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“AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Acanthamoeba spp. EN LENTES DE CONTACTO DE USUARIOS DEL SERVICIO DE OFTALMOLOGIA DEL HOSPITAL GENERAL DE MÉXICO” T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO PRESENTA: JOSÉ LUIS PALACIOS SÁNCHEZ ASESORES: Dr. VICTOR MANUEL ZENDEJAS BUITRÓN Dr. JOSÉ LUIS TAPIA MALAGÓN Dr. LETICIA VAZQUEZ MAYA CUAUTITLAN IZCALLI ESTADO DE MÉXICO; 2010 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. II PÁGINA INDICE GENERAL. II ABREVIATURAS. IV INDICE DE TABLAS. VI INDICE DE FIGURAS. VII RESUMEN. IX 1 Introducción. 1 1.1 Generalidades de las amebas de vida libre. 1 1.2 Clasificación de Acanthamoeba. 2 1.3 Morfología y ciclo biológico de Acanthamoeba. 6 1.4 Patologías causadas por Acanthamoeba. 9 1.5 Mecanismos de patogenicidad. 12 1.6 Inmunología en las infecciones por Acanthamoeba. 13 1.7 Diagnóstico de las infecciones por Acanthamoeba. 14 1.8 Tratamiento de las infecciones por Acanthamoeba. 17 2.0 Justificación. 21 3.0 Hipótesis. 21 4.0 Objetivos. 22 4.1 Objetivo general. 22 4.2 Objetivos específicos. 22 5. Metodología 5.1 Obtención de la muestra. 5.2 Cultivo de la muestra. 5.3 Examen de los cultivos. 5.4 Interpretación de los resultados. 5.5 Tinciones y morfología quística. 5.6 Cuantificación de proteínas. 5.7 Esquema de inoculación. 5.8 Toma de muestra. 5.9 Realización de ELISA. 5.10 Obtención de suero con Ac 23 24 24 24 25 25 28 30 31 32 33 34 5.11 Inmunofluorescencia. 6. Resultados 37 III 7. Discusión 50 8. Conclusiones 56 9. Referencias 57 IV ABREVIATURAS A Acanthamoeba Å Símbolo de Ångström, unidad de longitud empleada principalmente para expresar longitudes de onda. AC Acanthamoeba castellani Ac Anticuerpo ACF Adyuvante completo de Freund Ag Antígeno AIF Adyuvante incompleto de Freund ANN Agar no nutritivo ATCC American Tipe Culture Collection AVL Amibas de vida libre °C Grados Celsius DNA Acido desoxirribonucleico DO Densidad óptica E. Escherichia EAG Encefalitis amibiana granulomatosa EAP Encefalitis amibiana primaria G Gravedades. H2SO4 Acido sulfúrico H-E Hematoxilina-Eosina IFI Inmunofluorescencia indirecta kDa Kilodaltons. LASEK Queratomileusis subepitelial asistida por laser; del ingles Laser Assisted Subepithelial Keratomileusis LCR Liquido cefalorraquídeo mL Mililitros m Micrómetros N. Naegleria Nf Naegleria fowleri nm Nanómetros http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%85ngstr%C3%B6m V PAS Acido peryódico de Schiff PBS Solución salina buffer de fosfatos PCR Reacción en cadena de la polimerasa pH Potencial de hidrógeno PHMB Poliheximetilbiguanida QA Queratitis amibiana rRNA Acido ribonucleico ribosomal SIDA Síndrome de inmunodeficiencia adquirida SNC Sistema nervioso central Spp. Especie no especificada Tx Tipo número x (puede ser del 1 al 12). VI ÍNDICE DE TABLAS. N° de tabla Título de la tabla Pagina Tabla 1 Curva patrón para la cuantificación de proteínas por el método de Bradford. 28 Tabla 2 Cuantificación de proteínas en sueros de donadores infectados con Acanthamoeba castellani y Naegleria fowleri respectivamente. 29 Tabla 3 Esquema de inoculación para Acanthamoeba castellani. 30 Tabla 4 Esquema de inoculación para Naegleria fowleri. 31 Tabla 5 Resultados obtenidos mediante observación microscópica del cultivo de los lentes de contacto en medio de Page. 39 Tabla 6 Morfología de quistes de las muestras positivas. 41 Tabla 7 Densidad óptica de Ac anti- Acanthamoeba castellani en suero de conejo. 44 Tabla 8 Densidad óptica de Ac anti-Naegleria fowleri en suero de conejo. 45 Tabla 9 Concentración de anticuerpos anti-Acanthamoeba castellani obtenida mediante el ensayo de ELISA. 46 Tabla 10 Concentración de anticuerpos anti-Naegleria fowleri obtenida mediante el ensayo de ELISA. 47 VII ÍNDICE DE FIGURAS. N° de figura Título de figura Pagina Figura 1 Árbol filogenético de Acanthamoeba, Naegleria y Balamuthia. 2 Figura 2 Aislados de las distintas especies de Acanthamoeba incluyendo su designación ATCC, secuencia, tipo y lugar donde fue aislada. 3 Figura 3 Trofozoíto de Acanthamoeba. 7 Figura 4 Quiste de Acanthamoeba 9 Figura 5 Queratitis Amebiana causada por Acanthamoeba 10 Figura 6 Diagrama de flujo de la metodología realizada. 23 Figura 7 Trofozoíto de Acanthamoeba en medio de Page. 37 Figura 8 Trofozoítos de Acanthamoeba en medio de Page. 37 Figura 9 Quiste de Acanthamoeba en medio de Page. 38 Figura 10 Quistes de Acanthamoeba en medio de Page. 38 Figura 11 Trofozoíto de Acanthamoeba en proceso de enquistamiento. 40 Figura 12 Frotis en fresco de Acanthamoeba spp. 40 Figura 13 Tinción de Giemsa para trofozoítos de Acanthamoeba. 42 Figura 14 Tinción de Giemsa para las muestras 33, 43, 44 y 15; A, B, C y D respectivamente. 42 Figura 15 Tinción de calcoflúor aplicada a quistes de Acanthamoeba spp de las muestras positivas. 43 Figura 16 Gráfica para la obtención de concentración de proteínas de Ac anti- Acanthamoeba castellani en suero de conejo. 44 Figura 17 Gráfica para la obtención de concentración de proteínas de Ac anti- Naegleria fowleri en suero de conejo. 45 VIII Figura 18 Gráfica para la obtención de la concentración de anticuerpos anti- Acanthamoeba castellani mediante el ensayo de ELISA. 46 Figura 19 Gráfica para la obtención de la concentración de anticuerpos anti- Naegleria fowleri mediante el ensayo de ELISA. 47 Figura 20 Inmunofluorescencia indirecta aplicada a trofozoítos de Acanthamoeba 48 Figura 21 Inmunofluorescencia indirecta aplicada a trofozoítos de Naegleria. 48 Figura 22 Inmunofluorescencia cruzada realizada para comprobar la presencia de Acanthamoeba spp. en las muestras positivas. 49 IX RESUMEN. Acanthamoeba spp, es un protozoario anfizoico perteneciente al grupo de las amebas de vida libre. Dicho protozoario cobra importancia médica debido a que bajo ciertas condiciones es causante de una enfermedad de tipo invalidante conocida como queratitis amebiana. La Queratitis Amebiana es una patología que afecta principalmente a los usuarios de lentes de contacto del tipo blando. Factores como la poca higiene de los lentes o el uso de soluciones salinas de conservación y limpieza caseras, favorecen la proliferación de la ameba y por lo tanto promueven la enfermedad. El número creciente de usuarios de lentes de contacto ha hecho indispensable contar con herramientas suficientes para un diagnóstico temprano, pero sobre todo para la prevención de la enfermedad. Con la finalidad de conocer el porcentaje de usuarios de lentes de contacto portadores de la ameba, así como evaluar la utilidad de pruebas diagnósticas comolas tinciones de Giemsa y calcoflúor y las pruebas de ELISA e IFI se aislaron muestras de 100 pacientes del servicio de oftalmología del Hospital General de México. El porcentaje de muestras positivas para Acanthamoeba spp. fue del 11%. Además se determino que la observación microscópica y la realización de las tinciones de Giemsa y calcoflúor son útiles como pruebas de diagnóstico presuntivo, las cuales pueden ser realizadas de manera rutinaria en la mayoría de los hospitales. Por otra parte ELISA e IFI nos son útiles como pruebas secundarias y confirmatorias de la enfermedad. A la par de estos resultados se recomienda el aseo rutinario de los lentes de contacto y no utilizar soluciones salinas de fabricación casera como principales métodos de prevención de la enfermedad. 1 1. INTRODUCCIÓN. 1.1 Generalidades de las Amebas de Vida Libre. Los protozoarios de los géneros Naegleria, Balamuthia, Acanthamoeba y Sapinnea; conforman un grupo denominado “Amibas de vida libre” (AVL), debido a su capacidad de permanecer en la naturaleza sin la necesidad de un hospedero intermediario para su supervivencia, transmisión o diseminación (32). Las AVL son organismos cosmopolitas, que están ampliamente distribuidas en la naturaleza ya que se han logrado aislar de distintas muestras; tanto de agua, como de suelo en todo el mundo (4). Se ha logrado aislar Acanthamoeba de diversos tipos de muestras de suelo, polvo, aguas residuales, agua embotellada, agua de mar, agua tratada, agua de grifo, agua de escusados, agua de lavaojos, albercas, equipos de diálisis, aire, unidades de aire acondicionado, unidades dentales, tierra de plantas de ornato y a su vez de distintos tipos de plantas, soluciones de mantenimiento de lentes de contacto y de los mismos lentes de contacto, en especial los del tipo blando; además de que muchas veces son contaminantes de diversos cultivos celulares. También se ha logrado aislar Acanthamoeba del ser humano en pacientes de todo el mundo de órganos como el cerebro, cerebelo, pulmones, córnea, lesiones cutáneas y fosas nasales, tanto en personas aparentemente sanas como en personas con alguna patología. Además también se ha aislado de otros mamíferos como jabalíes, peces, anfibios y reptiles (13, 26, 31, 37). Dichos protozoarios cobran importancia médica, debido a que a condiciones aún desconocidas pueden comportarse como endoparásitos, tanto del ser humano como de otros mamíferos, por lo cual también son conocidos como organismos anfizóicos (32). 2 1.2 Clasificación de Acanthamoeba. Acanthamoeba fue descrita por primera vez por Castellani cuando reportó la presencia de una amiba en cultivos de Cryptococcus pararoseous; posteriormente el género fue establecido por Volkonski en 1931 (13). El género Acanthamoeba, se encuentra ubicado dentro del Reino Protista, Filo Amoebozoa; clase Lobosea, subclase Gymnamoebia orden Acanthopodia; Familia Acanthamoebidae; Género Acanthamoeba (9). Un segundo género, Balamuthia anteriormente ubicado en otra familia de amibas con las cuales tenía ciertas afinidades recientemente también ha sido ubicado en esta familia, ya que ambos géneros poseen la capacidad de causar la misma enfermedad (EAG) (1, 5). Figura 1: Árbol filogenético de Acanthamoeba, Naegleria y Balamuthia. 3 Las especies de este género son A. astronyxis*,A. castellanii*, A. commandoni, A. culbertsoni*, A. divionensis, A. echinulata A. griffini, A. hatchetti*, A. healyi, A. jacobsi, A. lenticulata, A. lugdunensis*, A. mauritaniensis, A. palestinensis*, A. pearcei, A. polyphaga*, A. pustulosa, A. quina*, A. rhysodes*, A. royreba, A. stivensoni, A. terrícola, A. triangularis y A. tubiashi; de las cuales las que se encuentran marcadas con asterisco son consideradas patógenas para el ser humano (13). ESPECIE TIPO DE CEPA CLASIFICACION GRUPO LUGAR DE DONDE SE AISLO A. astronixis 30137 T7 I Agua A. castellanii 30011 T4 II Cultivo de levaduras A. commandoni 30135 T9 I Jardín A.culbertsoni 30171 T10 III Cultivo celular de riñón de mono A. divionensis 50238 ____ II Tierra A. echinulata 50239 ____ I Composta A. griffini 30731 T3 II Muestra de agua de mar A. hatchetti 30730 T11 II Sedimento A. healyi CDC:1283:V013 T12 III Tejido cerebral A. jacobsi 30732 ____ III Sedimento marino A. lenticulata 30841 T5 III Agua de alberca A. lugdunensis 50240 T4 II Alberca A. mauritaniensis 50253 T4 II Alcantarilla A. palestinensis 30870 T2 IIII Suelo A. pearcei 50435 T3 I Aguas residuales A. poliphaga CCAP1501/3ª T4 II Estanque A. pustulosa 50252 T2 III Piscina A quina 50241 ____ II Agua de alberca A. rhysodes 30973 T4 II Suelo A. royreba 30884 T4 III Células humanas con carcinomas A. stivensoni 50438 T11 II Mariscos A. triangularis 50254 T4 II Heces humanas A. tubiashi 30867 T8 I Agua de río Figura 2: Aislados de las distintas especies de Acanthamoeba incluyendo su designación ATCC, secuencia, tipo y lugar donde fue aislada [modificados de (13)]. 4 La identificación de Acanthamoeba como género es relativamente sencilla, debido a que es la única AVL que posee pequeños lobopodos o proyecciones citoplasmáticas llamadas acantopodios cuando esta en fase de trofozoíto. Sin embargo, usando criterios morfológicos para la diferenciación y clasificación de especies se presentan muchos problemas (5). Acanthamoeba spp ha sido dividido en tres grupos morfológicos (I, II y III) basados en el tamaño y forma del quiste (15, 32). Las especies del grupo uno fueron designadas teniendo en cuenta el mayor tamaño del quiste en comparación con las especies de los otros dos grupos. Las especies del grupo II fueron clasificadas con base en que poseen una capa externa arrugada llamada exoquiste y una capa interna llamada endoquiste la cual puede ser triangular, estrellada, oval o poligonal. Las especies del grupo III son aquellas que poseen un exoquiste delgado y liso alrededor del endoquiste que es redondo (1, 9, 15). No obstante, la clasificación de Acanthamoeba basada en las características morfológicas del quiste no nos proporciona datos confiables, ya que dicha morfología cambia según las condiciones del cultivo en el que se encuentren (30, 31). Se han aplicado criterios inmunológicos, bioquímicos y fisiológicos para la identificación de las distintas especies de Acanthamoeba, sin embargo se ha observado que muchas especies comparten los mismos determinantes antigénicos. Por consiguiente las aproximaciones inmunológicas obtenidas por inmunoelectrotransferencia e inmunofluorescencia han sido inconclusas y de poca utilidad para la identificación de especies (10, 13). Los ensayos enzimáticos por electroforesis, muy útiles en otros organismos, muestran mucha variación entre las cepas de mismas especies y similitudes entre cepas de diferentes especies, incluso se ha demostrado que los tipos enzimáticos cambian cuando los aislados se cultivan en diferentes condiciones de laboratorio (15, 31). 5 Es por eso, que con el fin de establecer un esquema de clasificación más claro, se han llevado acabo diversos estudios moleculares, desarrollando esquemas de clasificación basados en la secuencia de los genes nucleares de rRNA, logrando así obtener 4 tipos o subgéneros (14, 34). En 1998, Stothard y colaboradores utilizaron dichos estudios moleculares para clasificar 53 aislados de Acanthamoeba los cuales fueron agrupados en 12 tipos, basados en la secuencia de rDNA y designándolos desde T1 hasta T12 teniendo en cuenta que secuencias distintas pueden existir y por lo tanto ser más de 12 (13, 14, 32). Una vez que se tuvieron los 12 tipos, se realizó un acoplamiento de estos con los esquemas morfológicos propuestos por Pussard y Pons de cada uno de los aislados, logrando así obtener un cierto grado de concordancia y obteniendo 3 grupos (13). En el grupo I fueroncolocadas las secuencias de tipo T7, T8 y T9; en el grupo II los tipos T3, T4 y T11; en el grupo III los tipos T1, T2, T5, T6, T10 y T12. Los estudios realizados de aislados de casos clínicos de QA que fueron identificados mediante su secuencia de rRNA, revelan que la mayoría de las cepas causantes de esta enfermedad pertenecen a T4 y por lo tanto al grupo II (18, 31). Posteriormente, Chung extrajo DNA genómico, y lo amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los resultados obtenidos coinciden con los esquemas de clasificación morfológica propuestos por Pussard y Pons y con la clasificación realizada por Stothard; obteniendo por lo tanto la clasificación de especies de Acanthamoeba más aceptada hasta la fecha, aunque cabe mencionar que la clasificación taxonómica de Acanthamoeba está en constante cambio (10, 15, 18, 29). 6 1.3 Ciclo biológico y morfología. Acanthamoeba es una amiba que presenta dos estadios dentro de su ciclo biológico, la fase de quiste y la de trofozoíto (4). El trofozoíto es la fase móvil de la amiba, tiene un tamaño promedio de 20 a 45 m; presenta proyecciones finas llamadas acantopodios (que dan nombre al género) las cuales no presentan los otros géneros de AVL. Dichas proyecciones se encuentran por toda la superficie de la amiba, miden entre 1 y 2 m y están constituidas por citoplasma hialino que excluye a los organelos, solo presentan partículas de glucógeno, algunos ribosomas libres y vesículas pequeñas (16, 31). Para desplazarse, Acanthamoeba presenta proyecciones hialinas llamadas pseudópodos o lobopodos, los cuales son de gran tamaño y pueden presentarse en cualquier dirección (6). El desplazamiento es lento en comparación con el resto de las AVL (32). Si se observa el trofozoíto en un microscopio electrónico, se puede distinguir una membrana plasmática con disposición trilaminar de 70 a 90 Å de espesor, además de que es asimétrica; la lámina externa es ligeramente más gruesa que la interna. Contiene todos los organélos característicos de los eucariontes; presenta un aparato de Golgi conformado por 2 o más grupos de cisternas localizadas en las regiones polares. Dicho aparato, está íntimamente relacionado con el núcleo el cual es de forma circular y con un diámetro de 7 a 10 m, además de que éste contiene un nucléolo central con un diámetro de 2 a 4 m. El retículo endoplásmico rugoso rodea al núcleo. El retículo endoplásmico liso es escaso y consta básicamente de vesículas. La mayoría de los ribosomas se encuentran libres en el citoplasma, junto con los gránulos de glucógeno. La reproducción ocurre mediante fisión binaria. Las mitocondrias son de diferentes tamaños, ya sean esféricas, ovaladas, en forma de copa o de campana (13, 32). 7 Generalmente todas las especies de Acanthamoeba contienen un solo núcleo, aunque puede haber amibas multinucleadas cuando Acanthamoeba es mantenida en un cultivo en suspensión (13). Acanthamoeba presenta vacuolas contráctiles las cuales regulan la presión osmótica y descargan su contenido en periodos cortos, además también tiene vacuolas digestivas fácilmente observables en un microscopio de luz (11). El trofozoíto se nutre básicamente de bacterias que se encuentran en el ecosistema que habitan, aunque también se pueden alimentar de pequeñas algas y levaduras (4, 31). La forma en que se alimenta la amiba, consiste en la formación de pseudópodos alrededor de la materia, para después alimentarse mediante el proceso de fagocitosis; o bien mediante la formación de copas fagocíticas y la ingestión de la materia en particular. Dichas copas fagocíticas formadas en la superficie de la amiba son estructuras temporales que desaparecen una vez que han cumplido con su misión de ingerir bacterias, algas, levaduras o células (4, 11). Figura 3. Trofozoíto de Acanthamoeba( donde A nos indica el núcleo; B nos muestra un acantopodio característico del género y C= vacuola contráctil). La etapa quística es la fase inactiva de la amiba y es la base inicial para la caracterización del género Acanthamoeba. Su tamaño varía de 11 a 20 m según la especie (7). A C B 8 La formación del quiste va precedida de cambios morfológicos y funcionales de los organélos citoplasmáticos del trofozoíto (13). La pared del quiste contiene celulosa, lo cual le confiere parte de su resistencia (33). Al microscopio electrónico se ha podido observar que durante el proceso de enquistamiento el trofozoíto se redondea, el retículo endoplásmico se alarga y se organiza en círculos concéntricos que rodea a las mitocondrias y al núcleo, además; aumenta el número de vacuolas lipídicas y se distribuyen de manera individual o en agregados (13, 32). El quiste está conformado por una pared doble, la pared externa es conocida como exoquiste; es generalmente redondeada y arrugada, mientras que el endoquiste muestra una disposición triangular, poligonal o estrellada. Las dos paredes parecen estar separadas entre sí a lo largo del perímetro celular por una zona fibrilar, y solo se unen en ciertas zonas angulares del endoquiste. En esas zonas de contacto, se forman poros con bordes circulares llamados opérculos (31, 33). La formación del quiste ocurre cuando las condiciones del medio son adversas; falta de alimento, cambios de temperatura, cambios de pH o desecación, ya que los quistes son capaces de resistir dichas condiciones adversas, además incluso pueden tolerar cloración del agua y un amplio espectro de agentes antimicrobianos, pueden resistir temperaturas de 0°C siendo que la temperatura óptima para su crecimiento es de 36 °C (7). Villemez y colaboradores han reportado que un anticuerpo específico a una proteína de la membrana está relacionado con el proceso de enquistamiento (31). A su vez Mazur demostró que el quiste mantiene viable a la amiba durante 24 años al almacenarse en agua a 24 °C (33), además de que demostró que dichas amibas mantienen su capacidad patogénica, utilizando 17 aislados de A. poliphaga o A. castellanii e inoculándolos en agar no nutriente enriquecido con bacterias. De los 17 aislados 14 lograron desenquistarse; los cuales posteriormente fueron inoculados vía intranasal en ratones. A su vez también se inocularon 14 ratones vía intranasal, pero con aislados recientes para comprobar si el tiempo influye en la patogenicidad de la amiba. Los aislados con 24 años de antigüedad registraron menos 9 muertes que los aislados recientes; lo cual demostró que al paso del tiempo la virulencia de la amiba va en declive en comparación con las cepas aisladas recientemente. En contraparte, se ha demostrado que mediante la utilización de freón u oxido de metileno o por utilización de autoclave se pueden destruir los quistes (13, 33). El desenquistamiento ocurre cuando las condiciones del medio en el que se encuentre la amiba son nuevamente favorables (4). Figura 4. Quistes de Acanthamoeba (en donde po= poro u opérculo; ec= ectoquiste y en = endoquiste). 1.4 Patología. Acanthamoeba, afecta principalmente SNC, ojos piel y pulmones (1,19). Las lesiones cerebrales producidas por este género de AVL junto con las de Balamuthia mandrillaris se conocen como encefalitis amibiana granulomatosa (EAG), ya que el daño en el SNC se caracteriza por necrosis hemorrágicas, granulomas, trombos de fibrina e inflamación (13, 20). Esta enfermedad es considerada de avance lento, prolongado y oportunista, aunque también se puede presentar en individuos totalmente sanos (20, 31). Las infecciones cutáneas producidas por Acanthamoeba se presentan principalmente en individuos con SIDA y pueden estar relacionadas o no con patología del SNC; aunque también han sido bien documentadas infecciones en individuos que están bajo un tratamiento de inmunosupresión para un trasplante de órganos o en personas con enfermedades 10 inmunológicas(13, 31). Las lesiones son nódulos eritematosos indurados o ulceras de la piel (17). Cabe mencionar que la tasa de mortalidad reportada para individuos con lesiones cutáneas pero sin afección del sistema nervioso central es del 73%; pero para individuos con lesiones cutáneas y afección de SNC es del 100% (35). Acanthamoeba también afecta a individuos inmunológicamente sanos. La patología producida por Acanthamoeba en individuos inmunocompetentes es la Queratitis Amebiana (24). Esta se caracteriza por opacidad de la córnea, posteriormente se infiltra al estroma causando una inflamación severa; se observa hiperemia de la conjuntiva, inflamación córneal y escleritis (21, 26). Los síntomas que sugieren QA incluyen un intenso dolor en el ojo con lagrimeo y fotofobia, ojo rojo, irritación, opacidad de la córnea, ruptura y pérdida del epitelio córneal, infiltrados perineurales, visión borrosa y anillo córneal; este último junto con el intenso dolor son la principal característica clínica que sugiere queratitis producida por Acanthamoeba (24, 26). Figura 5: Queratitis causada por Acanthamoeba 11 Los trofozoítos pueden alcanzar los nervios de la córnea y causar neuritis y necrosis. En raras ocasiones, Acanthamoeba puede diseminarse de la córnea a la retina causando corioretinitis (21). Los primeros casos de QA se observaron en el Reino Unido y Estados Unidos en la década de los años 70. En 1973 se informo del primer caso bien documentado de QA donde el afectado fue un paciente de sexo masculino de 41 años de edad del sur de Texas, con antecedentes de traumatismo córneal y exposición a agua contaminada (32, 37). En 1975 Nagington informó de 2 casos en la Gran Bretaña en los cuales la amiba produjo una ulceración crónica y progresiva de la córnea en el primero de los casos, el segundo fue sometido a una extirpación quirúrgica del ojo afectado. En el primer caso la especie aislada fue A. poliphaga y en el segundo de los casos fue A. castellanii (32). A mediados de 1980 ocurrió una epidemia de QA originada por el auge que cobró el uso de lentes de contacto en esa época, además de la poca higiene de los mismos (21). Acanthamoeba ha sido aislada de lentes de contacto, sobre todo de los llamados blandos, además de que también se ha aislado de sus estuches y de soluciones salinas elaboradas para su mantenimiento y limpieza (16). Es por eso, que se ha reconocido que el principal factor de riesgo para contraer QA es el uso de lentes de contacto (36). A su vez, las condiciones que promueven la enfermedad son el uso de soluciones salinas de preparación casera, la mala o escasa higiene de los lentes de contacto y pequeñas abrasiones cornéales (13, 36). En las soluciones oftálmicas mal manejadas o mal conservadas pueden proliferar bacterias que constituyen una buena fuente de nutrición para las amibas (21). También existen casos de QA en personas no usuarias de lentes de contacto, en este caso, el individuo contrae la enfermedad al entrar en contacto con agua contaminada con la amiba, la cual se introduce a la córnea a través de una pequeña lesión o abrasión la cual existía con anterioridad aunque también puede atravesar el epitelio córneal intacto (36). Las especies más comunes causantes de esta enfermedad son A. polyphaga y A. castellani; aunque son varias las especies de Acanthamoeba las que pueden causar QA, 12 entre ellas A. hatchetti, A. culbertsoni, A. rhysodes, A. griffini, A. quina, A. lugdunensis (13). El periodo de incubación es de días y en general se afecta solo un ojo. No se ha descrito diseminación al SNC por esta vía (24). 1.5 Mecanismos de patogenicidad. A pesar de los númerosos estudios que se han realizado para conocer los factores de virulencia, no se conocen a ciencia cierta las determinantes bioquímicas causantes de enfermedad; aunque es bien sabido que factores como las propiedades de adherencia, los productos citolíticos producidos por la ameba, la tolerancia a temperaturas extremas y los mecanismos de evasión de la respuesta inmunitaria son importantes (12, 32). La virulencia de cepas patógenas disminuye en cultivos continuos en medios axénicos, pero se restablece mediante pases sucesivos en cerebro de ratón, lo cual sugiere que la virulencia está más bien relacionada con determinantes genéticos o fisiológicos (13). La adherencia a las células del epitelio córneal, seguida de una lesión e invasión del tejido, parecen ser uno de los factores más importantes para que se establezca la infección; ya que por ejemplo; A. castellanii se adhiere a glicoproteínas de la superficie de células epiteliales que contienen manosa, proceso mediado por una proteína de superficie de 136 kDa presente en la membrana de los trofozoítos (13). La adherencia de Acanthamoeba a las células de la córnea se puede inhibir con manosa o metilmanosa, pero no con otros azúcares (22). Estudios con anticuerpos monoclonales que reconocen diferentes epítopos de la membrana celular del epitelio, sugieren la presencia de más de una molécula de adhesión en la membrana del trofozoíto; una vez adherida a las células invade el tejido y eventualmente lo destruye (32). Los glicolipidos presentes en el epitelio córneal juegan un papel muy importante para la adherencia de Acanthamoeba a la córnea. Se han realizado estudios “in vitro” en los que se ha demostrado que Acanthamoeba tiene una gran afinidad para adherirse al colágeno. Se piensa que el daño provocado en células y tejidos se debe a fenómenos de fagocitosis y a sustancias citotóxicas producidas por la amiba, ya que una vez adherida al 13 epitelio córneal esta se alimenta de las células del epitelio lo cual genera abrasión y destrucción del tejido (12, 22). Las fosfolipasas son muy activas en cepas virulentas de Acanthamoeba, a diferencia de las cepas no virulentas. Algunos autores suponen que estas promueven la desmielinización del tejido cerebral. Otro tipo de enzimas líticas que pudieran contribuir de manera importante a la patogenia son las proteasas. Este tipo de enzimas pueden encontrarse en la membrana o ser secretadas y causar el efecto citolítico directo de las amibas (12). Estudios realizados por Mitro utilizando una cepa de Acanthamoeba poliphaga ATCC 30461 revelan que dicha cepa segrega múltiples serina proteasas, metalo proteasas y cisteína proteasas, las cuales sirven para degradar colágeno el cual es uno de los principales componentes del estroma córneal. Cabe mencionar que se ha demostrado que las serina proteasas tienen efecto citopático en células del epitelio córneal y fibroblastos (13). Acanthamoeba culbertsonii contiene altos niveles de elastasa, la cual degrada tejido conectivo (12). 1.6 Inmunología en las infecciones por Acanthamoeba. No se sabe bien como opera el sistema inmunitario en las infecciones por Acanthamoeba. En lo que se refiere a EAG, al parecer la exposición es un fenómeno común ya que se han detectado anticuerpos contra dicha amiba en sueros de individuos asintomáticos y aparentemente sanos. Tampoco se sabe si la presencia de anticuerpos se debe a infecciones leves, las cuales estimularían una respuesta inmunitaria que eventualmente eliminaría al parásito (32). La protección contra infecciones letales puede involucrar a la inmunidad innata y a la adquirida. Los factores de resistencia innata y el complemento podrían ser parte de la primera línea de defensa del hospedero contra la invasión del organismo, ya que este último puede eliminar al parasito mediante lisis (12, 32). 14 Se ha demostrado que a pesar de que la gran mayoría de los individuos que sufren de QA son personas inmunocompetentes, estos no desarrollan inmunidad protectora, por lo cual puede haber reinfección (12). 1.7 Diagnóstico. Para el diagnóstico de laboratorio de Acanthamoeba en pacientes que presentan síntomasde EAG, se incluye la observación directa al microscopio del sedimento de líquido cefalorraquídeo (LCR) realizando un fresco en el cual podemos observar los trofozoítos a 40X en el microscopio óptico, aunque cabe la posibilidad de confundir estos con macrófagos. También se puede realizar un frotis del LCR, fijarlo con metanol y teñir con Giemsa-Wright, aunque la tinción mas recomendada para evitar confundir los trofozoítos con macrófagos debido a la falta de experiencia es la tinción tricrómica o la de Hematoxilina-Eosina (13, 32). Otro método diagnóstico utilizado es el cultivo “in vitro”; en medio de crecimiento para amibas, el cual generalmente es en agar no nutritivo (medio de Page) inoculado con una capa de Escherichia coli o Enterobacter aerogenes (30). También se pueden utilizar cultivos celulares de mamíferos como medio de crecimiento (13). El diagnóstico histológico está basado en cortes finos de cerebro o biopsias de lesiones cutáneas incluidos en parafina y teñidos con H-E (31). Para la observación del quiste se han empleado técnicas de tinción como la del acido peryódico de Schiff (PAS), la técnica de Gomori-plata-metenamina o la tinción de calcoflúor (4). Para el diagnóstico de infecciones cutáneas la metodología es básicamente la misma que para EAG agregando que para este tipo de patología se puede utilizar un medio de cultivo liquido (generalmente medio de Chang) obteniendo la muestra de lesiones cutáneas (13). El diagnóstico temprano de QA es fundamental para el curso que seguirá la enfermedad. Dicho diagnóstico es difícil, principalmente porque las características clínicas de la enfermedad se confunden con otras patologías más frecuentes como queratitis fúngica, 15 infecciones por Pseudomonas aeruginosa o queratitis atípica causada por herpes simplex. Además el diagnóstico se complica cuando se presentan infecciones bacterianas secundarias (2, 3). Se debe de considerar realizar un estudio sugestivo de QA cuando no se responde a los tratamientos antibacterianos (21). El método diagnóstico ideal y más efectivo hasta el momento es el aislamiento, cultivo e identificación de las amibas en muestras de raspados o biopsias cornéales (35). Es importante que el diagnóstico sea rápido y acertado porque en las etapas crónicas de la infección los trofozoítos llegan a enquistarse y los quistes son más resistentes a los fármacos que los trofozoítos (2). Una vez que se tiene el raspado o biopsia córneal, este se debe de inocular en un agar no nutritivo el cual contenga E. coli o Enterobacter aerogenes, las cuales servirán de alimento para la ameba. Preferentemente la muestra debe ser sembrada en el mismo lugar donde se tomo, pero si ésta debe de ser llevada a otro sitio se transportara en un frasco con solución de Page. Las placas de ANN (agar no nutritivo) inoculadas con la muestra, deberán de ser incubadas a temperaturas de 28 a 35 °C durante un lapso no menor a 10 días, tiempo aproximado durante el cual se logrará el desenquistamiento. Un inconveniente es que generalmente la muestra contiene bacterias o levaduras, las cuales confunden el diagnóstico (13, 30). El diagnóstico citológico se basa en diversos métodos de marcado; la realización de inmunofluorescencia indirecta (IFI) es uno de ellos, en el cual mediante una reacción antígeno anticuerpo se detecta a la amiba en raspados o biopsias de córnea (28). También se puede utilizar blanco de calcoflúor, el cual muestra afinidad por los polímeros de polisacáridos presentes en los quistes de las amibas: Al utilizar calcoflúor se tiñe la pared del quiste de color azul brillante fluorescente, efecto que dura durante un tiempo prolongado. El calcoflúor blanco también es útil para la observación de muestras de tejido o raspados cornéales incluidos en parafina (38). La tinción con naranja de acridina también es un método confiable 16 y fidedigno para el diagnóstico citológico además de las tinciones mencionadas anteriormente para EAG (28). En usuarios de lentes de contacto, Acanthamoeba también puede ser aislada de los lentes, de sus estuches de contención o de las soluciones limpiadoras si el raspado córneal ha sido negativo aunque un diagnóstico positivo de cualquiera de estas muestras no confirma una afección por Acanthamoeba aunque si lo sugiere en gran medida (21). Un problema grave es la falta de conocimiento del personal médico sobre la enfermedad, lo cual puede conducir a un diagnóstico erróneo que retrase el tratamiento adecuado y por lo tanto cause la pérdida total de la visión o hasta la enucleación en casos extremos. Se han realizado estudios retrospectivos de casos en los cuales existe patología de la córnea y hay síntomas que sugieren que Acanthamoeba es la causante. En el 73% de estos casos se logro aislar Acanthamoeba, que en su tiempo no fue diagnosticada (2). La utilización de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa en tejidos infectados mediante anticuerpos específicos contra Acanthamoeba y la microscopía electrónica de transmisión han dado buenos resultados en la investigación científica pero su aplicación clínica es casi nula. Cabe mencionar que IFI es solo útil en la identificación de género pero no de especie (28). Otra técnica aplicada a la investigación en el diagnóstico de género es la reacción en cadena de la Polimerasa. Esta técnica es tan sensible, que si tuviéramos solamente 10 células de Acanthamoeba estas podrían ser detectadas y por lo tanto este método también ha sido utilizado para el diagnóstico clínico de QA. Por otro lado investigadores como Lemman han reportado el uso de PCR para detección de Acanthamoeba en QA con tan solo de 1 a 5 amibas. Además, sugiere que este método no solo es útil para el diagnóstico, sino también para evaluar y monitorear la respuesta del tratamiento (3, 13). Un método prometedor para la detección de QA es la hibridación in situ, método que utiliza sondas especificas de género o secuencias tipo (T4). Hasta la fecha se han utilizado sondas de tipo T4 debido a que la mayoría de las especies de Acanthamoeba que causan QA son de secuencia tipo T4. Los resultados pueden ser obtenidos 1 ó 2 días después, a diferencia 17 de los métodos de cultivo en los cuales debemos de esperar semanas; sin embargo si los resultados obtenidos por este método son negativos, es necesario confirmar este resultado con cultivo en ANN (3). También se han utilizado pruebas de inmunodiagnóstico para la detección de Acanthamoeba como la citometría de flujo, aunque dicho método no está estandarizado (20). Finalmente, númerosos investigadores han reportado que un método no invasivo de diagnóstico de queratitis amebiana es el escaneo de córnea mediante microscopía confocal. El método consiste en la visualización de imágenes de alto contraste en las cuales se pueden distinguir tanto quistes como trofozoítos que se encuentren en la córnea. Dichas imágenes son grabadas y reproducidas en un monitor (21). En resumen, podemos decir que lo más importante en el diagnóstico de enfermedades producidas por Acanthamoeba es el diagnóstico oportuno ya que si este se da, el pronóstico de recuperación del paciente es bueno; sobre todo en la QA (2). 1.8 Tratamiento. En lo que se refiere a la EAG, un buen número de agentes antimicrobianos y extractos de plantas han demostrado su eficacia contra estas amibas en estudios “in vitro”, sin embargo; no existe la seguridad de que la misma droga sea efectiva clínicamente en individuos con EAG. Entre las drogas que se han utilizado se encuentran la anfotericina B, azitromicina, fluconazol, ketokonazol, pentamidinas, paramomicinas, polimixinas, trimetropin con sulfametoxazol, rifampicina y sulfadiazina, además de extractos de plantas medicinales (6, 13, 31). El tratamiento para lesiones cutáneas producidas por Acanthamoeba no está bien definido. Se han probado diversascombinaciones de tratamientos, pero la mayoría de los pacientes han muerto; además si también se lleva acabo diseminación a SNC la probabilidad de eficacia disminuye severamente a casi nula. Existen reportados algunos casos de 18 tratamiento exitoso en los cuales se han utilizado itraconazol, 5-fluorocitocina, gluconato de clorhexidina tópico y ketoconazol en crema. Entre las combinaciones de fármacos con resultado exitoso para lesiones cutáneas existe el tratamiento con fluconazol y sulfadiazinas (17,19). En el caso de la QA por ser difícil y confuso el diagnóstico, el tratamiento generalmente comienza tarde, lo cual lleva a la pérdida total de la visión del ojo infectado con Acanthamoeba. El pronóstico es mejor si el diagnóstico es oportuno, esto es cuando Acanthamoeba apenas empieza a envolver el epitelio córneal. Cuando se ataca al organismo infeccioso en esta etapa, este se puede remover mediante tratamiento tópico. Si no hay diagnóstico oportuno, Acanthamoeba invade la córnea y en estos casos la terapia puede durar de varios meses a un año o un poco más, lo cual puede ser perjudicial ya que en casos aislados se desarrolla resistencia a ciertas drogas (2). Otro problema es que el tratamiento no se lleve acabo durante el tiempo necesario o no sea el adecuado, lo cual desencadena la reincidencia de la enfermedad, ya que los quistes de Acanthamoeba son resistentes a un gran número de fármacos. Los fármacos que son efectivos en los inicios de la enfermedad, no son efectivos una vez que la amiba ha invadido los tejidos debajo de la córnea (24, 32). Estudios in vitro han demostrado la efectividad de ciertos fármacos en diversos aislados de pacientes con QA. Los aislados fueron crecidos en ANN con E. coli durante 1 semana, lavados e incubados en distintas diluciones de drogas amebicidas durante 48 horas. Después se determino la concentración mínima quisticida colocando nuevamente la solución de los aislados en ANN para favorecer el crecimiento amebiano y observando que no hubiera crecimiento de trofozoítos ni quistes durante 1 semana. Así, investigadores como Wright reportaron tratamientos efectivos para QA utilizando 0.1% de isotianato de propamidina tópico con 0.15% de dibromopropamidina, aunque este tratamiento solo es efectivo en los inicios de la infección. Estudios como este han demostrado que las biguanidas son los 19 fármacos más utilizados con resultados excelentes, tanto contra las formas tróficas como las quísticas. La poliheximetilbiguanida (PHMB), que es elaborada por “Zeneca Pharmaceuticals” y manufacturada como desinfectante con el nombre de Bacuacil, ha demostrado una notable actividad amebicida para un gran número de cepas, aunque cabe mencionar que PHMB no cuenta con licencia para uso médico, por lo cual solo es utilizada “in vitro”. Una combinación de digluconato de clorhexidina con PHMB, o con aminas aromáticas semejantes a la hexamidina, pentamidina o isiotonato de propamidina han sido reportadas para el tratamiento para QA. Por otro lado PHMB utilizado solo, no reporta toxicidad alguna; en cambio en combinación con algunos otros compuestos muestra efectos adversos. Existen reportes de casos en los que se relaciona el uso de gluconato de clohexidina tópico durante 8 semanas con queratitis ulcerativa (13, 32). Otros estudios han demostrado que la administración tópica de clorhexidina y propanamina surten efecto cuando son administrados durante largos periodos en pacientes con QA; sin embargo la propanamina no es recomendada para todos los pacientes debido a que se ha demostrado que en algunos de ellos el uso de este fármaco provoca anormalidades en la córnea cuando se utiliza por periodos prolongados (13). También se han utilizado los azoles en el tratamiento de QA como miconazol o fluconazol (25). Los corticosteroides en combinación con agentes terapéuticos han sido utilizados para el tratamiento de QA, sin embargo aunque el uso de estos reduce la inflamación, su utilización debe de restringirse lo mayor posible, ya que estudios “in vitro” e “in vivo” en animales de experimentación han demostrado que el uso de corticoesteroides semejantes a dexametasona incrementan la patogenicidad de la amiba. Un experimento realizado en hamsters mostró que la QA fue más grave en los que fueron tratados con dexametasona que en los hamsters no tratados. Adicionalmente, en un estudio realizado en conejos, se observó que al administrarles a estos corticoesteroides resultaba perjudicial (13). 20 También se ha estudiado la actividad amebicida de diferentes alquilfosfocolinas. La Hexadecilfosfocolina ha demostrado llevar acabo lisis de Acanthamoeba in “vitro” en una hora, sin embargo este compuesto aún se encuentra en fase de experimentación (31). Hay medicamentos cuyo efecto amebicida es variable, de modo que es importante incluir en el tratamiento medicamentos que actúen tanto contra la forma de trofozoíto como contra la forma quística, ya que mientras no se eliminen los quistes la infección puede reincidir (4). Además, es necesaria la investigación y búsqueda de nuevos agentes terapéuticos debido a que antibióticos que anteriormente eran efectivos, hoy en día no tienen efectos positivos debido a que Acanthamoeba ha generado resistencia en contra de ellos. Dicha resistencia, aparentemente es causada por la pared del quiste (2). Cuando el paciente no responde satisfactoriamente al tratamiento farmacológico ni al quirúrgico (trasplante de córnea) se tiene que llevar a cabo la enucleación del ojo. (24). Algunos investigadores sugieren realizar una queratoplastia penetrante cuando existe perforación de la córnea, sin embargo el uso de este método en el tratamiento de QA está en debate; si el avance de la QA es menor a 6 semanas no es necesaria la utilización de este método, en cuyo caso; de no existir una respuesta adecuada al tratamiento se utilizará como último recurso (21). 21 2. JUSTIFICACIÓN. Las amebas del género Acanthamoeba son protozoarios ampliamente distribuidos en la naturaleza, a excepción de las zonas extremadamente frías, son aisladas con facilidad de la tierra, el agua y el aire de todas las regiones habitadas por el hombre, consecuentemente, la interacción con ellas de manera cotidiana resulta prácticamente inevitable (4). Lo anterior, combinado con otros factores como su elevada capacidad de reproducción, la invasión de ecosistemas por el ser humano así como el aumento de personas inmunosuprimidas y de usuarios de lentes de contacto, multiplican y favorecen la probabilidad de que ocurran infecciones causadas por esta amiba. Actualmente se argumenta que el diagnóstico de QA es difícil de realizar en el laboratorio clínico, además; al no existir datos estadísticos en México sobre esta patología no se toman las medidas precautorias que se deberían tener ya que esta enfermedad es de tipo invalidante. Por todo lo dicho anteriormente, la importancia de este trabajo radica en demostrar que el diagnóstico clínico es sencillo y barato, además de proporcionar herramientas útiles para la capacitación de químicos y médicos en la detección temprana de la enfermedad. Por otra parte, es de suma importancia el conocer que porcentaje de la población estudiada es portadora de Acanthamoeba ya que hasta la realización de este trabajo no existen datos al respecto en México y por lo tanto no se le asigna la importancia debida a esta patología. 3. HIPOTESIS Al lograr aislar e identificar amebas del género Acanthamoeba, seremos capaces de determinar el porcentaje de la población usuaria de lentes de contacto que es portadora de dicha ameba además, demostraremos que el diagnóstico clínico de QA es sencillo y barato. 22 4. OBJETIVO GENERAL: Aislar e identificar amibas del género Acanthamoeba, mediante el cultivo de lentes de contactode usuarios del servicio de oftalmología del Hospital General de México, para así determinar el porcentaje de la población usuaria de dichos lentes que es portadora de la ameba además de valorar la utilidad de los métodos utilizados en el diagnóstico de QA. 4.1 Objetivos particulares: 1.- Aislar amebas del género Acanthamoeba spp a partir de lentes de contacto del tipo blando de 100 usuarios sanos o con afección ocular mediante el cultivo en medio de Page. 2.- Identificación del género Acanthamoeba spp. mediante el uso de tinciones (Giemsa, calcoflúor) y morfología microscópica; quistes (forma y tamaño), trofozoítos (presencia de acantopodios). 3.- Identificación de antígenos de Acanthamoeba spp en las muestras positivas (según el punto anterior) de los usuarios de lentes de contacto mediante la aplicación de la técnica de Inmunofluorescencia indirecta (IFI). 4.- Evaluar la utilidad de las técnicas utilizadas (cultivo, tinciones, cuantificación de proteínas, ELISA e IFI) para la identificación y el diagnóstico clínico de Acanthamoeba spp. 5.- Informar a la población usuaria de lentes de contacto que acude a consulta oftalmológica en el Hospital General de México, sobre los factores de riesgo que favorecen adquirir infecciones por Acanthamoeba. 23 5. Metodología Figura 6. Diagrama de flujo de la metodología realizada. Obtención de la muestra (lentes de contacto) Cultivo de la muestra (medio de Page) Examen de los cultivos e interpretación de los resultados (+) Frotis en fresco Tinción de calcoflúor Tinción de Giemsa Observación morfológica (40 y 100 X) Buscar fluorescencia de quistes a 40 X Observar morfología de trofozoítos Obtención de antígeno (congelación-ebullición) Cuantificación de proteínas (Bradford) Esquema de inoculación en conejos raza Nueva Zelanda Titulación de anticuerpos (ELISA) Obtención de Ac en suero (punción cardiaca) IFI 24 5.1 Obtención de la muestra: El lente de contacto se retiro del paciente utilizando pinzas estériles y fue colocado en un frasco estéril de boca ancha el cual contenía aproximadamente 25 mL de solución de Page. La muestra se transportó hasta el laboratorio donde fue procesada sumergida en hielo, además; se agitó manualmente varias veces con el fin de que la amiba no se adhiriera a las paredes del frasco. 5.2 Cultivo de la muestra. Los frascos que contenían el lente de contacto sumergido en medio de Page, reposaron en hielo durante 20 minutos, agitando dichos frascos manualmente cada 4 ó 5 minutos, (sin utilizar vortex para evitar la ruptura de los trofozoítos o quistes) esto con el fin de favorecer el desprendimiento de la ameba de las paredes del frasco (esto se realiza si no hubiera sido posible transportar la muestra sumergida en hielo). Una vez transcurrido el tiempo, se rasparon con suavidad las paredes del frasco y se colocó el contenido en tubos para centrifugar 10 minutos a 250 g. Posteriormente, utilizando pipeta Pasteur se tomaron aproximadamente de 4 a 5 gotas del líquido del fondo del tubo y se colocaron en una placa con medio de Page; la cual fue previamente preparada e inoculada con Escherichia coli que sirvió de alimento para la amiba. Se recomienda colocar el lente de contacto en la placa. Finalmente, las placas se incubaron a 37 °C. 5.3 Examen de los cultivos. Se revisaron las placas cada 24 horas durante un período de 4 semanas. La revisión se realizó en un microscopio invertido a 20X. En caso de observar formas sugerentes de trofozoítos o quistes se observaron a 40X para comprobar su morfología. Las placas fueron hidratadas e inoculadas nuevamente con Escherichia coli cada semana con el fin de evitar la deshidratación y falta de alimento en las mismas. 25 5.4 Interpretación de los resultados. Una muestra fue considerada como positiva cuando se observaron quistes y/o trofozoítos en el microscopio invertido en un lapso no mayor a 4 semanas. Si al término de las 4 semanas no se observó crecimiento amebiano la muestra se tomo como negativa. A las muestras que fueron consideradas como positivas, se les realizó un pequeño corte de agar y se colocó en otra placa de medio de Page inoculado con Escherichia coli; esto con el fin de eliminar hongos y/o bacterias que pudieron estar presentes en la muestra y por lo tanto obtener un cultivo axénico de Acanthamoeba. Este paso se realizó varias veces en las muestras que se consideró necesario. Una vez que contamos con las muestras positivas axenisadas al eliminar se procedió a obtener los quistes y/o trofozoítos de las cajas Petri, de cada una de las muestras positivas, para lo cual; se agregaron con pipeta Pasteur de 5 a 10 gotas de SSF a cada caja y se raspó la parte superior del agar de forma suave para finalmente obtener mediante pipeta Pasteur la mayor cantidad de líquido posible el cual contenía las amebas y se colocaron en tubos estériles previamente rotulados. Cabe mencionar que fue necesario contar con cajas de reserva las cuales contengan a cada una de las muestras positivas, esto por si llegase a fallar la técnica y sea necesario repetirla. 5.5 Tinciones y morfología quística. Una vez obtenidas las amebas se procedió a realizar las tinciones de calcoflúor y Giemsa, pero antes fue necesario realizar un frotis en fresco de la muestra con el fin de comprobar que logramos obtener quistes y/o trofozoítos. Además se aprovecharon dichos frotis para comparar la morfología quística de las muestras obtenidas con su morfología reportada en la literatura. 26 Para la realización del frotis en fresco se colocó en un portaobjetos limpio una gota de la muestra, la cual previamente fue resuspendida. Posteriormente se colocó un cubreobjetos cuidando de no formar burbujas. Finalmente con el fin de evitar derrames se selló la muestra utilizando esmalte de uñas. Cada laminilla se observó a 40x tomando como muestra positiva a aquella en la cual se logró observar quistes y/o trofozoítos de Acanthamoeba. En ocasiones se pudieron ver acantopodios a 100x. Para la confrontación de la morfología de las muestras con la morfología típica de Acanthamoeba reportada en la literatura se evaluó el aspecto de 100 quistes de cada muestra, teniendo en cuenta el tamaño en micras así como el aspecto físico de los quistes (presencia o no de opérculos y número de estos, presencia o no de doble pared, refringencia). Al ser positivos los frotis en fresco, se realizaron las tinciones de Giemsa y calcoflúor. Calcoflúor. Se realizó una limpieza exhaustiva de cada uno de los portaobjetos a utilizar mediante el uso de acetona. Una vez que se tuvieron los portaobjetos limpios se agitaron los tubos que contenían las muestras positivas y se tomo una gota de dicha muestra con pipeta Pasteur, la cual se colocó en el centro del portaobjetos y se extendió utilizando un aplicador de madera. Después se dejó secar la muestra a temperatura ambiente o también se puede utilizar el método de fijación por calor. Ya que la muestra fue fijada, se adiciono por goteo la cantidad necesaria de calcoflúor para cubrir el portaobjetos y se dejó reposar durante 1 minuto, para después lavar con agua destilada. Finalmente se dejó secar la muestra y se observó en el microscopio de fluorescencia utilizando luz ultravioleta a 40X. 27 Se consideró una tinción de calcoflúor como positiva a aquella en la cual los quistes de Acanthamoeba presentaron una fluorescencia de color azul cobalto. Cabe mencionar que aunque existan trofozoítos de Acanthamoeba presentes en la muestra estos no presentaron fluorescencia ya que esta tinción es exclusiva para quistes. Giemsa Para la observación de trofozoítos de Acanthamoeba mediante esta tinción, fue necesario realizar esta técnica inmediatamente después dela obtención de los trofozoítos del cultivo axenico, ya que si se deja pasar tiempo estos se enquistarán. Se realizó una limpieza exhaustiva de cada uno de los portaobjetos a utilizar mediante el uso de acetona. Una vez que se tuvieron los portaobjetos limpios se agitaron los tubos que contenían las muestras positivas y se tomó una gota con pipeta Pasteur, la cual se colocó en el centro del portaobjetos y se extendió por éste utilizando un aplicador de madera. Después se dejó secar a temperatura ambiente o también se puede utilizar el método de fijación por calor. Ya que la muestra estaba fijada, se adiciono por goteo la cantidad necesaria de colorante de Giemsa para cubrir el portaobjetos y se dejó reposar durante 10 minutos; después se lavo con agua destilada y se dejó secar la muestra a temperatura ambiente. La laminilla se observó al microscopio a 40X para observar trofozoítos y a 100x si buscamos acantopodios. Se consideró una tinción de Giemsa como positiva a aquella en la cual el trofozoíto se tiñó de color morado con núcleo(s) rosa(s). Si logramos observar acantopodios a 100x esto es una prueba de que trata de Acanthamoeba, ya que ningún otro género de AVL posee este tipo de proyecciones citoplasmáticas. 28 5.6 Cuantificación de proteínas. A la par de las pruebas mencionadas con anterioridad, se realizó la cuantificación de proteínas por el método de Bradford. Los antígenos utilizados tanto de A. castellani como de N. fowleri se obtuvieron de aislados de pacientes positivos de EAG y EAP respectivamente. A su vez, dichos antígenos fueron preparados para su utilización mediante congelación-descongelación durante 8 ciclos, pasando de nitrógeno líquido a agua a 60 °C; seguido de una centrifugación a 150 g durante 10 minutos Posteriormente, se prepararon 50 mL de solución de albúmina al 1% en PBS pH= 7.6 destilada, teniendo cuidado de no hacer burbujas. Después se elaboró una curva patrón de albúmina en tubos Ependorf de la siguiente manera: NÚMERO DE TUBO CANTIDAD DE H2O + CANTIDAD DE ALBÚMINA A MEZCLAR 1 990 L de H2O + 10 L de albúmina 2 980 L de H2O + 20 L de albúmina 3 970 L de H2O + 30 L de albúmina 4 960 L de H2O + 40 L de albúmina 5 950 L de H2O + 50 L de albúmina 6 940 L de H2O + 60 L de albúmina 7 930 L de H2O + 70 L de albúmina 8 920 L de H2O + 80 L de albúmina 9 910 L de H2O + 90 L de albúmina 10 900 L de H2O + 100 L de albúmina Tabla 1: Curva patrón para la cuantificación de proteínas por el método de Bradford. 29 En una placa para ELISA con pozos de fondo plano se colocó la curva realizada anteriormente y la muestra problema (por duplicado ambas) de la siguiente manera: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Tubo 1 40 L Tubo 2 40 L Tubo 3 40 L Tubo 4 40 L Tubo 5 40 L Tubo 6 40 L Tubo 7 40 L Tubo 8 40 L Tubo 9 40 L Tubo 10 40 L PBS 40 L PBS 40 L B Pozos no utilizados C D PBS 70L + 10L Ag 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS PBS 40 L PBS 40 L E PBS 70L + 10L Ag 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS PBS 40 L PBS 40 L F PBS 70L + 10L Ag 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS PBS 40 L PBS 40 L G PBS 70L + 10L Ag 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS 40 L del pozo anterior + 40 L PBS PBS 40 L PBS 40 L Tabla 2: Cuantificación de proteínas en sueros de donadores infectados con AC y Nf respectivamente (donde A = Curva de albúmina; D y E = Antígeno de Acanthamoeba castellani; F y G = Antígeno de Naegleria fowleri). Finalmente se agregaron 160 L del reactivo de Bradford a todos los pozos y se realizó la lectura a 595 nm; la concentración de proteínas se obtuvo mediante interpolación en la curva patrón. 30 5.7 Esquema de inoculación. Con el fin de obtener anticuerpos anti-Acanthamoeba así como anticuerpos anti- Naegleria los cuales fueron utilizados posteriormente para la realización de la técnica de IFI. Se llevaron acabo los siguientes esquemas de inoculación en conejos de raza Nueva Zelanda: DÍA INOCULACIÓN VIA DE ADMINISTRACION 1 Ag de AC + ACF. Vía subcutánea (Dorso) 8 Ag de AC + AIF. Vía subcutánea (Dorso) 15 Ag de AC (1000 L). Intramuscular (Pierna) 21 Toma de muestra sanguínea. Titulación de anticuerpos (realización de ELISA) 22 Ag de AC 500 L. Intramuscular (Pierna) 26 Toma de muestra sanguínea Titulación de anticuerpos (realización de ELISA) 27 Toma de muestra sanguínea Titulación de anticuerpos (realización de ELISA) 28 Ag de AC (500 mL). Intramuscular (Pierna) Tabla 3. Esquema de inoculación para Acanthamoeba castellani; (donde ACF= Adyuvante completo de Freund; AIF= Adyuvante Incompleto de Freund). 31 DÍA INOCULACION VIA DE ADMINISTRACION 1 Ag de Nf + ACF. Vía subcutánea (Dorso) 8 Ag de Nf + AIF. Vía subcutánea (Dorso) 15 Ag de Nf (1000 L). Intramuscular (Pierna) 21 Toma de muestra sanguínea. Titulación de anticuerpos (realización de ELISA) 22 Ag de Nf 500 L. Intramuscular (Pierna) 26 Toma de muestra sanguínea Titulación de anticuerpos (realización de ELISA) 27 Toma de muestra sanguínea Titulación de anticuerpos (realización de ELISA) 28 Ag (500 mL). Intramuscular (Pierna) Tabla 4. Esquema de inoculación para Naegleria fowleri (donde ACF=Adyuvante completo de Freund; AIF= Adyuvante Incompleto de Freund). 5.8 Toma de muestra. 1.- Se colocó al conejo dentro de la caja dejando las orejas afuera. 2.-Se frotó con alcohol la parte interior de la oreja del conejo y se rasuró la zona correspondiente a la vena. 3.- Se realizó la toma de muestra con jeringa de 3 o 5 mL y se colocó la sangre obtenida en un tubo previamente rotulado teniendo cuidado de no hemolisar la muestra. 32 5.9 Realización de ELISA. 1.- Se centrifugó a 250 g la sangre del conejo para así obtener suero con Ac anti- Acanthamoeba o anti-Naegleria según sea el caso. 2.- Se diluyeron 10 L de antígeno en 10 mL de buffer de carbonatos pH= 9.6 y se colocaron 100 L en cada pozo a utilizar. 3.-Se incubó la placa a 4 °C durante toda la noche. 4.- Al día siguiente se eliminó la solución sacudiendo la placa sobre una gasa extendida, para posteriormente realizar 3 lavados de 5 minutos cada uno con solución PBS-Tween 0.05%. 5.- Se bloqueó con 200 L leche descremada al 1% durante 30 minutos a 37 °C. 6.- Se realizaron 3 lavados de la misma forma en que se hicieron en el paso 4. 7.- Se colocaron 200 L de la muestra con Agdiluida 1/1000 en PBS en todos los pozos de la línea A. 8.- Se colocaron 100 L de PBS-Tween en todos los pozos inferiores. 9.- Se efectuó la dilución en orden descendente hasta alcanzar una dilución de 1/128,000. 10.- Se cubrió la placa con parafilm y se incubo durante 2 horas a 37 °C. 11.- Se realizaron 3 lavados de la misma forma en que se hicieron en el paso 4. 12.- Se colocaron 100 L del conjugado anti-conejo diluido 1/500 en PBS-Tween 0.05% a todos los pozos en uso y se cubrieron con parafilm 13.- Se incubó durante 2 horas a 37 °C. 14.- Se colocaron 100 L de sustrato a cada pozo en uso y se esperó a que el color de los pozos cambiara a amarillo. 33 15.- Se detuvo la reacción con 100 L de H2SO4 2N en cada pozo y se efectuó la lectura a 490 nm. 5.10 Obtención de suero con Ac. Se obtuvo la mayor cantidad posible de suero de conejo mediante punción venosa (de las 2 orejas) para posteriormente llevar acabo una punción cardiaca de la siguiente manera: 1.- Para obtener la mayor cantidad de sangre la punción se realizó sin anestesia, para lo cual el conejo se sujetó de las cuatro patas con el abdomen hacia arriba sobre la mesa de disección. 2.- Se palpó con el dedo índice la zona del tórax hasta localizar los latidos del corazón. 3.- Se limpió con alcohol la zona localizada. 4.- Se procedió a realizar la punción utilizando jeringa de 10 mL. 5.- Se quitó la aguja de la jeringa y se vació la sangre en un tubo de forma lenta y por las paredes de este. 6.- Se dejó reposar 10 minutos para después centrifugar a 150 g durante 10 minutos. 7.- Finalmente se separó el suero y se almaceno a -70 °C hasta su uso. 34 5.11 Inmunofluorescencia. 1.- Se obtuvieron trofozoítos de cada una de las muestras positivas de los cultivos en cajas Petri. 2.- Se fijaron los trofozoítos de Acanthamoeba con formaldehido. 2.- Se centrifugó el tubo con los trofozoítos fijados a 250 g 3.- Se descartó el sobrenadante y se resuspendió la muestra. 4.- Se colocaron 15 L de antígeno en cada pozo, los cuales fueron previamente limpiados con alcohol-acetona. 5.- Una vez que la muestra secó, se colocó 1 gota de acetona en cada pozo y se dejo secar. 6.- Se realizaron las diluciones necesarias del suero de conejo anti-Acanthamoeba (1:100, 1:200, 1: 400) en PBS. 7.- Se repitió el paso anterior utilizando un suero testigo negativo. 8.- Los pozos 1 y 5 fueron utilizados como testigos, por lo cual en ellos se colocaron 15 L de PBS. 9.- Los pozos 2, 3 y 4 fueron utilizados para las diluciones del suero testigo negativo; utilizando el pozo 2 para la dilución 1:100, el pozo 3 para la dilución 1:200 y el pozo 4 para la dilución 1: 400 10.- Los pozos 6, 7 y 8 fueron utilizados para el suero testigo positivo, utilizando el pozo 6 para la dilución 1:100, el pozo 7 para la dilución 1:200 y el pozo 8 para la dilución 1:400 11.- Se cubrió la placa con papel aluminio y se incubó a 37 °C durante 30 minutos en cámara húmeda. 12.-Una vez transcurridos los 30 minutos se lavaron los pozos con PBS; después se introdujo la placa en una cámara con PBS durante 5 minutos y después 1 minuto en agua destilada. 35 13.- Se realizó la dilución del conjugado marcado con fluoresceína 1:200 mezclado con azul de Evans diluido 1:100 y se colocaron 12 L en cada pozo 14.- Se repitieron los pasos 11 y 12. 15.- Se realizó el montaje para lectura dejando secar al aire y colocando una gota de glicerina en cada esquina para posteriormente colocar un cubreobjetos. 16.- Se observaron las preparaciones en microscopio de luz ultravioleta a 40X Posteriormente se repitió la metodología anteriormente descrita pero en esta ocasión utilizando suero de conejo anti-Naegleria spp. Finalmente se realizó una tercer IFI de la manera siguiente: 1.- En los pozos 1 y 5 se colocó antígeno testigo (+) de Acanthamoeba spp. 2.- En los pozos 4 y 8 se colocó antígeno testigo (+) de Naegleria spp. 3.- En los pozos 2 y 3; se colocaron 15 L de antígeno muestra problema de Acanthamoeba spp. 4.- En los pozos 6 y 7 se colocaron 15 L de antígeno de Naegleria spp. 5.- Una vez que la muestra seco, se colocó 1 gota de acetona en cada pozo y se dejo secar. 6.- Los pozos 1 y 5 fueron utilizados como testigos negativos, por lo cual se colocaron 15 L de PBS. 5.- Los pozos 4 y 8 fueron utilizados como testigos positivos, por lo cual se colocaron en el pozo 4, 15 L de suero de conejo testigo positivo anti-Acanthamoeba (1/200) y en el pozo 8, 15 L de suero de conejo testigo positivo anti-Naegleria (1/200). 6.- En los pozos 2 y 7 se colocaron 15 L de suero de conejo anti-Acanthamoeba (1/200). 7.- En los pozos 3 y 6 se colocaron 15 L de suero de conejo anti- Naegleria (1/200). 36 8.- Se cubrió la placa con papel aluminio y se incubó a 37 °C durante 30 minutos en cámara húmeda. 9.-Una vez transcurridos los 30 minutos se lavaron los pozos con PBS; después se introdujo la placa en una cámara con PBS durante 5 minutos y después 1 minuto en agua destilada. 10.- Se realizó la dilución del conjugado de cabra anticonejo marcado con fluoresceína 1:200, mezclado con azul de Evans diluido 1:100 y se colocaron 12 L en cada pozo 11.- Se repitieron los pasos 6 y 7. 12.- Se realizó el montaje para lectura dejando secar al aire y colocando una gota de glicerina en cada esquina para posteriormente colocar un cubreobjetos.. 13.- Se observaron las preparaciones en microscopio de luz ultravioleta a 40X, comenzando por los testigos positivos y negativos, para finalmente observar las pruebas cruzadas. 37 6. RESULTADOS. Se obtuvieron muestras de 100 pacientes del servicio de oftalmología del Hospital General de México, específicamente del departamento de córnea a cargo de la doctora Leticia Vázquez Maya. Del total de las muestras, 11 de ellas resultaron positivas al ser observadas morfológicamente en el microscopio estereoscópico (2, 4, 7, 13, 15, 24, 33, 43, 44, 45, 94). Figura 7: Trofozoíto de Acanthamoeba en medio de Page (muestra 24). Figura 8: Trofozoítos de Acanthamoeba en medio de Page (Muestra 94). 38 Figura 9: Quiste de Acanthamoeba en medio de Page (Muestra 7). Figura 10: Quistes de Acanthamoeba en medio de Page (donde A nos muestra un trofozoíto en proceso de enquistamiento; nótese la doble pared de un quiste totalmente formado en B; muestra 45). A B 39 Según la morfología observada en cada una de las 100 muestras y los datos proporcionados por los pacientes se realizó la siguiente tabla. TABLA 5. Resultados obtenidos mediante observación microscópica del cultivo de los lentes de contacto en medio de Page. [La tabla anteriormente mostrada cuenta con otros datos de utilidad como nombre del paciente, número de expediente clínico, domicilio y teléfono (en el caso de los positivos), fecha de cultivo de la muestra y un apartado de observaciones especiales]. MUESTRA DATOSCUNICOS DIAGNOSTICO Padente lemeninode l4anolde edad, operada de drugia relractiva (~ Ie l) , Utililó 101lentelde rontacto por una 1 lemana, POlitivo (Ojo ilquierdo y derecho) Perlona lana de 44anolde edad uluaria de lentelde rontacto por mal de 11 ~oral d i a r i al d eld e aproximadamente 10 4 • POlitivo Ojo ilquierdo y derecho anOI, Padente lemeninode 16anolde edad operada de drugia relractiva (IASEK), utilila lente de rontacto en ojo ilquierdo 7 delde ~ a[e dOllemanal por delecto epitelial; actualmente prelenta edema rorn ea l, POlitivo B femenino de 47 anolde edad, no propoprdona maldatol, POlitivo (ojo derecho) Padentelemenino de ¡¡anolde edad operada de drugia relractiva (IASEK) el7 de leptiembre del 1008; utililó lentel 15 de rontacto lolamente lOdial, POlitivo Ojo ilquierdo 14 Padente lemeninode 59anolde edad, Utililó lentel de rontacto lolamnete llemana, POlitivo Padente lemeninode 1Oanolde edad operada de drugia relractiva (IASEK) en ojo derecho el dia 6 de octubre del 1008, II Utililó4dial el lente de rontacto, POlitivo 4J Padente malWlino el cual utililó 101lentelde rontactodura nte 4dial, No ~ ay maldatol, POlitivo Padente malWlinoal cual le le d i agno~iro leuroma lecundarioa aOCelororneal, utililó el lente de rontactodura nte 4 44 dial, POlitivo Padente malWlinode llanolde edad operadode drugia relractiva (IASEK) el dia J de noviembre del 1008, Utililó 101 45 lentel15dial, POlitivo Padente malWlinode 55anolde edad uluariode lente de rontacto terapeutiro; prelenta 1 dia ron leerelion ocular y 94 d i agno~irode ~i popi on , Utililó e~e lente de rontactodurante Jlemanal , POlitivo MU ESTR\ DATOSCUNICOS DIAGNOSTICO Padente femenino ~e l4 a n os~e e~a~, opera~a ~e drugia refractiva ( ~se l) . Utili ló los l e ntes~e contacto por una 1 semana. Positivo (Ojo i l~ ui er~o y ~erecho) Persona ~na ~e 44anos~e e~a~ usuaria ~e lentes ~e contacto por mas~e 11 ~oras ~ i ari as~esde aprox imadamente 10 4 • Positivo Ojo i l~ ui erdo y derecho anos. Padente femenino de 16anos ~e eda~ opera~a de drugia refractiva (IASEK), utili la lente de contacto en ojo i l~ ui erdo 7 des~e ~a~ dos semanas por ~electo epitelial; actualmente presenta edema corn ea l. Positivo B feme nino de 47 anos de eda~, no propoprdona mas datos. Positivo (ojoderecho) Padente femenino de 18anosde eda~ opera~a de drugia relractiva (IASEK) el7 de septiembre del 1008; utili ló lentes 15 de contacto solamente 10dias. Positivo Ojo i l~ ui erdo 14 Padente lemeninode 59anos ~e eda~. Utili ló lentes de contacto solamnete 1 semana. Positivo Padente femenino de lDanos ~e edad operada de drugia relractiva (IASEK) en ojo derecho el dia 6 de octubre del 1008. 11 Utili ló4dias el lente de contacto. Positivo 41 Padente mas rulino el rual utili l610s lentes ~e rontacto ~ u ra nte 4dias. No ~ ay mas datos. Positivo Padente mascu lino al rual se le ~ i agno~i co leucoma serun ~ari oa abcesororneal. Utili l6 el lente de rontacto ~ ura nte 4 44 ~ i as. Positivo Padente masru li no ~e llanosde e~a~ opera~o ~e drugia relractiva (IASEK) el dia 1 ~e noviembre ~e I 1OO8. Utili l610s 45 lentes15dias. Positivo Padente mascu lino de 55 anos de eda~ usuariode lente de contacto terapeutico; presenta 1 ~ i a ron secresion crular y 94 ~ i agno~ico ~e ~i popi on. Utili ló este lente de rontactodura nte 1 semanas. Positivo 40 Con el fin de comparar la morfología de nuestras muestras positivas con la estipulada en la literatura, se realizaron frotis en fresco observándose a 100X en microscopio estereoscópico la siguiente morfología: Figura 11: Frotis en fresco donde A nos muestra un trofozoíto de Acanthamoeba en proceso de enquistamiento (Muestra 2). Figura 12: Frotis en fresco de Acanthamoeba spp (en donde A nos muestra su vacuola contráctil, B la doble pared característica del quiste y C los acantopodios característicos del género, muestra 33). A A B C 41 A su vez se realizó el conteo y caracterización de 100 quistes de cada muestra positiva con el fin de evaluar si las características observadas coinciden con lo estipulado en la literatura para Acanthamoebas del grupo II las cuales son las principales causantes de QA. MUESTRA 96 TAMAÑO (MICRAS) MORFOLOGÍA DEL QUISTE Nº de quistes con las mismas características 10 Doble pared gruesa, refringente, estrellada con 6 opérculos 1 10 Doble pared gruesa, refringente, hexagonal con 6 opérculos 3 10 Doble pared gruesa, refringente, irregular sin opérculos 1 10 Doble pared gruesa, refringente, pentagonal con 5 opérculos 6 12 Doble pared gruesa, refringente, estrellada con 6 opérculos 4 12 Doble pared gruesa, refringente, hexagonal con 6 opérculos 8 12 Doble pared gruesa, refringente, Hexagonal con 5 opérculos 2 12 Doble pared gruesa, refringente, irregular con 4 opérculos 1 12 Doble pared gruesa, refringente, irregular sin opérculos 4 12 Doble pared gruesa, refringente, ovoide sin opérculos 4 12 Doble pared gruesa, refringente, pentagonal con 5 opérculos 23 12 Doble pared gruesa, refringente, poligonal con 4 opérculos 1 12 Doble pared gruesa, refringente, romboide con 4 opérculos 10 12 Doble pared gruesa, refringente, trapecio con 4 opérculos 2 14 Doble pared gruesa, refringente, estrellada con 6 opérculos 3 14 Doble pared gruesa, refringente, hexagonal con 6 opérculos 8 14 Doble pared gruesa, refringente, irregular con 3 opérculos 1 14 Doble pared gruesa, refringente, irregular sin opérculos 1 14 Doble pared gruesa, refringente, ovoide sin opérculos 2 14 Doble pared gruesa, refringente, pentagonal con 5 opérculos 5 14 Doble pared gruesa, refringente, romboide con 4 opérculos 5 16 Doble pared gruesa, refringente, hexagonal con 6 opérculos 2 16 Doble pared gruesa, refringente, irregular sin opérculos 1 16 Doble pared gruesa, refringente, pentagonal con 5 opérculos 1 16 Doble pared gruesa, refringente, romboide con 4 opérculos 1 Tabla 6. Morfología de quistes de las muestras positivas. 42 Para poder observar de mejor manera los organélos característicos de Acanthamoeba como vacuola contráctil, acantopodios, doble pared y opérculos; se realizó la tinción de Giemsa tanto a quistes como a trofozoítos. Figura 13: Tinción de Giemsa para trofozoíto de Acanthamoeba (donde A nos muestra el núcleo teñido de color rosa; muestra 4) - Figura 14: Tinción de Giemsa para las muestras 33, 43, 44 y 15; A, B, C y D respectivamente. (Se observa en A, B y D las múltiples formas que puede adoptar un trofozoíto de Acanthamoeba debido a la proyección de lobopodos además de los múltiples acantopodios. En C podemos observar un quiste con doble pared gruesa en forma de estrella con 4 opérculos característico del género Acanthamoeba). A C B D A 43 Debido a la gran afinidad del calcoflúor por los polisacáridos y a que los quistes de Acanthamoeba contienen gran cantidad de estos, se realizó la tinción de calcoflúor a las muestras positivas. Figura 15: Tinción de calcoflúor aplicada aquistes de Acanthamoeba [obsérvese que en D hay en el fondo trofozoítos los cuales no se tiñeron debido a que la tinción con calcoflúor es exclusiva para quistes. Muestras 44 (A), 24(B), 7(C) y 45(D)] A B C D 44 Con el fin de evaluar si los Ag. con los que contábamos eran útiles para nuestro esquema de inoculación, se realizó una cuantificación de proteínas por el método de Bradford. Los Ag se obtuvieron de suero de donadores con diagnóstico positivo a EAG y a EAP respectivamente. Acanthamoeba castellani. POZO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 D.O. curva patrón 0.007 0.028 0.063 0.09 0.142 0.181 0.224 0.249 0.263 0.291 D.O. Ag de AC 0.899 0.842 0.721 0.572 0.427 0.283 0.191 0.122 0.077 0.043 D.O. Ag de AC duplicado 0.934 0.836 0.721 0.585 0.415 0.296 0.196 0.142 0.092 0.087 Tabla 7. Densidad óptica de Ac anti-Acanthamoeba castellani en suero de conejo. Figura 16. Gráfica para la obtención de concentración de proteínas de Ac anti-Acanthamoeba castellani en suero de conejo. [ ] De proteínas = 23 mg/ M 45 Naegleria fowleri. POZO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 D.O. curva patrón 0.007 0.014 0.042 0.09 0.13 0.159 0.224 0.257 0.289 0.319 D.O. Ag de Nf 0.904 0.827 0.729 0.593 0.389 0.241 0.177 0.121 0.052 0.022
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