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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE CIENCIAS Actividad in vitro de Piqueria trinervia Cav. en trofozoítos de Giardia intestinalis y Trichomonas vaginalis T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: B I O L O G A P R E S E N T A : CANDY NAFTALY JIMÉNEZ FRAGOSO DIRECTOR DE TESIS: M. en C. Yadira Rufino González- 2014 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 1.Datos del alumno Jiménez Fragoso Candy Naftaly Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Ciencias Biología 306164880 2. Datos del tutor M. en C. Yadira Rufino González 3. Datos del sinodal 1 Dr. Manuel Jiménez Estrada 4. Datos del sinodal 2 Dra. Martha Ponce Macotela 5. Datos del sinodal 3 Dr. José Hugo Aguilar Díaz 6. Datos del sinodal 4 M. en C. Isabel Cristina Cañeda Guzmán 7. Datos del trabajo escrito. Actividad in vitro de Piqueria trinervia Cav. en trofozoítos de Giardia intestinalis y Trichomonas vaginalis. 76p 2014 AGRADECIMIENTOS A mis padres, porque han sido los maestros, de quienes he aprendido las mejores cosas, porque ellos son el mas claro ejemplo de amor, respeto, cariño y tolerancia, porque este logro en mi vida también es suyo, porque siempre nos esforzamos juntos para hacer que esto sucediera. Gracias por confiar en mí y por el apoyo incondicional. Los amo. A mis hermanos Luis y Clau por sus consejos, por todas las locuras juntos, por ser mis compañeros en esta vida, por su apoyo y sus regaños. Los quiero y admiro muchísimo. Al instituto Nacional de Pediatría. A mi directora de tesis: M. en C. Yadira Rufino por su apoyo, por la confianza y sus consejos. Gracias. A cada uno de los sinodales que con sus conocimientos y comentarios enriquecieron esta tesis. A la Dra. Martha Ponce Macotela por apoyarme en el desarrollo de este proyecto y por brindarme su confianza. Al Biólogo Mario Martínez por todos los consejos y conocimientos aportados. A la Dra. Rossana Arroyo por la donación del aislado de T. vaginalis. Al Dr. Manuel Jiménez Estrada, a Gabriel Sansón y a Dalia Barrios por su apoyo en el laboratorio de Productos naturales y por compartir sus conocimientos conmigo. A Anahí Anzo, Marco A. Martínez y a Lilia Roberts. A Christian, por el apoyo que me ha brindado para terminar este proyecto y para iniciar muchos otros, por los consejos, la paciencia, por el amor que me tiene, por estos 8 años que ha compartido conmigo y porque me enseñó lo maravilloso que es amar. ¡Te amo cielo! A mi amigo Rafa, que siempre me ha echado porras, me ha animado cuando he estado triste, me ha apoyado en todo, nunca me ha negado un consejo y a pesar de la distancia siempre ha estado conmigo. Gracias amigo. A mis amigos de la Facultad de Ciencias : Abril, Vero, Aralia, Vale, Ana Karina, Tania, Uriel entre otros… por el tiempo compartido, tantas risas y las experiencias. A mis compañeros del laboratorio de Parasitología experimental: Karina Clavijo, Christian García (mi cuaderno de doble raya), Gustavo Peralta, Laura Soto y Berenice González por la convivencia y el apoyo. A la Universidad Nacional Autónoma de México y a la Facultad de Ciencias. DEDICATORIA Esta tesis la dedico a mis padres y hermanos, porque fue un esfuerzo de los cinco y juntos lo logramos. A mis sobrinas Julieta e Isabella. A Christian porque con su motivación y cariño, hace que todo lo que me ocurra valga la pena. No debemos tener miedo a equivocarnos… Hasta los planetas chocan y del caos nacen las estrellas. (Charles Chaplin). Este proyecto contó con el apoyo de la Comisión Coordinadora de Institutos Nacionales de Salud y Hospitales de Alta Especialidad. Beca PROBEI. 1.0 Introducción .............................................................................................................................. 1 1.1 Giardiasis ................................................................................................................................... 1 1.1.1 Generalidades de Giardia intestinalis ................................................................................................ 1 1.1.2 Historia ............................................................................................................................................. 2 1.1.3 Taxonomía ........................................................................................................................................ 2 1.1.4 Especies del género Giardia .............................................................................................................. 3 1.1.5 Morfología ........................................................................................................................................ 4 1.1.6 Ciclo de vida ..................................................................................................................................... 5 1.1.7 Epidemiología ................................................................................................................................... 7 1.1.8 Mecanismos de transmisión ............................................................................................................... 7 1.1.9 Mecanismos patogénicos ................................................................................................................... 8 1.1.10 Mecanismos de defensa contra la respuesta inmune ......................................................................... 9 1.1.11 Manifestaciones clínicas ................................................................................................................ 10 1.1.12 Diagnóstico ................................................................................................................................... 10 1.1.13 Tratamiento ................................................................................................................................... 11 1.2 Tricomoniasis ...................................................................................................................... 15 1.2.1 Generalidades de Trichomonas vaginalis ......................................................................................... 15 1.2.2 Historia ........................................................................................................................................... 15 1.2.3 Taxonomía ...................................................................................................................................... 15 1.2.4 Especies del género Trichomonas .................................................................................................... 16 1.2.5 Morfología ...................................................................................................................................... 17 1.2.6 Ciclo de vida ...................................................................................................................................19 1.2.7 Epidemiología ................................................................................................................................. 21 1.2.8 Mecanismos de transmisión ............................................................................................................. 21 1.2.9 Mecanismos Patogénicos ................................................................................................................. 21 1.2.10 Mecanismos de defensa contra la respuesta inmune ....................................................................... 22 1.2.11 Manifestaciones clínicas ................................................................................................................ 23 1.2.12 Diagnóstico ................................................................................................................................... 24 1.2.13 Tratamiento .................................................................................................................................. 25 1.3 Medicina tradicional mexicana ................................................................................................. 28 1.3.1 Plantas con actividad antigiardiásica y tricomonicida ....................................................................... 29 1.4 Piqueria trinervia Cav. ............................................................................................................. 31 1.4.1 Taxonomía ...................................................................................................................................... 31 1.4.2 Descripción botánica ....................................................................................................................... 31 1.4.3 Distribución geográfica ................................................................................................................... 32 1.4.4 Usos en la Medicina tradicional ....................................................................................................... 33 1.4.5 Actividad biológica de extractos y compuestos ................................................................................ 33 2.0 Justificación ............................................................................................................................ 35 3.0 Hipótesis ................................................................................................................................. 35 4.0 Objetivo .................................................................................................................................. 35 5.0 Material y método ........................................................................................................................ 36 5.1 Material Biológico .................................................................................................................... 37 5.1.1 Piqueria trinervia Cav. .................................................................................................................... 37 5.1.2 Giardia intestinalis y Trichomonas vaginalis ................................................................................... 37 5.2 Obtención de extractos totales (acuoso, etanólico y metanólico) ............................................... 37 5.3 Aceite rojo, fracciones y compuestos puros (Trinervinol, Piquerol) ........................................... 37 5.4 Rendimiento de extractos totales ............................................................................................... 38 5.5 Cromatografía en capa fina ....................................................................................................... 38 5.6 Cultivo de Giardia intestinalis (WB) con extractos, aceite, fracciones y compuestos de Piqueria trinervia y tinción con azul de metileno .......................................................................................... 39 5.7 Cultivo de Trichomonas vaginalis (CNCD) con extractos, aceite, fracciones y compuestos de Piqueria trinervia y tinción con azul de metileno............................................................................ 40 5.8 Actividad antiparasitaria de Piqueria trinervia Cav................................................................... 40 5.9 Microscopía de interferencia diferencial (Nomarski) ................................................................. 41 5.10 Cortes semifinos de trofozoítos de Giardia intestinalis ........................................................... 41 5.11 Análisis estadístico ................................................................................................................. 41 6.0 Resultados .................................................................................................................................... 42 6.1 Rendimiento de los extractos totales ........................................................................................ 42 6.2 Cromatografía en capa fina ....................................................................................................... 42 6.3 Efecto de extractos totales de Piqueria trinervia en trofozoítos de Giardia intestinalis. ........... 43 6.4 Efecto de aceite, fracciones y compuestos puros de Piqueria trinervia en trofozoítos de Giardia intestinalis ...................................................................................................................................... 45 6.5 Efecto de extractos totales de Piqueria trinervia en trofozoítos de Trichomonas vaginalis ........ 49 6.6 Efecto de aceite, fracciones y compuestos puros de Piqueria trinervia en trofozoítos de Trichomonas vaginalis ................................................................................................................... 50 6.7 Microscopía de interferencia diferencial (Nomarski) ................................................................ 52 6.8 Cortes Semifinos de Giardia intestinalis ................................................................................... 54 7.0 Discusión ..................................................................................................................................... 56 8.0 Conclusiones ................................................................................................................................ 59 9.0 Perspectivas ................................................................................................................................. 59 10.0 Referencias................................................................................................................................. 60 11.0 Anexos ....................................................................................................................................... 75 Resumen Giardia intestinalis es un parásito cosmopolita, que infecta a mamíferos incluido el hombre, produce diarrea, malabsorción intestinal, limitando el desarrollo físico e intelectual. Trichomonas vaginalis es un parásito de transmisión sexual, que coloniza el tracto urogenital del hombre y puede producir infertilidad, partos prematuros y productos de bajo peso. El metronidazol es el fármaco de elección para combatir ambas parasitosis, sin embargo, provoca efectos secundarios que van desde leves hasta efectos teratogénicos y daño genético, además existen cepas resistentes. Ante este panorama es imperativo buscar nuevos antiparasitarios. Una fuente de búsqueda es la medicina tradicional y la etnobotánica. El propósito de este estudio, fue valorar la actividad antigiardiásica y tricomonicida de extractos y compuestos de Piqueria trinervia Cav. En placas de 96 pozos se sembraron 20000 trofozoítos de G. intestinalis o 5000 de T. vaginalis, se sometieron a diferentes concentraciones (6.2 – 800 µg/mL) de extractos Acuoso, Etanólico y Metanólico; (1.5 - 200 µg/mL) de dos compuestos puros (Piqueroly Trinervinol), Aceite rojo y Fracción 1 y 2 (F1 y F2) de Piqueria trinervia. Los controles fueron: trofozoítos sin tratamiento, trofozoítos con metronidazol 8.3 µg/mL, y trofozoítos con DMSO (0.4%). Las placas se incubaron 48 horas, se fijaron con metanol y tiñeron con azul de metileno 0.1%. La absorbancia se leyó a 650 nm, y se calculó el porcentaje de muerte de los trofozoítos. El extracto etanólico presentó la mejor actividad antigiardiásica, con 200 µg/mL se produjo el 94.3 ( 5.9 %) de trofozoítos muertos. A partir de 400 µg/mL los tres extractos presentaron índices de mortalidad de más del 97%. La F2 tuvo el mejor efecto antigiardiásico, con 25 µg/mL se murió el 94 ( 6.3 %) de los trofozoítos; con la misma dosis el efecto antigiardiásico del Trinervinol y Piquerol fue del 87.4 ( 5.2 %) y 87.4 ( 6.5 %) respectivamente. Las dos fracciones y los dos compuestos presentaron índices de mortalidad del 90 – 99 % con 50 µg/mL, estos porcentajes fueron mayores a los obtenidos con el metronidazol. El Aceite rojo con 200 µg/mL tuvo actividad antigiardiásica del 99 %. En trofozoítos de T. vaginalis Los extractos etanólico, metanólico y acuoso (800 µg/mL) produjeron el 52.2 ( 2.28 %), 43 ( 5.62 %) y 4.5 ( 3.01 %) de trofozoítos muertos, respectivamente. El porcentaje de muerte obtenido con el metronidazol fue del 99 %. La F2 presentó índices de mortalidad de 72.2 ( 4.1 %) de trofozoítos. El Piquerol y la F2 presentaron mejor actividad antigiardiásica. Ningún extracto ni compuesto de P. trinervia presentó buen efecto tricomonicida. 1 1.0 Introducción El parasitismo es un tipo de asociación donde un ser vivo (parásito) se aloja en otro de diferente especie (huésped u hospedero), del cual obtiene alimento y protección. Desde el punto de vista biológico, un parásito se considera más adaptado a su huésped cuando le produce menor daño. Los menos adaptados son aquellos que causan la muerte al huésped (Botero y Restrepo 2003). Los parásitos tienen un papel ecológico muy importante en la regulación poblacional, ya que en algunas ocasiones disminuyen la reproducción de sus hospederos y en otras les produce la muerte, además se han adaptado a los hábitats de los hospederos (piel, tejido subcutáneo, cavidades, tejidos y sangre). La mayoría de los animales alberga una o varias especies de parásitos con cientos o miles de especímenes. La mayoría de las especies de parásitos se encuentran entre los protozoarios, helmintos, artrópodos y pentastómidos (Quiroz 2005). Los protozoarios son organismos eucariotas, unicelulares, su información genética se encuentra almacenada en cromosomas en una envoltura nuclear y algunas especies son parásitos que afectan animales y al hombre (Taylor 2007). 1.1 Giardiasis 1.1.1 Generalidades de Giardia intestinalis Desde 1964 la Organización Mundial de la Salud (OMS) consideró a las enfermedades diarreicas como un grave problema, principalmente en los países en vías de desarrollo, debido a diversos factores: nivel socioeconómico, mala higiene, deficiencias nutricionales, cambios ambientales, mala infraestructura y poca educación. Estas enfermedades representan una de las principales causas de muerte en niños menores de cinco años (WHO 1964). Entre las parasitosis intestinales más común están la disentería amebiana causada por E. histolytica, seguida por la giardiasis causada por Giardia intestinalis (Paniagua et al., 2007). 2 G. intestinalis (syn. G. duodenalis, G. lamblia), es un parásito cosmopolita (Roxström-Lindquist et al., 2006; Mørch et al., 2008), con un amplio rango de hospederos vertebrados (Robertson et al., 2010). 1.1.2 Historia Anton Van Leeuwenhoek identificó por primera vez a Giardia bajo el microscopio a partir de sus muestras fecales, en 1859 Vilem Lamble lo redescubrió en muestras diarreicas de niños y lo nombró Cercomonas intestinalis. En 1882 Kunstler encontró en renacuajos organismos similares a los que nombró Giardia agilis y posteriormente Blanchard a los trofozoítos de mamíferos los nombró Lamblia intestinalis. Aunque el descubrimiento de los quistes se le atribuye a Grassi en 1879, se tienen registros de Vilem publicados desde 1860; Grassi analizó muestra de heces de humanos y de ratas de granero, pensando que el humano se infectaba al consumir los granos que estaban en contacto con las heces de las ratas y llamó a estos organismos Dimorphus muris. Blanchard en 1888 propone el género Lamblia en reconocimiento del trabajo de Vilem Lamble (Adam 2001; Farthing 1999; Upcroft and Upcroft 2001; Cox 2002). El 1915 se denominó a este parásito Giardia en honor a Alfred Giard, profesor de Kunstler. En ese mismo año, Stiles propuso la unificación de la terminología binomial de Giardia lamblia (Taylor 2007). 1.1.3 Taxonomía Cavalier-Smith en 1998 ubicó el género Giardia dentro del Subreino Archeozoa, que agrupa a protozoarios, amitocondriados y sin aparato de Golgi y los organismos del Phylum Metamonada se caracterizan por la presencia de flagelos. Imperio: Eucariota Reino: Protozoa Subreino: Archezoa Phylum: Metamonada Subphylum: Eopharyngia Clase: Trepomonadea Orden: Diplomonadida Género: Giardia Especie: G. intestinalis (G. lamblia, G. duodenalis 3 1.1.4 Especies del género Giardia El género Giardia parasita diversos hospederos y existen varias especies, es por ello que se han tomado varios criterios para agruparlas. En 1952, Filice, basándose en características morfológicas de los trofozoítos, describió tres especies, G. muris, G. agilis y G. duodenalis (Fig. 1). Posteriormente fueron descritas tres especies: G. psittaci, G. ardeae y G.microti (Tabla 1). (Olson et al., 2004; Ponce-Macotela y Martínez-Gordillo 2011; Adam 2001). Los trofozoítos de G. intestinalis que se obtienen a partir de muestras de diversos hospederos, son morfológicamente indistinguibles, para poder diferenciarlos, se han utilizado técnicas moleculares: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), polimorfismos de los fragmentos de restricción (RFLP) y secuenciación. Mediante el análisis molecular de genes que codifican a la glutamato deshidrogenasa, (gdh), triosa fosfato isomerasa (tpi), β-giardina, factor de elongación 1α y la subunidad del RNA ribosomal se han descrito ocho ensambles. Los ensambles A y B (zoonóticos). C y D (cánidos), E (artiodáctilos), F (félidos), G (ratas) y H (mamíferos marinos) (Feng y Xiao 2011; Xiao y Fayer 2008; Hussein et al., 2009; Thompson 2004; Ponce-Macotela 2006; Olson et al., 2004; Read et al., 2004; Lasek-Nelsselquist et al., 2010). a) b) c) Figura 1. Morfología de 3 especies del género Giardia a) G. agilis, b) G. muris, c) G. intestinalis (Tomada de Farthing 1999). 4 Tabla1. Especies del género Giardia (Olson et al., 2004; Adam 2001). 1.1.5 Morfología Trofozoíto Es la forma trófica o vegetativa, responsable de las manifestaciones clínicas debido a que coloniza el intestino delgado (duodeno y yeyuno), es piriforme, con simetría bilateral, cóncavo ventralmente y convexo dorsalmente. Mide entre 12 a 15 µm de longitud, por 5 a 9 µm de ancho y de 1 a 2 µm de espesor, tiene dos núcleos, cada uno diploide. El cuerpo medio en forma de uña de martillo, cuerpos basales, vacuolas periféricas cuatro pares de flagelos: antero-laterales, postero-laterales, ventrales y caudales, los cuales surgen de un cuerpo basal con axonemas, presentando una estructura típica de 9 + 2. Tienen un disco suctor, que se encuentra en la parte anterior, el cual mediante mecanismos de hidroadhesión, le confieren al parásito su capacidad de adherencia al epitelio intestinal, mide de 8 a 10 µm, no es simétrico y esta compuesto por proteínas como la tubulina, giardinas, y otras proteínas contráctiles (Fig. 2 A). La membrana citoplasmáticaque lo cubre presenta lectinas que son de gran importancia en los mecanismos de adhesión. Los trofozoítos se reproducen de manera asexual mediante fisión binaria longitudinal (Ponce-Macotela y Martínez-Gordillo 2011; Tay et al., 1996; Pascual 2005). Especies Hospederos Características morfológicas de los trofozoítos G. intestinalis Hombre y otros Mamíferos Piriformes, cuerpos medios en forma de uña de martillo. G agilis Anfibios Alargados, cuerpos medios en forma de gotas. G. muris Roedores y algunas aves Redondos, cuerpos medios pequeños y redondos. G. ardeae Aves (garzas) Redondos, cuerpos medios en forma de uña de martillo, sin flagelo caudal. G. microti Roedores Piriformes, cuerpos medios en forma de uña de martillo. Los quistes presentan 2 trofozoítos. 5 Quiste El quiste es una estructura de resistencia a diferentes condiciones ambientales y la forma infectante, es ovoide, mide entre 8 a 12 µm, su pared tiene un espesor entre 0.3 a 0.5 µm, que le confiere la capacidad de resistencia al medio ambiente, se encuentra compuesta por una capa externa filamentosa y una interna membranosa, que le confieren la capacidad de permanecer viables en el agua durante largos períodos de tiempo. Se pueden observar de 2 a 4 núcleos, dependiendo del grado de madurez en que se encuentre, presenta vacuolas, cuerpos basales, axonemas, flagelos retraídos, fragmentos del disco suctor y del cuerpo medio. Entre la membrana plasmática y la pared se identifica un espacio lacunar (Fig. 2B) (Sherffild y Bjorvatn1977; Ponce-Macotela y Martínez-Gordillo 2011; Pascual 2005; Tay et al., 1996). Los quistes han permanecido viables en agua a 8°C durante 77 días, 26 días a 21° C y 6 días a 37°C, y menos del 1 % de los ellos sobrevivió a -13° C durante 14 días y no soportan la ebullición (Bingham et al., 1979). BAA Figura 2. Microfotografías de G. intestinalis A) Trofozoíto teñido con Giemsa. B) Quiste con lugol. 1.1.6 Ciclo de vida La infección inicia por la ingesta de quistes viables en agua o alimentos contaminados. Los quistes inician su proceso de desenquistamiento, con el pH ácido y el pH alcalino del intestino delgado; estos cambios hacen que la pared del quiste se rompa y salga el trofozoítos que coloniza el intestino delgado 6 (duodeno y yeyuno), los trofozoítos se dividen por fisión binaria longitudinal y se adhieren al epitelio, las sales biliares y el colesterol favorecen su crecimiento (Ponce-Macotela y Martínez-Gordillo 2011; Adam 2001). Debido a la escasez de colesterol, los trofozoítos comienzan a enquistarse, después de enquistarse el parásito duplica sus órganos, de tal manera que el quiste maduro posee cuatro núcleos. La división del citoplasma ocurre hasta que el parásito se desenquista. Los quistes maduros llegan al colon y son eliminados en las heces (OPS 2003). Algunos trofozoítos pueden eliminarse cuando las heces son diarreicas pero no logran sobrevivir (Figura 3) (Pascual 2005; Bernarder et al., 2001; Ponce-Macotela y Martínez-Gordillo 2011). Figura 3. Esquema del Ciclo biológico de Giardia intestinalis. La infección inicia al ingerir alimentos contaminados con quistes, de los que emergen los trofozoítos para colonizar el intestino delgado, reproduciéndose por fisión binaria longitudinal, cuando las condiciones ya no son favorables, los trofozoítos secretan una pared resistente volviéndose quistes, los cuales salen con las heces, con la capacidad de infectar a otro hospedero, cuando las heces son diarreicas pueden encontrarse trofozoítos. (www.dpd.cdc.gov/dpdx). 7 1.1.7 Epidemiología G. intestinalis es cosmopolita, presenta una mayor incidencia en regiones tropicales y subtropicales, donde es frecuente la contaminación de agua o alimentos con materia fecal (Mandell et al., 2002; Botero y Restrepo 1998; Pascual 2005). Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) en el mundo hay 280 millones de personas con giardiasis y medio millón se infectan cada año en América, Asia y África (WHO 1996). En los países desarrollados la prevalencia va del 2 al 5 % (Feng y Xiao 2011; Sagebiel et al., 2009; Giangaspero et al., 2007). En países en vías de desarrollo la prevalencia es variable, va del 20 al 69 %, en ocasiones alcanza el 100 % en niños (Jacobsen et al., 2007; Feng y Xiao. 2011; Ortega y Adam 1997). Los países en vías de desarrollo tienen una prevalencia mayor, debido a la baja economía, niveles bajos de educación, escasez de agua potable, condiciones de hacinamiento, condiciones sanitarias inadecuadas, falta de higiene, mala infraestructura y servicios de salud insuficientes. En México la prevalencia en niños entre 4 a 14 años oscila de 18 a 54 % (Rodríguez-Guzmán et al., 2000; Morales-Espinoza et al., 2003). En niños de 1 hasta los 5 años es mayor al 40 % (Tay et al., 1994; Sánchez-Vega et al., 2006). Solo en una área del Distrito Federal se encontró una prevalencia del 14.5 % (Sánchez-Vega et al., 2000). Los quistes de G. intestinalis, han infectado a hombres, animales domésticos y silvestres en climas muy fríos. En Canadá, se reportó un aumento en la prevalencia del 2 % al 17 % en humanos (Brown et al., 1950; Eaton 1976). Este parásito fue responsable del 47 % de todos los brotes epidémicos trasmitidos por agua que se produjeron desde 1974 hasta 2001 (Schuster et al., 2005). Se ha encontrado G. intestinalis en perros y otros animales domésticos, en distintos lugares del norte de Canadá, Alaska y Groenlandia (Himsworth et al., 2010; Salb et al., 2008; Schurer et al., 2012; Bryan et al., 2011) y en focas en el Golfo de St. Lawrence (Appelbee et al., 2010). Los quistes se han encontrado en agua potable y efluentes de aguas residuales (Roach et al., 1993) así como en muestras de heces de animales silvestres (Hueffer et al., 2011; Johnson et al., 2010; Kutz et al., 2008). 1.1.8 Mecanismos de transmisión Esta parasitosis se transmite por fecalismo, por la ingestión de agua o alimentos contaminados con quistes, mediante fómites, transmisores mecánicos, ano-mano-boca comúnmente en niños que se encuentran en guarderías o estancias infantiles, por contacto sexual (anolinguo). Para generar la 8 infección es necesario ingerir mínimo 10 quistes (Rendtorff 1954; Farthing 1999; Lujan 2006; Bland y Altman 1977; Keystone and Keystone 1980). 1.1.9 Mecanismos patogénicos Una vez iniciada la infección, los trofozoítos al colonizar el duodeno y yeyuno son responsables de diversos daños en el hospedero, estos daños son provocados por diferentes mecanismos. Traumático Los trofozoítos se adhieren a los enterocitos mediante el disco suctor, esta adherencia se encuentra mediada por las proteínas contráctiles que se encuentran en el disco: giardinas, actina, miosina, vinculina, tropomiosina y lectinas; éstas últimas son responsables de las anormalidades morfológicas en las microvellosidades y lisis celular al interactuar con las células del epitelio. Las anormalidades estructurales en la mucosa del intestino delgado y las criptas, a menudo se asocian con un aumento en las células inflamatorias crónicas en la lámina propia y en el epitelio, debido a estas anomalías morfológicas en el intestino delgado hay una reducción en la actividad de disacaridasas, específicamente en lactasa, sacarosa, maltasa y trehalosa (Farthing 1999; Troeger et al., 2007; Buret 2007). Barrera mecánica Si las condiciones de crecimiento son óptimas para el desarrollo de los trofozoítos, cuando se adhieren al epitelio intestinal comienzan a reproducirse exitosamente cubriendo algunas zonas e interfiriendo en la absorción de nutrientes (Buret 2007). Enzimático Los trofozoítos de Giardia secretan proteinasas, que contribuyen en el daño de los enterocitos, afectando la estructura de las células del epitelio o actuando como caspasas, promoviendo la apoptosis. Las sulfatasas, hidrolasas, fosfatasasácidas y tiolproteinasas pueden ayudar a la adherencia del parásito al epitelio, ya que atacan a las glucoproteinas de los enterocitos, alterando la morfología de las microvellosidades (Farthing 1997; Hare et al., 1989). 9 Competencia Los trofozoítos de Giardia compiten con el hospedero por las sales biliares, colesterol, fosfolípidos, nucleótidos, aminoácidos y los micronutrientes (zinc y hierro), tomándolos del medio cuando los necesita, se ha observado que la población infantil infectada con G. intestinalis tiene un nivel ligeramente bajo antes del tratamiento representando un factor de riesgo (Quihui et al., 2010). Estos mecanismos causan mala absorción, daño en las células del epitelio, vellosidades atrofiadas, esteatorrea debido a la mala absorción de grasas, mala función de la hemoglobina por la carencia de hierro y retraso del crecimiento, cambios neurosensoriales, la función cognitiva deficiente, funciones inmunes anormales por la carencia de zinc (Eckmann y Gillin 2001; Farthing 1999; Rosado 1998). Tóxico Puede ser que haya daño en el hospedero, debido a toxinas de Giardia, ya que se describió el gen de una proteína variable de superficie (CRP136) que tiene secuencias repetidas, con homología a una sarafotoxina, que es una sustancia que se encuentra en el veneno de serpientes de la familia Atractaspididae (Upcroft et al., 1997; Adam 2001). 1.1.10 Mecanismos de defensa contra la respuesta inmune Para que la infección sea exitosa, el parásito debe tener varias estrategias para evadir la respuesta inmune del hospedero, así como para inhibir ciertas sustancias o proteínas que puedan perjudicar su estabilidad. Para favorecer su crecimiento, Giardia necesita sales biliares, así como colesterol para la biogénesis de sus membranas, los trofozoítos inhiben la lipasa pancreática dejando pocos ácidos grasos libres y se protege de los pocos que pudieran estar libres en el intestino induciendo el crecimiento de células caliciformes (Lujan et al., 1996). Los trofozoítos evitan la agresión del Oxido Nítrico (NO) al inhibir su formación con el consumo de arginina ya que esta es necesaria para formarlo (Eckmann et al., 2000). Inhiben a la tripsina evitando la proteólisis, también se protegen mediante las proteínas variables de superficie (VSP), que son ricas en cisteína, proporcionándole estabilidad a su estructura, forman puentes disulfuro, se unen al zinc, haciendo que disminuya en el intestino, provocando que se inhiba la función de las carboxipeptidasas dependientes de zinc y el recambio constante de las VSP ayuda a evadir la respuesta inmune. El trofozoíto secreta tiolproteínasas para su defensa contra el ataque de https://www.google.com.mx/search?newwindow=1&biw=800&bih=447&q=Familia+Atractaspididae&spell=1&sa=X&ei=qzVjU43gLIuBogSz3IGgCg&ved=0CCoQBSgA 10 inmunoglobulinas, ya que logra romperlas (Faubert 2000; Farthing 1997; Singer et al., 2001; Eckmann y Gillin 2001). 1.1.11 Manifestaciones clínicas El periodo de incubación puede ir de los 12 hasta los 19 días. La giardiasis puede ocurrir de tres formas clínicas: portador asintomático, sintomática aguda y crónica. En la giardiasis aguda los síntomas más comunes son: dolor abdominal, diarrea, hiporexia, meteorismo, náuseas, flatulencia, estreñimiento, vómito, bajo peso, palidez de tegumentos, borborigmos y talla baja, las evacuaciones son explosivas, acuosas al inicio y después son esteatorreicas, fétidas. La fase crónica, puede durar varios meses, se presenta dolor abdominal, que se incrementa al consumir alimentos, provocando que los niños dejen de comer; meteorismo, inflamación abdominal, flatulencias fétidas, astenia, pérdida de peso, talla baja y déficit cognitivo, las evacuaciones son blandas y esteatorreicas. Es en esta fase donde se presenta el Síndrome de mala absorción, el cual consiste en la no absorción de Vitaminas A y B12, zinc, hierro, lípidos, proteínas y carbohidratos (Ponce-Macotela y Martínez-Gordillo 2011; Farthing 1999). 1.1.12 Diagnóstico Para comprobar la presencia del parásito, existen varias alternativas como: análisis coproparasitoscópicos, inmunológicos y moleculares, sin embargo la especificidad y sensibilidad entre cada una es diferente. Análisis coproparasitoscópicos Se considera como el estándar de oro en el diagnóstico de Giardia. Se recomienda hacer análisis en directo en fresco (a partir de la muestra del paciente, se homogeniza con una gota de solución salina y otra muestra con lugol, se observa en microscopio óptico a 40X), o técnica de flotación-Faust (se utiliza para concentrar quistes). En tres muestras seriadas de materia fecal en días consecutivos se tiene una sensibilidad de más del 95 %. Sin embargo, si con las tres muestras el resultado es negativo pero la sintomatología para Giardia persiste, se debe realizar el análisis a un grupo de cinco muestras seriadas, esto puede ser debido a la intermitencia en la eliminación de quistes (Giraldo-Gómez et al., 2005; Karabay et al., 2004; Yereli et al., 2004; Ponce-Macotela y Martínez-Gordillo 2011; Cañete et al., 2012). 11 Análisis inmunológicos Una variedad de enfoques inmunológicos han sido utilizados para detectar antígenos específicos de Giardia en muestras de heces, el más utilizado es en Inmunoensayo Ligado a Enzimas (ELISA), Inmunofluorescencia Indirecta (IFI), Inmunofluorescencia directa (IFD) y Western blot. Estos análisis resultan ser muy específicos y con una sensibilidad cercana al 100 % (Thompson 2004; Cedillo-Rivera et al., 2009; Grit et al., 2012; Faubert 2000). Análisis moleculares Con el análisis molecular mediante PCR, RFLP y secuenciación se puede reconocer el ensamble infectante (Xiao y Fayer 2008; Feng y Xiao 2011). 1.1.13 Tratamiento Se han usado diversos fármacos para tratar la giardiasis: 5- Nitroimidazoles (Metronidazol, Tinidazol, Ornidazol y Secnidazol); Benzimidazoles (Mebendazol y Albendazol); Quinacrina (Atabrine y Mepacrine); 5-Nitrotiazol (Nitazoxanida), (Furoxona), y Paramomicina (Hematina). 5-Nitroimidazoles El metronidazol es un fármaco sintético antibacteriano y antiparasitario, inicialmente se utilizó en el tratamiento de infecciones causadas por Trichomonas vaginalis, con el paso del tiempo se ha utilizado para el tratamiento de infecciones provocadas por diferentes organismos. Desde 1959 fue introducido en el mercado, en 1963 se aprobó por la asociación de alimentos y drogas de Estados Unidos (FDA) para uso humano. Se absorbe rápidamente y se distribuye en tejidos y fluidos del organismo, debido a que su unión con proteínas plasmáticas es baja (Bendesky y Menéndez 2001). Penetra en el tejido cerebro espinal, alcanzando el sistema nervioso central, también se han encontrado concentraciones bajas en leche materna y en el tejido placentario (Loft et al., 1986; Jokipii et al., 1977; Rosa et al., 1987), por lo que no se recomienda en mujeres que están lactando. El metronidazol es activo cuando se encuentra dentro de las células donde su grupo nitro se reduce por la enzima piruvato ferredoxina oxidorreductasa resultando en radicales intermediarios citotóxicos que se fijan a las cadenas de ADN del parásito provocando su muerte (Müller 1986; Müller et al., 2007; Misra et al., 1995; Farthing 1999; Ponce-Macotela y Martínez-Gordillo 2011; Cañete et al., 2012; 12 Yereli et al., 2004). El 77 % se elimina por la orina y el 13 % en las heces, también se ha encontrado en líquidos seminales, y vaginales ( Knov y Nord 1982). Los efectos secundarios que se han reportado son: vómito, náuseas, cefalea, boca seca,sabor metálico, diarrea y dolor abdominal; efectos neurotóxicos como vértigo, mareo y rara vez convulsiones y ataxia. Este fármaco esta contraindicado en pacientes con enfermedades del sistema nervioso central (Goldstein and Morais 1994; Cañete et al., 2012; Karabay et al., 2004). Se considera potencialmente embriotóxico en estudios con ratas, conejos y ratones. En humanos no se recomienda durante el primer trimestre de embarazo (Williams and Woodeock 2000). Se ha demostrado que el metabolito hidroxilado del metronidazol tiene la capacidad de inducir daños en el ADN en linfocitos humanos, en animales experimentales ha producido linfomas, cáncer pulmonar, fibroadenomas mamarios y adenocarcinomas (Farthring and Engelke, 1997; Wegman et al., 1994). Tinidazol Derivado del nitroimidazol usado como agente antiparasitario, aprobado para infecciones por protozoarios: tricomoniasis, amebiasis y giardiasis. También se ha usado para tratar o prevenir infecciones bacterianas (Tabla 2) (Escobedo et al., 2008). Benzimidazoles El albendazol y el mebendazol, se usan como antihelmínticos, desde 1990 fueron propuestos para el tratamiento de la giardiasis. Ejercen su efecto tóxico sobre G. intestinalis por que se unen a la β-tubulina del citoesqueleto. Esta unión provoca la inhibición de la polimerización del citoesqueleto y la absorción de la glucosa. (Tabla 2) (Cañete et al., 2012; Karabay et al., 2004; Yereli et al., 2004). Quinacrina Inicialmente se utilizó contra el paludismo en los años 30s, fue el primer antigiardiásico efectivo hasta que fue sustituido por el metronidazol. El mecanismo de acción de este fármaco se debe a que se intercala fácilmente con el ADN de G. intestinalis, esta interacción causa una inhibición de la síntesis de ácidos nucleícos (Tabla 2) (Gardner y Hill 2001; Upcroft y Upcroft 2001). 13 Furazolidona Es un fármaco del tipo de los nitrofuranos con un amplio espectro contra bacterias. Fue introducido en 1962 para tratar la giardiasis, en niños, por su disponibilidad en suspensión. Dentro del trofozoíto se somete a la activación reductiva, a diferencia del metronidazol, la reducción ocurre por la enzima NADH oxidasa, sus productos pueden dañar componentes celulares importantes incluyendo ADN (Tabla 2) (Gardner y Hill 2001). Nitazoxanida Es un fármaco derivado del 5-Nitrotiazol, con una buena efectividad contra infecciones intestinales causadas por protozoarios, helmintos y algunas bacterias, se introdujo al mercado latinoamericano en 1996 y en el año 2002 fue aprobado por la FDA para el tratamiento de la diarrea causada por G. intestinalis (Tabla 2) (Escobedo et al., 2008; Romero- Cabello et al., 1997). Paramomicina Es un aminoglucósido aislado en 1956 inicialmente para tratar infecciones causadas por Entamoeba histolytica y Trichomonas vaginalis. Se absorbe poco por el intestino, es por ello que tiene un efecto menor. Inhibe la síntesis por interferencia con las subunidades ribosomales 50S y 30S; provoca que el ARNr del parásito tenga un tamaño y una secuencia inusual, causando mala interpretación de los codones de ARNm. Es recomendado en mujeres embarazadas (Tabla 2) (Cedillo-Rivera y Muñoz 1992; Gardner 2001; Upcroft y Upcroft 2001). 14 Tabla 2. Fármacos utilizados contra Giardia intestinalis Fármaco Eficacia (%) Efectos secundarios Dosis Referencia Adultos Niños Metronidazol 85 - 100 Sabor metálico, dolor abdominal, dolor de cabeza, vértigo, insomnio, convulsiones, orina rojiza 250 mg 3 veces al día / 3 días. 500 mg/ dosis única / 10 días 20 mg/Kg 3 veces al día / 7 días Cañete et al., 2012; Yereli et al., 2004 Tinidazol 74- 100 Raro: Hepatitis y colangitis 300 mg /día/7 días 50 mg /Kg dosis única Escobedo et al., 2008; Jokipii 1978 et al., Furazolidona 20- 92 Nauseas, vómito, diarrea, orina café 400 mg 4 veces al día 7- 10 días 8 mg/Kg/ día / 7-10 días Levi et al., 1977 Albendazol 82- 94 Nausea, vómito, diarrea, dolor de estómago 400 mg dosis única / 5 días 10 mg /Kg /5 días Cañete et al., 2012; Yereli et al., 2004; Karabay et al., 2004 Mebendazol 42 – 86 Dolor de estómago, vómito, diarrea 200 mg / 2-3 veces al día / 1-5 días 600 mg / día/ 3-5 días Rodríguez-García et al., 1999 Quinacrina 84- 100 Vómito, sabor metálico, dolor de cabeza, nauseas, piel amarillenta, urticaria 100 mg 3 veces al día / 5- 7 días 2 mg/Kg 3 veces al día/ 7 días Kyrönseppa y Pettersson 1981 Paramomicina 40 – 91 Desordenes gastrointestinales 500 mg 3 veces al día / 10 días 30 mg /Kg 3 veces al día /10 días Pengasaa et al., 1999 Nitazoxanida 64 - 94 Dolor abdominal, diarrea, vómito, dolor de cabeza, orina café 500 mg 2 veces al día / 3 días 7.5 mg /Kg 2 veces al día / 3 días Escobedo et al., 2008 Romero- Cabello et al., 1997 15 1.2 Tricomoniasis 1.2.1 Generalidades de Trichomonas vaginalis Las enfermedades de transmisión sexual (ETS) representan una de las principales causas a nivel mundial de enfermedades agudas, infertilidad a largo plazo y muerte, con consecuencias médicas graves y psicológicas para millones de hombres, mujeres y niños. La OMS estima que 340 millones de nuevos casos de Sífilis, Gonorrea, Chlamydia y Tricomoniasis han ocurrido en el mundo en hombres y mujeres entre 15 y 19 años (WHO 2001). Trichomonas vaginalis es un protozoario flagelado, parásito, que se transmite principalmente por vía sexual, colonizando el tracto urogenital de los humanos. 1.2.2 Historia Alfred Donné en el Hospital de Caridad en París, examinó exudados vaginales y en 1836 reportó animáculos en secreciones purulentas de casos de vaginitis. El zoólogo Dujardin dio el nombre de “Trico-Monas vaginale” uniendo los géneros Monas y Tricoides, ya que sus flagelos se parecían. En 1838 Ehrenberg la nombró como Trichomonas vaginalis. Los trofozoítos de T. vaginalis era vistos generalmente como habitantes comunes e inofensivos del tracto genital de la mujer (Simpson et al.,1999). Trussell en 1947 publicó un texto titulado Trichomonas vaginalis y tricomoniasis, donde describió sobre el cultivo y la morfología del organismo (Trusell 1947). 1.2.3 Taxonomía Cavalier-Smith en 1998. Ubicó el genero Trichomonas en el subreino Archezoa, en el que se encuentran los protozoarios amitocondriados. Los organismos del Phylum Trichozoa, son protozoarios flagelados anaerobios, amitocondriados que ancestralmente tenían 4 centriolos, no dos como los eucariontes superiores. La familia trichomonadidae presenta hidrogenosomas, organelos de doble 16 membrana que realizan una función similar a las mitocondrias, produciendo energía a través del metabolismo del piruvato. Imperio: Eucariota Reino: Protozoa Subreino: Archezoa Phylum: Trichozoa Subphylum: Parabasala Clase: Trichomonadea Orden: Trichomonadida Genero: Trichomonas Especie: T. vaginalis 1.2.4 Especies del género Trichomonas Existen tres especies de Trichomonas que infectan al humano: T. vaginalis (tracto genitourinario), T. hominis (tracto intestinal), T. tenax (tracto gingivial y traqueobronquial). T. muris infecta roedores y T. foetus a bovinos (Fig. 4) (Salazar y Bucio 2011; Simpson 1999; Botero y Restrepo 2003). En la tabla 3 se muestran diferentes especies de Trichomonas, las cuales difieren en hospedero, hábitat y características morfológicas, como tamaño y número de flagelos. a) b) c) a) c)b) d) a) b) c) e) f) a) b) c) a) c)b) d) a) b) c) e) f)a) c)b) d) Figura 4. Morfología de especies del género Trichomonas. a) T. tenax; b), T. vaginalis; c) T. hominis; d) T. foetus. (Tomada de Smyth 1994 y Simpson 1999). 17 Tabla 3. Especies del género Trichomonas. Especies HospederoHábitat Características morfológicas T. vaginalis Humano Aparato urogenital Trofozoíto piriforme, 20µm cuatro flagelos anteriores libres y uno recurrente. T. hominis Humano Intestino Trofozoíto < 20µm, cinco flagelos anteriores y uno recurrente. T.tenax Humano Cavidad bucal Trofozoíto <15µm cuatro flagelos anteriores y uno recurrente. T. foetus Bovino Tracto genital Trofozoíto piriforme, tres flagelos anteriores y uno recurrente. 1.2.5 Morfología T. vaginalis sólo existe en forma de trofozoíto, es piriforme, con un núcleo en la parte anterior, sus dimensiones van de 7 a 20 µm de longitud y 5 µm de ancho; presenta cuatro flagelos anteriores libres y uno recurrente a lo largo de la membrana ondulante; posee una estructura llamada axostilo, que lo recorre internamente de forma longitudinal, proporcionándole rigidez (Salazar y Bucio 2011; Petrin et al., 1998) (Fig. 5). 18 Figura 5. Esquema de la estructura de Trichomonas vaginalis. A, axostilo; FA, flagelos anteriores; C, costa; MC, membrana citoplásmica; K, kinetosoma; LM, lamela marginal; N, núcleo; P, pelta; FP, filamento parabasal; FR, flagelo recurrente; F, fibras; H, hidrogenosoma, MO, membrana ondulante. (Tomada de Simpson et al., 1999). En el citoplasma se pueden identificar: el retículo endoplásmico, sistema vacuolar, gránulos paraxostilares y paracostales conocidos como hidrogenosomas (en los que se realiza la síntesis de ATP), ribosomas libres y asociados al retículo endoplásmico, gránulos de glucógeno y un citoesqueleto complejo constituido por microtúbulos clasificados de acuerdo con su posición (flagelares, axostilares y mitóticos) (Petrin et al., 1998). 19 A B Figura 6. Microfotografía de trofozoítos de T. vaginalis. A. Forma ovoide. B. Forma ameboide adherida a células del epitelio. Imagen de Pereira-Neves y Benchimol. Universidad Santa Ursula, Río de Janeiro, Brasil. 2007 (http://memoria.cnpq.br/saladeimprensa/noticias/2007/0202.htm). La morfología del trofozoíto puede ser: ovoide en cultivos líquidos y en secreciones vaginales, ameboide aplanado adherido al epitelio celular. Este cambio de forma está acompañado del incremento de la síntesis de adhesinas AP23 y AP33. Cuando los trofozoítos piriformes entran en contacto con tejido del epitelio vaginal adoptan la forma ameboide en menos de tres minutos, formando lamelipodios. Ésta capacidad de transformación le proporcionan un aumento en la superficie de unión con el epitelio, teniendo así una mayor estabilidad durante la infección (Fig. 6) (Arroyo et al., 1993). 1.2.6 Ciclo de vida Involucra únicamente la transferencia directa de trofozoítos de un individuo infectado a otro, mediante contacto sexual. No existe la forma de resistencia. Los trofozoítos de T. vaginalis colonizan el epitelio vaginal, próstata y uretra según sea el caso. Dentro de su hospedero se reproducen por fisión binaria longitudinal, adhiriéndose al epitelio, se pueden encontrar en secreciones vaginales, prostáticas y orina, estos son capaces de infectar a otras personas al mantener contacto sexual (Fig. 7) (Salazar y Bucio 2011; Simpson et al., 1999). 20 Figura 7. Esquema que muestra el Ciclo biológico de Trichomonas vaginalis. La infección se da por contacto sexual, porque los trofozoítos están presentes en la vagina o en el orificio uretral, cuando colonizan el epitelio se reproducen por fisión binaria longitudinal (www.dpd.cdc.gov/dpdx). 21 1.2.7 Epidemiología La tricomoniasis vaginal, se ha considerado como la enfermedad número uno de transmisión sexual, no viral en todo el mundo (WHO 2001). Tiene una distribución cosmopolita, con mayor prevalencia en países en vías de desarrollo. A nivel mundial se estima que cada año aparecen 174 millones de casos de tricomoniasis, una cifra muy alta comparado con los 92 millones casos de Chlamydia trachomatis y 62 millones de Neisseria gonorrhoeae (Johnston and Mabey 2008). La prevalencia en embarazadas de países en vías de desarrollo (Sudáfrica, Brasil, Nicaragua, Chile y Cuba) va de 8 hasta 41.4% (WHO 2001; Rojas-Rivero et al., 2002). La prevalencia en los países desarrollados, como Estados Unidos es de 2.3 a 3.1% (Weinstock et al., 2004; Sutton et al., 2007; Miller et al., 2005). En México la prevalencia es de 1.7 a 23.4 % (Rivera et al., 1996; Sánchez-Vega et al., 1993; Mendoza- González et al., 2001; López-Monteon et al., 2013). La Dirección General de Epidemiologia, (2011) reportó una morbilidad de 113 843 casos, el grupo de edad con mayor morbilidad fue de 25-44 años con 59890 casos (http://www.epidemiologia. salud.gob.mx/anuario/html/ anuarios.html). 1.2.8 Mecanismos de transmisión La principal vía de transmisión es por contacto sexual, sin embargo, ocasionalmente se puede contraer mediante fómites (esponjas, toallas de baño húmedas y juguetes sexuales contaminados) o en albercas. (Pereira-Neves y Benchimol 2008; Smith 1983). Las embarazadas pueden infectar al producto a través del canal de parto (Petrin et al., 1998). 1.2.9 Mecanismos Patogénicos Adherencia El primer paso en la patogénesis de T.vaginalis es la adherencia. Al adherirse el parásito al epitelio vaginal o uretral, provoca daños en el hospedero, la adhesión está facilitada por la alfa-D-manosa y N- 22 acetiglucosamina en la membrana del parásito, así como por las proteasas que digieren la fibronectina, colagenasas, hemoglobina y otras adhesinas como por AP120, AP65, AP51, AP33 y AP23, la expresión de estas adhesinas esta regulada por el hierro (Arroyo y Alderete 1995; Alderete et al., 1995). Presenta varias proteasas, la mayoría de ellas cistein-proteasas (mínimo 23) y metaloproteasas, algunas relacionadas en mecanismos de citotoxicidad, hemólisis y evasión de la respuesta inmune (Provenzano y Alderete 1995). Hemólisis Al ser la mucosa vaginal un ambiente pobre en nutrientes, T. vaginalis puede adquirir hierro y lípidos a través de la lisis de eritrocitos mediante su proteína formadora de poros (Lehker et al., 1991). La actividad hemolítica de T. vaginalis explica por qué durante y después de la menstruación se observa un aumento en la intensidad de las manifestaciones clínicas durante la infección (Petrin et al., 1998; Carrada-Bravo 2006; Rojas Rivero et al., 2002; Goyal et al., 2011). Factor de desplegamiento celular (CDF) Es una glicoproteína que causa la separación de las células del epitelio y su producción se ha relacionado con la gravedad de la enfermedad; probablemente sea responsable de la producción del eritema de la mucosa vaginal durante la infección, además disminuye su actividad con el beta estradiol y los síntomas aumentan con la baja concentración de estrógenos en la vagina, es también por esta causa que aumentan los síntomas durante la menstruación, ya que es el periodo del ciclo en el que los niveles de estrógenos son mas bajos (Garber y Lemchuk 1990; Garber et al., 1991). 1.2.10 Mecanismos de defensa contra la respuesta inmune La capacidad de T. vaginalis para evadir el sistema inmune del hospedero es un aspecto importante para que la infección llegue a ser crónica (Petrin et al., 1998). 23 El moco cervical es deficiente en complemento, pero la sangre menstrual representa una fuente disponible de este en la vagina, T. vaginalis evade el sistema del complemento mediante la expresión de cistein-proteasas que degradan la porción C3 (Alderete et al., 1995). Las proteasas de T. vaginalis también degradan las inmunoglobulinas IgG e IgA (Alderete 1988). Los trofozoítos pueden cubrirse con proteínas plasmáticas del hospedero, provocando que el sistema inmune no lo reconozca como extraño (Peterson y Alderete 1982). 1.2.11 Manifestaciones clínicas Los casos clínicos de la tricomoniasis, van desde asintomáticos, hasta sintomáticos severos. En lavagina se observa edema, ulceración, enantema, produce hemorragias, leucorrea abundante, color amarillo-verdoso con aspecto espumoso, olor fuerte y desagradable, prurito vulvar, dispareunia, dolor en abdomen bajo, disuria. Los síntomas suelen incrementarse después de la menstruación (Petrin et al., 1998; Carrada-Bravo 2006; Rojas Rivero et al., 2002; Goyal et al., 2011). Puede provocar embarazos de alto riesgo y productos de bajo peso al nacer. Debido a la alta incidencia y a las secuelas causadas por la infección con T. vaginalis, se ha llegado a relacionar con problemas de infertilidad y la infección vaginal por Trichomonas facilita la propagación de varias infecciones de transmisión sexual, por ejemplo de VIH (Jarecki Black et al., 1998). En individuos masculinos puede ser asintomática. La infección suele ser de corta duración, pero puede transmitirse fácilmente en el periodo en que persiste (WHO 2001). Los trofozoítos invaden la uretra, próstata y vesículas seminales, produciendo uretritis y prostatitis, en los casos sintomáticos hay prurito y disuria, secreción mucopurulenta abundante por la mañana que disminuye con la primer orina del día (Yepes et al., 1999; González-Robles y Cristobal-Ramos 2002; WHO 2001). Los varones que cursan como asintomáticos representan una gran importancia y peligro en la transmisión, ya que pueden seguir propagando la infección sin saberlo. 24 1.2.12 Diagnóstico Microscopía directa de orina, secreciones vaginales, uretrales o prostáticas Es el método más accesible para el diagnóstico de T. vaginalis. La muestra de orina debe ser la primera del día. La muestra de secresiones vaginales se obtiene directamente de la vagina con un hisopo estéril, tomando la muestra de los fondos del saco uterino y del resto de la cavidad vaginal. En el caso masculino, en el orificio uretral se introduce un asa de platino estéril, realizando raspados al interior de la uretra. Tiene una sensibilidad del 40 - 82 % (Garber 2005; Sánchez-Vega et al., 1993; Rivera et al., 1996; Rojas Rivero et al., 2002). Cultivo El cultivo se realiza a partir de una muestra vaginal, o bien del sedimento de la primer orina del día o del semen, es considerado el estándar de oro en el diagnóstico de T. vaginalis, sin embargo, tienen la desventaja de que los cultivos deben estar de 2 a 7 días en incubación y durante éste tiempo los individuos infectados pueden continuar transmitiendo la infección. La sensibilidad de estos medios selectivos es del 85 - 87 % (Carrada-Bravo 2006; Nanda et al., 2006; Garber and Lemchuk 2005; Yepes et al.,1999; Rojas Rivero et al., 2002). Tinción de Giemsa A partir de exudados vaginales o de secreciones uretrales se realizan preparaciones, se fijan con metanol y se realizan tinciones con este colorante (Fosch et al., 2006). Tinción de Papanicolaou Tinción que permite diferenciar a las células debido a la diversidad de colores con las que se observa, los colorantes que se utilizan son: hematoxilina de Harris (tinción nuclear), Orange G (tinción citoplasmática, solución de PAP (Eosina y Verde claro moléculas de distinto tamaño que penetran por su tamaño), la preparación se pasa por xilol, se realiza un montaje con resina sintética y se observa en el microscopio (Otárola et al., 2005). 25 Prueba inmunológica rápida que detecta el antígeno de Trichomonas, (OSOM Trichomonas rapid test) El método de diagnóstico utiliza muestras en fresco, se trata de una inmunocromatografía de flujo capilar que provee resultados en aproximadamente 10 minutos, cuya sensibilidad y especificidad es de 83.3 % y 98.8 % respectivamente (Goyal et al., 2011). Affirm VP III (Becton Dickinson) A partir de una muestra vaginal se pueden detectar tres patógenos: Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis y Candida albicans. Estas pruebas tienen una sensibilidad mayor al 83 % y una especificidad mayor al 97 %. Se utiliza secuencias complementarias de ADN que se unen o hibridan únicamente con los ácidos nucleícos del organismo diana. Esta reacción de hibridación es altamente sensible y específica y por medio de reacciones colorimétricas permite la detección e identificación simultáneas de múltiples patógenos (Brown et al., 2004; Levi et al., 2011). Otras técnicas de diagnóstico como ELISA, hibridación in situ y pruebas con anticuerpos fluorescentes tienen entre 70 y 90 % de sensibilidad. La PCR ha sido probada para la aplicación en el diagnóstico y tiene una sensibilidad cercana al 100% (Garber 2005; Shaio et al., 1997; Madico et al., 1998; López-Monteón et al., 2013; Salazar y Bucio 2011). Una vez que es diagnosticada esta parasitosis es importante que se de tratamiento al compañero sexual, al mismo tiempo aunque no presente síntomas, ya que de no ser así es muy probable que haya reinfección (Berk et al., 1996). 1.2.13 Tratamiento Metronidazol Penetra a los trofozoítos por el mecanismo de difusión simple y se activa en los hidrogenosomas, su grupo nitro es reducido anaeróbicamente por la enzima piruvato ferredoxina oxidorreductasa, resultando en radicales intermediarios citotóxicos, que se fijan a las cadenas de ADN del parásito provocando su muerte (Müller 1986), la cual ocurre 8 horas después de que se aplica el fármaco (Crossnoe et al., 2002). La resistencia a este fármaco se ha visto en varios aislados de T. vaginalis 26 (Tabla 4) (Meri et al., 2003; Kulda et al.,1982; http://www.facmed. unam.mx/bmnd/gi_2k8/prods /PRODS /Metronidazol.htm). Tinidazol Es un fármaco derivado del nitroimidazol, se usa como agente parasitario aprobado para el tratamiento de protozoarios como tricomoniasis, giardiasis y amebiasis (Tabla 4) (Nyirjesy et al., 2011). Ornidazol Fármaco derivado del nitroimiodazol utilizado para el tratamiento de tricomoniasis, amebiasis y bacterias (Tabla 4) (Chunge et al., 1992) Nimorazol Su mecanismo de acción es la alteración en la síntesis y el metabolismo de los ácidos nucleícos, en especial el DNA (Tabla 4) (Bhiraleus et al., 1990). file:///D:\Kulda%20et%20al.,1982 27 Tabla 4. Fármacos utilizados contra T. vaginalis Fármaco Eficacia (%) Efectos secundarios Dosis Referencias Metronidazol 88 Sabor metálico, dolor de cabeza, vértigo, insomnio, convulsiones, orina rojiza. oral: 1.5-2 g dosis única 250 mg 3 veces al día / 7 días. vaginal: 500 mg /12 h/5 días Carrada- Carrada-Bravo 2006; Kissinger et al., 2010; Nyirjesy et al., 2011; Tinidazol 75 Sabor amargo, dolor abdominal, dolor de cabeza, orina inusualmente amarillenta. Oral: 1 g 3 veces al día/ 7 días. Vaginal: 500mg 2 veces al día / 1 4 días Nyirjesy et al., 2011. Nimorazol 78 Anorexia, dolor abdominal, náuseas, vómitos, pérdida de peso, insomnio, dolor de cabeza, reacciones alérgicas, psicosis, convulsiones, vértigo, somnolencia. Oral: 2 g dosis única Bhiraleus et al., 1990; Chunge et al., 1992 Ornidazol 73 Malestar estomacal, vómito, estreñimiento, mareos. Oral: 1.5 g dosis única Chunge et al., 1992 28 1.3 Medicina tradicional mexicana La OMS ha definido a la medicina tradicional como la suma de conocimientos, habilidades y prácticas, basadas en teorías, creencias y experiencias de indígenas, de distintas culturas, sean o no explicables, usados en el mantenimiento de la salud, así como en la prevención, diagnósticos o tratamiento de las enfermedades físicas o mentales (http://www.who.int/medicines/areas/traditional/definitions/en/index. html). Su empleo se encuentra arraigado a las circunstancias históricas y creencias, siendo en algunos casos la única fuente accesible de atención para la salud especialmente para la población más pobre. Se ha estimado que un80 % de los habitantes del mundo confían en la medicina tradicional para sus necesidades primarias de salud y mucha de esta terapia involucra en la actualidad, el uso de extractos de plantas o sus compuestos activos (Craig 1999; Harvey 2000). Las plantas medicinales se han usado de dos formas: como mezclas complejas (infusiones, aceites, tintes y extractos) y como puros (principios activos químicamente definidos) (Hambuerger y Hostettmann 1991). México cuenta con una gran riqueza y diversidad vegetal, tanto nativa como introducida, una gran parte de esta diversidad esta representada por la flora medicinal, que constituye uno de los principales recursos terapéuticos en zonas rurales y suburbanas, donde los servicios de atención médica llegan a ser escasos (Osuna et al., 2005). De las 30 000 especies de angiospermas, 5 000 son utilizadas en la medicina tradicional (Lozoya 1999). Documentos desde la época prehispánica como El códice Cruz-Badiano (Libellus de Medicinalibus Indorum Herbis), El Códice Florentino, La historia Natural de la Nueva España, enaltecen la riqueza y uso de la medicina tradicional para aliviar diversos malestares (Aranda et al., 2003; http://www.ibiologia.unam.mx/plantasnuevaespana/historia_de_las_plantasIG.html). Las plantas son importantes en la producción de químicos generados durante su actividad metabólica (metabolitos secundarios), dentro de sus funciones están: dispersión de semilla, defensa contra depredadores, atracción de polinizadores, entre otras. 29 1.3.1 Plantas con actividad antigiardiásica y tricomonicida Algunos estudios demuestran la actividad antigiardiásica (Tabla 5) y tricomonicida (Tabla 6) de extractos y compuestos elaborados a partir de hojas, tallos, cortezas, raíces o frutos. Tabla 5. Plantas con actividad antigiardiásica. AA+AM= allyl alcohol + allyl mercaptano, B= Bulbo, C= Corteza, F= Flor, Fr = Fruto, H= Hoja, S= Semilla, T= Tallo, NE= No especificado. Nombre científico Parte usada Solvente Concentración (µg/mL) Inhibición (%) Referencia Justicia spicigira Lippia beriandieri Psidium guajava T y H Agua 120 000 30 000 40 000 91 90 87 Ponce Macotela et al., 1994 Allium sativum B AA + AM 290 50 Harris et al., 2000 Lipia spp H Etanol 58.8 100 Ponce-Macotela et al., 2006 Lavandula angustifolia L. intermedia NE Aceite esencial 1 0.5 % 100 Moon et al., 2006 Achyrocline satureoides Eugenia uniflora Psidium guajava H Y T C C Agua 313 313 20 93 67 82.2 Costa et al., 2009 Origanum viens Thymbra capitata Lippia graveolens Thymus zygis NE Aceite esencial 70 70 50 100 50 70 50 50 Machado et al., 2010 Alocasia indica H Agua Etanol 4.12 4.65 50 Mulla et al., 2010 Zyzygium aromaticum Eugenol Aceite esencial 134 101 50 Machado et al., 2011 Cucurbita pepo S Metanol Agua 55 290 50 Barrón et al., 2012 Pulsatilla chinensis NE Acetato de etilo Agua 257 501.2 50 Ling-Dan et al., 2012 Persea americana S Triclorom etano Etanol 0.634 0.486 50 Jiménez- Arellanes et al., 2013 Calea ternifolia Zaluzania augusta Turnera diffusa H Metanol 100 200 200 83.3 90 90 Martínez 2013 30 Tabla 6. Plantas con actividad tricomonicida. Nombre científico Parte usada Solvente Concentr ación (µg/ml) Inhibición (%) Referencia L. angustifolia y L. intermedia NE Aceite esencial 1 y 0.5% 100 Moon et al., 2006 Viola odorata + Ruta graveolens H Agua 10 000 100 Al-Heali y Rahemo 2006 Allium hirtifolium B Agua/etanol Diclorometano 10.5 5 MIC Taran et al., 2006 Carica papaya L. Cocos nucifera L. S C Metanol 5.6 5.8 50 Calzada et al., 2007 Myristica fatua Scaevola balansae Fr C Diclorometano 35.2 29.3 50 Desrivot et al., 2007 Agave brittoniana Saponinas- FIII y FIV H Etanol-n- butanol 100 100 Guerra et al., 2008 Púnica granatum Fr Metanol 50 000 100 El-Sherbiny y El- Sherbiny 2011 Arbutus unedo H Acetato de etilo 500 100 Ertabaklar et al., 2009 Eucalyptus camaldulensis H Etanol Agua 15 100 Youse et al., 2012 Persea americana S Triclorometano Etanol 0.524 0.533 50 Jiménez-Arellanes et al., 2013 B= bulbo, C= corteza, F= flor, Fr= fruto, H= hoja, S= semilla, T= tallo, NE= no especificado, MIC= concentración mínima inhibitoria. 31 1.4 Piqueria trinervia Cav. Pertenece a la familia Asteraceae, tiene amplia distribución en México, algunas especies son utilizadas en la medicina tradicional (Longanga et al., 2000). 1.4.1 Taxonomía Piqueria trinervia Cav. es conocida en nuestro país como: hierba de San Nicolás, tabardillo, hierba del perro, hierba del zopilote, Yoloxiltic, Tzonixtalli (Nahuatl), su ubicacion taxonómica es: Reino: Plantae División: Magnoliophyta Clase: Magnoliopsida Subclase: Asteridae Orden: Asterales Familia: Asteraceae Subfamilia: Asteroideae Genero: Piqueria Especie: P. trinervia (IBUNAM/UNIBIO 2011). 1.4.2 Descripción botánica Es una hierba perenne, erguida, llega a medir hasta de 70 cm de altura; presenta tallo ramificado, cilíndrico, de 2 a 4 mm de diámetro, verde-amarillento, en ocasiones rojizo, glabro o puberulento solamente a lo largo de 2 hileras longitudinales dísticas; hojas opuestas, peciolo de 2 a 3 mm de largo, casi glabro, lámina lanceolada o angostamente ovada, ápice agudo, borde aserrado, base cuneada, glabra, tri a pentanervada desde la base; capítulos de 3 a 4 mm de largo, dispuestos en inflorescencias cimoso-corimbosas; 4 brácteas involucrales: elípticas, anchas, de ápice redondeado y mucronado, eroso-marginadas, verdes, glabras; corola de 1.5 mm de largo, tubo cortísimo, blanco con tinte rojizo, densamente pubescente, lóbulos blancos, glabros; aquenio de ± 1.5 mm de largo, glabro, con 4 costillas, vilano ausente (Rzedowski y Rzedowski 2005) (Fig. 8). 32 a b c d Figura 8. Piqueria trinervia Cav. a) tallo ramificado, b) planta completa, c) inflorescencias d) hojas opuestas (Fotografías de Pedro Tenorio Lezama Conabio 2005). 1.4.3 Distribución geográfica El género Piqueria comprende 26 especies, distribuidas en el continente Americano, 6 de ellas se encuentran en la República Mexicana, Panamá, Costa Rica, Guatemala Haití y Brasil. Se pueden encontrar en partes de Centroamérica y las Antillas (Rzedowski y Rzedowski 2005; Bejar et al., 2000; Balleza y Villaseñor 2002). En nuestro país, Piqueria trinervia Cav. se encuentra ampliamente distribuida en los estados de Aguascalientes, Campeche, Chiapas, Colima, Distrito Federal, Durango, Estado de México, Guerrero, Hidalgo, Jalisco, Michoacán, Morelos, Nayarit, Nuevo León, Oaxaca, Puebla Querétaro, San Luis Potosí, Sinaloa, Tamaulipas, Veracruz y Zacatecas. Esta distribución está relacionada con climas cálido, semiseco y templado. Desde los 1000 hasta los 3000 msnm. En ocasiones crece a orilla de los ríos, en bosque tropical caducifolio y subcaducifolio, matorral xerófilo, bosque espinoso, pastizal, bosques de encino, de pino, mixto de encino-pino, pino-encino y 33 ocasionalmente de oyamel (http://www.conabio.gob.mx/malezasdemexico/asteraceae/piqueriatrinervia /fichas/pagina1.htm). 1.4.4 Usos en la Medicina tradicional Desde el siglo XVI en el El Códice Florentino se registró a P. trinervia contra la fiebre. Juan de Esteyneffer, a inicios del siglo XVIII, refiere su uso contra el humor colérico. A finales del mismo siglo, Vicente Cervantes, hace referencia de su uso como: aromática y febrífuga. A finales del siglo XIX, el Instituto Médico Nacionallo menciona como: antipalúdico y antitérmico. En el siglo XX, Maximino Martínez la describe: antipirética, antirreumática, contra los cálculos de la vesícula, contra el vómito y en enfermedades exantemáticas. Luis Cabrera la refiere contra la bronquitis, enfermedades exantemáticas, fiebre tifoidea, gastralgia, neumonía, tifus exantemático. Finalmente, la Sociedad Farmacéutica de México la consigna como: antipalúdica, antipirética y para el tifus exantemático (Bejar et al., 2000). En la región centro del país (Hidalgo, Estado de México, Michoacán y Tlaxcala) es utilizada en desórdenes digestivos como infecciones intestinales, para el empacho (indigestión o ahíto). Además se emplea para el dolor de estómago, disentería en adultos, para controlar la fiebre, ronchas, resfrío, para acelerar el parto, reumas, lavar heridas, sarampión, dolor de oídos, purgante contra lombrices y paludismo (http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/monografia.php?l=3&t=Hierba_de_ San_Nicol%C3%A1s&id=7679; Martínez Bolaños 2012). 1.4.5 Actividad biológica de extractos y compuestos Se han valorado los extractos y compuestos de P. trinervia Cav. en diversos organismos como bacterias, hongos, parásitos, caracoles y malezas encontrando diferentes efectos (Tabla 7). En los Anales del Instituto Médico Nacional se reportó que Piqueria tuvo propiedades antitérmicas, en pacientes con tuberculosis y neumonía, se valoró en pacientes con paludismo y no presentó efecto (http://archive.org/stream/analesdelinstitu01inst/analesdelinstitu01inst_djvu.txt). 34 Tabla 7. Antecedentes de actividad de Piqueria trinervia Cav. Parte de la planta Extracto y/o compuesto. Organismos susceptibles Respuesta Referencia H Extracto acuoso Piquerol A Malezas Inhibición de germinación y crecimiento con 50 ppm (95 % y 30 % ) González de la Parra et al., 1981 H Piquerol A 8 especies de caracoles transmisores de Fasciola hepática y Schistosoma mansoni. Con 25ppm 100 % de caracoles muertos a las 24h de ser expuestos Cruz-Reyes et al., 1989 H Piquerol A y B larvas y garrapatas grávidas de Boophilus microplus 100% de muerte con 300 µg /mL/ 3 días. El Piquerol A causó muerte significativa en hembras grávidas. No se impidió la oviposición González de la Parra et al., 1991 H Piquerol A Trypanosoma cruzi (epimastigotes) Con 200 µg/mL se detuvo la reproducción pero no hubo muerte. Castro et al., 1992 CTC Ocho cepas de hongos parásitos de plantas. Se aislaron cuatro compuestos, no detectados en cultivos sin hongos, estos compuestos afectaron el crecimiento de los hongos. Saad et al., 2000 T, R, H, I Extractos: etanólico hexánico diclorometánico Nueve cepas bacterianas efecto sobre bacterias Gram negativas con 2mg/sensidisco del extracto hexánico de tallo Goldhaber- Pasillas 2004 Ty H Extracto etanólico Hongo Sporothrix schenckii Se inhibió 80% a una concentración de 50µg/ placa. Zurita- Valencia 2008 T y H Extractos: Etanólico y Diclorometánico Piquerol Trinervinol Aceite rojo F1 y F2 12 cepas bacterianas , 6 cepas fúngicas y Taenia crassiceps (cisticercos) El extracto diclorometánico tuvo efecto en 11 cepas bacterianas el Piquerol y Trinervinol en ninguna. El extracto diclorometánico tuvo el mejor efecto fungicida y la F2 el mejor cisticida Sansón- Romero 2012 T= tallo, H= hoja, R= raíz, I= inflorescencia, CTC= cultivo de tejidos celulares. 35 2.0 Justificación Giardia intestinalis y Trichomonas vaginalis son protozoarios de importancia médica, el primero puede causar síndrome de mala absorción, déficit cognitivo en niños y el segundo afecta principalmente a mujeres, causando infertilidad, partos prematuros y productos de bajo peso. Los fármacos que se utilizan para el tratamiento de estas parasitosis, presentan una eficacia variable, efectos secundarios que van desde leves hasta graves y se están generando cepas resistentes. México tiene una diversidad florística, que es utilizada en numerosas comunidades indígenas como primer alternativa para tratar sus malestares. No existe un respaldo científico del uso de Piqueria trinervia Cav. contra trofozoítos de Giardia intestinalis y Trichomonas vaginalis. Por lo que es necesario determinar si los extractos y/o compuestos de esta planta tienen efecto antigiardiásico y tricomonicida. 3.0 Hipótesis Los extractos totales: acuoso, etanólico y metanólico; así como los compuestos puros (Piquerol y Trinervinol); el aceite rojo y las fracciones (F1 y F2) de Piqueria trinervia Cav. presentarán efecto antigiardiásico y/o tricomonicida dosis-dependiente. 4.0 Objetivo Comparar el efecto de los extractos totales: acuoso, etanólico y metanólico, el aceite rojo, las fracciones (F1 y F2) y dos compuestos puros (Trinervinol y Piquerol) de P. trinervia Cav. en trofozoítos de Giardia intestinalis y Trichomonas vaginalis. 36 5.0 Material y método Extractos: A, E, M Piqueria trinervia Cav. Bioensayos Extractos, Fracciones y compuestos (6.2,12.5, 25 , 50, 100, 200, 400, 800 µg/mL) (1.5,3.1, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 µg/mL) Controles: Vivas, Metronidazol (8.3µg/mL), DMSO (0.4%) G. intestinalis (WB) 20 X 10³ T. vaginalis (CNCD) 5 X 10³ Fracciones y compuestos AR, F1, F2, P, T 48 hrs. 37ºC Azul de metileno 0.1% (D.O. 650 nm) Porcentaje de muerte: DO VIVAS - DO EXP DO VIVAS - DO MEDIO * 100 Microscopía de contraste por Interferencia Diferencial. Nomarski Cortes semifinos de trofozoítos de G. intestinalis Cromatografía en capa fina 37 5.1 Material Biológico 5.1.1 Piqueria trinervia Cav. La planta se colectó en el Cerro del Ajusco, en la Delegación Tlalpan, Distrito Federal, en Noviembre de 2010. 5.1.2 Giardia intestinalis y Trichomonas vaginalis Se utilizó el aislado WB (G. intestinalis) y CNCD (T. vaginalis). Los trofozoítos de G. intestinalis se mantuvieron a 37°C en medio TYI-S-33 suplementado con bilis y 10 % de suero fetal bovino. Los trofozoítos de Trichomonas vaginalis fueron donados por la Dra. Rossana Arroyo (CINVESTAV). El mantenimiento se realizó en medio TYM complementado con 10% de suero de caballo a 37ºC. 5.2 Obtención de extractos totales (acuoso, etanólico y metanólico) La planta se secó a temperatura ambiente, se fragmentó y se pesaron los tallos y hojas, se obtuvo un total de 700 g, para cada extracción se utilizaron 233 g. Las extracciones (acuosa, etanólica y metanólica) se realizaron a temperatura ambiente, utilizando 100 mL de solvente por cada 15.5 g de muestra macerada (peso seco) durante 24 horas. Los extractos se filtraron; el acuoso se evaporó a temperatura ambiente y el etanólico y metanólico en rotavapor. Finalmente los extractos (solidos), se dejaron a temperatura ambiente hasta alcanzar un peso constante y se almacenaron en frascos ámbar, hasta su uso. 5.3 Aceite rojo, fracciones y compuestos puros (Trinervinol, Piquerol) El Trinervinol, el Piquerol (Fig. 9), Aceite rojo y las fracciones (F1 y F2) fueron donados por el Dr. Manuel Jiménez Estrada del laboratorio de productos Naturales del Instituto de Química de la UNAM. Se obtuvieron a partir de un extracto acuoso de P. trinervia que fue particionado en un embudo de separación con diclorometano obteniendo una fase acuosa y una orgánica. Esta ultima se sometió a destilación para obtener un extracto diclorometánico, el cual fue filtrado para retener el Trinervinol. El 38 extracto se secó bajo flujo de aire para la cristalización del Piquerol. De estas separaciones, el extracto diclorometánico quedó rojizo con apariencia oleosa (aceite rojo), que se sometió a una separación por cromatografía en capa fina preparativa utilizando Hexano-Acetato de etilo (1:1) como eluyente, se obtuvieron 8 fracciones, eligiendo las dos mas cercanas
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