Actividad-microbiologica-como-biomarcador-de-un-proceso-de-fitorremediacion-asistida

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
DE MÉXICO 
 
ACTIVIDAD MICROBIOLÓGICA 
COMO BIOMARCADOR DE UN 
PROCESO DE 
FITORREMEDIACIÓN ASISTIDA 
TESIS 
PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGA 
PRESENTA: 
CLAUDIA VIANNEY DOMÍNGUEZ MENDOZA 
MÉXICO, D.F. 2011 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
JURADO ASIGNADO 
Presidente Rodolfo Pastelin Palacios 
Secretario Víctor Manuel Luna Pabello 
Vocal Adriana Guadalupe Mejía Chávez 
Primer suplente Beatriz Ruiz Villafan 
Segundo suplente María Guadalupe Tsuzuki Reyes 
 
LUGAR DONDE SE REALIZÓ LA TESIS 
Laboratorio de Microbiología Experimental, Facultad de Química de la 
Universidad Nacional Autónoma de México. 
DIRECTOR DE TESIS: 
 
Dr. Víctor Manuel Luna Pabello 
ASESOR TÉCNICO: 
 
M. en C. María Guadalupe Tsuzuki Reyes 
SUSTENTANTE: 
 
Claudia Vianney Domínguez Mendoza 
 
 
RECONOCIMIENTOS 
Al apoyo recibido por parte del proyecto DGAPA PAPIT IN-107209 
“Desarrollo de un humedal artificial de alta eficiencia para remoción 
de contaminantes orgánicos y microorganismos patógenos”, así como 
al PAIP FQ-VMLP 6190-14 (2009 y 2010). 
AGRADECIMIENTOS 
Al Dr. Víctor Manuel Luna Pabello, por su apoyo durante todo el 
desarrollo de esta Tesis. 
A la M. en C. Guadalupe Tsuzuki Reyes técnico académico del 
Laboratorio de Microbiología Experimental de la Facultad de Química 
de la UNAM por el apoyo técnico durante la etapa experimental. 
A Jackie “la chiqui”, por toda su ayuda durante la realización de esta 
tesis, pero sobre todo por ser tan buena amiga y siempre hacerme 
reír. 
A Holdy por ayudarme siempre, resolverme mis dudas y por 
apoyarme siempre en todo lo que necesitaba. 
A Don Félix, del laboratorio 1F de la Facultad de Química por todas las 
veces que nos ayudó. 
Pero principalmente a Dios por acompañarme a lo largo de todo este 
proyecto y de toda mi vida 
 
 
 
 
 
 
DEDICATORIA 
 
 
A MIS PAPIS: 
POR QUE A PESAR DE TODOS LOS PROBLEMAS QUE 
HA HABIDO EN NUESTRO CAMINO EL HECHO DE QUE 
CON ESTA TESIS SE CIERRE UN CAPITULO EN MI VIDA 
ES GRACIAS A USTEDES, A SU APOYO 
INCONDICIONAL, A SUS REGAÑOS, A TODO EL TIEMPO 
QUE HAN ESTADO CONMIGO, PERO SOBRE TODO A 
SU AMOR. 
NUNCA OLVIDEN QUE LOS AMO MUCHO Y QUE SON 
LA LUZ MAS GRANDE QUE ILUMINA MI CAMINO. 
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                                            DE UN PROCESO DE FITORREMEDIACIÓN ASISTIDA 
 
 
 
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CONTENIDO 
RESUMEN ................................................................................ 4 
I. INTRODUCCIÓN.................................................................. 6 
II. OBJETIVOS E HIPÓTESIS .................................................... 9 
1.1.OBJETIVO GENERAL .............................................................. 9 
1.2.OBJETIVOS PARTICULARES ..................................................... 9 
2. HIPÓTESIS .......................................................................... 9 
III.MARCO TEÓRICO ............................................................. 10 
1. PANORAMA GENERAL DE LA CONTAMINACIÓN POR HIDROCARBUROS. 10 
1.1. Composición del petróleo ......................................... 10 
1.2. Causas y consecuencias de la contaminación por 
hidrocarburos ................................................................... 12 
1.3. Legislación de la contaminación por hidrocarburos .. 13 
2. EL SUELO .......................................................................... 15 
2.1. Definición ................................................................. 15 
2.2. Propiedades fisicoquímicas y biológicas del suelo .... 15 
2.3. La rizosfera .............................................................. 17 
3. TÉCNICAS PARA EL SANEAMIENTO DE SUELOS. ........................... 18 
3.1. Biorremediación ....................................................... 19 
3.2. Fitorremediación. ..................................................... 21 
3.2.1. Ventajas y desventajas de la fitorremediación .... 22 
3.2.2. Mecanismos de fitorremediación. ........................ 23 
3.2.3. Fitorremediación asistida. ................................... 25 
4. BACTERIAS PROMOTORAS DEL CRECIMIENTO VEGETAL (BPCV) .... 26 
4.1. Descripción general .................................................. 26 
4.2. Actividades promotoras del crecimiento vegetal. ..... 27 
5. EL GÉNERO AZOSPIRILLUM ................................................... 28 
5.1. Características generales ......................................... 28 
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5.2. Aislamiento y crecimiento característico en medios de 
cultivo .............................................................................. 30 
5.3. Interacción bacteria-planta ...................................... 31 
5.4. Mecanismos promotores del crecimiento vegetal ..... 32 
6. ACTIVIDAD MICROBIOLÓGICA DEL SUELO ................................. 34 
6.1. Actividad deshidrogenasa ......................................... 37 
6.2. Actividad fosfatasa ................................................... 38 
6.3. Actividad β-glucosidasa ............................................ 39 
IV. MATERIALES Y MÉTODOS .............................................. 41 
1. ETAPA PRELIMINAR. ............................................................ 41 
1.1. Elección de semilla ................................................... 43 
1.2. Elección de cepa ....................................................... 44 
2. CONTAMINACIÓN DEL SUELO. ................................................ 44 
3. PREPARACIÓN DE LAS UNIDADES EXPERIMENTALES ..................... 45 
4. MONITOREO DE LAS UNIDADES EXPERIMENTALES ....................... 46 
4.1. Determinación de la concentración de hidrocarburos 
en suelo. .......................................................................... 47 
4.2. Determinación de la concentración de fósforo en 
suelo.. .............................................................................. 47 
4.3. Determinación de la concentración de nitrógeno en 
suelo ................................................................................ 47 
4.4. Determinación de los parámetros bioquímicos en 
suelo. ............................................................................... 47 
4.4.1. Fosfatasa ............................................................. 47 
4.4.2. Deshidrogenasa ................................................... 48 
4.4.3. β-glucosidasa ...................................................... 48 
4.5. Número de microorganismos en suelo. ..................... 48 
V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .............................................. 49 
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5.1. Selección de cepa ..................................................... 49 
5.2. Monitoreo de unidadesexperimentales .................... 51 
5.3. Concentración de hidrocarburos en suelo ................. 51 
5.4. Análisis estadístico de la concentración de 
hidrocarburos ................................................................... 54 
5.5. Concentración de fósforo soluble en suelo ............... 54 
5.6. Concentración de nitrógeno en suelo ........................ 56 
5.7. Actividad enzimática del suelo ................................. 58 
5.7.1. Actividad deshidrogenasa .................................... 58 
5.7.2. Relación entre la actividad deshidrogenasa y los 
niveles de hidrocarburos en el suelo.............................. 62 
5.7.3. Análisis estadístico de la actividad 
deshidrogenasa.. ........................................................... 64 
5.7.4. Actividad fosfatasa .............................................. 64 
5.7.5. Relación entre la actividad fosfatasa y los niveles 
de hidrocarburos en el suelo ......................................... 67 
5.7.6. Análisis estadístico de la actividad fosfatasa ....... 69 
5.7.7. Actividad β-glucosidasa ....................................... 69 
5.7.8.Relación entre la actividad β- glucosidasa y los 
niveles de hidrocarburos en el suelo.............................. 72 
5.7.9.Análisis estadístico de la actividad β-
glucosidasa.…… ............................................................. 74 
5.7.10. Cuantificación de microorganismos .................. 74 
VI. CONCLUSIONES ............................................................. 77 
VII. RECOMENDACIONES ...................................................... 78 
VIII.REFERENCIAS ................................................................ 79 
IX. ANEXOS ............................................................................ 86 
 
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RESUMEN 
 
La fitorremediación se define como una técnica biológica de 
saneamiento de suelos, que utiliza plantas y microorganismos con 
capacidad fisiológica y bioquímica para absorber, retener, degradar o 
transformar sustancias contaminantes a formas menos tóxicas. Una 
de las consecuencias de la contaminación del suelo es el cambio en 
los factores microbiológicos del mismo, como son el número de 
microorganismos y la actividad enzimática. Los biomarcadores o 
marcadores biológicos son los cambios medibles, ya sean estos 
bioquímicos, fisiológicos o morfológicos, que se asocian a la 
exposición de un compuesto tóxico. 
El objetivo de ésta tesis fue determinar el potencial de la actividad 
microbiológica del suelo como biomarcador en tres procesos de 
fitorremediación. 
Se trabajó con un suelo artificial que fue contaminado con diesel a 
una concentración inicial de 18 706 mg·kg-1. 
Se realizaron tres tratamientos de fitorremediación utilizando 
“Ryegrass” perenne tetraploide (Lolium perenne tetraploide): 
 Fitorremediación convencional (FTRC), utilizando solo 
“Ryegrass, 
 Fitorremediación asistida (FTRAs), adicionando una bacteria 
promotora del crecimiento vegetal (BPCV) Azospirillum 
lipoferum cepa AZm1 y 
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 Fitorremediación asistida con bioestimulación (FTRAs+BEs), en 
la cual además de la cepa se agregaron dosis extras de fósforo 
y nitrógeno durante el tratamiento; se utilizó como testigo el 
proceso de atenuación natural (ATN). 
Las variables medidas en el suelo correspondieron a: concentración 
de hidrocarburos totales del petróleo (HTP), concentración de 
nitrógeno total y fósforo, así como número de microorganismos y 
actividad deshidrogenasa, fosfatasa y β- glucosidasa 
El porcentaje de remoción de HTP fue ligeramente mayor en el 
sistema de FTRAs+BEs, seguida por la FTRAs, el porcentaje menor de 
remoción fue para la ATN, aunque el cambio más notorio se observa 
en el tiempo en el que se lleva a cabo el proceso de remediación. El 
cual muestra que el sistema de FTRAs+BEs alcanza un porcentaje 
mayor al 50% de remoción a los 20 días del experimento. 
Las tres actividades enzimáticas medidas, es decir, actividad 
deshidrogenasa, fosfatasa y β-glucosidasa, así como el número de 
microorganismos presentaron una respuesta negativa a la presencia 
del diesel, sin embargo las actividades fosfatasa y β-glucosidasa no 
mostraron diferencias significativas entre los diferentes sistemas, 
además la respuesta mostrada a la remoción del contaminante no fue 
notable en comparación con los sistemas que no estaban 
contaminados. 
Por otro lado, la actividad enzimática deshidrogenasa presentó la 
mejor respuesta a la presencia del diesel y su posterior remoción, los 
resultados mostraron que la determinación de éste parámetro puede 
ser utilizado como biomarcador de procesos de fitorremediación. 
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I. INTRODUCCIÓN 
Aquellos eventos en los que se encuentran involucradas sustancias 
que implican algún riesgo para el ambiente o la población y que 
puedan generar contaminación de suelos y cuerpos de agua, son 
conocidos como emergencias ambientales. De acuerdo con 
estadísticas de la Procuraduría Federal de Protección al Ambiente 
(PROFEPA), cada año se presentan en México un promedio de 370 
emergencias ambientales asociadas con materiales y residuos 
peligrosos. Dentro de los compuestos peligrosos más comúnmente 
involucrados en emergencias ambientales se encuentran el petróleo y 
sus derivados (gasolinas, combustóleo, diesel), agroquímicos, entre 
otros (PROFEPA, 2010). 
La contaminación del suelo por cualquier tipo de compuestos produce 
una gran cantidad de efectos en el ambiente, que se pueden observar 
desde problemas en la calidad del suelo hasta afectaciones a los seres 
humanos; dentro de éstos efectos se puede encontrar el cambio en 
los factores microbiológicos del suelo. 
Estos factores microbiológicos pueden determinarse a través de la 
investigación de la actividad biológica del suelo con parámetros tales 
como respiración del suelo, biomasa, actividad enzimática y conteo 
microbiológico. Todos estos datos pueden dar información sobre la 
presencia de organismos viables, así como, de la intensidad, tipo y 
duración de los efectos de los contaminantes sobre la actividad 
metabólica del suelo (Paz, 2005). 
 
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La actividad metabólica es la responsable en el suelo de procesos 
como la mineralización y humificación de la materia orgánica, lo cual 
incide en otra serie de procesos en que se ven incluidos elementos 
fundamentales (C, N, P y S) (García y Hernández, 2000). Su 
determinación puede ser útil para evaluar procesos de contaminación 
y descontaminación, siendo la mencionada actividad un reflejo de la 
posibilidad de degradación de compuestos que pueden ser tóxicos 
para ese suelo, y que pueden haber sido adicionados al mismo 
antropogénicamente (García y Hernández, 2004). 
La facilidad que presenta la actividad metabólica del suelo para 
responder rápidamente a cambios en el ambiente la propone como 
una herramienta útil para ser empleada como biomarcador de 
procesos de remediación de suelos, que indique la manera en la que 
se está llevando a cabo el proceso y la efectividad que este presenta 
(García, 2003). 
Existen muchas técnicas que se utilizan para la recuperación de suelos 
contaminados, dentro de éstas se encuentran aquellas que utilizan 
sistemas biológicos como plantas y microorganismos para que lleven 
a cabo el proceso de remoción de los contaminantes; y que son 
conocidos como procesos biológicos o biorremediación(Cookson 
1995). 
Una de las variantes de este tipo de procesos es la fitorremediación, 
en la cual el sistema biológico que se utiliza para llevar a cabo el 
saneamiento son plantas, este proceso generalmente se realiza in situ 
y tiene como ventajas el ser económicamente factible y que puede 
abarcar grandes extensiones de suelo contaminado; sin embargo, 
también posee algunas limitantes como son el tiempo en el que se 
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lleva a cabo el proceso en comparación con procesos fisicoquímicos, la 
viabilidad de las plantas para sobrevivir en ambientes contaminados, 
entre otros (Alkorta et al., 2004). 
Se han realizado estudios enfocados a mejorar los procesos de 
fitorremediación y evitar de esta manera algunas de la limitaciones 
que ésta presenta, como la inhibición del crecimiento de las plantas 
en ambientes contaminados, una solución a éste tipo de problemas se 
ha encontrado en la adición de bacterias promotoras del crecimiento 
vegetal (BPCV o PGPR por sus siglas en inglés Promoting Growth Plant 
Rhizobacterias), que dado a sus características se encuentran de 
forma natural en la rizosfera y brindan protección a diferentes tipos 
de estrés ambiental (estrés hídrico, falta de nutrientes, presencia de 
ciertos microorganismos), como es el caso de la contaminación. Este 
tipo de remediación se conoce como fitorremediación asistida y como 
se mencionó anteriormente comprende el uso de plantas asociadas a 
BPCV (Glick, 2010). Una de las BPCV más estudiadas en los últimos 
años es Azospirillum lipoferum, esta bacteria es conocida por ayudar 
al crecimiento de las plantas, esto se debe a varios mecanismos 
propios de la bacteria, como son la fijación de nitrógeno, la 
solubilización de fósforo y la producción de ciertas fitohormonas. 
(Steenhoudt et al., 2000). 
 
 
 
 
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II. OBJETIVOS E HIPÓTESIS 
1.1. Objetivo general 
Determinar el potencial de la actividad microbiológica del suelo como 
biomarcador de un proceso de fitorremediación asistida. 
1.2. Objetivos particulares 
 Evaluar el porcentaje de la remoción de diesel de “Ryegrass 
perenne” (Lolium perenne tetraploide) en tres diferentes 
sistemas: fitorremediación convencional, fitorremediación 
asistida y fitorremediación asistida y bioestimulada con fuentes 
de nitrógeno y fósforo. 
 Determinar la actividad microbiológica del suelo por medio de la 
cuantificación de microorganismos y de la actividad de las 
enzimas fosfatasa, deshidrogenasa y β-glucosidasa 
 Evaluar la utilidad de éstos parámetros como biomarcadores de 
la fitorremediación del diesel. 
2. Hipótesis 
Si la actividad microbiológica presenta una respuesta a la presencia 
del diesel ésta puede ser utilizada como biomarcador de procesos de 
remediación de suelos. 
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III. MARCO TEÓRICO 
1. Panorama general de la contaminación por 
hidrocarburos. 
1.1. Composición del petróleo 
El petróleo es extremadamente importante para la economía mundial, 
como proveedor de energía y como punto de partida para un gran 
número de productos de la industria química. El 95% de la gasolina 
para motores se obtiene del petróleo, así como el carburante diesel 
para motores y barcos, el combustible para fábricas y para usos 
domésticos, los aceites lubricantes, disolventes, plásticos, colorantes, 
detergentes, productos farmacéuticos y muchos otros compuestos 
químicos. 
El petróleo es el resultado de la degradación anaeróbica de materia 
orgánica, durante largos períodos de tiempo y bajo condiciones de 
alta temperatura y presión, que la convierte en gas natural, petróleo 
crudo y derivados. El petróleo crudo es una mezcla extremadamente 
compleja y variable de compuestos orgánicos, donde la mayoría de 
ellos son hidrocarburos, que varían en peso molecular desde el gas 
metano hasta los altos pesos moleculares de alquitranes y bitúmenes 
(Vargas et al., 2004). El petróleo crudo varía en composición química, 
color, viscosidad, peso específico, y otras propiedades físicas así como 
en su composición química de acuerdo al lugar en que se encuentre el 
yacimiento; por análisis elemental se ha observado que la mayoría 
contienen 81-87% de carbono, 10-14% de hidrógeno, 0.7% de 
nitrógeno y otros elementos en pequeñas cantidades (Rivera, 2008). 
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Tabla 3.1. Composición de las fracciones de un petróleo crudo 
FRACCIÓN COMPOSICIÓN 
Saturados n-alcanos, alcanos de cadena ramificada 
e isoprenoides y cicloparafinas o 
cicloalcanos, hopanos 
Aromáticos Hidrocarburos monoaromáticos, 
diaromáticos, aromáticos policíclicos 
(HAP) 
Resinas Agregados de piridinas, quinolinas, 
carbazoles, tiofenos, sulfóxidos y amidas 
Asfaltenos Agregados de HAP, ácidos nafténicos, 
sulfuros, ácidos grasos, metaloporinas, 
fenoles polihidratados 
 
Los hidrocarburos del petróleo comprenden una gran cantidad de 
compuestos que por definición se encuentran en el combustible 
crudo, así como en otras fuentes de combustible, como gas natural, 
carbón y turba (Tabla 3.1). Con base en su estructura, los 
hidrocarburos se dividen en dos clases principales: alifáticos y 
aromáticos policiclicos (HAP´s). Los primeros se subdividen en 
familias: alcanos, alquenos, alquinos y sus análogos cíclicos 
(cicloalcanos, cicloalquenos, entre otros); son de cadenas abiertas, 
lineales o ramificadas y cíclicas que se les asemejan. Por otro lado, los 
compuestos aromáticos se subdividen en monoaromáticos como el 
benceno, el tolueno, xileno y los poliaromáticos como el naftaleno, 
antraceno, fenantreno, benzopireno entre otros (Morrison, 1993). 
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Las parafinas son un componente principal del petróleo crudo y se 
encuentran en los principales productos de refinación. Hay tres tipos 
de parafinas, los alcanos lineales, los alcanos ramificados y los 
naftenos. Las olefinas se forman durante la refinación del petróleo 
crudo y se caracterizan por tener dobles enlaces en su estructura 
(Martín et al., 2004). 
Los diferentes productos que se obtienen por la refinación o 
destilación del petróleo crudo corresponden a: gasolina, diesel y 
asfaltos, son una combinación de diferentes hidrocarburos 
individuales, cada uno de los cuales tiene diferente punto de 
ebullición. Los compuestos con puntos de ebullición intermedios se 
utilizan en diferentes proporciones para conseguir productos como 
queroseno, diesel y aceites combustibles. Estos productos contienen 
preferentemente alcanos de 10 a 28 carbonos y policiclicos 
aromáticos con bajo o ningún contenido de olefinas. 
1.2. Causas y consecuencias de la contaminación por 
hidrocarburos 
Debido al manejo inadecuado de los materiales y residuos peligrosos 
se ha generado a nivel mundial, un problema grave de contaminación 
de los suelos y los cuerpos de agua; entre las más severas 
contaminaciones se destacan aquellas que son causadas por la 
extracción y transporte de hidrocarburos en países productores, como 
es el caso de México.(SEMARNAT 2005). 
Cuando en el suelo ocurre una contaminación por hidrocarburos, se 
originan varios cambios, por ejemplo: los hidrocarburos impiden el 
intercambio gaseoso con la atmósfera, iniciando una serie de procesos 
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fisicoquímicos simultáneos, como evaporación, y penetración, que 
dependiendo del tipo de hidrocarburo, temperatura, humedad, textura 
del suelo y cantidad vertida pueden ser procesos más o menos lentos, 
lo que ocasiona la toxicidad (Benavides, et al., 2006). 
Diferentes estudios han determinado el efecto de la contaminación 
con hidrocarburos en la germinación y crecimiento vegetativo de 
diferentes especies de pastos sometidos a concentraciones variables 
de hidrocarburo, concluyendo que hay una inhibición en la 
germinación del trébol común y un marcado retraso en el crecimiento 
de todas las plantas evaluadas. Asimismo, otros estudios evaluaron el 
efecto de los hidrocarburos poliaromáticos en ecosistemas forestales y 
plantas madereras, demostrando un efecto de necrosis foliar 
(Benavides et al., 2006). 
1.3. Legislación de la contaminación por hidrocarburos 
Como base de la legislación actual acerca de la contaminación con 
hidrocarburos, en el 2001 se publicaron por parte de la SEMARNAT las 
Bases de Política para la Prevención de la Contaminación del Suelo y 
su Remediación que incluyó una propuesta de Reglamento en materia 
de sitios contaminados y materiales y residuos peligrosos. 
En el año 2002 se emitió la Norma emergente NOM-183-ECOL-2002 
que establecía los límites máximos permisibles de contaminación en 
suelos afectados por hidrocarburos, la caracterización de sitios y 
procedimientos de restauración 
 
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El 30 de marzo de 2005 se publicó en el diario Oficial de la Federación 
la Norma Oficial Mexicana NOM-138-SEMARNAT/SS-2003, que 
establece los límites máximos permisibles de hidrocarburos en suelos 
y las especificaciones para su caracterización y remediación, y que 
reguló en el país la contaminación de suelos con hidrocarburos 
Actualmente está en vigor la NOM-138-SEMARNAT/SSA1-2008, que 
establece los límites máximos permisibles de hidrocarburos en suelo y 
lineamientos para el muestreo y la remediación. Esta norma es de 
observancia obligatoria en todo el territorio nacional. En la Tabla 3.2 
se muestran los límites máximos permisibles de hidrocarburos de 
acuerdo al uso de suelo de acuerdo a ésta norma. 
 
Tabla 3.2. Límites máximos permisibles para fracciones de Hidrocarburos 
en el suelo. NOM-138.SEMARNAT/SSA1-2008 
FRACCIÓN DE 
HIDROCARBUROS 
USO DE SUELO PREDOMINATE (mg·kg-1) 
Agrícola Residencial Industrial 
Ligera 200 200 500 
Media 1200 1200 5000 
Pesada 3000 3000 6000 
 
 
 
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2. El suelo 
2.1. Definición 
Se denomina suelo a la parte superficial de la corteza terrestre y 
biológicamente activa, que juega un papel importante en el 
mantenimiento de la calidad del aire, almacenamiento de agua y 
nutrientes para las plantas y microorganismos, y como medio 
purificador de contaminantes mediante procesos químicos, físicos y 
biológicos (Sylvia, et al., 1998). El suelo está conformado por cinco 
componentes principales que incluyen, la materia orgánica, los 
minerales, el agua, el aire y los organismos vivos, entre los que se 
produce un intercambio continuo de moléculas 
El suelo se desarrolla cuando la roca madre sufre cambios por una 
serie de procesos conocidos generalmente como intemperización. La 
roca madre se disgrega en pequeños fragmentos por las oscilaciones 
térmicas, la acción del agua, alcalinidad, acidez extremas y otras 
acciones químicas producidas por la acción biológica. Mientras se 
desintegra por la acción de estos efectos, intercambia materiales con 
su entorno inmediato, dando como producto final una capa superficial 
del suelo que se distingue física y químicamente del material 
subyacente. Los elementos más abundantes en el suelo son el silicio, 
aluminio, hierro y oxígeno, encontrándose básicamente en forma de 
silicatos. 
2.2. Propiedades fisicoquímicas y biológicas del suelo 
Las propiedades fisicoquímicas del suelo, determinan en gran medida, 
la capacidad de los usos del suelo; su condición física determina la 
rigidez y la fuerza de sostenimiento, la facilidad para la penetración 
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de las raíces, la aireación, la capacidad de drenaje y de 
almacenamiento de agua, la plasticidad y la retención de nutrientes 
(Rucks et al., 2004) 
Desde el punto de vista general, la composición elemental de los 
suelos varía de acuerdo a la naturaleza de la roca madre y los 
cambios producidos durante la meteorización, acumulación de materia 
orgánica y prácticas de manejo. Los componentes del suelo se pueden 
dividir en sólidos, líquidos y gaseosos. 
Los minerales del suelo están constituidos por aluminosilicatos 
hidratados, carbonatos, fosfatos, nitratos, nitritos e iones metálicos, 
incluyendo un gran número de grupos funcionales, que en conjunto 
participan en los procesos de adsorción/desorción e intercambio de 
iones en el suelo. Las cantidades de agua y aire que posee un suelo 
presentan fluctuaciones, pero se sabe que constituyen 
aproximadamente el 50 % del volumen total del suelo (Rucks et al., 
2004). 
Las propiedades fisicoquímicas que definen el tipo de suelo, son la 
capacidad de intercambio iónico, el contenido de materia orgánica, el 
pH, la porosidad, el tamaño de partícula y la textura del suelo, que 
determinan su comunidad microbiana puesto que son factores que 
establecen cada nicho ecológico 
La parte líquida está constituida por una disolución acuosa de las 
sales y los iones más comunes como Na+, K+, Ca2+, Cl-, NO3-, así 
como por una amplia serie de sustancias orgánicas. Finalmente la 
parte gaseosa se compone de gases atmosféricos y tiene gran 
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variabilidad en su composición, por el consumo de O2, y la producción 
de CO2 (Tan, 1994). 
Desde el punto de vista biológico, las características más importantes 
del suelo son su permeabilidad; relacionada con la porosidad; su 
estructura y su composición química. Los suelos retienen las 
sustancias minerales que las plantas necesitan para su nutrición y que 
se liberan por la degradación de los compuestos orgánicos. 
Por otra parte la fertilidad de los suelos puede ser evaluada con base 
en sus características físicas (densidad, estructura, porosidad), 
químicas (actividad de arcillas, potenciales de óxido reducción, 
materia orgánica) y biológicas (microorganismos que conforman la 
microbiota y la microfauna, además de la meso y macrofauna). Las 
interacciones que se derivan de estas tres características producen 
cambios significativos en los ciclos biogeoquímicos del suelo y en la 
disponibilidad de los nutrimentos para las plantas (Ferrera y Alarcón, 
2001). 
2.3. La rizosfera 
A principios del siglo XX, Hiltner introdujo el término de rizosfera para 
referirse a la zona del suelo influenciada por el desarrollo de las 
raíces, en donde se activa la proliferación de microorganismos. Este 
efecto de la presencia de las raíces llamado efecto rizosférico se debe 
al suministro de exhudados radicales que contienen azúcares, 
aminoácidos, vitaminas, enzimas, así como otros componentes, 
además de señales que modulan las interacciones microbio-planta 
(Pérez et al., 2002). 
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DE UN PROCESO DE FITORREMEDIACIÓN ASISTIDA 
   
 
 
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Las propiedades físicas, químicas y biológicas de la rizosfera son 
diferentes a las del suelo no rizosférico y, particularmente, la 
población microbiana desciendeal alejarse de la superficie radical. 
Las poblaciones rizosféricas están compuestas por bacterias, hongos, 
algas, nemátodos, protozoarios y virus. Los microorganismos tienen 
un protagonismo destacado en el sistema suelo-planta, ya que 
realizan diversas actividades que afectan el desarrollo, nutrición y 
salud de la planta y benefician la calidad del suelo. 
3. Técnicas para el saneamiento de suelos. 
Este tipo de técnicas pueden clasificarse de acuerdo a diferentes 
principios: 
 Lugar en que se realiza el proceso de remediación: en general 
se distinguen dos tipos de tecnologías 
- In situ. Son las aplicaciones en las que el suelo contaminado 
es tratado, o los contaminantes son removidos, sin necesidad 
de excavar el sitio. Es decir se realizan en el mismo lugar en 
donde se encuentra la contaminación. 
- Ex situ. Este tipo de tecnologías, requiere de excavación, 
degradado o cualquier otro proceso para remover el suelo 
contaminado antes de su tratamiento que puede realizarse 
en los alrededores del sitio afectado (on site) o fuera de él 
(off site). 
 
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 Tipo de tratamiento: esta clasificación se basa en el principio de 
la tecnología de remediación y se divide en tres tipos: 
- Tratamientos biológicos (biorremediación): utilizan las 
actividades metabólicas de ciertos organismos (plantas, 
hongos, bacterias) para degradar, transformar o remover los 
contaminantes a productos metabólicos inocuos. 
- Tratamientos fisicoquímicos: utilizan las propiedades físicas 
y/o químicas de los contaminantes o del medio contaminado 
para separar o contener la contaminación. 
- Tratamientos térmicos: utilizan calor para incrementar la 
volatilización (separación), quemar, descomponer, o fundir 
(inmovilización) los contaminantes en el suelo (Khan et al., 
2004) 
3.1. Biorremediación 
La biorremediación se define como el uso de sistemas biológicos para 
degradar, transformar, eliminar o reducir la concentración de 
compuestos orgánicos tóxicos a productos metabólicos inocuos o 
menos tóxicos. Es una tecnología que emplea procesos biológicos, 
mediados principalmente por microorganismos, para transformar, 
detoxificar y/o mineralizar contaminantes del ambiente (Cookson, 
1995). 
El objetivo de la biorremediación consiste en la mineralización del 
contaminante, es decir, la completa degradación de una molécula a 
compuestos inorgánicos, como CO2 y H2O y formas celulares. Su 
aceptación como una estrategia de limpieza viable, en muchos casos 
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depende de sus precios; sin embargo, muchas de las estrategias de 
biorremediación son factibles en términos de costos y del impacto 
sobre la matriz contaminada (Semple et al., 2001). 
Se han desarrollado diferentes tecnologías de biorremediación cuyas 
principales diferencias estriban en las condiciones en las que se lleva 
a cabo el proceso, en los parámetros que son controlados o 
modificados, así como en el lugar en que se apliquen (Cookson, 1995; 
Riser-Roberts, 1998). 
La biorremediación de suelos puede llevarse a cabo in situ, o bien, el 
material puede ser excavado y tratado ex situ. La principal ventaja de 
los tratamientos in situ es que permiten tratar el suelo sin necesidad 
de excavar ni transportar, dando como resultado una disminución en 
costos. Sin embargo, este tipo de tratamientos generalmente requiere 
de periodos de tratamiento largos y es menos seguro en cuanto a la 
uniformidad del tratamiento debido a la heterogeneidad propia del 
suelo. 
Las tecnologías de biorremediación in situ, incluyen el bioventeo, la 
bioaumentación, la bioestimulación, la biolabranza, la atenuación 
natural y la fitorremediación (Van Deuren et al., 1997). 
- Bioventeo o bioaereación: es una forma de estimulación 
realizada con gases, como por ejemplo oxígeno y metano, 
éstos son adicionados de forma pasiva en el suelo para 
estimular la actividad microbiana. 
- Bioaumentación: es la inoculación de una alta concentración 
de microorganismos en el suelo contaminado para facilitar la 
biodegradación. 
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- Bioestimulación: como su nombre lo indica, consiste en 
estimular a los microorganismos nativos del suelo 
adicionando nutrientes como nitrógeno o fósforo. 
- Fitorremediación: es el uso de plantas para remover, 
contener o transformar un contaminante. Ésta puede ser 
directa, donde las plantas actúan sobre el compuesto, o 
indirecta, donde éstas se utilizan para estimular 
microorganismos en la rizosfera. 
En el caso de las técnicas ex situ, incluyen técnicas de composteo 
(biopilas) y el uso de biorreactores. 
- Biopilas: consiste en la reducción de la concentración de 
contaminantes derivados del petróleo en suelos excavados. 
La técnica consiste en la formación de pilas del material 
biodegradable, formadas por suelo contaminado y materia 
orgánica en condiciones favorables para el desarrollo de los 
procesos de biodegradación de los contaminantes. 
- Biorreactores: consiste en colocar el suelo en contenedores 
con microorganismos externos o autóctonos capaces de 
degradar hidrocarburos; las condiciones de temperatura, 
humedad y nutrientes son controladas. 
3.2. Fitorremediación. 
Una de las técnicas biológicas más estudiadas es la fitorremediación 
que tiene como objetivo degradar, asimilar, metabolizar o 
desintoxicar contaminantes como: metales pesados, compuestos 
orgánicos y compuestos radioactivos por medio de la acción 
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DE UN PROCESO DE FITORREMEDIACIÓN ASISTIDA 
   
 
 
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combinada de plantas y microorganismos con capacidad fisiológica y 
bioquímica para absorber, retener, degradar o transformar sustancias 
contaminantes a formas menos tóxicas (Harvey et al., 2002). 
3.2.1. Ventajas y desventajas de la fitorremediación 
Las principales ventajas que tiene la fitorremediación son: 
- Incrementa la mineralización de los contaminantes, 
- Sus costos son bajos, en comparación con métodos 
fisicoquímicos, 
- Disminuye la distribución a los ecosistemas, 
- Evita la erosión, 
- Aumenta la disponibilidad del contaminante y 
- Puede abarcar grandes extensiones de suelo (USEPA, 2001) 
Sin embargo, la aplicación de la fitorremediación tiene limitaciones 
tales como: 
- La profundidad de penetración de las raíces, 
- La fitotoxicidad en áreas fuertemente contaminadas, 
- Los tiempos de proceso pueden ser muy prolongados y 
- Los compuestos pueden pasar a otras cadenas tróficas 
(López et al., 2005) 
 
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Para superar estas limitaciones es indispensable comprender: (i) los 
mecanismos de la fitorremediación, (ii) las fases que participan en la 
fitorremediación y (iii) las interacciones planta microorganismo 
(Cunningham et al., 1997). 
3.2.2. Mecanismos de fitorremediación. 
La desintoxicación de contaminantes por fitorremediación se realiza 
empleando al menos uno de los siguientes mecanismos: 
fitoextracción, rizofiltración, fitoestimulación, fitoestabilización, 
fitovolatilización y fitodegradación (López, 2005). 
Figura 3.1. Principales mecanismos de fitorremediación (Juárez, 2007) 
 
 
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 La fitoextracción o fitoacumulación, consiste en la absorción de 
contaminantes por las raíces; es la capacidad de algunasplantas para acumular contaminantes en sus raíces, tallos o 
follaje. 
 La rizofiltración, consiste en la utilización de plantas crecidas en 
cultivos hidropónicos, para absorber, concentrar y precipitar 
contaminantes. 
 En la fitoestimulación o rizodegradación, las plantas generan los 
exudados radiculares que estimulan el crecimiento de los 
microorganismos nativos capaces de degradar compuestos 
orgánicos xenobióticos. 
 La fitoestabilización, consiste en utilizar a la planta para 
desarrollar un sistema denso de raíces que le permite reducir la 
biodisponibilidad y la movilidad de los contaminantes evitando 
el transporte a capas subterráneas o a la atmósfera. 
 La fitodegradación, consiste en la transformación de los 
contaminantes orgánicos en moléculas más simples que pueden 
ser utilizados por el metabolismo de las plantas. 
 La fitovolatilización, consiste en que las plantas absorben los 
contaminantes junto con el agua. Algunos de los contaminantes 
pueden llegar hasta las hojas y evaporarse o volatilizarse a la 
atmósfera. 
Una planta fitorremediadora realiza cualquiera de los mecanismos 
anteriores siguiendo tres fases: absorción, excreción y desintoxicación 
de contaminantes. 
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25 
 
 La absorción de contaminantes se realiza a través de las raíces 
y las hojas mediante los estomas y la cutícula de la epidermis 
(Watt y Evans, 1999). Esta absorción ocurre en la rizodermis de 
las raíces jóvenes, que absorben los compuestos por ósmosis 
dependiendo de factores externos como la temperatura y el pH 
del suelo. Otros factores importantes que inciden en la 
penetración del contaminante son su peso molecular e 
hidrofobicidad que determinan que estas moléculas atraviesen 
las membranas celulares de la planta. Después de cruzar la 
membrana, los contaminantes son distribuidos a través de toda 
la planta (Harvey et al., 2002). 
 Los contaminantes que se absorben por las raíces, se excretan 
vía hojas (fitovolatilización). Cuando las concentraciones de los 
contaminantes son elevadas, fracciones menores al 5 % se 
excretan sin cambios en su estructura química. 
 La desintoxicación de los compuestos orgánicos se lleva a cabo 
por la vía de la mineralización hasta dióxido de carbono. 
3.2.3. Fitorremediación asistida. 
Dentro de la tecnología de fitorremediación se ha prestado atención a 
la aplicación de una variante de este tratamiento que ayude a superar 
algunas desventajas que ésta presenta, tales como la toxicidad del 
contaminante hacia la planta y la limitación en cuanto al tamaño de la 
raíz. 
Por lo anterior se han implementado sistemas en donde a la par de la 
aplicación de las plantas fitorremediadoras se agregan 
microorganismos que promueven el crecimiento vegetal y que de esta 
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manera minimizan el estrés al que es sometida la planta, facilitando 
su crecimiento y mejorando su capacidad de absorber y biodegradar 
los contaminante (Glick, 2010). 
A este tipo de tecnologías se le conoce como fitorremediación asistida 
y aún se están estudiando los efectos benéficos y la posible 
cooperación existente entre la planta y los microorganismos en el 
proceso de degradación de los contaminantes ya que se sabe que en 
condiciones de contaminación con hidrocarburos en concentraciones 
de baja toxicidad, el sistema rizosférico proporciona condiciones 
nutricionales y aireación favorables para el aumento de las 
poblaciones y la diversidad de la biota (Peréz, et al., 2002). 
4. Bacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal (BPCV) 
4.1. Descripción general 
Los microorganismos con efecto benéfico en la planta pueden tener 
un potencial considerable como agentes de biocontrol y 
biofertilizantes. Se distinguen tres grandes grupos: (a) 
microorganismos fijadores de nitrógeno, (b) hongos micorrízicos y (c) 
bacterias promotoras del crecimiento de plantas. Este último grupo de 
bacterias son conocidas como Rizobacterias promotoras del 
crecimiento vegetal (o PGPR por sus siglas en inglés Plant Growth-
Promoting Rhizobacteria) (Camarillo, 2006). 
Se llaman rizobacterias a aquellas bacterias que colonizan la raíz y su 
zona de influencia, para que esta colonización se lleve a cabo la 
bacteria debe ser atraída por quimiotaxis a la rizosfera por los 
exudados radicales y posteriormente se une a la superficie radical 
(Kloepper, 1994). 
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Las BPCV deben cumplir con 4 características intrínsecas (i) ser 
capaces de colonizar la raíz, (ii) ser capaces de sobrevivir y 
multiplicarse en el microhábitat asociado a la superficie de la raíz 
donde compite con la microbiota natural al menos hasta ejercer el su 
actividad promotora del crecimiento, (iii) ser capaces de estimular el 
crecimiento vegetal y (iv) ser inofensivas para la salud de las plantas 
y del hombre. (Kloepper, 1994; Jiménez et al., 2001; Xuliang et al., 
2007). 
4.2. Actividades promotoras del crecimiento vegetal. 
Las BPCV pueden afectar el crecimiento vegetal de forma directa o 
bien pueden actuar de forma indirecta evitando los efectos de algunos 
organismos fitopatógenos. 
Entre los mecanismos directos se pueden citar, la fijación de 
nitrógeno, la solubilización de minerales especialmente el fósforo y la 
producción de fitohormonas, estos mecanismos actúan estimulando el 
desarrollo de las raíces y mejorando la nutrición de las plantas, lo que 
repercute en un mayor crecimiento de las mismas y en un aumento 
en la producción de granos y frutos. 
Dentro de los métodos indirectos se encuentran la producción de 
antibióticos, la producción de metabolitos que actúan como 
antagonistas y la inducción de mecanismos de resistencia. La forma 
de actuar de estos mecanismos radica en que a través de ellos se 
suprime o inhibe el crecimiento de microorganismos perjudiciales para 
el desarrollo de la planta y actúan previniendo la acción de 
fitopatógenos (Jiménez, 2001). 
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La conjunción de ambos mecanismos de acción ha dado como 
resultado la promoción evidente del crecimiento en plantas (Mayak et 
al., 2004); se ha observado un incremento en la emergencia, el vigor 
y el peso de plántulas, un mayor desarrollo en sistemas radiculares y 
un incremento hasta de 30% en la producción de cultivos de interés 
comercial, tales como papa, rábano, jitomate, trigo y soya (Jiménez, 
2001). 
5. El género Azospirillum 
5.1. Características generales 
Azospirillum es el género más característico de las BPCV. Spirillum 
lipoferum fue descrito en 1925 por Beijerink, posteriormente los 
estudios de Peña-Cabriales y Döbereiner en 1973 dieron nuevos 
resultados que condujeron a su reclasificación en un género nuevo: 
Azospirillum (Caballero-Mellado, 2006). 
Actualmente son reconocidas 15 especies del género Azospirillum, las 
dos primeras en ser descritas fueron A. lipoferum y A. brasilense, 
siendo éstas las más estudiadas (Steenhoudt et al., 2000). 
Las bacterias del género Azospirillum tienen forma vibroide son de 
vida libre, Gram negativas, heterotróficas, fijadoras de nitrógeno, 
pertenecen a la subclase alfa de las proteobacterias, muestran un 
metabolismo versátil de carbono y nitrógeno lo que le permite 
establecerse en el complicado ambiente rizosférico. Éstas han sido 
aisladas de la rizosfera o del interior de la raíz de numerosas plantas 
como pastos y cereales alrededor del mundo, tanto en climas 
templados como en climas tropicales. Lascaracterísticas que sirven 
para la identificación rutinaria de Azospirillum son la forma vibroide, el 
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pleomorfismo y la movilidad en espiral. Es considerada una bacteria 
promotora del crecimiento vegetal, por el beneficio obtenido después 
de la inoculación de la bacteria, en una gran variedad de plantas 
forrajeras y otras de interés agronómico (Caballero-Mellado, 2006; 
Steenhoudt et al., 2000). 
Las condiciones adversas, como la desecación y la limitación de 
nutrimentos provocan que las células vibroides presenten un cambio 
morfológico y tomen la forma de quistes, conduciendo a la agregación 
celular y formando grumos visibles de gran tamaño. Las células 
contienen elevadas cantidades de poli-β-hidroxibutirato (PHB), hasta 
el 50% del peso seco celular y al microscopio se pueden observar en 
las células jóvenes como abundantes gránulos refringentes 
(Caballero-Mellado, 2006). La agregación y la formación de quistes 
mejoran la sobrevivencia de Azospirillum, situación en la que la 
acumulación de PHB juega un papel importante al servir como 
almacén de carbono y energía (Caballero-Mellado, 2006). 
Las bacterias pertenecientes al género Azospirillum son altamente 
móviles, A. brasilense, A. lipoferum y A. irakense muestran un patrón 
mixto de flagelación. Un flagelo polar es sintetizado durante el 
crecimiento en medios líquidos y es usado principalmente para el 
desplazamiento. La presencia de flagelos le da la movilidad necesaria 
para dirigirse hacia lugares donde la concentración de nutrimentos es 
más favorable (Steenhoudt et al., 2000) 
El género Azospirillum muestra una amplia distribución geográfica 
alrededor del mundo, aun cuando es más abundante en las regiones 
tropicales. El pH del suelo juega un papel importante para su 
establecimiento en el suelo (Camarillo, 2006). 
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Con la inoculación de Azospirillum se observa frecuentemente un 
mayor desarrollo del sistema radical, el cual se traduce en mayor 
superficie de absorción de nutrimentos así como en mayor desarrollo 
de la parte aérea de las plantas. También son descritos incrementos 
en el contenido de nitrógeno, fosforo, potasio y otros minerales en las 
plantas inoculadas, es por esto que se considera que la inoculación 
con Azospirillum, favorece el crecimiento de las plantas, mejora las 
cosechas y aumenta la concentración de nitrógeno en la planta 
(Steenhoudt et al., 2000). 
5.2. Aislamiento y crecimiento característico en medios de 
cultivo 
El aislamiento de las bacterias del género Azospirillum por lo general 
es muy fácil, ya sea a partir del suelo de la rizosfera o de la superficie 
de las raíces de numerosas plantas hospederas, el medio de cultivo 
usado por excelencia para el enriquecimiento del género Azospirillum 
ha sido el Nfb semigelificado libre de nitrógeno y con malato como 
fuente de carbono (Camarillo, 2006). Sin embargo en este medio de 
cultivo son aisladas predominantemente las especies de A. lipoferum 
y A. brasilense, con cambios en la composición y pH se puede obtener 
el aislamiento de otras especies. Estos medios son usados 
frecuentemente para evaluar la actividad reductora de acetileno, 
como indicativo de la fijación de nitrógeno. Tubos en los cuales se 
observa el crecimiento bacteriano en forma de sombrilla, la cual se 
transforma en una película blanca y densa abajo de la superficie del 
medio de cultivo y vire del indicador azul de bromotimol son 
considerados tentativamente como positivos para el aislamiento en 
cultivo puro de la bacteria. Otro de los medios de cultivo empleados 
usualmente en el laboratorio es un medio adicionado con colorante 
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rojo Congo, en el cual A. lipoferum y A. brasilense toman un color rojo 
escarlata que permite su diferenciación de otros géneros bacterianos 
(Caballero-Mellado, 2006; Camarillo, 2006 y Schoebitz, 2006). 
5.3. Interacción bacteria-planta 
La inoculación con Azospirillum modifica el sistema radical por un 
mecanismo o mecanismos aún no completamente establecidos; sin 
embargo, esto se atribuye al menos en parte, a la producción por las 
bacterias de sustancias que regulan el crecimiento vegetal, 
conduciendo a un incremento en el número de raíces laterales y pelos 
radicales, aumentando la superficie disponible para la absorción de 
nutrientes y el flujo de protones en la membrana de la raíz, lo que 
promueve la captación de agua y minerales. La inoculación con estas 
bacterias generalmente implica costos más bajos que el empleo de 
fertilización química además de generar un menor impacto ambiental 
(Aguilar et al., 2008) 
La adaptación de Azospirillum al ambiente rizosférico probablemente 
se inicia con la germinación de la semilla y la exudación de una gran 
cantidad de compuestos orgánicos, tales como azúcares, ácidos 
orgánicos, compuestos aromáticos, entre otros, estos compuestos 
producen una respuesta quimiotáctica demostrada en A. lipoferum y 
A. brasilense (Steenhoudt et al., 2000). 
La asociación de Azospirillum con las raíces de las plantas se 
desarrolla en dos etapas completamente independientes. (Figura 3.2) 
La primera consiste en una adsorción rápida, débil y reversible; la 
cual es dependiente de proteínas de superficie de membrana del tipo 
de las adhesinas en conjunto con la participación del flagelo polar. La 
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32 
 
segunda fase consiste de un anclaje lento pero firme e irreversible 
que alcanza su máximo nivel 16 h después de la inoculación, el cual 
parece ser dependiente de un polisacárido extracelular de 
Azospirillum, de apariencia fibrilar (Steenhoudt et al., 2000; 
Caballero-Mellado, 2006). 
 
 
 
 
 
 
 
5.4. Mecanismos promotores del crecimiento vegetal 
Varios son los mecanismos que se han sugerido como responsables 
del efecto estimulatorio observado en el crecimiento de las plantas 
inoculadas con Azospirillum, uno de los principales mecanismos 
estudiados a este respecto consiste en la fijación biológica de 
nitrógeno, esta bacteria es capaz de convertir nitrógeno atmosférico a 
amonio; sin embargo, se ha comprobado que las cantidades de 
amonio liberadas por Azospirillum no son considerablemente altas y 
por lo tanto pone en duda que este mecanismo sea el responsable 
principal de la promoción del crecimiento de la planta (Steenhoudt et 
al., 2000) 
Figura 3.2. Mecanismo de adhesión de Azospirillum a las raíces de las 
plantas (Steenhoud et al., 2000) 
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33 
 
Otro de los mecanismos que propone una alternativa diferente para la 
estimulación del crecimiento de las plantas está en la producción de 
sustancias reguladoras del crecimiento por las bacterias. Se han 
detectado tres tipos de sustancias en los cultivos de Azospirillum: 
auxinas, citocinas y giberelinas (Aguilar et al., 2008). 
La más importante fitohormona producida por Azospirillum es el Ácido 
Indolacético (AIA). La producción bacteriana de esta fitohormona es a 
lo que se le asumen los cambios detectados en la morfología de la raíz 
después de la inoculación con Azospirillum (Steenhoudt et al., 2000; 
Caballero-Mellado, 2006; Aguilar et al., 2008). 
No obstante, se descubrió que la bacteria es capaz de sintetizar 
biomoléculas que transmiten señales que atraviesan lapared celular 
de las plantas y al ser reconocidas por sus receptores inician una 
cadena de eventos que resulta en la alteración del metabolismo de la 
planta. Así mismo se ha demostrado que los nitritos sintetizados por 
Azospirillum inducen el aumento de la formación de las raíces 
laterales. Y se ha sugerido que el beneficio de la inoculación con 
Azospirillum es el resultado de los diversos mecanismos que efectúa 
la bacteria, los que actúan solos o simultáneamente a través del ciclo 
de vida de la planta, los que además son afectados por las 
condiciones ambientales (Camarillo 2006). 
 
 
 
 
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6. Actividad microbiológica del suelo 
El componente biológico es fundamental en numerosos procesos y 
funciones que son llevadas a cabo en los suelos, como pueden ser la 
descomposición de residuos orgánicos, el ciclo de nutrimentos, la 
síntesis de sustancias húmicas, la agregación y degradación de 
xenobióticos, y la fijación de nitrógeno por lo que el conocimiento de 
las comunidades microbianas, bien sea por métodos directos o 
indirectos adquiere una gran importancia para el estudio de la calidad 
del suelo. 
Por otro lado, las actividades enzimáticas, principalmente, se pueden 
emplear como medidas de la actividad microbiana, de la productividad 
del suelo y del efecto inhibitorio de contaminantes, y han demostrado 
responder al manejo del suelo (Nannipieri et al., 2002). 
La importancia que está adquiriendo la determinación de los 
parámetros bioquímicos y microbiológicos, tanto de las actividades 
enzimáticas, como de aquellas relacionadas con la masa microbiana, 
es cada vez mayor en los estudios avanzados de la ciencia del suelo. 
Esto se debe a que, dado que son esenciales para que el suelo realice 
sus funciones de manera correcta, su medida dará idea de la actividad 
metabólica del suelo y servirá de ayuda para entender la 
funcionalidad del mismo (García y Hernández, 2004). 
En el suelo la actividad metabólica es la responsable de procesos tan 
importantes como la mineralización y la humificación de la materia 
orgánica, los cuales incidirán a su vez sobre otra serie de procesos 
donde intervienen algunos elementos fundamentales (C, N, P, S). Es 
por esto que la actividad metabólica que presente un suelo se verá 
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                                            DE UN PROCESO DE FITORREMEDIACIÓN ASISTIDA 
   
 
35 
 
afectada en procesos en los que el suelo es contaminado, así como en 
aquellos casos en los que se lleve a cabo un proceso de 
descontaminación (García, 2003). 
La verdadera importancia de los microorganismos en cuanto a su 
relación con la calidad de un suelo, o con procesos de degradación o 
recuperación del mismo, no es tanto conocer los tipos de 
microorganismos que llevan a cabo funciones concretas, sino la 
actividad microbiana en ese determinado ambiente. Para ello, 
parámetros de tipo bioquímico pueden constituir un excelente punto 
de partida (García, 2003). El principal inconveniente de este tipo de 
medidas es la elevada variabilidad de los sistemas biológicos. En 
general se piensa que los indicadores de la calidad del suelo deben 
relacionarse con las principales funciones del ecosistema, como 
pueden ser el ciclo del carbono y del nitrógeno. 
Entre los indicadores biológicos más frecuentemente estudiados se 
encuentran los siguientes: 
- Indicadores bioquímicos y biológicos, 
- Abundancia de fauna en el suelo y 
- Estructura de la cadena alimenticia. 
Los indicadores bioquímicos de la calidad del suelo pueden dividirse 
en dos grupos, están aquellos que pueden ser considerados como 
“generales”, ya que su medida permite dar idea de los procesos 
microbianos que se producen en un suelo de manera global 
(determinación del C y N de la biomasa microbiana, mineralización del 
nitrógeno, determinación del ATP, respiración del suelo, o incluso 
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DE UN PROCESO DE FITORREMEDIACIÓN ASISTIDA 
   
 
 
36 
 
oxidorreductasas como la actividad deshidrogenasa y catalasa) (Paz, 
2005) 
Mientras que por el contrario, otros, como la mayoría de las 
actividades enzimáticas del tipo hidrolasas, actividades relacionadas 
con los ciclos de los elementos importantes que se dan en el suelo: 
carbohidrasas, β-glucosidasa y, β-galactosidasa del ciclo del C, 
fosfatasas del ciclo del P, ureasa y proteasas del ciclo del N, 
arilsulfatasa del ciclo del S; u otras actividades como la quitinasa, 
deben ser considerados como parámetros “específicos”, puesto que 
corresponden a reacciones concretas y dependen precisamente de 
sustratos específicos, y son hasta cierto punto independientes de la 
dinámica de población microbiana (Paz, 2005; García y Hernández, 
2004). 
Una de las mejores características que posee este tipo de parámetros 
es la capacidad para responder rápidamente a los cambios físicos y 
químicos que se den en el ambiente del suelo, es por esto que la 
medición de la actividad microbiológica y bioquímica son consideradas 
las mejores para evaluar la actividad del suelo. 
La determinación de una sola enzima no provee información confiable 
y precisa acerca de las propiedades del suelo, es por esto que se 
recomienda la medida simultánea de varias enzimas que ayuden a 
obtener resultados más significativos para estimar la actividad 
microbiológica total del suelo. Cecccanti et al. (1994) propone el uso 
de una oxidoreductasa (deshidrogenasa) y de una serie de hidrolasas 
(fosfatasa y β- glucosidasa) y de ésta manera evaluar los efectos de 
diferentes factores, como, la contaminación del suelo, el estrés 
hídrico, entre otros. 
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37 
 
Los resultados del estudio de este grupo enzimático se relacionan con 
algunas propiedades del suelo: nivel de fertilidad biológica, 
transformación metabólica de macrocompuestos en compuestos 
minerales simples y presencia de nutrimentos disponibles para la 
planta, entre otros (Paz, 2005). 
6.1. Actividad deshidrogenasa 
Las deshidrogenasas son un tipo de oxidorreductasas, que oxidan 
compuestos orgánicos debido a la transferencia de dos átomos de 
hidrógeno. Muchas deshidrogenasas transfieren los hidrógenos 
separados a una o dos de las siguientes coenzimas NAD y NADP. A 
través de esta coenzima el hidrógeno entra en la cadena respiratoria 
o participa en procesos biosintéticos de reducción (Paz, 2005). 
La actividad deshidrogenasa del suelo es el resultado de la actividad 
de diferentes deshidrogenasas, que son un importante componente 
del sistema enzimático de todos los microorganismos (enzimas del 
metabolismo respiratorio, ciclo del citrato y metabolismo del 
nitrógeno), por lo tanto, la actividad deshidrogenasa es un indicador 
de los sistemas redox biológicos y puede ser tomada como un 
indicador general de la intensidad del metabolismo microbiano en el 
suelo. 
La deshidrogenasa está considerada como uno de los mejores 
indicadores de actividad microbiana, debido a que su actividad solo se 
da en células vivas y no se acumula en los complejos del suelo. 
 
 
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DE UN PROCESO DE FITORREMEDIACIÓN ASISTIDA 
   
 
 
38 
 
6.2. Actividad fosfatasa 
El término fosfatasas se utiliza para designar, de modo genérico a un 
amplio grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de ésteres y 
anhídridos de ácido fosfórico, generalmente se clasifican de acuerdo al 
tipo de enlace y compuesto sobre el que actúan en: 
- Enzimas que actúan sobre enlaces tipo éster, que a su vez se 
subdividen en: monoésterfosfato hidrolasas, diésterfosfato 
hidrolasas y triesterfosfatohidrolasas, 
- Enzimas que actúan sobre anhídridos ácidos y en anhídridos 
que contengan fosfatos, 
- Enzimas que actúan sobre enlaces P-N y 
- Enzimas que actúan sobre enlaces C-N. 
De entre todos ellos se puede mencionar de manera especial a los 
monoésterfosfato hidrolasas. A éste grupo pertenecen la fosfatasa 
ácida y la fosfatasa alcalina, que son dos enzimas inespecíficas que 
catalizan la hidrólisis de glicerofosfatos y se diferencian por su pH 
óptimo de acción. Las enzimas fosfatasas son las encargadas de 
hidrolizar el fósforo que se encuentra de forma orgánica, hasta formas 
inorgánicas, haciéndolo de ésta manera asimilable para las plantas. 
 
 
 
 
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39 
 
6.3. Actividad β-glucosidasa 
Esta enzima, también conocida como gentiobiasa o celobiasa cataliza 
la hidrólisis de β-D-glucopiranosidos para liberar azucares (glucosa) 
por lo que interviene en el proceso final de la degradación de la 
celulosa y con frecuencia puede ser el paso limitante de este proceso. 
Su actividad indica el potencial del suelo para descomponer materia 
orgánica. La hidrólisis de los β-glucósidos es muy importante como 
fuente de energía para los microorganismos y las plantas. Esta 
actividad se encuentra generalmente ligada con el contenido de 
carbono orgánico en el suelo (Paz, 2005). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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40 
 
ESTRATEGIA DE TRABAJO 
 
 
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IV. Materiales y métodos 
1. Etapa preliminar. 
La etapa preliminar se realizó en base a lo descrito previamente por 
Hernández, 2010. 
Se trabajó con un suelo conformado artificialmente con la finalidad de 
reducir la variabilidad de los resultados. El suelo artificial fue 
conformado tomando en cuenta los resultados obtenidos de la 
caracterización de un suelo natural cuya probabilidad de incidencia a 
derrames de hidrocarburos fuera alta. 
Los métodos utilizados para la caracterización del suelo natural se 
describen en la Tabla 4.1. 
Tabla 4.1. Métodos para la caracterización del suelo 
Variables Descripción 
Fósforo aprovechable Procedimiento de Olsen 
Humedad Gravimétrico 
Materia orgánica Walkley y Black 
Nitrógeno Extracción por Micro-Kjeldahl 
pH Electrométrico 
Textura Bouyoucos 
Carbono Analizador elemental 
Densidad aparente Método de la probeta 
Densidad real Picnómetro 
Porosidad Densidades 
 
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DE UN PROCESO DE FITORREMEDIACIÓN ASISTIDA 
   
 
 
42 
 
El suelo conformado artificialmente se obtuvo utilizando las porciones 
según las propiedades del suelo natural que se obtuvieron por medio 
de la caracterización y que se muestran en la Tabla 4.2. La 
experimentación se realizó con un solo lote conteniendo la mezcla de 
arena, feldespato como limo y arcilla de tipo caolinita. Las tres 
fracciones fueron obtenidas comercialmente. La materia orgánica se 
adicionó en forma de materia orgánica de tipo comercial. Las 
propiedades del suelo artificial, obtenidas por medio de su 
caracterización se muestran en la Tabla 4.3 
Tabla 4.2. Propiedades del suelo natural 
Determinación Resultado suelo 
natural 
Fósforo aprovechable 2.0 mg·kg-1 
Humedad 18.63 % 
Materia orgánica 2.51 % 
Nitrógeno (NTK) 0.17 % 
pH 7.75 
porosidad 51.53 
Carbono 1.91 
Densidad aparente 1.46 g·cm-3 
Densidad real 2.60 g·cm-3 
Arena 44.09 % 
Arcilla 21.91 
Limo 28.00 % 
textura Franco arcillosa 
arenosa 
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43 
 
Tabla 4.3. Propiedades del suelo artificial 
Determinación Resultado 
suelo natural 
Fósforo 
aprovechable 
1.16 mg·kg-1 
Humedad 23.12 % 
Materia orgánica 2.54 % 
Nitrógeno (NTK) 0.12 % 
pH 7.60 
porosidad 30.38 
Carbono 1.96 
Densidad aparente 1.26 g·cm-3 
Densidad real 1.81 g·cm-3 
Arena 45.09 % 
Arcilla 27.91 
Limo 28.00 % 
textura Franco arcillosa 
arenosa 
1.1. Elección de semilla 
La semilla con la que se trabajó fue seleccionada con base en estudios 
anteriores realizados a base de bioensayos de acuerdo a Hernández, 
2010 y Carranza, 2010. Los bioensayos constaron de: porcentaje de 
germinación y pruebas de viabilidad con diesel. La semilla de elección 
fue “Ryegrass perene tetraploide” (Lolium perenne tetraploide). 
Los resultados obtenidos en el bioensayo de porcentaje de 
germinación se muestran en la Tabla 4.4. 
 
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44 
 
Tabla 4.4. Porcentaje de germinación 
Semilla Porcentaje de 
germinación 
(%) 
Desviación 
estándar 
Ryegrass perene 
tetraploide 
96.67 5.77 
Alfalfa española 90.00 10.00 
Trébol rojo 86.67 15.27 
Los resultados de CL50 y porcentaje de mortandad se tomaron de 
Hernández (2010), determinado que la CL50 de la semilla “Ryegrass 
perene tetraploide” es de 15 007.50 mg·kg-1. 
1.2. Elección de cepa 
Ésta elección se realizó evaluando tres cepas específicas de 
Azospirillum lipoferum, identificadas como: AZm1, AZm3 y AZm5, que 
se obtuvieron del Laboratorio de Microbiología Experimental. Para la 
determinación se realizaron cuentas de UFC por mL y UFC por semilla, 
utilizando el método de Miles y Misra, utilizando como criterio de 
aceptación aquella cepa que tuviera la mayor adhesión a la superficie 
de la semilla. La metodología empleada para ambas cuantificaciones 
se detalla en el Anexo A. 
2. Contaminación del suelo. 
El suelo artificial fue secado, molido y posteriormente tamizado, se 
mezcló con agrolita en un porcentaje de 1.5% m/m para dar 
estructura y se contaminó con diesel a una concentración aproximada 
de 20000 mg·kg-1 agregando por aspersión 280 mL de diesel y 
moviendo cada día durante 15 días, para lograr una concentración 
uniforme y estable. 
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45 
 
3. Preparación de las unidades experimentales 
Se preparó un total de 124 unidades experimentales las que 
consistieron de vasos de vidrio de tipo comercial de 125 mL, que 
fueron previamente lavados con agua acidulada (HNO3) y enjuagados 
con agua destilada. En la Tabla 4.2, se muestra la descripción de cada 
una de las unidades experimentales. 
Tabla 4.2. Descripción de las unidades experimentales 
 
 NOMBRE DESCRIPCIÓN 
TESTIGOS SUELO Para determinar la presencia de 
factores que pudieran alterar los 
resultado con respecto a los 
tratamientos 
S= suelo 
B= Azospirillum lipoferum 
P= Rye Grass 
F= adición de fuentes de N y P 
S+B 
S+P 
S+P+B 
S+P+B+F 
CONTROLES S+D Atenuación natural ATN 
S+B+D ATN+B 
TRATAMIENTOS S+P+D Tratamiento fitorremediación 
convencional FTRC 
S+P+B+D Tratamiento fitorremediación 
asistida con A. lipoferum FTRAs 
S+P+B+F+D Tratamiento fitorremediación 
asistida con A. lipoferum y fuentes 
de nitrógeno y fósforo en forma de 
urea y fosfato diamónico 
FTRAs+BEs 
 
A cada unidad experimental se les colocó 150 g de suelo conformado, 
contaminado o sin contaminar según fuera el caso. El procedimiento 
detallado para la elaboración de cada unidad experimental se 
encuentra en el Anexo A. 
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46 
 
Una vez preparada las 124 unidades experimentales se cubrieron con 
bolsas negras para evitar la entrada de luz durante la etapa de 
germinacióny se colocaron en el cuarto de incubación a 30 °C. Se 
regaron cada tercer día con un volumen de 10 mL de agua del grifo y 
una vez que las semillas germinaron (aproximadamente al tercer día) 
se sacaron del cuarto de incubación y se colocaron en un cuarto cerca 
de un ventanal por donde penetraba la luz del sol y que tenía una 
temperatura promedio de 25 °C por 60 días. 
4. Monitoreo de las unidades experimentales 
Las unidades experimentales fueron evaluadas cada 10 días a partir 
del día 0, para cada evaluación se tomó un lote que consistía en 3 
unidades de cada uno de los diferentes sistemas como se muestra en 
la Figura 4.1. 
Figura 4.1. Relación de las unidades experimentales usadas en el 
proyecto 
 
 
SUELO 
 
S+B+P 
S +P+D 
S+B+D 
 
S+P 
 
S + B 
 
S +D 
 
S+B+P+F+D 
 
S+B+P+F 
S+P+B+D 
1 BLOQUE POR CADA 10 DÍAS DE MONITOREO 
CADA MUESTRA POR 
TRIPLICADO 
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47 
 
4.1. Determinación de la concentración de hidrocarburos en 
suelo. 
La concentración de diesel en suelo fue determinada a través de un 
método gravimétrico propuesto por Villalobos et al. (2008). El 
procedimiento completo para la realización de ésta técnica se 
encuentra en el Anexo A. 
4.2. Determinación de la concentración de fósforo en suelo 
Este procedimiento se realizó por el método de determinación de 
fósforo soluble en bicarbonato de sodio (extracción de acuerdo con 
Olsen et al.) usando ácido ascórbico como agente reductor (PRESOP 
MET-021). Esta determinación se basa en la extracción de fósforo de 
una muestra utilizando una solución de bicarbonato de sodio; el 
fósforo en el extracto se determina colorimétricamente con molibdato 
de amonio y ácido ascórbico como agente reductor (Anexo A). 
4.3. Determinación de la concentración de nitrógeno en suelo 
La determinación de la concentración de nitrógeno en suelo se llevó a 
cabo por el método de Kjeldahl; el cual consta de tres pasos: 
digestión, destilación y titulación del amonio liberado. El 
procedimiento detallado se encuentra en el Anexo A 
4.4. Determinación de los parámetros bioquímicos en suelo 
4.4.1. Fosfatasa 
La actividad fosfatasa se determinó usando p- nitrofenilfosfato de 
sodio como substrato (Tabatai y Bremner, 1969). 
 
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48 
 
4.4.2. Deshidrogenasa 
La actividad deshidrogenasa se determinó por reducción de 
clorhidrato de 2-p-iodo-3-nitrofenil-5-fenil-tetrazolium a 
iodonitrofenilformazan (García et al., 1987). 
4.4.3. β-glucosidasa 
La actividad β-glucosidasa fue determinada usando p-nitrofenil-β-D- 
glucopiranosida como substrato (Masciandro et al., 1994). 
Los procedimientos detallados para la determinación de las tres 
actividades enzimáticas antes mencionadas se encuentran en el 
Anexo A. 
4.5. Número de microorganismos en suelo. 
La determinación del número de microorganismos en suelo fue 
realizado mediante el método de la gota o de Miles y Misra, este 
método se refiere al número de células viables capaces de crecer en 
un medio de cultivo sólido. Se reporta el número de unidades 
formadoras de colonias por gramo de suelo (UFC·g-1). La técnica 
completa se describe en el Anexo A. 
 
 
 
 
 
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49 
 
V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
5.1. Selección de cepa 
Como se mencionó anteriormente se contaban con tres cepas de A. 
lipoferum con ellas se realizaron conteos por mililitro y por semilla. 
Los resultados para la cuenta de UFC por mililitro (UFC mL-1) se 
muestran en la Figura 5.1, en donde se observa que la cepa con 
mayor abundancia es la cepa AZm5. 
 
 
Después de obtener la cuenta de bacterias por mililitro, se obtuvo el 
número de UFC adsorbidas por semilla, los resultados se muestran en 
la Figura 5.2. 
Figura 5.1. Cuenta de UFC de A. lipoferum por mililitro 
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50 
 
 
Figura 5.2. Cuenta de UFC de A. lipoferum por semilla 
La cepa de A. lipoferum que presentó una mayor fijación a la 
superficie de la semilla fue AZm1, siendo considerablemente mayores 
los resultados obtenidos en comparación con las otras dos semillas. 
Aunque en los resultados de UFC por mililitro los valores obtenidos 
para AZm1 son bajos, el objetivo de éste proyecto de tesis es el 
efecto benéfico que las BPCV produce en la planta por la presencia de 
Azospirillum en el área cercana a la raíz es por esto que se decidió 
trabajar con AZm1. 
 
 
 
 
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51 
 
5.2. Monitoreo de unidades experimentales 
Las unidades experimentales montadas (Figura 5.3), se les dio 
seguimiento a los días 0, 10, 20, 30, 40 y 60, del estudio, esto se 
realizó con la finalidad de observar la efectividad de los tres 
tratamientos que se llevaron a cabo: fitorremediación convencional 
(FTRC), fitorremediación asistida con Azospirillum lipoferum (FTRAs) y 
fitorremediación asistida con bioestimulación (FTRAs+BEs), además 
se monitorearon dos controles que fueron la atenuación natural (ATN) 
y la atenuación natural con bacteria (ATN+B). 
 
 
5.3. Concentración de hidrocarburos en suelo 
Se realizó el monitoreo de la concentración de hidrocarburos totales 
de petróleo (HTP) en suelo a los días 0, 10, 20, 30, 40 y 60 de 
tratamiento. Los resultados se muestran en la Figura 5.4. La tabla con 
los valores de todos los tratamientos y los controles se encuentran en 
el Anexo B. 
Figura 5.4. Algunas unidades experimentales que se 
montaron durante el proyecto 
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52 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura. 5.4. Concentración de HTP vs. Tiempo 
En la Figura 5.5, se muestran los resultados en la gráfica de la 
concentración de hidrocarburos totales de petróleo (HTP) expresados 
en mg.kg-1 de suelo de acuerdo a los diferentes tratamientos. La 
concentración inicial de todos los sistemas es de 18 706 mg·kg -1 de 
suelo; al final del tratamiento los valores más bajos de concentración 
de HTP se obtienen con el sistema de fitorremediación asistida más 
bioestimulación, que alcanzó valores de concentración de 
4615mg•kg1, seguido por la fitorremediación asistida, cuyo valor es 
de 5 260 mg•kg -1. 
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53 
 
Una forma complementaria de observar los resultados con respecto a 
la concentración de hidrocarburos en el suelo es el porcentaje de 
remoción [(C0 – Cf) x 100 / C0]. En la figura 5.5, se muestran los 
valores de porcentaje de remoción con respecto al tiempo de cada 
uno de los diferentes tratamientos. 
 
Como se puede observar los sistemas de fitorremediación asistida y 
de fitorremediación asistida más bioestimulación presentan los 
mayores porcentajes de remoción con respecto a los otros sistemas, 
alcanzando niveles de remoción cercanos al 75%, en contraste con el 
porcentaje alcanzado por el sistema de atenuación natural que no 
supera los valores de 45%. 
Sin embargo, es importante recalcar que los porcentajes de remoción 
que se alcanzan en el sistema de FTRAs+BEs al día 20 son cercanos al 
Figura 5.5. Porcentaje de remoción vs. tiempo 
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