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Estudiando Veterinaria

19/7/2022

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Anatomía Veterinaria I

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Curso de Química Biológica
Guía de Trabajos Prácticos

Prof. Titular Dr. Pablo Cetica
Prof. Adjunto Dr. Gabriel Dalvit

2016

1
Curso de Química Biológica

Guía de Trabajos Prácticos

Edición 2016

Redacción: Dra. Martha Beconi
Bioq. Norma Beorlegui
Lic. Laura Pintos
Dr. Pablo Cetica

Actualización: Dr. Pablo Cetica
Colaboración del Dr. Gabriel Alvarez, Mg. Silvina Fernández,
Méd. Vet. Noemí Mora y Vet. Eva Romero

Rediseño: Dr. Pablo Cetica
Dr. Gabriel Dalvit

Docentes 2016

Profesores: Titular Dr. Pablo Cetica
Adjunto Dr. Gabriel Dalvit

Jefes de Trabajos Prácticos: Dra. María Verónica Achi
Dr. Gabriel Alvarez
Dra. Elizabeth Breininger
Dra. Mariana Córdoba
Dra. Cynthia Gutnisky
Med. Vet. Noemí Mora
Dr. Pablo Rodríguez
Mg. Mercedes Satorre

Ayudantes de Primera: Mg. Silvina Fernández
Dra. Ana Marquínez
Dr. Sergio Morado
Dra. María Sol Pérez Aguirreburualde
Vet. Eva Romero
Vet. Matías Tellado

2
Indice

MATERIAL DE LABORATORIO Y BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO
BIOQUIMICO.....................................................................................................................pág. 4
1. Material de laboratorio no volumétrico.
2. Material de laboratorio volumétrico.
3. Bioseguridad en el laboratorio de bioquímica.
PROTEINAS.......................................................................................................................pág. 14
4. Comportamiento de proteínas en solución.
5. Métodos más usados para el fraccionamiento y/o purificación de proteínas.
6. Proteínas plasmáticas.
7. Fotometría.
8. Determinación de proteínas plasmáticas.
9. Trabajo práctico experimental.
10. Fraccionamiento de proteínas plasmáticas: Electroforesis.
11. Trabajo práctico experimental.

BIOENERGETICA...........................................................................................................pág. 46
1. Definición.
2. Principios de la Termodinámica.
3. Energía libre y energía libre estándar.
4. Compuestos de alta energía.
5. Carga energética de la célula.

ENZIMAS...........................................................................................................................pág. 53
1. Aislamiento y purificación de enzimas.
2. Determinación de la actividad de la lipasa pancreática.
3. Trabajo práctico experimental.

FERMENTACION LACTICA.......................................................................................pág. 63
1. Procesos aeróbicos y anaeróbicos.
2. Trabajo práctico experimental.

REGULACION HORMONAL DEL METABOLISMO DE LOS HIDRATOS
DE CARBONO..................................................................................................................pág. 71
1. Mecanismos de regulación de glucosa en sangre.
2. Método de dosaje de glucosa sanguínea.
3. Trabajo práctico experimental.

3
LIPIDOGRAMA................................................................................................................pág. 80
1. Lipoproteínas plasmáticas.
2. Aplicaciones clínicas.
3. Trabajo práctico experimental.

METABOLISMO DE AMINOACIDOS....................................................................pág. 90
1. Enzimas séricas.
2. Transaminasas.
3. Métodos de determinación de actividad de las transaminasas.
4. Interpretaciones clínicas.
5. Trabajo práctico experimental.

CUESTIONARIOS.........................................................................................................pág. 103
a) Material de laboratorio y bioseguridad en el laboratorio bioquímico.
b) Proteínas I.
c) Proteínas II.
d) Bioenergética.
e) Enzimas.
f) Digestión y metabolismo de hidratos de carbono I.
g) Metabolismo de hidratos de carbono II.
h) Metabolismo de hidratos de carbono III.
i) Respiración celular I.
j) Respiración celular II.
k) Aspectos genéticos del metabolismo.
l) Hormonas.
m) Regulación hormonal del metabolismo de los hidratos de carbono.
n) Digestión y metabolismo de lípidos I.
o) Metabolismo de lípidos II.
p) Digestión de proteínas y Metabolismo de aminoácidos.
q) Digestión y metabolismo en poligástricos.
r) Fotosíntesis.

4
MATERIAL DE LABORATORIO
Y BIOSEGURIDAD EN EL
LABORATORIO BIOQUIMICO

TEMARIO

1. Material de laboratorio no volumétrico. Material volumétrico sin graduaciones. Material
no volumétrico con graduaciones aproximadas.

2. Material de laboratorio volumétrico. Matraces. Probetas. Pipetas. Buretas.

3. Bioseguridad en el laboratorio bioquímico. Normas básicas de bioseguridad en el
laboratorio de bioquímica. Sustancias químicas peligrosas.

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Para la realización de los Trabajos Prácticos es necesaria la correcta utilización del
material de laboratorio. Uno de los factores que influyen en la aparición de errores en el
laboratorio es la inadecuada utilización del material destinado a la medición de volúmenes,
generando resultados confusos, principalmente al realizar determinaciones que sirvan como base
para la toma de decisiones terapéuticas. El material de laboratorio se puede clasificar en no
volumétrico y volumétrico.

1. MATERIAL DE LABORATORIO NO VOLUMETRICO

1.1. Material no volumétrico sin graduaciones

Corresponde al material que no posee ningún tipo de escala graduada, como el caso de los
tubos de ensayo. Una característica a tener en cuenta es que el diámetro y longitud de los
mismos es variable entre distintos fabricantes, lo que puede generar confusiones al controlar
visualmente el llenado de los mismos. Los tubos de ensayo se colocan en gradillas diseñadas para
ese fin que pueden ser de metal, de plástico o de madera. Las de madera no deben sumergirse
dentro de baños de incubación, ya que el agua puede arruinar la madera.

1.2. Material no volumétrico con graduaciones aproximadas

La graduación que presenta este tipo de material no es exacta. Generalmente se indica,
junto al volumen máximo de graduación, el error aproximado que se puede realizar al medir con
este material, a una temperatura de 20°C.
En el laboratorio, comúnmente se utilizan: vasos de precipitados, balones y
erlenmeyers.
Este material no se usa para la medición de volúmenes exactos. Por ejemplo, al llenar un
vaso de precipitados hasta la línea que indica 100 ml no tenemos exactamente 100 ml, sino que
existen aproximadamente 100ml. Esto significa que, aunque hayamos enrasado perfectamente en
la línea que indica los 100 ml, en realidad puede haber 93, 114 ó 100,4 ml. Esto no se debe a
errores en la manipulación por parte del operador, sino que es una característica del material
utilizado.
Los erlenmeyers se utilizan para preparar soluciones y facilitar la mezcla acelerando el
proceso de disolución. También se usan en las titulaciones para facilitar la agitación.

2. MATERIAL DE LABORATORIO VOLUMETRICO

Corresponde al material específicamente fabricado para la medición de volúmenes. Por
ejemplo: matraces, probetas, pipetas (manuales y automáticas) y buretas.

Cómo realizar la lectura del nivel en el material graduado (Enrase)
En los tubos delgados de vidrio, debido a la tensión superficial de los
fluidos contenidos en ellos, se forma un menisco cóncavo (M en el
gráfico) en la superficie del líquido a medir.
La lectura se debe realizar en la línea de graduación (G en el gráfico)
correspondiente a la parte más baja del menisco.
Para evitar errores en la lectura, el material deberá encontrarse en
posición vertical, y el menisco deberá mantenerse a la altura de los ojos
del operador.

2.1. Matraces

Se trata de material volumétrico con una única medida. Están graduados para medir un
volumen determinado cuando son llenados hasta la línea de graduación correspondiente, por lo
tanto, no se pueden utilizar, para medir volúmenes inferiores o superiores al volumen indicado.
Existen matraces de diversas capacidades, desde 5 hasta 2000 ml (5, 10, 25, 50, 100, 250, 500,1000 y 2000 ml).
Se utilizan principalmente para la preparación de soluciones y reactivos y no para
determinar el volumen desconocido de un líquido.

2.2. Probetas

Son cilindros graduados de boca ancha y permiten la medición de volúmenes de 10 a 2000
ml (10, 50, 100, 250, 500, 1000, 2000 ml). Siempre se debe utilizar una probeta con capacidad
superior más cercana al volumen a medir. Por ejemplo: Para medir 45 ml, se deberá utilizar una
probeta de 50ml. Para medir 180 ml, se deberá utilizar una probeta de 250ml.

2.3. Pipetas manuales (De simple y doble aforo)

Las pipetas más comunes pueden ser de: 0,1, 0,2, 1, 2, 5 y 10 ml. Para la correcta
utilización de las pipetas manuales se debe tener en cuenta:

2.3.1. Conocer que pipeta utilizar
Como en el caso de las probetas, siempre debe utilizarse la pipeta de un volumen superior
próximo al volumen a medir. Po ejemplo, para medir 0,7 ml, se deberá utilizar una pipeta de 1
ml. Para medir 2,6 ml, se deberá utilizar una pipeta de 5 ml.

2.3.2. Identificar la pipeta a utilizar

a) Identificar el volumen máximo y la precisión: Todas las pipetas tienen en su extremo
superior la indicación de sus características, por lo tanto se puede observar:
- El volumen máximo que puede ser medido (Por ejemplo, 5 ml)
- El volumen que hay entre dos líneas de graduación (Por ejemplo, la marca "1/100"
indica que cada línea de graduación contiene 1/100 de ml).

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b) Identificar el tipo de pipeta, de simple o de doble aforo: Las pipetas de simple aforo
se cargan hasta un volumen superior a cero, luego se enrasa y se descarga exactamente hasta el
volumen requerido, o completamente si se necesita el volumen total.
Las pipetas de doble aforo tienen la particularidad de tener el área graduada separada del
extremo de la pipeta, lo que implica que el volumen máximo a medir queda incluido entre dos
líneas claramente definidas, que indican el inicio y el final de la escala. Por lo tanto, deberán ser
descargadas hasta la marca inferior y no hasta el final de la pipeta.
Si es necesario hacer la descarga completa de la pipeta, las mediciones realizadas con una
pipeta de doble aforo son más exactas que las realizadas con las de simple aforo (excepto al
medir agua destilada). La razón de esto es que en las pipetas de simple aforo las graduaciones
inferiores corresponden a la sección cónica de la pipeta y el volumen remanente que queda por
capilaridad puede variar de una sustancia a otra.

c) Cargar la pipeta: Para realizar la carga de la pipeta es recomendable el uso de una
propipeta o una pera de goma, ya que el operador se expone menos al riesgo de tragar la sustancia
a pipetear y permite controlar el ascenso de la columna del líquido hasta la graduación deseada.

Manipulación de la pipeta
La pipeta debe ser tomada entre los dedos medio y pulgar,
utilizando al dedo índice como tope en el extremo superior de la
misma.
Esta forma de tomar la pipeta puede ser dificultosa al principio,
pero tiene las siguientes ventajas respecto a tomarla con la mano,
tapando con el pulgar:
- Al tomar la pipeta en la forma correcta, el centro de rotación de
la misma se encuentra en una posición más conveniente, por lo
tanto la manipulación, ya sea para cargarla o descargarla, es mucho
más precisa.
- La movilidad fina en el dedo índice es mejor, permitiendo que la
descarga de la pipeta pueda ocurrir en forma gradual, lo que no
ocurre al ocluirla con el dedo pulgar.

Manipulación de propipetas
Las propipetas de goma se manipulan de la siguiente forma:
- Para expeler el aire presionar la válvula A sobre la parte
superior del bulbo.
- Succionar el líquido hacia arriba presionando la válvula S
ubicada en la parte inferior.
- Para descargar presionar la válvula E que se encuentra al
costado de la válvula S.

Las propipetas de émbolo se manejan con una sola mano. Girando
la rueda dentada hacia arriba o abajo se obtiene un llenado o
vaciado preciso y pulsando la clavija lateral se produce el vaciado
automático.

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d) Descargar la pipeta: Para efectuar la descarga de la pipeta deberá apoyarse el extremo
inferior de la misma a la pared del recipiente en donde se descargue el contenido, liberando
lentamente el dedo índice y permitiendo la descarga del volumen deseado. En el caso de
descargar completamente el contenido de una pipeta de simple aforo, se considera al volumen
remanente en el extremo de la misma, incluido en el volumen medido, por lo tanto este volumen
remanente no debe ser descargado. Esto implica que nunca se debe soplar el contenido remanente
de la pipeta.

2.4. Buretas

Las buretas se utilizan para realizar titulaciones. Constan de un cilindro graduado (con
doble aforo) y un robinete, que permite ocluir el paso del líquido en forma total o parcial. El
robinete deberá ser manipulado con los dedos índice y pulgar de la mano izquierda,
manteniéndose el cuerpo de la bureta en el espacio dejado por estos dedos. Esto permite que
cualquier exceso de fuerza no desplace al robinete de su ubicación, evitando las pérdidas por los
laterales del mismo.
Al realizar una titulación, el punto de interés es el recipiente en donde se está realizando la
misma, deteniéndose el proceso en el momento en el que el indicador utilizado realice el cambio
esperado en su coloración, por lo tanto las buretas permiten independizarse de la lectura del
volumen utilizado, que se realiza después de finalizar la titulación.
Los pasos a seguir para la correcta utilización de las buretas son los siguientes:

2.4.1. Montaje de la bureta en su soporte

Para tal fin deberá armarse el soporte, utilizando una doble nuez que se fija al mismo y
mantiene a la bureta en posición vertical. Para fijar la bureta, deberá ajustarse lentamente la
tuerca mariposa de la doble nuez, hasta que la bureta no tenga más movilidad. El ajuste deberá
ser lo suficientemente firme como para mantener a la bureta en posición vertical, evitando el
exceso de presión, lo que podría provocar la rotura de la bureta. La altura de la doble nuez no
deberá interferir con la lectura de las graduaciones de la bureta.

2.4.2. Cargado de la bureta

a) Llenado: Una vez fijada la bureta con el robinete cerrado, se coloca un embudo en la
parte superior para efectuar la carga, prestando especial cuidado en evitar la formación de
burbujas en el interior de la misma. En este paso, no es necesario el enrase a cero. El aire
contenido en la porción inferior al robinete debe ser desalojado para poder utilizar las buretas con
exactitud. Para esto, se deberá colocar un recipiente debajo de la bureta, y abrir el robinete, hasta
que la burbuja sea desalojada completamente. En caso que la burbuja persista, se puede descargar
completamente la bureta e iniciar nuevamente la carga con el robinete abierto, habiendo colocado
previamente un recipiente debajo de la misma.

b) Enrase: Una vez cumplidos los pasos anteriores, se procederá al llenado final y enrase
de la bureta, manteniendo las mismas precauciones citadas anteriormente.

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c) Descarga de la bureta: La descarga del contenido de la bureta deberá ser realizada en
forma de goteo lento (no abrir el robinete completamente), reduciendo gradualmente el flujo de la
solución a medida que se aproxima el punto de viraje del indicador utilizado. Cuando se logra el
punto final de la titulación se debe cerrar el robinete.

d) Lectura del volumen utilizado: La lectura del volumen utilizado deberá realizarse al
final de la utilización de la bureta, tomando las precauciones descriptas anteriormente para el
enrase y lectura.

e) Recarga: Una vez finalizada la lectura, es recomendable la recarga y el enrase de la
bureta, si es necesario realizar otra titulación.

Limpieza del material de laboratorio
Todo el material utilizado debe ser enjuagado inmediatamente después de su uso, para evitar que se tapen y
eliminar sustancias extrañas que puedan interferiren futuras determinaciones. Como las buretas son utilizadas
para realizar titulaciones con soluciones de ácidos o bases, el secado de dichas soluciones, forma cristales, los
cuales pueden provocar la obstrucción del pico o el bloqueo del robinete, con lo cual quedarían
completamente inutilizadas. Si se trabaja con una pipeta que se utilizó para medir una solución de proteínas
y fue mal lavada, se estará obteniendo e informando un valor de proteínas superior al valor real del paciente.
Al finalizar el trabajo práctico se deberá lavar el material con detergente y abundante agua corriente,
particularmente si se utilizó material biológico con materia grasa como leche o yogur. Para ello se puede
utilizar escobillas, que resultan particularmente útiles para lavar el fondo de tubos de ensayo, probetas y
erlenmeyers. Finalmente deben enjuagarse todos los materiales lavados utilizando preferentemente agua
destilada.
Posteriormente se dejará secar al aire, antes de ser colocado en su lugar correspondiente, si no se dispone de
estufa para secar el material. Queda exceptuado del secado en estufa el material de vidrio volumétrico, ya que
el vidrio puede sufrir modificaciones en su forma por efecto del calor y del enfriamiento, afectando la escala
de graduación.

3. BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO BIOQUIMICO

3.1. Normas básicas de bioseguridad en el laboratorio de bioquímica

Las prácticas que se llevan a cabo en el laboratorio presentan riesgos propios de cada
actividad. Las reglas básicas que se detallan a continuación, son un conjunto de normas
destinadas a prevenir accidentes y proteger la salud de alumnos y docentes. El conocimiento de
esta información resulta esencial para evitar o minimizar inconvenientes dentro del laboratorio.

 Se deberá conocer la ubicación de los elementos de seguridad como matafuegos, salidas de
emergencia, duchas y lavaojos.

 Se debe utilizar la vestimenta apropiada para el trabajo en el laboratorio. El guardapolvo
constituye una barrera de protección, por lo que debe usarse completamente abrochado, sin
arremangar y sin ninguna vestimenta por encima. Las piernas deben estar totalmente cubiertas
y el calzado debe ser cerrado. El cabello largo debe estar siempre recogido.

 Las mesadas de trabajo deben estar siempre despejadas, libres de libros, abrigos, materiales
de estudio y objetos personales como celulares.

 Las manos deben lavarse cuidadosamente luego de manipular cualquier sustancia química o
material biológico y antes de retirarse del laboratorio.

 Se debe dar aviso inmediato al personal docente si detecta fallas en las instalaciones eléctricas
o de gas, así como al detectar materiales de laboratorio rotos o dañados.

 Toda herida o abrasión, por más pequeña que sea, así como el ingerir accidentalmente alguna
sustancia, se deberá informar inmediatamente a los docentes. El laboratorio debe contar con
un botiquín de primeros auxilios correctamente identificado y de fácil acceso.

 Todo residuo que se genere deberá ser depositado en el recipiente destinado para tal fin. Estos
deben estar correctamente rotulados con el tipo de desechos que pueden contener, como
sustancias tóxicas, material biológico, papeles, etc. El material de vidrio roto deberá
envolverse en papel antes de ser depositado en el cesto de basura.

 Utilizar preferentemente dispositivos mecánicos como propipetas o peritas de goma para
pipetear.

 Mantener el orden y la limpieza dentro del ámbito del laboratorio. Las mesadas deberán
quedar perfectamente limpias y libres de cualquier residuo o elemento al finalizar la
actividad.

 No se debe comer, beber o fumar dentro del laboratorio.

 No llevar las manos a la boca u ojos cuando se haya manipulado sustancias químicas y
biológicas.

 No inhalar o probar productos químicos o biológicos.

 Se debe evitar el uso de accesorios, como pulseras, collares, relojes, anillos, etc.

 No retirarse del laboratorio sin haberse quitado el guardapolvo para dirigirse a otras áreas
(comedor, sanitarios, aulas, oficinas) o viajar.

 No se deben bloquear los pasillos y caminos de escape ante una emergencia con bancos,
sillas, mochilas o cualquier elemento que entorpezca la correcta circulación. No se permite
correr dentro del laboratorio, el andar dentro del mismo debe ser cuidadoso para evitar
romper los materiales y causar derrames de sustancias.

 No utilizar equipos sin haber recibido entrenamiento previo o supervisión del personal
docente.

 No se deben guardar alimentos en heladeras o freezers donde se almacenen sustancias
químicas o material biológico.

 No utilizar el contenido de un recipiente que no esté identificado. Todo material a utilizar
debe estar adecuadamente rotulado.

 Está prohibido descartar sustancias tóxicas, inflamables y corrosivas, así como material
biológico, por las piletas.

3.2. Sustancias químicas peligrosas

Las sustancias químicas se clasifican en función de su peligrosidad y se reconocen por un
símbolo específico.

Sustancias y preparados que pueden explotar al acercarles una llama
o por choques o movimientos violentos. Debe evitarse el calor,
fuego, chispas, percusión o fricción.
Mezclas como sodio y agua, hidrógeno y aire (en contacto con una
llama).

Sustancias que por la acción de una fuerte ignición, pueden
arder y continuar quemando. Deben mantenerse lejos de llamas,
chispas y fuentes de calor.
Acetona, alcoholes, benceno, magnesio en polvo, hexano,
fenolftaleína, éter etílico.
Líquidos con puntos de inflamación y ebullición bajos, y gases
que a presión y temperatura ambiente son muy inflamables en el
aire. Deben mantenerse lejos de llamas, chispas y fuentes de
calor.

En contacto con otros productos, especialmente con los
inflamables, reaccionan desprendiendo calor. Pueden provocar
incendios.
Nitrato de amonio, de plomo, de potasio, de aluminio y de cinc,
clorato de sodio y de potasio, ácido perclórico, dicromato de
potasio, ácido nítrico, agua oxigenada.

Por inhalación, ingestión o penetración por la piel pueden producir
envenenamientos graves o incluso la muerte. Benceno, mercurio,
metanol, cianuros, arsénico, dicromato de potasio, tetracloruro de
carbono, óxidos de nitrógeno, halógenos, fenol, sulfato de cromo,
anilinas.
La absorción de estas sustancias en cantidades muy pequeñas puede
tener efectos muy graves para la salud, pudiendo llegar a
consecuencias mortales.

Por inhalación, ingestión o penetración por la piel pueden producir
daños de gravedad limitada.
Ácido bórico, permanganato de potasio, yodo, algunas sales y óxido
de plomo, naftaleno, algunas sales y óxidos de cobre.
Por contacto prolongado con piel y mucosas, pueden originar
inflamaciones.
Hidróxido de amonio, sulfato de sodio, cromato de potasio, gases de
muchos ácidos (clorhídrico, nítrico, sulfúrico, etc.).

13
Sustancias y preparados que tienen una acción corrosiva sobre la piel.
Muchos ácidos (nítrico, clorhídrico, sulfúrico, etc.), nitrato de plata,
bases fuertes (hidróxido de sodio, de potasio, amoníaco).

El contacto de esta sustancia con el medioambiente puede causar
daños en el ecosistema.
Benceno, cianuro de potasio, entre otros.

Riesgo de emisión radiactiva.
Ciertos isótopos de algunos elementos (yodo, polonio, etc.).

Riesgo de peligro biológico.
Virus, bacterias, priones, parásitos.

14
PROTEINAS

TEMARIO

Estructura y funciones biológicas de las proteínas. Desnaturalización. Propiedades ácido-base
de aminoácidos y proteínas. Significado del punto isoeléctrico y pK. (Estos temas deberán
repasarse del Curso de Química Orgánica de Biomoléculas).

1. Comportamiento de proteínas en solución. pH. Fuerza iónica. Propiedades dieléctricas del
solvente. Temperatura.

2. Métodos másusados para el fraccionamiento y/o purificación de proteínas.
Centrifugación. Cromatografía líquida. Electroforesis. Fraccionamiento Salino. Diálisis.

3. Proteínas plasmáticas. Composición de la sangre. Fracciones proteicas del plasma.

4. Fotometría. Introducción. Teoría de la espectrofotometría. Instrumental: Fotocolorímetro y
Espectrofotómetro. Curva de calibración. Utilización del blanco. Cálculo del factor.

5. Determinación de proteínas plasmáticas. La reacción del Biuret: Fundamento. Otros
métodos para valorar proteínas.

6. Trabajo práctico experimental. Dosaje de proteínas plasmáticas.

7. Fraccionamiento de proteínas plasmáticas: Electroforesis. Introducción. Teoría de la
Electroforesis. Electroendósmosis. Variacione fisiológicas. Aplicaciones clínicas.

8. Trabajo práctico experimental. Proteinograma electroforético.

1. COMPORTAMIENTO DE PROTEINAS EN SOLUCION

La solubilidad de las proteínas depende del pH, de la fuerza iónica de la solución, de las
propiedades dieléctricas del solvente y de la temperatura. Estas variables pueden usarse para
separar mezclas de proteínas.

1.1. pH

Las proteínas muestran un mínimo de solubilidad a un determinado pH, que es específico para
cada una de ellas y se denomina punto isoeléctrico (PI), que se define como el pH en el cual, la
molécula proteica no posee carga eléctrica neta. En estas condiciones no hay repulsión
electrostática entre moléculas vecinas y tienden a agregarse y a precipitar. A mayores o menores
valores de pH, las proteínas tienen carga eléctrica neta del mismo signo, incrementando la capa
de solvatación e impidiendo que se formen agregados insolubles. El PI varía con la composición
iónica del medio. Cuando las proteínas están disueltas en agua pura (deionizada) el PI se conoce
como pH isoiónico. El pH isoeléctrico de una proteína, esta determinado por el número y los pK
de cada grupo R que se ioniza.

1.2. Fuerza iónica

La fuerza iónica de una solución es una medida de su concentración salina y se puede calcular a
través de la siguiente fórmula:   221 ZiCi
, donde Ci es la concentración de cada ión
presente en la solución y Zi es la carga correspondiente a cada uno de estos iones. Las sales
neutras en solución se disocian, formando iones solvatados que modifican la solubilidad de las
proteínas. A baja concentración salina, la solubilidad de la proteína aumenta: "salting in",
debido a que las cargas de las proteínas interaccionan con los iones de las sales, incrementando la
capa de solvatación de las mismas y disminuyendo la interacción proteína-proteína.
Por otra parte, a altas concentraciones de sales neutras, la solubilidad de las proteínas disminuye
("salting out") porque los iones de la sal disuelta atraen el agua de solvatación disponible,
aumentando la interacción entre las moléculas de proteína. Las proteínas precipitadas por
"salting out", retienen su conformación nativa y pueden disolverse nuevamente con el agregado
de solvente sin experimentar desnaturalización.

1.3. Propiedades dieléctricas del solvente

La solubilidad de una proteína a una fuerza iónica y pH determinados, es función de la
constante dieléctrica del medio. A medida que disminuye la constante dieléctrica del solvente
disminuye la solubilidad de las proteínas, porque a menor constante dieléctrica aumenta la fuerza
de atracción entre las cargas opuestas, luego las proteínas tienden a agregarse y precipitar. El
agua tiene la máxima constante dieléctrica, mientras que los solventes orgánicos tienen valores
más bajos de constantes dieléctricas.

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1.4. Temperatura

Dentro de un rango limitado entre 0º y 40ºC, la mayor parte de las proteínas aumenta su
solubilidad al aumentar la temperatura. A temperaturas mayores de 40ºC, aumenta la agitación
térmica y se rompen las uniones que mantenían las estructuras secundaria, terciaria, cuaternaria y
la proteína se desestabiliza y precipita (desnaturalización).

2. METODOS MAS USADOS PARA FRACCIONAMIENTO Y/O
PURIFICACION DE PROTEINAS

En el fraccionamiento y/o purificación de proteínas se utilizan métodos que se describen a
continuación:

2.1. Centrifugación

La fuerza centrífuga permite separar partículas en suspensión que posean diferente masa o
diferente densidad, depositándolas en el fondo del tubo a diferentes velocidades. A menor
velocidad se depositan las partículas más pesadas o de mayor densidad. Los tipos más usados
son:

2.1.1. Centrifugación diferencial (se verá más adelante)

2.1.2. Centrifugación en gradiente de densidad
Se prepara una solución de sacarosa de densidad creciente en un tubo de centrífuga, luego
se deposita la mezcla de proteínas y se centrifuga en posición horizontal a alta velocidad. Se
obtienen así diferentes bandas según su tamaño y densidad.

2.2. Cromatografía líquida

Es otra técnica utilizada comúnmente para separar mezclas de proteínas, que se basa en la
interacción entre las moléculas disueltas y una superficie sólida que se halla contenida en una
columna. Este tipo de cromatografía puede ser:

2.2.1. Cromatografía de exclusión o de filtración por gel
Las proteínas se separan de acuerdo a su tamaño. En este caso la columna contiene polímeros con
poros de diferente tamaño, de acuerdo a las proteínas que se desean separar. La mezcla con las
proteínas disueltas fluye sobre la columna, las moléculas de pequeño tamaño penetran en los
poros del polímero y su movimiento a través de la columna se retarda. En cambio las proteínas
de mayor tamaño no pueden penetrar en los poros del gel y fluyen más rápidamente.

2.2.2. Cromatografía de intercambio iónico
Las proteínas son separadas por diferencia de carga. Grupos funcionales cargados positivamente
(-NH3+) o negativamente (-COO-) se unen covalentemente a un soporte sólido formando un

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intercambiador aniónico o catiónico. Cuando una molécula proteica cargada se hace pasar por un
intercambiador de carga opuesta, ésta es retenida por fuerzas electrostáticas, mientras que las
moléculas neutras o de igual carga, pasan a través de la columna. La unión de la molécula
retenida es reversible y puede ser eluida por el agregado de soluciones de diferentes
concentraciones salinas o por una solución con un gradiente de pH.

2.2.3. Cromatografía de afinidad
Se basa en la afinidad con que una proteína se une específicamente a otra molécula
(ligando). Ej: enzimas unen coenzimas e inhibidores, anticuerpos unen a proteínas antigénicas,
etc. Un ligando está covalentemente unido al soporte y está dentro de una columna
cromatográfica. Cuando se coloca una mezcla de componentes, los compuestos que no tienen
afinidad por el ligando, fluyen a través de la columna, quedando retenida la proteína que tiene
afinidad por dicho ligando. La elución se hace con soluciones que contienen exceso de ligando.

2.3. Electroforesis

Es una técnica para separar proteínas bajo la influencia de un campo eléctrico. La
movilidad de cada uno de las moléculas cargadas en un campo eléctrico depende de su carga y de
su tamaño molecular. Si dos moléculas tienen la misma masa y forma, la que tiene una carga
eléctrica neta mayor, se moverá más rápidamente hacia el electrodo de signo opuesto.
Las más comúnmente usadas son:

2.3.1. Electroforesis en tiras de acetato de celulosa (se utilizará en el trabajo práctico
experimental)

2.3.2. Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-poliacrilamida)
En este caso la mezcla de proteínas es tratada con SDS (dodecil sulfato de sodio) que es
un detergente cargado negativamente, que se une a las proteínas. Colocando la mezcla sobre el
gel de poliacrilamida y aplicando una corriente eléctrica, los complejos SDS-proteínas migran a
través de los poros del gel de poliacrilamida (el tamaño de los poros del gel depende de la técnica
de preparación del mismo). Las proteínas más pequeñas pasan a través de los poros del gel más
fácilmente, recorriendo unamayor distancia, lo contrario ocurre con las proteínas de mayor
tamaño, como consecuencia, las proteínas se separan en bandas de acuerdo a su tamaño. Estas
bandas se visualizan por tratamientos con un colorante. Si L es el largo del gel y d1, d2 y d3 son
las distancias recorridas se pueden calcular los Rf ("Running front": frente de corrida) para cada
una de ellas:
L
dRf 

A partir de los Rf se puede calcular el peso molecular de cada una de las proteínas.

18
2.4. Fraccionamiento salino

Se basa en la separación de una mezcla proteica por el agregado de sales ("salting in" o
"salting out"). La precipitación con sales es un método muy efectivo para la purificación proteica.
El agente precipitante más usado es el sulfato de amonio: (NH4)2SO4. Se usa para la precipitación
y purificación de las distintas enzimas presentes en un tejido determinado, debido a su gran
solubilidad en agua destilada aún a bajas temperaturas, lo que permite usarlo en altas
concentraciones, es además económico y no tiene efectos nocivos sobre las proteínas.

2.5. Diálisis

Permite separar las proteínas, de un soluto de bajo peso molecular, haciendo pasar este
último a través de una membrana semipermeable que retiene a las moléculas proteicas.

3. PROTEINAS PLASMATICAS

3.1. Composición de la sangre

La sangre es un tejido que circula dentro del sistema de los vasos sanguíneos. Está
compuesta por elementos figurados (eritrocitos o glóbulos rojos, leucocitos o glóbulos blancos y
plaquetas) y por el plasma que mantiene a las células en suspensión.
La sangre constituye el vehículo por el cual la mayor parte de los nutrientes son
transportados al hígado y a los órganos en general, y los productos de desecho retornan a los
pulmones y a los riñones, para su excreción. La sangre transporta el oxígeno desde los pulmones
a los tejidos, y el dióxido de carbono, producido durante el metabolismo respiratorio desde las
células hacia los pulmones.
Casi la mitad, aproximadamente, del volumen sanguíneo lo ocupan sus células, que
consisten en su mayor parte en los glóbulos rojos y en una cantidad mucho más pequeña, los
glóbulos blancos y las plaquetas.
Si se saca sangre de una vena y se agrega un anticoagulante apropiado para prevenir su
coagulación, los elementos celulares en suspensión pueden ser separados por centrifugación. El
líquido sobrenadante, normalmente de color ligeramente amarillo, se denomina plasma
sanguíneo.
Si al extraer la sangre se deja que coagule, y se somete luego a centrifugación, se separa
un líquido que se denomina suero sanguíneo.
Así, la diferencia entre plasma y suero sanguíneo es que este último carece de fibrinógeno
(precursor de la fibrina que forma el coágulo).
El plasma contiene aproximadamente un 10% de solutos disueltos, de estos un 2% esta
integrado por nutrientes orgánicos y sustancias de desecho. Un 1% está representado por sales
inorgánicas y aproximadamente el 7% restante, lo constituyen las proteínas plasmáticas.
Los principales iones inorgánicos del plasma sanguíneo son el Na+, Ca++, Mg++, Cl-,
HCO3- y H2PO4-, que desarrollan una importante función en la regulación de la actividad hística.

19
Las proteínas plasmáticas están integradas por una mezcla de diferentes fracciones
proteicas. La concentración total de proteínas plasmáticas en mamíferos varía entre 5,5 y 8,5
g/100ml (ver cuadro pág. 28).

3.2. Fracciones proteicas del plasma

3.2.1. Fibrinógeno
Es el precursor de la fibrina, que participa en la formación del coágulo sanguíneo. Esta
proteína es producida por el hígado y constituye solo el 4 - 6% de las proteínas totales del plasma.
El suero no contiene fibrinógeno puesto que se usa en el mecanismo de coagulación, pero sí
contiene la misma cantidad de albúminas y globulinas que el plasma.

3.2.2. Albúmina
Es la fracción más abundante, aunque las cantidades relativas, varían entre 40-60% de las
proteínas totales, según las distintas especies. La albúmina es sintetizada en el hígado y sus
principales funciones son:
a) El mantenimiento del volumen del plasma, o sea del equilibrio osmótico entre la sangre
circulante y el líquido intersticial.
b) El transporte de sustancias poco solubles en agua (Ej: ácidos grasos libres).

3.2.3. Globulinas
La fracción globulínica de las proteínas plasmáticas es una mezcla muy compleja, que
agrupa las siguientes fracciones principales: 1 y 2 globulinas,  globulinas y  globulinas.
Todas cumplen funciones biológicas muy importantes; por ejemplo:
a) Antitripsina (1 globulina)
b) Ceruloplasmina: (2 globulina), transporta el 90% del cobre presente en el plasma.
c) Transferrina: ( globulina) es una glucoproteína que transporta el Fe+++ desde el intestino a
los lugares del organismo que lo necesiten.
d) Inmunoglobulinas: ( globulina) son sintetizadas en los linfocitos B, secretadas a la
circulación sanguínea y constituyen un mecanismo importante de defensa del organismo.
Las proporciones de las globulinas varían según las especies animales.

Las proteínas plasmáticas se pueden dosar por varios métodos espectrofotométricos.

4. FOTOMETRIA

4.1. Introducción

La luz, energía radiante o radiación electromagnética interactúa con la materia
produciendo una variedad de fenómenos ampliamente conocidos: reflexión, refracción,
absorción, polarización, etc. De todos estos fenómenos, el de absorción de la luz constituye la
base de los métodos de análisis más importantes de la química biológica y otras ciencias.

20
Cuando un haz de luz llega a un medio homogéneo, una parte de la luz incidente se
refleja, otra se absorbe y el resto es transmitida.
Verificándose que: I0=Ia+It+Ir
Donde:Io = intensidad de la luz incidente.
Ia = intensidad de la luz absorbida.
It = intensidad de la luz transmitida.
Ir = intensidad de la luz reflejada.
De la ecuación anterior puede despreciarse la Ir por ser del orden del 4% respecto de la
incidente (cuando se trata de interfase aire-vidrio) quedando:

I0=Ia+It

La fracción de luz transmitida It depende:
a) De la intensidad de la Io.
b) Del espesor (l) del medio atravesado por la luz.
c) De la estructura molecular de la sustancia disuelta en ese medio y también de la estructura del
solvente.
d) De la concentración (c) de dicha sustancia.
e) De la longitud de onda () utilizada en el haz incidente.
f) De la temperatura del sistema.

Los métodos fotométricos se pueden utilizar para:
a) La identificación de una sustancia por medio de su espectro de absorción característico.
b) Hallar la concentración en base a la luz absorbida a una determinada longitud de onda ().
De estas dos posibilidades que brinda la espectrofotometría, estudiaremos aquí la segunda
o sea la medición de la concentración de una sustancia en solución en base a la luz absorbida.

21
4.2. Teoría de la espectrofotometría

4.2.1. Ley de Lambert
En 1760, Lambert investigó la relación existente entre Io e It cuando la luz atravesaba
láminas coloreadas de diferentes espesores, estableciendo que la It decrece exponencialmente al
aumentar el espesor (l) de la lámina, es decir:
l
0 10
 IIt (1)
Siendo  el coeficiente de extinción que es constante y específico de la lámina utilizada.

4.2.2. Ley de Beer
En 1852, Beer estudió la absorción de la luz por medio de soluciones coloreadas variando
la concentración (c) en lugar del espesor, llegando a una expresión matemática similar:
c
t II
 100 (2)
Lo que significa que la It disminuye exponencialmente al aumentar c.
Como las soluciones pueden medirse bajo espesores diferentes se pueden combinar las
dos ecuaciones anteriores (1) y (2) en una que reúne las leyes de Lambert y Beer:
lc
t II
 100 o bien
clt
I
I 10
0

Que al aplicarle logaritmo resulta:
10loglog
0
 cl
I
It 
Multiplicando por (-1) nos conduce al concepto de absorbancia (A) ya que:
cl
I
I
II
t
t  0
0
loglog ó clA  (3)
De la ecuación (3) podemos despejar el coeficiente de extinción molar:
cl
A
 que puede
definirse como la absorbancia de una solución cuando el espesor es igual a 1 cm y la
concentración es 1 M y sus unidades son: 11  Mcm ya que la absorbancia no tiene unidades.
Se llama transmitancia (T) a la relación
0I
IT t o fracción de luz transmitida, y
transmitancia porcentual:

0
100%
I
IT t

De estas definiciones se deduce la relación entre Absorbancia y Transmitancia porcentual:
Como
0
100%
I
IT t

Aplicando logaritmos 0100 IIT t logloglog%log 

22
Multiplicando x (-1) 0100 IIT t logloglog%log 

tI
IT 0log2%log 
AT  2%log

Para T% = 100 100% de luz transmitida
la A = 0
Para T% = 0 0% de luz transmitida
la A  2

4.3. Instrumental: Fotocolorímetro y espectrofotómetro

El fotocolorímetro se esquematiza en la siguiente figura:

Se emplea usualmente luz blanca de tungsteno que es filtrada por láminas coloreadas
(fotométro a filtro). De todo el espectro visible, el filtro deja pasar un cierto ancho de longitudes
de onda ( ) que incidirá en el tubo o cubeta con la solución a medir.
Si en lugar de filtros se utiliza un prisma o una red de difracción (o ambos combinados) se
consiguen medidas más precisas, pudiéndose modificar la longitud de onda del espectro en forma
continua. Con esto se consigue más definición en las lecturas del aparato (espectrofotómetro).
Por otra parte, puede cambiarse la fuente de luz y alcanzarse, usando otras lámparas,
zonas del espectro no visibles, por ej. lámparas de Deuterio para leer en la zona Ultra Violeta
(U.V.). Todos estos métodos permiten dosar sustancias en muy pequeñas cantidades (trazas).
Las lecturas se hacen en un galvanómetro graduado directamente en unidades de
absorbancia, aunque la mayoría de los equipos cuentan con una doble escala paralela de
Absorbancia y Transmitancia porcentual (ver esquema). En el trabajo práctico utilizaremos la
absorbancia que mantiene una relación lineal con la concentración.
Por último puede mencionarse que en equipos más modernos la lectura es digital y poseen
minicomputadoras que permiten obtener directamente la concentración expresada en las unidades
deseadas.
%log2 TA 

4.4. Curva de calibración

Se usa para evaluar la concentración de una sustancia S. De la ecuación lcA  se
infiere que si se grafica la absorbancia de una solución en función de concentraciones variables
de la misma, se obtiene una recta que pasa por el origen y cuya pendiente es l, o sea una curva
de calibración consiste en un gráfico que relaciona absorbancia con concentraciones conocidas de
la sustancia S a dosar.
Para realizar una curva de calibración:
a) Se utiliza como testigo una solución de la sustancia a dosar (S), valorada por otro método.
b) Se toman diferentes alícuotas de la solución testigo, llevándolas en cada caso al mismo
volumen final con agua destilada, luego se agregan el o los reactivos que producen la
reacción de color. Quedan así diferentes concentraciones de la sustancia y a cada una le
corresponderá un valor determinado de absorbancia.
c) Se prepara un blanco en el que intervienen todas las sustancias que participan en la reacción
colorimétrica menos la que se quiere dosar.
d) Se coloca el blanco en la cubeta de un fotocolorímetro o espectofotómetro y se ajusta la
absorbancia a cero.
e) Se lee a continuación las absorbancias de cada una de las distintas concentraciones de la
solución testigo.
f) Los datos obtenidos se consignan en una tabla y luego se realiza un gráfico de absorbancia en
función de la concentración.
Este gráfico puede ser una recta o una curva que en ambos casos pasan por el origen.

En el caso I se observa que la absorbancia es directamente proporcional a la
concentración o sea, se cumple la Ley de Lambert y Beer: A = lc en todo el rango de
concentraciones elegidas en este ejemplo (salvo pequeñas desviaciones experimentales).

24
En el caso II, se produce una desviación para concentraciones mayores de 4 mg/ml. Esto
se debe a alteraciones del  que modifican la pendiente.
Una vez construida la curva de calibración, se procede a hallar la concentración
desconocida de la sustancia (S) contenida en algún material biológico; para ello, a una cantidad
determinada de dicha sustancia se le agrega el o los reactivos de color y se lee la absorbancia
(As).
El valor de la absorbancia (As) se busca sobre el eje de las ordenadas y se halla la
concentración correspondiente.
En el caso II que no cumple con la Ley de Lambert y Beer se deberá hacer una dilución
de la sustancia en estudio para que el valor de la absorbancia esté comprendido en la zona en que
se cumple la ley (menor 4mg/ml).

4.5. Utilización del blanco

Se prepara un blanco con los reactivos (R) sin el agregado de la sustancia a dosar (S). El
blanco puede ser utilizado en dos formas:

1er Método:
a) Se coloca el blanco en la cubeta del aparato y se ajusta la absorbancia a cero.

Ab=0

b) Se prepara un tubo con la sustancia a dosar (S) más los reactivos (R+S). Se coloca en la
cubeta del aparato y se mide su absorbancia As. El valor de la absorbancia leída corresponde
al color desarrollado en la reacción colorimétrica debido a S. A este valor se lo llama
absorbancia corregida (Ac).

2º Método:
a) Se coloca agua destilada en la cubeta del aparato y se ajusta la absorbancia a cero.
b) Luego se mide la absorbancia del blanco de los reactivos y obtenemos Ab.
c) Por último se mide la absorbancia de (R+S) y se obtiene As.

AbAsAc 

Este último método se utiliza cuando el color de los reactivos es casi tan pronunciado
como el de la reacción. Si se ajustara la absorbancia a cero con el 1er método, la lectura de la
absorbancia de la reacción sería muy baja, moviéndose la aguja en una zona de la escala en la
cual el aparato tiene muy poca sensibilidad.

4.6. Cálculo del factor

Cuando se obtiene una recta, como en el caso I, que mantiene la proporcionalidad como
exige la Ley de Lambert y Beer, puede hallarse un factor para calcular la concentración

25
desconocida de una sustancia (S). Trazada la recta que pasa por el origen, si se toman dos
puntos sobre la recta para los cuales se verifica:

11 lcA 
22 clA 

Dividiendo miembro a miembro:
2
1
2
1
c
c
A
A


 y l son constantes porque l no varía por usarse la misma cubeta y  es el coeficiente de
extinción molar para la sustancia en estudio.
Luego: 1
2
2
1 AA
cc 
Donde: f
A
c

2
2
f: es el factor de la reacción en las condiciones utilizadas, con el cual podremos independizarnos
del gráfico. Este factor, que es un dato experimental, no es otra cosa que la inversa de la
pendiente de la recta. Entonces, para cualquier concentración desconocida (cx) se efectúa la
lectura Ax y se emplea la ecuación:
Axfcx 

5. DETERMINACION DE PROTEINAS PLASMATICAS

5.1. La reacción del Biuret: Fundamento

Las sustancias que contienen dos o más uniones peptídicas, forman un complejo
coloreado con sales de cobre en solución alcalina (reactivo del Biuret). La absorbancia de estos
complejos coloreados varía linealmente con la concentración de proteínas (cumple la Ley de
Lambert y Beer), dentro de ciertos límites.
En este trabajo práctico se construirá una curva de calibración usando como solución
testigo: albúmina bovina.

5.2. Otros métodos para valorar proteínas

5.2.1. Método de Lowry
Fundamento: El color obtenido es el resultado de:
a) La formación del complejo entre proteínas y el ion cúprico en medio alcalino (reacción del
Biuret).

26
b) Reducción del reactivo fosfomolíbdico-fosfotúngstico por acción de la tirosina y el triptofano
presentesen las proteínas. Se obtiene así una sensibilidad unas 100 veces mayor que la del
Biuret solamente.

5.2.2. Método de absorción en el ultravioleta
Fundamento: Las proteínas tienen una absorción máxima de la luz ultravioleta a 280 nm,
luego la lectura directa de una solución proteica en la  = 280, es un método rápido y sensible
para calcular la concentración de proteínas.

5.2.3. Método de Bradford
Fundamento: El colorante Coomasie Brillant Blue G250 existe en dos diferentes colores, azul y
rojo, la forma roja se convierte en la azul cuando el colorante se une a proteínas formando un
complejo de color azul. Este ensayo evita la mayor parte de las interferencias de los otros
métodos mencionados y puede ser aplicado a una gran variedad de muestras. Es un método muy
sensible debido al alto coeficiente de extinción del complejo formado. Rango de trabajo: 10 – 100
g. Puede reducirse la escala y llevarla al rango 1 – 10 g.

El aumento de la concentración de las proteínas plasmáticas (hiperproteinemia) o su
disminución (hipoproteinemia) están vinculados con diferentes patologías cuyo diagnóstico, debe
ser completado con el estudio de las diferentes fracciones proteicas mediante un proteinograma.

27
6. TRABAJO PRACTICO EXPERIMENTAL

DOSAJE DE PROTEINAS PLASMATICAS

DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DEL BIURET

1. Muestra
Suero sanguíneo de concentración proteica desconocida.

2. Reactivos
a) Solución saturada de hidróxido de sodio
Hidróxido de sodio p.a. 70 g
Agua destilada c.s.p. 100 ml
b) Solución de hidróxido de sodio 10%
Solución saturada 42,8 ml
Agua destilada c.s.p. 300 ml
c) Solución testigo de albúmina bovina 10 mg/ml:
Albúmina bovina 1 g
Cloruro de sodio 0,9% c.s.p. 100 ml
Disolver a temperatura ambiente.
d) Reactivo del Biuret
Sulfato cúprico penta hidratado p.a. 1,6 g
Tartrato de sodio y potasio puro 6,0 g
Solución de hidróxido de sodio 10% 300 ml
Agua destilada c.s.p. 1.000 ml
Disolver el sulfato cúprico y tartrato de sodio y potasio en aproximadamente 300 ml de
agua destilada, agregar 300 ml de solución de hidróxido de sodio 10% dejar enfriar y llevar a
volumen en un matraz aforado de 1 litro.

3. Material de laboratorio (por grupo de alumnos)
13 tubos de ensayo
1 pipeta de 0,1 ml graduada 1/1000
1 pipeta de 0,2 ml graduada 1/1000
1 pipeta de 1 ml graduada 1/100
1 pipeta de 2 ml graduada 1/10
1 pipeta de 5 ml graduada 1/10
1 gradilla para tubos de ensayo

4. Aparatos e instrumentos
Fotocolorímetro o espectrofotómetro

28
5. Técnica

5.1. Curva de calibración

Rotular un tubo de ensayo con la letra B (blanco) y cuatro tubos de ensayo con los
números 1, 2, 3, 4. Agregar los reactivos según se indica en el cuadro.

4 Orden de los tubos
en la gradilla

Sc. Testigo Prot. 10mg/ml

0,2

0,4

0,6

0,8

Agua destilada (ml)

1,8

1,6

1,4

1,2

Reactivo del Biuret

Mezclar y leer a los 20 minutos las absorbancias del contenido de cada uno de los tubos,
usando como blanco el contenido del tubo B, para llevar a 0. Usar filtro 546 nm y anotar los
resultados en este cuadro.

Absorbancia corregida
Cantidad de proteínas en los
testigos (mg) - 2 4 6 8

Reproducir "Absorbancias corregidas" en el cuadro de resultados del informe y con ellos
graficar en papel milimetrado la curva de calibración (Absorbancia corregida en función de mg
de proteína). El gráfico debe dar una recta que pasa por el origen.

5.2. Dosaje de proteínas totales en suero sanguíneo

Rotular dos tubos de ensayo con las letras B (blanco) y M (muestra). Colocar en los tubos
rotulados los reactivos en el orden que indica el siguiente cuadro.

Orden de los tubos en la gradilla

Suero (ml)

0,1

Agua destilada (ml)

1,9

Reactivo del biuret (ml)

Mezclar el contenido de cada tubo y esperar 20 minutos para que se desarrolle color. Leer
las absorbancias a 546 nm usando el contenido del tubo B como blanco. Anotar en este cuadro.

Absorbancia corregida

mg proteínas

Concentración de proteínas en g/100 ml

Buscar e indicar en la curva de calibración los mg de proteínas correspondientes a la
absorbancia de la muestra y anotarlas en la última columna. La última fila (g/100 ml) se calculará
en base a la cantidad de muestra utilizada, 0,1 ml de suero, teniendo en cuenta que se midió
directamente (sin diluir).
Ej.: Una muestra de suero sanguíneo da por el método del Biuret una absorbancia de
0,300. Suponiendo que esta absorbancia corresponda, según la curva de calibración, a 6 mg de
proteínas, calcular la concentración en g/100 ml si se utilizaron para la reacción 0,1 ml de suero.

0,1 ml de suero ––––––––– 6 mg de proteínas
100,0 ml de suero ––––––––– x mg de proteínas x = 6000 mg = 6g

Luego la concentración de proteínas = 6 g/100 ml de suero.
Reproducir las tres últimas filas del cuadro anterior en la hoja del informe y calcular la
concentración de proteínas totales. Este valor depende de la edad, sexo, y de la especie animal.
Su alteración tiene significado clínico en algunas enfermedades. Volcar estos resultados en el
último cuadro del informe.

30
Apellido y nombre:
Comisión:
Fecha:

INFORME DEL TRABAJO PRACTICO EXPERIMENTAL
DOSAJE DE PROTEINAS PLASMATICAS

1. Objetivo y fundamento

......................................................................................................................................................

2. Resultados

a) Curva de calibración

Tubo

Absorbancia
corregida

mg Proteínas

31
b) Gráfico

c) Dosaje de proteínas totales

Tubo

Absorbancia

mg Proteínas

g de proteínas/100 ml suero

3. Conclusiones

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................32
7. FRACCIONAMIENTO DE PROTEINAS PLASMATICAS: ELECTRO-
FORESIS

Introducción

Se denomina electroforesis al movimiento de partículas cargadas, presentes en una
solución, bajo la influencia de un campo eléctrico. Las partículas cargadas pueden ser enzimas,
ácidos nucleicos, lipoproteínas, glucoproteínas o elementos organizados como virus, bacterias,
espermatozoides.
En la electroforesis sobre soporte, la solución que contiene las sustancias a separar se
coloca (o siembra) sobre un soporte, embebido en un buffer adecuado, cuyos extremos están
sumergidos en sendas cubas cargadas con dicho buffer y conectadas a los electrodos provenientes
de una fuente de poder. Como soportes pueden utilizarse agar, gel de poliacrilamida, papel de
filtro, acetato de celulosa, etc.
En el trabajo práctico se realizará la electroforesis de proteínas plasmáticas en tiras de
acetato de celulosa: Proteinograma. El acetato de celulosa contiene la celulosa con parte o
todos los grupos -OH de las unidades de glucosa reemplazados por acetato. Esto elimina casi
enteramente las propiedades adsorbentes de la celulosa. Es un soporte delgado que presenta las
siguientes ventajas:
a) Mínima adsorción, separación de las fracciones más rápida y eliminación del color de base
más fácilmente.
b) Material homogéneo, microporoso y químicamente puro.
c) Se usa menos material biológico que con el papel.
d) Se puede transparentar para su "scanning", o cortar las bandas y medirlas
fotocolorimétricamente.
Las desventajas serían:
a) Tendencia a secarse durante la corrida por su delgadez.
b) Alta electroendósmosis.
c) Alto costo.
El proteinograma se efectuará con un equipo semejante al de la siguiente figura.

33
Una vez colocado el soporte adecuadamente, se siembra el suero en la zona indicada en la
figura, luego se aplica una corriente eléctrica para lograr la separación de las fracciones proteicas
según la especie, por ejemplo en bovinos las fracciones son albúminas, 1, 2,  y  globulinas.
Luego de efectuada la corrida electroforética, las fracciones proteicas separadas se pondrán de
manifiesto mediante la tinción de las mismas.
El aspecto de la tira coloreada (proteinograma) mostrando las zonas separadas es el
siguiente en una muestra de suero bovino:
Teoría de la electroforesis

En principio, podemos considerar que la velocidad de una partícula cargada es
directamente proporcional al campo eléctrico aplicado y la constante de proporcionalidad es
llamada movilidad m.
mHv  Donde
d
VH 

H = campo eléctrico v = velocidad de migración de la partícula
V = voltaje aplicado d = distancia entre electrodos

A su vez, la movilidad depende de la carga neta de la partícula, su radio, la viscosidad del
medio líquido en que se mueve y de la trama microcapilar del soporte sólido sobre el cual migra
(papel o acetato de celulosa), siendo además inversamente proporcional a la raíz cuadrada de la
fuerza iónica.
En condiciones de trabajo estándar (cubeta, soporte, soluciones buffers y voltaje
definidos) los factores que hacen que la movilidad (m) de cada una de las fracciones proteicas sea
diferente son principalmente su tamaño y su carga eléctrica neta. La carga eléctrica depende a
su vez del punto isoeléctrico de cada proteína y del pH del buffer elegido.
En general, en la realización del proteinograma se utiliza un buffer de pH alcalino (9,2) al
cual todas las proteínas del suero estarán cargadas negativamente, dependiendo la cantidad de
cargas del número de grupos –COO - , –O - de cada una de las fracciones proteicas. Si una
proteína tiene mayor cantidad de estos grupos, migrará más rápidamente hacia el polo positivo o
ánodo.
De todo lo dicho puede inferirse que las funciones del buffer serán:
a) Mantener el pH constante por encima del PI de las proteínas, para que los grupos –COO - y
–O - estén disociados.

34
b) Transportar la corriente eléctrica.
c) Proveer al medio de la fuerza iónica adecuada para lograr una eficiente movilidad de las
proteínas.

Otros factores que, si bien no influyen en la migración diferencial de las proteínas,
determinan una eficiente corrida electroforética son: intensidad de corriente, temperatura y
evaporación. La intensidad de la corriente eléctrica que depende del voltaje aplicado (V) y de la
resistencia de las tiras (R), genera un calentamiento de las mismas por efecto Joule, efecto que
explica la elevación de la temperatura de cualquier elemento que funcione como resistencia
eléctrica. Al aumentar la temperatura de las tiras, aumenta la evaporación del solvente en el
soporte, lo que se traduce en un aumento de la concentración del buffer. Esto a su vez implica un
aumento de la fuerza iónica 




   2
2
1 zc y por ende una disminución de la movilidad, que es
inversamente proporcional a  , como se dijo anteriormente.
La evaporación del solvente puede disminuirse trabajando con la cuba electroforética
cerrada. Esto producirá condensación del mismo en la cara interna de la tapa de la celda
electroforética. Cuando se trabaja a elevados voltajes es necesario refrigerar por medios
especiales las tiras electroforéticas.
Debido a que los extremos de las tiras están sumergidos en la cuba se generan corrientes
ascendentes de succión por capilaridad. Para que estas corrientes tengan igual velocidad es
importante que el nivel del buffer en los compartimientos electródicos sea el mismo.

(1) Succión por capilaridad. (2) Evaporación. (3) Condensación en la tapa.

Electroendósmosis

En la electroforesis sobre soporte debe tenerse en cuenta el fenómeno de
electroendósmosis. Como la electroforesis se realiza en presencia de un buffer de pH alcalino (en
nuestro caso veronal sódico pH 9,2), los grupos ionizables del soporte estarán cargados
negativamente (-COO- del acetato de celulosa) y se rodean de iones cargados positivamente.

35
Al aplicar la corriente eléctrica las partículas cargadas negativamente no se desplazan por
estar unidas al soporte mientras que las cargadas positivamente se desplazarán hacía el polo
negativo o cátodo. Esta corriente líquida que se desplaza en sentido contrario al de la corriente
eléctrica, se llama corriente electroendosmótica y el fenómeno se llama electroendósmosis.
Dicha corriente puede ser lo suficientemente fuerte como para arrastrar a moléculas neutras o con
pocas cargas negativas (como las  globulinas) en sentido contrario al resto de las proteínas,
como sí hubieran estado cargadas positivamente, sobre todo si la muestra fue sembrada cerca del
centro de la tira donde las corrientes de succión se anulan.
Considerando el conjunto de todas las fuerzas e interacciones que intervienen en una
corrida electroforética, el proceso final se puede resumir esquemáticamente en la siguiente figura.

Zona 1 Zona 2

La dirección de la corriente eléctrica será del polo negativo (-) hacia el polo positivo (+) y
la dirección de la corriente electroendosmótica, opuesta a la dirección de migración de la
corriente eléctrica, será entonces hacia el polo negativo (-). Las corrientes de succión en la zona 1
(según el esquema) es en el mismo sentido que la electroendósmosis y en la zona 2 a favor de la
corriente eléctrica. En la zona central las corrientes líquidas de succión se anulan.
Para que un proteinograma sea óptimo debe ser nítido y contrastado, o sea sus bandas
deben ser paralelas y bien marcadas, con buena resolución entre ellas (espacios blancos bien
definidos entre ellas).
Variaciones fisiológicas

a) En animales, las observaciones realizadas deben compararse con valores tomados como
normales, según la especie, la edad y técnica empleada. Se acepta generalmente que en los
sueros animales se encuentran las mismas fracciones que en el humano, si bien en
proporciones diferentes.
b) Los valores de las proteínas totales son menores durante la vida fetal y hasta 2 ó 3 meses delnacimiento, especialmente en la fracción  globulina, que es la que contiene la mayor parte de
los anticuerpos (los mamíferos los reciben durante la ingesta del calostro).
c) En el hombre y el perro el contenido de albúmina es superior al de globulinas, en cambio en
el caballo, vaca, oveja y cerdo la relación se invierte (ver cociente proteico
Albúmina/Globulinas en el siguiente cuadro).

Valores Normales de Proteínas Séricas en Diferentes Especies

Suero Proteínas Totales g/100ml
Albúminas
g/100ml
Globulinas
g/100ml

C.P.= Alb.
Glob.

Humano 6,0 – 8,0 3,2 - 4,5 2,7 - 3,6 1,0 - 1,8

Canino 5,5 – 7,5 2,6 - 4,0 2,1 - 3,4 1,0 - 1,7

Bovino 6,0 – 8,5 2,7 - 3,9 2,9 - 4,9 0,6 - 1,0

Ovino 6,0 – 8,0 2,7 - 3,7 3,2 - 5,0 0,4 - 0,8

Equino 6,0 – 8,0 2,4 - 3,8 2,5 - 4,6 0,5 - 1,0

Porcino 6,0 – 8,0 2,3 - 4,0 3,9 - 6,0 0,4 - 0,8

Aplicaciones clínicas

El conocimiento de los valores de un proteinograma constituye un valioso elemento de
juicio para elaborar un diagnóstico, pero siempre debe acompañarse de otros análisis y del
examen clínico del animal enfermo. Una disproteinemia puede cursar con normoproteinemia
(valores normales de proteínas totales) ya que es posible que el descenso de una fracción
compense el incremento anormal de otra. Por esto es importante determinar simultáneamente las
proteínas totales, el proteinograma y la relación Albúmina/Globulinas para adquirir una cabal
idea del estado clínico del paciente.

37
Hiperproteinemia

a) Puede ser causada por hemoconcentración debido a una deshidratación que provocará
hiperalbuminemia e hiperglobulinemia, de modo que se mantiene el cociente proteico
albúmina/globulina normal.
b) Problemas infecciosos e inflamatorios aumentan las proteínas plasmáticas totales por
aumento de síntesis de globulinas. El aumento de  globulinas se debe a estados de defensa
contra agentes infecciosos (inmunidad natural o adquirida por vacunación)
Las  y  globulinas aumentan también en procesos inflamatorios agudos y/o crónicos.

Hipoproteinemia
Resulta de una variedad de estados patológicos que se pueden agrupar en:
a) Desórdenes que producen pérdida de proteínas. Ej: Hemorragias, nefropatías, enteropatías.
b) Desórdenes causados por disminución de la síntesis de proteínas. Ejemplo: Insuficiencia
hepática, mala absorción, desnutrición, neoplasia hepática, que cursan con hipoalbuminemia;
o hipoplasia y neoplasia linfoide que presentan hipo  globulinemia.
c) En preñez y lactancia debido a las necesidades proteicas aumentadas. En ovinos la albúmina
disminuye en la primera mitad de la gestación, mientras la globulina disminuye en la etapa
final por lo que el calostro es rico en globulinas.

La electroforesis de proteínas séricas ha sido utilizada en estudios inmunoquímicos de
diversas enfermedades en distintas especies (fiebre aftosa, peste porcina, etc.).
En todo proceso inmunitario se produce un aumento de  globulinas (debido a la
generación de anticuerpos que se hallan presentes en dicha fracción) y muchas veces de las 
globulinas, cuando el organismo atacado se restablece y obtiene una verdadera resistencia a la
infección.

38
Proteinogramas normales y patológicos en distintas especies

39
8. TRABAJO PRACTICO EXPERIMENTAL

PROTEINOGRAMA ELECTROFORETICO

En la práctica se separarán por electroforesis las diferentes fracciones proteicas del suero
usando como soporte una lámina de acetato de celulosa y como buffer veronal sódico (pH 9,2).
Finalizada la separación, la lámina de acetato de celulosa se tiñe con un colorante (Amido
Schwartz) con el fin de que las distintas fracciones puedan observarse y determinarse
cuantitativamente.
Para la determinación cuantitativa se corta la tira ya teñida para separar las distintas
fracciones, luego se sumerge cada una de ellas en solución eluyente y se realizan las lecturas
fotocolorimétricas respectivas.

1. Material biológico
Suero sanguíneo no hemolizado.

2. Reactivos
a) Solución reguladora de pH 9,2
Dietilbarbiturato de sodio (veronal sódico) p.a. 8,24 g
Agua destilada c.s.p. 1.000 ml
b) Solución colorante
Amido Schwartz 10 B p.a. 5 g
Metanol puro 450 ml
Acido acético glacial puro 100 ml
Agua destilada 450 ml
c) Solución eluyente
Acido acético glacial puro 80 ml
Agua destilada 20 ml
d) Solución lavadora
Metanol puro 475 ml
Acido acético glacial puro 50 ml
Agua destilada c.s.p. 1.000 ml
e) Solución para preteñido del suero
Azul de bromofenol puro 0,1 g
Etanol puro (96% V/V) c.s.p. 100 ml
f) Solución para conservar las tiras
Metanol puro 80 ml
Agua destilada 120 ml

3. Material de laboratorio
1 gradilla para tubos de ensayo
6 tubos de ensayo

40
1 varilla de vidrio
1 pipeta graduada de 10 ml (1/10)
1 pipeta capilar o sembrador
1 policubeta o portaobjetos
1 tijera
1 tira de acetato de celulosa

4. Aparatos e instrumentos
Los equipos utilizados para electroforesis están constituidos por una fuente de poder que
suministra la fuerza electromotriz necesaria y una cuba electroforética.
Durante el trabajo práctico experimental se usarán también un transformador de corriente
(220-110 voltios) y un fotocolorímetro.

5. Técnica
Carga de los compartimientos electródicos: Colocar la cantidad apropiada de solución buffer de
pH 9,2 en los compartimientos electródicos, cuidando que el nivel del líquido llegue en ambos
casos hasta la misma altura.
Preparación de las tiras de acetato de celulosa: Sumergir las tiras de acetato de celulosa de 2,5
cm de ancho y 8,5 cm de largo en solución buffer de pH 9,2 durante 10 minutos para que se
impregnen bien con la misma. Retirar las tiras y eliminar el exceso de líquido secándolo con
papel de filtro (*). Inmediatamente, colocarlas sobre el soporte de la cuba electroforética tratando
de que queden bien tensas y que sus extremos se hallen sumergidos en cada uno de los
compartimientos.
Preparación de la muestra: Colocar dos gotas del colorante indicador (azul de bromofenol) en un
portaobjetos o policubetas. Inflamar hasta evaporar el solvente (etanol), dejar enfriar y agregar
dos gotas de suero sobre el residuo sólido del colorante. Mezclar hasta que el conjunto tome color
azul bien homogéneo. Este preteñido servirá como indicador del avance del frente de proteínas (o
sea de la albúmina).
Siembra de la muestra: Cargar el sembrador con la mezcla de suero y colorante. Retirar el exceso
de suero y apoyarlo suavemente del lado no brillante de la tira a 2 cm del compartimiento
catódico.

Esperar 3 minutos para que la muestra sea completamente adsorbida por el soporte y tapar
la cuba.

41
Ajuste de la intensidad de corriente: Conectar la cuba electroforética a la fuente de tensión de
manera que el cátodo se halle del lado que se sembró la muestra. Mediante el control de ajuste de
la corriente, aumentar la diferencia de potencial hasta que el miliamperímetro marque una
intensidad de corriente correspondiente a 1,5 - 2,0 miliamperes por tira. Mantener el sistema en
estas condiciones hasta que la albúmina, que corre coloreada, se desplace de 35 a 45 mm
(aproximadamente 45 minutos).
Coloración de las fracciones proteicas: Una vez finalizada la separación electroforética,
sumergir las tiras en el reactivo colorante de 3 a 5 minutos (no más). Eliminar el exceso de
colorante mediante sucesivos lavados con la solución lavadora hasta que ésta permanezca
incolora (generalmente bastan 3 lavados).

(*) IMPORTANTE: Debe tenerse especial cuidado en evitar que las tiras queden
expuestas al aire sin estar en contacto con el buffer. La deshidratación de las mismas puede
alterar irreversiblemente al acetato de celulosa.

6. Valoración cuantitativa:
La valoración cuantitativa de las fracciones puede realizarse por dos métodos:
densitometría y elución.

6.1. Densitometría (no se hace en este trabajo práctico experimental).El aparato utilizado en este caso es un densitómetro que mide la intensidad del color de
cada zona por transparencia o reflexión.
Primero la tira debe ser sometida a un tratamiento químico que la transparenta sin alterar
la intensidad de la tinción de cada fracción proteica.

Técnica de transparentación: Se sumerge la tira lavada 1º en metanol anhidro durante 1 minuto,
y 2º en una solución formada por: metanol (85 ml), ácido acético (14 ml) y glicerina (1 ml),
durante 2 minutos. Luego se coloca sobre una placa de vidrio y se deja en estufa a 70°C (o bajo
lámpara) durante unos minutos hasta transparencia completa. Se invierte la placa de vidrio sobre
el papel de filtro, se deja enfriar 20 minutos como mínimo y se separa la tira transparentada.

Luego se la coloca en el densitómetro, que esencialmente funciona como un
fotocolorímetro. La tira trasparentada se desplaza (como una diapositiva en un proyector)
perpendicularmente a un haz de luz. A medida que este haz intercepta las franjas coloreadas, las
absorbancias producidas son traducidas al movimiento de una pluma o aguja registradora que
va graficando el densitograma sobre un papel milimetrado que se desplaza sincrónicamente con
la tira electroforética.

La superficie de cada "pico" del densitograma (o forograma) obtenido representa la
cantidad de proteínas en la fracción respectiva.

Dicha superficie puede medirse mediante varios métodos que no se describirán en este
curso.
El porcentaje proteico de cada fracción se calcula mediante simples reglas de tres; por
ejemplo para  globulina:
%100
%
.
. 


totalSup
Sup o bien
ml
TPg
ml
g
totalSup
Sup
100
..
100
.
.




43
En el segundo caso es necesario valorar proteínas totales (g%) por cualquier otro método
(por ejemplo utilizando la reacción del Biuret).
Las ventajas principales del densitograma son que, conociendo bien la forma de la curva
normal, permite visualizar rápidamente alguna posible alteración patológica sin necesidad de
recordar cifras y que pueden informarse o archivarse junto con el proteinograma el cual, estando
transparentado, se conserva indefinidamente.
La desventaja reside en que el densitómetro es costoso, tiene una calibración algo
engorrosa y requiere además proteinogramas muy bien corridos (sin manchas ni franjas curvadas
o deformadas).

6.2. Elución. Es el método que se utilizará en el trabajo práctico experimental.
Para ello rotular seis tubos de ensayo: B, Alb., 1, 2,  y  globulinas, colocar en cada
uno 2 ml de solución eluyente.
Seleccionar la tira de manera que las fracciones queden separadas. Esto se logra cortando
por la parte media de la zona más clara que separa a las fracciones, como se indica en la figura.

Utilizar como blanco una sección de la misma tira de una superficie equivalente a la de
cualquiera de las fracciones y que no contenga colorante. Colocar los recortes así obtenidos en
los tubos de ensayos correspondientes. Dejar en contacto y agitar repetidamente durante el
tiempo necesario para que la tira y el colorante sean disueltos por la solución eluyente.
Realizar la lectura fotocolorimétrica contra un blanco a 620 nm.

7. Cálculos:
Una vez realizadas las lecturas en el fotocolorímetro se tendrán cinco valores de absorbancia:
AAlb, A1, A2, A y A. Sumando todas ellas obtenemos At, que representa la absorbancia total:
  AAAAAA albt 21
Para obtener la concentración relativa de cada una de las fracciones tendrá que tenerse en
cuenta que At representa 100%. Por lo tanto conociendo la absorbancia de cada fracción, por
regla de tres puede realizarse el cálculo. Calcular también la concentración absoluta de las
distintas fracciones teniendo en cuenta que la concentración de proteínas totales representa el
100% y conociendo la concentración relativa de cada fracción por regla de tres puede realizarse
el cálculo. Volcar estos resultados en el cuadro del informe. Luego hallar el cociente proteico
como se indica en el informe.

Apellido y nombre:
Comisión:
Fecha:

INFORME DEL TRABAJO PRACTICO EXPERIMENTAL
PROTEINOGRAMA ELECTROFORETICO

1. Objetivo y fundamento

......................................................................................................................................................

2. Resultados

Fracción Absorbancia corregida

Concentración relativa
(%)

Concentración
absoluta (g%)

Albúmina

1 globulina

2 globulina

 globulina

 globulina

Globulinas Totales

Proteínas totales

100

En general es muy utilizado el llamado cociente proteico que está dado por la relación
Albúmina/Globulinas:
GlobulinasdeiónConcentrac
AlbúninadeiónConcentracPC
..
.... 

Este cociente tiene importancia diagnóstica en situaciones patológicas.

3. Conclusiones

......................................................................................................................................................

GUIA TP 2016

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