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Z UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
 FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES IZTACALA 
 
 
 
 
ACTIVIDAD DE LOS COMPLEJOS RESPIRATORIOS EN 
MITOCONDRIAS AISLADAS DE HÍGADO, CORAZÓN Y RIÑÓN 
DE UN MODELO DE LA ENFERMEDAD DE HUNTINGTON. 
 
 
 
 
T E S I S 
 
 
 QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
 BIÓLOGO 
 P R E S E N T A : 
 
JOSÉ ENRIQUE MILLÁN BÁRCENAS 
DIRECTOR DE TESIS: 
DRA. EMMA BERTA GUTIÉRREZ-CIRLOS 
MADRID 
 
LOS REYES IZTACALA, EDO. DE MÉXICO, 2015 
 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
 
 
ACTIVIDAD DE LOS COMPLEJOS RESPIRATORIOS EN MITOCONDRIAS 
AISLADAS DE HÍGADO, CORAZÓN Y RIÑÓN DE UN MODELO DE LA 
ENFERMEDAD DE HUNTINGTON. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Este trabajo se realizó en el laboratorio de Bioquímica y Bioenergética (L-2) UBIMED, en la 
Facultad de Estudios Superiores Iztacala UNAM y con el apoyo de los donativos DGAPA, UNAM 
IN221611 y IN215915, CONACYT 102102. Se agradece a la Dra. Elizabeth Hernández Echeagaray 
por proporcionar el modelo murino. Al M en C Ernesto Mendoza y la M en C Tecilli Cabellos por 
su ayuda técnica. 
 
 
 
 
 
 
 
Agradecimientos 
 
A mi directora de tesis: Doctora Emma Berta Gutiérrez-Cirlos Madrid, por haberme dado la 
oportunidad de formar parte de su equipo de trabajo, además de su confianza, asesoría y 
enseñanzas que hicieron posible la elaboración de este proyecto. 
 
A la Doctora. Elizabeth Hernández Echeagaray, titular del laboratorio de Neurofisiología del 
desarrollo y neurodegeneración por proporcionar la información necesaria y el modelo murino 
para llevar a cabo esta investigación. 
 
A la M. en C. Tecilli Cabellos Avelar por brindarme los principios teóricos y prácticos los cuales 
fueron de suma importancia para realizar este trabajo. 
 
Al M. en C. Ernesto Mendoza Duarte por la ayuda técnica y consejos necesarios en este trabajo 
 
A mis compañeros de laboratorio: Laura, Ana, Alejandra, Viridiana, Dulce, Gerardo, Led y Obed, a 
los cuales tuve la oportunidad de conocer en durante la realización de este proyecto, y que me 
brindaron su ayuda cuando lo necesite, además de su agradable compañía y amistad. 
 
A mis sinodales: Elizabeth Hernández Echeagaray, Martha Ofelia Salcedo Alvares, Josefina Vázquez 
Medrano y Héctor Barrera Escorcia, quienes con sus consejos sentaron los fundamentos básicos de 
esta investigación y me hicieron sentir orgulloso de ser Biólogo. 
 
A la UNAM la máxima casa de estudios de este país, por permitirme ser parte de sus filas y recibir 
una educación de alto nivel. En especial a la Facultad de Estudios Superiores Iztacala FESI, a la cual 
le estoy muy agradecido por lo fascinante e inigualable que fue realizar la licenciatura en este 
lugar, que fomento mi desarrollo académico y personal, mediante todos los académicos que me 
dieron clases. 
 
 
Dedicatorias. 
A mis padres Guadalupe Bárcenas y José Millán, por el apoyo incondicional y absoluto, el cual me 
permitió terminar esta carrera, además por haberme educado en libertad y siempre dar lo mejor 
día con día. Por darme las herramientas y el carácter necesarios que me han permitido tomar 
decisiones firmes para enfrentarme los retos de la vida cotidiana. 
A mis hermanos Evelin y Bryan, por haber compartido conmigo varias experiencias, puntos de vista 
que aunque son distintos, siempre es muy agradable escuchar, pero sobre todo por crecer y 
madurar juntos. También Alberto nuestro primo que con el tiempo se convirtió en un hermano 
más. 
A mi abuela Juana por enseñarme tantas cosas de la vida y contarme esas historias tan graciosas 
que siempre tienen moraleja, pero sobre todo por permitirme vivir en sus aposentos razón muy 
importante para haber llegado hasta aquí. A todas mis tías que con su carácter me mostraron 
como superar etapas difíciles en la vida. 
A todos mis primos con los cuales compartí parte de mi niñez, travesuras y risas. A todas mis 
primas de las cuales también tengo muy buenos recuerdos y además me han apoyado a terminar 
este proyecto en especial Katia. 
 
A mis amigos de mi calle con los cuales crecí, y me dan su apoyo moral y amistad hasta estos días 
y con los que disfruto mucho tener en equipo de futbol gracias a todos ellos. 
 
A Laura una persona muy especial e importante, la cual me ha apoyado mucho tanto en las buenas 
como en las malas, académicamente como moralmente y sobre todo soportar mi carácter un poco 
impulsivo, muchas gracias Laura de nuevo y espero que seas una gran profesionista. 
A mis compañeros de carrera los BITTLOS Luis Arratia, Ricardo Gutiérrez (el Wuapo), Ricardo 
Gutiérrez y Luis Arratia, Emmanuel Molina (el Flaco), Víctor Velázquez (el Galeno), Alexis Gallegos 
(el Gallos), Erick González, Darío García (el Zorro) y Julio Godínez (el Julito), con los cuales tuve la 
suerte de encontrarme y de vivir muchas experiencias buenas y malas, locuras, pero sobre todo ese 
debraye tan característico de cada uno de ellos. También a mis compañeras Juliana, Alejandra, 
Paola Margarita, María ,Esther y Andrea, con las cuales disfrute mucho de esas charlas. Y a otros 
compañeros no menos importantes como: Adan, Daniel (el chanfle), chavita Fernando (el más 
chavo de mis chavos) Juanote, Manolo todos y los manolos, que poco a poco se fueron uniendo a 
nuestra convivencia. A todos ellos les agradezco por haberme enseñado con sus acciones el 
significado de la palabra amistad. 
 
 
 
Contenido 
Abreviaturas…………………………………………………………………………………………………...1 
 Resumen…………………………………………………………………………………………..................3 
1. Introducción ..................................................................................................................................... 5 
1.1. Estructura de la mitocondria .............................................................................................................. 5 
1.2. Cadena respiratoria ............................................................................................................................. 7 
1.2.1. Complejo I (NADH: ubiquinona oxidorreductasa) ................................................................... 7 
1.2.2. Complejo II (succinato: ubiquinona oxidorreductasa) ............................................................ 8 
1.2.3. Complejo III (ubiquinol: citocromo c oxidorreductasa). .......................................................... 8 
1.2.4. Complejo IV (citocromo c oxidasa o COX) ............................................................................... 9 
1.2.5. Complejo V (ATP-sintasa) .......................................................................................................... 9 
1.3. Disfunción mitocondrial ..................................................................................................................... 10 
1.4. Enfermedad de Huntington .............................................................................................................. 11 
1.5. Ácido 3-nitropropiónico (3NP) .......................................................................................................... 11 
1.6. Métodode criopreservación conDimetil-sulfóxido (DMSO) ........................................................ 13 
2. Hipótesis ......................................................................................................................................... 15 
3. Objetivos ......................................................................................................................................... 15 
4.Metodología ..................................................................................................................................... 16 
4.1. Grupo Experimental .......................................................................................................................... 17 
4.2. Método de Criopreservación ............................................................................................................ 17 
4.3. Aislamiento de Mitocondrias de hígado ......................................................................................... 17 
4.4. Aislamiento de mitocondrias de corazón y riñón .......................................................................... 18 
4.5. Cuantificación de Proteína ............................................................................................................... 19 
4.6. Obtención de la concentración de citocromos por espectro de absorción ............................... 19 
4.7. Medición de las actividades enzimáticas por Oximetría .............................................................. 20 
5. Resultados...................................................................................................................................... 21 
5.1. Hígado. ................................................................................................................................................ 21 
5.2. Cuantificación de proteína mitocondrias aisladas de hígado. ........ ¡Error! Marcador no definido. 
5.3. Espectros de absorción de las mitocondrias aisladas de hígado. . ¡Error! Marcador no definido. 
5.4. Actividadde los complejos respiratorios en mitocondrias aisladas de hígado.. ¡Error! Marcador 
no definido. 
6. Corazón .......................................................................................................................................... 29 
6.1. Cuantificación de proteína de mitocondrias aisladas de corazón. . ¡Error! Marcador no definido. 
 
 
6.2. Espectros de absorción de mitocondrias aisladas de corazón. .................................................. 30 
6.3. Actividad de los complejos respiratorios en mitocondrias aisladas de corazón. ..................... 32 
 
7. Riñón. ............................................................................................................................................. 36 
7.1. Cuantificación de proteína mitocondrias aisladas de riñón. ............ ¡Error! Marcador no definido. 
7.2. Espectros de absorción de mitocondrias aisladas de riñón. ....................................................... 37 
7.3. Actividad de los complejos respiratorios en mitocondrias aisladas de riñón. ........................... 39 
 7.4.Valores de rendimiento de la actividad mitocondrial………………………………………………………….42 
8. Discusión ........................................................................................................................................ 44 
9. Conclusiones . ................................................................................................................................ 49 
 
13. Anexos. ........................................................................................................................................ 50 
Estadísticos realizados a la actividad de mitocondrias aisladas de hígado sin criopreservación. Control vs 3-
NP ................................................................................................................................................................. 50 
Estadísticos realizados a la actividad de mitocondrias aisladas de corazón sin criopreservación. Control vs 
3-NP.............................................................................................................................................................. 51 
Estadísticos realizados a la actividad de mitocondrias aisladas de riñón sin criopreservación. Control vs 3-
NP ................................................................................................................................................................. 52 
Estadísticos realizados a la actividad de mitocondrias aisladas de hígado con criopreservación. Control vs 
3-NP.............................................................................................................................................................. 53 
Estadísticos realizados a la actividad de mitocondrias aisladas de corazón con criopreservación. Control vs 
3-NP.............................................................................................................................................................. 54 
Estadísticos realizados a la actividad de mitocondrias aisladas de riñón con criopreservación. Control vs 3-
NP ................................................................................................................................................................. 55 
 Estadísticos realizados a la actividad de complejo i en mitocondrias de corazón control y 3-np con y sin 
DMSO…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..56 
 Estadístico ANOVA para dos muestras independientes, realizados a los valores de concentración obtenidos 
de citocromos de mitocondrias aisladas hígado con criopreservación. Control vs 3-NP……………………………….57 
14. Bibliografía................................................................................................................................... 59 
 
 
1 
 
Abreviaturas 
 
ADN: Ácido desoxirribonucleico 
ATP: AdenosÍn trifosfato 
Ca+2 : Calcio 
RNAr: Ácido ribonucleico ribosomal 
RNAt: Ácido ribonucleico de transferencia 
NADH: Nicotinamida adenina dinucleótido 
ADP: AdenosÍn difosfato 
Pi: Fosfato 
FMN: Flavín mononucleótido 
pH: Potencial de hidrógeno 
Fe-S: Fierro-azufre 
ROS: Espacies reactivas de oxígeno 
FDH2: Flavín adenin dinucleótido reducido 
O2: Oxígeno molecular 
H2O: Agua 
HD: Enfermedad de Huntington 
3-NP: Ácido 3 nitropropiónico 
NMDA: N-metil D-aspartato 
DMSO: Dimetil sulfóxido 
EDTA: Ácido etilendiaminotetracético 
EGTA: Ácido etilenglicoltetracético 
U.V : Ultravioleta 
SDS: Dodecilsulfato sódico 
BSA: Suero fetal de bovino 
TMPD: Tetrametil-P-enilendiamina 
DBH2 : Decil hidroxiquinol 
2 
 
SDH: succinato deshidrogenasa 
Cox: citocromo c oxidasa 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 
 
Resumen. 
La cadena respiratoria mitocondrial es considerada como la fuente principal de energía 
para la célula. Alteraciones en la función de algunos de sus componentes, han sido 
implicados en la muerte de células neuronales, la cual se encuentra asociada a 
desordenes neurodegenerativos como la enfermedad de Huntington (HD), la cual se 
caracteriza por movimientos o posturas involuntarias (corea, disquinesia y distonia), 
además de déficits cognitivos y psiquiátricos. Algunas características de esta enfermedad 
se pueden reproducir utilizando modelos fenotípicos, los cuales son una alternativa en 
fines prácticos para el estudio más detallado de esta enfermedad. La administración de 3-
NP en roedores induce una respuesta muy similar a la HD, este es metabolito del 
nitropropanol, el cual en la naturaleza se encuentra como una toxina fúngica y en algunasleguminosas, que al ser ingeridas por animales o humanos se evidencia intoxicación y 
problemas en las funciones motoras. El 3-NP interrumpe la cadena respiratoria 
mitocondrial a través de la inhibición del complejo II (succinato deshidrogenasa), lo que 
tiene por consecuencia déficit energético y neurodegeneración, además de problemas en 
otros procesos celulares como síntesis de proteínas y la restauración de gradientes 
iónicos. Se sabe que la administración de 3-NP, causa degeneración principalmente en el 
estriado en roedores y primates no humanos, además de producir déficits cognitivos y 
movimientos coreformes. 
Visto la capacidad de esta toxina, para reproducir algunos de los daños neuronales 
característicos de la HD, en este trabajo se investigó si el 3-NP es capaz de afectar las 
funciones energéticas de otros órganos del cuerpo como: hígado, corazón y riñón. En este 
caso se utilizó un modelo sub-crónico de la enfermedad de Huntington, el cual imita las 
etapas tempranas de esta enfermedad, esto en ratones machos de la cepa C57BL/6. La 
administración del 3-NP fue en una dosis de 15mg/Kg vía intraperitoneal durante 5 días. 
4 
 
Posteriormente se obtuvo el hígado, corazón y riñón de cada individuo, los cuales fueron 
dividíos a su vez en dos grupos, sin y con medio de criopreservación. En el primer caso, 
cada uno de los órganos, fue únicamente congelado con nitrógeno líquido y almacenado a 
-70°C. En el segundo caso se agregó a cada uno de los órganos 30% Dimetil-Sulfóxido 
(DMSO), una sustancia generalmente utilizada como un agente crioprotector que puede 
contrarrestar el daño producido por el congelamiento, el cual es otro de los objetivos de 
este trabajo. 
En las oximetrías realizadas a las mitocondrias aisladas de órganos sin criopreservación, 
se observó disminución en la actividad de complejo II (succinato deshidrogenasa), en 
hígado y corazón de individuos tratados con 3-NP, al encontrar en ambos órganos una 
diferencia significativa de *P<0.05 con respecto al control, en los demás los valores de 
actividad resultaron similares. En cuanto a riñón los valores de actividad de los complejos 
respiratorios no se encontraron diferencias significativas. 
Por lo que se refiere a los órganos congelados con medio criopreservación (DMSO), no se 
encontraron diferencias significativas en valores de la actividad mitocondrial, en ninguno 
de los tres casos, realizando una comparación con las mitocondrias aisladas de órganos 
sin criopreservación, los valores de actividad son en algunos casos iguales o menores. 
Con esto se puede decir que el Dimetil-Sulfóxido (DMSO) no tuvo el efecto esperado. 
 
 
 
 
 
5 
 
1. Introducción. 
Dentro de las células de mamíferos las mitocondrias son el sitio del metabolismo aerobio, 
mecanismo mediante el cual la energía de los enlaces químicos de las moléculas de 
alimento se captura para impulsar la síntesis dependiente de oxígeno del trifosfato de 
adenosina (ATP), la molécula de almacenamiento de energía de la célula. En las 
mitocondrias se llevan a cabo procesos metabólicos fundamentales como: el ciclo de 
Krebs, la beta-oxidación de ácidos grasos, la síntesis de aminoácidos, hierro y la 
homeostasis de calcio. Además se relacionan con la producción de radicales libres y son 
reguladores clave de la apoptosis celular (Nouette-Gauilain et al., 2007, Mackee et al., 
2009). 
1.1 Estructura de la mitocondria. 
La mitocondria es un organelo citoplasmático de forma generalmente elipsoide de un 
tamaño que varía entre 0.5 a 1µm de diámetro y aproximadamente 7µm de longitud, su 
forma, tamaño, así como la cantidad en cada célula depende de los requerimientos 
energéticos de cada tejido (May-Panlop et al., 2006). Se encuentra delimitada por dos 
membranas: una externa la cual es lisa y permeable a moléculas de hasta 10 kDa, así 
como algunos polipéptidos y aminoácidos. Estos se mueven libremente a través de una 
serie de canales compuestos por proteínas semejantes a las porinas bacterianas, las 
cuales se encargan de formar poros no específicos, esto posibilita el intercambio de 
moléculas entre la mitocondria y el citoplasma. Además contiene las enzimas: monoamino 
oxidasa, colina fosfotransferasa, fosfolipasa A, acetil graso CoA, quinurenina hidroxilasa. 
La membrana interna contiene aproximadamente un 75% de su masa en proteínas, 
presenta invaginaciones llamadas crestas donde las únicas moléculas que pueden cruzar 
son aquellas para las que existen transportadores específicos. En esta membrana se 
localizan las enzimas de la cadena respiratoria mitocondrial, carnitina acetil CoA 
6 
 
transferasa, glicerol 3-fosfato deshidrogenasa, translocasa de glutamato-aspartato 
(Lehninger et al., 2006). Entre estas dos membranas se encuentra el espacio 
intermembranal el cual contiene las enzimas: adenilato cinasa, nucleósido difosfato 
cinasa, creatina cinasa. La matriz está rodeada por la membrana interna y en ésta se 
encuentra el complejo de la piruvato deshidrogenasa, las enzimas del ciclo del ácido 
cítrico, y de la β-oxidación de los ácidos grasos, citrato sintasa, la ruta de oxidación de 
aminoácidos y el ADN mitocondrial. Este contiene 16 569 pares de bases que codifican 
para 37 genes, 22 para RNAt, 2 de RNAr y 13 para sintetizar 13 proteínas de la cadena 
respiratoria (Lehninger et al., 2006; Solano et al., 2001). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura1. Estructura general de la mitocondria con la membrana externa, espacio intermembranal y membrana 
interna. La matriz mitocondrial contiene en su interior partículas de ATP-sintasa que se muestran en círculos rosas, el 
DNA mitocondrial en filamentos azules, ribosomas y gránulos en círculos azules y naranja respectivamente (Frey et al., 
2000). 
 
7 
 
1.2. Cadena respiratoria. 
En la membrana interna mitocondrial existen cinco complejos enzimáticos, con diferentes 
potenciales de óxido-reducción y dos acarreadores móviles de electrones (ubiquinona y 
citocromo c). Los primeros cuatro complejos constituyen la cadena respiratoria 
mitocondrial, estos poseen grupos prostéticos capaces de aceptar y donar electrones. En 
este proceso se oxidan los equivalentes redox (NADH y FAD2) para la reducción de 
oxígeno y la formación de agua. La transferencia de electrones por la cadena respiratoria 
esta acoplada a la translocación de protones de los complejos I, III y IV. Este fenómeno 
contribuye a que se forme un gradiente de pH entre la matriz y el espacio intermembranal 
(∆pH) y un potencial de membrana (∆Ψ). El complejo V acopla el retorno de protones del 
espacio intermembranal hacia la matriz, para la síntesis de ATP a partir de ADP y Pi 
(Morán et al., 2012; May-Panloup et al., 2006). A continuación se describirán brevemente 
cada uno de los complejos respiratorios. 
1.2.1. Complejo I (NADH: ubiquinona oxidorreductasa). 
Es el más grande de la cadena respiratoria, se compone de 45 a 46 unidades 
polipeptídicas diferentes, de las cuales 7 están codificadas por el ADN mitocondrial. 
Contiene una flavoproteína con flavín mononucleótido (FMN) y como mínimo seis centros 
fierro azufre. La estructura general es en forma de L con un brazo embebido en la 
membrana interna el cual es hidrofóbico y una porción hidrofílica que se prolonga hacia la 
matriz, este complejo cataliza dos procesos simultáneos: la transferencia de electrones 
del NADH hacia el mononucleótido de flavina (FMN) y a los centros fierro azufre, los 
cuales transfieren los electrones de la flavina hacia la ubiquinona. Este complejo bombea 
cuatro protones desde la matriz al espacio intermembranal. Puede ser inhibido con 
rotenona, un producto vegetal utilizado frecuentemente como insecticida, que bloquea el 
flujo electrónico desde los centros Fe-S a la ubiquinona (Lehninger et al., 2006). 
8 
 
1.2.2. Complejo II (succinato: ubiquinona oxidorreductasa). 
Es el complejo más pequeño de la cadenarespiratoria y la única enzima del ciclo del 
ácido cítrico ligada a la membrana, contiene 4 subunidades codificadas en el ADN 
nuclear, este complejo cataliza la oxidación de succinato a fumarato dentro de la matriz 
mitocondrial. Tiene tres centros fierro-azufre, un hemo b, y flavín adenín dinucleótido 
(FAD) como grupo prostético, los electrones se desplazan desde el succinato hacia FAD, 
posteriormente a través de los tres centros hierro azufre a la ubiquinona. Es decir, la 
oxidación de succinato a fumarato por la reducción de FAD a FDH2 (Chem et al., 2007). El 
hemo b no se encuentra en la ruta principal de la transferencia de electrones, pero 
protege de la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés) 
que pueden ser generados por la cadena respiratoria (Lehninger et al., 2006). La actividad 
de este complejo es sensible al inhibidor malonato (Wojtovich et al., 2008). Sin embargo 
también se utilizan otros compuestos como el 2-thenoyltrifluroacetona (TTFA), carboxina y 
ácido 3-nitropropiónico (3-NP) (Sun et al., 2006). 
1.2.3. Complejo III (ubiquinol: citocromo c oxidorreductasa). 
La estructura de este complejo es un dímero, conformado por dos monómeros idénticos, 
compuestos por 11 subunidades polipeptídicas, de las cuales 10 están codificadas en el 
ADN nuclear. Esta enzima consta de tres componentes redox: el citocromo b, el cual tiene 
dos hemos (bH y bL), una proteína fierro-azufre un citocromo c1. Este complejo acopla la 
transferencia de electrones desde ubiquinol hacia el citocromo c, acompañado de la 
translocación de protones. El paso de electrones y protones en el complejo se explica 
mediante el ciclo Q (Lehninger et al., 2006), en el cual el hemo bL localizado en el lado 
positivo de la membrana es el sitio de oxidación de ubiquinol (Qp), el cual también es el 
sito de salida de protones y el hemo bH que se encuentra en el lado negativo de la 
membrana es el sitio reductor de ubiquinona (Qn), por el cual entran los protones al 
9 
 
complejo. La oxidación de ubiquinol (QH2) en el sitio (Qp) tiene como resultado la 
transferencia de un electrón, que es transportado al centro fierro-azufre para reducir al 
citocromo c1 y posteriormente al complejo IV, otro electrón es transferido al sitio (Qn) para 
reducir ubiquinona a semiquinona. En este proceso es necesario otro ciclo de oxidación 
de ubiquinol y reducción de semiquinona en el sitio (Qn). Con este proceso se translocan 
cuatro protones a través de la membrana mitocondrial por cada dos electrones 
transferidos desde ubiquinol al citocromo c. La antimicina es una sustancia utilizada 
generalmente como inhibidor del complejo III ya que bloquea al ciclo Q uniéndose al 
hemo bH del citocromo b (Casey et al., 2011; Devlin: 2004). 
1.2.4. Complejo IV (citocromo c oxidasa o COX). 
Es la enzima terminal de la cadena respiratoria, se compone de 13 subunidades, 3 de 
ellas están codificadas en el ADN mitocondrial. En su estructura tiene dos grupos hemo 
(a, a3,) y dos centros de cobre conocidos como CuA y CuB. El hemo a3 se une al CuA para 
formar un centro binuclear implicado en la transferencia de cuatro electrones desde el 
citocromo c hacia el O2 para formar H2O, además también participa en la translocación de 
protones de la matriz hacia el espacio intermembranal. El cianuro es utilizado para inhibir 
la actividad de este complejo (Murray et al., 2007; Lehninger et al., 2006). 
1.2.5. Complejo V (ATP-sintasa). 
 Este complejo cataliza la formación de ATP a partir de ADP y fosfato inorgánico (Pi), el 
cual ocurre por la utilización de la fuerza protón motriz que se genera por la cadena 
respiratoria. En mitocondrias de bovino tiene de 16 subunidades diferentes de las cuales 2 
son codificadas en el ADN mitocondrial. Posee dos componentes distintos, un centro 
catalítico F1 la cual es la porción soluble de la proteína y una parte hidrofóbica F0, que es 
integral de la membrana. La F1 se compone 6 subunidades, α, β, δ, ε, posee tres sitos 
catalíticos de los cuales 2 pueden tener diferentes nucleótidos ADP y Pi o ATP quedando 
10 
 
el tercero libre, esta subunidad tiene la acción de un catalizador rotatorio. Estos se 
encuentran unidos con la F0 por las subunidades, δ, γ, ε el cual realiza una rotación de 
360 ° para la síntesis de ATP, la actividad de este complejo pude ser inhibida con 
oligomicina (Lehninger et al., 2006). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Representación esquemática de la cadena respiratoria mitocondrial. Se muestra flujo electrónico a través de 
los cuatro complejos del I al IV (flechas blancas) acompañado de la translocación de protones de la matriz al espacio 
intermembranal por los complejos I, III y IV (flechas grises). Además el citocromo c y ubiquinona (CoQ), así como la 
ATPsintasa (complejo V). (http.//www. (Neurowikia es/content características de la cadena respiratoria. Fecha de 
actualización: 25 feb-2015). 
 
1.3. Disfunción mitocondrial. 
Alteraciones en el transporte de electrones dentro de la cadena respiratoria, provoca 
déficit en la síntesis de ATP, producción de radicales libres y apoptosis celular (Morán et 
al., 2012). La disfunción mitocondrial y el estrés oxidativo son parte de los mecanismos 
celulares de la neurodegeneración y varias enfermedades como Huntington (Hernández-
Echeagaray et al., 2012). 
11 
 
1.4. Enfermedad de Huntington. 
La enfermedad de Huntington (HD por sus siglas en inglés) es un trastorno 
neurodegenerativo autosómico dominante, caracterizado por movimientos involuntarios y 
déficits cognoscitivos. Se manifiesta cuando el gen que codifica para la proteína 
huntingtina localizado en la región 4p16.3 en el brazo corto del cromosoma 4, muestra un 
incremento en el número de tripletes CAG. La huntingntina mutada tiene una elongación 
en el sitio N-terminal del aminoácido glutamina, esta resulta citotóxica para el tejido 
cerebral principalmente en el núcleo estriado (Lasprilla et al., 2003), el cual forma parte de 
los ganglios basales y se ubica en el interior de los hemisferios cerebrales. Esta estructura 
involucra al caudado, putamen y el globus pallidus, los cuales se encargan de controlar 
los procesos motores, cognitivos, de memoria y de conducta emocional (Purves et al., 
2007). Estudios realizados en tejido cerebral demuestran alteraciones en los complejos 
mitocondriales II-III en el núcleo caudado de pacientes con HD. También se ha 
demostrado que la expresión de constituyentes muy importantes para el complejo II como 
las proteínas hierro- azufre y el FAD se reduce en pacientes con HD (Benchoua et al., 
2006). 
1.5. Ácido 3-nitropropiónico (3-NP). 
Se han diseñado diferentes maneras de abordar la neurodegeneración que causa HD, 
para lo cual existen modelos farmacológicos, que mediante una técnica experimental (que 
no implique manipulación genética) se produce una respuesta con características muy 
similares a las de la enfermedad. El modelo con 3-NP es uno de los más utilizados para 
reproducir la HD, debido a que imita la histopatología del padecimiento. Este es un 
metabolito del nitropropanol que se encuentra en la naturaleza como una toxina fúngica 
propia del género Arthrinium, también de algunas plantas leguminosas como Indogofera o 
Astragalus, que al ser ingeridas por animales o humanos genera intoxicación y problemas 
12 
 
en las funciones motoras. Esta toxina actúa como inhibidor crónico e irreversible del 
complejo II succinato deshidrogenasa, bloqueando la oxidación de succinato a fumarato y 
la síntesis de ATP, que tiene como consecuencia neurodegeneración preferencial en el 
estriado (Brouillet et., al 2005). El 3-NP también activa la producción de caspasas, las 
cuales son proteasas relacionadas con la apoptosis celular. Además afecta el potencial de 
membrana, lo que activa indirectamente los receptores N-metil-D-aspartato (NMDA), 
resultando en una entrada excesiva de calcioa la célula, lo que provoca muerte neuronal. 
Influye en la relocalización del citocromo c hacia el citosol y promueve la producción 
masiva de especies reactivas de oxígeno (ROS) (Brouillet et., al 2005). Se ha observado 
disfunción mitocondrial del complejo II en ratas y en primates no humanos produciendo 
degeneración en el estriado, movimientos anormales y déficits cognoscitivos altamente 
relacionados con la HD (Brouillet et al., 1999). 
El efecto neurotóxico del 3-NP depende de la manera de la aplicación, por ejemplo 
intramesenquimal induce isquemia, mientras que la inducción intraperitoneal produce 
degeneración en el estriado, el cual muestra el fenotipo de la HD. El género de los 
animales utilizados en los modelos experimentales también influye, ya que las ratas 
hembras son menos sensibles que los machos, lo que sugiere que la protección de los 
estrógenos afecta el grado de sensibilidad. El 3-NP resulta más tóxico en ratas que en 
ratones y entre las cepas de estos, por ejemplo las ratas Fisher son más susceptibles que 
las Sprague-Dawley y en ratones las cepas C57BL/6 y Balb/c resultan ser más resistentes 
con respecto a las 129SVEMS y FVB/n. Los modelos de la HD también dependen del 
periodo y la dosis de la administración del 3-NP, la concentración de 20mg/kg en ratas 
induce el comportamiento del fenotipo de la HD después de dos inyecciones, pero no se 
genera lesión en el estriado una característica frecuente en los estados iniciales de esta 
enfermedad. En administraciones crónicas en las cuales se emplean dosis bajas de 
13 
 
10mg/kg por día durante tres semanas, genera alteraciones metabólicas y otras 
características celulares de pacientes con HD, pero no causa no causa el comportamiento 
como los movimientos llamados coreas. 
Vistas estas diferencias de respuesta del tratamiento de 3-NP entre cepas de animales, 
se designó la administración de dosis bajas de 15mg/kg vía intraperitoneal bajo un 
periodo sub-crónico de 5 días en ratones de la cepa C57BL/6, los cuales se sabe que son 
más resistentes a la toxicidad del 3-NP. Con este modelo se tiene la ventaja de observar 
los cambios histopatológicos, también de imitar los estados iniciales de la enfermedad, 
además de provocar alteraciones motoras y comportamientos parecidos al fenotipo de la 
enfermedad de Huntington (Rodríguez et al., 2010; Hernández-Echeagaray et al., 2012). 
En este trabajo se investigó el efecto que tiene este tratamiento sub-crónico de 3-NP en la 
actividad de las mitocondrias de hígado, corazón y riñón. 
1.6. Método de criopreservación con Dimetil-sulfóxido (DMSO). 
Para obtener una información más completa sobre la actividad mitocondrial se realizan 
distintos análisis de bioenergética. Los estudios son generalmente inmediatamente 
después del aislamiento, esto sin embargo en algunas ocasiones requiere grandes 
cantidades de tejido. Además estos experimentos pueden ser relativamente largos, lo cual 
contribuye al deterioro de la función mitocondrial. Recientes avances han demostrado la 
eficacia de la preservación de los tejidos a largo plazo, que permite realizar experimentos 
adicionales sin necesidad de obtener una muestra fresca. La actividad mitocondrial 
generalmente se analiza en biopsias de músculo esquelético, en el cual la muestra es 
congelada y posteriormente se realizan métodos enzimáticos de histoquímica y análisis 
moleculares (Kuznetsov et al., 2003). En estudios previos se ha demostrado la 
conservación de mitocondrias de hígado congelado y descongelado utilizando dimetil-
sulfóxido (DMSO) (Fuller et al., 1989). Este es un compuesto orgánico derivado de la 
14 
 
pulpa de la celulosa, básicamente inodoro utilizado generalmente como solvente ya que 
es dipolar, así como por su estabilidad a la mayoría de sales básicas y neutras, además 
su bajo nivel de toxicidad (Gaylor Chemical Company 2007). En este trabajo se evaluó 
efecto crioprotector del Dimetil-sulfóxido (DMSO), contra el daño por congelamiento en los 
tejidos: hígado, corazón y riñón almacenados a -70°C. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
15 
 
2. Hipótesis. 
 
 
Si la administración de ácido 3-nitropropionico por vía intraperitoneal induce daño 
principalmente en neuronas y en músculo esquelético en el modelo farmacológico de la 
enfermedad de Huntington, es posible que también afecte a las mitocondrias de órganos 
como: hígado, corazón y riñón. Además si el Dimetil-sulfóxido (DMSO) resulta un buen 
agente crioprotector, es posible que pueda contrarrestar el daño celular producido por el 
congelamiento en estos órganos. 
 
 
 3. Objetivos. 
 Medir la actividad de los cuatro complejos respiratorios por medio de oximetría, en 
mitocondrias aisladas de hígado, corazón y riñón de ratones control y 3-NP 
congelados con y sin Dimetil-sulfóxido (DMSO). 
 
 Evaluar el efecto que tiene la administración del 3-NP en los complejos 
respiratorios de estas mitocondrias. 
 
 
 Evaluar si existe un efecto crioprotector sobre las mitocondrias aisladas de órganos 
tratados con Dimetil-sulfóxido (DMSO). 
16 
 
4. Metodología. 
 
 
 
. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ratones machos 
657BL/6 
 
Grupo 3-NP 
15mg/Kg diluido en buffer 
de fosfatos 0.1M pH 7.4 
Durante 5 días 
 
Grupo control 
Buffer de fosfatos 0.1M 
pH7.4 
Durante 5 días 
 
 
 
 Almacenados con y sin 
DMSO 30% a -70°C 
-70°C 
 
 
 
Medición de los 
complejos respiratorios 
por oximetría 
 
 
 
Cálculo concentración 
de citocromos por 
espectro de absorción 
 
 
 
Medición de concentración 
de proteína por U.V. y 
método de Lowry 
 
 
 
Extracción de mitocondrias 
 
 
 
Sacrificio de animales 
 
Hígado (n=4) 
 Corazón (n=3) 
 Riñón (n=3) 
 
 
 
 
 
 
 
Extracción de órganos 
Hígado n=4 
 Corazón n=3 
Riñón n=3 
 
 
 
 
 
Extracción de 
órganos 
 
 
 
17 
 
4.1. Grupo Experimental. 
Se utilizaron de ratones machos de la cepa C57BL/6, de aproximadamente cuatro 
semanas de edad, alojados en cajas de plástico con libre acceso de agua y comida. Los 
cuáles fueron divididos en: grupo control y con tratamiento de 3NP. 
El grupo control fue tratado con buffer de fosfatos PB 0.1M pH 7.4 que se utilizó como 
vehículo del fármaco, el cual se reintrodujo vía intraperitoneal durante cinco días. En el 
grupo tratado el 3-NP se aplicó vía intraperitoneal 15mg/Kg diluido en PB a pH 7.4 
durante cinco días con dos días de descanso. Los animales se sacrificaron 48 horas 
después de la última dosis de 3-NP, posteriormente se colectaron los órganos: hígado, 
corazón y riñón de ambos grupos, los cuáles fueron colocados en tubos por separado 
(todo en hielo) y a su vez subdivididos en dos grupos: con y sin medio de 
criopreservación. Los animales fueron obtenidos y tratados por el laboratorio número 6 de 
neurofisiología del desarrollo y la neurodegeneración (Dra. Elizabeth Hernández 
Echeagaray) de la UBIMED, FES I, UNAM. 
4.2. Método de Criopreservación. 
Consistió lavar los órganos colectados con 250mM de sacarosa, posteriormente se 
agregaron 500µl de medio que contiene (10mM de Tris-HCl 1mM EDTA, 320mM 
sacarosa) pH 7.4 frío a 4C°, adicionado con 30% de DMSO a cada uno. Posteriormente 
se almacenaron a -70C° para evitar algún daño celular (Kuznetsov., 2003). 
4.3. Aislamiento de Mitocondrias de Hígado. 
El aislamiento de mitocondrias de hígado se realizó de acuerdo al método descrito por 
(Frezza et al., 2007). Todo el procedimiento se hizo en hielo a 4C°. Cada hígado se lavó 
con medio de aislamiento IBc (0.01M Tris-MOPS, 0.001M EGTA-Tris, 0.2M sacarosa, 
concentraciones finales) pH 7.4 frío a 4°C. Después se agregaron 5ml de medio IBc y se 
18 
 
cortó en trozos pequeños. Se retiró el medio de aislamiento utilizado en el corte y se 
agregaron 5ml de nuevo. La solución se homogenizó manualmente. Después se 
centrifugó 600g por 10 minutosa 4°C en un rotor SS-34 (Sorvall), el sobrenadante fue 
centrifugado de nuevo a 7,000g durante 10 minutos a 4°C. La pastilla obtenida fue 
resuspendida en 5ml de medio IBc frío a 4C° y centrifugado nuevamente a 7000g por 10 
minutos a 4C°. Las mitocondrias obtenidas fueron resuspendidas en volumen mínimo de 
150µl-200µl del sobrenadante obtenido de la misma centrifugación. La muestra se 
congeló con nitrógeno líquido. Finalmente se almacenó a -70C°. 
4.4. Aislamiento de mitocondrias de corazón y riñón. 
El método de aislamiento de mitocondrias de corazón y riñón se realizó a 4C°. Se 
utilizaron dos corazones y un par de riñones por cada extracción. Cada tejido fue 
descongelado y pesado e inmediatamente lavado tres veces con buffer de aislamiento 
que contiene: 0.22M de manitol, 0.07M de sacarosa, 1mM de EDTA, 10mM de Tris-HCI, 
0.5mg/ de albúmina, pH 7.4 a 4C°. Posteriormente fueron colocados en vasos de 
precipitados con 10ml por 1g de tejido del mismo buffer de aislamiento y se cortó en 
pedazos pequeños utilizando tijeras de disección .Se retiró el buffer y se agregaron 
nuevamente 10ml por cada 1 gramo de tejido, este fue transferido se homogenizó 
utilizando un taladro, cual fue sumergido siete veces en la solución hasta que el tejido 
fue completamente triturado (este paso se realizó solo en corazón), se tomó una alícuota 
de 30µl de este homogenizado para poder calcular la concentración de proteína total del 
tejido. Luego se centrifugó a 750xg durante 10 minutos utilizando una mini-centrifuga 
EPPENDORF 5418, se recuperó el sobrenadante y se centrifugó nuevamente a 8,000xg 
durante 10 minutos. Posteriormente se recuperó la pastilla y fue resuspendida en 1ml de 
buffer de aislamiento, nuevamente centrifugado a 8,000xg durante 10 minutos (este paso 
se realizó por duplicado). Las mitocondrias fueron resuspendidas en volumen mínimo de 
19 
 
150µl-250µl del sobrenadante (Valdez et al., 2006; Hung et al., 1995). Por último las 
mitocondrias fueron congeladas con nitrógeno líquido y posteriormente almacenadas a 
una temperatura de -70C°. 
4.5. Cuantificación de Proteína. 
La determinación de la concentración de proteína de las mitocondrias se realizó por 
absorbancia en U.V. utilizando el espectrofotómetro Biomate3. Para este método se 
preparó la solución de 0.6% de SDS en agua bidestilada el cual se utiliza como referencia, 
posteriormente se tomaron 10µl de las mitocondrias aisladas, las cuales fueron diluidas en 
990µl de la solución de SDS. Se midió la absorbancia de esta solución a 280nm. Se 
calculó la concentración de proteína, tomado como referencia regla que un valor de 
absorbancia de 0.12 equivale a 10mg/ml (Glick y Pon, 1995). 
4.6. Determinación de la concentración de citocromos por espectro de 
absorción. 
Se realizaron espectros de absorción diferencial reducido con ditionita menos oxidado, de 
las mitocondrias aisladas de hígado, corazón y riñón, en un intervalo de longitud de onda 
de 400-650nm con el espectrofotómetro de doble haz Aminco DW2, modernización de 
OLIS. Para ello se utilizó el modo split el cual consiste en que un monocromador hace un 
barrido de los 400 a los 650nm de longitud de onda e induce un haz de luz sobre la 
muestra y la referencia (de la misma longitud de onda). 
Se realizó una línea base con buffer de 50mM fosfatos (pH 7) a la cual se agregó 1mg de 
proteína de las mitocondrias aisladas; esta fue la muestra oxidada después se agregó 
ditionita para reducir las mitocondrias y se realizó el barrido. Posteriormente se restó el 
espectro reducido, menos el espectro oxidado para obtener el espectro diferencial. 
Después se midió la absorbancia de los citocromos mediante su pico alfa: citocromo 
20 
 
c550nm, citocromo b560nm, citocromo a600nm. Para calcular las concentraciones de los 
citocromos presentes se tomaron los coeficientes de extinción 17.5 mM-1 cm-1 para cit c, 
25 mM-1 cm-1 para cit b 24mM-1 cm-1 para cit a (Yu et al., 1972; Degli et al., 1986). Por 
último se calculó la concentración µM de citocromos mediante la ecuación de Lambert-
Beer: A= c b ε donde A=absorbancia obtenida, c= concentración de la solución, b= paso de 
la luz a través de la celdilla, ε=coeficiente de extinción molar. 
4.7. Medición de las actividades enzimáticas por Oximetría. 
Se utilizó la unidad de control del electrodo CB1-D3 y la cámara de oxígeno DW1 de la 
marca Hansatech calibrado con ditionita. Se realizó el ensayo para medir consumo de 
oxígeno de los cuatro complejos mitocondriales: NADH deshidrogenasa, succinato 
deshidrogenasa, ubiquinol citocromo c reductasa o bc1, citocromo c oxidasa, en buffer de 
complejos (75mM de Manitol, 250mM de Sacarosa, 10mM de Fosfatos de Potasio 
Monobásico,100mM de Cloruro de potasio, 0.5mM EDTA,1mg/ml BSA , 20mM Tris) pH 
7.4 a temperatura ambiente. Para cada experimento se agregaron 0.6mg de proteína de 
las mitocondrias aisladas de hígado y riñón, y 0.4mg para las mitocondrias de corazón. 
Los reactivos se adicionaron en el siguiente orden y concentración: 50µM NADH, 20µM 
rotenona, 10mM succinato, 10mM de malonato, 10µM citocromo c oxidado, 50µM de 
DBH2, µM antimicina, 2 µM ascorbato, 5mM TMPD, 1mM de cianuro de sodio. Se 
obtuvieron las pendientes de cada reactivo y se calculó el consumo de oxígeno en cada 
una considerando la concentración de 253.4 nmol/ml de O2 en agua, a una temperatura de 
25°C (Kunz et al., 1993). Por último el análisis estadístico de los valores obtenidos fueron 
analizados con ANOVA de una vía y prueba de Tukey´s para múltiples comparaciones 
utilizando el programa GraphPad Prism versión 6.0 para Windows, considerando P<0.05 
como valor de significancia. 
 
21 
 
5. Resultados. 
5.1 Hígado. 
Se registró el peso de cada uno de los hígados y se analizaron los valores obtenidos de 
cada grupo. Los resultados de los tejidos almacenados sin criopreservación, no mostraron 
diferencias entre los hígados control y tratados con 3-NP. Por lo que se refiere a tejidos 
almacenados con Dimetil-sulfóxido (DMSO) los valores de peso, son semejantes entre el 
control y 3-NP. Posteriormente se aislaron las mitocondrias de hígado de cada grupo, y se 
calculó la cantidad de proteína total, por el método de Lowry y U.V. En mitocondrias 
aisladas de hígados sin criopreservación, los valores calculados por ambas técnicas, no 
mostraron diferencias significativas entre el control y 3-NP. Por lo que se refiere a las 
mitocondrias aisladas de hígados con DMSO, la cantidad de proteína también es similar 
entre el grupo control y 3-NP por ambos métodos, sin embargo los valores resultaron 
ligeramente más elevados en este grupo, con respecto a los hígados almacenados sin 
criopreservación. Por ambos métodos la cantidad de proteína mitocondrial obtenida 
resultó suficiente para realizar los experimentos, con lo que se confirmó que la técnica de 
extracción de mitocondrias es eficiente (tabla 1). 
Tabla 1. Valores de peso y mg de proteína total de mitocondrias de hígado. 
Promedios de los pesos en (gr) registrados de hígados control y 3-NP, con y sin medio de criopreservación con DMSO 
de cada uno de los individuos utilizados en este experimento. Valores de proteína obtenidos (mg totales) por método 
U.V y Lowry de mitocondrias aisladas n=4. 
 
 
Hígado sin DMSO 
 
 Hígado con DMSO 
Control 
 
3-NP 
 
Control 
 
 
3-NP 
Peso (gr) 
 
1.24 1.22 1.15 1.21 
U.V. (mg totales) 14.32 
 
15.30 18.36 16.80 
Lowry (mg totales) 13.43 11.27 
 
17.59 16.41 
22 
 
5.3. Espectros de absorción de las mitocondrias aisladas de hígado. 
 
Como se mencionó anteriormente los citocromos transportan electrones, tienen como 
grupo prostético un hemo que alterna reversiblemente entre los estados de oxidación Fe 
(II) y Fe (III). El grupo Fe (II) de los citocromos absorbe radiación electromagnética en el 
rango de luz visible y su espectro de absorción presenta tres máximos: las bandas α, β y γ 
de 400-650nm. Laλ max de la banda α, varía característicamente en los diferentes 
citocromos y es útil para su diferenciación. De acuerdo al espectro de absorción en 
mitocondrias, se encuentran tres tipos de citocromos, a, b y c, localizados entre los 550 a 
650nm (McGilveri et al.1977). Es importante identificar cada uno para conocer su 
concentración mediante el pico de absorbancia. 
Se obtuvieron los espectros de absorción de mitocondrias aisladas de hígado, en los 
cuales identificaron los picos (α) de los citocromos: c (550nm) b (560nm) y a (600nm). En 
mitocondrias aisladas de hígado sin medio de criopreservación (Figura 3A), el grupo 
control mostró la concentración más alta en los tres casos, el citocromo c, tiene los 
valores más elevados seguido del citocromo b, citocromo a respectivamente, aunque en 
este último la concentración es más elevado con respecto al grupo 3-NP, sin embargo los 
demás valores son similares con los tratados. Por el contrario en mitocondrias aisladas de 
hígado con criopreservación (Figura 4A), el grupo 3-NP tiene los valores más altos en los 
tres citocromos, la mayor diferencia se observa en el citocromo b (Tabla 2). Por otro lado, 
al realizar la amplificación de los espectros de absorción se encontró una distorsión 
cercana a en los 585nm, la cual se podría tratar de hemoglobina esto en (Figura 3B) y 
(Figura 4B). 
 
 
23 
 
Espectros de Absorción de mitocondrias aisladas de hígado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Espectro de absorción (reducido con ditionita-oxidado) de mitocondrias aisladas de hígado control y 3-NP sin 
criopreservacion. A) Se muestran los picos α de los citocromos: c (550nm), b (560nm) y a (600nm), en un intervalo de 
400-650nm. B) Amplificación del espectro de absorción en un intervalo de 500-650nm, en la cual se observa una 
distorsión cercana a los 585nm (flecha color rojo). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Espectro de absorción (reducido con ditionita-oxidado) de mitocondrias aisladas de hígado control y 3-NP 
con criopreservacion. A) Se muestran los picos α de los citocromos: c (550nm), b (560nm) y a (600nm), en un intervalo 
de 400-650nm. B) Amplificación del espectro de absorción en un intervalo de 500-650nm, en la cual se observa una 
distorsión cercana a los 585nm (flecha color rojo). 
A) 
A) 
B) 
B) 
24 
 
 
Tabla 2. Concentración de citocromos. * 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Valores promedio calculados en concentración (nmol/mg de proteína) de citocromo: a, b y c, de mitocondrias aisladas 
de hígado control y 3-NP con y sin medio de criopreservación con DMSO n=4. 
 
5.4. Actividad de los complejos respiratorios en mitocondrias aisladas de 
hígado. 
 
Una de las características de la enfermedad de Huntington es la degeneración estriatal, la 
cual está basada en la excitotoxicidad (Hickey et al 2000). Sin embargo defectos en el 
metabolismo energético mitocondrial pueden ser la base del desarrollo de esta 
enfermedad (Browne et al., 1997), se especula que el modelo 3-NP también genera 
exitotoxicidad por mediadores de glutamato en el estriado y además tiene como efecto 
bloquear el funcionamiento del complejo II (SDH), enzima del ciclo de ácido y de la 
fosforilación oxidativa, lo que puede desencadenar un daño rápido y severo en el 
organismo, por la reducción en los niveles de ATP y a la interrupción del suplemento de 
oxígeno (Brouillet et al., 2005). En este trabajo se midió la actividad de los complejos 
respiratorios de mitocondrias aisladas de hígado, para averiguar si existe una posible 
influencia del 3-NP, en este modelo temprano de la enfermedad de Huntington. Por otro 
lado se evaluó el efecto crioprotector del dimetil-sulfóxido (DMSO) (Figura 5). 
 
tipo de 
citocromo 
Hígado sin DMSO Hígado con DMSO 
Control 3-NP 
 
Control 
 
3-NP 
 
citocromo c 0.26 0.24 0.22 0.34 
citocromo b 0.20 0.22 0.16 0.30 
citocromo a 0.14 0.04 0.06 0.07 
25 
 
B 
 D 
Sin Criopreservación 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Con Criopreservación 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Trazos representativos de la actividad mitocondrial medida por oximetría, realizados a mitocondrias aisladas 
de hígado. A) control y B) 3-NP, sin criopreservación. C) control y D) 3-NP con criopreservacion, se utilizaron 0.6 mg de 
proteína. a los cuales se agregó mit: mitocondrias, rot: rotenona, succ: succinato, mal:malonato, cit c: citocromo c, 
DBH2:Decil hidroxiquinol, anti: antimicina, asc/TMPD: ascorbato/TMPD, cit c: citocromo c, CN: cianuro. 
A 
C 
26 
 
Complejo I (NADH: ubiquinona oxidorreductasa). 
 La actividad del complejo I de mitocondrias aisladas de hígado sin criopreservación, el 
grupo control fue ligeramente mayor al grupo 3-NP. Sin embargo no existen diferencias 
significativas entre ambos grupos (Figura 6A), por lo que la administración de 3-NP no 
afectó la actividad de este complejo en mitocondrias aisladas de hígado. En mitocondrias 
aisladas de hígado con criopreservación con DMSO, no se observó diferencia entre los 
grupos control y 3-NP (Figura 6B). 
Complejo II (succinato: ubiquinona oxidorreductasa). 
Los valores obtenidos de este complejo muestran que el grupo control tiene mayor 
actividad, ya que se observó una disminución en el grupo 3-NP, en este caso se 
encontraron diferencias significativas *P<0.05 entre ambos grupos. La administración de 
3-NP, como era de esperarse, afectó la actividad del complejo II (Figura 6C). Por lo que 
se refiere a los valores de actividad de mitocondrias aisladas de hígado con 
criopreservación los valores de este complejo, no mostraron diferencias significativas 
entre el control y 3-NP (Figura 6D). 
Complejo III (ubiquinol: citocromo c oxidorreductasa). 
La actividad de este complejo resultó ligeramente mayor en el grupo control con respecto 
al 3-NP, aunque no fue una variación significativa, con lo cual se puede decir que la 
administración de 3-NP no afectó la actividad del complejo III (Figura 6E), de igual manera 
en mitocondrias de hígados con criopreservación (Figura 6F) 
Complejo IV (citocromo c oxidasa o COX). 
Los valores registrados de actividad del complejo IV en mitocondrias de hígado fueron 
muy similares entre el grupo control y 3-NP, con lo que se puede decir que la 
administración de esta toxina no influyó este complejo (Figura 6G). Lo cual se podría 
correlacionar con el contenido de citocromos c y b, ya que los valores registrados son muy 
27 
 
similares entre ambos grupos. A diferencia del contenido de citocromo a, el cual se ve 
disminuido en mitocondrias del grupo 3-NP. En mitocondrias aisladas de hígado con 
criopreservación no se mostraron diferencias significativas (Figura 6H). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
* 
 
 
D C 
B A 
* 
28 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Actividad de los complejos respiratorios de mitocondrias aisladas de hígado control y tratado con 
3-NP, sin y con medio de criopreservación Dimetil-sulfóxido (DMSO). (A complejo I sin criopreservación, 
B) complejo I con criopreservación, C) complejo II sin criopreservación, D) complejo II I con 
criopreservación, E) complejo III sin criopreservación, F) complejo III con criopreservación, G) complejo IV 
sin criopreservación, H) complejo IV con criopreservación. Se encontraron diferencias significativas en el 
complejo II entre el control y tratados con 3-NP, solo en órganos sin criopreservación (P<0.05 Prueba de 
Anova para dos muestras independientes) n=4. 
E 
8
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F 
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H G 
29 
 
6. Corazón. 
Los resultados obtenidos de peso de los corazones utilizados para realizar este trabajo, 
resultaron muy semejantes, tanto en el grupo control como en el tratado con 3-NP, esto 
se observó en órganos almacenados sin y con medio de criopreservación. En este caso 
se decidió calcularla cantidad de proteína total del homogenado, antes de obtener las 
mitocondrias. Los valores obtenidos de corazones almacenados sin DMSO, muestran una 
disminución en la cantidad de proteína en el grupo control con respecto al tratado con 3-
NP, en órganos almacenados con medio de criopreservación los valores son muy 
semejantes entre control y tratado. La cantidad de proteína mitocondrial obtenida por los 
métodos UV y Lowry, en mitocondrias aisladas de corazón sin medio de conservación, el 
grupo control mostró valores más bajos con respecto al 3-NP, aunque estas diferencias 
son mayores en los valores obtenidos del homogenado. Por lo que se refiere a las 
mitocondrias aisladas de corazón con criopreservación, los resultados son semejantes en 
el grupo control como 3-NP tanto en la proteína mitocondrial como en el homogenado 
(Tabla 3). 
Tabla 3. Valores de peso y mg de homogenado y proteína de mitocondrias de corazón. 
Promedios de lo peso en (gr) registrados de corazones control y 3-NP, con y sin medio de criopreservación con DMSO 
de cada uno de los individuos utilizados en este experimento. Valores de proteína obtenidos (mg totales) por método 
U.V y Lowry de mitocondrias aisladas n=3 
 
 
 
Corazón sin DMSO 
 
 Corazón con DMSO 
Control 
 
 
3-NP Control 
 
 
3-NP 
 
Peso (gr) 
 
0.18 0.20 0.23 0.22 
Homogenado 
(mg totales) 
 
 
1.68 
 
 
3.03 
 
3.02 
 
2.84 
U.V. (mg totales) 0.87 0.98 
 
1.34 1.01 
Lowry (mg totales) 
 
0.86 1.09 1.57 1.29 
30 
 
 6.1 Espectros de absorción de mitocondrias aisladas de corazón. 
 
Se realizó el espectro de absorción de mitocondrias aisladas de corazón de los grupos 
control y 3-NP para cuantificar los citocromos a, b y c. Se identificaron los picos de los 
citocromos c (550nm), b (560nm) y a (600nm), los cuales fueron utilizados para obtener 
las concentraciones. Los resultados en mitocondrias aisladas de corazón sin medio de 
criopreservación (Figura 8A), los valores de los tres citocromos fueron ligeramente más 
elevados para el grupo 3-NP con respecto al grupo control. Por el contrario en 
mitocondrias aisladas de corazón con criopreservación (Figura 9A), los resultados fueron 
mayores para los citocromos c y b del grupo control, solo el citocromo a fue más elevado 
en el grupo 3-NP (Tabla 4). En ambos espectros se detectó una distorsión cercana a los 
585nm, la que puede estar relacionada con la presencia de hemoglobina (Figura 8B) y 
(Figura 9B). 
Espectros de Absorción de mitocondrias aisladas de corazón control y 3-NP, sin criopreservación. 
 
 
 
. 
 
 
 
Figura 8. Espectro de absorción (reducido con ditionita-oxidado) de mitocondrias aisladas de corazón control y 3-NP 
sin criopreservacion. A) Se muestran los picos α de los citocromos: c (550nm), b (560nm) y a (600nm), en un intervalo 
de 400-650nm. B) Amplificación del espectro de absorción en un intervalo de 500-650nm, en la cual se observa una 
distorsión cercana a los 585nm (flecha color rojo). 
A) B) 
31 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 9. Espectro de absorción (reducido con ditionita-oxidado) de mitocondrias aisladas de corazón control y 3-NP 
con criopreservacion. A) Se muestran los picos α de los citocromos: c (550nm), b (560nm) y a (600nm), en un intervalo 
de 400-650nm. B) Amplificación del espectro de absorción en un intervalo de 500-650nm, en la cual se observa una 
distorsión cercana a los 585nm (flecha color rojo). 
 
 
Tabla 4. Concentración de citocromos de mitocondrias aisladas de corazón. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Valores promedio calculados en concentración (nmol/mg de proteína) de citocromo: a, b y c, de mitocondrias aisladas 
de corazón control y 3-NP con y sin medio de criopreservación con DMSO n=3. 
 
 
 
 
tipo de 
citocromo 
 
Corazón sin DMSO Corazón con DMSO 
Control 
 
3-NP 
 
Control 3-NP 
citocromo c 0.90 1.0 1.24 0.79 
citocromo b 0.64 0.76 0.90 0.62 
citocromo a 0.34 0.5 0.40 0.47 
A) 
B) 
32 
 
A B
) 
6.2. Actividad de los complejos respiratorios en mitocondrias aisladas de 
corazón. 
 En este trabajo se midió la actividad de los cuatro complejos mitocondriales por 
oximetría, en mitocondrias aisladas de corazón control y 3-NP sin medio de 
criopreservación. En la figura 8 se muestran los trazos representativos obtenidos. 
Sin Criopreservación 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Con Criopreservación 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 10. Trazos representativos de la actividad mitocondrial medida por oximetría, realizados a mitocondrias 
aisladas de corazón. A) control y B) 3-NP, sin criopreservación. C) control y D) 3-NP con criopreservacion, se utilizaron 
0.6 mg de proteína. a los cuales se agregó mit: mitocondrias, rot: rotenona, succ: succinato, mal:malonato, cit c: 
citocromo c, DBH2 :Decil hidroxiquinol, anti: antimicina, asc/TMPD: ascorbato/TMPD, cit c: citocromo c, CN: cianuro. 
D 
C 
33 
 
 
Complejo I (NADH: ubiquinona oxidorreductasa). 
Tanto en mitocondrias aisladas de corazón sin y con criopreservación, la actividad del 
complejo I fue muy similar entre el grupo control y el 3-NP, con lo que podemos decir que 
la administración de 3-NP en este caso no influyó en la actividad del complejo I (Figura 7A 
y 7B). 
Complejo II (succinato: ubiquinona oxidorreductasa). 
 En mitocondrias aisladas de corazón sin DMSO, los valores obtenidos de este complejo 
muestran que el grupo control tiene mayor actividad, además se observó una disminución 
de la actividad en el grupo 3-NP, la cual mostró diferencias significativas *P<0.05 entre 
ambos grupos (Figura 7C. y 7D.). Esto era de esperarse, ya que en investigaciones 
realizadas previamente en corazón de ratones tratados con 3-NP, se ha encontrado una 
disminución significativa en la actividad del complejo II, por otro lado se ha evaluado el 
efecto de esta toxina en la toxicidad cardiaca in vivo en ratas y se observó que es un 
inhibidor competitivo de la succinato deshidrogenasa (Gabrielson et al., 2001). En 
mitocondrias aisladas de corazón con criopreservación, no se encontraron diferencias 
significativas para este complejo. 
 
Complejo III (ubiquinol: citocromo c oxidorreductasa). 
 En mitocondrias aisladas de corazón con y sin criopreservación, la actividad de este 
complejo fue muy similar entre ambos (Figura 7E y 7F). 
 
Complejo IV (citocromo c oxidasa o COX). 
En este caso se observó que los valores registrados de actividad del complejo IV en 
mitocondrias de corazón con y sin DMSO fueron muy similares entre el grupo control y 3-
NP, con lo que se puede decir que la administración de esta toxina no influye este 
34 
 
complejo (Figura 7G y 7H), por otro lado las concentraciones de citocromos c, b y a fueron 
similares entre el grupo control y 3-NP. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A B 
C D 
* 
35 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 11. Actividad de los complejos respiratorios de mitocondrias aisladas de corazón control y tratado 
con 3-NP, sin y con medio de criopreservación Dimetil-sulfóxido (DMSO). (A complejo I sin 
criopreservación, B) complejo I con criopreservación, C) complejo II sin criopreservación, D) complejo II I 
con criopreservación, E) complejo III sin criopreservación, F) complejo III con criopreservación, G) complejo 
IV sin criopreservación, H) complejo IV. Se encontraron diferencias significativas en el complejo II entre el 
control y tratados con 3-NP, solo en órganos sin criopreservación (P<0.05, Prueba de Anova para dos 
muestras independientes) n=3. 
E F 
G H 
36 
 
7. Riñón 
En este estudio se evaluó el posible efecto de 3-NP sobre mitocondrias aisladas de este 
órgano. Antes de realizar los experimentos se registró el peso de cada par de riñones 
utilizados en este trabajo, los valores obtenidos de los tejidos almacenados sin medio de 
criopreservación fueron muy similares entre el grupo controly 3-NP. Por lo que se refiere 
a los riñones congelados con DMSO, los valores como en el primer caso también 
resultaron semejantes. La cantidad de proteína obtenida en mitocondrias aisladas de 
riñón sin criopreservación no mostró diferencias entre el control y 3-NP, esto tanto en la 
técnica de U.V como en Lowry. En riñones almacenados con DMSO los valores de 
proteína resultaron semejantes entre el control y el grupo tratado, esto se observó en 
ambas metodologías, aunque menores con respecto al grupo sin criopreservación los 
resultados se muestran en la Tabla 5. 
 
Tabla 5. Pesos registrados y mg totales de proteína mitocondrial obtenida de riñones control. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Promedios de lo peso en (gr) registrados de riñones control y 3-NP, con y sin medio de criopreservación con DMSO de 
cada uno de los individuos utilizados en este experimento. Valores de proteína obtenidos (mg totales) por método 
U.V y Lowry de mitocondrias aisladas n=3. 
 
 
 
Riñón sin DMSO 
 
 Riñón con DMSO 
Control 
 
3-NP 
 
Control 
 
 
3-NP 
 
Peso (gr) 
 
0.24 0.26 0.23 0.22 
Homogenado 
(mg totales) 
 
 
4.37 
 
 
4.68 
 
 
3.02 
 
 
2.84 
 
U.V. (mg totales) 3.14 3.27 
 
1.34 1.01 
Lowry (mg totales) 
 
2.68 3.23 1.54 1.63 
37 
 
7.1 Espectros de absorción de mitocondrias aisladas de riñón. 
Se localizaron los citocromos c, b y a en las mitocondrias aisladas de riñón y se calculó la 
concentración de cada uno de ellos. En mitocondrias aisladas de riñones sin 
criopreservación (Figura 13A), la concentración obtenida de citocromo c resultó 
ligeramente mayor en el grupo 3-NP, en los citocromos b y c las concentraciones fueron 
muy similares entre ambos grupos Por lo que se refiere al grupo con criopreservación 
(Figura14A), los valores de los tres citocromos mostraron diferencias, ya que el grupo 
tratado con 3-NP muestra las concentraciones más altas (Tabla 6).Aunque el espectro de 
absorción obtenido muestra una perturbación cercana a los 600nm posiblemente por la 
presencia de hemoglobina (Figura 13B) y (Figura 14B). 
Espectros de Absorción de mitocondrias aisladas de riñón control y 3-NP, sin criopreservación. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 13. Espectro de absorción (reducido con ditionita-oxidado) de mitocondrias aisladas de riñón control y 3-NP sin 
criopreservacion. A) Se muestran los picos α de los citocromos: c (550nm), b (560nm) y a (600nm), en un intervalo de 
400-650nm. B) Amplificación del espectro de absorción en un intervalo de 500-650nm, en la cual se observa una 
distorsión cercana a los 585nm (flecha color rojo). 
A) 
Figura 
9. 
Espect
ro de 
absor
ción 
(reduc
ido 
con 
ditioni
ta-
oxida
do) de 
mitoc
ondria
s 
aislad
as de 
coraz
ón 
contro
l y 3-
NP 
con 
criopr
eserva
cion. 
A) Se 
muest
ran 
los 
picos 
α de 
los 
B) 
Figura 
9. 
Espect
ro de 
absor
ción 
(reduc
ido 
con 
ditioni
ta-
oxida
do) de 
mitoc
ondria
s 
aislad
as de 
coraz
ón 
contro
l y 3-
NP 
con 
criopr
eserva
cion. 
A) Se 
muest
ran 
los 
picos 
α de 
los 
38 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 14. Espectro de absorción (reducido con ditionita-oxidado) de mitocondrias aisladas de riñón control y 3-NP con 
criopreservacion. A) Se muestran los picos α de los citocromos: c (550nm), b (560nm) y a (600nm), en un intervalo de 
400-650nm. B) Amplificación del espectro de absorción en un intervalo de 500-650nm, en la cual se observa una 
distorsión cercana a los 585nm (flecha color rojo). 
 
Tabla 6. Concentración de citocromos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Valores promedio calculados en concentración (nmol/mg de proteína) de citocromo: a, b y c, de mitocondrias aisladas 
de riñón control y 3-NP con y sin medio de criopreservación con DMSO n=3. 
 
 
tipo de 
citocromo 
Riñón sin DMSO Riñón con DMSO 
Control 
 
3-NP 
 
Control 
 
3-NP 
citocromo c 0.53 0.62 0.37 0.88 
citocromo b 0.40 0.44 0.30 0.57 
citocromo a 0.07 0.05 0.01 0.03 
b) 
B) 
Figura 
9. 
Espect
ro de 
absor
ción 
(reduc
ido 
con 
ditioni
ta-
oxida
do) de 
mitoc
ondria
s 
aislad
as de 
coraz
ón 
contro
l y 3-
NP 
con 
criopr
eserva
cion. 
A) Se 
muest
ran 
los 
picos 
α de 
los 
citocr
omos: 
c 
(550n
m) b 
(560n
m) y a 
(600n
m), en 
un 
interv
alo de 
400-
650n
m. B) 
Ampli
ficació
n del 
espect
ro de 
absor
ción 
en un 
interv
alo de 
A) 
Figura 
9. 
Espect
ro de 
absor
ción 
(reduc
ido 
con 
ditioni
ta-
oxida
do) de 
mitoc
ondria
s 
aislad
as de 
coraz
ón 
contro
l y 3-
NP 
con 
criopr
eserva
cion. 
A) Se 
muest
ran 
los 
picos 
α de 
los 
citocr
omos: 
c 
(550n
m) b 
(560n
m) y a 
(600n
m), en 
un 
interv
alo de 
400-
650n
m. B) 
Ampli
ficació
n del 
espect
ro de 
absor
ción 
en un 
interv
alo de 
39 
 
A 
7.2. Actividad de los complejos respiratorios en mitocondrias aisladas de 
riñón. 
 
En la figura 10 se muestran las gráficas obtenidas de las oximetrías realizadas a 
mitocondrias aisladas de riñón. 
 Sin Criopreservación 
 
 
 
 
 
 
 
 
Con Criopreservación 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 15. Trazos representativos de la actividad mitocondrial medida por oximetría, realizados a mitocondrias 
aisladas de riñón. A) control y B) 3-NP, sin criopreservación. C) control y D) 3-NP con criopreservacion, se utilizaron 0.6 
mg de proteína. a los cuales se agregó mit: mitocondrias, rot: rotenona, succ: succinato, mal:malonato, cit c: 
citocromo c, DBH2 :Decil hidroxiquinol, anti: antimicina, asc/TMPD: ascorbato/TMPD, cit c: citocromo c, CN: cianuro. 
B 
 D C 
40 
 
En este caso no se encontraron diferencias significativas, en mitocondrias control 
y 3-NP, tanto en los grupos sin y con criopreservación. Los valores resultaron muy 
semejantes en los cuatro complejos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
C 
A
 A 
 
B A 
C D 
41 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 12. Actividad de los complejos respiratorios de mitocondrias aisladas de riñón control y tratado con 
3-NP, sin y con medio de criopreservación Dimetil-sulfóxido (DMSO). (A complejo I sin criopreservación, 
B) complejo I con criopreservación, C) complejo II sin criopreservación, D) complejo II I con 
criopreservación, E) complejo III sin criopreservación, F) complejo III con criopreservación, G) complejo IV 
sin criopreservación, H) complejo IV, con criopreservación. En este caso no se encontraron diferencias 
significativas (P>0.05, Prueba de Anova para dos muestras independientes) n=3. 
 
E F 
G H 
42 
 
 
 
Una vez que se evaluó la actividad de la cadena respiratoria, se analizó el rendimiento de 
cada uno de los tejidos, para lo cual se realizó una comparación entre el peso y la 
cantidad de proteína mitocondrial obtenida. Los valores demuestran que del hígado se 
obtienen los valores más elevados de proteína mitocondrial, seguido de riñón y corazón 
respectivamente. Por otro lado el total de mitocondrias fue ligeramente mayor en los 
tejidos que fueron preservados con Dimetil-sulfóxido (DMSO), sin embargo las 
mitocondrias extraídas de cada uno de los órganos resultaron suficientes para realizar 
cada uno de los experimentos. 
Tabla 7. Valores rendimiento en órganos sin criopreservación. 
 Hígado Corazón Riñón 
 Control 
(n=4) 
3-NP 
(n=4) 
 Control 
(n=3) 
3-NP 
(n=3) 
 Control 
(n=3) 
3-NP 
(n=3) 
Tejido (gr) 1.24 1.22 0.18 0.20 0.24 0.26 
mitocondrias 
(mg de prot) 
14.32 15.30 0.87 0.98 3.14 3.27 
 Promedios de los pesos y proteína mitocondrial obtenidos de hígado, corazón y riñón sin criopreservación 
 
Tabla 8. Valores rendimiento en órganos con criopreservación. 
 Hígado Corazón Riñón 
 Control 
(n=4) 
3-NP 
(n=4) 
 Control 
(n=3) 
3-NP 
(n=3) 
 Control 
(n=3) 
3-NP 
(n=3) 
Tejido (gr)1.15 1.21 0.23 0.21 0.31 0.32 
mitocondrias 
(mg de prot) 
18.36 16.80 1.34 1.0 3.30 3.31 
Promedios de los pesos y proteína mitocondrial obtenidos de hígado, corazón y riñón con criopreservación. 
43 
 
Otro de los aspectos que se analizaron fue la actividad de los complejos respiratorios de 
los tres órganos, con y sin DMSO, para evaluar si este medio de criopreservación es 
eficiente. En la tabla 9 se muestran los resultados obtenidos. 
 Tabla 9. Actividad hígado, corazón y riñón, sin y con criopreservación. 
 
 
 
 
 
Sin criopreservación 
 
Con criopreservación 
Hígado Corazón Riñón Hígado Corazón Riñón 
control 3-NP control 3-NP control 3-NP control 3-NP control 3-NP control 3-NP 
Complejo I 11.28 
 
7.02 48.60* 
 
41.33** 14.02 
 
35.43* 
 
 6.77 
 
6.97 
 
33.72* 
 
21.87** 
 
19.89 
 
24.78* 
Complejo II 15.13 
 
5.57 46.30 
 
29.60 35.43 
 
33.70 11.72 
 
11.84 46.42 
 
38.25 30.17 
 
25.91 
Complejo III 15.93 
 
9.32 34.57 
 
35.50 47.53 
 
48.34 11.18 13.03 53.09 
 
52.58 
 
43.10 
 
43.09 
Complejo IV 15.75 
 
13.30 42.99 
 
47.67 41.62 
 
33.25 20.23 
 
19.29 46.04 
 
45.95 37.68 
 
44.61 
Promedios de actividad ( nmol de O2 min 
-1 
mg 
-1 
) de los complejos respiratorios de mitocondrias control y 3NP 
aisladas de hígado(n=4), corazón (n=3) y riñón (n=3) sin y con medio de criopreservación. Se encontraron diferencias 
significativas en el complejo I y III de mitocondrias aisladas de corazón (*P<0.05 y **P<0.01 respectivamente) y en el 
complejo I de mitocondrias aisladas de riñón (*P<0.05, prueba de Tukey para múltiples comparaciones). 
 La actividad de los complejos respiratorios fue diferente entre cada órgano, las 
mitocondrias aisladas de corazón presentaron valores más elevados en los cuatro 
complejos, seguido de riñón e hígado respectivamente. Al realizar el análisis estadístico 
de la prueba de Tukey’s de para múltiples comparaciones entre los valores de órganos 
almacenados sin y con DMSO, se observó disminución en la actividad del complejo I y III, 
en mitocondrias de corazón con medio de criopreservación, esto al encontrar una 
diferencia significativa de *P<0.05 entre los controles y de **P<0.01 entre los grupos 
tratados. Otro de los órganos que mostro disminución fue riñón, ya que la actividad de 
complejo I, fue menor en el grupo 3-NP sin creopreservar que con DMSO, al mostrar una 
diferencia significativa de *P<0.05. Los demás órganos mostraron valores muy similares. 
44 
 
8. Discusión 
Cuantificación de proteína mitocondrial. 
Determinar la concentración de una muestra biológica es una técnica básica en la 
purificación de una proteína concreta o cuando se quiere conocer la actividad específica, 
de una preparación enzimática, en este trabajo se utilizaron dos técnicas, esto para 
obtener valores confiables de proteína mitocondrial. La medición de absorbancia U.V. a 
280 nm depende del contenido de tirosina, triptófano, en menor medida de fenilalanina y 
en enlaces disolfuro, lo cual es diferente entre cada tipo de proteínas. Este método, es 
sencillo y práctico en cuestiones de tiempo, y se utiliza menor cantidad de muestra, ya 
que en este proyecto fue un punto muy importante, aunque tiene la desventaja de 
confiabilidad ya que al realizar las mediciones puede existir interferencia de otras 
proteínas. Por lo que se refiere al método de Lowry, es un método más sensible a la 
composición de aminoácidos aromáticos de las proteínas, con lo cual se obtiene 
estimaciones aceptables, sin embargo se requiere más de tiempo para realizar la técnica, 
aunque también presenta algunos inconvenientes, ya que no todas las proteínas 
reaccionan al Cu+ de la misma manera (Walker et al., 2002). Sin embargo los resultados 
de cantidad de proteína obtenida en este trabajo por ambos métodos, no presento 
diferencias significativas en mitocondrias aisladas en los tres órganos, con lo que se 
puede decir que la cantidad de proteína es aceptable. 
Determinación de citocromos. 
Como se mencionó anteriormente, los citocromos son componentes muy importantes para 
la cadena respiratoria mitocondrial, en este trabajo se identificaron los citocromos: c 
(550nm), b (560nm) y a (600nm). La concentración de citocromos, resultó diferente entre 
 
45 
 
 
cada órgano, las mitocondrias de corazón mostraron los valores más elevados, en ambos 
grupos, tanto con y sin medio de criopreservación, aunque las concentraciones más altas 
se observaron en el grupo 3-NP de corazones con medio de criopreservación, seguido de 
riñón e hígado respectivamente, esto se puede deber a que la cada órgano tiene 
funciones especializadas y la demanda energética es variable. En estudios anteriores, se 
ha cuantificado el contenido de citocromos en mitocondrias de diferentes tejidos, se 
observado un comportamiento similar, ya que el corazón tiene los valores de 
concentración más altos, con respecto al riñón e hígado (Benard et al., 2006). Aunque en 
este trabajo se utilizó un modelo sub-crónico que imita las etapas tempranas de la HD, en 
investigaciones anteriores realizados en cortex y caudado de pacientes con enfermedad 
de Huntington, se cuantificó la concentración de citocromos c, b y a, encontrando valores 
más altos en los tres citocromos en el cortex de los pacientes con HD con respecto al 
control, con lo cual se dice que el contenido de citocromos no está relacionado con el 
grado de degeneración en el tejido (Brennan et al., 1985). 
 
Actividad de la cadena respiratoria. 
El estudio de la cadena respiratoria en la enfermedad de Huntington, ha sido el objetivo 
de varias investigaciones principalmente en mitocondrias de caudado, cortex y músculo 
esquelético, para lo cual se ha empleado la administración sistemática del 3-NP. En este 
trabajo, los resultados obtenidos sugieren, que esta toxina también afecta a las 
mitocondrias de otros órganos como hígado y corazón. 
Al evaluar la actividad de la cadena respiratoria en mitocondrias aisladas hígado sin 
criopreservación, se observó una disminución en complejo II succinato deshidrogenasa, 
en el grupo 3-NP, al encontrar diferencia significativa de *P<0.05 con el grupo control. 
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Esto es relevante, ya que las investigaciones se han encontrado que existe 
susceptibilidad de las mitocondrias de hígado cuando se administra 3-NP en ratas, y con 
dosis más elevadas de esta toxina. En contraste con modelo murino utilizado en este 
trabajo, en el cual, la cepa C57BL/6 es una de las más resistentes a esta toxina. Con 
respecto a los modelos experimentales en los cuales se utilizan ratas, en estos animales 
la administración de 3-NP, resulta más toxica que en ratones, estas diferencias 
posiblemente pueden estar relacionadas con la eliminación y detoxificación de cada 
organismo (Brouillet et al., 2005). Otro punto importante es la dosis empleada, es que en 
este trabajo se utilizó un modelo sub-crónico de la HD con dosis bajas de 3-NP, de 
15mg/kg durante 5 días. En trabajos anteriores realizados bajo estas mismas condiciones, 
se han reportado alteraciones celulares que estimulan daño en el estriado y músculo, que 
se presentan en pacientes de HD, en las etapas iniciales de la enfermedad (Hernández-
Echeagaray 2012). 
 En la actividad de los cuatro complejos respiratorios en mitocondrias aisladas de corazón 
sin criopreservación, solo se observó una disminución en la actividad del complejo II 
succinato deshidrogenasa en el grupo tratado con 3-NP con respecto al control con una 
diferencia significativa de *P<0.05, en estudios realizados anteriormente en ratones de la 
cepas 129SVEMS y C57BL/6 se observó que la administración de esta toxina produce 
hinchamiento en mitocondrias de cardioimicetes, daño que es más en evidente ratones 
129SVEMS. También se ha investigado la toxicidad cardiaca producida por el 3-NP in vivo 
demostrando que es un inhibidor