Actividad-de-sacarosa-fosfato-sintasa-en-embriones-y-vainas-de-Phaseolus-vulgaris-L -bajo-dos-condiciones-de-deficit-de-nutrientes

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
 DE MÉXICO 
 
 FACULTAD DE CIENCIAS 
 
 
Actividad de sacarosa fosfato sintasa en embriones 
y vainas de Phaseolus vulgaris L. bajo dos 
condiciones de déficit de nutrientes 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
T E S I S 
 
 
 QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
 B I Ó L O G A 
 P R E S E N T A : 
 
MÓNICA MARIEL REYES ANTÚNEZ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DIRECTOR DE TESIS: 
DR. ELEAZAR MARTÍNEZ BARAJAS 
 
Ciudad Universitaria, Cd. Mx., 2018 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
1 
 
RESUMEN 
Se realizaron experimentos para evaluar el papel de la sacarosa fosfato sintasa en 
el desarrollo de semillas de Phaseolus vulgaris L. bajo condiciones que limitan el 
suministro de nutrientes. El primer tratamiento consistió en cortar los frutos a 20 días 
después de la floración para obligar a que las semillas se desarrollaran a partir de 
reservas acumuladas en la vaina, mientras que el segundo consistió en suspender 
el riego de las plantas. Las respuestas fueron diferentes. Sin embargo, en ambos 
casos se observó que la actividad de la enzima sacarosa fosfato sintasa está 
estrechamente relacionada con la sobrevivencia de los embriones en desarrollo: 
cortar los frutos incrementó la actividad en los embriones, mientras que al someter 
las plantas a sequía hizo que la enzima se mantuviera activa por más tiempo. Por 
otro lado, se observó que la actividad de sacarosa fosfato sintasa no tuvo una 
relación proporcional con la cantidad de proteína, lo que sugiere la existencia de 
mecanismos regulatorios adicionales que deben ser investigados. 
 
2 
 
AGRADECIMIENTOS 
Agradezco a mi madre, María de la Luz Reyes Antúnez, por brindarme su apoyo en 
todo momento y formarme como la persona que soy. Sin ella muchas de mis metas 
alcanzadas hasta ahora difícilmente se habrían realizado. 
A mi abuela, Amelia Antúnez Díaz, y a mis tías Araceli Reyes Antúnez y Martha 
Reyes Antúnez, por formar parte invaluable en mi vida y aparecer en ella siempre. 
A mi marido, Erik Enríquez Reséndiz, por alentarme a continuar con mis proyectos. 
A toda mi familia, por amarme como yo a ustedes, por creer en mí y por ver siempre 
la manera en cómo salir de las adversidades. 
A mi tutor, Eleazar Martínez Barajas, quien hizo posible que este trabajo se llevara 
a cabo, por su tiempo y dedicación. 
A mis sinodales, quienes estudiaron mi tesis y la aprobaron. 
A todos mis amigos, porque me han apoyado en diferentes etapas, y han creído que 
soy capaz de superar cualquier reto. 
A todos ellos agradezco, ya que cada uno forma parte importante para ver concluido 
este trabajo. 
 
3 
 
Este trabajo se realizó con el financiamiento otorgado por DGAPA-UNAM al 
proyecto IN203017: Análisis de la removilización de reservas acumuladas en vainas 
de frutos de frijol y de la distribución de nutrientes entre las semillas de frutos de 
frijol sometidos a severas restricciones nutricionales. 
Así como con recursos aportados por la Facultad de Química, UNAM (PAIP 5000-
9127). 
 
4 
 
INDICE 
Capítulo 1. Introducción ..................................................................................................... 8 
Descripción del modelo y características relevantes de la planta de frijol ....................... 8 
Descripción del proceso de desarrollo de la semilla ..................................................... 10 
Efecto de las condiciones ambientales adversas sobre el proceso de formación de la 
semilla .......................................................................................................................... 11 
Descripción de los mecanismos que usan la plantas para enfrentar las condiciones 
adversas que pudieran presentarse durante el periodo de formación de semilla .......... 12 
Papel de la sacarosa y la sacarosa fosfato sintasa en el metabolismo de la planta y 
cómo influye en condiciones adversas ......................................................................... 13 
Capítulo 2. Hipótesis y objetivos ...................................................................................... 17 
Hipótesis ...................................................................................................................... 17 
Objetivos ...................................................................................................................... 17 
Capítulo 3. Materiales y métodos ..................................................................................... 18 
Cultivo de las plantas ................................................................................................... 18 
Remoción de frutos ................................................................................................... 18 
Frutos en sequía ....................................................................................................... 18 
Extractos ...................................................................................................................... 19 
Actividad de sacarosa fosfato sintasa .......................................................................... 19 
Determinación de proteína ........................................................................................... 20 
Ensayos de inmunodetección por western-blot ............................................................ 20 
Capítulo 4. Resultados ..................................................................................................... 22 
Determinación de la actividad de SPS.......................................................................... 22 
Actividad de SPS en embriones removidos .................................................................. 23 
Actividad de SPS en vainas removidas ........................................................................ 25 
Actividad de SPS en embriones sometidos a sequía .................................................... 27 
Actividad de SPS en vainas sometidas a sequía .......................................................... 29 
Evaluación de la cantidad de SPS por Western-blot. .................................................... 31 
Capítulo 5. Discusión ....................................................................................................... 33 
Capítulo 6. Conclusiones ................................................................................................. 37 
Capítulo 7. Perspectivas .................................................................................................. 37 
Referencias ..................................................................................................................... 38 
 
5 
 
INDICE DE GRÁFICOS 
Figura 1. Regulación de actividad de la enzima SPS. En hojas de espinaca la actividad de 
SPS es regulada por ritmo circadiano, por enzimas rio arriba y por su interacción con 
efectores alostéricos, Ttomado de Huber y Huber, 1996). ............................................... 14 
Figura 2. Movilización de sacarosa. Una vez que ha sido sintetizada en los tejidos 
fotosintéticos, la sacarosa pasaa las células acompañantes y se incorpora el floema, por 
donde puede viajar hasta llegar a otra célula acompañante conectada a una célula 
demand demandante. Allí puede ser metabolizada en distintos organelos gracias a la 
presencia de sacarosa sintasa (SuSy) y de diferentes invertasas (INV). (Tomado de Wind 
et al., 2010). ..................................................................................................................... 15 
Figura 3. Efecto del tiempo de incubación sobre la actividad de SPS medido en 
condiciones limitantes (lim) o de velocidad máxima (max) en extractos de embriones que 
se desarrollaron normalmente por 22 DDF (22) y en embriones que crecieron en frutos 
que habían sido cortados de la planta 3 días antes (20+3). ............................................. 22 
Figura 4. Curva patrón de sacarosa. ................................................................................ 23 
Figura 5. Actividad de la enzima SPS medida en condiciones de velocidad máxima o de 
limitación de sustratos en extractos de embriones que se desarrollaron normalmente o en 
frutos que fueron removidos a 20 DDF. A) Actividad expresada /g de peso fresco. B) 
Actividad específica. Los puntos representan el promedio ±SD, n=4. .............................. 24 
Figura 6. Cociente resultante de dividir los valores de actividad máxima por los obtenidos 
en condiciones de limitación de sustratos en embriones control y removidos. Los puntos 
representan el promedio ± SD, n=4. ................................................................................ 25 
Figura 7. Actividad de la enzima SPS en extractos de vainas de frutos removidos. A) 
Actividad expresada /g de peso fresco. B) Actividad específica. Los puntos representan el 
promedio ±SD, n=4. ......................................................................................................... 26 
Figura 8. Cociente de dividir la actividad obtenida en condiciones de velocidad máxima 
entre la resultante cuando hay limitación de sustratos en vainas control y removidas. Los 
puntos representan el promedio ±SD, n=4. ...................................................................... 27 
Figura 9. Actividad de SPS en embriones desarrollados normalmente (control) o en 
plantas sometidas a sequía a partir de los 20 DDF medida en condiciones óptimas o de 
limitación de sustratos. A) Actividad expresada /g de peso fresco. B) Actividad expresada 
por /m g proteína. Los puntos representan el promedio ± SD, n=4. ................................. 28 
Figura 10. Cociente resultante de dividir los valores de actividad obtenida en condiciones 
óptimas (máxima) entre la observada al hacer las mediciones con cantidades limitadas de 
6 
 
sustratos en embriones que se desarrollaron en condiciones normales (control) o en 
plantas sometidas a sequía. Los puntos representan el promedio ±S D, n=4. ................. 29 
Figura 11. Actividad de SPS medida en condiciones óptimas o de limitación de sustratos 
en vainas de frutos que se desarrollaron en condiciones normales o en sequía. A) 
Actividad de SPS expresada /g de peso fresco. B) Actividad expresada /g proteína. Los 
puntos representan el promedio ± SD, n=4. ..................................................................... 30 
Figura 12. Cociente de actividad de SPS medida en condiciones ideales sobre la 
observada al medirla con limitación de sustratos en vainas de frutos que se desarrollaron 
en plantas cultivadas bajo condiciones óptimas (control) o sometidas a sequía. Los puntos 
representan el promedio ± SD, n=4. ................................................................................ 31 
Figura 13. Separación de proteínas totales por SDS-PAGE de embriones que se 
desarrollaron normalmente (20 a 25) o en frutos cortados de la planta cuando tenían 20 
DDF (20+1 a 20+5). A) Tinción de las proteínas con Azul de Coomassie. B) 
Inmunodetección por Western-blot utilizando anticuerpos contra SPS. La flecha señala la 
banda de 130 kD correspondiente a la masa de la SPS. ................................................. 32 
Figura 14. Separación de proteínas totales por SDS-PAGE de embriones que se 
desarrollaron normalmente (20 a 35) o en frutos que dejaron de regarse a los 20DDF 
(20+1 a 20+15). A) Tinción de las proteínas con azul de Coomassie. B) Inmunodetección 
de la SPS por Western-blot utilizando anticuerpos contra SPS. La flecha señala la banda 
de 130 kD correspondiente a la masa de la SPS. ............................................................ 33 
 
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INDICE DE ABREVIATURAS 
ABA. Ácido abcísico. 
CINV: Invertasa citosólica, plastídica o mitoconrial. 
CWINV: Invertasa de pared celular. 
DDF: Días después de la floración. 
DTT: Ditiotreitol: 
INV: Invertasa. 
Gr/L: gramo por litro. 
Pi: Fosfato inorgánico. 
PMSF: Fenilmetilsulfonil fluoruro. 
PVDF: Polifluoruro de vinilideno 
SDS Dodecilsulfato sódico 
Ser: Serina. 
SPP. Sacarosa fosfatasa. 
SPS: Sacarosa fosfato sintasa. 
SPS-PP: Sacarosa fosfato sintasa fosfatasa. 
SuSy: Sacarosa sintasa. 
TBST: Tris buffered saline with tween-20 
TEMED: Tetrametiletilendiamina. 
Ton/ha: Toneladas por hectárea. 
Tris: Tisaminometano 
UDP: Uridina difosfato. 
V: Velocidad de reacción. 
VINV: Invertasa vacuolar. 
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Capítulo 1. Introducción 
 
Descripción del modelo y características relevantes de la planta de frijol 
La planta de frijol (Phaseolus vulgaris L.) se domesticó en dos regiones geográficas 
de América Latina: Mesoamérica y los Andes (Hernández-López et al., 2013). Sin 
embargo, a pesar de que ambos linajes derivan de un ancestro común de 100,000 
años de antigüedad, son genéticamente diferenciables entre sí. México es uno de 
los centros de origen del frijol, gracias a lo cual se cuenta con un vasto acervo de 
poblaciones silvestres y nativas, éstas últimas también conocidas como criollas 
(Sangerman-Jarquín et al., 2010; Ramírez y Rangel, 2011). Taxonómicamente, el 
frijol pertenece al género Phaseolus, dentro de la tribu Phaseoleae, subfamilia 
Papilionaideae, familia Fabaceae y del orden Rosales (Ramírez y Rangel, 2011; 
Lara-Flores, 2015). 
Durante el año agrícola 2015 en México se cultivaron 1.56 millones de hectáreas lo 
que lo convierte en el cuarto cultivo más importante del país (Panorama 
Agroalimentario 2016). Existen alrededor de 70 variedades nativas y más de 150 
comerciales (Panorama Agroalimentario, 2016) cuyas semillas tienen un contenido 
de proteínas varía entre 14 y 33%; los carbohidratos pueden representar entre 52 y 
76%, cuya fracción más importante la constituye el almidón; mientras que el 
contenido de lípidos oscila entre 1.5 y 6.2%. Estos últimos son una mezcla de 
acilglicéridos cuyos ácidos grasos predominantes son los mono-insaturados y los 
poli-insaturados. La fibra representa entre el 14-19%, de la cual hasta la mitad 
puede ser de la forma soluble (pectina) (Sangerman-Jarquín et al., 2010; Ramírez 
y Rangel, 2011). También es una fuente considerable de calcio, hierro, fósforo, 
magnesio y zinc y de las vitaminas tiamina, niacina y ácido fólico (Sangerman-
Jarquín et al., 2010; Ramírez y Rangel, 2011). 
El frijol y el maíz son la base de la alimentación en México, por lo que su cultivo es 
de suma importancia socioeconómica (Lara-Flores, 2015). Sin embargo, la 
producción nacional de frijol enfrenta algunos problemas muy serios. Uno de ellos 
9 
 
es su baja productividad. En el periodo 2000-2010 el rendimiento promedio a nivel 
mundial fue de 1.27 ton/ha, mientras que en México apenas se produjeron 0.8 ton/ha 
(Lara-Flores, 2015). Los efectos negativos de condiciones abióticas tales como 
temperaturas extremas y sequía tienen que ver con esa situación y probablemente 
el recrudecimiento ambiental producto del cambio climático agrave el panorama 
(Treviño-Quintero y Rosas-Quijano, 2013). Recientemente se ha observado que la 
producción de frijol en México va en decaimientoy es urgente hacer esfuerzos para 
revertir esa tendencia (Sangerman-Jarquín et al., 2010; Lara-Flores, 2015). 
El cultivo de frijol puede prosperar en un intervalo de temperaturas de entre 10°C y 
30°C, siendo el óptimo entre 16°C y 24°C. Las altas temperaturas inducen la caída 
de los órganos reproductivos, reduciendo así el rendimiento, mientras que las bajas 
temperaturas retardan el crecimiento de la planta; además, cabe mencionar que el 
frijol no tolera heladas (Treviño-Quintero y Rosas-Quijano, 2013). 
En México, el 85% de la superficie cultivada se siembra en el ciclo primavera-
verano, bajo condiciones de temporal errático con periodos de sequía recurrentes 
(Treviño-Quintero y Rosas-Quijano, 2013). Como ejemplo puede mencionarse que 
el ciclo primavera-verano de 2011 fue afectado por una sequía muy intensa que 
redujo la superficie cosechada de frijol en 54.7%, el 40.2% de la superficie sembrada 
fue destruida y los rendimientos medios disminuyeron en 89.3%. Ante este 
panorama, fue necesario importar alrededor de 135,900 toneladas de frijol de 
Estados Unidos (Treviño-Quintero y Rosas-Quijano, 2013). Creemos que el estudio 
de las respuestas bioquímicas de las plantas de frijol a condiciones ambientales 
adversas es urgente, pues de esas investigaciones pueden derivarse criterios de 
selección que permitan hacer un uso más eficiente de la riqueza genética disponible 
en nuestro país. 
 
 
10 
 
Descripción del proceso de desarrollo de la semilla 
Las semillas de las leguminosas consisten de una cubierta seminal (de origen 
materno), endospermo y embrión (ambos de origen filial). Los tejidos que los forman 
son fisiológicamente heterogéneos y el desarrollo de la semilla depende de los 
cambios metabólicos que se van dando gradualmente (Weber et al., 2005). En las 
etapas iniciales, los procesos que ocurren en la cubierta seminal hacen que el 
desarrollo de la semilla esté controlado por la planta madre. Sucesivamente, el 
control del desarrollo es ejercido por los órganos filiales del embrión, los cuales se 
convierten posteriormente en órganos especializados en el almacenamiento de 
nutrientes. Todo el proceso involucra la participación de una red compleja de 
señalización, que incluye la reprogramación transcripcional y fisiológica mediada en 
principio por azúcares y hormonas (Weber et al., 2005). 
En el género Vicia, se identifican tres etapas en el crecimiento de la semilla, de la 
cuales una engloba los cambios que suceden en la fase de pre-almacenamiento y 
dos que ocurren en la fase de almacenamiento (Weber et al., 2005). La fase de pre-
almacenamiento comprende el desarrollo de la cubierta seminal y el endospermo, y 
posteriormente el desarrollo del embrión, completando así la embriogénesis, donde 
el embrión crece por división celular mitótica (Weber et al., 2005). 
Weber et al. (2005) identifican una etapa de transición o “Switch Toward Filial 
Control” entre las fases de pre almacenamiento y de almacenamiento, que consiste 
en la diferenciación secuencial de los cotiledones, para convertirse de un tejido 
meristemático en uno de almacenamiento bien diferenciado. Algunos de los 
cambios que caracterizan esta transición son los siguientes: 1) una región del 
protodermo se diferencia, formando células de transferencia, las cuales se encargan 
de tomar los nutrientes; 2) se incrementan los niveles de sacarosa y aumenta la 
concentración de azúcares; 3) se disminuye el crecimiento mitótico y aumenta el 
crecimiento debido la expansión celular; 4) comienza la actividad fotosintética del 
embrión, mejorando el estado energético; 5) se induce la expresión de genes 
asociados con almacenamiento, lo que conduce a un alto flujo metabólico hacia la 
síntesis de productos que serán almacenados. 
11 
 
La segunda fase o fase de almacenamiento comprende un periodo que se 
caracteriza por la expansión de las células del embrión y la acumulación de 
productos de reserva (Weber et al., 2005). Finalmente, la semilla termina su 
maduración fisiológica y la actividad de almacenamiento se detiene desde el centro 
hacia la periferia. Después inicia un proceso de desecación de tejidos para 
posteriormente entrar en latencia (Weber et al., 2005). 
Además de las enzimas involucradas en los procesos de demanda de nutrientes, el 
ácido abcísico (ABA) también juega un papel importante en la maduración de 
semillas. En Arabidopsis el ABA se produce primero en tejido materno (en la 
cubierta seminal) y después en el embrión. El ABA que se sintetiza en la cubierta 
seminal, promueve la expresión de genes para proteínas de almacenamiento. Una 
parte se trasloca al embrión donde promove su crecimiento y reduce las 
probabilidades de aborción (Weber et al, 2005). 
En leguminosas no se ha probado que el ABA de origen materno tenga un efecto 
sobre la diferenciación embrionaria. Sin embargo, se propone que ABA sintetizado 
dentro del eje embrionario difunda hacia los cotiledones donde podría desempeñar 
un papel importante (Weber et al, 2005). 
 
Efecto de las condiciones ambientales adversas sobre el proceso de 
formación de la semilla 
Las altas temperaturas y la sequía afectan el crecimiento y el desarrollo de las 
plantas de frijol y tienen un impacto negativo muy importante sobre su rendimiento. 
La exposición a temperaturas elevadas a partir de la antesis genera un aumento 
considerable en la abscisión de botones, flores y vainas recién formadas (Treviño-
Quintero & Rosas-Quijano, 2013). En plantas de frijol, esto se debe en gran medida 
al aumento en la concentración de ABA (Ofir, et al., 1993). 
La sequía es un estrés abiótico muy importante. Desde el punto de vista 
agronómico, la sequía se puede definir como la baja disponibilidad de agua en el 
12 
 
suelo. A nivel fisiológico, hace que la tasa de transpiración en la superficie de las 
hojas sea mayor a la cantidad de agua tomada por las raíces (Hossain et al, 2016). 
Dentro de los efectos negativos del estrés hídrico sobre las plantas de frijol están: 
la reducción del crecimiento en general, el enrollamiento de las hojas, el incremento 
en la relación del peso entre la raíz y el resto de la planta, el aumento de cera en la 
cubierta de las hojas, reducción de las tasas de transpiración, respiración y 
fotosíntesis, así como importantes cambios en la distribución de nutrientes. A nivel 
bioquímico, se aprecia el incremento en los niveles de ABA que entre muchas otras 
cosas induce el cierre de los estomas, para evitar que la planta se deshidrate, así 
como cambios importantes en la síntesis de proteínas (Treviño-Quintero & Rosas-
Quijano, 2013). 
El rendimiento de la cosecha en general se ve más afectado cuando el estrés se 
presenta la etapa reproductiva del cultivo que cuando se le aplica en la etapa 
vegetativa, siendo el número de vainas el parámetro más afectado (Acosta-
Gallegos, Kohashi-Shibata; 1989). El número de semillas abortadas se incrementa 
en los frutos de plantas que experimentan sequía, lo que sugiere que la competencia 
intra-ovario se incrementa bajo esas condiciones (Flores-Lui, 1982; Acosta-
Gallegos, Kohashi-Shibata; 1989). 
 
Descripción de los mecanismos que usan la plantas para enfrentar las 
condiciones adversas que pudieran presentarse durante el periodo de 
formación de semilla 
Se han estudiado las respuestas de Phaseolus vulgaris (frijol), Vignia unguiculata 
(judía), Lycopersicon esculentum (tomate), Spinacia oleracea (espinaca), entre 
otras, a condiciones adversas como salinidad, temperaturas extremas o sequía 
(Guy et al., 1992; Ingram y Bartels, 1996; Jones, et al., 1998; Gupta y Kaur, 2005). 
Se ha observado que estas condiciones producen un aumento en la concentración 
de ABA (hormona que señaliza la existencia de estrés) y de algunos productos como 
sacarosa, polialcoholes y manitol (Gupta y Kaur, 2005). Se ha propuesto que tales 
modificaciones pueden alterar la expresión génica y contribuira generar respuestas 
13 
 
de resistencia de las plantas al estrés que se esté experimentado (Gupta y Kaur, 
2005). 
En plantas de frijol sometidas a estrés hídrico, disminuye la disponibilidad de 
nutrientes y se reduce tanto la cantidad de vainas como el número y el peso 
promedio de las semillas que se desarrollan (Acosta-Gallegos y Kohashi-Shibata, 
1989; Boutraa y Sanders, 2001). Sin embargo, si la disminución en el flujo de 
nutrientes se da cuando los frutos tienen al menos 20 días después de floración, 
hay una serie de ajustes metabólicos que permiten la formación de algunas semillas 
viables. 
 
Papel de la sacarosa y la sacarosa fosfato sintasa en el metabolismo de la 
planta y cómo influye en condiciones adversas 
La sacarosa es un disacárido formado por glucosa y fructosa que se sintetiza como 
producto de la fotosíntesis, o bien a partir de carbono generado de la hidrólisis del 
almidón o de la gluconeogénesis. En la síntesis de sacarosa está involucrada la 
actividad de la enzima sacarosa fosfato sintasa (SPS), la cual cataliza la conversión 
de UDP-glucosa y fructosa-6-fosfato en sacarosa-6-fosfato, a la que posteriormente 
la enzima sacarosa fosfatasa (SPP) convierte en sacarosa (Wind et al., 2010). La 
SPS tiene una masa molecular que oscila entre 110-138 kD (Huber y Huber, 1996) 
y su actividad está sujeta a una regulación compleja en la que destacan el ritmo 
circadiano (fotoperiodo), el ciclo fosforilación-defosforilaciòn (que la hace transitar 
entre un estado inactivo a otro funcional, respectivamente) y la interacción con 
moléculas como la glucosa-6-fosfato o el fosfato inorgánico (Pi), que funcionan 
como activador e inhibidor, respectivamente (Figura 1) (Doehlert y Huber, 1983; 
Huber y Huber, 1992; 1996; Jones y Ort, 1997). 
La SPS tiene múltiples en residuos de serina que pueden Ser fosforilados. En hojas 
de espinaca se ha identificado a Ser158, como uno de los más importantes, pues es 
el que se fosforila/defosforila más rápido y su estado de fosforilación tiene un efecto 
inhibidor/activador de la actividad de SPS. Se presume que SPS-fosfatasa (SPS-
14 
 
PP) es la enzima responsable de la defosforilación de SPS, y su actividad puede 
ser inhibida por Pi (Huber y Huber, 1996). Las bajas temperaturas también pueden 
alterar el estado de fosforilación de SPS, pues esas condiciones inhiben la 
expresión de un gen que codifica SPS-fosfatasa (Jones, et al., 1998). 
 
 
Figura 1. Regulación de actividad de la enzima SPS. En hojas de espinaca la actividad de 
SPS es regulada por ritmo circadiano, por enzimas rio arriba y por su interacción con 
efectores alostéricos, Ttomado de Huber y Huber, 1996). 
 
La sacarosa es una molécula muy estable que diversas especies de plantas usan 
para la distribución y almacenamiento de carbono. Su transporte desde órganos 
fuente (hojas) inicia con su paso desde las células fotosintéticas a las células 
acompañantes del floema por medio de plasmodesmos (Figura 2) (Sauer, 2007). 
Posteriormente, se descarga del floema gracias a transportadores específicos, y se 
moviliza hasta llegar a puntos cercanos a tejidos sumideros; los cuales la pueden 
15 
 
incorporar directamente, o con la intervención de las células acompañantes a las 
cuales están conectadas por plasmodesmos (Figura 2) (Sauer, 2007). La sacarosa 
puede catabolizarse en diferentes organelos, y dependiendo del sitio, las enzimas 
involucradas varían (Figura 2). La sacarosa sintasa (SuSy) hidroliza la sacarosa en 
UDP-glucosa y fructosa en el citosol, mientras que las invertasas (INV) la convierten 
en glucosa y fructosa tanto en el apoplasto como en el interior de las células (Wind 
et al., 2010). Las invertasas asociadas a la pared celular (CWINV) participan en la 
descarga de sacarosa desde los elementos cribosos (Wind et al., 2010). Las 
invertasas vacuolares (VINV), mientras que las invertasas citosólicas, plastídicas y 
mitocondriales la metabolizan dentro de sus respectivos compartimentos 
intracelulares (Wind et al., 2010). 
 
Figura 2. Movilización de sacarosa. Una vez que ha sido sintetizada en los tejidos 
fotosintéticos, la sacarosa pasa a las células acompañantes y se incorpora el floema, por 
donde puede viajar hasta llegar a otra célula acompañante conectada a una célula 
16 
 
demandante. Allí puede ser metabolizada en distintos organelos gracias a la presencia de 
sacarosa sintasa (SuSy) y de diferentes invertasas (INV). (Tomado de Wind et al., 2010). 
 
Se ha observado que cambios en la tasa de la síntesis, transporte o degradación de 
sacarosa afectan la disponibilidad de carbono, lo que sumado a su papel como 
molécula señalizadora hacen que la sacarosa tenga un papel muy importante en la 
regulación del crecimiento y del desarrollo de las plantas (Wind et al., 2010). Las 
flores y posteriormente los frutos, son órganos que demandan el suministro de 
grandes cantidades de nutrientes para la formación de semillas viables; en semillas 
en desarrollo de Vicia faba, la actividad de SPS se activa en la etapa de pre-
almacenamiento y se inactiva en la de almacenamiento (Weber et al., 1996; 2005). 
También se ha reportado que condiciones de sequía producen un aumento en la 
actividad de amilasa, invertasa soluble, SPS y SuSy en hojas de Cajanus cajan (frijol 
de palo). En Craterostigma plantigineum (Blue carpet), SPS y SuSy también se 
inducen por estrés hídrico, lo que sugiere que los mecanismos de síntesis y de 
degradación de sacarosa, son sensibles a condiciones de privación de agua (Hare 
et al., 1998). En tubérculos de Solanum tuberosum la síntesis de carbohidratos es 
dependiente de la magnitud del estrés hídrico, y entre mayor sea éste, menor será 
la cantidad de almidón que se sintetice en los tubérculos, lo que se compensa con 
un incremento en la cantidad de sacarosa (Geisenberger et al., 1996). Estos mismos 
autores también observaron que al medir la actividad SPS tanto en condiciones de 
limitantación de sustratos (y en presencia de fosfato) como en condiciones óptimas 
(incluyendo glucosa 6-P como activador), se aprecia que las proporciones entre los 
valores obtenidos, son menores durante el estrés, lo que se ha interpretado como 
una consecuencia de cambios en el estado de fosforilación de la enzima. 
La sacarosa tiene funciones adicionales. En Arabidopsis thaliana induce la actividad 
de un transportador de sacarosa SUT2 (Barker et al., 2000); y en tubérculos de papa 
estimula la actividad del promotor de papatina-1, la cual representa entre el 30 y 
40% de la proteína total en este tejido (Jefferson et al., 1990; Wenzler et al., 1989). 
También tiene un rol muy importante en el desarrollo de semillas de leguminosas, 
17 
 
ya que induce la expansión celular y la síntesis de almidón (Gibson, 2005). Por lo 
que resulta probable que el estudio de las enzimas involucradas en regular su 
concentración sea importante para etender las respuestas de las plantas a 
estímulos ambientales y a señales originadas durante su desarrollo. 
 
Capítulo 2. Hipótesis y objetivos 
 
Hipótesis 
En las vainas y embriones de los frutos de frijol afectados por una severa reducción 
en la disponibilidad de nutrientes (por su remoción de la planta madre o sequía), la 
actividad de la enzima sacarosa fosfato sintasa (SPS) se incrementa para favorecer 
el desarrollo de algunas semillas. 
 
Objetivos 
Establecer un método confiable que permita medir la actividad enzimática de SPS 
tanto en frutos como vainas de frijol. 
Medir la actividad de la SPS en vainas y embriones de Phaseolus vulgaris L. bajo 
condiciones que limiten la disponibilidad de los nutrientes necesarios para el 
desarrollo de las semillas. 
Evaluar si la actividad enzimática de SPS en las muestras es proporcional a la 
cantidad de la enzima. 
 
 
18 
 
Capítulo 3. Materiales y métodos 
 
Cultivo de las plantas 
Se sembraron semillas de frijol (Phaseolus vulgaris L.) variedadCanario-60 en 
macetas con 3L de agrolita y se regaron diario con 100 mL solución nutritiva de 
Hoagland, el cual contiene los siguientes macronutrientes (peso molecular en gr/L): 
101.1 de KNO3, 236.16 de Ca(NO3)2·4H2O, 115.08 de NH4H2PO4 y 246.48 de 
MgSO4·7H2O; y micronutrientes (peso molecular en gr/L): 74.55 de KCL, 61.83 de 
H2BO3, 169.01 de MnSO4·H2O, 287.54 de ZnSO4·7H2O, 249.68 de 
CuSO4·5H2O,161.97 de H2MoO4 (85% de MoO3) y 468.2 de NaFeDTPA (10% Fe) 
(Hoagland y Arnor, 1950; Caniguante-Rivera et al., 2009; Taiz y Zeiger, 2002) . Las 
flores se etiquetaron el día de la antesis y su edad se estableció en días posteriores 
a ese momento (DDF). 
Remoción de frutos 
Se seleccionaron frutos de 20 DDF y se formaron dos grupos: (1) los frutos cuyo 
desarrollo continuó pegado a la planta (control); y (2) los frutos que se removieron 
en ese momento y se incubaron en oscuridad a 27°C por 5 días. Se tomaron 
muestras de la vaina y de los embriones viables en los frutos de ambos grupos a 
partir de los días 0, 1, 2, 3 y 5 posteriores al inicio del experimento. 
 Frutos en sequía 
Se seleccionaron plantas que en conjunto tenían 55 frutos de 20 DDF. Las plantas 
se dividieron en 2 grupos: control y estrés hídrico. (1) las plantas control se regaron 
regularmente con 100 mL de solución nutritiva de Hoagland; (2) las plantas se 
sometieron a sequía, se dejaron de regar con la solución en ese momento. Se 
tomaron muestras de la vaina y de los embriones viables de los frutos de ambos 
grupos a partir de los días 0, 2, 4, 8, 12 y 15 días posteriores al inicio del 
experimento. 
 
19 
 
Extractos 
A partir de las muestras de vaina y embrión colectadas se hicieron 4 extractos 
independientes. 
El tejido se pesó y aproximadamente 0.5 g se maceraron con 2 ml de amortiguador 
de extracción (Hepes 50 mM, pH 7.4, KCl 100 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, 
glicerol al 10% (v/v), Tritón X-100 al 0.1% (v/v), benzamidina 1 mM, PMSF 1 mM, 
DTT 1 mM y 2 g/L de polivinil-pirrolidona insoluble) por cada muestra de tejido. Los 
homogenados se centrifugaron a 10,000 rpm durante 5 min en hielo. Se tomó 1 ml 
del sobrenadante y se colocó en una columna de Sephadex G-10 previamente 
equilibrada con el mismo amortiguador. Las muestras se eluyeron de la matriz con 
1.5 ml del amortiguador usado para equilibrar la columna. El extracto desalado se 
usó para las determinaciones enzimáticas. 
 
Actividad de sacarosa fosfato sintasa 
La actividad enzimática se determinó siguiendo el protocolo reportado por Weiner 
et al. (1992). Se mezclaron 30 µl de extracto enzimático con 20 µl de 2 soluciones 
de reacción, una de ellas diseñada para medir la actividad en condiciones óptimas 
y la otra para evaluar el efecto de condiciones limitantes. La composición de la 
mezcla de reacción que permitió medir la velocidad de la enzima en condiciones 
óptimas consistió de Hepes 50 mM (pH 7.4), UDP-glucosa 10 mM, fructosa-6-fosfato 
10 mM, glucosa 6-fosfato 40 mM, MgCl2 15 mM, y 2.5 mM de DTT. Mientras que 
para la medición de la velocidad de reacción en condiciones limitantes, se usó una 
solución de ensayo compuesta por 50 mM de Hepes (pH 7.4), UDP-glucosa 10 mM, 
fructosa-6-fosfato 3 mM, glucosa 6-P 12 mM, MgCl2 15 mM, DTT 2.5 mM y 10 mM 
de Pi. Las muestras se incubaron en baño maría a 30°C y la reacción se detuvo a 
0, 15 y 30 min con 50 µl de hidróxido de potasio (KOH) al 30% (w/v). En el caso del 
tiempo cero, el KOH se agregó antes de la mezcla de reacción. Posteriormente, las 
muestras se calentaron a 80°C en baño seco durante 10 min. Para cuantificar la 
sacarosa generada, se agregaron 1.5 ml de antrona al 0.14% (w/v), diluida en ácido 
20 
 
sulfúrico al 70% (v/v) y se incubó durante 10 min a 30°C. Posteriormente, se leyó la 
absorbancia a 620 nm. 
Para interpolar las lecturas de los extractos, se realizó una curva patrón con 0, 5, 
10, 20 y 50 μl de sacarosa 2.5 mM (diluidos con agua destilada para un volumen de 
50 μl) y procesados de manera similar.. 
Finalmente, la actividad se expresó en μmol de sacarosa sintetizada por g de peso 
fresco de tejido en 30 min (μmol / 30 min/ g PF). También se calculó la actividad 
específica, para lo cual, la cantidad de sacarosa producida se expresó por mg de 
proteína (µmol / 30 min / mg proteína). 
 
Determinación de proteína 
La cantidad de proteína presente en los extractos se determinó por medio del 
método de (Bradford, 1976). En los pozos de una placa para ensayos de ELISA se 
mezclaron 10 μl de extracto, 40 μl de H2O y 200 μl de reactivo de Bradford (BioRad). 
Paralelamente, se realizó una curva patrón con albúmina de suero bovino (BSA). 
En los pozos se pusieron 0, 5, 10, 15, 20, 25, y 30 μl de un stock de una solución 
BSA 0.5 mg/ml, se agregó H2O hasta completar un volumen de 50 μl y 200 μl de 
reactivo de Bradford. Se hizo una incubación de 10 min a temperatura ambiente y 
se leyó la absorbancia a 595 nm. 
 
Ensayos de inmunodetección por western-blot 
Para analizar las proteínas presentes en las muestras de los embriones se realizó 
una electroforesis desnaturalizante de acuerdo al protocolo de Bernal et al. (2005). 
El gel separador al 10% se preparó mezclando 3.34 ml de solución de acrilamida al 
30%, 2.5 ml de Tris-HCl 375 mM (pH 8.8), 50 μL de SDS al 20% y 4.16 ml de agua 
desionizada. Como catalizadores de la reacción de polimerización se agregaron 5 
μL de TEMED y 50 μL de una solución de persulfato de amonio al 10% (w/v). Para 
21 
 
preparar el gel apilador se mezclaron 1 ml de solución de acrilamida al 30%, 1.25 
ml de Tris-HCl 125 mM (pH 6.8), 25 μL de SDS al 20 % y 2.75 ml de agua 
desionizada. Como catalizadores de la reacción de polimerización se agregaron 5 
μL de TEMED y 20 μL de una solución al 10 % (w/v) de persulfato de amonio. Como 
amortiguador de corrida se usó Tris-HCl 20 mM (pH 8.3), glicina 192 mM y 0.1% 
(w/v) de SDS. 
Para la electroforesis, las muestras se prepararon mezclando en una proporción 1:1 
el extracto con el amortiguador compuesto por Tris-HCl 60 mM (pH 6.8), 2% (w/v) 
SDS, 2-mercaptoetanol al 5% (v/v), 10% (v/v) de glicerol y 1 mg/ml de azul de 
bromofenol. 
Terminada la electroforesis, los geles se tiñeron con azul de Coomassie, utilzando 
una solución con 0.125% (w/p) de azul de Coomassie R-250, 50% (v/v) de metanol 
y ácido acético al 10% (v/v). Para desteñir se usó una solución de metanol al 10% 
(v/v) y ácido acético al 7% (v/v). 
Para la transferencia de proteínas a membranas PVDF (Immobilon) se utilizó un 
amortiguador que contiene Tris-HCl 25 mM (pH 8.3), 52 mM de glicina y 20% (v/v) 
de metanol. El procedimiento se llevó a cabo por 1 h a 50 V a 4ºC. 
Para evaluar la cantidad de SPS presente en los extractos, las membranas se 
incubaron en agitación durante 1h a temperatura ambiente en 20 ml de solución de 
bloqueo [leche descremada al 5% (w/v) en TBST (9.68 g/L de tris base (pH 7.6), 32 
g/L de NaCl y 1 ml/L de tween-20)]. Posteriormente, se desechó la solución de 
bloqueo y se agregó solución fresca con1 µl de anticuerpo policlonal contra SPS, se 
incubó con agitación constante por 12 a 16 h a 4°C. Transcurrido el tiempo, se 
realizaron 4 lavados de 10 min cada uno a temperatura ambiente y con agitación 
constante con 20 ml de TBST. Después se agregó 1µl del anticuerpo secundario 
(anti-conejo) diluido en 20 ml de solución de bloqueo y se incubó durante 1h a 
temperatura ambiente con agitación. Este anticuerpo está acoplado a una enzima 
con actividad de peroxidasa. Se hicieron 4 lavados con TBST y la actividad de 
peroxidasa se evaluó aprovechando la capacidad de ésta para producir una señal 
22 
 
luminosa a partir del sustrato quimioluminicente para peroxidasa (Millipore), misma 
que se detectó en un equipo fotodocumentador (Chemidoc, Bio-Rad). 
 
Capítulo 4. Resultados 
 
Determinación de la actividad de SPS 
Para el establecimiento de las condiciones que permitieran medir la actividad de 
SPS se usaron 2 extractosde proteína de embriones de Phaseolus vulgaris var. 
Canario-60 (embriones que crecieron en condiciones normales por 22 días (control) 
y otros que se desarrollaron en frutos que fueron removidos de la planta 3 días antes 
del ensayo). Se observó que en ambos casos la actividad se incrementó de manera 
lineal al menos durante los 30 min del ensayo (Figura 3). 
 
Figura 3. Efecto del tiempo de incubación sobre la actividad de SPS medido en condiciones 
limitantes (lim) o de velocidad máxima (max) en extractos de embriones que se 
desarrollaron normalmente por 22 DDF (22) y en embriones que crecieron en frutos que 
habían sido cortados de la planta 3 días antes (20+3). 
 
23 
 
Adicionalmente, fue necesario hacer una curva patrón de sacarosa (Figura 4) para 
expresar en unidades de concentración las lecturas que se obtuvieron en los 
ensayos en donde se midió la actividad de SPS. 
 
 
Figura 4. Curva patrón de sacarosa. 
 
Actividad de SPS en embriones removidos 
Una vez que se establecieron las condiciones para la medición confiable de la 
actividad de SPS (30 minutos de reacción, 37°C con 30 µl de extracto proteico y 20 
ml de mezcla de reacción), se procedió a midir la actividad en cada uno de los 
extractos. Los resultados obtenidos indican que la actividad de SPS en los 
embriones control se mantuvo relativamente constante entre los 20 y 25 DDF. En 
los embriones que se desarrollaron en los frutos removidos, se observó un 
incremento importante a partir del segundo día posterior a que los frutos fueron 
cortados de la planta. La actividad se expresó tanto por gramo de peso fresco 
(Figura 5 A) como por cantidad de proteína presente en la muestra (Figura 5 B) y 
en ambos la tendencia fue similar. En todos los casos, la actividad en condiciones 
y = 4.949x - 0.0078
R² = 0.9988
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
A
 6
2
0
µmol sacarosa
24 
 
limitantes fue menor a la observada en condiciones óptimas (Figura 5) y el aumento 
de la actividad en los embriones removidos se observó tanto en condiciones 
limitantes como en las óptimas. 
 
Figura 5. Actividad de la enzima SPS medida en condiciones de velocidad máxima o de 
limitación de sustratos en extractos de embriones que se desarrollaron normalmente o en 
frutos que fueron removidos a 20 DDF. A) Actividad expresada /g de peso fresco. B) 
Actividad específica. Los puntos representan el promedio ±SD, n=4. 
 
El cociente que resulta al dividir los valores de la actividad máxima entre los valores 
de actividad obtenidos en condiciones limitantes muestra una relación casi 
constante en las semillas removidas, mientras que las control tienen un pico de 
 
A
)
25 
 
actividad al día 21, y después se estabiliza, los valores son similares a los que se 
detectaron en las muestras de embriones removidos (Figura 6). 
 
 
Figura 6. Cociente resultante de dividir los valores de actividad máxima por los obtenidos 
en condiciones de limitación de sustratos en embriones control y removidos. Los puntos 
representan el promedio ± SD, n=4. 
 
Actividad de SPS en vainas removidas 
La actividad de SPS en las vainas de los frutos que se desarrollaron normalmente 
(vainas del control), muestra pocos cambios en el periodo de 20 a 25 DDF. En 
cambio, en las vainas de los frutos removidos se aprecia un aumento al primer día 
después de que los frutos fueron cortados. Posteriormente hay una disminución muy 
importante. En este caso, la actividad medida en condiciones de velocidad máxima 
es similar a la observada en condiciones de limitación de sustratos. Por otro lado, el 
patrón es idéntico si la actividad de expresa por gramo de peso fresco (figura 7 A) 
o por cantidad de proteína (figura 7 B). 
26 
 
 
Figura 7. Actividad de la enzima SPS en extractos de vainas de frutos removidos. A) 
Actividad expresada /g de peso fresco. B) Actividad específica. Los puntos representan el 
promedio ±SD, n=4. 
 
El cociente que resulta al dividir los valores de actividad máxima entre la obtenida 
en condiciones limitantes es cercano a 1 y casi constante en el grupo de los frutos 
control, mientras que en las vainas de los frutos removidos, tiene un incremento en 
el día 21, después de lo cual disminuye (Figura 8). 
 
A
)
B
)
27 
 
 
Figura 8. Cociente de dividir la actividad obtenida en condiciones de velocidad máxima entre 
la resultante cuando hay limitación de sustratos en vainas control y removidas. Los puntos 
representan el promedio ±SD, n=4. 
 
Actividad de SPS en embriones sometidos a sequía 
En condiciones normales la actividad de SPS presenta un máximo entre los 25 y 30 
días, el cual se observa si la actividad se mide en condiciones óptimas o de 
limitación de sustratos. En los embriones que se desarrollaron en las plantas 
sometidas a sequía, la actividad durante los primeros días de iniciado el tratamiento 
fue similar a la de los embriones que se desarrollaron normalmente. Sin embargo, 
a partir de día 12 de iniciado el tratamiento, la actividad se incrementó de manera 
significativa (Figura 9 A). La actividad de la enzima expresada tanto por gramo de 
peso fresco como por la cantidad de proteína presente en la muestra (actividad 
específica) mostró un comportamiento similar (Figura 9 B). 
 
 
28 
 
 
Figura 9. Actividad de SPS en embriones desarrollados normalmente (control) o en plantas 
sometidas a sequía a partir de los 20 DDF medida en condiciones óptimas o de limitación 
de sustratos. A) Actividad expresada /g de peso fresco. B) Actividad expresada por /m g 
proteína. Los puntos representan el promedio ± SD, n=4. 
 
El cociente de la actividad observada en condiciones óptimas entre la actividad 
medida con limitación de sustratos se presenta en la figura 10. Se observa que en 
los embriones control hay un valor máximo cercano a los 20 DDF, el cual baja 
rápidamente y después disminuye de manera muy gradual. En los embriones de las 
plantas sometidas a sequía, la tendencia fue muy similar. Sin embargo, no se 
observó el incremento que presentaron los embriones control, después de lo cual 
29 
 
los valores fueron ligeramente superiores en los embriones desarrollados en las 
plantas sometidas a sequía (Figura 10). 
 
 
Figura 10. Cociente resultante de dividir los valores de actividad obtenida en condiciones 
óptimas (máxima) entre la observada al hacer las mediciones con cantidades limitadas de 
sustratos en embriones que se desarrollaron en condiciones normales (control) o en plantas 
sometidas a sequía. Los puntos representan el promedio ±S D, n=4. 
 
Actividad de SPS en vainas sometidas a sequía 
Nuestros resultados muestran que la actividad de SPS en las vainas de frutos que 
se desarrollaron en condiciones normales de riego fue máxima entre los 20 y 24 
DDF, y luego se redujo gradualmente. En las vainas de los frutos sometidos a 
sequía en la Fig. 11 se aprecia que el valor máximo de actividad se presentó 
después (aproximadamente 10-12 días después de iniciado el tratamiento de 
sequía). 
30 
 
 
Figura 11. Actividad de SPS medida en condiciones óptimas o de limitación de sustratos en 
vainas de frutos que se desarrollaron en condiciones normales o en sequía. A) Actividad de 
SPS expresada /g de peso fresco. B) Actividad expresada /g proteína. Los puntos 
representan el promedio ± SD, n=4. 
 
Por otro lado, en condiciones limitantes, la actividad fue muy baja en ambos casos 
(Figura 11), lo que afectó el cálculo de la relación entre las actividades medidas en 
condiciones óptimas y de limitación de sustratos. Durante la primera mitad del 
periodo analizado, la sequía no indujo cambios muy importantes en las tendencias 
de la relación. Posteriormente, la actividad en las vainas de los frutos sometidos a 
sequía se redujo drásticamente y el cálculo se volvió poco confiable (Figura 12). 
 
31 
 
 
Figura 12. Cociente de actividad de SPS medida en condiciones ideales sobrela observada 
al medirla con limitación de sustratos en vainas de frutos que se desarrollaron en plantas 
cultivadas bajo condiciones óptimas (control) o sometidas a sequía. Los puntos representan 
el promedio ± SD, n=4. 
 
Evaluación de la cantidad de SPS por Western-blot. 
En las Figuras 13 A y 14 A se muestran los análisis de las proteínas totales 
presentes en los extractos de los embriones durante el desarrollo de las semillas. 
Como puede observarse, ni la falta de nutrientes derivada de la remoción anticipada 
de los frutos o la sequía fueron factores que hayan modificado las características de 
las proteínas que acumulan los embriones. Por otro lado, el anticuerpo contra la 
SPS permitió detectar 2 bandas entre los marcadores de 100 y 150 kD (Figuras 13 
B y 14 B, respectivamente). Como se observa en la Figura 13 B, la intensidad de la 
señal disminuye conforme se incrementa la edad de los frutos, cuya remoción de la 
planta parece acelerar la velocidad con la que se reduce la intensidad de la señal. 
32 
 
 
Figura 13. Separación de proteínas totales por SDS-PAGE de embriones que se 
desarrollaron normalmente (20 a 25) o en frutos cortados de la planta cuando tenían 20 
DDF (20+1 a 20+5). A) Tinción de las proteínas con Azul de Coomassie. B) 
Inmunodetección por Western-blot utilizando anticuerpos contra SPS. La flecha señala la 
banda de 130 kD correspondiente a la masa de la SPS. 
 
La sequía parece modificar el patrón de proteínas detectadas por el anticuerpo 
(Figura 14.B): 2 días después de iniciada la sequía parece incrementarse la 
intensidad de la banda de 130 kD, pero después esta condición acelera la velocidad 
con la que desaparece esa señal. 
33 
 
 
Figura 14. Separación de proteínas totales por SDS-PAGE de embriones que se 
desarrollaron normalmente (20 a 35) o en frutos que dejaron de regarse a los 20DDF (20+1 
a 20+15). A) Tinción de las proteínas con azul de Coomassie. B) Inmunodetección de la 
SPS por Western-blot utilizando anticuerpos contra SPS. La flecha señala la banda de 130 
kD correspondiente a la masa de la SPS. 
 
En vainas no se realizó la inmunodetección por Western-blot debido a que la 
cantidad de proteína presente en los extractos era muy pequeña. 
 
Capítulo 5. Discusión 
Durante la etapa inicial de este trabajo se lograron establecer las condiciones 
adecuadas para medir de manera confiable la actividad de la SPS (Figuras 3 y 4). 
Una vez logrado ese objetivo, se hicieron las mediciones de la actividad enzimática 
de los extractos de embriones y vainas tanto de condiciones de sequía como 
34 
 
remoción de los frutos. Los resultados obtenidos muestran que en condiciones 
normales la actividad de SPS en embriones y vainas se incrementa en el periodo 
que va de los 20 a los 25 DDF (Figuras 5 a 11). Esa etapa coincide con el inicio de 
la acumulación de sustancias de reserva en los embriones de las semillas de frijol. 
Ese patrón se modificó cuando los frutos fueron cortados o las plantas sometidas a 
sequía. Es muy probable que los cambios observados tengan una relación directa 
con las modificaciones en los niveles de ABA que estas condiciones experimentales 
podrían inducir (Weber et al., 2005). 
La limitación de nutrientes como resultado de la remoción de los frutos y el 
sometimiento de las plantas a sequía tienen efectos diferentes sobre la actividad de 
la SPS en embriones y vainas. La actividad de SPS manifestó un incremento 
gradual a partir del día 2 posterior a que los frutos fueron cortados de la planta 
(Figura 5), mientras que el efecto de la sequía fue poco perceptible (Figura 9). El 
incremento en la actividad de SPS en los embriones de los frutos que fueron 
cortados de la planta podría sugerir una respuesta tendiente a mantener niveles de 
sacarosa suficientemente elevados como para permitir que el desarrollo de algunas 
semillas continúe. Por otro lado, el hecho de que en los embriones de las plantas 
sometidas a sequía los cambios hayan sido mínimos, podría sugerir que esos 
embriones no estuvieron sometidos a una deficiencia nutricional tan severa 
(Geisenberger et al., 1996). Los embriones son estructuras con alta fuerza de 
demanda cuya nutrición se ve especialmente favorecida en condiciones adversas 
(Sauer, 2007) y la contribución de otros tejidos podría haber sido suficiente para 
mantener los niveles de sacarosa dentro de límites adecuados. 
En los extractos de vainas se observó que la remoción de los frutos produce un 
incremento al día 1 posterior a que los frutos fueron cortados, después de lo cual, 
la actividad baja considerablemente (Figura 7), mientras que la sequía hace que la 
actividad se mantenga elevada por más tiempo (Figura 11). La sacarosa tiene 
múltiples efectos sobre la fisiología de las plantas y en este caso podría promover 
la expansión celular y la acumulación de sustancias de reserva como almidón en 
los embriones (Gibson, 2005); o bien estimular la expresión de transportadores de 
35 
 
sacarosa para favorecer su movilización a órganos sumidero (Barker et al., 2000). 
El hecho de que la actividad de SPS se mantenga elevada por más tiempo en las 
vainas de los frutos de plantas que se desarrollaron sometidas a sequía (figura 11), 
sugiere que esta actividad podría estar involucrada en la síntesis de sacarosa 
destinada a favorecer el desarrollo de los embriones; para lo cual es probable que 
bajo estas condiciones, también se incremente la expresión o la actividad de 
trasportadores específicos de sacarosa (Barker et al., 2000). 
La actividad de SPS se regula a diferentes niveles. Uno de ellos es el efecto 
alostérico de distintos metabolitos, como glucosa 6-P y Pi, por lo que es importante 
que las mediciones se hayan hecho usando extractos desalados, lo permite eliminar 
el efecto de moléculas pequeñas (Weiner et al., 1992). 
Otro punto importante en la regulación de la actividad de SPS es su estado de 
fosforilación y la medición de la actividad en condiciones óptimas y de limitación de 
sustratos permite estimar el efecto de esta modificación (Huber y Huber, 1992 Jones 
y Ort, 1997). La fosforilación inactiva a SPS y su efecto es más evidente cuando la 
medición de la actividad se hace en condiciones de limitación de sustratos, en 
presencia de Pi (Huber y Huber, 1992 Jones y Ort, 1997). Al calcular la relación V 
óptima / V limitante observamos qué tan grande es esa diferencia. En general, en 
los frutos removidos (embriones y vainas, Figuras 6 y 8), la respuesta es modesta; 
mientras que en los extractos de embriones y especialmente en las vainas de los 
frutos que se desarrollaron en plantas sometidas a sequía (Figuras 10 y 12) la 
diferencia es muy importante. Estos resultados sugieren que si bien cortar los frutos 
o someter las plantas a sequía pueden ser maneras efectivas para reducir la 
disponibilidad de los nutrientes necesarios para favorecer el desarrollo de las 
semillas, el efecto es diferente al observado en plantas sometidas a sequía en 
donde es probable que SPS esté más fosforilada. Estas diferencias podrían estar 
relacionadas con la cantidad de ABA presente en los embriones y su efecto sobre 
la actividad de SPS. Los embriones removidos sólo cuentan con el ABA que ellos 
mismos puedan producir, mientras que los sometidos a sequía pueden responder 
36 
 
al ABA producido por ellos mismos y al que la planta madre pueda traslocar (Weber 
et al., 2005). 
Las diferencias observadas en el comportamiento de las vainas usadas como 
control en el experimento en donde los frutos fueron removidos difieren de aquellas 
en donde las plantas fueron sometidas a sequía (figuras 8 y 12). Por otro lado, los 
valores de la actividad obtenida en condiciones de limitación de sustratos fueron 
especialmente bajos cuando se analizó el efecto de la sequía (figura 11). Es 
probable que esta diferencia sea consecuencia de errores metodológicos. También 
es posible que la sencibilidaddel método no sea suficiente para la medición 
confiable de la actividad de SPS en este tejido, en donde la cantidad de la proteína 
es muy pequeña. Sin embargo, también es importante mencionar que los 
experimentos para analizar los efectos de cortar los frutos o de someter las plantas 
a sequía se realizaron en diferentes etapas del año, por lo que también es posible 
que las diferencias observadas se deban a variables importantes que no 
controlamos adecuadamente. 
El uso de anticuerpos específicos contra SPS permitió la detección de 2 bandas que 
corresponden a una masa molecular de 110 y 130 kD, respectivamente (Figuras 13 
B y 14 B). Se ha reportado que SPS es una proteína de 130 kD (Guy, et al., 1992), 
por lo que la banda de 110 kD podría ser un producto de su degradación. En 
términos generales la intensidad de la banda de 130 kDa disminuye conforme 
avanza el desarrollo de los embriones (Figuras 13 B y 14 B) lo cual explica la 
disminución gradual de la actividad. Sin embargo, en los extractos de los embriones 
removidos la actividad se mantiene elevada (figura 5), a pesar de que la cantidad 
de proteína detectada por Western-blot claramente se ha reducido (figura 13 B). Por 
lo que suponemos que SPS es mucho más activa (menos fosforilada) en este tejido 
cuando el fruto se remueve de la planta como parte del mecanismo para procurar 
un mayor número de semillas viables. 
El efecto de la sequía es diferente, se observa un incremento en la intensidad de la 
banda de 130 kDa a 2 días después de que inició el tratamiento (figura 14 B). Sin 
37 
 
embargo, ese cambio no se reflejó en la actividad, lo que podría suponer que la 
enzima permanece fosforilada. 
 
Capítulo 6. Conclusiones 
 Se estableció un método confiable para medir la actividad de SPS. 
 La actividad de SPS en embriones y vainas de frutos de frijol se incrementa 
al mismo tiempo que inicia la etapa de acumulación masiva de sustancias de 
reserva en los embriones. 
 Las condiciones adversas afectan la actividad de SPS y los efectos son 
dependientes del tejido y de la condición que la provoque: la deficiencia 
nutricional hace que la actividad se incremente en los embriones y que 
disminuya en las vainas; mientras que la sequía produce pocos cambios en 
la actividad de los embriones y prolonga la actividad en las vainas. 
 La cantidad de SPS en algunos casos tiene poca relación con los cambios 
en la actividad. Se propone que la fosforilación es el elemento regulatorio 
postraduccional más relevante en la actividad SPS, sobretodo en 
condiciones de sequía. 
 
Capítulo 7. Perspectivas 
Este trabajo es una primera aproximación al estudio del papel de la enzima SPS en 
las respuestas del proceso de desarrollo de las semillas de frijol a condiciones 
adversas. Algunos puntos para robustecer el protocolo seguido son los siguientes. 
 Medir el efecto de los tratamientos sobre las cantidades de ABA. 
 Para determinar de manera más precisa la intensidad del estrés hídrico que 
se aplica, se puede medir el potencial hídrico del sustrato. Al respecto puede 
usarse como referencia que en condiciones control el potencial hídrico de -3 
38 
 
MPa y a partir de -1.5 MPa las plantas están sometidas a estrés hídrico 
(Acosta-Gallegos y Kohashi-Shibata, 1989) 
 
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	Portada 
	RESUMEN
	Índice
	Capítulo 1. Introducción 
	Capítulo 2. Hipótesis y Objetivos 
	Capítulo 3. Materiales y Métodos 
	Capítulo 4. Resultados 
	Capítulo 5. Discusión 
	Capítulo 6. Conclusiones Capítulo 7. Perspectivas 
	Referencias