidad es el óxido nítrico (NO). El TNF-α producido por macrófagos activados aumenta la citotóxicidad dependiente de NO contra E. histolytica, elevándose los niveles de expresión del gen óxido nítrico sintetasa inducible (iNOS) (Cantellano y Martínez, 2000). La lectina amibiana induce la expresión del gen del TNF-α, los niveles altos de esta citocina promueven la actividad amebicida y los bajos, estimulan granulocitos y crecimiento de fibroblastos, inhiben la migración de neutrófilos y promueven su adherencia con el consecuente daño al tejido, también se le atribuyen la acumulación de macrófagos y leucocitos así como la diferenciación epiteloide y la formación de granulomas, efectos que pueden contribuir al desarrollo del absceso hepático amibiano (AHA). En modelos animales, durante las primeras horas (6h) de la formación del absceso hepático amibiano experimental se apoya la propuesta anterior, ya que en el foco inflamatorio hay producción de TNF-α y se incrementa el número de células mononucleares con el progreso de la infección (Maldonado y col., 2005). La capacidad citotóxica de los macrófagos se reduce en la amibiasis hepática aguda y las amibas por medio de sus productos modulan en esta célula la formación de NO, H2O2 y HO por lo que inhiben el estallido respiratorio. Aún no está definido el mecanismo por el 19 cual los macrófagos distales al sitio de infección se pueden activar ya que se ha sugerido que la inactivación de estas células es principalmente local, por exposición directa a los trofozoítos amibianos y/opor sus productos (Cambell y Chadee, 1997). Los componentes solubles amibianos, junto con la activación de macrófagos y el estallido respiratorio (cuando aún no ha sido inhibido) pueden contribuir a la respuesta inflamatoria aguda inicial asociada al daño tisular. Los receptores Toll o TLR tienen un papel esencial en la inmunidad innata principalmente en el reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) y en el desencadenamiento de la inmunidad innata y adaptativa. Estos receptores activan las vías de transducción y señalización para inducir la expresión de una variedad de genes que promueven la respuesta inflamatoria (citocinas, sustancias inflamatorias y quimiocinas), así como el reclutamiento y la activación de macrófagos, células dendríticas y T reguladoras CD4+ CD25+ (Campos y Jarillo, 2005; Maldonado y col., 2005). Las lectinas, lipofosfoglicano (LPG) y lipofosfopeptidoglicano (LPPG) de la amiba pueden ser reconocidas e inducir una respuesta inmune innata a través de los TLRs. El TLR2 puede contribuir a la invasión y daño hepático o eliminar el parásito principalmente por la activación de macrófagos y la producción de NO. La LPPG de la amiba puede regular la expresión de TLR2 e inducir la liberación de IL-10. Los TLR2 y 4 pueden interactuar para reconocer combinaciones de PAMPs de ciertos patógenos. Al interaccionar LPPG de amibas con TLR2 y TLR4 de macrófagos de ratón se activa (NF)-κB y hay liberación de TNF-α e IL-6 (Maldonado y col., 2005). En ratones con macrófagos TLR2-/- (ausente) o TLR4d/d (deficiente) disminuyó la producción de IL-6 y TNF-α, lo que señala a la LPPG de la amiba como un patrón molecular con funciones inmuno-estimulatorias para la activación 20 de (NF)-κB y la síntesis de TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12 e IL-10, todos ellos componentes críticos de una respuesta inmune innata. Además se ha demostrado que la LPPG es agonista con TLR2 y TLR4 sugiriendo que dentro de los procesos de interacción hospedero-amiba, la LPPG participa en la activación de la respuesta inmune innata induciendo la síntesis y secreción de mediadores solubles, los cuales regulan la respuesta inmune adaptativa (Campos y Jarillo, 2005; Maldonado y col., 2005). E. histolytica secreta además, un factor inhibidor de la locomoción de monocitos denominado FILM, que tiene un peso molecular de 1000 kDa y la capacidad de inhibir el estallido respiratorio de los neutrófilos humanos (Rico y Kretschmer, 1997). El complemento es un componente importante de la inmunidad innata. Las amibas son capaces de activar el complemento a través de las vías de la lectina y alterna, aún así las amibas patógenas son capaces de resistir el daño del complejo de ataque a la membrana (CAM) y solo las cepas no patógenas (E. dispar) son susceptibles a la lisis mediada por el complemento (Campos y Jarillo, 2005). Se ha mencionado que la patogenicidad de E. histolytica está relacionada con la capacidad de evadir la inmunidad innata, y entre los componentes de superficie, involucrados en la destrucción del tejido se proponen además de la lectina a la proteína rica en serina, pero principalmente a dos moléculas de superficie la LPG y LPPG que son potentes inmunógenos (Maldonado y col., 2005). La LPPG esta constituida por 75 a 85% de carbohidratos, 8% de proteínas, 2 a 5% de lípidos y 1% de fosfatos, es altamente inmunogénica, ya que se han detectado anticuerpos (Ab) contra esta molécula en pacientes diagnosticados con AHA y en calostro de madres infectadas con amibas; además, tiene influencia en la síntesis del TNF-α, IL-12 e IL-8 de monocitos humanos. La caracterización 21 inmunoquímica del polisacárido de la LPPG revela diferencias entre cepas virulentas y no virulentas de E. histolytica, la LPPG es similar a la LPG de Leishmania que es un PAMP con capacidad inmuno-estimulatoria (Campos y Jarillo, 2005; Maldonado y col., 2005). 2.2 Inmunidad Humoral La respuesta inmune humoral en los pacientes, se identifica por la presencia de anticuerpos específicos circulantes, generalmente, una semana después de los primeros síntomas, aunque también se pueden producir en la amibiasis asintomática. Indicadores sensibles de una respuesta humoral local son los coproanticuerpos, como se ha comprobado en diferentes estudios realizados en individuos con amibiasis intestinal (Martínez-Palomo, 1993). Se ha observado presencia de coproanticuerpos de la clase IgG, IgA e IgM, por hemaglutinación indirecta (HI) en 80% de pacientes con disentería amibiana y únicamente en 2% de los controles y en 4% de los pacientes con infección intestinal no amibiana (Martínez-Palomo, 1993). Las cifras de coproanticuerpos de los pacientes con disentería amibiana, disminuyeron después de 3 semanas hasta un 55%, lo que coincidió con el incremento en los Ab séricos, cuyos títulos no se correlacionan con la severidad de la enfermedad; esto sugiere que la inmunidad adquirida contra la amibiasis tiene una mayor correlación con la respuesta inmune de la mucosa (Miller y Petri Jr., 2002). Los anticuerpos circulantes para E. histolytica se pueden detectar una semana después de los primeros síntomas, la clase IgM es la que se presenta en el contacto inicial con el parásito (Martínez-Palomo y Espinosa-Castellano, 1998) posteriormente en humanos predomina la IgG y principalmente la subclase IgG2. La actividad de la IgA secretoria antiamibiana es uno de los mecanismos del hospedero 22 para impedir la adherencia de los trofozoítos al epitelio intestinal. Sin embargo se ha demostrado que estos últimos degradan rápidamente la IgA secretoria humana por medio de las proteasas de cisteína como se ha visto en leche humana, calostro, saliva y bilis. Los pacientes con AHA tienen una vigorosa respuesta de anticuerpos séricos contra la amiba, pero esta aparición de anticuerpos no tiene efecto sobre el curso de la enfermedad ya que esta forma clínica tiene un alto índice de mortalidad si no hay un tratamiento adecuado. Estudios recientes mostraron que anticuerpos anti-amiba provenientes de pacientes con AHA, evitaron el desarrollo de esta patología, al ser administrados parenteralmente en ratones sin linfocitos B y T involucrados con E. histolytica (Cambell y Chadee, 1997). El suero inmune de animales puede inhibir la eritrofagocitosis de E. histolytica y su efecto citotóxico en cultivo celular; a dosis elevadas, este suero lisa los trofozoítos de E. histolytica. En condiciones normales, la amiba elude los anticuerpos por medio de la distribución de sus antígenos de superficie con la formación de capping y el uroide (Martínez-Palomo y Espinosa-Castellano, 1998). El sistema inmune humoral da poca protección contra la amibiasis, pues se ha observado un alto índice de reinfección, en personas con títulos elevados de anticuerpos (Martínez-Palomo y Espinosa-Castellano, 1998). 2.3 Inmunidad Celular La inmunidad mediada por células, como respuesta del hospedero a la infección amibiana, se ha demostrado en humanos y en modelos animales. Estudios realizados en animales de experimentación, indican que los mecanismos de inmunidad celular pueden limitar o prevenir la formación del absceso hepático amibiano; así, se ha visto que la 23 inmunización con proteínas totales del parásito, induce protección contra la inoculación intrahepática de trofozoítos virulentos de E. histolytica. Al inocular trofozoítos por vía intracecal en ratones C3H como un modelo de colitis amibiana, se genera una respuesta dañina de linfocitos T CD4+. Asimismo en estos ratones las células de los nódulos linfáticos mesentéricos y del ciego, incrementaron los niveles de IL-4 e IL-13. Un anticuerpo monoclonal anti-CD4+ se usó para reducir los linfocitos T CD 4+ y así evaluar su papel en la infección amibiana. El porcentaje inicial de la infección enratones con T CD4+ disminuidos fue menor en relación con el control, presumiblemente porque la respuesta inmune innata se encontraba intacta. Sin embargo en estos ratones disminuye el número de amibas y antígenos fecales y en los cortes histológicos hay mejoría comparado con el ratón infectado como control, por consiguiente en este caso la respuesta adquirida de células T CD4+ se ve deteriorada y probablemente el daño directo del intestino es por la producción de las citocinas IL-4 e IL-13 (Cambell y Chadee, 1997; Chaudhry y Petri Jr., 2005). Durante la amibiasis invasiva, el estudio de la respuesta inmune celular muestra una disminución de los linfocitos T CD4+ y un aumento de los linfocitos T CD8+, la disminución in vitro de la proliferación de los linfocitos T contra antígenos amibianos indica una supresión de la respuesta inmune. La respuesta de Th1 esta mediada por IL-2, TNF-α e IFN-γ, y la respuesta de Th2 es mediada por la producción de IL-4, IL-5, IL-6, IL-9 e IL-10. Se ha sugerido que diferentes epitopes de la amiba pueden estimular una respuesta Th2 (supresiva) o una Th1 (protectora) (Bansal y col., 2005). Durante la formación del absceso hepático amibiano (AHA), en las células presentadoras de antígenos (APC) se reduce esta capacidad de presentar antígenos 24 amibianos a células T CD4+. Esto puede ocurrir por la reducción en la expresión de las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad II (MHC II) (Cambell y Chadee, 1997). Se ha observado que macrófagos vírgenes de roedores, al ser tratados con proteínas solubles amibianas (SAP) o productos secretados por los trofozoítos inducen una disminución en la expresión de moléculas de superficie de estas células inducidas por IFN- γ, citocina que promueve la expresión de la molécula MHC II. Asimismo el IFN-γ puede ser inhibido por IFN-α y β, LPS y PGE2, en el caso particular la PGE2 inhibe tanto la expresión del MHC II como la transcripción del gen, lo que limita la capacidad cooperadora de los macrófagos (Cambell y Chadee, 1997; Sánchez y Talamás, 2002). Las células T son importantes productoras de citocinas activadoras de macrófagos y pueden ser directamente citotóxicas para las amibas por un mecanismo aún desconocido. En pacientes y animales de experimentación con AHA las células T presentan una disminución en la proliferación al ser estimuladas con mitógenos (fitohemaglutinina y concanovalina A) (Cambell y Chadee, 1997). La proteína amibiana de superficie de 220 kDa estimula en ratón la producción de IL-4 e IL-10 y suprime la mitogénesis de células T (Talamás, 1995). En la amibiasis invasiva hay un efecto supresor en suero que inhibe la producción de IL-2 y por consiguiente la respuesta Th1, lo que puede atribuirse parcialmente a la producción de PGE2 (Zambrano y col., 2002). Las citocinas TGF-β, IL-4 e IL-10, ejercen un efecto inhibitorio sobre los macrófagos y la respuesta Th1 durante la amibiasis (Cambell y Chadee, 1997). 25 2.4 Tratamiento Los amebicidas han contribuido grandemente en la disminución de la morbilidad y mortalidad de la enfermedad. De acuerdo a su sitio de acción los medicamentos antiamibianos pueden clasificarse en tres grupos: luminal, tisular y mixto. Dentro de los de acción luminal están la diiodohidroxiquinoleina, el furoato de diloxanida y la paramomicina; los de acción en tejidos incluyen a la emetina y la dihidroemetina, que actúan tanto en la pared intestinal como en el hígado y otros tejidos, y a la cloroquina que sólo actúa en el hígado. Uno de los grupos principales de medicamentos que actúan en el lumen y en los tejidos, es el de los nitroimidazoles, que incluyen al metronidazol, tinidazol y ornidazole (Martínez-Palomo, 1993). El metronidazol es el agente farmacológico más ampliamente usado en la amibiasis. El nombre químico del metronidazol es 1-(2-hidroxietil)-2-metil-5-nitroimidazol, es un compuesto heterocíclico con un grupo nitro en su estructura molecular, que le da la importancia médica. Tiene acción antimicrobiana en una gran variedad de patógenos procariontes y eucariontes anaerobios como: Trichomonas vaginalis, Giardia lamblia y E. histolytica (Bartlett, 1981). El metronidazol se absorbe rápidamente en el organismo, se difunde con gran facilidad lo que incluye al sistema nervioso central, alcanza el nivel máximo de concentración una hora después de ingerirlo y su vida media es de ocho horas. El metronidazol puede permanecer en los órganos reproductores de la mujer, la próstata y las vesículas seminales del hombre (Dobias y col., 1994). Después de la hidroxilación y oxidación, los metabolitos de este medicamento se eliminan principalmente por vía renal y de 6 a 15% por las heces (Anderson, 1981). Los metabolitos también se pueden detectar en otros fluidos corporales como líquido seminal, secreciones vaginales, bilis, sudor, saliva y leche humana (Dobias y col., 1994). El mecanismo de acción del metronidazol (Figura 4), comprende cuatro etapas consecutivas: a) entrada a la célula blanco, b producto o los productos reducidos y d) liberación de los productos finales inactivos (Müller, 1983). Figura 4: Etapas del mecanismo de acción del metronidazol ( La entrada de este medicamento es por un proceso activo de difusión y en el interior de la célula blanco el grupo nitro de esta molécula se reduce por la acción de una proteína líquido seminal, secreciones vaginales, bilis, sudor, saliva y leche humana (Dobias y El mecanismo de acción del metronidazol (Figura 4), comprende cuatro etapas consecutivas: a) entrada a la célula blanco, b) activación reductiva, c) efecto tóxico de producto o los productos reducidos y d) liberación de los productos finales inactivos Figura 4: Etapas del mecanismo de acción del metronidazol (Modificado de Müller, 1983). La entrada de este medicamento es por un proceso activo de difusión y en el interior de la célula blanco el grupo nitro de esta molécula se reduce por la acción de una proteína 26 líquido seminal, secreciones vaginales, bilis, sudor, saliva y leche humana (Dobias y El mecanismo de acción del metronidazol (Figura 4), comprende cuatro etapas reductiva, c) efecto tóxico del producto o los productos reducidos y d) liberación de los productos finales inactivos Müller, 1983). La entrada de este medicamento es por un proceso activo de difusión y en el interior de la célula blanco el grupo nitro de esta molécula se reduce por la acción de una proteína metabólica, la ferredoxina de bajo potencial redox, sie electrón (Samuelson, 1999). Figura 5: Metronidazol normal ácido (II) (Modificado de Anderson, 19 El metronidazol puede dar origen a varios metabolitos (Figura 5), siendo los principales productos de origen oxidativo (2-hidroxietil)-2-hidroximetil su grupo hidroxietil [1-(2 mantienen su grupo nitro intacto y su actividad biológica es baja Cuando se reduce el grupo nitro (Figura 6) se forma intermediarios heterocíclicos, en los que el radical nitroso se puede reducir a hidroxilamina (R-NHOH) o a una amina (R la ferredoxina de bajo potencial redox, siendo el grupo nitro el aceptor del electrón (Samuelson, 1999). Figura 5: Metronidazol normal (M). Metabolitos de origen oxidativo del metronidazol: alcohol Anderson, 1981). El metronidazol puede dar origen a varios metabolitos (Figura 5), siendo los principales gen oxidativo el alcohol obtenido por hidroxilación de su grupo metil [1 hidroximetil-5-nitroimidazol] y el ácido obtenido por la hidroxilación de (2-carbiximetil)-2-metil-5-nitroimidazol], estos dos compuestos mantienen su grupo nitro intacto y su actividad biológica es baja (Anderson, 1981) Cuando se reduce el grupo nitro(Figura 6) se forma un radical nitroso y se forman otros intermediarios heterocíclicos, en los que el radical nitroso se puede reducir a hidroxilamina NHOH) o a una amina (R-NH2); estos dos últimos compuestos interaccionan con el 27 ndo el grupo nitro el aceptor del . Metabolitos de origen oxidativo del metronidazol: alcohol (I) y El metronidazol puede dar origen a varios metabolitos (Figura 5), siendo los principales el alcohol obtenido por hidroxilación de su grupo metil [1- do por la hidroxilación de , estos dos compuestos (Anderson, 1981). un radical nitroso y se forman otros intermediarios heterocíclicos, en los que el radical nitroso se puede reducir a hidroxilamina ); estos dos últimos compuestos interaccionan con el DNA y las proteínas, entre otros, por lo inactivos, constituidos por fragmentos de la molécula de metronidazol, son la acetamida (c) y el ácido 2-hidroxietil oxamico (d) (Müller, 1983; Dobi 2000). I II Figura 6: (I) Reducción del grupo nitro del metronidazol: a) pasos de la reducción del grupo nitro b) reoxidación del radical nitroso libre por metronidazol: c) acetamida d) ácido 2 Algunas cepas de E. histolytica, porque inhiben enzimas que reducen el metronidazol co por su capacidad para incrementar a la superóxido dismutasa y la peroxiredoxina, participan también las EhPgp (glicoproteínas P de membrana), que actúan como una bomba DNA y las proteínas, entre otros, por lo que son mutagénicos. Los productos finales inactivos, constituidos por fragmentos de la molécula de metronidazol, son la acetamida (c) hidroxietil oxamico (d) (Müller, 1983; Dobias y col., 1994; I II Figura 6: (I) Reducción del grupo nitro del metronidazol: a) pasos de la reducción del grupo nitro b) reoxidación del radical nitroso libre por oxígeno. (II) Productos finales de la molécula del metronidazol: c) acetamida d) ácido 2-hidroxietil oxamico (tomado de Müller, 1983). E. histolytica, han presentado resistencia al metronidazol, ya sea porque inhiben enzimas que reducen el metronidazol como ferredoxina y flavin reductasa o por su capacidad para incrementar a la superóxido dismutasa y la peroxiredoxina, participan también las EhPgp (glicoproteínas P de membrana), que actúan como una bomba 28 que son mutagénicos. Los productos finales inactivos, constituidos por fragmentos de la molécula de metronidazol, son la acetamida (c) 1994; Idkaidek y Najib, I II Figura 6: (I) Reducción del grupo nitro del metronidazol: a) pasos de la reducción del grupo nitro b) inales de la molécula del Müller, 1983). han presentado resistencia al metronidazol, ya sea mo ferredoxina y flavin reductasa o por su capacidad para incrementar a la superóxido dismutasa y la peroxiredoxina, participan también las EhPgp (glicoproteínas P de membrana), que actúan como una bomba 29 molecular dependiente de ATP, para disminuir la concentración intracelular del fármaco (Wassmann y Bruchhaus, 2000; Orozco y col., 2002). Investigaciones sobre el efecto del metronidazol en microorganismos susceptibles, indican que sus metabolitos son mutagénicos, por lo que cabe la posibilidad de que en humanos tenga estos efectos. En animales de experimentación, como ratas y ratones, se ha observado embriotoxicidad, teratogenicidad y carcinogenicidad. Estos efectos como ya se mencionó se atribuyen a los metabolitos que son capaces de unirse al DNA, a las proteínas y de inhibir macromoléculas. No está del todo claro el papel de los metabolitos en la célula blanco, debido a que en presencia de altas dosis ésta se desintegra, lo que sugiere que estos metabolitos pueden actuar sobre varios componentes de la célula y no solo en las proteínas que están cerca del DNA (Roe, 1983; Gómez y col., 2004). Los efectos colaterales ó tóxicos del metronidazol, conllevan frecuentemente a la interrupción del tratamiento, por lo que continúa la búsqueda de nuevos medicamentos para el tratamiento de la amibiasis. Al respecto se han realizado estudios para analizar el efecto del zinc sobre la actividad de E. histolytica (Vega y Carrero, 1997; Vega y col., 1999). El zinc es importante para más de 300 enzimas que lo requieren para sus funciones metabólicas, incluyendo a las responsables de la replicación del DNA y la síntesis de RNA y proteínas, así como de la transcripción de genes (Vallee y Falchuk, 1993). El zinc es uno de los micronutrientes de mayor importancia en el organismo y su ingestión o absorción insuficientes, se asocian con retraso del crecimiento, anorexia, dermatitis, diarrea, alopecia, alteración en la capacidad reproductiva y del sistema inmune (Reinhold y col., 1999). Este metal es muy importante para el sistema inmune, porque su deficiencia causa un desbalance entre las funciones de Th1 y Th2, ya que la producción de IFN-γ e IL-2 (productos de Th1) disminuye, mientras la producción de IL-4, IL-6 e IL-10 30 (productos de Th2) no se encuentra afectada (Prasad y Kucuk, 2002). La capacidad inmunomoduladora y farmacológica del zinc se ha usado para restaurar la función inmune dañada y algunos estudios muestran que puede estimular in vitro la secreción de citocinas de células mononucleares de sangre periférica (Wellinghausen y col., 1996). El contenido de zinc en alimentos es muy variable, abundante en carnes rojas, en algunos mariscos y el germen de los cereales. El zinc se absorbe en el intestino delgado principalmente en yeyuno e íleon, absorción que se incrementa cuando hay deficiencia orgánica. Se absorbe por difusión pasiva y por transportadores, e interfieren con este proceso el calcio, el ácido fítico y otros compuestos. El transporte en la circulación es principalmente por albúmina y transferrina (Vallee y Falchuk, 1993; Hambidge y Krebs, 2001). La penetración en la célula es por medio de transportadores de los cuales en mamíferos se conocen cuatro ZnT-1, ZnT-2 ambos involucrados en el flujo del zinc en el intestino, el riñón y los testículos, ZnT-3 en las neuronas y el ZnT-4 en las glándulas mamarias y el cerebro (McMahon y Counsins, 1998). El calcio tiene un importante papel en la patogénesis de muchos protozoos parásitos. En E. histolytica, el calcio está involucrado en la patofisiología y está presente en la actividad citolítica, pues esta actividad se puede inhibir bloqueando los canales de calcio, además se han observado cambios en el perfil de calcio en el ciclo celular y en el desarrollo de los estadios de la amiba (quiste y trofozoíto) (Sahoo y col., 2004). Se han reportado cuatro proteínas unidoras de calcio: la ATPasa transportadora del ion calcio, calmodulina (CaM), la EhCaBP1 y la EhCaBP2 (proteína unidora de calcio de E. histolytica), éstas dos últimas se localizan en gránulos intracelulares y pueden participar en la fagocitosis, control de la vía endocítica y descarga granular. La calmodulina que ya ha sido caracterizada bioquímicamente, está implicada en las siguientes funciones: activación de canales, 31 liberación de gránulos electro-densos, proliferación celular y actividad patogénica de la amiba (Sahoo y col., 2004; Chakrabarty y col., 2004). El calcio (Ca2+) es fundamental para la polimerización de la actina y miosina de los microfilamentos del citoesqueleto y de la tubulina en los microtúbulos (Carbajal y col., 1996). En E. histolytica se han caracterizado tres moléculas del citoesqueleto: 1.- Actina: a) Filamentosa (F), forma los filamentos y es la más abundante en el centro de la célula y el uroide; b) Globular (G), que está concentrada en el pseudópodo. Estas moléculas son importantes en la fagocitosis ya que son responsables del movimiento celulary de las vacuolas. 2.- Miosina II. Es una proteína fibrosa de 250 kDa que posee sitios de fosforilación de PKC de caseín kinasa II, se sitúa junto a los filamentos de actina y se ha localizado por medio de un anticuerpo (anti-miosina) con microscopía confocal de fluorescencia alrededor del uroide. 3.- Tubulina. Localizada en el sitio donde el ADN genómico contiene un ORF (del inglés Open Reading Frame) ó marco de lectura, que codifica para una proteína de 455 aminoácidos homóloga a tubulina (Guillén, 1993; Tavares y col., 2005). La actividad citolítica de la amiba depende de la dinámica e integridad del citoesqueleto, por lo que el zinc al alterar esta estructura, afecta la replicación y adherencia de la amiba y con ello su virulencia. El zinc ejerce un efecto directo en los microfilamentos y en la polimerización de la tubulina, además se ha sugerido que inhibe competitivamente algunos efectos del calcio, un elemento esencial para la actividad del ameboporo y fosfolipasas. Asimismo, este elemento participa en la dinámica del citoesqueleto, proteínas, citotoxicidad y en la lisis de la célula blanco, por lo que al antagonizar con el zinc, el calcio en la amiba inhibe funciones celulares como el movimiento, fagocitosis, endocitosis, etc. 32 Por tal efecto en el citoesqueleto, se altera la patogenicidad del parásito (Vega y Carrero, 1997; Vega y col., 1999). 33 3. Hipótesis Si con el efecto obtenido por el zinc sobre la patogenicidad del parásito, se potencializa la actividad antiamibiana de otros fármacos, entonces, la dosis terapéutica, el tiempo de administración, los efectos tóxicos y el costo disminuirían, lo que permitiría al paciente completar el esquema terapéutico con facilidad. 4. Objetivos 4.1 General • Analizar el efecto de la asociación del zinc con el metronidazol en la viabilidad y proliferación de los trofozoítos de E. histolytica. 4.2 Particulares • Mantener cultivos axénicos de trofozoítos de E. histolytica de la cepa HM1: IMSS. • Obtener una curva de proliferación y viabilidad de los trofozoítos de E. histolytica en un lapso de 96 horas. • Realizar múltiples ensayos con diferentes dosis del metal, el fármaco y la asociación de ambos. • Analizar la acción del zinc y el metronizadol en trofozoítos amibianos a las 24 horas de aplicados. 34 5. Materiales y Métodos 5.1 Preparación del medio de cultivo TYI-S-33 En 82 ml de agua bidestilada se disolvieron: 3.0 gr de Biosate Peptona (BBL 65% caseína digerida con enzimas pancreáticas y 35% extracto de levadura), 1.0 gr de dextrosa anhidra (D-glucosa anhidra); 0.2 gr de NaCl (cloruro de sodio), 0.06 gr de KH2PO4 (fosfato de potasio monobásico), 0.1 gr de K2HPO4 (fosfato de potasio dibásico), 0.1 gr de L- cisteína; 0.02 gr de ácido ascórbico (vitamina C) y 0.0023 gr de citrato de amonio férrico. Después de ajustar el pH a 6.8 con NaOH 1N, la solución se filtra en embudo Buchner con doble papel filtro (Whatman # 1) y se esteriliza a 121 °C con 15 libras de presión por 15 minutos. Finalmente el medio se suplementa con suero de bovino adulto (SBA) al 10% y una mezcla multivitaminica al 3% (Diamond y col., 1978). 5.2 Parásitos Los trofozoítos de E. histolytica de la cepa patógena HM1: IMSS, obtenidos de abscesos hepáticos amibianos de hámster (AHAH), se cultivaron en medio axénico TYI-S- 33 a 37°C durante 72 horas. Se cosecharon colocándolos en hielo durante 15 minutos y después de concentrarlos por centrifugación a 1500 rpm por 5 minutos se ajustaron a la concentración requerida para iniciar los microcultivos. 5.3 Curvas de viabilidad y proliferación Los cultivos con 5x104 trofozoítos y 5 ml de medio TYI-S-33 se colocaron siempre en condiciones de esterilidad y por duplicado en tubos de vidrio con tapa de rosca. A las 24, 35 48, 72 y 96 horas de iniciado el cultivo se determinó, al microscopio óptico, la viabilidad por la técnica de exclusión del azul tripano y el número de trofozoítos por mililitro en cámara de Neubauer. 5.4 Microcultivos Se utilizaron cajas de poliestireno de 24 pozos (Costar, Cambridge, MA), en los que se colocó medio de cultivo TYI-S-33 sólo (como control) o suplementado con dosis de zinc en el rango de 1.0 a 10 mM (1mM=250 µg de ZnSO4/ml) y metronidazol de 0.1 a 1.0 µg (1mM=171.16 µg de metronidazol/ml) o la combinación de zinc con metronidazol resuspendidos, en un volumen de 50 µl de agua desionizada. A cada pozo se le adicionaron 2.5 x 103 amibas, en fase logarítmica de crecimiento (72 h) y el volumen final de cada pozo se ajustó a 1.0 ml con medio de cultivo TYI-S-33; todo el procedimiento se realizó en condiciones de esterilidad. Las microplacas se colocaron en jarras Gas Pack, con cojinetes generadores de anaerobiosis (Anaerocult Merck, Germany) en su interior y papel aluminio en el exterior para evitar el paso de la luz. Se incubaron a 37°C por 24 horas. Al término del lapso señalado, se realizó la observación directa de los pozos de la placa con microscopio invertido, para comparar las características morfológicas de los trofozoítos amibianos controles y experimentales. Posteriormente se enfrió la placa en hielo (4°C) durante 15 minutos para inhibir la adherencia, se tomó una alícuota y en la cámara de Neubauer finalmente se determinó su viabilidad y proliferación. 5.5 Análisis estadístico Los resultados se analizaron por la prueba no paramétrica de Mann-Whitney. 36 6. Resultados 6.1 Viabilidad Durante las 72 horas de incubación, en el medio de cultivo TYI-S-33, la viabilidad de los trofozoítos de E. histolytica (n=5) se mantuvo en cifras superiores a 95% (Figura 7). Figura 7. Curva de viabilidad de E. histolytica. La viabilidad en los trofozoítos amibianos incubados durante 24 h, con dosis de metronidazol de 0.1 (84%), 0.2 y 0.4 µg (75%), fue significativamente menor (p<0.02) a la de los controles (93%). Esta diferencia (p<0.02) se mantuvo con 0.6 y 0.8 µg de metronidazol, dosis con la que se obtuvo una viabilidad de 23 y 2 % respectivamente (Figura 8). 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 24 48 72 V ia bi lid ad ( % ) Horas 37 Figura 8. Efecto del metronidazol a las 24 h sobre la viabilidad de los trofozoítos amibianos. Con 0.6 µg de metronidazol hubo pérdida de la integridad celular y se observaron algunos trofozoítos en proceso de fragmentación; la lisis se incrementó con 0.8 y 1.0 µg (Figura 9). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1 V ia bi lid ad ( % ) Metronidazol ( µµµµg/ml) Figura 9. Efecto del metronidazol (1 restos celulares (RC) (10x). En los trofozoítos tratados con dosis de 280 a 560 con 756 µg de 68% y con 1008 la obtenida con el control (93 Figura 10. Efecto del zinc a las 24 h sobre la 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 V ia bi lid ad ( % ) RRCC 40 µm . Efecto del metronidazol (1 µg) en trofozoítos amibianos, se observan redondeados y s tratados con dosis de 280 a 560 µg de zinc la viabilidad fue de 76 g de 68% y con 1008 µg de 56%, cifras significativamente inferiores (p<0.02) a la obtenida con el control (93%). Con 2800 µg, la viabilidad fue de 4% (Figura 10 . Efecto del zinc a las 24 h sobre la viabilidad de los trofozoítos amibianos. 0 280 420 504 560 756 1008 Zinc ( µµµµg/ml) 38 se observan redondeados y de zinc la viabilidad fue de 76%, %, cifras significativamente inferiores (p<0.02) a %(Figura 10). viabilidad de los trofozoítos amibianos. 1008 2800 La morfología de los trofozoítos amibianos, no se modificó en los cultivos suplementados con dosis de zinc en un rango de 280 a 1008 mostraron vacuolización, aglutinación y en algu Figura 11. Efecto del zinc (2800 algunos con fragmentación (F) Para estudiar la asociación del metal y del fármaco concentraciones que individualmente permitieron a los superior a 40%. En las amibas tratadas con 280 metronidazol la viabilidad fue de 70 y 75 de metronidazol a los cultivos con 280 y 420 significativamente (p<0.01) comparado con el control (93 29% respectivamente (Figura 12 40 µm La morfología de los trofozoítos amibianos, no se modificó en los cultivos suplementados con dosis de zinc en un rango de 280 a 1008 µg. Con la dosis de 2800 vacuolización, aglutinación y en algunos casos fragmentación (Figura 11 . Efecto del zinc (2800 µg) en trofozoítos amibianos observándose algunos con fragmentación (F) (10x). Para estudiar la asociación del metal y del fármaco se utilizaron aquellas concentraciones que individualmente permitieron a los trofozoítos amibian En las amibas tratadas con 280 µg de zinc, asociado a dosis de 0.1 ol la viabilidad fue de 70 y 75% respectivamente (p<0.01). Al adicionar 0.4 de metronidazol a los cultivos con 280 y 420 µg de zinc, la viabilidad disminuyó 1) comparado con el control (93%), obteniéndose c 29% respectivamente (Figura 12). A F 39 La morfología de los trofozoítos amibianos, no se modificó en los cultivos g. Con la dosis de 2800 µg casos fragmentación (Figura 11). observándose aglutinación (A) y se utilizaron aquellas s amibianos una viabilidad g de zinc, asociado a dosis de 0.1 y 0.2 µg de 0.01). Al adicionar 0.4 µg g de zinc, la viabilidad disminuyó obteniéndose cifras de 49 y 40 Figura 12. Efecto de la asociación del zinc con el metronidazol a las 24 h sobre la viabilidad de los trofozoítos amibianos. 6.2 Proliferación En la curva de proliferación de los trofozoítos realizado en tubos de cultivo (n=5) a partir de 1x104 amibas, se obtuvieron cifras de 41, 70 y 196 x104 parásitos a las 24, 48 y 72 horas respectivamente (Figura 13). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 0.1 0.2 0.4 V ia bi lid ad ( % ) Metronidazol ( g/ml) Control Zinc [280 g/ml] Zinc [420 g/ml] µ µ µ 41 Figura 13. Curva de proliferación de E. histolytica en medio de cultivo TYI-S-33. Los trofozoítos amibianos obtenidos a las 24 horas de microcultivos tratados con 0.1 y 0.2 µg de metronidazol fue de 45 y 48 x103 respectivamente, cifra significativamente inferior (p<0.02) a la obtenida en el control (114 x103). Con 0.4 y 0.6 µg disminuyó a 27 y 23 x103 respectivamente (p<0.01) y con dosis de 0.8 y 1 µg se obtuvieron 15 x103 parásitos (p<0.001) (Figura 14). 0 50 100 150 200 250 0 24 48 72 T ro fo zo íto s ( 1x 10 4 / m l) Horas 42 Figura 14. Efecto del metronidazol a las 24 h en la proliferación de los trofozoítos amibianos. Con dosis de zinc de 280, 420 y 504 µg se obtuvieron 64, 63 y 53 x103 trofozoítos respectivamente, todas estas cifras fueron menores (p<0.01) a las obtenidas en el control (114 x103); con 560, 756 y 1008 µg del metal se cuantificaron 43, 45 y 35 x103 parásitos (p<0.01). La dosis de 2800 µg disminuyó la proliferación a 7 x103 (Figura 15). 0 20 40 60 80 100 120 140 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1 T ro fo zo íto s (1 x1 0 3 / m l) Metronidazol ( µµµµg/ml) 43 Figura 15. Efecto del zinc a las 24 h en la proliferación de los trofozoítos amibianos. Las dosis utilizadas (zinc: 280, 420 y 504 µg, metronidazol: 0.1, 0.2 y 0.4 µg) para el estudio de la asociación de los dos fármacos, fueron aquellas que permitieron a los trofozoítos amibianos tener una proliferación superior a 40%. La proliferación se inhibió (p<0.01) al asociar 504 µg de zinc con cada una de las tres dosis de metronidazol señaladas previamente (Figura 16). 0 20 40 60 80 100 120 140 0 280 420 504 560 756 1008 2800 T ro fo zo íto s (1 X 10 3 / m l) Zinc ( µµµµg/ml) Figura 16. Efecto de la asociación del zinc con el metronidazol a las 24 h en la proliferación de los trofozoítos amibianos. 6.3 Morfología En los trofozoítos normal endoplasma con sus vacuolas Figura 17. Cultivo de trofozoí 0 20 40 60 80 100 120 140 T ro fo zo ito s (1 x1 0 3 / m l) 30 µm Efecto de la asociación del zinc con el metronidazol a las 24 h en la proliferación de los trofozoítos amibianos. normales se distingue claramente el ectoplasma las (Figura 17). . Cultivo de trofozoítos amibianos a las 24 horas en medio TYI-S-33 (1 0 0.1 0.2 0.4 Metronidazol (µg/ml) Control Zinc [280 µg/ml] Zinc [420 µg/ml] Zinc [504 µg/ml] 44 Efecto de la asociación del zinc con el metronidazol a las 24 h en la proliferación de los el ectoplasma hialino y el 33 (10x). Zinc [280 µg/ml] Zinc [420 µg/ml] Zinc [504 µg/ml] Los trofozoítos amibianos tratados con 280 normal (Figura 18A) y al utilizar con 504 morfológicas (Flechas) (Figura 18 Figura 18. Trofozoítos amibianos incubados durante 24 horas con zinc: A) 280 normal y B) 504 µg algunos parásitos con alteraciones morfológicas Con 0.2 µg de metronidazol la mayoría de los trofozoítos perdió su forma ameboide y algunos de ellos adquirieron de metronidazol, se observaron redondeados (R) y Figura 19. Trofozoítos amibianos incubados 24 horas con metronidazol: A) 0.2 presentan vacuolas grandes (VG) amebiode, redondeándose (R) (10x). Al utilizar 280 µg de zinc (Zn) y 0.2 trofozoítos perdieron su forma ameboide A A VVGG Los trofozoítos amibianos tratados con 280 µg de zinc conservaro A) y al utilizar con 504 µg solo algunos parásitos mostraron alt (Figura 18B). s amibianos incubados durante 24 horas con zinc: A) 280 algunos parásitos con alteraciones morfológicas (→) (10x). g de metronidazol la mayoría de los trofozoítos perdió su forma ameboide y algunos de ellos adquirieron grandes vacuolas (VG), (Figura 19A). Los t de metronidazol, se observaron redondeados (R) y con numerosas vacuolas (Figura 19 s amibianos incubados 24 horas con metronidazol: A) 0.2 presentan vacuolas grandes (VG) y B) 0.4 µg, además de vacuolas grandes (VG) pierden su forma redondeándose (R) (10x). g de zinc (Zn) y 0.2 µg de Metronidazol (M) (Figura 20 forma ameboide (Flechas). Con 504 µg de Zn y 0.2 B B VVGG RR 40 µm 40 µm VVGG 45 g de zinc conservaron su morfología g solo algunos parásitos mostraron alteraciones s amibianos incubados durante 24 horas con zinc: A) 280 µg con morfología ) (10x). g de metronidazol la mayoría de los trofozoítos perdió su forma ameboide y A). Los tratados con 0.4 µg con numerosas vacuolas (Figura 19B). s amibianos incubados 24 horas con metronidazol: A) 0.2 µg los trofozoítos g, además de vacuolas grandes (VG) pierden su forma g de Metronidazol (M) (Figura 20A) los g de Zn y 0.2 µg de M hubo 40 µm 40 µm lisis, se observó una gran cantidad de redondeados (R), hialinos, sin refringencia y con vacuolas gr 20B). Con 280 µg de Zn y 0.4 redondeados (R), sin refringencia y suplementados con 504 µ conservaron su integridad presentaron características similares a las ya descr figura 20B (Figura 20D). Figura 20. Cultivos de trofozoíto horas: A) 280 µg Zn + 0.2 µg M, M, la
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