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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE CIENCIAS AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE Escherichia coli EN AGUA, SUELO Y VEGETALES DE UNA CHINAMPA DE XOCHIMILCO, CDMX, MÉXICO T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: B I Ó L O G A P R E S E N T A : LÓPEZ DELGADO ELIZABETH ALEJANDRA DIRECTOR DE TESIS: DRA. IRMA AURORA ROSAS PÉREZ CIUDAD UNIVERSITARIA, CD. MX. 2018 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. Hoja de datos del Jurado 1. Datos del alumno López Delgado Elizabeth Alejandra 56450096 Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Ciencias Biología 309240057 2. Datos del Asesor Rosas Pérez Irma Aurora 3. Datos del sinodal 1 Dra. Irma Aurora Rosas Pérez 4. Datos del sinodal 2 Dra. Claudia Alejandra Ponce de León Hill 5. Datos del sinodal 3 Dra. Ruth Cecilia Vanegas Pérez 6. Datos del sinodal 4 M. en C. Manuel Hernández Quiroz 7. Datos del sinodal 5 M. en C. Leticia Martínez Romero 8. Datos de la tesis Aislamiento y caracterización de Escherichia coli. en agua, suelo y vegetales de una chinampa de Xochimilco, CDMX, México. 48p 2018 9. Palabras clave: Escherichia coli, coliformes fecales, biopelícula. Agradecimientos Agradezco a la Dra. Irma Aurora Rosas Pérez por haberme dado la oportunidad de llevar a cabo mi proyecto de tesis bajo su tutoría y por los conocimientos brindados en clase. A la M. en C. María Eva Salinas Cortés por el apoyo, y el conocimiento que me brindó durante la realización de este trabajo, así como el tiempo dedicado a la revisión de la misma y las aportaciones realizadas. A la M. en C. Leticia Martínez Romero por su asesoría en cada uno de los muestreos, por el tiempo y apoyo dedicado en la enseñanza de cada una de las técnicas en este trabajo y por sus aportaciones en el mejoramiento del mismo. Al Sistema Nacional de Investigadores, SIN III Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología CONACYT, por haberme otorgado la beca durante 2 años para llevar acabo el presente trabajo. Dedicatoria Le doy gracias a la máxima casa de estudios, UNAM por permitirme formar parte de esta gran comunidad, ser egresada de una de las mejores universidades del mundo es un orgullo y un privilegio para mí. Gracias a mis padres, Delfina y José Luis por estar conmigo en mis tropiezos y en mis logros, gracias por enseñarme los valores necesarios para ser una mejor persona y brindarme su amor y apoyo siempre, ustedes han sido para mí un ejemplo de responsabilidad y esfuerzo, sin su apoyo esto no hubiera sido posible, gracias mami por estar detrás de mí y no dejarme caer en malas decisiones, a ti papi por esforzarte cada día para que nunca me falte nada en todos los aspectos, tanto material como persona. A mi hermano Omar por ser siempre mi ejemplo a seguir, por ser mi amigo y contar con tú apoyo y consejo para cualquier cosa, gracias por impulsarme a seguir adelante en cada cosa que me propongo y estar ahí a pesar de mis errores. A las personas que ya no están: A mi amigo Gerardo, aunque ya no te encuentres conmigo físicamente, siempre fuiste mi apoyo y compañía, gracias por los momentos alegres y divertidos que me diste desde la prepa y a lo largo de la carrera, te extraño amigo, me haces falta todos los días y siempre estás en mi pensamiento y corazón. Jorge, donde te encuentres, te doy gracias por haber sido parte de mi vida, no olvido los momentos que compartimos todos los días te recuerdo con cariño, nos haces mucha falta. Rosita desde el lugar en el que estés, te agradezco tus palabras de aliento, tu cariño incondicional, tú recuerdo está presente en cada uno de mis días. A mis mejores amigos Pedro y Anayeli: Pedro, amigo gracias por tu amistad, y por los recuerdos que hemos generado en tampoco tiempo, eres una persona especial e importante en mi vida, siempre sé que estás ahí para escucharme, y brindarme tú apoyo. Ana: Eres una mujer súper fuerte, siempre sigues adelante a pesar de todo, te adoro y te admiro mucho como mujer por todo lo que haces por Michelle, gracias por ser mi amiga y aunque estemos lejos brindarme tu apoyo Mis amigas del taller: Diana Jurado, Paola Mendoza, Paola Munive y Sandy, gracias por brindarme su amistad, a pesar de que nos es muy difícil ponernos de acuerdo para coincidir, sé que siempre están ahí dándome su consejo y buenas vibras, a cada una de ustedes les tengo un cariño especial. A mis amigos incondicionales: Luis Bernal gracias por todas los momentos que tengo contigo desde la prepa, por tú apoyo y tu amistad incondicional, Adrián Martínez, gracias por tu cariño, tus palabras de aliento y por siempre estar para mí en cualquier circunstancia, Max Padilla, por los recuerdos que tengo contigo, no solo en las clases y en las prácticas de campo en las que estuvimos en la carrera, en las que compartimos muchas anécdotas y que recuerdo cada una de ellas con mucho cariño, a pesar de todo, sabes que eres una persona muy importante en mi vida. Contenido Resumen 2 1. Introducción 4 2. Antecedentes 11 3. Justificación 14 4. Hipótesis 14 5. Objetivos 15 6. Materiales y métodos 16 6.1 Área de estudio 16 6.2. Análisis microbiológico 17 6.2.1 Análisis de bacterias coliformes totales y fecales 18 6.2.2 Pruebas bioquímicas 21 6.2.3 Resistencia antibiótica 25 6.2.4 Formación de biopelículas 25 6.2.5 Genes de virulencia 26 7. Resultados 28 7.1 Parámetros fisicoquímicos28 7.2 Análisis microbiológico 29 7.2.1 Bacterias mesofílicas cultivables 29 7.3 Coliformes fecales y totales 29 7.4 Identificación 30 7.5 Resistencia antibiótica 31 7.6 Formación de Biopelícula 33 7.7 Genes de virulencia 34 8. Discusión 36 9. Conclusiones 42 10. Bibliografía 43 RESUMEN Escherichia coli es un bacilo Gram negativo que se encuentra en la microbiota de animales de sangre caliente; debido a esta característica es utilizado para la evaluación y control de calidad de la inocuidad de alimentos y agua para consumo humano. El objetivo de este estudio fue evaluar la presencia de bacterias coliformes totales y fecales en muestras de agua, suelo y hortalizas, el estudio se realizó en la zona chinampera de San Gregorio Atlapulco, Xochimilco y en un mercado cercano al área de muestreo. Se tomaron muestras de agua, suelo y hortalizas, el muestreo se llevó a cabo en los meses de Enero del 2015, Marzo, Abril y Septiembre del 2016, el mes de Enero se consideró como temporada de secas frías, los meses de Marzo y Abril como secas cálidas y por último el mes de Septiembre como temporada de lluvias. Las muestras de suelo y agua se tomaron en la zona chinampera; las hortalizas (cilantro y lechuga), se tomaron además de la zona chinampera y del mercado local. Las coordenadas de la zona de estudio se determinaron con ayuda de un GPS; asimismo se tomaron los parámetros fisicoquímicos del agua del canal utilizada para regar la parcela de cultivo. De cada muestra se determinó la concentración de bacterias mesofílicas cultivables y se utilizó la técnica del número más probable (NMP), para la cuantificación de bacterias coliformes totales y fecales. De los tubos múltiples de fermentación, se aislaron las probables Escherichia coli y se identificaron con las pruebas bioquímicas de IMVyC (indol, rojo de metilo, Voges-Proskawer y citrato) y la prueba de oxidasa. Se logró la identificación de 275 aislados de E. coli. Posteriormente a cada una de las muestras se le aplicó la prueba de susceptibilidad a seis diferentes antimicrobianos: tetraciclina, ampicilina, cefotaxima, cefalotin, sulfonamidas y trimetoprima. Por último se realizó el ensayo de formación de biopelícula en microplaca. De acuerdo con los resultados de los parámetros físicoquímicos, los valores de oxígeno disuelto fluctuaron entre 4.39-6.32 mg/L, el valor más bajo de temperatura se registró en el mes de enero (9.13°C), el pH se mantuvo ligeramente ácido en todos los muestreos (6.13-6.87). Las concentraciones más altas de bacterias mesofílicas cultivables (MC), en el caso de ambos vegetales, se registraron en las muestras colectadas del mercado local durante los meses de marzo y abril (secas cálidas). En las muestras de suelo las concentraciones más altas se reportaron también durante los meses de secas cálidas, por último, el valor más alto de MC en las muestras de agua se registró en el mes de abril. Con respecto a las concentraciones más altas de coliformes totales y fecales, tanto de lechuga como de cilantro, también se obtuvieron de las muestras del mercado. En el caso de las muestras de suelo, el valor más alto de coliformes fecales se registró durante el mes de abril y en las muestras de agua también se registraron durante marzo y abril. En la prueba de susceptibilidad a antibióticos, el 54% de los aislados fueron sensibles a los seis antimicrobianos y el 46% fue resistente al menos a un antibiótico, principalmente a la tetraciclina, o a la ampicilina. En la prueba de formación de biopelículas, el 79% de los aislados fueron no adherentes, el 19% se reportó como débilmente adherente, el 2% resulto moderadamente adherente y ninguna de las muestras se registró como fuertemente adherente. Con base en los resultados, se determinó que las muestras de agua, suelo y vegetales presentaron contaminación de origen fecal, debido a la presencia de Escherichia coli, bacteria descrita como indicadora de contaminación fecal reciente, principalmente en las muestras de agua, ya que fue en donde se obtuvo la mayor concentración de esta bacteria. Palabras clave: Escherichia coli, coliformes fecales, biopelícula. 1. INTRODUCCIÓN El lago de Xochimilco es el remanente de un sistema lacustre de cinco lagos que abarcaron una distancia de 920 kilómetros cuadrados de la cuenca de México (Zambrano et al., 2009), sin embargo, a lo largo de los años ha sufrido incontables alteraciones antropogénicas. Estas alteraciones han devenido en la reducción del área de cobertura de la vegetación, y área chinampera la alteración de los patrones de precipitación, el cambio en los niveles freáticos y la disminución de la biodiversidad en la zona (Nemer, 2013). Actualmente, el sistema de chinampas se encuentra amenazado por la introducción de nuevas técnicas agrícolas, la extracción excesiva de agua de los acuíferos de la zona, el abandono, el desarrollo urbano y la contaminación. La zona enfrenta una serie de problemáticas relacionadas con las presiones sociales y urbanas que se derivan de su relación con la Ciudad de México. En las últimas tres décadas los procesos de urbanización y construcción irregular de viviendas se han acelerado, conformando uno de los problemas más preocupantes para la región. En la actualidad, los canales de Xochimilco se recargan con agua residual con tratamiento secundario proveniente principalmente de la planta de tratamiento “Cerro de la Estrella”, en la que se encuentran diferentes microorganismos (virus, bacterias y protozoarios), algunos potencialmente patógenos, el agua tratada se utiliza para mantener los niveles de los canales de la zona chinampera, utilizada en bienes de consumo humano como lo es el riego de áreas verdes, el desarrollo de los productos agrícolas, establecimientos industriales, comercios, parques y jardines (DGCOH, 2005). Por ello es necesario conocer la calidad sanitaria del agua ya que es básico para establecer su uso. La calidad del agua se determina a través de bioindicadores, los cuales se rigen, entre otras cosas, con base en las concentraciones de bacterias coliformes totales y fecales en las muestras de agua (SEMARNAP, 1998; CONAGUA, 2009). Además, los canales abiertos están sujetos a descargas ilegales tanto de granjas y viviendas (Valdespino et al, 1985). La fuente de agua para la producción agrícola es crucial en estas áreas, ya que las verduras cultivadas en Xochimilco se comercializan para consumo en toda la Ciudad de México. El efecto de la contaminación de los asentamientos irregulares y las fugas del sistema de alcantarillado público puede facilitar la transmisión de agentes enteropatógenos a través de cultivos contaminados y a través del contacto directo con trabajadores agrícolas (Juárez et al, 2003) El consumo de hortalizas es vital para la salud humana, puesto que poseen innumerables propiedades alimenticias, sin embargo por sus características físicas y de cultivo, algunosde estos productos están expuestos a contaminación de tipo biológico y químico, situación que genera un riesgo para la salud humana. Uno de los factores más importantes de contaminación microbiana para los cultivos son las aguas de riego empleadas con altos recuentos microbianos, como vertederos de aguas residuales. La vigilancia del estado higiénico de aguas y alimentos se lleva a cabo mediante la detección de bacterias indicadoras de contaminación, organismos coliformes de origen fecal como Escherichia coli (Rivera et al., 2009). Las distintas etapas que un producto debe pasar desde la cosecha hasta el consumo tanto fresco como procesado proveen innumerables oportunidades para incrementar el nivel de contaminación que naturalmente trae el campo. Esencialmente existen tres tipos de organismos que pueden ser transportados por las frutas y hortalizas y que representan un peligro para la salud humana: virus (hepatitis A), bacterias (Salmonella spp., Escherichia coli, Shigela spp. entre otras) y parásitos (Giardia spp. por ejemplo). La contaminación microbiana es un problema complejo de resolver, una de las estrategias es prevenir la contaminación del alimento a lo largo de toda la cadena de producción y distribución, conjuntamente con la ejecución de determinados tratamientos sanitarios y el mantenimiento del producto en condiciones desfavorables para el desarrollo de los microorganismos (FAO, 2003). Escherichia coli es una bacilo Gram negativo, anaerobio facultativo, perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, que se encuentra normalmente en el tracto gastrointestinal de los seres humanos y animales de sangre caliente, coloniza el intestino del hombre pocas horas después del nacimiento y se le considera un organismo de microbiota normal (Rodríguez, 2002). Debido a su elevada concentración en el tracto gastrointestinal y en las heces, E. coli se utiliza como el indicador principal de contaminación fecal en la evaluación de la inocuidad de los alimentos y el agua. La mayoría de las E. coli son organismos comensales inofensivos cuando se encuentran en su hábitat intestinal natural. Sin embargo, diferentes cepas de E.coli son patógenos gastrointestinales graves para los seres humanos y algunas también son patógenos para animales jóvenes destinados a la producción de alimentos. E. coli tiene la capacidad de intercambiar material genético por medio de elementos móviles, tales como plásmidos y bacteriófagos, como respuesta de adaptación a entornos nuevos y adversos. Se cree que estos elementos genéticos contribuyen a la aparición de agentes patógenos con mayor virulencia, supervivencia ambiental y persistencia en los sistemas alimentarios (FAO, 2011). E. coli es un patógeno involucrado tanto en cuadros de diarrea, como en infecciones extraintestinales en las que se incluyen las de vías urinarias. A partir de los años cuarenta del siglo pasado se aceptó la participación de ciertos tipos antigénicos específicos de E. coli (serotipos) en la patogénesis de la diarrea. Lo anterior en conjunto con las características clínicas del padecimiento (diarrea aguda, persistente, con sangre, etc.), distribución epidemiológica y la presencia de factores de virulencia específicos, dio lugar a que E. coli asociada con la etiología de la diarrea se integrara en los siguientes grupos: E. coli enteropatógena (EPEC), enterotoxigénica (ETEC), enterohemorrágica (EHEC), enteroinvasiva (EIEC), con adherencia difusa (DAEC) y enteroagregativa (EAEC). Además de los grupos antes referidos, hay cepas que producen infecciones extraintestinales como las septicemias (ExEC) y las de vías urinarias (UPEC) (Rosario et al., 2008). Los diferentes patotipos (poblaciones de la misma especie que difieren por su capacidad patogénica) se distinguen de la microbiota normal, por el hecho de presentar lo que se consideran como factores de virulencia, los cuales son adquiridos principalmente por la transferencia horizontal de genes presentes en plásmidos, fagos y/o el genoma de otras bacterias. Las cepas de estos grupos presentan antígenos de superficie (antígeno somático y/o flagelar) diferentes, mecanismos de patogenicidad específicos que ocasionan infecciones y síndromes diferentes (Rosario et al., 2008). Tabla 1. Características de patotipos de E. coli causantes de diarrea Patotipo Epidemiología Síntomas clínicos Genotipo ETEC Niños menores de cinco años y diarrea del viajero Diarrea aguda acuosa ST y LT EHEC Niños y adultos que la adquieren por comer carne cruda o mal cocida Diarrea, dolor abdominal, fiebre y vomito Stx1, Stx2 STEC Jóvenes y adultos mayores Diarrea suave hasta sanguinolenta grave, la infección puede transformarse síndrome urémico hemolítico Stx1 EPEC Niños menores de seis meses Diarrea aguda, dolor abdominal, vómito y fiebre. Bfp EAEC Recién nacidos y niños menores de dos años Diarrea líquida sin sangre, persistente hasta 20 días Citotoxina (Rodríguez, 2002). Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC) es el agente más frecuente asociado a enfermedades diarreicas agudas en infantes en todo el mundo y el que está asociado con mayor mortalidad y morbilidad en niños menores de 5 años después de rotavirus. Además, se le reconoce como el agente más frecuente asociado a diarrea del viajero. ETEC se caracteriza por expresar la enterotoxina termolábil (LT) y/o la enterotoxina termoestable (ST), son capaces de colonizar el intestino humano mediante más de 22 factores de colonización constituidos por pilis y adhesinas no asociadas a pilis, que permiten la adherencia bacteriana a células intestinales facilitando la colonización del intestino delgado (Gómez, 2014). E. coli enterohemorrágica (EHEC) se caracteriza por provocar diarrea con sangre en hospederos susceptibles, especialmente en adultos, además es capaz de inducir síndrome urémico hemolítico, caracterizado por hemolisis, falla renal y trombocitopenia (Gómez, 2014). EHEC tiene la capacidad de producir una citotóxina con actividad en células Vero (VT), la capacidad toxigénica de las cepas es necesaria para que el paciente desarrolle colitis hemorrágica y diarrea con sangre, ya que la citotóxina Stx (toxina Shiga) es el principal mecanismo de patogenicidad de EHEC y su síntesis está relacionada con la presencia del bacteriófago lisogénico Stx 933W que está insertado en el genoma. La Stx actúa a nivel de síntesis de proteínas ya que se une a la subunidad 60S de los ribosomas de las células intestinales o renales del hospedero. En las cepas EHEC, se han encontrado las variantes Stx1 y Stx2 que son inmunológicamente diferentes, de tal manera que se pueden aislar bacterias que sinteticen alguna de las toxinas o ambas. Además de esta toxina, las EHEC tienen otros mecanismos de patogenicidad como el fenómeno de adherencia y esfacelación; presentan también el gen cromosomal eae que codifica para la proteína de membrana externa de 94 kDa, llamada intimina, cuya expresión es regulada por genes plasmídicos. Actualmente hay al menos dos clasificaciones del grupo EHEC. Una en función de la presencia de sus factores de patogenicidad y otra en función del serotipo (E. coli 0157:H7), que se puede encontrar en bovinos, cabras, borregos y con menos frecuencia en cerdos y pollos; además se ha logrado recuperar de frutas y vegetales como la lechuga, rábanos y alfalfa, así como en productos industrializados como la mayonesa, jugos de naranja y manzana no pasteurizados. La transmisión de E coli O157:H7 puede ser por ingerir carne cruda o mal cocida, leche bronca y agua contaminada. El período de incubación de EHEC es de 1 a 8 días; inicialmente produce diarrea sin sangre, con o sin vómito, dolor abdominal, fiebre, y después de 1 a 2 días la diarrea se torna sanguinolenta y se intensifica el dolor abdominal, de una duración de 4 a 10 días, con heces abundantemente sanguinolentas.Se cura o bien llega a producir el síndrome urémico hemolítico (Rodríguez, 2002). E. coli enteropatógena (EPEC) fue la primera en describirse y es tal vez uno de los microorganismos más estudiados. La infección por EPEC es una de las causas más comunes de diarrea infantil en países en vías de desarrollo, como México. Una de las principales características de la infección es la diarrea de tipo acuoso, que puede ocurrir en diversos grados de intensidad. Además, es común que los niños infectados presenten vómito y fiebre. EPEC induce una alteración histopatológica en el intestino conocida como lesión A/E (adherencia y eliminación). La lesión se lleva a cabo mediante un mecanismo de virulencia complejo que induce la degeneración de las microvellosidades y altera la morfología normal de la región apical del enterocito, en donde se reconocen tres fases a) adherencia inicial b) inyección de factores y transducción de señales y c) contacto íntimo (Vidal et al., 2007). Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) es un agente causal de diarrea persistente en países en desarrollo y están determinadas por su adherencia agregativa, definidas por su patrón de agregación (Okeke y Nataro, 2001). La adherencia agregativa se caracteriza por formar un cúmulo de bacterias unidas a células hospederas, además EAEC es un factor importante que causa diarrea en niños, viajeros y pacientes con VIH (Huang y Dupont, 2004). En ciudades desarrolladas EAEC se asocia con el 32% de los casos agudos de diarrea pediátrica y con el 30% de diarrea persistente. La patogénesis de EAEC tiene 3 etapas, en la primera se adhiere a la mucosa intestinal por medio de una fimbria adherente, en la segunda incrementa la producción de mucosa y biopelícula en la superficie del enterocito, por último una respuesta inflamatoria con liberación de citocinas, toxicidad mucosa y secreción intestinal (Huang et al., 2004). EAEC se adhiere a células denominadas HEp-2, la adherencia a estas células y la hemaglutinación de eritrocitos humanos se debe a la presencia de una fimbria llamada fimbria I de adherencia agregativa (AAF/I), codificada por el gen aggA que se encuentra en un plásmido de 60 MDa. También se ha descrito la fimbria AAF/II inmunológicamente diferente a AAF/I y que está codificada por el gen aafA; sin embargo, no todas las EAEC presentan estas fimbrias (Rodríguez, 2002). Las infecciones del tracto urinario son causa frecuente de consulta médica y también de infecciones intrahospitalarias. Dentro de los agentes más frecuentes de estas infecciones se encuentra E. coli ya que es el agente causal de cerca del 80% de las infecciones del tracto urinario y aunque la mayoría de las infecciones se resuelven adecuadamente gracias al tratamiento antimicrobiano, en los últimos años el aumento de la resistencia a los diferentes antimicrobianos, especialmente dentro de la familia Enterobacteriaceae, ha generado un problema especialmente grave (Valdivieso, 1999). La resistencia antibiótica es un fenómeno biológico natural debido a las mutaciones y a la gran capacidad de las bacterias de transferir horizontalmente su material genético, existiendo una clara correlación entre el uso de antibióticos y la resistencia bacteriana (OMS, 2001). Las enterobacterias a nivel mundial presentan alta resistencia hacia ampicilina (betalactámico), trimetoprim-sulfametoxazol, tetraciclina, cloranfenicol y ácido nalidíxico (Mosquito et al., 2011). Dentro de los mecanismos de resistencia bacteriana destaca el de las betalactamasas de espectro extendido, cuya aparición en los años ochenta se atribuyó al uso masivo de cefalosporinas. Las betalactamasas son una familia de enzimas producidas por bacilos Gram-negativos como E. coli, estas enzimas confieren resistencia a un gran número de antibióticos de uso común como penicilina, ampicilina, cefalosporinas de cualquier generación (excepto cefamicinas), aztreonam e incluso a los betalactámicos asociados a inhibidores de betalactamasas, aminoglucósidos, tetraciclinas y cotrimoxazol (García et al., 2011). La ampicilina es un betalactámico de espectro moderado, cuyo mecanismo de acción se da al interferir en las últimas fases de la síntesis del peptidoglucano, componente necesario en la formación de la pared bacteriana. Uno de los principales mecanismos de resistencia hacia los betalactámicos es la hidrolisis enzimática, que es debida a la presencia de enzimas llamadas betalactamasas que se caracterizan por hidrolizar el enlace amida del núcleo betalactámico, inactivando de esta manera el antibiótico antes de que genere cualquier efecto (Mosquito et al., 2011). Las tetraciclinas son una familia de antibióticos cuyo mecanismo de acción es unirse a la parte 16S, de la subunidad 30S del ribosoma bacteriano, de manera que se inhibe la síntesis de proteínas al evitar la unión del aminacil-tRNA en la posición A del ribosoma. El mecanismo de resistencia más común hacia este antibiótico es mediante sistemas de eflujo, en Gram negativos éstos están codificados por los genes tetA, tetB, tetC, tetD, tetE, tetl y tetY; sin embargo, existen otros mecanismos de resistencia como protección ribosomal y acción enzimática sobre las tetraciclinas codificados por diferentes genes (Chopra, 2001). Además, E coli es una de las bacterias que posee la capacidad de formar biopelículas. Las biopelículas están constituidas por comunidades microbianas complejas que tienen la capacidad, entre otras cosas, de reducir la sensibilidad a los antibióticos convencionales. Las biopelículas o biofilm se encuentran embebidas en una matriz de exopolímeros que las mismas bacterias producen como mecanismo de supervivencia y protección. La composición de esta matriz es variable, puede estar formada de carbohidratos, péptidos y proteínas aunque la mayor parte del volumen la constituye el agua (Branda et al., 2005). La biología de las biopelículas se centra en su ciclo vital e interacciones con el medio ambiente. El ciclo vital es un proceso dinámico que puede ser dividido en tres partes: adhesión, crecimiento y separación. Durante la primera fase, las bacterias, perciben una superficie para posteriormente proceder a formar una unión activa vía apéndices, como fimbria y flagelos. La adhesión de bacterias a una superficie ocurre más fácilmente en aquellas que son más ásperas e hidrofóbicas (Nazar, 2007). E. coli y otras enterobacterias ensamblan fibras amiloides adhesivas denominadas Curli en la superficie de la célula bacteriana que están implicadas en la formación del biofilm, Los Curli intervienen en las interacciones célula-célula y célula superficie para promover la adhesión bacteriana a células de mamíferos y de plantas, así como a superficies inertes como vidrio, acero inoxidable y plástico. Además funcionan como soporte adhesivo y estructural para promover el montaje del biofilm y otros funcionamientos de la comunidad (Cegelski et al., 2009). Durante la segunda fase de crecimiento, la bacteria, una vez adherida, comienza a dividirse y las células hijas se extienden alrededor del sitio de unión, formando una microcolonia, a medida que las células se dividen y colonizan la superficie, las bacterias comienzan a elaborar exopolisacaridos que constituyen la matriz del biofilm y esté comienza a desplegarse en un forma tridimensional. La composición de exopolisacaridos es diferente para cada bacteria. Además estudios recientes señalan que, incluso una misma bacteria, dependiendo de las condiciones ambientales en las que se encuentre, puede producir diferentes exopolisacaridos. Finalmente en la tercera etapa, luego de que el biofilm ha alcanzado la madurez, algunas células, ya sea aisladamente o en conglomerados bacterianos, se liberan de la matriz para poder colonizar nuevas superficies, cerrando el proceso de formación y desarrollo del biofilm. El desprendimiento puede ser resultadode fuerzas externas al biofilm o de procesos activos por esté (Nazar, 2007). Durante la formación de biopelículas interviene un mecanismos de comunicación entre células llamado Quorum sensing mediante el cual las bacterias son capaces de saber cuántas son a través de la producción y detección de la acumulación de una molécula de señalización que secretan a su entorno y así conocer el momento en el que deben actuar para desarrollar sus funciones de la forma más eficaz. Algunas de las actividades fisiológicas de los microorganismos reguladas por mecanismos de Quorum sensing son: adquisición de nutrientes, conjugación, transformación, síntesis de los factores de virulencia, colonización, producción y resistencia a antibióticos, motilidad, esporulación y formación de biofilms (March y Eiros 2012). La formación de biopelículas por microorganismos representa un serio problema para los sectores industriales, de salud y de la producción de alimentos, ya que es una fuente de contaminación microbiológica constante, debido a la dificultad para eliminarlas una vez formadas (Scher et al., 2005). Los biofilm están implicados en enfermedades infecciosas graves y persistentes, incluida la fibrosis quística, otitis media crónica e infecciones del tracto urinario (Cegelski et al., 2009). 2. ANTECEDENTES Dentro de los estudios que se han realizado en el lago de Xochimilco y la zona chinampera, con respecto a la calidad microbiológica del agua y de los vegetales cultivados en esta zona, podemos mencionar los siguientes: Figueroa y colaboradores (2003) cuantificaron indicadores biológicos de contaminación en los efluentes de dos plantas de tratamiento de aguas residuales y en diferentes canales de Xochimilco, los indicadores que evaluaron fue la presencia de coliformes fecales, enterococos, colifagos somáticos, ooquistes de Cryptosporidium sp. y quistes de Giardia sp. en 10 diferentes sitios, cinco efluentes y cinco canales, además realizaron pruebas de susceptibilidad a siete antibióticos En cuanto a la presencia de coliformes fecales se encontró que el agua tratada que se descarga en los canales presentó bajas concentraciones de coliformes fecales con una media de 40.4 NMP/100ml y presentó resistencia a los antibióticos tetraciclina y ampicilina. En 2009 la Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios (COFEPRIS) de la Secretaria de la Salud informó que las delegaciones de Xochimilco, Milpa Alta y Tláhuac presentaron riesgo por contaminación bacteriológica del agua potable, debido a infiltraciones de agua contaminada con heces a las redes de distribución. En el estudio se tomaron 107 muestras de la red de abastecimiento donde el 8.4% presentaron bacterias de origen fecal (E. coli), pese a que la red de agua potable fue clorada. Barrera y colaboradores (2013) evaluaron la contaminación microbiológica en cuatro cuerpos acuáticos, entre ellos el lago de Xochimilco. En su estudio cuantificaron coliformes totales y fecales en muestras de agua y sedimento por medio de la técnica del número más probable, sus resultados indicaron que en el lago de Xochimilco se encuentran bacterias entéricas, como Escherichia coli, Klebsiella spp, Enterobacter spp. y Salmonella. Además, todas las muestras rebasaron los límites establecidos para el agua utilizada para servicios al público por contacto directo. En 2015, Rosas y colaboradores llevaron a cabo el muestreo de cuatro diferentes áreas del lago de Xochimilco, en donde tomaron muestras del lago y de la planta de tratamiento de agua residual justo antes de la liberación en el lago, logrando obtener 800 aislados de Escherichia coli de la planta de tratamiento, agua del lago, sedimento y raíces de plantas acuáticas , realizaron pruebas de formación de biopelículas y pruebas de susceptibilidad antimicrobiana , además evaluaron la presencia del gen catl de resistencia al cloranfenicol por medio de la técnica de PCR. En sus resultados encontraron que, el 20% de las cepas aisladas de las raíces de lirio acuático presentaron formación de biopelículas el 5% de sedimento, el 14% de agua del lago y el 13% del agua de la planta de tratamiento. En la prueba de susceptibilidad a antimicrobianos, la mayor parte de los aislados fueron resistentes a ampicilina; en el caso del cloranfenicol, hubo un mayor porcentaje de resistencia en los aislados provenientes de la planta de tratamiento, y todas las cepas resistentes a este antibiótico presentaron el gen catl. En 2015, la Secretaria de Ciencia y Tecnología (SECITI) realizó el “Censo de descargas de aguas negras y grises en los canales de Xochimilco” en el cual hallaron que a lo largo de 116 km de canales se encontraron 1374 descargas irregulares de aguas negras y grises que llegan directamente a los canales. En su estudio las concentraciones de bacterias coliformes fecales fueron de entre 50 y 1100 número más probable por cada 100 mL (NMP/100 mL), además concluyen que la contaminación de los canales ha generado problemas de salud en los pobladores de la zona. En cuanto a estudios realizados en otros países relacionados con el consumo de alimentos y vegetales contaminados; destaca la presencia de E. coli en los mismos. En 2009, Rivera y colaboradores realizaron un estudio en 85 muestras de hortalizas, entre éstas cebolla, rábano, cilantro, lechuga y perejil, obtenidas de manera aleatoria de los tres principales mercados de Cajamarca, Perú, en el 40% de las muestras se determinó la presencia de coliformes fecales, principalmente en muestras de perejil y lechuga que presentaron los índices más altos de contaminación, con una concentración superior a 1000 NMP/gramo vegetal de coliformes fecales. La presencia de E. coli se detectó en más del 24% del total de muestras analizadas, principalmente en perejil, lechuga y rábano. En 2015 Heiman y colaboradores analizaron brotes notificados de infecciones causados por Escherichia coli O157 productora de la toxina Shiga, en Estados Unidos durante el período de 2003- 2012. Entre los datos obtenidos, identificaron 390 brotes, que incluyeron 4928 infecciones intestinales, 1272 hospitalizaciones y 33 muertes; el 65% de la transmisión fue a través de alimentos, el 39.10% fue por contacto de persona a persona, el 39.10% por contacto directo o indirecto con animales, el 15.4% por agua y el 11% correspondió a una enfermedad diferente o desconocida. Además en el caso de la transmisión por alimentos la principal causa fue a través del consumo de carne de res y vegetales de hoja generalmente consumidos crudos. Cabe mencionar que la presencia de bacterias resistentes a antibióticos en el suelo, aguas residuales, aguas superficiales, suministros de agua subterránea, agua potable y vegetales que se consumen crudos, es un problema creciente de salud pública (Reinthaler, 2003). En 2005 López y colaboradores, con el fin de cuantificar y determinar la presencia de Escherichia coli y Salmonella, analizaron 51 muestras de agua y 23 muestras de suelo en cuatro regiones del Valle de Culiacán, Sinaloa, México, y determinaron el perfil de resistencia de Salmonella a ampicilina, ciprofloxacino, trimetoprim-sulfametoxazol, tetraciclina, estreptomicina y gentamicina; los últimos tres antimicrobianos se probaron también en E. coli. En sus resultados no registraron presencia de E. coli y Salmonella en las muestras de suelo; sin embargo, el 98% de las muestras de agua estuvieron contaminadas por E coli, de las cuales se seleccionaron 46 cepas para evaluar el perfil de resistencia a antimicrobianos. 9 cepas fueron resistentes a tetraciclina, 38 fueron resistentes a estreptomicina y sólo una fue resistente a gentamicina, mientras que 23 cepas presentaron resistencia intermedia. En 2014 se dio a conocer el primer informe a nivel global de la Organización Mundial de la Salud (OMS) sobre la resistencia a los antibióticos, dondeseñala que la resistencia está afectado a distintos agentes infecciosos; sin embargo, este reporte se enfoca principalmente a siete grupos bacterianos responsables de infecciones graves como la septicemia, la diarrea, la neumonía, las infecciones urinarias o la gonorrea. Entre los principales hallazgos del informe destacaron la resistencia a antibióticos a carbapenémicos, utilizados para infecciones causadas por Klebsiella pneumoniae; la resistencia a las fluroquinolonas, utilizada en el tratamiento de las infecciones urinarias por Escherichia coli; y la resistencia a la meticilina para personas infectadas por Staphylococcus aureus. Por otra parte en el año 2000, el Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (InDRE) de la Secretaria de Salud, llevó a cabo un estudio con el objetivo de identificar el agente causal del brote de diarrea asociado con el desbordamiento de canal de aguas negras del Valle de Chalco, en su estudio se obtuvieron 1550 hisopos rectales para su aislamiento e identificación bioquímica. En sus resultados obtuvieron que el 0.06% correspondió a Shigella, el 0.045% a Salmonella, el 76.6% a Escherichia coli y el restante fueron bacterias sin importancia médica. En el caso de los aislados de E. coli la mayoría correspondió al serotipo ETEC, donde el 44.6% hibridó con la sonda para la enterotoxina termolábil (LT), el 11.2% con la enterotoxina ST y el 44.1% con ambas sondas. 3. JUSTIFICACIÓN El consumo de vegetales y agua contaminada con E. coli es una de las principales causas de enfermedades diarreicas en nuestro país. En Xochimilco, al ser un sector importante de producción de hortalizas, es necesario evaluar los niveles de contaminación microbiológica del agua de riego de los vegetales y el suelo que funciona como sustrato de los mismos, así como identificar los patrones de resistencia a los antibióticos, los genes de virulencia en los probables aislados de E. coli, así como determinar el factor de riesgo que se tiene al consumir este tipo de alimentos o al estar en contacto con el agua de los canales. 4. HIPÓTESIS Si la zona chinampera de Xochimilco es recargada con aguas tratadas y existen descargas directas del drenaje de las viviendas de la zona, es probable que se logre el aislamiento de E. coli que es un microorganismo cuyo hábitat primario es el intestino del hombre y de los animales de sangre caliente, por lo que se considera indicadora de contaminación fecal reciente en el ambiente, existiendo además la probabilidad de que presenten resistencia a antimicrobianos, lo que puede constituir un factor de riesgo para la salud humana. 5. OBJETIVOS Objetivos generales ° Evaluar cualitativa y cuantitativamente la presencia de bacterias coliformes totales y fecales en muestras de agua de un canal adyacente a la zona de cultivo, suelo y vegetales en un sitio de la zona chinampera de Xochimilco. ° Determinar la presencia de factores de patogenicidad de los aislados de Escherichia coli a través de la identificación de genes de virulencia, formación de biopelículas y susceptibilidad a antimicrobianos. Objetivos particulares ° Evaluar la concentración de coliformes totales y coliformes fecales en muestras de agua, suelo y vegetales, a través de la técnica de número más probable. ° Identificar a través de pruebas bioquímicas los aislados presuntivos de E. coli. ° Evaluar la susceptibilidad a distintos antibióticos en los aislados de E. coli, así como la capacidad de formación de biopelículas. ° Identificar los genes de virulencia para E. coli EAEC (pCVD432) y STEC (Stx1) a través de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). ° Determinar el riesgo potencial hacia los humanos, con base en los patrones de resistencia a los antibióticos y los factores de virulencia encontrados en los aislados de E. coli. 6. MATERIALES Y MÉTODOS 6.1 Área de estudio El estudio se realizó en la zona chinampera de San Gregorio Atlapulco, Xochimilco, y en un mercado cercano a la zona chinampera. Se realizaron 4 muestreos en los meses de Septiembre del 2015, Enero, Marzo y Abril del 2016, el mes de Septiembre se consideró como época de lluvias, el mes de Enero como secas frías, mientras que los meses de Marzo y Abril se consideraron como secas- cálidas. Se seleccionó una chinampa con cultivo mixto con siembra de cilantro y lechuga que presentara un canal de agua cercano con el que fuera regada el área de cultivo. Figura 1. Zona de estudio, San Gregorio Atlapulco (Google Earth). Se determinó la localización geográfica de la zona de estudio por medio de un GPS GARMIN 12XL y se tomaron muestras de suelo, agua y hortalizas. Figura 2. Zona Chinampera. Zona de estudio Las muestras de cilantro (Coriandrum sativum) y lechuga (Lactuca spp.) fueron colectadas en su etapa de cosecha, se colectaron en tres diferentes puntos a lo largo de la chinampa, cada una de las muestras se colectaron como una muestra compuesta, las muestras se cortaron desde la parte más cercana al suelo y se colocaron en bolsas de colecta estériles etiquetadas. Las muestras de suelo asociadas a las plantas, se tomaron con cucharas estériles y se colocaron en bolsas de colecta estériles etiquetadas. Por último, las muestras de agua se tomaron de un canal cercano a la chinampa, por medio de una botella Van Dorn, se colocaron 200 mL en botellas DBO de vidrio previamente esterilizadas y se tomaron los parámetros fisicoquímicos: transparencia, oxígeno disuelto, temperatura, salinidad y pH por medio de un equipo multiparámetros HANNA HI 9829. Las muestras recolectadas se colocaron en una hielera con cuerpos fríos para su transporte y posterior análisis en el laboratorio Figura 3. Toma de muestras de agua 6.2 Análisis microbiológico Se pesaron 10 g de las hojas de cada hortaliza en fresco, en el caso de la lechuga se tomaron las hojas de la parte externa, cada una de las muestras se colocaron en botellas previamente esterilizadas con 90 mL de solución salina estéril al 0.85%, se agitaron por 2 minutos y posteriormente se realizaron diluciones seriadas 1:10, desde la muestra directa hasta la dilución 1:10000. Se pesaron 0.5 g de suelo fresco y se colocaron en botellas previamente esterilizadas con 90 mL de solución salina estéril al 0.85%, se agitaron por 2 minutos y posteriormente se realizaron diluciones seriadas 1:10, desde la muestra directa hasta la dilución 1:10000. De la muestra colectada de agua sin filtrar se tomaron 100 mL y esta se consideró como muestra directa, y a partir de esta se realizaron diluciones seriadas 1:10 desde la muestra directa hasta la dilución 1:10000. Figura 4. Procesamiento de las muestras en el laboratorio De los tubos de dilución de cada una de las muestras (agua, suelo, lechuga y cilantro) se sembraron por espatulado 100 µL en medio de cultivo general agar de soya y tripticaseína (TSA, Bioxon, México) para la cuantificación de bacterias mesofílicas cultivables, y se incubaron las placas a 37°C por 24-48 h. Transcurrido el tiempo de incubación se realizó el conteo de las colonias desarrolladas. Figura 5. Siembra en medio de cultivo TSA 6.2.1 Análisis de bacterias coliformes La concentración de bacterias coliformes totales y fecales se determinó por la técnica del número más probable (NMP) con tubos múltiples de fermentación (TMF) (American Public Health Association, 1985) utilizando tres tubos por dilución. Se Inoculó 1 ml de la muestra directa y de las diluciones en caldo lactosado (BBL, Cockeysville, MD), por triplicado, y se incubaron a una temperatura de 37°C durante 24/48h. Transcurrido el tiempo de incubación, se efectuó la lectura en los tubos. Se consideraron tubos positivos aquellos en los que el medio presentaba turbidez y producción de gasen el interior de la campana Durham. Figura 6. Tubos múltiples de fermentación De los tubos positivos de caldo lactosado se tomaron 100 µL de cada tubo positivo y fueron inoculados en tubos con caldo Bilis Verde Brillante (BD Becton, México), se incubaron durante 24/48h a 37°C y transcurrido el tiempo se realizó la lectura de los tubos, la presencia de gas y turbiedad que apareció en el interior de la campana de Durham fue considerada positiva a la prueba confirmativa de coliformes totales. Figura 7. Tubos en caldo bilis verde brillante Para la fase confirmativa de coliformes fecales se resembraron 100 µL de los tubos positivos de la fase presuntiva de caldo Bilis Verde Brillante en caldo EC (EC; BBL Cockeysville, MD) y se incubaron a 45°C por 24/48 h en baño de agua. La turbiedad y producción de gas en el interior de la campana de Durham se tomaron como positivas para la prueba confirmativa de coliformes fecales. Con base en tablas publicadas por la American Public Health Association (1985) se determinó el número más probable de bacterias coliformes totales y fecales para cada muestra analizada. Posteriormente se tomó una asada de los tubos positivos de caldo EC y se sembraron en agar McConkey (BD Bioxon, México). Se seleccionaron 3 colonias típicas de E. coli (por cada tubo positivo de EC) y se resembraron en medio de cultivo TSA por estriado. Se incubaron durante 24 h a 37°C, para posteriormente aplicar las pruebas bioquímicas. Figura 8. Siembra en medio de cultivo McConkey 6.2.2 Pruebas bioquímicas La identificación de las probables E. coli se realizó con la aplicación de las pruebas bioquímicas de IMVyC (indol, rojo de metilo, Voges-Proskawer y citrato) y oxidasa (O’Leary 1989). A partir de un cultivo fresco de los aislados, se inoculó en el medio semisólido SIM (sulfuro, indol, motilidad) (BD, BBL, USA) mediante un asa bacteriológica recta y se incubaron durante 24-48h a 37°C. Transcurrido el tiempo se verificó si los tubos presentaban turbidez y desplazamiento en el medio, lo que indica motilidad positiva de la bacteria. Figura 9. Prueba de motilidad (SIM) Posteriormente en este mismo medio se realizó la prueba de indol, se agregaron 2 a 3 gotas del reactivo de Kovac’s a cada tubo. La prueba de indol determina la habilidad de la bacteria para producir triptofanasa y oxidar el triptófano con producción de indol. La triptofanasa hidroliza el triptofano con la producción de anillos indólicos. La adición del reactivo de Kovac´s detecta la presencia de los anillos indólicos libres y por lo tanto, indirectamente la producción de la enzima triptofanasa. E. coli es positiva a esta prueba. En este medio se determinó también la capacidad de la bacteria para producir o no ácido sulfhídrico (H2S), que se forma cuando algunas bacterias reducen los aminoácidos sulfurados del medio de cultivo hasta ácido sulfhídrico, el cual se transforma en sulfito de Fe, formando un precipitado negro a lo largo de la picadura (prueba positiva). Para E. coli la producción de H2S fue negativa. Figura 10. Prueba de indol Para la prueba de rojo de metilo se tomó una azada de un cultivo fresco y se inoculó en caldo MR-VP (BD Bioxon, México), se incubaron las muestras a 37°C por 24 h y transcurrido el tiempo se añadieron dos gotas de rojo de metilo al 0.04%. Con esta prueba se determinó la producción de ácido a partir de la utilización de la glucosa. La prueba positiva adquirió un color rojo y la negativa una coloración amarilla. E. coli reaccionó positivamente a esta prueba. En este mismo medio se realizó la prueba de Vorges-Proskawer que nos indica la habilidad del microorganismo para producir acetoína a partir de la glucosa. Se añadieron 0.6 ml de alfa naftol (Sigma-Aldrich, USA) al 5% en alcohol etílico absoluto y 0.2 mL de hidróxido de potasio (JT Baker, México) al 40% y se dejó en reposo por 10 min. Una prueba positiva torna la superficie del medio roja y si es negativa queda sin color. E. coli es negativa a esta prueba. La prueba de Citrato de Simmons se usó para determinar la capacidad de la bacteria de utilizar al citrato como única fuente de carbono. Se tomó una azada de cultivo fresco y se sembró en la superficie inclinada de tubos con agar Citrato Simmons (BD Bioxon, México), se incubaron a 37°C por 24/48 h, transcurrida la incubación se verificó si en los tubos había cambio de coloración en el medio. En esta prueba las bacterias al utilizar el citrato como fuente de carbono, liberan residuos de sodio, que al unirse con radicales hidroxilo alcalinizan el medio. Bajo estas condiciones el indicador de pH cambia de color verde a color azul. La prueba se consideró positiva si se observó cambio en el medio de color verde a azul. E. coli es citrato negativa. Figura 11. Prueba de Citrato de Simmons Para la prueba de agar hierro Kligler (BD Bioxon, México), se tomó una azada de un cultivo fresco en medio TSA y se resembró en medio de cultivo Hierro-Kligler, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie inclinada del medio, se incubaron a 37°C por 18/24h y transcurrido el tiempo se llevó a cabo la lectura de los tubos. Este medio es utilizado para la diferenciación de enterobacterias; se basa en la fermentación de glucosa, lactosa y producción de ácido sulfhídrico. Por la fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira a color amarillo en medio ácido, lo cual indica que el microorganismo fermenta la glucosa y la lactosa; la presencia de burbujas o ruptura del medio de cultivo indica que el microorganismo produce gas. E. coli es positiva a la prueba de fermentación de glucosa y lactosa, y generalmente negativa a la producción de ácido sulfhídrico. Figura 12. Agar Hierro- Kligler El objetivo de la prueba de oxidasa es determinar la producción de la enzima citocromo c oxidasa. Para realizarla se impregnó un trozo de papel filtro con 2-3 gotas de solución acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil p-fenildiamina (Sigma, USA). Con ayuda de un palillo estéril se tomó una colonia del cultivo fresco en medio TSA y se frotó sobre la superficie del papel filtro. La aparición de un color púrpura intenso en 10 segundos indicó una prueba positiva, las reacciones tardías se ignoraron. Si no hubo viraje en la coloración se consideró oxidasa negativo. Las bacterias que producen esta enzima son capaces de oxidar el reactivo con la consecuente aparición del color púrpura. Escherichia coli, al carecer de citocromo c oxidasa, no expresa el color púrpura característico de la prueba. Figura 13. Prueba de oxidasa aplicada a aislados presuntivos de E. coli. Con base en los resultados de las pruebas bioquímicas se identificaron como Escherichia coli los aislados que fueron positivos a la prueba de indol, rojo de metilo, glucosa positivas (fondo ácido en agar Kligler) y lactosa positivas (pico ácido en agar Kligler), y negativos a la prueba de Vorges-Proskawer, citrato y oxidasa. En total se identificaron 275 cepas de E. coli. Posteriormente los aislados de E. coli se sembraron en medio de cultivo TSA y se cosechó toda la muestra en crioviales con caldo Luria Bertani (Alpha Biosciences, Inc., USA) con 20% de glicerol, con el fin de conservar los aislados a -70°C. 6.2.3 Susceptibilidad antibiótica Los aislados identificados cómo E. coli se resembraron en medio de cultivo TSA y se realizó una suspensión bacteriana a partir del cultivo fresco, en tubos de dilución con solución fisiológica salina estéril al 0.45% y se ajustó al 0.5 de turbidez de McFarland con ayuda de un densitometro densiCHEK plus (BioMéricus, Inc, Durham, North Carolina, USA). Posteriormente se inoculó en agar Mueller-Hinton (Bioxon, México) y se distribuyó de manera homogénea sobre la placa con ayuda de un hisopo de algodón estéril, se dejó absorberpor unos minutos antes de aplicar los discos para antibiograma (Oxoid, Basingstoke, Hants, UK). Se colocaron 6 discos por caja: Sulfonamidas 300µg, Ampicilina 10µg, Tetraciclina 30µg, Trimetoprima 5 µg, Cefalotina 30µg y Cefotaxima 30µg. Las placas se incubaron invertidas a 35° durante 18 h. Transcurrido el tiempo, se midió el halo de inhibición en mm de cada uno de los sensidiscos. Figura 14. Prueba de suceptibilidad antimicrobiana 6.2.4 Formación de Biopelículas Se sembraron en medio TSA las muestras identificadas como E. coli, un control positivo de EAEC (E. coli O42) y un control negativo (E. coli K12), las muestras se dejaron incubar por 18h a 37°C. Posteriormente cada uno de los aislados se ajustó al 0.5 de turbidez de McFarland en tubos de dilución con 3 ml de solución fisiológica salina estéril al 0.45%. En una microplaca estéril de 96 pozos se colocaron 200 µL de medio líquido MEM+glucosa (1g/L) estéril que fue considerado como blanco (con tres réplicas); en los demás pozos se colocaron 180 µL del medio MEM+glucosa; posteriormente se inocularon 20 µL de la suspensión bacteriana de las cepas en cada uno de los pozos, se consideraron 3 réplicas por muestra. Todas las placas se incubaron a 37°C por 24 h. (Beehan et al., 2015). Transcurrido el tiempo de incubación, se retiró el medio de cultivo con el inóculo y se lavó con agua estéril cada uno de los pozos (3 veces); se agregaron 200 µL de cristal violeta al 0.4% en cada pozo y se dejó teñir durante 10 minutos. Nuevamente se retiró el colorante y se enjuagó 3 veces cada uno de los pozos con agua estéril. Se agregaron 200 µL de etanol al 96%, se dejó actuar por 20 min y se leyó la placa en un lector de microplaca xMARK; BioRad, a 570 nm con 1 minuto de agitación orbital. Figura 15. Prueba de formación de biopelícula en microplaca 6.2.5 Genes de virulencia A partir de los 275 aislados de E. coli, se seleccionaron los aislados que presentaron biopelícula, y se realizó una extracción de ADN por hervido. Para la extracción del ADN se tomó una asada del cultivo fresco de cada cepa y se resuspendió en un tubo Eppendorf con 1 mL de agua Milli-Q estéril, se hirvió a 100°C durante 10 min y se centrifugó por 5 minutos a 14,000 rpm. Posteriormente se recuperó el sobrenadante y se refrigeró hasta su uso. Tabla 2. Mezcla de reacción Reactivos Concentración Buffer 5 µL Mg Cl2 1.5 µL Primer F 2 µL Primer R 2 µL dNTP´s 1 µL Taq polimerasa 0.1 µL DNA 5 µL Agua 33.4 µL Se colocó en un termociclador Gene Amp PCR Sistem 9009 AB Applied Biosystems (Singapur) con 30 ciclos con las siguientes condiciones: Tabla 3. Condiciones de temperatura Temperatura Tiempo 95°C 5 minutos 95°C 20 segundos 53°C 10 segundos 72°C 10 segundos 72°C 2 minutos *Condiciones de temperatura para StX1 *Condiciones de temperatura para pCVD432 Para verificar la amplificación de los genes, se realizó una electroforesis en gel de agarosa a 1.5%. Terminado el tiempo de corrida se tiñó el gel en bromuro de etidio y se observó en un transiluminador de UV MacroVue Uvis-20 Hoefer (E.U.A). Temperatura Tiempo 95°C 5 minutos 95°C 1 minuto 53°C 1.5 minutos 72°C 1.5 minutos 72°C 2 minutos 7. RESULTADOS 7.1 Parámetros Físico-Químicos En la tabla 5 se muestran los parámetros físico-químicos del agua de los muestreos realizados en los meses de septiembre del 2015, enero, marzo y abril del 2016. La mayor profundidad del canal (120 cm) se obtuvo en el mes de septiembre que corresponde a la temporada de lluvias y la más baja en enero (70 cm), que corresponde a la temporada de secas frías; en este mes se registró también la temperatura más baja de la zona (9.13°C). La transparencia fluctuó entre 27-58 cm y el oxígeno disuelto entre 4.39mg/L en enero (secas frías) y 6.32 mg/L en marzo (secas calientes). La salinidad varió entre 0.39-0.54 (ppt) y el pH en general se mantuvo ligeramente ácido entre 6.13 a 6.87. Tabla4. Coordenadas geográficas de los tres puntos de muestreo de la chinampa de estudio. Latitud E Longitud N Parcela 494584 2129206 494585 2129217 494590 2129242 Canal 494546 2129139 *Coordenadas UTM Tabla 5. Resultados de los parámetros físico-químicos del agua de los cuatro meses muestreados del canal adyacente al área de muestreo. Parámetro Septiembre Enero Marzo Abril Profundidad (cm) 120 70 104 104 Transparencia (cm) 40 58 27 27 Temperatura (°C) 10.09 9.13 13.33 13.46 Oxígeno disuelto (mg/L) 4.94 4.39 6.32 5.30 Salinidad (ppt) 0.54 0.39 0.42 0.42 pH 6.5 6.87 6.13 6.77 7.2 Análisis Microbiológico 7.2.1 Bacterias mesofílicas cultivables En la tabla 6 se muestran las concentraciones de bacterias mesofílicas cultivables (BMC) en agua, suelo, lechuga y cilantro. La concentración más altas de las muestras de agua se registró en el mes de abril con 1150x10 3 unidades formadoras de colonias por mililitro de agua (UFC/mL) y la más baja en enero con 27x10 3 UFC/mL las muestras de suelo presentaron las concentraciones más elevadas durante los meses de marzo y abril (6600 y 7300x10 3 UFC/0.5 g, respectivamente), que corresponden a la temporada de secas cálidas. En relación a las muestras de vegetales, en general las concentraciones de BMC fueron más altas en la lechuga y el cilantro adquiridos en el mercado, en comparación con las colectadas en la parcela. En la lechuga de la parcela se obtuvieron concentraciones entre 121-250x10 3 UFC/g y en la del mercados entre 370-1720x10 3 UFC/g; en las muestras de cilantro, las concentraciones del colectado en la parcela fluctuaron entre 71-308x10 3 UFC/g y las del mercado entre 550-1650x10 3 UFC/g. Se observa que las concentraciones más bajas se obtuvieron durante la temporada de lluvias (septiembre) y de secas frías (enero) y las más altas durante secas-cálidas (marzo-abril). Tabla 6. Concentración (UFC/103) de bacterias mesofílicas cultivables en muestras de agua, suelo y vegetales.4 Mes Agua Suelo Parcela Mercado UFC/mL UFC/0.5g Lechuga UFC/g Cilantro UFC/g Lechuga UFC/g Cilantro UFC/g Septiembre 76 890 121 71 370 550 Enero 27 3100 162 78 990 680 Marzo 81 6600 171 251 1180 1320 Abril 1150 7300 250 308 1720 1650 UFC: Unidades formadoras de colonias 7.3Coliformes totales y fecales En la tabla 7 se presenta el número más probable (NMP) de coliformes totales, en la tabla 8 se presenta el número más probable de coliformes fecales de las muestras de agua, suelo y vegetales. En todas las muestras de agua se registraron coliformes fecales con un NMP superior a 1000 NMP/100 mL, principalmente durante los meses de marzo y abril (secas cálidas) en los que se alcanzaron concentraciones de 1.1x10 6 NMP/100 mL. En las muestras del suelo de la parcela las concentraciones de coliformes fecales fueron menores, desde no detectables en el mes de septiembre, hasta 930 NMP/0.5g en el mes de abril. En relación a los vegetales, las concentraciones de coliformes fecales fueron superiores en las muestras adquiridas en el mercado que en las tomadas de la parcela. En la lechuga de la parcela se registró un NMP/g de 91 en enero a 2.9x10 3 en marzo; en la del mercado las concentraciones fluctuaron entre 230 (en septiembre) a 24x10 3 NMP/g (en marzo). En el cilantro de la parcela no se detectaron coliformes fecales en ninguna de las muestras y en el mercado se obtuvieron concentraciones desde 36 NMP/g en abril, hasta 46x10 3 NMP/g en el mes de marzo. Tabla 7. Número más probable de coliformes totales (CT) en muestras de agua, suelo y vegetales. Mes Agua NMP/100mL Suelo NMP/0.5g Lechuga de parcela NMP/g Cilantro de parcela NMP/g Lechuga de mercado NMP/g Cilantro de mercado NMP/g Sep. 11x10 3 4.6x10 3 930 36 11x10 3 46x10 3 Enero 1.5x10 3 430 91 91 110x10 3 24x10 3 Marzo 1.1x10 6 24x10 3 24x10 3 150 46x103 110x10 3 Abril 1.1x10 6 46x10 3 24x10 3 72 460x10 3 4.6x10 3 Tabla 8. Número más probable de coliformes fecales (CF) en muestras de agua, suelo y vegetales. Mes Agua NMP/100mL Suelo NMP/0.5g Lechuga de parcela NMP/g Cilantro de parcela NMP/g Lechuga de mercado NMP/g Cilantro de mercado NMP/g Sep. 2.4x10 3 ND 160 ND 230 930 Enero 1.5x10 3 430 91 ND 2.4x10 3 4.6x10 3 Marzo 1.1x10 6 360 2.9x10 3 ND 24x10 3 46x10 3 Abril 1.1x10 6 930 2.4x10 3 ND 11x10 3 36 7.4 Identificación Con base en las pruebas bioquímicas aplicadas se lograron identificar un total de 275 aislados como Escherichia coli, de las cuales 134 se aislaron de las muestras de agua, 47 de las muestras de lechuga de mercado, 40 de muestras de cilantro del mercado, 32 de lechuga de parcela y 22 de muestras de suelo. Figura 16. Número de aislados totales identificados como E. coli. 134 47 40 32 22 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Agua Lechuga mercado Cilantro mercado Lechuga parcela Suelo Agua Lechuga mercado Cilantro mercado Lechuga parcela Suelo 7.5 Resistencia antibiótica El resultado de la susceptibilidad a los antimicrobianos se obtuvo con base en los puntos de corte para Enterobacterias publicados por la CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, 2007) mostrados en la tabla 9. Tabla 9. Puntos de corte para los agentes antimicrobianos probados. Agente antimicrobiano Concentración del disco Diámetro de la zona de inhibición (mm) R I S Ampicilina 10 µg <13 14-16 >17 Tetraciclina 30 µg ≤11 12-14 >15 Trimetroprima 5 µg <10 11-15 >16 Tetraciclina 30 µg <11 12-14 >15 Sulfonamidas 300 µg <12 13-16 >17 Cefalotina 30 µg <14 15-17 >18 Cefotaxima 30 µg <14 15-22 >23 R: resistentes; I: intermedios; S: Sensibles. De los 275 aislados de E. coli, 54% fueron sensibles a los seis antimicrobianos probados y el 46% fue resistente al menos a un antibiótico. El 13% presentó resistencia sólo a un antibiótico, el 6% a dos antibióticos, el 7% a tres antibióticos, el 14% a cuatro antibióticos y solamente el 2% y el 4% presentaron resistencia a cinco y seis antibióticos, respectivamente. Figura 17. Porcentaje de susceptibilidad a los antimicrobianos. 54% 13% 6% 7% 14% 2% 4% Sensibles a todos los antibioticos Resistentes a 1 antibiotico Resistentes a 2 antibioticos Resistentes a 3 antibioticos Resistentes a 4 antibioticos Resistentes a 5 antibioticos Resistentes a 6 antibioticos El antibiótico al que presentaron mayor resistencia fue la tetraciclina, con 101 aislados resistentes, seguido de la ampicilina con 86 aislados, la trimetoprima con 73 y la sulfonamida con 66 aislados resistentes. El menor número de aislados resistentes se presentó con la cefalotina (33) y la cefotaxima (12), que son cefalosporinas de primera y tercera generación, respectivamente como se presenta en la tabla 10. Tabla 10. Número de bacterias resistentes, sensibles e intermedias a los antibióticos probados. Antibiótico Resistente Intermedio Sensible Ampicilina 86 4 184 Tetraciclina 101 5 171 Trimetoprima 73 0 202 Sulfonamidas 66 0 209 Cefalotina 33 36 207 Cefotaxima 12 0 263 La mayoría de las cepas resistentes fueron aisladas del agua del canal (tabla 10), seguido de la lechuga del mercado, el cilantro del mercado y el menor número se registró del suelo y de la lechuga de la parcela. Tabla 11. Origen de las cepas resistentes a los antimicrobianos Antibióticos Agua Suelo Parcela Mercado Lechuga Cilantro Lechuga Cilantro Ampicilina 37 1 0 0 33 15 Tetraciclina 53 2 0 0 40 6 Trimetoprima 30 2 1 0 35 8 Sulfonamidas 22 1 1 0 34 8 Cefalotina 15 0 2 0 11 4 Cefotaxima 7 0 0 0 5 0 7.6 Formación de Biopélicula De acuerdo con la clasificación de Christensen y colaboradores (1985), la capacidad de adherencia de las cepas probadas se puede dividir en cuatro categorías con base en la densidad óptica del blanco a 570 nm: OD ≤ ODc no adherente ODc < OD≤ 2 X ODc débilmente adherente 2X ODc < OD ≤ 4 X ODc moderadamente adherente 4X ODc < OD fuertemente adherente OD: Densidad óptica a 570 nm ODc: Densidad óptica del control negativo (medio de cultivo) La densidad óptica del control negativo fue ≤ 0.1 nm. Todos los aislados que presentaron en promedio de las cuatro réplicas lecturas superiores 0.1 nm se consideraron cepas con capacidad de formar biopelículas. La cepa Escherichia coli O42, control positivo de adherencia, en promedio registró una lectura de 0.920 nm. En los 275 aislados identificados como E. coli, 218 no presentaron adherencia (79%), 54 aislados fueron registrados como débilmente adherente (19%), 5 fueron moderadamente adherente (2%) y ningún aislado se registró como fuertemente adherente como se presenta en la tabla 12. Tabla 12. Número de aislados con formación de biopelícula. Categoría No. de cepas Porcentaje (%) No adherente (0) 218 79 Débilmente adherente (+) 54 19 Moderadamente adherente (++) 5 2 Fuertemente adherente (+++) 0 0 7.7 Genes de virulencia De los 275 aislados de Escherichia coli, se les evaluó la presencia de los genes Stx1 y pCVD432 a los aislados que habían presentado formación de biopelícula, sin embargo en los aislados hubo ausencia de ambos genes como se muestra en la figura 18. Para el gen pCVD432 se utilizó como control positivo Escherichia coli enteroagregativa. Figura 18. Resultados de PCR negativos para los genes en gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. Carril 1: marcador de peso molecular Carril 2: control positivo Stx1 Carril 3: control positivo pCVD43 Carril 4-8: muestras negativas de Escherichia coli 8. DISCUSIÓN Los parámetros físico-químicos brindan información extensa de la naturaleza de las especies químicas del agua y sus propiedades físicas (Orozco et al., 2005). El conocimiento de las características físico-químicas del agua, constituye una herramienta importante para gestionar adecuadamente este recurso. Dentro de los indicadores a tener en cuenta son la temperatura, el potencial redox, el oxígeno disuelto y el pH, ya que éstos regulan el fenómeno altamente complejo de liberación de nutrientes, metales y materia orgánica (Betancourt et al., 2008). El análisis del agua revela la presencia de gases, elementos minerales y orgánicos en solución o suspensión. Estos elementos tiene un origen natural y antrópico que definen la calidad del agua, de acuerdo a los diversos usos posibles (Betancourt y Rodríguez, 2009). En este estudio se tomaron los parámetros físicos químicos con el objetivo de contar con un mejor panorama de las condiciones en las que se encontraba el canal de agua muestreado. La temperatura y el oxígeno disuelto son factores que influyen en la mayoría de los procesos vitales de los organismos, así como en varios factores abióticos del ecosistema (Betancourt et al., 2009). Estas variables físico-químicas juegan un papel importante en la intensidad de los procesos fotosintéticos, remineralización de la materia orgánica y liberación de nutrientes y metales (Bostrom et al., 1988; Harris, 1999). En este estudio las concentraciones más bajas de oxígeno disuelto (4.39 mg/L), se reportaron en el mes de enero, que corresponde a la temporada de secas frías, y septiembre que corresponde a la temperatura de lluvias. Además hay que considerar que el área muestreada, es una zona urbanizada por lo que probablemente el área muestreada reciba la descarga directa de drenajes, y en consecuencia, se presente un aumento en la concentración de materia orgánica, la cual requiere concentraciones altas de oxígeno para su degradación, además de tener en cuenta que el canal muestreado, es un canal aislado que carece de recirculación. Por otra parte los valores más altos de oxígeno disuelto se registraron en los meses de marzo yabril (6.32 y 5.30 mg/L). De acuerdo con el segundo informe de validación en campo de la zona lacustre ejidos de Xochimilco y San Gregorio Atlapulco (2012), los valores de oxígeno disuelto reportados para la zona de San Gregorio fue de entre 6.0 mg/L, el cual es un valor similar a los reportados en este estudio. En el caso de la temperatura el valor más bajo registrado fue de 9.13°C en el mes de enero que corresponde a la temporada de secas frías. La temperatura es un factor abiótico que participa en procesos vitales para los organismos vivos, así como también afecta las propiedades químicas y físicas de otros factores abióticos en un ecosistema. El efecto de la temperatura desempeña un papel fundamental en el metabolismo, la nutrición y la reproducción de los microorganismos, así como en el desarrollo de adaptaciones moleculares para sobrevivir en ambientes con temperaturas extremas (Fuentes y Massol, 2002). La temperatura más alta se registró en el mes de marzo y abril que generalmente se caracterizan por presentar temperaturas elevadas; la temperatura a la que sobrevive E. coli, es 37°C, sin embargo se ha reportado que algunas cepas son capaces de crecer entre 7°C y 50°C. La temperatura puede jugar un papel importante para que la bacteria permanezca en el ambiente y se presente un aumento en las concentraciones de E. coli durante los meses cálidos del año, como lo fue en el caso de este estudio en los meses de marzo y abril. En el caso del pH, en 2012 en los meses de Septiembre a Diciembre, CONAGUA reportó para los canales de San Gregorio Atlapulco valores de entre 7.9 y 11.7, es decir valores de pH básicos. En este estudio los valores registrados en los cuatro meses muestreados son ligeramente ácidos, con valores entre 6.5 y 6.87. De acuerdo con Small y colaboradores (1994), microorganismos como E. coli crecen normalmente en rangos de pH de 5 a 9. En cuanto a la transparencia, los valores más bajos se registraron en el mes de marzo y abril (27 cm), por lo que es probable que en estos meses se presentara un incremento de partículas suspendidas a lo largo de la columna de agua muestreada, como pueden ser arcillas, materia orgánica e inorgánica, así como compuestos solubles y microorganismos. De acuerdo con la NOM NMX-AA-038-SCFI-2001 la transparencia del agua es muy importante cuando está destinada al consumo humano, a la elaboración de productos destinados al mismo y a otros procesos de manufactura, que requieren el empleo de agua con características específicas, razón por la cual, la determinación de este parámetro es muy útil como indicador de la calidad de agua y juega un papel importante en el desempeño de las plantas de tratamiento de agua, en este caso, el valor de este parámetro es importante ya que este recurso está destinado a la producción de hortalizas para consumo humano. En cuanto a la profundidad de la columna de agua, el valor más alto se reportó en el mes de septiembre (120 cm) que corresponde a temporada de lluvias por lo que los niveles de profundidad aumentan en los canales, por otra parte el valor más bajo se registró en el mes de enero (70 cm), que corresponde a la temporada de secas frías por lo que a diferencia del mes de septiembre, los niveles de profundidad disminuyen evidentemente. En este estudio las muestras de agua tomadas durante los cuatro meses muestreados, rebasan los límites máximos permisibles establecidos en la NOM-003-ECOL-1997 que establece los límites máximos permisibles de coliformes fecales para aguas residuales tratadas que se reúsen en servicio al público es de 240 NMP/100mL y para el reúso con contacto directo u ocasional de 1000 NMP/100mL. Esta norma considera el agua que se destina a actividades donde el público usuario esté expuesto directamente o en contacto físico con los siguientes reúsos: llenado de lagos y canales artificiales recreativos con paseos en lancha, remo, canotaje y esquí; fuentes de ornato, lavado de vehículos, riego de parques y jardines; y el reusó en servicios al público con contacto indirecto u ocasional, el que se destina a actividades donde el público en general esté expuesto indirectamente o en contacto físico incidental y que su acceso es restringido, ya sea por barreras físicas o personal de vigilancia, como: riego de jardines y camellones en autopistas, camellones en avenidas, fuentes de ornato, campos de golf, abastecimiento de hidrantes de sistemas contra incendio, lagos artificiales no recreativos, barreras hidráulicas de seguridad y panteones. Las concentraciones más elevadas de coliformes fecales y totales en muestras de agua se reportaron en el mes de marzo y abril (1100000 NMP/100mL), que corresponden a la temporada de secas cálidas, en estos meses se registraron las temperaturas más elevadas (13.4°C), por lo que probablemente este parámetro fue un factor importante para que los valores de E. coli aumentaran en ambos meses, ya que contaba con mejores condiciones de temperatura para su permanencia en el ambiente. Por otra parte las concentraciones más bajas de coliformes fecales se registraron en el mes de septiembre que corresponde a la temporada de lluvias (10.09°C), en donde se registra un aumento en los niveles de precipitación y disminución de la temperatura, lo que propicia una disminución en las concentraciones de coliformes en esta temporada debido al efecto de dilución ocasionado por el incremento en el nivel del agua y las temperaturas bajas que pueden tener un efecto bacteriostático o de aletargamiento. Por otra parte en las muestras de suelo, en el mes de septiembre, no se logró detectar la presencia de coliformes fecales, sin embargo este resultado no necesariamente sugiere la ausencia de la bacteria, ya que se ha reportado que las bacterias en ambientes desfavorables entran en un estado viable pero no cultivable lo que dificulta su aislamiento en medios de cultivo. Sin embargo Millán y colaboradores (2015) mencionan que factores como la radiación y la falta de agua son factores que pueden disminuir la presencia de bacterias en un medio. Por otra parte la concentración más alta de coliformes fecales se registró en el mes de abril (930 NMP/0.5g) que corresponde a la temporada de secas, por lo que probablemente al igual que en los resultados de las muestras de agua, la temperatura favoreció la permanencia de estas bacterias durante esta temporada, aunque también hay que tener en cuenta que en los meses más cálidos el aporte de agua de los canales es mayor debido a desecación, por lo que el depósito de bacterias puede verse incrementado. Los resultados obtenidos, demuestran que existe contaminación de origen fecal en ambas hortalizas (lechuga y cilantro), por lo que funcionan como vehículos de contaminación microbiana, debido en parte al riego de las mismas con agua que contiene altos niveles de coliformes fecales como se registró en este estudio. Sin embargo, en el caso del cilantro, no fue posible la detección de coliformes fecales en las muestras tomadas de la parcela; en las muestras tomadas del mercado el valor más alto registrado en las muestras de cilantro fue de 46x10 3 NMP/g, mientras que en las muestras de lechuga fue 2.9x10 3 NMP/g. Las concentraciones de coliformes fecales y totales para ambas muestras fueron más elevadas durante el mes de marzo en las muestras provenientes de mercado por lo que es posible que exista un factor externo que incrementa los valores en las concentraciones de ambas muestras, debido probablemente a la falta de higiene en la manipulación de ambos vegetales. Factores como el incremento en la temperatura durante los meses de marzo y abril, pudo haber sido un parámetro de gran importancia, ya que, se vio reflejado en el aumento de los valores registrados de coliformes fecales para las cuatro muestras. De acuerdo con Hernández y colaboradores (2011), la presencia de Escherichia coli
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