Logo Studenta

Aislamiento-e-identificacion-de-Acanthamoeba-spp-en-lentes-de-contacto-de-usuarios-del-servicio-de-oftalmologa-del-Hospital-General-de-Mexico

Vista previa del material en texto

“AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Acanthamoeba spp. EN LENTES DE 
CONTACTO DE USUARIOS DEL SERVICIO DE OFTALMOLOGIA DEL HOSPITAL 
GENERAL DE MÉXICO” 
 
T E S I S 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO 
PRESENTA: 
JOSÉ LUIS PALACIOS SÁNCHEZ 
 
 
 
ASESORES: 
Dr. VICTOR MANUEL ZENDEJAS BUITRÓN 
Dr. JOSÉ LUIS TAPIA MALAGÓN 
Dr. LETICIA VAZQUEZ MAYA 
 
 CUAUTITLAN IZCALLI ESTADO DE MÉXICO; 2010 
UNIVERSIDAD NACIONAL 
AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES 
CUAUTITLAN 
 
 
Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán 
 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
II 
 
 PÁGINA 
INDICE GENERAL. II 
ABREVIATURAS. IV 
INDICE DE TABLAS. VI 
INDICE DE FIGURAS. VII 
RESUMEN. IX 
1 Introducción. 1 
1.1 Generalidades de las amebas de vida libre. 1 
1.2 Clasificación de Acanthamoeba. 2 
1.3 Morfología y ciclo biológico de Acanthamoeba. 6 
1.4 Patologías causadas por Acanthamoeba. 9 
1.5 Mecanismos de patogenicidad. 12 
1.6 Inmunología en las infecciones por Acanthamoeba. 13 
1.7 Diagnóstico de las infecciones por Acanthamoeba. 14 
1.8 Tratamiento de las infecciones por Acanthamoeba. 17 
 
2.0 Justificación. 
21 
 
3.0 Hipótesis. 
 
21 
4.0 Objetivos. 22 
4.1 Objetivo general. 22 
4.2 Objetivos específicos. 22 
5. Metodología 
5.1 Obtención de la muestra. 
5.2 Cultivo de la muestra. 
5.3 Examen de los cultivos. 
5.4 Interpretación de los resultados. 
5.5 Tinciones y morfología quística. 
5.6 Cuantificación de proteínas. 
5.7 Esquema de inoculación. 
5.8 Toma de muestra. 
5.9 Realización de ELISA. 
5.10 Obtención de suero con Ac 
23 
24 
24 
24 
25 
25 
28 
30 
31 
32 
33 
34 5.11 Inmunofluorescencia. 
 
6. Resultados 
 
37 
III 
 
 
7. Discusión 50 
8. Conclusiones 56 
9. Referencias 57 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
IV 
 
ABREVIATURAS 
 
A Acanthamoeba 
Å Símbolo de Ångström, unidad de longitud empleada principalmente 
para expresar longitudes de onda. 
AC Acanthamoeba castellani 
Ac Anticuerpo 
ACF Adyuvante completo de Freund 
Ag Antígeno 
AIF Adyuvante incompleto de Freund 
ANN Agar no nutritivo 
ATCC American Tipe Culture Collection 
AVL Amibas de vida libre 
°C Grados Celsius 
DNA Acido desoxirribonucleico 
DO Densidad óptica 
E. Escherichia 
EAG Encefalitis amibiana granulomatosa 
EAP Encefalitis amibiana primaria 
G Gravedades. 
H2SO4 Acido sulfúrico 
H-E Hematoxilina-Eosina 
IFI Inmunofluorescencia indirecta 
kDa Kilodaltons. 
LASEK Queratomileusis subepitelial asistida por laser; del ingles Laser 
Assisted Subepithelial Keratomileusis 
LCR Liquido cefalorraquídeo 
mL Mililitros 
m Micrómetros 
N. Naegleria 
Nf Naegleria fowleri 
nm Nanómetros 
http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%85ngstr%C3%B6m
V 
 
PAS Acido peryódico de Schiff 
PBS Solución salina buffer de fosfatos 
PCR Reacción en cadena de la polimerasa 
pH Potencial de hidrógeno 
PHMB Poliheximetilbiguanida 
QA Queratitis amibiana 
rRNA Acido ribonucleico ribosomal 
SIDA Síndrome de inmunodeficiencia adquirida 
SNC Sistema nervioso central 
 Spp. Especie no especificada 
Tx Tipo número x (puede ser del 1 al 12). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
VI 
 
ÍNDICE DE TABLAS. 
 
N° de tabla Título de la tabla Pagina 
Tabla 1 Curva patrón para la cuantificación de proteínas por el método de 
Bradford. 
28 
Tabla 2 Cuantificación de proteínas en sueros de donadores infectados con 
Acanthamoeba castellani y Naegleria fowleri respectivamente. 
29 
Tabla 3 Esquema de inoculación para Acanthamoeba castellani. 30 
Tabla 4 Esquema de inoculación para Naegleria fowleri. 31 
Tabla 5 Resultados obtenidos mediante observación microscópica del cultivo 
de los lentes de contacto en medio de Page. 
39 
Tabla 6 Morfología de quistes de las muestras positivas. 41 
Tabla 7 Densidad óptica de Ac anti- Acanthamoeba castellani en suero de 
conejo. 
44 
Tabla 8 Densidad óptica de Ac anti-Naegleria fowleri en suero de conejo. 45 
Tabla 9 Concentración de anticuerpos anti-Acanthamoeba castellani obtenida 
mediante el ensayo de ELISA. 
46 
Tabla 10 Concentración de anticuerpos anti-Naegleria fowleri obtenida 
mediante el ensayo de ELISA. 
47 
 
 
 
 
 
 
 
VII 
 
ÍNDICE DE FIGURAS. 
 
N° de figura Título de figura Pagina 
Figura 1 Árbol filogenético de Acanthamoeba, Naegleria y Balamuthia. 2 
Figura 2 Aislados de las distintas especies de Acanthamoeba incluyendo su 
designación ATCC, secuencia, tipo y lugar donde fue aislada. 
3 
Figura 3 Trofozoíto de Acanthamoeba. 7 
Figura 4 Quiste de Acanthamoeba 9 
Figura 5 Queratitis Amebiana causada por Acanthamoeba 10 
Figura 6 Diagrama de flujo de la metodología realizada. 23 
Figura 7 Trofozoíto de Acanthamoeba en medio de Page. 37 
Figura 8 Trofozoítos de Acanthamoeba en medio de Page. 37 
Figura 9 Quiste de Acanthamoeba en medio de Page. 38 
Figura 10 Quistes de Acanthamoeba en medio de Page. 38 
Figura 11 Trofozoíto de Acanthamoeba en proceso de enquistamiento. 40 
Figura 12 Frotis en fresco de Acanthamoeba spp. 40 
Figura 13 Tinción de Giemsa para trofozoítos de Acanthamoeba. 42 
Figura 14 Tinción de Giemsa para las muestras 33, 43, 44 y 15; A, B, C y D 
respectivamente. 
42 
Figura 15 Tinción de calcoflúor aplicada a quistes de Acanthamoeba spp de las 
muestras positivas. 
43 
Figura 16 Gráfica para la obtención de concentración de proteínas de Ac anti-
Acanthamoeba castellani en suero de conejo. 
44 
Figura 17 Gráfica para la obtención de concentración de proteínas de Ac anti-
Naegleria fowleri en suero de conejo. 
45 
VIII 
 
Figura 18 Gráfica para la obtención de la concentración de anticuerpos anti-
Acanthamoeba castellani mediante el ensayo de ELISA. 
46 
Figura 19 Gráfica para la obtención de la concentración de anticuerpos anti-
Naegleria fowleri mediante el ensayo de ELISA. 
47 
Figura 20 Inmunofluorescencia indirecta aplicada a trofozoítos de Acanthamoeba 48 
Figura 21 Inmunofluorescencia indirecta aplicada a trofozoítos de Naegleria. 48 
Figura 22 Inmunofluorescencia cruzada realizada para comprobar la presencia de 
Acanthamoeba spp. en las muestras positivas. 
49 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
IX 
 
RESUMEN. 
 Acanthamoeba spp, es un protozoario anfizoico perteneciente al grupo de las amebas 
de vida libre. Dicho protozoario cobra importancia médica debido a que bajo ciertas 
condiciones es causante de una enfermedad de tipo invalidante conocida como queratitis 
amebiana. La Queratitis Amebiana es una patología que afecta principalmente a los usuarios 
de lentes de contacto del tipo blando. Factores como la poca higiene de los lentes o el uso de 
soluciones salinas de conservación y limpieza caseras, favorecen la proliferación de la ameba y 
por lo tanto promueven la enfermedad. 
 
El número creciente de usuarios de lentes de contacto ha hecho indispensable contar 
con herramientas suficientes para un diagnóstico temprano, pero sobre todo para la 
prevención de la enfermedad. 
 
 Con la finalidad de conocer el porcentaje de usuarios de lentes de contacto portadores 
de la ameba, así como evaluar la utilidad de pruebas diagnósticas comolas tinciones de 
Giemsa y calcoflúor y las pruebas de ELISA e IFI se aislaron muestras de 100 pacientes del 
servicio de oftalmología del Hospital General de México. 
 
 El porcentaje de muestras positivas para Acanthamoeba spp. fue del 11%. Además se 
determino que la observación microscópica y la realización de las tinciones de Giemsa y 
calcoflúor son útiles como pruebas de diagnóstico presuntivo, las cuales pueden ser realizadas 
de manera rutinaria en la mayoría de los hospitales. Por otra parte ELISA e IFI nos son útiles 
como pruebas secundarias y confirmatorias de la enfermedad. A la par de estos resultados se 
recomienda el aseo rutinario de los lentes de contacto y no utilizar soluciones salinas de 
fabricación casera como principales métodos de prevención de la enfermedad. 
1 
 
1. INTRODUCCIÓN. 
1.1 Generalidades de las Amebas de Vida Libre. 
 Los protozoarios de los géneros Naegleria, Balamuthia, Acanthamoeba y Sapinnea; 
conforman un grupo denominado “Amibas de vida libre” (AVL), debido a su capacidad de 
permanecer en la naturaleza sin la necesidad de un hospedero intermediario para su 
supervivencia, transmisión o diseminación (32). 
 Las AVL son organismos cosmopolitas, que están ampliamente distribuidas en la 
naturaleza ya que se han logrado aislar de distintas muestras; tanto de agua, como de suelo 
en todo el mundo (4). Se ha logrado aislar Acanthamoeba de diversos tipos de muestras de 
suelo, polvo, aguas residuales, agua embotellada, agua de mar, agua tratada, agua de grifo, 
agua de escusados, agua de lavaojos, albercas, equipos de diálisis, aire, unidades de aire 
acondicionado, unidades dentales, tierra de plantas de ornato y a su vez de distintos tipos de 
plantas, soluciones de mantenimiento de lentes de contacto y de los mismos lentes de 
contacto, en especial los del tipo blando; además de que muchas veces son contaminantes de 
diversos cultivos celulares. También se ha logrado aislar Acanthamoeba del ser humano en 
pacientes de todo el mundo de órganos como el cerebro, cerebelo, pulmones, córnea, 
lesiones cutáneas y fosas nasales, tanto en personas aparentemente sanas como en personas 
con alguna patología. Además también se ha aislado de otros mamíferos como jabalíes, peces, 
anfibios y reptiles (13, 26, 31, 37). 
 Dichos protozoarios cobran importancia médica, debido a que a condiciones aún 
desconocidas pueden comportarse como endoparásitos, tanto del ser humano como de otros 
mamíferos, por lo cual también son conocidos como organismos anfizóicos (32). 
 
 
 
2 
 
1.2 Clasificación de Acanthamoeba. 
Acanthamoeba fue descrita por primera vez por Castellani cuando reportó la presencia 
de una amiba en cultivos de Cryptococcus pararoseous; posteriormente el género fue 
establecido por Volkonski en 1931 (13). 
 El género Acanthamoeba, se encuentra ubicado dentro del Reino Protista, Filo 
Amoebozoa; clase Lobosea, subclase Gymnamoebia orden Acanthopodia; Familia 
Acanthamoebidae; Género Acanthamoeba (9). Un segundo género, Balamuthia 
anteriormente ubicado en otra familia de amibas con las cuales tenía ciertas afinidades 
recientemente también ha sido ubicado en esta familia, ya que ambos géneros poseen la 
capacidad de causar la misma enfermedad (EAG) (1, 5). 
 
 
Figura 1: Árbol filogenético de Acanthamoeba, Naegleria y Balamuthia. 
 
3 
 
 Las especies de este género son A. astronyxis*,A. castellanii*, A. commandoni, A. 
culbertsoni*, A. divionensis, A. echinulata A. griffini, A. hatchetti*, A. healyi, A. jacobsi, A. 
lenticulata, A. lugdunensis*, A. mauritaniensis, A. palestinensis*, A. pearcei, A. polyphaga*, A. 
pustulosa, A. quina*, A. rhysodes*, A. royreba, A. stivensoni, A. terrícola, A. triangularis y A. 
tubiashi; de las cuales las que se encuentran marcadas con asterisco son consideradas 
patógenas para el ser humano (13). 
 
ESPECIE TIPO DE CEPA CLASIFICACION GRUPO LUGAR DE DONDE SE AISLO 
A. astronixis 30137 T7 I Agua 
A. castellanii 30011 T4 II Cultivo de levaduras 
A. commandoni 30135 T9 I Jardín 
A.culbertsoni 30171 T10 III Cultivo celular de riñón de mono 
A. divionensis 50238 ____ II Tierra 
A. echinulata 50239 ____ I Composta 
A. griffini 30731 T3 II Muestra de agua de mar 
A. hatchetti 30730 T11 II Sedimento 
A. healyi CDC:1283:V013 T12 III Tejido cerebral 
A. jacobsi 30732 ____ III Sedimento marino 
A. lenticulata 30841 T5 III Agua de alberca 
A. lugdunensis 50240 T4 II Alberca 
A. mauritaniensis 50253 T4 II Alcantarilla 
A. palestinensis 30870 T2 IIII Suelo 
A. pearcei 50435 T3 I Aguas residuales 
A. poliphaga CCAP1501/3ª T4 II Estanque 
A. pustulosa 50252 T2 III Piscina 
A quina 50241 ____ II Agua de alberca 
A. rhysodes 30973 T4 II Suelo 
A. royreba 30884 T4 III Células humanas con carcinomas 
A. stivensoni 50438 T11 II Mariscos 
A. triangularis 50254 T4 II Heces humanas 
A. tubiashi 30867 T8 I Agua de río 
 
Figura 2: Aislados de las distintas especies de Acanthamoeba incluyendo su designación ATCC, secuencia, tipo y 
lugar donde fue aislada [modificados de (13)]. 
 
4 
 
La identificación de Acanthamoeba como género es relativamente sencilla, debido a 
que es la única AVL que posee pequeños lobopodos o proyecciones citoplasmáticas llamadas 
acantopodios cuando esta en fase de trofozoíto. Sin embargo, usando criterios morfológicos 
para la diferenciación y clasificación de especies se presentan muchos problemas (5). 
 Acanthamoeba spp ha sido dividido en tres grupos morfológicos (I, II y III) basados en 
el tamaño y forma del quiste (15, 32). 
 Las especies del grupo uno fueron designadas teniendo en cuenta el mayor tamaño del 
quiste en comparación con las especies de los otros dos grupos. Las especies del grupo II 
fueron clasificadas con base en que poseen una capa externa arrugada llamada exoquiste y 
una capa interna llamada endoquiste la cual puede ser triangular, estrellada, oval o poligonal. 
Las especies del grupo III son aquellas que poseen un exoquiste delgado y liso alrededor del 
endoquiste que es redondo (1, 9, 15). 
 No obstante, la clasificación de Acanthamoeba basada en las características 
morfológicas del quiste no nos proporciona datos confiables, ya que dicha morfología cambia 
según las condiciones del cultivo en el que se encuentren (30, 31). 
 Se han aplicado criterios inmunológicos, bioquímicos y fisiológicos para la 
identificación de las distintas especies de Acanthamoeba, sin embargo se ha observado que 
muchas especies comparten los mismos determinantes antigénicos. Por consiguiente las 
aproximaciones inmunológicas obtenidas por inmunoelectrotransferencia e 
inmunofluorescencia han sido inconclusas y de poca utilidad para la identificación de especies 
(10, 13). Los ensayos enzimáticos por electroforesis, muy útiles en otros organismos, 
muestran mucha variación entre las cepas de mismas especies y similitudes entre cepas de 
diferentes especies, incluso se ha demostrado que los tipos enzimáticos cambian cuando los 
aislados se cultivan en diferentes condiciones de laboratorio (15, 31). 
 
5 
 
Es por eso, que con el fin de establecer un esquema de clasificación más claro, se han 
llevado acabo diversos estudios moleculares, desarrollando esquemas de clasificación basados 
en la secuencia de los genes nucleares de rRNA, logrando así obtener 4 tipos o subgéneros 
(14, 34). 
En 1998, Stothard y colaboradores utilizaron dichos estudios moleculares para 
clasificar 53 aislados de Acanthamoeba los cuales fueron agrupados en 12 tipos, basados en la 
secuencia de rDNA y designándolos desde T1 hasta T12 teniendo en cuenta que secuencias 
distintas pueden existir y por lo tanto ser más de 12 (13, 14, 32). 
Una vez que se tuvieron los 12 tipos, se realizó un acoplamiento de estos con los 
esquemas morfológicos propuestos por Pussard y Pons de cada uno de los aislados, logrando 
así obtener un cierto grado de concordancia y obteniendo 3 grupos (13). 
En el grupo I fueroncolocadas las secuencias de tipo T7, T8 y T9; en el grupo II los 
tipos T3, T4 y T11; en el grupo III los tipos T1, T2, T5, T6, T10 y T12. Los estudios realizados de 
aislados de casos clínicos de QA que fueron identificados mediante su secuencia de rRNA, 
revelan que la mayoría de las cepas causantes de esta enfermedad pertenecen a T4 y por lo 
tanto al grupo II (18, 31). 
Posteriormente, Chung extrajo DNA genómico, y lo amplificó mediante reacción en 
cadena de la polimerasa (PCR). Los resultados obtenidos coinciden con los esquemas de 
clasificación morfológica propuestos por Pussard y Pons y con la clasificación realizada por 
Stothard; obteniendo por lo tanto la clasificación de especies de Acanthamoeba más aceptada 
hasta la fecha, aunque cabe mencionar que la clasificación taxonómica de Acanthamoeba está 
en constante cambio (10, 15, 18, 29). 
 
 
 
6 
 
1.3 Ciclo biológico y morfología. 
Acanthamoeba es una amiba que presenta dos estadios dentro de su ciclo biológico, la 
fase de quiste y la de trofozoíto (4). 
 El trofozoíto es la fase móvil de la amiba, tiene un tamaño promedio de 20 a 45 m; 
presenta proyecciones finas llamadas acantopodios (que dan nombre al género) las cuales no 
presentan los otros géneros de AVL. Dichas proyecciones se encuentran por toda la superficie 
de la amiba, miden entre 1 y 2 m y están constituidas por citoplasma hialino que excluye a 
los organelos, solo presentan partículas de glucógeno, algunos ribosomas libres y vesículas 
pequeñas (16, 31). 
Para desplazarse, Acanthamoeba presenta proyecciones hialinas llamadas 
pseudópodos o lobopodos, los cuales son de gran tamaño y pueden presentarse en cualquier 
dirección (6). El desplazamiento es lento en comparación con el resto de las AVL (32). 
 Si se observa el trofozoíto en un microscopio electrónico, se puede distinguir una 
membrana plasmática con disposición trilaminar de 70 a 90 Å de espesor, además de que es 
asimétrica; la lámina externa es ligeramente más gruesa que la interna. Contiene todos los 
organélos característicos de los eucariontes; presenta un aparato de Golgi conformado por 2 o 
más grupos de cisternas localizadas en las regiones polares. Dicho aparato, está íntimamente 
relacionado con el núcleo el cual es de forma circular y con un diámetro de 7 a 10 m, 
además de que éste contiene un nucléolo central con un diámetro de 2 a 4 m. El retículo 
endoplásmico rugoso rodea al núcleo. El retículo endoplásmico liso es escaso y consta 
básicamente de vesículas. La mayoría de los ribosomas se encuentran libres en el citoplasma, 
junto con los gránulos de glucógeno. La reproducción ocurre mediante fisión binaria. Las 
mitocondrias son de diferentes tamaños, ya sean esféricas, ovaladas, en forma de copa o de 
campana (13, 32). 
 
7 
 
 Generalmente todas las especies de Acanthamoeba contienen un solo núcleo, aunque 
puede haber amibas multinucleadas cuando Acanthamoeba es mantenida en un cultivo en 
suspensión (13). Acanthamoeba presenta vacuolas contráctiles las cuales regulan la presión 
osmótica y descargan su contenido en periodos cortos, además también tiene vacuolas 
digestivas fácilmente observables en un microscopio de luz (11). 
El trofozoíto se nutre básicamente de bacterias que se encuentran en el ecosistema 
que habitan, aunque también se pueden alimentar de pequeñas algas y levaduras (4, 31). La 
forma en que se alimenta la amiba, consiste en la formación de pseudópodos alrededor de la 
materia, para después alimentarse mediante el proceso de fagocitosis; o bien mediante la 
formación de copas fagocíticas y la ingestión de la materia en particular. Dichas copas 
fagocíticas formadas en la superficie de la amiba son estructuras temporales que desaparecen 
una vez que han cumplido con su misión de ingerir bacterias, algas, levaduras o células (4, 11). 
 
Figura 3. Trofozoíto de Acanthamoeba( donde A nos indica el núcleo; 
B nos muestra un acantopodio característico del género y C= vacuola 
contráctil). 
 
 
La etapa quística es la fase inactiva de la amiba y es la base inicial para la 
caracterización del género Acanthamoeba. Su tamaño varía de 11 a 20 m según la especie 
(7). 
A 
C 
B 
8 
 
La formación del quiste va precedida de cambios morfológicos y funcionales de los 
organélos citoplasmáticos del trofozoíto (13). La pared del quiste contiene celulosa, lo cual le 
confiere parte de su resistencia (33). Al microscopio electrónico se ha podido observar que 
durante el proceso de enquistamiento el trofozoíto se redondea, el retículo endoplásmico se 
alarga y se organiza en círculos concéntricos que rodea a las mitocondrias y al núcleo, 
además; aumenta el número de vacuolas lipídicas y se distribuyen de manera individual o en 
agregados (13, 32). 
El quiste está conformado por una pared doble, la pared externa es conocida como 
exoquiste; es generalmente redondeada y arrugada, mientras que el endoquiste muestra una 
disposición triangular, poligonal o estrellada. Las dos paredes parecen estar separadas entre sí 
a lo largo del perímetro celular por una zona fibrilar, y solo se unen en ciertas zonas angulares 
del endoquiste. En esas zonas de contacto, se forman poros con bordes circulares llamados 
opérculos (31, 33). 
La formación del quiste ocurre cuando las condiciones del medio son adversas; falta de 
alimento, cambios de temperatura, cambios de pH o desecación, ya que los quistes son 
capaces de resistir dichas condiciones adversas, además incluso pueden tolerar cloración del 
agua y un amplio espectro de agentes antimicrobianos, pueden resistir temperaturas de 0°C 
siendo que la temperatura óptima para su crecimiento es de 36 °C (7). 
Villemez y colaboradores han reportado que un anticuerpo específico a una proteína 
de la membrana está relacionado con el proceso de enquistamiento (31). A su vez Mazur 
demostró que el quiste mantiene viable a la amiba durante 24 años al almacenarse en agua a 
24 °C (33), además de que demostró que dichas amibas mantienen su capacidad patogénica, 
utilizando 17 aislados de A. poliphaga o A. castellanii e inoculándolos en agar no nutriente 
enriquecido con bacterias. De los 17 aislados 14 lograron desenquistarse; los cuales 
posteriormente fueron inoculados vía intranasal en ratones. A su vez también se inocularon 
14 ratones vía intranasal, pero con aislados recientes para comprobar si el tiempo influye en 
la patogenicidad de la amiba. Los aislados con 24 años de antigüedad registraron menos 
9 
 
muertes que los aislados recientes; lo cual demostró que al paso del tiempo la virulencia de la 
amiba va en declive en comparación con las cepas aisladas recientemente. En contraparte, se 
ha demostrado que mediante la utilización de freón u oxido de metileno o por utilización de 
autoclave se pueden destruir los quistes (13, 33). 
El desenquistamiento ocurre cuando las condiciones del medio en el que se encuentre 
la amiba son nuevamente favorables (4). 
 
Figura 4. Quistes de Acanthamoeba (en donde po= poro u opérculo; ec= ectoquiste y en = endoquiste). 
 
1.4 Patología. 
 Acanthamoeba, afecta principalmente SNC, ojos piel y pulmones (1,19). Las lesiones 
cerebrales producidas por este género de AVL junto con las de Balamuthia mandrillaris se 
conocen como encefalitis amibiana granulomatosa (EAG), ya que el daño en el SNC se 
caracteriza por necrosis hemorrágicas, granulomas, trombos de fibrina e inflamación (13, 20). 
Esta enfermedad es considerada de avance lento, prolongado y oportunista, aunque también 
se puede presentar en individuos totalmente sanos (20, 31). 
Las infecciones cutáneas producidas por Acanthamoeba se presentan principalmente 
en individuos con SIDA y pueden estar relacionadas o no con patología del SNC; aunque 
también han sido bien documentadas infecciones en individuos que están bajo un tratamiento 
de inmunosupresión para un trasplante de órganos o en personas con enfermedades 
10 
 
inmunológicas(13, 31). Las lesiones son nódulos eritematosos indurados o ulceras de la piel 
(17). 
 Cabe mencionar que la tasa de mortalidad reportada para individuos con lesiones 
cutáneas pero sin afección del sistema nervioso central es del 73%; pero para individuos con 
lesiones cutáneas y afección de SNC es del 100% (35). 
Acanthamoeba también afecta a individuos inmunológicamente sanos. La patología 
producida por Acanthamoeba en individuos inmunocompetentes es la Queratitis Amebiana 
(24). Esta se caracteriza por opacidad de la córnea, posteriormente se infiltra al estroma 
causando una inflamación severa; se observa hiperemia de la conjuntiva, inflamación córneal 
y escleritis (21, 26). Los síntomas que sugieren QA incluyen un intenso dolor en el ojo con 
lagrimeo y fotofobia, ojo rojo, irritación, opacidad de la córnea, ruptura y pérdida del epitelio 
córneal, infiltrados perineurales, visión borrosa y anillo córneal; este último junto con el 
intenso dolor son la principal característica clínica que sugiere queratitis producida por 
Acanthamoeba (24, 26). 
 
 
Figura 5: Queratitis causada por Acanthamoeba 
 
11 
 
Los trofozoítos pueden alcanzar los nervios de la córnea y causar neuritis y necrosis. En 
raras ocasiones, Acanthamoeba puede diseminarse de la córnea a la retina causando 
corioretinitis (21). 
 Los primeros casos de QA se observaron en el Reino Unido y Estados Unidos en la 
década de los años 70. En 1973 se informo del primer caso bien documentado de QA donde el 
afectado fue un paciente de sexo masculino de 41 años de edad del sur de Texas, con 
antecedentes de traumatismo córneal y exposición a agua contaminada (32, 37). 
 En 1975 Nagington informó de 2 casos en la Gran Bretaña en los cuales la amiba 
produjo una ulceración crónica y progresiva de la córnea en el primero de los casos, el 
segundo fue sometido a una extirpación quirúrgica del ojo afectado. En el primer caso la 
especie aislada fue A. poliphaga y en el segundo de los casos fue A. castellanii (32). A 
mediados de 1980 ocurrió una epidemia de QA originada por el auge que cobró el uso de 
lentes de contacto en esa época, además de la poca higiene de los mismos (21). 
Acanthamoeba ha sido aislada de lentes de contacto, sobre todo de los llamados 
blandos, además de que también se ha aislado de sus estuches y de soluciones salinas 
elaboradas para su mantenimiento y limpieza (16). Es por eso, que se ha reconocido que el 
principal factor de riesgo para contraer QA es el uso de lentes de contacto (36). A su vez, las 
condiciones que promueven la enfermedad son el uso de soluciones salinas de preparación 
casera, la mala o escasa higiene de los lentes de contacto y pequeñas abrasiones cornéales 
(13, 36). En las soluciones oftálmicas mal manejadas o mal conservadas pueden proliferar 
bacterias que constituyen una buena fuente de nutrición para las amibas (21). 
También existen casos de QA en personas no usuarias de lentes de contacto, en este 
caso, el individuo contrae la enfermedad al entrar en contacto con agua contaminada con la 
amiba, la cual se introduce a la córnea a través de una pequeña lesión o abrasión la cual 
existía con anterioridad aunque también puede atravesar el epitelio córneal intacto (36). 
Las especies más comunes causantes de esta enfermedad son A. polyphaga y 
A. castellani; aunque son varias las especies de Acanthamoeba las que pueden causar QA, 
12 
 
entre ellas A. hatchetti, A. culbertsoni, A. rhysodes, A. griffini, A. quina, A. lugdunensis (13). El 
periodo de incubación es de días y en general se afecta solo un ojo. No se ha descrito 
diseminación al SNC por esta vía (24). 
 
1.5 Mecanismos de patogenicidad. 
A pesar de los númerosos estudios que se han realizado para conocer los factores de 
virulencia, no se conocen a ciencia cierta las determinantes bioquímicas causantes de 
enfermedad; aunque es bien sabido que factores como las propiedades de adherencia, los 
productos citolíticos producidos por la ameba, la tolerancia a temperaturas extremas y los 
mecanismos de evasión de la respuesta inmunitaria son importantes (12, 32). 
 La virulencia de cepas patógenas disminuye en cultivos continuos en medios axénicos, 
pero se restablece mediante pases sucesivos en cerebro de ratón, lo cual sugiere que la 
virulencia está más bien relacionada con determinantes genéticos o fisiológicos (13). 
 La adherencia a las células del epitelio córneal, seguida de una lesión e invasión del 
tejido, parecen ser uno de los factores más importantes para que se establezca la infección; ya 
que por ejemplo; A. castellanii se adhiere a glicoproteínas de la superficie de células 
epiteliales que contienen manosa, proceso mediado por una proteína de superficie de 136 
kDa presente en la membrana de los trofozoítos (13). La adherencia de Acanthamoeba a las 
células de la córnea se puede inhibir con manosa o metilmanosa, pero no con otros azúcares 
(22). Estudios con anticuerpos monoclonales que reconocen diferentes epítopos de la 
membrana celular del epitelio, sugieren la presencia de más de una molécula de adhesión en 
la membrana del trofozoíto; una vez adherida a las células invade el tejido y eventualmente lo 
destruye (32). Los glicolipidos presentes en el epitelio córneal juegan un papel muy 
importante para la adherencia de Acanthamoeba a la córnea. Se han realizado estudios “in 
vitro” en los que se ha demostrado que Acanthamoeba tiene una gran afinidad para adherirse 
al colágeno. Se piensa que el daño provocado en células y tejidos se debe a fenómenos de 
fagocitosis y a sustancias citotóxicas producidas por la amiba, ya que una vez adherida al 
13 
 
epitelio córneal esta se alimenta de las células del epitelio lo cual genera abrasión y 
destrucción del tejido (12, 22). 
 Las fosfolipasas son muy activas en cepas virulentas de Acanthamoeba, a diferencia de 
las cepas no virulentas. Algunos autores suponen que estas promueven la desmielinización del 
tejido cerebral. Otro tipo de enzimas líticas que pudieran contribuir de manera importante a 
la patogenia son las proteasas. Este tipo de enzimas pueden encontrarse en la membrana o 
ser secretadas y causar el efecto citolítico directo de las amibas (12). Estudios realizados por 
Mitro utilizando una cepa de Acanthamoeba poliphaga ATCC 30461 revelan que dicha cepa 
segrega múltiples serina proteasas, metalo proteasas y cisteína proteasas, las cuales sirven 
para degradar colágeno el cual es uno de los principales componentes del estroma córneal. 
Cabe mencionar que se ha demostrado que las serina proteasas tienen efecto citopático en 
células del epitelio córneal y fibroblastos (13). 
 Acanthamoeba culbertsonii contiene altos niveles de elastasa, la cual degrada tejido 
conectivo (12). 
 
1.6 Inmunología en las infecciones por Acanthamoeba. 
No se sabe bien como opera el sistema inmunitario en las infecciones por 
Acanthamoeba. En lo que se refiere a EAG, al parecer la exposición es un fenómeno común ya 
que se han detectado anticuerpos contra dicha amiba en sueros de individuos asintomáticos y 
aparentemente sanos. Tampoco se sabe si la presencia de anticuerpos se debe a infecciones 
leves, las cuales estimularían una respuesta inmunitaria que eventualmente eliminaría al 
parásito (32). 
 La protección contra infecciones letales puede involucrar a la inmunidad innata y a la 
adquirida. Los factores de resistencia innata y el complemento podrían ser parte de la primera 
línea de defensa del hospedero contra la invasión del organismo, ya que este último puede 
eliminar al parasito mediante lisis (12, 32). 
14 
 
Se ha demostrado que a pesar de que la gran mayoría de los individuos que sufren de 
QA son personas inmunocompetentes, estos no desarrollan inmunidad protectora, por lo cual 
puede haber reinfección (12). 
 
1.7 Diagnóstico. 
Para el diagnóstico de laboratorio de Acanthamoeba en pacientes que presentan 
síntomasde EAG, se incluye la observación directa al microscopio del sedimento de líquido 
cefalorraquídeo (LCR) realizando un fresco en el cual podemos observar los trofozoítos a 40X 
en el microscopio óptico, aunque cabe la posibilidad de confundir estos con macrófagos. 
También se puede realizar un frotis del LCR, fijarlo con metanol y teñir con Giemsa-Wright, 
aunque la tinción mas recomendada para evitar confundir los trofozoítos con macrófagos 
debido a la falta de experiencia es la tinción tricrómica o la de Hematoxilina-Eosina (13, 32). 
Otro método diagnóstico utilizado es el cultivo “in vitro”; en medio de crecimiento 
para amibas, el cual generalmente es en agar no nutritivo (medio de Page) inoculado con una 
capa de Escherichia coli o Enterobacter aerogenes (30). También se pueden utilizar cultivos 
celulares de mamíferos como medio de crecimiento (13). 
 El diagnóstico histológico está basado en cortes finos de cerebro o biopsias de lesiones 
cutáneas incluidos en parafina y teñidos con H-E (31). Para la observación del quiste se han 
empleado técnicas de tinción como la del acido peryódico de Schiff (PAS), la técnica de 
Gomori-plata-metenamina o la tinción de calcoflúor (4). 
 Para el diagnóstico de infecciones cutáneas la metodología es básicamente la misma 
que para EAG agregando que para este tipo de patología se puede utilizar un medio de cultivo 
liquido (generalmente medio de Chang) obteniendo la muestra de lesiones cutáneas (13). 
El diagnóstico temprano de QA es fundamental para el curso que seguirá la 
enfermedad. Dicho diagnóstico es difícil, principalmente porque las características clínicas de 
la enfermedad se confunden con otras patologías más frecuentes como queratitis fúngica, 
15 
 
infecciones por Pseudomonas aeruginosa o queratitis atípica causada por herpes simplex. 
Además el diagnóstico se complica cuando se presentan infecciones bacterianas secundarias 
(2, 3). 
Se debe de considerar realizar un estudio sugestivo de QA cuando no se responde a los 
tratamientos antibacterianos (21). El método diagnóstico ideal y más efectivo hasta el 
momento es el aislamiento, cultivo e identificación de las amibas en muestras de raspados o 
biopsias cornéales (35). Es importante que el diagnóstico sea rápido y acertado porque en las 
etapas crónicas de la infección los trofozoítos llegan a enquistarse y los quistes son más 
resistentes a los fármacos que los trofozoítos (2). 
Una vez que se tiene el raspado o biopsia córneal, este se debe de inocular en un agar 
no nutritivo el cual contenga E. coli o Enterobacter aerogenes, las cuales servirán de alimento 
para la ameba. Preferentemente la muestra debe ser sembrada en el mismo lugar donde se 
tomo, pero si ésta debe de ser llevada a otro sitio se transportara en un frasco con solución de 
Page. Las placas de ANN (agar no nutritivo) inoculadas con la muestra, deberán de ser 
incubadas a temperaturas de 28 a 35 °C durante un lapso no menor a 10 días, tiempo 
aproximado durante el cual se logrará el desenquistamiento. Un inconveniente es que 
generalmente la muestra contiene bacterias o levaduras, las cuales confunden el 
diagnóstico (13, 30). 
El diagnóstico citológico se basa en diversos métodos de marcado; la realización de 
inmunofluorescencia indirecta (IFI) es uno de ellos, en el cual mediante una reacción antígeno 
anticuerpo se detecta a la amiba en raspados o biopsias de córnea (28). También se puede 
utilizar blanco de calcoflúor, el cual muestra afinidad por los polímeros de polisacáridos 
presentes en los quistes de las amibas: Al utilizar calcoflúor se tiñe la pared del quiste de color 
azul brillante fluorescente, efecto que dura durante un tiempo prolongado. El calcoflúor 
blanco también es útil para la observación de muestras de tejido o raspados cornéales 
incluidos en parafina (38). La tinción con naranja de acridina también es un método confiable 
16 
 
y fidedigno para el diagnóstico citológico además de las tinciones mencionadas anteriormente 
para EAG (28). 
En usuarios de lentes de contacto, Acanthamoeba también puede ser aislada de los 
lentes, de sus estuches de contención o de las soluciones limpiadoras si el raspado córneal ha 
sido negativo aunque un diagnóstico positivo de cualquiera de estas muestras no confirma 
una afección por Acanthamoeba aunque si lo sugiere en gran medida (21). 
 Un problema grave es la falta de conocimiento del personal médico sobre la 
enfermedad, lo cual puede conducir a un diagnóstico erróneo que retrase el tratamiento 
adecuado y por lo tanto cause la pérdida total de la visión o hasta la enucleación en casos 
extremos. Se han realizado estudios retrospectivos de casos en los cuales existe patología de 
la córnea y hay síntomas que sugieren que Acanthamoeba es la causante. En el 73% de estos 
casos se logro aislar Acanthamoeba, que en su tiempo no fue diagnosticada (2). 
La utilización de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa en tejidos infectados 
mediante anticuerpos específicos contra Acanthamoeba y la microscopía electrónica de 
transmisión han dado buenos resultados en la investigación científica pero su aplicación 
clínica es casi nula. Cabe mencionar que IFI es solo útil en la identificación de género pero no 
de especie (28). Otra técnica aplicada a la investigación en el diagnóstico de género es la 
reacción en cadena de la Polimerasa. Esta técnica es tan sensible, que si tuviéramos 
solamente 10 células de Acanthamoeba estas podrían ser detectadas y por lo tanto este 
método también ha sido utilizado para el diagnóstico clínico de QA. Por otro lado 
investigadores como Lemman han reportado el uso de PCR para detección de Acanthamoeba 
en QA con tan solo de 1 a 5 amibas. Además, sugiere que este método no solo es útil para el 
diagnóstico, sino también para evaluar y monitorear la respuesta del tratamiento (3, 13). 
Un método prometedor para la detección de QA es la hibridación in situ, método que 
utiliza sondas especificas de género o secuencias tipo (T4). Hasta la fecha se han utilizado 
sondas de tipo T4 debido a que la mayoría de las especies de Acanthamoeba que causan QA 
son de secuencia tipo T4. Los resultados pueden ser obtenidos 1 ó 2 días después, a diferencia 
17 
 
de los métodos de cultivo en los cuales debemos de esperar semanas; sin embargo si los 
resultados obtenidos por este método son negativos, es necesario confirmar este resultado 
con cultivo en ANN (3). 
 También se han utilizado pruebas de inmunodiagnóstico para la detección de 
Acanthamoeba como la citometría de flujo, aunque dicho método no está estandarizado (20). 
 Finalmente, númerosos investigadores han reportado que un método no invasivo de 
diagnóstico de queratitis amebiana es el escaneo de córnea mediante microscopía confocal. El 
método consiste en la visualización de imágenes de alto contraste en las cuales se pueden 
distinguir tanto quistes como trofozoítos que se encuentren en la córnea. Dichas imágenes 
son grabadas y reproducidas en un monitor (21). 
 En resumen, podemos decir que lo más importante en el diagnóstico de enfermedades 
producidas por Acanthamoeba es el diagnóstico oportuno ya que si este se da, el pronóstico 
de recuperación del paciente es bueno; sobre todo en la QA (2). 
 
1.8 Tratamiento. 
 En lo que se refiere a la EAG, un buen número de agentes antimicrobianos y extractos 
de plantas han demostrado su eficacia contra estas amibas en estudios “in vitro”, sin 
embargo; no existe la seguridad de que la misma droga sea efectiva clínicamente en 
individuos con EAG. Entre las drogas que se han utilizado se encuentran la anfotericina B, 
azitromicina, fluconazol, ketokonazol, pentamidinas, paramomicinas, polimixinas, trimetropin 
con sulfametoxazol, rifampicina y sulfadiazina, además de extractos de plantas medicinales (6, 
13, 31). 
 
El tratamiento para lesiones cutáneas producidas por Acanthamoeba no está bien 
definido. Se han probado diversascombinaciones de tratamientos, pero la mayoría de los 
pacientes han muerto; además si también se lleva acabo diseminación a SNC la probabilidad 
de eficacia disminuye severamente a casi nula. Existen reportados algunos casos de 
18 
 
tratamiento exitoso en los cuales se han utilizado itraconazol, 5-fluorocitocina, gluconato de 
clorhexidina tópico y ketoconazol en crema. Entre las combinaciones de fármacos con 
resultado exitoso para lesiones cutáneas existe el tratamiento con fluconazol y sulfadiazinas 
(17,19). 
 
En el caso de la QA por ser difícil y confuso el diagnóstico, el tratamiento generalmente 
comienza tarde, lo cual lleva a la pérdida total de la visión del ojo infectado con 
Acanthamoeba. El pronóstico es mejor si el diagnóstico es oportuno, esto es cuando 
Acanthamoeba apenas empieza a envolver el epitelio córneal. Cuando se ataca al organismo 
infeccioso en esta etapa, este se puede remover mediante tratamiento tópico. Si no hay 
diagnóstico oportuno, Acanthamoeba invade la córnea y en estos casos la terapia puede durar 
de varios meses a un año o un poco más, lo cual puede ser perjudicial ya que en casos aislados 
se desarrolla resistencia a ciertas drogas (2). 
 
Otro problema es que el tratamiento no se lleve acabo durante el tiempo necesario o 
no sea el adecuado, lo cual desencadena la reincidencia de la enfermedad, ya que los quistes 
de Acanthamoeba son resistentes a un gran número de fármacos. Los fármacos que son 
efectivos en los inicios de la enfermedad, no son efectivos una vez que la amiba ha invadido 
los tejidos debajo de la córnea (24, 32). 
 
Estudios in vitro han demostrado la efectividad de ciertos fármacos en diversos 
aislados de pacientes con QA. Los aislados fueron crecidos en ANN con E. coli durante 1 
semana, lavados e incubados en distintas diluciones de drogas amebicidas durante 48 horas. 
Después se determino la concentración mínima quisticida colocando nuevamente la solución 
de los aislados en ANN para favorecer el crecimiento amebiano y observando que no hubiera 
crecimiento de trofozoítos ni quistes durante 1 semana. Así, investigadores como Wright 
reportaron tratamientos efectivos para QA utilizando 0.1% de isotianato de propamidina 
tópico con 0.15% de dibromopropamidina, aunque este tratamiento solo es efectivo en los 
inicios de la infección. Estudios como este han demostrado que las biguanidas son los 
19 
 
fármacos más utilizados con resultados excelentes, tanto contra las formas tróficas como las 
quísticas. La poliheximetilbiguanida (PHMB), que es elaborada por “Zeneca Pharmaceuticals” 
y manufacturada como desinfectante con el nombre de Bacuacil, ha demostrado una notable 
actividad amebicida para un gran número de cepas, aunque cabe mencionar que PHMB no 
cuenta con licencia para uso médico, por lo cual solo es utilizada “in vitro”. Una combinación 
de digluconato de clorhexidina con PHMB, o con aminas aromáticas semejantes a la 
hexamidina, pentamidina o isiotonato de propamidina han sido reportadas para el 
tratamiento para QA. Por otro lado PHMB utilizado solo, no reporta toxicidad alguna; en 
cambio en combinación con algunos otros compuestos muestra efectos adversos. Existen 
reportes de casos en los que se relaciona el uso de gluconato de clohexidina tópico durante 8 
semanas con queratitis ulcerativa (13, 32). 
Otros estudios han demostrado que la administración tópica de clorhexidina y 
propanamina surten efecto cuando son administrados durante largos periodos en pacientes 
con QA; sin embargo la propanamina no es recomendada para todos los pacientes debido a 
que se ha demostrado que en algunos de ellos el uso de este fármaco provoca anormalidades 
en la córnea cuando se utiliza por periodos prolongados (13). 
También se han utilizado los azoles en el tratamiento de QA como miconazol o 
fluconazol (25). 
Los corticosteroides en combinación con agentes terapéuticos han sido utilizados para 
el tratamiento de QA, sin embargo aunque el uso de estos reduce la inflamación, su utilización 
debe de restringirse lo mayor posible, ya que estudios “in vitro” e “in vivo” en animales de 
experimentación han demostrado que el uso de corticoesteroides semejantes a 
dexametasona incrementan la patogenicidad de la amiba. Un experimento realizado en 
hamsters mostró que la QA fue más grave en los que fueron tratados con dexametasona que 
en los hamsters no tratados. Adicionalmente, en un estudio realizado en conejos, se observó 
que al administrarles a estos corticoesteroides resultaba perjudicial (13). 
20 
 
También se ha estudiado la actividad amebicida de diferentes alquilfosfocolinas. La 
Hexadecilfosfocolina ha demostrado llevar acabo lisis de Acanthamoeba in “vitro” en una 
hora, sin embargo este compuesto aún se encuentra en fase de experimentación (31). 
Hay medicamentos cuyo efecto amebicida es variable, de modo que es importante 
incluir en el tratamiento medicamentos que actúen tanto contra la forma de trofozoíto como 
contra la forma quística, ya que mientras no se eliminen los quistes la infección puede 
reincidir (4). Además, es necesaria la investigación y búsqueda de nuevos agentes 
terapéuticos debido a que antibióticos que anteriormente eran efectivos, hoy en día no tienen 
efectos positivos debido a que Acanthamoeba ha generado resistencia en contra de ellos. 
Dicha resistencia, aparentemente es causada por la pared del quiste (2). 
Cuando el paciente no responde satisfactoriamente al tratamiento farmacológico ni al 
quirúrgico (trasplante de córnea) se tiene que llevar a cabo la enucleación del ojo. (24). 
Algunos investigadores sugieren realizar una queratoplastia penetrante cuando existe 
perforación de la córnea, sin embargo el uso de este método en el tratamiento de QA está en 
debate; si el avance de la QA es menor a 6 semanas no es necesaria la utilización de este 
método, en cuyo caso; de no existir una respuesta adecuada al tratamiento se utilizará como 
último recurso (21). 
 
 
 
 
 
 
 
21 
 
2. JUSTIFICACIÓN. 
Las amebas del género Acanthamoeba son protozoarios ampliamente distribuidos en 
la naturaleza, a excepción de las zonas extremadamente frías, son aisladas con facilidad de la 
tierra, el agua y el aire de todas las regiones habitadas por el hombre, consecuentemente, la 
interacción con ellas de manera cotidiana resulta prácticamente inevitable (4). 
Lo anterior, combinado con otros factores como su elevada capacidad de 
reproducción, la invasión de ecosistemas por el ser humano así como el aumento de personas 
inmunosuprimidas y de usuarios de lentes de contacto, multiplican y favorecen la 
probabilidad de que ocurran infecciones causadas por esta amiba. 
Actualmente se argumenta que el diagnóstico de QA es difícil de realizar en el 
laboratorio clínico, además; al no existir datos estadísticos en México sobre esta patología no 
se toman las medidas precautorias que se deberían tener ya que esta enfermedad es de tipo 
invalidante. 
Por todo lo dicho anteriormente, la importancia de este trabajo radica en demostrar 
que el diagnóstico clínico es sencillo y barato, además de proporcionar herramientas útiles 
para la capacitación de químicos y médicos en la detección temprana de la enfermedad. Por 
otra parte, es de suma importancia el conocer que porcentaje de la población estudiada es 
portadora de Acanthamoeba ya que hasta la realización de este trabajo no existen datos al 
respecto en México y por lo tanto no se le asigna la importancia debida a esta patología. 
 
3. HIPOTESIS 
 Al lograr aislar e identificar amebas del género Acanthamoeba, seremos capaces de 
determinar el porcentaje de la población usuaria de lentes de contacto que es portadora de 
dicha ameba además, demostraremos que el diagnóstico clínico de QA es sencillo y barato. 
22 
 
4. OBJETIVO GENERAL: 
Aislar e identificar amibas del género Acanthamoeba, mediante el cultivo de lentes de 
contactode usuarios del servicio de oftalmología del Hospital General de México, para así 
determinar el porcentaje de la población usuaria de dichos lentes que es portadora de la 
ameba además de valorar la utilidad de los métodos utilizados en el diagnóstico de QA. 
4.1 Objetivos particulares: 
1.- Aislar amebas del género Acanthamoeba spp a partir de lentes de contacto del tipo 
blando de 100 usuarios sanos o con afección ocular mediante el cultivo en medio de Page. 
2.- Identificación del género Acanthamoeba spp. mediante el uso de tinciones (Giemsa, 
calcoflúor) y morfología microscópica; quistes (forma y tamaño), trofozoítos (presencia de 
acantopodios). 
3.- Identificación de antígenos de Acanthamoeba spp en las muestras positivas (según 
el punto anterior) de los usuarios de lentes de contacto mediante la aplicación de la técnica 
de Inmunofluorescencia indirecta (IFI). 
4.- Evaluar la utilidad de las técnicas utilizadas (cultivo, tinciones, cuantificación de 
proteínas, ELISA e IFI) para la identificación y el diagnóstico clínico de Acanthamoeba spp. 
5.- Informar a la población usuaria de lentes de contacto que acude a consulta 
oftalmológica en el Hospital General de México, sobre los factores de riesgo que favorecen 
adquirir infecciones por Acanthamoeba. 
 
 
 
23 
 
5. Metodología 
 
Figura 6. Diagrama de flujo de la metodología realizada. 
 
 
 
 
 
 
Obtención de la muestra 
(lentes de contacto) 
Cultivo de la muestra (medio 
de Page) 
Examen de los cultivos e 
interpretación de los 
resultados 
(+) 
Frotis en 
fresco 
Tinción de 
calcoflúor 
Tinción de 
Giemsa 
Observación 
morfológica 
(40 y 100 X) 
Buscar 
fluorescencia de 
quistes a 40 X 
Observar 
morfología de 
trofozoítos 
Obtención de antígeno 
(congelación-ebullición) 
Cuantificación de proteínas 
(Bradford) 
Esquema de inoculación en 
conejos raza Nueva Zelanda 
Titulación de anticuerpos (ELISA) 
Obtención de Ac en suero (punción 
cardiaca) 
IFI 
24 
 
5.1 Obtención de la muestra: 
 El lente de contacto se retiro del paciente utilizando pinzas estériles y fue colocado en 
un frasco estéril de boca ancha el cual contenía aproximadamente 25 mL de solución de Page. 
La muestra se transportó hasta el laboratorio donde fue procesada sumergida en hielo, 
además; se agitó manualmente varias veces con el fin de que la amiba no se adhiriera a las 
paredes del frasco. 
 
5.2 Cultivo de la muestra. 
 Los frascos que contenían el lente de contacto sumergido en medio de Page, 
reposaron en hielo durante 20 minutos, agitando dichos frascos manualmente cada 4 ó 5 
minutos, (sin utilizar vortex para evitar la ruptura de los trofozoítos o quistes) esto con el fin 
de favorecer el desprendimiento de la ameba de las paredes del frasco (esto se realiza si no 
hubiera sido posible transportar la muestra sumergida en hielo). Una vez transcurrido el 
tiempo, se rasparon con suavidad las paredes del frasco y se colocó el contenido en tubos 
para centrifugar 10 minutos a 250 g. Posteriormente, utilizando pipeta Pasteur se tomaron 
aproximadamente de 4 a 5 gotas del líquido del fondo del tubo y se colocaron en una placa 
con medio de Page; la cual fue previamente preparada e inoculada con Escherichia coli que 
sirvió de alimento para la amiba. Se recomienda colocar el lente de contacto en la placa. 
Finalmente, las placas se incubaron a 37 °C. 
 
5.3 Examen de los cultivos. 
 Se revisaron las placas cada 24 horas durante un período de 4 semanas. La revisión se 
realizó en un microscopio invertido a 20X. En caso de observar formas sugerentes de 
trofozoítos o quistes se observaron a 40X para comprobar su morfología. Las placas fueron 
hidratadas e inoculadas nuevamente con Escherichia coli cada semana con el fin de evitar la 
deshidratación y falta de alimento en las mismas. 
25 
 
5.4 Interpretación de los resultados. 
Una muestra fue considerada como positiva cuando se observaron quistes y/o 
trofozoítos en el microscopio invertido en un lapso no mayor a 4 semanas. Si al término de las 
4 semanas no se observó crecimiento amebiano la muestra se tomo como negativa. 
A las muestras que fueron consideradas como positivas, se les realizó un pequeño 
corte de agar y se colocó en otra placa de medio de Page inoculado con Escherichia coli; esto 
con el fin de eliminar hongos y/o bacterias que pudieron estar presentes en la muestra y por 
lo tanto obtener un cultivo axénico de Acanthamoeba. Este paso se realizó varias veces en las 
muestras que se consideró necesario. 
 Una vez que contamos con las muestras positivas axenisadas al eliminar se procedió a 
obtener los quistes y/o trofozoítos de las cajas Petri, de cada una de las muestras positivas, 
para lo cual; se agregaron con pipeta Pasteur de 5 a 10 gotas de SSF a cada caja y se raspó la 
parte superior del agar de forma suave para finalmente obtener mediante pipeta Pasteur la 
mayor cantidad de líquido posible el cual contenía las amebas y se colocaron en tubos 
estériles previamente rotulados. Cabe mencionar que fue necesario contar con cajas de 
reserva las cuales contengan a cada una de las muestras positivas, esto por si llegase a fallar la 
técnica y sea necesario repetirla. 
 
5.5 Tinciones y morfología quística. 
 Una vez obtenidas las amebas se procedió a realizar las tinciones de calcoflúor y 
Giemsa, pero antes fue necesario realizar un frotis en fresco de la muestra con el fin de 
comprobar que logramos obtener quistes y/o trofozoítos. Además se aprovecharon dichos 
frotis para comparar la morfología quística de las muestras obtenidas con su morfología 
reportada en la literatura. 
26 
 
 Para la realización del frotis en fresco se colocó en un portaobjetos limpio una gota de 
la muestra, la cual previamente fue resuspendida. Posteriormente se colocó un cubreobjetos 
cuidando de no formar burbujas. Finalmente con el fin de evitar derrames se selló la muestra 
utilizando esmalte de uñas. 
 Cada laminilla se observó a 40x tomando como muestra positiva a aquella en la cual se 
logró observar quistes y/o trofozoítos de Acanthamoeba. En ocasiones se pudieron ver 
acantopodios a 100x. 
 Para la confrontación de la morfología de las muestras con la morfología típica de 
Acanthamoeba reportada en la literatura se evaluó el aspecto de 100 quistes de cada 
muestra, teniendo en cuenta el tamaño en micras así como el aspecto físico de los quistes 
(presencia o no de opérculos y número de estos, presencia o no de doble pared, refringencia). 
 Al ser positivos los frotis en fresco, se realizaron las tinciones de Giemsa y calcoflúor. 
 Calcoflúor. 
Se realizó una limpieza exhaustiva de cada uno de los portaobjetos a utilizar mediante el 
uso de acetona. Una vez que se tuvieron los portaobjetos limpios se agitaron los tubos que 
contenían las muestras positivas y se tomo una gota de dicha muestra con pipeta Pasteur, la 
cual se colocó en el centro del portaobjetos y se extendió utilizando un aplicador de madera. 
Después se dejó secar la muestra a temperatura ambiente o también se puede utilizar el 
método de fijación por calor. 
 Ya que la muestra fue fijada, se adiciono por goteo la cantidad necesaria de calcoflúor 
para cubrir el portaobjetos y se dejó reposar durante 1 minuto, para después lavar con agua 
destilada. Finalmente se dejó secar la muestra y se observó en el microscopio de fluorescencia 
utilizando luz ultravioleta a 40X. 
 
27 
 
 Se consideró una tinción de calcoflúor como positiva a aquella en la cual los quistes de 
Acanthamoeba presentaron una fluorescencia de color azul cobalto. Cabe mencionar que 
aunque existan trofozoítos de Acanthamoeba presentes en la muestra estos no presentaron 
fluorescencia ya que esta tinción es exclusiva para quistes. 
 Giemsa 
Para la observación de trofozoítos de Acanthamoeba mediante esta tinción, fue 
necesario realizar esta técnica inmediatamente después dela obtención de los trofozoítos 
del cultivo axenico, ya que si se deja pasar tiempo estos se enquistarán. 
Se realizó una limpieza exhaustiva de cada uno de los portaobjetos a utilizar mediante el 
uso de acetona. 
Una vez que se tuvieron los portaobjetos limpios se agitaron los tubos que contenían las 
muestras positivas y se tomó una gota con pipeta Pasteur, la cual se colocó en el centro del 
portaobjetos y se extendió por éste utilizando un aplicador de madera. Después se dejó secar 
a temperatura ambiente o también se puede utilizar el método de fijación por calor. 
Ya que la muestra estaba fijada, se adiciono por goteo la cantidad necesaria de colorante 
de Giemsa para cubrir el portaobjetos y se dejó reposar durante 10 minutos; después se lavo 
con agua destilada y se dejó secar la muestra a temperatura ambiente. La laminilla se observó 
al microscopio a 40X para observar trofozoítos y a 100x si buscamos acantopodios. 
 Se consideró una tinción de Giemsa como positiva a aquella en la cual el trofozoíto se 
tiñó de color morado con núcleo(s) rosa(s). Si logramos observar acantopodios a 100x esto es 
una prueba de que trata de Acanthamoeba, ya que ningún otro género de AVL posee este tipo 
de proyecciones citoplasmáticas. 
 
 
 
28 
 
5.6 Cuantificación de proteínas. 
A la par de las pruebas mencionadas con anterioridad, se realizó la cuantificación de 
proteínas por el método de Bradford. 
Los antígenos utilizados tanto de A. castellani como de N. fowleri se obtuvieron de 
aislados de pacientes positivos de EAG y EAP respectivamente. A su vez, dichos antígenos 
fueron preparados para su utilización mediante congelación-descongelación durante 8 ciclos, 
pasando de nitrógeno líquido a agua a 60 °C; seguido de una centrifugación a 150 g durante 
10 minutos 
 Posteriormente, se prepararon 50 mL de solución de albúmina al 1% en PBS pH= 7.6 
destilada, teniendo cuidado de no hacer burbujas. 
Después se elaboró una curva patrón de albúmina en tubos Ependorf de la siguiente 
manera: 
NÚMERO DE TUBO CANTIDAD DE H2O + CANTIDAD DE ALBÚMINA A MEZCLAR 
1 990 L de H2O + 10 L de albúmina 
2 980 L de H2O + 20 L de albúmina 
3 970 L de H2O + 30 L de albúmina 
4 960 L de H2O + 40 L de albúmina 
5 950 L de H2O + 50 L de albúmina 
6 940 L de H2O + 60 L de albúmina 
7 930 L de H2O + 70 L de albúmina 
8 920 L de H2O + 80 L de albúmina 
9 910 L de H2O + 90 L de albúmina 
10 900 L de H2O + 100 L de albúmina 
Tabla 1: Curva patrón para la cuantificación de proteínas por el método de Bradford. 
 
 
29 
 
En una placa para ELISA con pozos de fondo plano se colocó la curva realizada 
anteriormente y la muestra problema (por duplicado ambas) de la siguiente manera: 
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 
A 
Tubo 
1 40 
L 
Tubo 2 
40 L 
Tubo 3 
40 L 
Tubo 4 
40 L 
Tubo 5 
40 L 
Tubo 6 
40 L 
Tubo 7 
40 L 
Tubo 8 
40 L 
Tubo 9 
40 L 
Tubo 10 
40 L 
PBS 
40 
L 
PBS 
40 
L 
B 
Pozos no utilizados C 
D 
PBS 
70L 
+ 
10L 
Ag 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
PBS 
40 
L 
PBS 
40 
L 
E 
PBS 
70L 
+ 
10L 
Ag 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
PBS 
40 
L 
PBS 
40 
L 
F 
PBS 
70L 
+ 
10L 
Ag 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
PBS 
40 
L 
PBS 
40 
L 
G 
PBS 
70L 
+ 
10L 
Ag 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
40 L del 
pozo 
anterior + 
40 L PBS 
PBS 
40 
L 
PBS 
40 
L 
Tabla 2: Cuantificación de proteínas en sueros de donadores infectados con AC y Nf respectivamente (donde A = Curva de albúmina; D y E = 
Antígeno de Acanthamoeba castellani; F y G = Antígeno de Naegleria fowleri). 
Finalmente se agregaron 160 L del reactivo de Bradford a todos los pozos y se realizó 
la lectura a 595 nm; la concentración de proteínas se obtuvo mediante interpolación en la 
curva patrón. 
 
30 
 
5.7 Esquema de inoculación. 
Con el fin de obtener anticuerpos anti-Acanthamoeba así como anticuerpos anti-
Naegleria los cuales fueron utilizados posteriormente para la realización de la técnica de IFI. 
Se llevaron acabo los siguientes esquemas de inoculación en conejos de raza Nueva Zelanda: 
 
DÍA INOCULACIÓN VIA DE ADMINISTRACION 
1 Ag de AC + ACF. Vía subcutánea (Dorso) 
8 Ag de AC + AIF. Vía subcutánea (Dorso) 
15 Ag de AC (1000 L). Intramuscular (Pierna) 
21 Toma de muestra sanguínea. Titulación de anticuerpos 
(realización de ELISA) 
22 Ag de AC 500 L. Intramuscular (Pierna) 
26 Toma de muestra sanguínea Titulación de anticuerpos 
(realización de ELISA) 
27 Toma de muestra sanguínea Titulación de anticuerpos 
(realización de ELISA) 
28 Ag de AC (500 mL). Intramuscular (Pierna) 
Tabla 3. Esquema de inoculación para Acanthamoeba castellani; (donde ACF= Adyuvante completo de Freund; 
AIF= Adyuvante Incompleto de Freund). 
 
 
 
 
 
 
31 
 
DÍA INOCULACION VIA DE ADMINISTRACION 
1 Ag de Nf + ACF. Vía subcutánea (Dorso) 
8 Ag de Nf + AIF. Vía subcutánea (Dorso) 
15 Ag de Nf (1000 L). Intramuscular (Pierna) 
21 Toma de muestra sanguínea. Titulación de anticuerpos 
(realización de ELISA) 
22 Ag de Nf 500 L. Intramuscular (Pierna) 
26 Toma de muestra sanguínea Titulación de anticuerpos 
(realización de ELISA) 
27 Toma de muestra sanguínea Titulación de anticuerpos 
(realización de ELISA) 
28 Ag (500 mL). Intramuscular (Pierna) 
Tabla 4. Esquema de inoculación para Naegleria fowleri (donde ACF=Adyuvante completo de Freund; AIF= 
Adyuvante Incompleto de Freund). 
 
 
5.8 Toma de muestra. 
1.- Se colocó al conejo dentro de la caja dejando las orejas afuera. 
2.-Se frotó con alcohol la parte interior de la oreja del conejo y se rasuró la zona 
correspondiente a la vena. 
3.- Se realizó la toma de muestra con jeringa de 3 o 5 mL y se colocó la sangre obtenida en un 
tubo previamente rotulado teniendo cuidado de no hemolisar la muestra. 
 
 
32 
 
5.9 Realización de ELISA. 
1.- Se centrifugó a 250 g la sangre del conejo para así obtener suero con Ac anti-
Acanthamoeba o anti-Naegleria según sea el caso. 
2.- Se diluyeron 10 L de antígeno en 10 mL de buffer de carbonatos pH= 9.6 y se colocaron 
100 L en cada pozo a utilizar. 
3.-Se incubó la placa a 4 °C durante toda la noche. 
4.- Al día siguiente se eliminó la solución sacudiendo la placa sobre una gasa extendida, para 
posteriormente realizar 3 lavados de 5 minutos cada uno con solución PBS-Tween 0.05%. 
5.- Se bloqueó con 200 L leche descremada al 1% durante 30 minutos a 37 °C. 
6.- Se realizaron 3 lavados de la misma forma en que se hicieron en el paso 4. 
7.- Se colocaron 200 L de la muestra con Agdiluida 1/1000 en PBS en todos los pozos de la 
línea A. 
8.- Se colocaron 100 L de PBS-Tween en todos los pozos inferiores. 
9.- Se efectuó la dilución en orden descendente hasta alcanzar una dilución de 1/128,000. 
10.- Se cubrió la placa con parafilm y se incubo durante 2 horas a 37 °C. 
11.- Se realizaron 3 lavados de la misma forma en que se hicieron en el paso 4. 
12.- Se colocaron 100 L del conjugado anti-conejo diluido 1/500 en PBS-Tween 0.05% a todos 
los pozos en uso y se cubrieron con parafilm 
13.- Se incubó durante 2 horas a 37 °C. 
14.- Se colocaron 100 L de sustrato a cada pozo en uso y se esperó a que el color de los 
pozos cambiara a amarillo. 
33 
 
15.- Se detuvo la reacción con 100 L de H2SO4 2N en cada pozo y se efectuó la lectura a 490 
nm. 
 
5.10 Obtención de suero con Ac. 
 Se obtuvo la mayor cantidad posible de suero de conejo mediante punción venosa (de 
las 2 orejas) para posteriormente llevar acabo una punción cardiaca de la siguiente manera: 
1.- Para obtener la mayor cantidad de sangre la punción se realizó sin anestesia, para lo cual el 
conejo se sujetó de las cuatro patas con el abdomen hacia arriba sobre la mesa de disección. 
2.- Se palpó con el dedo índice la zona del tórax hasta localizar los latidos del corazón. 
3.- Se limpió con alcohol la zona localizada. 
4.- Se procedió a realizar la punción utilizando jeringa de 10 mL. 
5.- Se quitó la aguja de la jeringa y se vació la sangre en un tubo de forma lenta y por las 
paredes de este. 
6.- Se dejó reposar 10 minutos para después centrifugar a 150 g durante 10 minutos. 
7.- Finalmente se separó el suero y se almaceno a -70 °C hasta su uso. 
 
 
 
 
 
 
34 
 
5.11 Inmunofluorescencia. 
1.- Se obtuvieron trofozoítos de cada una de las muestras positivas de los cultivos en cajas 
Petri. 
2.- Se fijaron los trofozoítos de Acanthamoeba con formaldehido. 
2.- Se centrifugó el tubo con los trofozoítos fijados a 250 g 
3.- Se descartó el sobrenadante y se resuspendió la muestra. 
4.- Se colocaron 15 L de antígeno en cada pozo, los cuales fueron previamente limpiados con 
alcohol-acetona. 
5.- Una vez que la muestra secó, se colocó 1 gota de acetona en cada pozo y se dejo secar. 
6.- Se realizaron las diluciones necesarias del suero de conejo anti-Acanthamoeba (1:100, 
1:200, 1: 400) en PBS. 
7.- Se repitió el paso anterior utilizando un suero testigo negativo. 
8.- Los pozos 1 y 5 fueron utilizados como testigos, por lo cual en ellos se colocaron 15 L de 
PBS. 
9.- Los pozos 2, 3 y 4 fueron utilizados para las diluciones del suero testigo negativo; 
utilizando el pozo 2 para la dilución 1:100, el pozo 3 para la dilución 1:200 y el pozo 4 para la 
dilución 1: 400 
10.- Los pozos 6, 7 y 8 fueron utilizados para el suero testigo positivo, utilizando el pozo 6 
para la dilución 1:100, el pozo 7 para la dilución 1:200 y el pozo 8 para la dilución 1:400 
11.- Se cubrió la placa con papel aluminio y se incubó a 37 °C durante 30 minutos en cámara 
húmeda. 
12.-Una vez transcurridos los 30 minutos se lavaron los pozos con PBS; después se introdujo la 
placa en una cámara con PBS durante 5 minutos y después 1 minuto en agua destilada. 
35 
 
13.- Se realizó la dilución del conjugado marcado con fluoresceína 1:200 mezclado con azul de 
Evans diluido 1:100 y se colocaron 12 L en cada pozo 
14.- Se repitieron los pasos 11 y 12. 
15.- Se realizó el montaje para lectura dejando secar al aire y colocando una gota de glicerina 
en cada esquina para posteriormente colocar un cubreobjetos. 
16.- Se observaron las preparaciones en microscopio de luz ultravioleta a 40X 
Posteriormente se repitió la metodología anteriormente descrita pero en esta ocasión 
utilizando suero de conejo anti-Naegleria spp. 
Finalmente se realizó una tercer IFI de la manera siguiente: 
1.- En los pozos 1 y 5 se colocó antígeno testigo (+) de Acanthamoeba spp. 
2.- En los pozos 4 y 8 se colocó antígeno testigo (+) de Naegleria spp. 
3.- En los pozos 2 y 3; se colocaron 15 L de antígeno muestra problema de Acanthamoeba 
spp. 
4.- En los pozos 6 y 7 se colocaron 15 L de antígeno de Naegleria spp. 
5.- Una vez que la muestra seco, se colocó 1 gota de acetona en cada pozo y se dejo secar. 
6.- Los pozos 1 y 5 fueron utilizados como testigos negativos, por lo cual se colocaron 15 L de 
PBS. 
5.- Los pozos 4 y 8 fueron utilizados como testigos positivos, por lo cual se colocaron en el 
pozo 4, 15 L de suero de conejo testigo positivo anti-Acanthamoeba (1/200) y en el pozo 8, 
15 L de suero de conejo testigo positivo anti-Naegleria (1/200). 
6.- En los pozos 2 y 7 se colocaron 15 L de suero de conejo anti-Acanthamoeba (1/200). 
7.- En los pozos 3 y 6 se colocaron 15 L de suero de conejo anti- Naegleria (1/200). 
36 
 
8.- Se cubrió la placa con papel aluminio y se incubó a 37 °C durante 30 minutos en cámara 
húmeda. 
9.-Una vez transcurridos los 30 minutos se lavaron los pozos con PBS; después se introdujo la 
placa en una cámara con PBS durante 5 minutos y después 1 minuto en agua destilada. 
10.- Se realizó la dilución del conjugado de cabra anticonejo marcado con fluoresceína 1:200, 
mezclado con azul de Evans diluido 1:100 y se colocaron 12 L en cada pozo 
11.- Se repitieron los pasos 6 y 7. 
12.- Se realizó el montaje para lectura dejando secar al aire y colocando una gota de glicerina 
en cada esquina para posteriormente colocar un cubreobjetos.. 
13.- Se observaron las preparaciones en microscopio de luz ultravioleta a 40X, comenzando 
por los testigos positivos y negativos, para finalmente observar las pruebas cruzadas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
37 
 
6. RESULTADOS. 
Se obtuvieron muestras de 100 pacientes del servicio de oftalmología del Hospital 
General de México, específicamente del departamento de córnea a cargo de la doctora Leticia 
Vázquez Maya. Del total de las muestras, 11 de ellas resultaron positivas al ser observadas 
morfológicamente en el microscopio estereoscópico (2, 4, 7, 13, 15, 24, 33, 43, 44, 45, 94). 
 
 
Figura 7: Trofozoíto de Acanthamoeba en medio de Page (muestra 24). 
 
 
Figura 8: Trofozoítos de Acanthamoeba en medio de Page (Muestra 94). 
38 
 
 
Figura 9: Quiste de Acanthamoeba en medio de Page (Muestra 7). 
 
 
 
Figura 10: Quistes de Acanthamoeba en medio de Page (donde A nos 
muestra un trofozoíto en proceso de enquistamiento; nótese la doble pared 
de un quiste totalmente formado en B; muestra 45). 
 
 
 
A 
B 
39 
 
Según la morfología observada en cada una de las 100 muestras y los datos 
proporcionados por los pacientes se realizó la siguiente tabla. 
 TABLA 5. Resultados obtenidos mediante observación microscópica del cultivo de los lentes de contacto en medio de 
Page. [La tabla anteriormente mostrada cuenta con otros datos de utilidad como nombre del paciente, número de 
expediente clínico, domicilio y teléfono (en el caso de los positivos), fecha de cultivo de la muestra y un apartado de 
observaciones especiales]. 
MUESTRA DATOSCUNICOS DIAGNOSTICO 
Padente lemeninode l4anolde edad, operada de drugia relractiva (~ Ie l) , Utililó 101lentelde rontacto por una 
1 lemana, POlitivo (Ojo ilquierdo y derecho) 
Perlona lana de 44anolde edad uluaria de lentelde rontacto por mal de 11 ~oral d i a r i al d eld e aproximadamente 10 
4 • POlitivo Ojo ilquierdo y derecho anOI, 
Padente lemeninode 16anolde edad operada de drugia relractiva (IASEK), utilila lente de rontacto en ojo ilquierdo 
7 delde ~ a[e dOllemanal por delecto epitelial; actualmente prelenta edema rorn ea l, POlitivo 
B femenino de 47 anolde edad, no propoprdona maldatol, POlitivo (ojo derecho) 
Padentelemenino de ¡¡anolde edad operada de drugia relractiva (IASEK) el7 de leptiembre del 1008; utililó lentel 
15 de rontacto lolamente lOdial, POlitivo Ojo ilquierdo 
14 Padente lemeninode 59anolde edad, Utililó lentel de rontacto lolamnete llemana, POlitivo 
Padente lemeninode 1Oanolde edad operada de drugia relractiva (IASEK) en ojo derecho el dia 6 de octubre del 1008, 
II Utililó4dial el lente de rontacto, POlitivo 
4J Padente malWlino el cual utililó 101lentelde rontactodura nte 4dial, No ~ ay maldatol, POlitivo 
Padente malWlinoal cual le le d i agno~iro leuroma lecundarioa aOCelororneal, utililó el lente de rontactodura nte 4 
44 dial, POlitivo 
Padente malWlinode llanolde edad operadode drugia relractiva (IASEK) el dia J de noviembre del 1008, Utililó 101 
45 lentel15dial, POlitivo 
Padente malWlinode 55anolde edad uluariode lente de rontacto terapeutiro; prelenta 1 dia ron leerelion ocular y 
94 d i agno~irode ~i popi on , Utililó e~e lente de rontactodurante Jlemanal , POlitivo 
MU ESTR\ DATOSCUNICOS DIAGNOSTICO 
Padente femenino ~e l4 a n os~e e~a~, opera~a ~e drugia refractiva ( ~se l) . Utili ló los l e ntes~e contacto por una 
1 semana. Positivo (Ojo i l~ ui er~o y ~erecho) 
Persona ~na ~e 44anos~e e~a~ usuaria ~e lentes ~e contacto por mas~e 11 ~oras ~ i ari as~esde aprox imadamente 10 
4 • Positivo Ojo i l~ ui erdo y derecho anos. 
Padente femenino de 16anos ~e eda~ opera~a de drugia refractiva (IASEK), utili la lente de contacto en ojo i l~ ui erdo 
7 des~e ~a~ dos semanas por ~electo epitelial; actualmente presenta edema corn ea l. Positivo 
B feme nino de 47 anos de eda~, no propoprdona mas datos. Positivo (ojoderecho) 
Padente femenino de 18anosde eda~ opera~a de drugia relractiva (IASEK) el7 de septiembre del 1008; utili ló lentes 
15 de contacto solamente 10dias. Positivo Ojo i l~ ui erdo 
14 Padente lemeninode 59anos ~e eda~. Utili ló lentes de contacto solamnete 1 semana. Positivo 
Padente femenino de lDanos ~e edad operada de drugia relractiva (IASEK) en ojo derecho el dia 6 de octubre del 1008. 
11 Utili ló4dias el lente de contacto. Positivo 
41 Padente mas rulino el rual utili l610s lentes ~e rontacto ~ u ra nte 4dias. No ~ ay mas datos. Positivo 
Padente mascu lino al rual se le ~ i agno~i co leucoma serun ~ari oa abcesororneal. Utili l6 el lente de rontacto ~ ura nte 4 
44 ~ i as. Positivo 
Padente masru li no ~e llanosde e~a~ opera~o ~e drugia relractiva (IASEK) el dia 1 ~e noviembre ~e I 1OO8. Utili l610s 
45 lentes15dias. Positivo 
Padente mascu lino de 55 anos de eda~ usuariode lente de contacto terapeutico; presenta 1 ~ i a ron secresion crular y 
94 ~ i agno~ico ~e ~i popi on. Utili ló este lente de rontactodura nte 1 semanas. Positivo 
40 
 
Con el fin de comparar la morfología de nuestras muestras positivas con la estipulada 
en la literatura, se realizaron frotis en fresco observándose a 100X en microscopio 
estereoscópico la siguiente morfología: 
 
 
Figura 11: Frotis en fresco donde A nos muestra un trofozoíto 
de Acanthamoeba en proceso de enquistamiento (Muestra 2). 
 
 
 
Figura 12: Frotis en fresco de Acanthamoeba spp (en donde A nos muestra su 
vacuola contráctil, B la doble pared característica del quiste y C los acantopodios 
característicos del género, muestra 33). 
A 
A 
B 
C 
41 
 
A su vez se realizó el conteo y caracterización de 100 quistes de cada muestra positiva 
con el fin de evaluar si las características observadas coinciden con lo estipulado en la 
literatura para Acanthamoebas del grupo II las cuales son las principales causantes de QA. 
 
MUESTRA 96 
TAMAÑO 
(MICRAS) 
 
MORFOLOGÍA DEL QUISTE 
Nº de quistes con 
las mismas 
características 
10 Doble pared gruesa, refringente, estrellada con 6 opérculos 1 
10 Doble pared gruesa, refringente, hexagonal con 6 opérculos 3 
10 Doble pared gruesa, refringente, irregular sin opérculos 1 
10 Doble pared gruesa, refringente, pentagonal con 5 opérculos 6 
12 Doble pared gruesa, refringente, estrellada con 6 opérculos 4 
12 Doble pared gruesa, refringente, hexagonal con 6 opérculos 8 
12 Doble pared gruesa, refringente, Hexagonal con 5 opérculos 2 
12 Doble pared gruesa, refringente, irregular con 4 opérculos 1 
12 Doble pared gruesa, refringente, irregular sin opérculos 4 
12 Doble pared gruesa, refringente, ovoide sin opérculos 4 
12 Doble pared gruesa, refringente, pentagonal con 5 opérculos 23 
12 Doble pared gruesa, refringente, poligonal con 4 opérculos 1 
12 Doble pared gruesa, refringente, romboide con 4 opérculos 10 
12 Doble pared gruesa, refringente, trapecio con 4 opérculos 2 
14 Doble pared gruesa, refringente, estrellada con 6 opérculos 3 
14 Doble pared gruesa, refringente, hexagonal con 6 opérculos 8 
14 Doble pared gruesa, refringente, irregular con 3 opérculos 1 
14 Doble pared gruesa, refringente, irregular sin opérculos 1 
14 Doble pared gruesa, refringente, ovoide sin opérculos 2 
14 Doble pared gruesa, refringente, pentagonal con 5 opérculos 5 
14 Doble pared gruesa, refringente, romboide con 4 opérculos 5 
16 Doble pared gruesa, refringente, hexagonal con 6 opérculos 2 
16 Doble pared gruesa, refringente, irregular sin opérculos 1 
16 Doble pared gruesa, refringente, pentagonal con 5 opérculos 1 
16 Doble pared gruesa, refringente, romboide con 4 opérculos 1 
Tabla 6. Morfología de quistes de las muestras positivas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
42 
 
Para poder observar de mejor manera los organélos característicos de Acanthamoeba 
como vacuola contráctil, acantopodios, doble pared y opérculos; se realizó la tinción de 
Giemsa tanto a quistes como a trofozoítos. 
 
 Figura 13: Tinción de Giemsa para trofozoíto de Acanthamoeba (donde A nos muestra el núcleo teñido de color rosa; 
muestra 4) 
 - 
 
 
Figura 14: Tinción de Giemsa para las muestras 33, 43, 44 y 15; A, B, C y D respectivamente. (Se observa en A, B y D las 
múltiples formas que puede adoptar un trofozoíto de Acanthamoeba debido a la proyección de lobopodos además de los 
múltiples acantopodios. En C podemos observar un quiste con doble pared gruesa en forma de estrella con 4 opérculos 
característico del género Acanthamoeba). 
A 
C 
B 
D 
A 
43 
 
Debido a la gran afinidad del calcoflúor por los polisacáridos y a que los quistes de 
Acanthamoeba contienen gran cantidad de estos, se realizó la tinción de calcoflúor a las 
muestras positivas. 
 
 
 
 
Figura 15: Tinción de calcoflúor aplicada aquistes de Acanthamoeba [obsérvese que en D hay en el fondo trofozoítos los 
cuales no se tiñeron debido a que la tinción con calcoflúor es exclusiva para quistes. Muestras 44 (A), 24(B), 7(C) y 45(D)] 
 
 
 
 
 
 
 
A B 
C D 
44 
 
 Con el fin de evaluar si los Ag. con los que contábamos eran útiles para nuestro 
esquema de inoculación, se realizó una cuantificación de proteínas por el método de 
Bradford. Los Ag se obtuvieron de suero de donadores con diagnóstico positivo a EAG y a EAP 
respectivamente. 
 
Acanthamoeba castellani. 
POZO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 
D.O. 
curva 
patrón 0.007 0.028 0.063 0.09 0.142 0.181 0.224 0.249 0.263 0.291 
D.O. Ag 
de AC 0.899 0.842 0.721 0.572 0.427 0.283 0.191 0.122 0.077 0.043 
D.O. Ag 
de AC 
duplicado 0.934 0.836 0.721 0.585 0.415 0.296 0.196 0.142 0.092 0.087 
Tabla 7. Densidad óptica de Ac anti-Acanthamoeba castellani en suero de conejo. 
 
 
Figura 16. Gráfica para la obtención de concentración de proteínas de Ac anti-Acanthamoeba castellani en suero de 
conejo. 
 
[ ] De proteínas = 23 mg/ M 
 
45 
 
Naegleria fowleri. 
POZO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 
D.O. 
curva 
patrón 0.007 0.014 0.042 0.09 0.13 0.159 0.224 0.257 0.289 0.319 
D.O. Ag 
de Nf 0.904 0.827 0.729 0.593 0.389 0.241 0.177 0.121 0.052 0.022

Otros materiales