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Aprendiendo Biologia

19.7.2022

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Biología

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

POSGRADO EN CIENCIAS
BIOLÓGICAS

Facultad de Medicina

Altas concentraciones de glucosa
inducen un fenotipo profibrótico en
células del epitelio alveolar pulmonar.

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE

MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
(Biología experimental)

P R E S E N T A

Miguel Angel Cid Soto

TUTOR PRINCIPAL DE TESIS: Dr. Moises Selman Lama

COMITÉ TUTOR: Dra. Annie Pardo Cemo. Dr. Guillermo Robles Díaz

MÉXICO, D.F. 2011

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL

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fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el
respectivo titular de los Derechos de Autor.

Agradecimientos

Agradezco a la UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉX ICO por la
oportunidad de dejarme estudiar en ella.
Agradezco al Posgrado e Ciencias Biológicas UNAM por darme la oportunidad de
estudiar en este plan de estudios.

Agradezco al CONACYT por el apoyo de la beca que recibí por parte de la
institución. ( CVU 294701 y registro N° 225563)
Agradezco a los miembros de mi comité tutoral: Dra. Annie Pardo Cemo y Dr.
Guillermo Robles Díaz por la ayuda, los conocimientos, el apoyo y la comprensión
aportados durante la realización de este trabajo.
A mi tutor el Dr. Moisés Selman por el tiempo, la comprensión, los conocimientos, el
apoyo constante, las atenciones y principalmente por darme la oportunidad de
trabajar con él durante este periodo.

Agradecimientos personales
Agradezco a mis padres Miguel Angel Cid Cervantes y María de Lourdes Soto Pérez y a
mi hermano Héctor Emmanuel Cid Soto por el amor y el cariño brindado, el apoyo
incondicional y todo lo que pueda pedir y necesitar no solo durante este periodo donde
desarrollé la maestría, sino durante todo lo que llevo de vida y me han guiado durante
estos años ya que ustedes han sido pieza clave para que esté en este lugar.
También quiero agradecer a mis abuelitas Meli y Nena y abuelitos que aunque ya no
están, siempre me brindaron todo el amor y el cariño así como todo lo necesario para
salir adelante.
A mis primos y primas Arturo, Nacho Károl, Mariana, Lorena, Priscila, Astrid, Marbella,
Servando, Rubí, Marcos, Diego, Julio, Mauricio, Ethan, Alexis y Michelle por su apoyo y
su cariño en este tiempo, los quiero mucho.
A mis tíos y tías: Eduardo, Ignacio, Jesús, Julio, Francisco, Marco, Miguel, Raúl,
Roberto, Ricardo, Antonio, Serge, Rosa, Carmen, Elena, Eugenia, Guadalupe, Victoria,
dolores, Sonia, María Luisa, Esther, Noemí Angélica, Arcelia y Beatriz por todo lo que
me han brindado.
Un agradecimiento especial a mis compañeros de los laboratorios de Biología Celular,
Biología molecular del INER, Bioquímica de la Facultad de Ciencias y de otros
laboratorios, amigos que estuvieron apoyándome durante este tiempo: Adrián, Yire,
Pablo, Luis, Ana Laura, Memo, Jorge, Miguel Negreros, Iliana, Anita, Carlos, David,

Lalo, Danae, Gaby, Atzi, Ricardo, Paul, Yair, Violeta, Alfredo, Nathalie, Sarai. cada uno
de ustedes han aportado cosas positivas para este trabajo, también agradezco su apoyo,
amistad y los ratos de diversión.
A los miembros de los laboratorios de Biología Celular y biología Molecular del INER
Carlos Ramos, Martha Montaño, Carina Becerril, José Cisneros , Criselda Mendoza, Paty
Zurita, Victor Ruiz, Carolina García de Alba, Marco Checa por su ayuda, buena
disposición y tiempo.
A Reme y Jorge por su ayuda y apoyo en lo que necesité cada que asistí a la Facultad de
Ciencias.

INDICE
RESUMEN 1
INTRODUCCIÓN 3
� Fibrosis pulmonar idiopática 3
� Matriz extracelular 7
� Metaloproteasas de matriz 9
� TIMPs 13
� Transición epitelio mesénquima 13
� Diabetes Mellitus 16
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 20
OBJETIVO 20
MATERIAL Y MÉTODOS 21
� Cultivo celular 21
� Análisis de la tasa de crecimiento 21
� Medición de glucosa 21
� Transición epitelio mesénquima 23
� Expresión génica 25
� Medición de osmolaridad 29

RESULTADOS 30
� Análisis de la tasa de crecimiento 30
� Expresión génica 31

� Transición epitelio mesénquima 40
� Expresión de TGF-β 45
DISCUSIÓN 47
REFERENCIAS 53

Resumen
Se ha sugerido que la diabetes mellitus es un factor de riesgo para desarrollar fibrosis
pulmonar idiopática aunque no se conocen cuales son los mecanismos patogénicos
implicados en la asociación de ambas enfermedades.
Para incrementar nuestro conocimiento acerca de los posibles mecanismos por los cuales la
diabetes mellitus puede incrementar el riesgo a desarrollar fibrosis pulmonar, en este
estudio se evaluaron los efectos que causa un ambiente hiperglucémico en células del
epitelio alveolar de la línea A549 analizando su efecto sobre la proliferación, sobre la
transición epitelio mesénquima (EMT) y sobre la expresión de algunas moléculas que son
consideradas profibrosantes como las metaloproteasas MMP-1 y MMP-7, el inhibidor
tisular de metaloproteasas TIMP-1 y el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β).
Nuestros hallazgos muestran que en condiciones hiperglucémicas se abate la tasa de
crecimiento de las células epiteliales, se incrementa la expresión génica de MMP-1, la cual
es una enzima que se ha encontrado sobre-expresada en pacientes con FPI, y se disminuye
la expresión de MMP-7. Asimismo, encontramos un aumento en la expresión del TIMP-1,
un inhibidor que también se incrementa en el pulmón de los pacientes con FPI. Por otro
lado, una alta concentración de glucosa indujo en las células epitelialesun decremento de la
isoforma inmadura de la E-caderina que interactúa con proteínas del citoesqueleto, lo cual
no se podría considerar como un proceso de TEM ya que no produjo el aumento de la alfa
actina de músculo liso (α-AML) que caracteriza a la transición epitelio-mesénquima.
En conclusión, estos resultados sugieren que las células epiteliales cultivadas en
condiciones que simulan el microambiente diabético sobre-expresan algunas moléculas que
pudieran influir en la remodelación anormal de matriz extracelular que caracteriza a la
fibrosis pulmonar idiopática.

Abstract
It has been suggested that diabetes mellitus is a risk factor for developing idiopathic
pulmonary fibrosis. Although do not know which are the pathogenesis mechanism
involved in the association of both diseases.
To increase our knowledge about of the possible mechanisms by which diabetes mellitus
may increase the risk of developing pulmonary fibrosis in this study evaluated the effects
caused by a hyperglycemic environment in alveolar epithelial cells A549 by analyzing it´s
effect on proliferation epithelial to mesenchymal transition (EMT) and the expression of
some molecules considered profibrotic as the metalloproteases MMP-1 and MMP-7, the
tissue inhibitor of metalloproteases TIMP-1 and transforming grow factor beta TGF-β.
Our findings shows that hyperglycemic conditions lowered the rate of growth of epithelial
cells, increases the gene expression of MMP-1, which is an enzyme that is overexpressed in
IPF patients and decrease the expression of MMP-7. Also found an increase in the
expression of TIMP-1, an inhibitor also increased in the lung of patients with IPF. On the
other hand, a high glucose concentration in epithelial cells induced a decrease in the
immature isoform of the E-cadherin which interacts with cytoskeleton proteins, which
could not be considered process of EMT as it does not cause the increase of alpha smooth
muscle actin (α-SMA) that characterizes the epithelial-mesenchymal transition.
In conclusion, these results suggest that epithelial cells grown in conditions that simulate
the diabetic environment overexpress certain molecules that may influence the abnormal
extracellular matrix remodeling that characterizes idiopathic pulmonary fibrosis.

Introducción
Fibrosis pulmonar idiopática
La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) forma parte de un amplio y heterogéneo grupo de
enfermedades respiratorias conocido como enfermedades pulmonares intersticiales difusas.
Dentro de este conjunto de padecimientos, la FPI pertenece a una subfamilia conocida
como neumonías intersticiales idiopáticas.
La FPI es la más agresiva de las neumopatías intersticiales y se caracteriza por ser
habitualmente progresiva, irreversible y letal en un plazo breve de tiempo(1). La
enfermedad ocurre habitualmente en sujetos mayores de 50 años y alcanza su pico de
incidencia alrededor de los 60 años(1,2).
Durante muchos años se consideró que la patogénesis de la FPI estaba asociada a una
inflamación crónica y persistente, lo que provocaba la respuesta fibrótica; sin embargo,
recientemente se propuso que la enfermedad es el resultado de múltiples microlesiones al
epitelio alveolar, lo que provoca la activación de las células epiteliales las que secretan los
mediadores que provocan la migración, proliferación y activación de células
mesenquimatosas con la formación de focos activos de fibroblastos/miofibroblastos que
finalmente provocan la acumulación excesiva de matriz extracelular y la destrucción de la
arquitectura pulmonar (2,3).
Uno de los rasgos histológicos en la FPI es un notable aumento en el número de células
epiteliales alveolares así como la presencia de varios fenotipos anormales, entre los que
destacan la hiperplasia e hipertrofia de neumocitos tipo 2, los cuales cuboidalizan al epitelio
alveolar, especialmente en las áreas donde se encuentran los septos alveolares fibróticos
(4). Estas las células del epitelio alveolar activadas anormalmente, secretan cantidades
4

excesivas de diferentes citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento que inducen la
formación de focos de fibroblastos/miofibroblastos y finalmente la acumulación exagerada
de moléculas de matriz extracelular, teniendo como consecuencia la destrucción del
parénquima pulmonar . Además de secretar citocinas y factores de crecimiento, las células
epiteliales alveolares expresan anormalmente por lo menos dos metaloproteasas de matriz
(MMPs por sus siglas en inglés), la MMP-1 y MMP-7, las cuales pueden participar en la
remodelación aberrante de la matriz intersticial que caracteriza a la FPI (5,6,7).
Las causas responsables del daño/activación epitelial de desconocen, pero probablemente la
FPI ocurre por una combinación de factores genéticos y ambientales. Entre los factores
ambientales, el tabaquismo, que es una causa de acortamiento anormal de telómeros,
muestra la asociación más significativa con la FPI. El papel de factores genéticos y su
interacción con factores ambientales se desconoce. Numerosos polimorfismos genéticos
han sido estudiados y solo unos cuantos han demostrado una asociación, la cuál es
generalmente débil; además éstas posibles asociaciones no han sido corroboradas en
cohortes independientes (6,7).

Activación anormal del epitelio alveolar
Como se mencionó, existen numerosas evidencias de que durante el desarrollo de la FPI las
células epiteliales son la fuente primaria de los mediadores responsables de la activación de
los fibroblastos, así como de su diferenciación a miofibroblastos(8). Estos mediadores
incluyen al factor de crecimiento transformante beta (TGB-β por sus siglas en inglés),
factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF por sus siglas en inglés), factor de
necrosis tumoral alfa (TNF-α por sus siglas en inglés), endotelina 1(ET-1), factor de
crecimiento de tejido conjuntivo (CTGF por sus siglas en inglés) y la osteopontina entre
otras; también se ha reportado que las células del epitelio alveolar de los pacientes con FPI
secretan la quimiocina CXCL12, la cual es responsable de atraer fibrositos circulantes
(precursores de fibroblastos) al pulmón, los cuales pueden incrementar la población local
de fibroblastos y miofibroblastos (8,9).
Sin embargo, el epitelio alveolar no solo produce cantidades anormales de factores
profibrosantes, sino que además pierde su capacidad funcional normal de suprimir la
actividad de fibroblastos, la cuál es mediada por la prostaglandina E2. En este contexto al
menos 2 estudios han revelado evidencias que sugieren que en FPI, las células del epitelio
alveolar muestran una expresión significativamente disminuida de las ciclo-oxigenasas 1 y
2, que son las enzimas responsables de la síntesis de prostanoides (9).
Recientemente se ha demostrado que durante el desarrollo de la FPI se produce un proceso
conocido como transición epitelio mesénquima (EMT por sus siglas en inglés); en el cual,
las células pierden sus características epiteliales y adquieren propiedades que son
distintivas de las células mesenquimatosas, se inhibe la expresión de moléculas de adhesión
epitelial como la E-caderina, y las células epiteliales pierden su polaridad ápicobasal,

comienzan a expresar moléculas mesenquimatosas como N
hacen migratorias (9,10).

Figura 1.- Esquema donde se muestran células epiteliales activadas las cuales
mediadores que crean un microambiente profibrótico en pulmones con FPI. (De: Selman
M. Proceeding of the American Thoracic Society, 2006).

La TEM es un proceso clave durante la embriogénesis donde lleva a la formación de un
mesénquima migratorio que progresa a lo largo de la línea primitiva para poblar nuevas
áreas del embrión donde desarrollarán el mesodermo y endodermo.
6
comienzana expresar moléculas mesenquimatosas como N-caderina y fibronectina y se
Esquema donde se muestran células epiteliales activadas las cuales
mediadores que crean un microambiente profibrótico en pulmones con FPI. (De: Selman
M. Proceeding of the American Thoracic Society, 2006).
La TEM es un proceso clave durante la embriogénesis donde lleva a la formación de un
que progresa a lo largo de la línea primitiva para poblar nuevas
áreas del embrión donde desarrollarán el mesodermo y endodermo.
caderina y fibronectina y se
Esquema donde se muestran células epiteliales activadas las cuales secretan
mediadores que crean un microambiente profibrótico en pulmones con FPI. (De: Selman
La TEM es un proceso clave durante la embriogénesis donde lleva a la formación de un
que progresa a lo largo de la línea primitiva para poblar nuevas
7

Sin embargo, diversos estudios han demostrado que un proceso tipo TEM ocurre en la vida
adulta y parece participar en diversas patologías incluyendo la progresión de algunas
neoplasias, el desarrollo de metástasis y algunas respuestas fibrosantes, siendo su principal
mediador el TGF-β(10,11,12). En el caso de la FPI, dos estudios in vivo han encontrado a
células pulmonares coexpresando moléculas epiteliales y de miofibroblastos lo que sugiere
un activo proceso de TEM. Aunque los mecanismos moleculares involucrados no se
conocen con precisión, recientemente se ha sugerido que el desarrollo de TEM en los
pulmones se debe a la expresión aberrante de diversos programas embrionarios que en
condiciones normales se apagan en la vida adulta (10).

Matriz extracelular
Los cuatro tejidos fundamentales que constituyen a todos los vertebrados son el conjuntivo,
epitelial, muscular y nervioso. Las células que los forman están inmersas en una red
compleja de macromoléculas que constituyen a la matriz extracelular (MEC), la cual es una
parte sustancial del volumen total del tejido y frecuentemente es más abundante que las
células a las que rodea(13).
Aunque se consideraba que la matriz extracelular era un componente inerte del tejido y que
sólo servía de soporte a las células, actualmente se sabe que es una estructura dinámica que
no solo constituye el andamio de los tejidos, sino que participa activamente en procesos
celulares como: desarrollo, migración, diferenciación, proliferación y apoptosis celular,
entre otros, y no sólo durante la homeostasis, sino también durante diversos procesos
patológicos. Muchas de estas actividades son reguladas por un conjunto de señales que se
registran directamente a través de receptores a las moléculas de matriz.
8

Las principales macromoléculas que forman a la matriz extracelular son:
• Proteínas formadoras de fibras que se organizan para formar estructuras bien
definidas de la matriz extracelular como son las colágenas intersticiales y las fibras
elásticas. Algunas colágenas, en especial la colágena tipo IV participan en la
formación de las membranas basales.
• Glicosaminoglicanos y proteoglicanos. Cadenas de polisacáridos de la clase de los
glicosaminoglicanos se unen covalentemente a proteínas, formando macromoléculas
más complejas denominadas proteoglicanos.
• Glicoproteínas de adhesión como la fibronectina que se pueden asociar entre sí, a
células, a fibras y a proteoglicanos, y como la laminina que forma parte de las
membranas basales(14).

Las proteínas que forman fibras están embebidas en una “sustancia fundamental”, que se
encuentra en estado físico de gel altamente hidratado y constituido por glicosaminoglicanos
y proteoglicanos; dicho gel, gracias a su carácter altamente hidrofílico participa de manera
importante en procesos como la comunicación celular y la migración, y proporciona el
ambiente adecuado para que la matriz funcione como sitio de almacenamiento a factores de
crecimiento, como se ha demostrado recientemente.
En la fibrosis pulmonar idiopática existe una remodelación aberrante de la MEC en donde
hay un desequilibrio entre síntesis y degradación de los componentes de la matriz, proceso
en el que están involucradas un gran número de enzimas, principalmente la familia de las
metaloproteasas de matriz(13,14).

Metaloproteasas de matriz
Las metaloproteasas de matriz (MMPs) son las principales enzimas responsables de la
degradación de la matriz extracelular y desempeñan un papel importante en diversos
procesos biológicos como la modulación de la actividad de factores de crecimiento y
algunas citocinas. La modificación del microambiente de la MEC puede resultar en
diversos cambios en el comportamiento celular favoreciendo o inhibiendo procesos como la
migración y proliferación celular, y la apoptosis. Las MMPs pueden regular la apoptosis ya
sea directamente o a través de la degradación de las membranas basales lo que trae como
consecuencia la pérdida de señales de supervivencia celular lo cual promueve la muerte
celular programada.
El estudio y comprensión de estos procesos es importante para conocer el papel que
desempeñan las MMPs en la patogénesis de distintas enfermedades en las que se han
descrito y que incluyen a la artritis reumatoide, cáncer, enfermedades fibrosantes, y
enfisema pulmonar entre otras (15,16).
Esta familia de endopeptidasas comparte un grupo de dominios entre los que se encuentran:
a) Un dominio propeptídico responsable de la latencia de las proenzimas. En este
dominio existe un residuo de cisteína que forma un enlace coordinado con el Zn2+,
presente en el dominio catalítico, y enmascara de esta manera al sitio activo de las
proenzimas o zimógenos.
b) Un dominio catalítico esencial para la actividad enzimática y que contiene el sitio
de unión Zn2+ y a Ca2+.
c) Una secuencia rica en prolina que funciona como bisagra y un sitio carboxilo-
terminal con un dominio tipo hemopexina (16).
10

Hasta hoy, se han identificado 25 MMPs, de las cuales 24 están presentes en los humanos y
que incluye a un gen duplicado de la MMP-23. Tomando en consideración la estructura de
los dominios y la afinidad de sustrato se han clasificado en nueve distintos subfamilias que
se especifican a continuación:
Tabla 1.- La familia de las metaloproteasas de matriz con sus sustratos. (De: Fanjul-Fernandez Biochin
Biophys acta 2010)

Subgrupo MMP Nombre alternativo Sustratos
Colagenasas MMP-1
MMP-8
MMP-13
Colagenasa-1
Colagenasa-2
Colagenasa-3
Colágenas, I, II, III, VII, X, gelatina, entactina,
agrecan, tenascina, inhibidor de proteinasa-α1,
pro-TNF-α, α1 antitripsina.
Estromelisinas MMP-3
MMP-10
MMP-11
Estromelisina-1
Estromelisina-2
Estromelicina-3
Proteoglicanos, laminina, fibonectina, gelatina,
fibrinógeno, entactina, pro-IL1-β, pro-TNF-α
Gelatinasas MMP-2
MMP-9
Gelatinasa A
Gelatinasa B
Colágenas IV, V, gelatina, elastina, decorina,
fibronectina, pro-TGF-β, pro-IL1-β, pro-TNF-α
Matrilisinas MMP-7
MMP-26
Matrilisina-1
Matrilisina-2
Laminina, prodefensina, osteopontina, decorina,
gelatina, fibronectina, colágenas III, IV, V, IX,
X, XI, fibrinógeno, proteoglicanos
Metaloproteasas tipo
membrana
(MT-MMPs)

MMP-14
MMP-15
MMP-16
MMP-24
MT1-MMP
MT2-MMP
MT3-MMP
MT5-MMP
Gelatina, fibronectina, vitronectina, colágena
IV, proMMP-2,
Otras MMPs MMP-12
MMP-19
MMP-20
MMP-27
Metaloelastasa
RASI
Enamelisina
Epilisina
Elastina, plasminógeno, fibronectina, laminina,
gelatina, tenascina, agrecán
Transmembranales
Tipo 2
MMP-23A
MMP-23B

Ancladas a GPI MMP-17
MMP-25
MT4-MMP
MT6-MMP

Por otro lado, como ya se mencionó, la MEC es una estructura dinámica que no solo
constituye el andamio de los tejidos y regula el ambiente celular, sino que además
interactúa con una gran variedad de factores de crecimiento y citocinas. En este contexto, el
recambio controlado de moléculas de MEC es importante parael mantenimiento de la
estructura y función de la arquitectura pulmonar. En la FPI existe un recambio
descontrolado de moléculas de matriz, lo que resulta en una remodelación aberrante de la
MEC(15,16).
Aunque la mayoría de las MMPs pueden degradar algunos componentes de la MEC, es
importante señalar que solo una fracción de alrededor de 100 componentes
macromoleculares de la MEC han sido examinados como posibles sustratos, de estos solo
muy pocos han sido corroborados como sustrato in vivo, entre ellas están las colágenas
intersticiales, donde se ha demostrado que los productos de degradación encontrados in
vitro tienen el aminoácido terminal equivalente a los registrados in vivo para algunas
MMPs (16).
Regulación de MMPs
La expresión génica de las MMPs está regulada principalmente a nivel transcripcional, el
cual resulta en bajos niveles de varias de estas enzimas en condiciones normales.
La mayoría de las enzimas de esta familia tienen en común elementos –cis en las
secuencias de su promotor, el cual permite el control de su expresión en células específicas.
Debido a esto las MMPs son a menudo coexpresadas o correprimidas en respuesta a
múltiples estímulos como por ejemplo en la repuesta inflamatoria, donde se liberan
citocinas y factores de crecimiento, glucocorticoides o retinoides.
12

Está respuesta a nivel transcripcional ocurre algunas horas después de la exposición al
estímulo, lo que sugiere que los promotores de las MMPs responden a las vías de
señalización de los genes de respuesta temprana, las cuales son inducidas poco después del
estímulo y en ausencia de nuevas proteínas de síntesis. Estos genes de respuesta temprana
codifican proteínas de señalización que fosforilan los diferentes factores de transcripción,
los cuales son capaces de unirse a los promotores de los genes. Los intermediarios de
señalización involucrados en la activación de factores de transcripción incluyen al factor
nuclear Kappa B (NFKb) , la proteína cinasa mitógena activada (MAPK) y la familia de
proteínas Smad. Estos intermediarios pertenecen a vías de señalización que son activadas
por una gran variedad de ligandos como interleucina (IL), TNF-α y Oncostatina M. El
bloqueo de estas vías de señalización por la disminución de la síntesis de algunos
mediadores, o por el secuestro de los factores de transcripción para evitar su unión o para
inhibir su fosforilación puede reprimir la expresión de los genes de MMPs. Algunos de los
moduladores de la expresión de MMPs incluyen a citocinas y factores de crecimiento como
interleucinas e interferones, el TGF-β, el factor de crecimiento epidérmico (EGF), y el
factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) entre otros.
De manera interesante las MMPs que están correguladas en su expresión bajo ciertas
condiciones comparten varios sitios de unión a transcripción en sus secuencias del
promotor mientras que las que están funcionalmente relacionadas como las gelatinasas o
colagenasas difieren en gran medida en la composición de sus elementos –cis presentes en
sus respectivas regiones promotoras(17).

TIMPs
Los TIMPs son inhibidores endógenos de las MMPs y como tales, importantes reguladores
de la remodelación tisular. Además de su actividad inhibitoria de MMPs, los TIMPS
funcionan como promotores de la proliferación celular, antiangiogénicos e inducen el
crecimiento celular. La familia está formada por cuatro miembros TIMP1, TIMP2, TIMP3
y TIMP4.
Los TIMPs son proteínas pequeñas de aproximadamente 20-24 kDa y una de sus
principales características es la presencia y conservación de 12 residuos de cisteína. Estas
cisteínas forman enlaces disulfuro plegando las proteínas en 2 dominios, un N-terminal y
un C-terminal. Cada dominio contiene tres puentes disulfuro los cuales hacen que el TIMP
sea estable; su actividad inhibitoria se encuentra en el dominio N-terminal; sin embargo,
aunque el dominio C-terminal no tiene actividad inhibitoria, este incrementa las uniones de
algunos TIMPs a MMPs, como en el caso de TIMP1 con estromelisina, donde propicia un
contacto y orientación del TIMP hasta el centro activo de la enzima. Cada uno de los dos
dominios terminales tiene una conformación rígida por tres puentes disulfuro los cuales
están altamente conservados a través de todas las especies y organismos (18).
Transición Epitelio Mesénquima (EMT)
Las células epiteliales y mesenquimatosas difieren en numerosas características funcionales
y fenotípicas. Las células epiteliales forman capas que están fuertemente unidas por
uniones especializadas como son las uniones estrechas y las uniones adherentes o
desmosomas. Las células epiteliales tienen una polaridad apical y otra basolateral las cuales
se manifiestan a través de la distribución de moléculas de adhesión como las caderinas e
integrinas, la organización de uniones célula-célula en forma lateral, la organización del
14

citoesqueleto de actina y la presencia de una lámina basal en la superficie basal de la célula.
Las células epiteliales son móviles dentro de su misma capa, sin embargo no se separan de
esta bajo condiciones normales.
Por otro lado, las células mesenquimatosas no forman capas de células organizadas ni
tienen la misma polaridad ápico basal ni organización del citoesqueleto que muestran las
células epiteliales; se contactan con otras células solo de forma focal y tienden a ser
migratorias ya sea en grupo o como células individuales; también presentan extensión
cíclica, adhesión, retracción, y translocación o cuerpo tipo ameboidal(19).
Las células epiteliales se pueden convertir a mesenquimatosas por el proceso de EMT, en el
cual ocurren una serie de eventos en donde las células epiteliales pierden progresivamente
sus características epiteliales y adquieren propiedades que son propias de células
mesenquimatosas(19,20).
Durante la embriogénesis diferentes señales extracelulares pueden activar la EMT, proceso
fundamental para las primeras etapas del desarrollo embrionario. Así por ejemplo, en
ausencia de TEM, el desarrollo no procede después de la blástula(20).
De manera interesante, el proceso de EMT se puede reactivar en organismos adultos donde
se ha demostrado que contribuye al desarrollo de ciertas patologías como el cáncer y la
fibrosis. La EMT es activada por una interacción de señales que incluyen algunos
componentes de la MEC como la colágena, y algunos factores de crecimiento, en especial
el TGF-β. La señalización mediada por receptores en respuesta a estos ligandos enciende la
activación de moléculas intracelulares de la familia de las GTPasas como Rho o Ras, las
que organizan el desensamble de los complejos funcionales y el cambio en la organización
del citoesqueleto que ocurre durante la EMT. La activación de la señalización también
15

resulta en la activación de factores de transcripción como SNAI1 y SNAI2, los cuales
regulan cambios en la expresión génica que caracteriza a la EMT.
Un blanco central en esa regulación transcripcional es la represión del gen de la E-caderina
que es un importante representante del fenotipo epitelial ya que resulta en una pérdida de
ésta en los complejos de unión intercelular característicos de los epitelios(21,22).
En términos generales, se considera que la inflamación o lesiones epiteliales como sucede
en la fibrosis pulmonar idiopática pueden causar EMT en los organismos adultos
probablemente como resultado de la producción de TGF-β(23,24,25).

Fig 2.- Esquema que muestra el ciclo de plasticidad de células epiteliales donde se ilustra el
ciclo de eventos durante el cual las células epiteliales se transforman en células
mesenquimatosas y viceversa. (De: Thiery JP. Nature reviews. Molecular cell biology. 7.
2006).
Disociación de
uniones oclusivas
Célula epitelial
Asociación
del desmosoma

Célula mesenquimatosa
Activación de Rho,
reorganizacióndel
citoesqueleto. Ensamble de
uniones adherentes
Contacto inicial adhesivo de
E-caderina

Disociación de uniones
adherentes
Formación de uniones
celulares y de polaridad
celular.
Marcadores mesenquimatosos.
Fibronectina
Vimentina
α-AML
Marcadores epiteliales
E-caderina
Claudina
Citoqueratina

Inductores de EMT:
Factores de crecimiento
Citocinas
MEC

Inductores de MET:
Adhesión y
reorganización de
microfilamentos de actina
corticales

Diabetes mellitus
La diabetes mellitus (DM) comprende un grupo de trastornos metabólicos frecuentes que
comparten el fenotipo de la hiperglucemia. Existen varios tipos de DM debidos a una
compleja interacción entre factores genéticos y ambientales. Dependiendo de la causa de la
DM, los factores que contribuyen a la hiperglucemia pueden ser deficiencia de la secreción
de insulina, incremento en su consumo o producción de glucosa(26). El trastorno de la
regulación metabólica que acompaña a la DM provoca alteraciones fisiopatológicas
secundarias en muchos órganos: Así, la DM es la primera causa de nefropatía, de
amputaciones no traumáticas de extremidades inferiores y de ceguera en adultos. También
predispone a enfermedades cardiovasculares. Dado que su incidencia está aumentando en
todo el mundo, seguirá siendo una de las primeras causas de morbilidad y mortalidad en el
futuro próximo(27,28).
Clasificación
La DM se ha clasificado en dos categorías que se designan tipo 1 y tipo 2. Los dos tipos de
diabetes son antecedidos por una fase de metabolismo anormal de glucosa, conforme
evolucionan los procesos patogénicos. La diabetes tipo 1 es resultado de la deficiencia
completa o casi total de insulina, y la tipo 2 representa a un grupo heterogéneo de trastornos
que se caracterizan por grados variables de resistencia a la insulina, menor secreción de
dicha hormona y una mayor producción de glucosa. Diversos defectos genéticos y
metabólicos en la acción, secreción o ambas funciones de la insulina originan el fenotipo
común de hiperglucemia en la DM tipo 2. Esta es precedida por un periodo de homeostasis
17

anormal de la glucosa clasificado como trastorno de la glucosa en ayunas o trastorno de la
tolerancia a la glucosa(26).
Diabetes mellitus de tipo 2
Debido a que la FPI se ha asociado a la diabetes mellitus tipo 2, lo que constituyó la base de
esta tesis, a continuación se hace un breve resumen de sus principales características.
La resistencia a la insulina y la secreción anormal de ésta son aspectos centrales del
desarrollo de DM de tipo 2. Aunque persisten las controversias en cuanto al defecto
primario, la mayoría de los estudios indican que la resistencia a la insulina precede a los
defectos de su secreción, y que la diabetes se desarrolla sólo si la secreción de insulina se
torna inadecuada(29).
Fisiopatología
La DM tipo 2 se caracteriza por una menor secreción de insulina, resistencia a dicha
hormona, producción excesiva de glucosa por el hígado y por el metabolismo anormal de
grasa. La obesidad, en particular la visceral o central es muy frecuente en la diabetes de tipo
2. En las etapas iniciales del padecimiento, la tolerancia a la glucosa sigue siendo casi
normal, a pesar de la resistencia a la insulina, porque las células beta del páncreas logran la
compensación al incrementar la producción de la hormona. Al evolucionar la resistencia a
la insulina y surgir hiperinsulinemia compensatoria, los islotes pancreáticos ya no pueden
conservar el estado hiperinsulinémico y en ese momento surge la incapacidad de tolerancia
a la glucosa, que se caracteriza por incrementos en el nivel de glucemia posprandial. La
18

disminución ulterior en la secreción de insulina y el incremento de la producción de glucosa
por el hígado culminan en la diabetes franca con hiperglucemia en el ayuno. Por último
surge insuficiencia de las células beta(26,29).
Trastorno de la secreción de insulina
La secreción de insulina y la sensibilidad a ella están relacionadas entre sí. En la DM de
tipo 2, la secreción de insulina aumenta inicialmente en respuesta a la insulino-resistencia
con el fin de mantener una tolerancia normal a la glucosa. Al principio el defecto de la
secreción de insulina es leve y afecta de manera selectiva la secreción estimulada por
glucosa. Finalmente, el defecto de la secreción de insulina progresa hasta hacerse
fuertemente anormal.
Las razones del declive de la capacidad secretora de insulina en la DM de tipo 2 no se
conocen con precisión aunque se supone que un segundo defecto genético lleva al fracaso
de las células beta. El polipéptido amiloide de los islotes, o amilina, es cosecretado por la
célula beta y probablemente forma el depósito de fibrillas amiloides que se encuentra en los
islotes de diabéticos de tipo 2 de larga evolución. Se ignora si estos depósitos insulares de
amiloide son un fenómeno primario o secundario. También el ambiente metabólico puede
ejercer un efecto negativo sobre la función de los islotes. Por ejemplo, la hiperglucemia
crónica altera de manera paradójica la función de los islotes y lleva a un empeoramiento de
la hiperglucemia. Asimismo, una mejoría en el control de la glucemia se acompaña con
frecuencia de un mejor funcionamiento insular. Además, la elevación de los valores de
19

ácidos grasos libres también empeora el funcionamiento de los islotes. La masa de células
beta disminuye en personas con diabetes de tipo 2 de larga evolución(25,26).
Aumento de la producción hepática de glucosa
En la DM de tipo 2, la resistencia hepática a la insulina refleja la incapacidad de la
hiperinsulinemia de suprimir la gluconeogénesis, lo que produce hiperglucemia en ayunas y
disminución del almacenamiento de glucosa en el hígado en el periodo posprandial. El
aumento de la producción hepática de glucosa ocurre en una fase temprana de la evolución
de la diabetes, aunque probablemente es posterior al inicio de las alteraciones de la
secreción insulínica y a la resistencia a la insulina en el músculo esquelético. Como
resultado de la resistencia a la insulina en tejido adiposo y la obesidad, el flujo de ácidos
grasos libres desde los adipocitos aumenta y ello hace que se incremente la síntesis de
lípidos en los hepatocitos. Este almacenamiento de lípido o esteatosis del hígado puede
ocasionar hepatopatía grasa no alcohólica y anormalidades en las pruebas de función
hepática. La situación anterior provoca también la dislipidemia o incremento del nivel de
triglicéridos que aparece en la diabetes de tipo 2, disminución de la lipoproteína de alta
densidad HDL e incremento del número de partículas densas pequeñas de lipoproteína de
baja densidad(26,29).
20

Planteamiento del problema
La FPI es una enfermedad progresiva y letal, de la cual no se conocen con precisión los
mecanismos patogénicos y agentes etiológicos. Algunos estudios epidemiológicos
realizados en diferentes poblaciones (Reino Unido, Japón, México) han sugerido que la
enfermedad es más frecuente en pacientes con diabetes (30,31,32). El estudio de los
mecanismos por los cuales un microambiente rico en glucosa modifica el comportamiento
de las células epiteliales alveolares puede ser importante para comprender la relación entre
ambos padecimientos.
Objetivo General: Determinar los efectos de altas concentraciones de glucosa sobre
células epiteliales alveolares de la línea A549.
Objetivos Particulares:
1. Evaluar los efectos de altas concentraciones de glucosa en la transición epitelio-
mesénquima mediante la presencia de marcadores de células epiteliales y de células
mesenquimatosas por medio de Western blot y PCR en tiempo real.
2. Examinar el efecto de altas concentraciones de glucosa en la expresión de MMP-1,
MMP-7, TGF-β1 y TIMP-1 mediante PCR en tiempo real.
3. Determinar el efecto de altas concentraciones de glucosa en latasa de crecimiento de las
células A549 usando el reactivo de viabilidad celular WST-1.

Materiales y métodos
Cultivo Celular
Se cultivaron células de la línea epitelial alveolar A549 (ATCC Rockville, MD) en cajas de
cultivo T-25 (Corning, Lowell MA, EUA) utilizando medio de cultivo Ham F-12
(GibcoLab., Grand Island, NY), suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB)
(GibcoLab) y antibióticos (penicilina 10,000 U/ml, estreptomicina 10 mg/ml y anfotericina
B 25 µg/ml) (Sigma Aldrich Co. St Louis Missouri), a una temperatura de 37ºC y con una
mezcla gaseosa de 5% de CO2 / 95% aire(33).
Cuando las células llegaron a confluencia temprana (70-80%), el medio se reemplazó por
Ham F-12 con albúmina sérica bovina (BSA por sus siglas en inglés Bovine Serum
Albumin) (Sigma Aldrich Co. St Louis Missouri) al 0.1% y se trataron según el siguiente
diseño experimental:
• Células A549 cultivadas en medio Ham F-12 con BSA al 0.1%.
• Células A549 cultivadas en medio Ham F-12 con BSA al 0.1% y 40 mmol/L D-
glucosa.
• Células A549 cultivadas en medio Ham F-12 con BSA al 0.1% con 40 mmol/L D-
Manitol. Este último se utilizó como control de hiperosmolaridad.

Análisis de la tasa de crecimiento celular
La tasa de crecimiento celular se determinó utilizando el reactivo de proliferación celular
WST-1 (Roche Applied Science, Manheim, Alemania), que contiene una sal derivada del
tetrasolio la cual es oxidada por el sistema enzimático succinato deshidrogenasa
mitocondrial de células metabólicamente activas o viables, produciendo como resultado un
22

cromóforo soluble, cuya concentración se determina en el medio de cultivo midiendo la
absorbancia a una longitud de onda de 450nm con un filtro de referencia de 620nm(34).
Curva control
Para realizar la curva control, las células epiteliales se sembraron por triplicado: 2,000,
4,000, 6,000 8,000 y 10000 células por pozo en cajas de cultivo de 96 pozos en 100µl de
medio de cultivo Ham F-12 con SFB al 10%. A las 24 horas se reemplazó el medio de
cultivo por 100µl de medio sin suero y se le adicionaron 10 µl del reactivo WST-1. Las
células se incubaron por tres horas a una temperatura de 37ºC con una mezcla gaseosa de
5% de CO2/95% aire y se determinó la absorbancia a 450nm/620 nm.
Tasa de crecimiento
El análisis de tasa de crecimiento se realizó a 2, 4 y 6 días. Las células epiteliales (2500 por
pozo) se sembraron por triplicado en cajas de 96 pozos en tres diferentes condiciones
experimentales:
1. 100µl de medio Ham F-12 y BSA al 0.1%.
2. Ham F-12 con BSA al 0.1% con 30 mmol/D-glucosa.
3. Ham F-12 con BSA al 0.1% con 30 mmol/D-manitol.
El número de células viables en cada uno de los tiempos de estudio se determinó con el
reactivo para proliferación celular WST-1. Para esto, el medio se reemplazó por 100µl de
medio fresco al que se adicionaron 10µl del reactivo WST-1, posteriormente se incubaron 3
horas en las condiciones antes mencionadas y el medio fue colectado en una nueva placa
para determinar la absorbancia.

Medición de glucosa de medios condicionados
Se cultivaron células de la línea A549 en cajas T-25 tratadas de acuerdo al diseño
experimental durante 3, 6 y 12 horas y 3 y 5 días. Se obtuvo el medio condicionado del cual
500µl fueron transferidos a jeringas de 1ml, la concentración de glucosa fue medida con un
gasómetro.

Transición epitelio mesénquima (TEM)
Determinación de proteínas
Las células epiteliales de la línea a549 se cultivaron en cajas T-25 durante 5 días en medio
Ham F-12 con BSA al 0.1% con y sin estímulo con TGF-β1 un potente inductor de TEM.
Se obtuvieron lisados celulares y medios condicionados(24).
La determinación de proteínas de los lisados celulares se realizó con el buffer de lisis RIPA
(Sigma Aldrich Co. St Louis Missouri, EU), para lo cual se lavaron dos veces con PBS, se
adicionaron 50µl de buffer RIPA, se levantaron las células con ayuda de un gendarme y las
muestras se transfirieron a tubos eppendorf de 1.5ml donde se sonicaron por seis segundos
en cuatro ocasiones y se centrifugaron a 14,000 rpm durante 10 minutos a 4° C. El
sobrenadante se transfirió a tubos eppendorf de 0.6ml y se determinó la concentración de
proteína total mediante el método de Bradford utilizando el reactivo Bradford Bio-Rad
Assay (Bio-Rad Laboratories. Inc, Hercules, CA. EU).
Por otro lado, los medios condicionados obtenidos de los cultivos se concentraron por
liofilización, se resuspendieron en 200µl de agua desionizada y se determinó la
concentración de proteínas con el método de Bradford.

Western Blot
Muestras de lisado celular y medios condicionados, se mezclaron V/V con buffer Laemmli
(Tris-HCl 0.5M pH 6.8 12.5%, agua destilada 50 % SDS 20%, glicerol 1.25%, azul de
bromofenol 2.5%, 2-B-mercaptoetanol 5%). Las proteínas contenidas en las muestras se
separaron en geles de poliacrilamida-SDS al 10% en condiciones reductoras en una cámara
para transferencia de geles Bio-Rad y posteriormente fueron transferidas a membranas de
nitrocelulosa (Hybond ECL, Amersham Pharmacia Biotech, RU). Se bloquearon los sitios
inespecíficos de la membrana con leche descremada al 5% en PBS durante 18 horas a 4°C.
Las membranas se incubaron con los anticuerpos monoclonales primarios específicos para
cada proteína. Para la transición epitelio-mesénquima: Ac contra E-caderina humana
(BioGenex san Ramon, CA. USA), y Ac contra α-AML humana (Biogenex). Para las
metaloproteasas de matriz: anticuerpos monoclonales anti-MMP-1 y anti-MMP-7
(AnaSpec) y anticuerpo contra β-tubulina (Santa Cruz Biotechnology), que se usó como
control de carga.
Las membranas se lavaron 4 veces con TBS-T (10 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM NaCl)
durante 10 minutos, y se incubaron 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo
secundario [IgG anti-ratón conjugado con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch)],
seguido de cuatro lavados con TBS-T. La detección se hizo con quimioluminiscencia ECL
(Amersham Biosciences, Bukinghamshire, UK). Finalmente, para cuantificar las proteínas
se realizó una densitometría de las bandas obtenidas en el Western blot con el programa
Kodak Digital Science 1D(24-33).

Expresión génica
Extracción de RNA
Se cultivaron células de la línea A549 en cajas T-25 tratadas de acuerdo al diseño
experimental por 3, 6 y 12 horas. Se utilizó la técnica de extracción de RNA de TRIzol
Reagent (Invitrogen Carlsbad, CA, EUA) para cultivos en monocapa. Se utilizaron 3 ml de
TRIzol por cada caja T-25 homogenizando suavemente el lisado el cual se pasó a 3 tubos
eppendorf de 1.5ml. A continuación, los lisados se incubaron 5 minutos a temperatura
ambiente y se añadieron 0.2 ml de cloroformo. Las muestras se homogenizaron e incubaron
a temperatura ambiente por tres minutos y se centrifugaron 15 minutos a 11,500 rpm a 4°C
en una centrífuga Mikro22R (Hettich). La fase acuosa se transfirió a otros tubos, se realizó
precipitación del RNA añadiendo 0.5 ml de isopropanol y se incubaron 10 minutos a
temperatura ambiente, se centrifugaron 10 minutos a 11,500 rpm a 4°C y se eliminó el
sobrenadante por decantación. Se adicionó 1ml de etanol al 75% y las muestras se
resuspendieron con vortex, se centrifugaron 5 minutos a 7,500 rpm a 4°C, se removió el
sobrenadante y se dejó secar a temperatura ambiente. Finalmente, las muestras se
resuspendieron en 8µl de agua libre de RNAsas(46).
Para cuantificar el RNA se utilizó un espectrofotómetro y se midió la absorbancia a una
longitud de onda de 260 nm. Para calcular la concentración se utilizó la siguiente fórmula:
[RNA] µg/ml = (A260) (40) (dilución)/1,000.

Transcripción reversa (RT-PCR)
Un microgramo de RNA fue tratado con 1µg de DNAsa (Life Tecnologies, Grand Island,
NY) para la eliminación de DNA genómico.
La mezcla para la reacción de la RT-PCR fue la siguiente:• 1µg de muestra de RNA
• 1µg de DNAsa
• 1µl de buffer de reacción DNAse I
• Agua DEPC para un volumen final de 10 µl
La mezcla se incubó a temperatura ambiente por 15 minutos, se adicionó 1µl de EDTA
25mM y se calentó 10 minutos a 65°C. Una vez sintetizado el cDNA las muestras se
llevaron a un volumen de 50µl con agua libre de RNAsas para realizar el análisis de PCR
en tiempo real(33,35).

PCR en tiempo real
Para las reacciones de PCR en tiempo real, se utilizaron Sondas TaqMan específicas para el
gen ribosomal 18s, MMP-1, MMP-7, TIMP-1, y TGF-β1 (Applied Biosystems Foster City
CA. EUA). El gen ribosomal 18s fue utilizado para ajustar las diferencias en la cantidad de
RNA total en cada muestra. Las reacciones de PCR en tiempo real se realizaron en un
termociclador Bio-rad, modelo iCycler iQ multicolor Real-Time PCR Detection Sistem
(Bio-Rad). Los genes de interés se amplificaron mediante una PCR convencional para
establecer las condiciones de amplificación y realizar las curvas estándar necesarias para la
reacción de PCR en tiempo real. Los productos obtenidos de los distintos genes, se
corrieron en geles de agarosa al 1.5%, las bandas específicas fueron cortadas y se
purificaron con el estuche de Quiagen II gel extraction (Quiagen, Valencia, CA). A partir
del producto purificado, se calculó el número de copias de los productos de PCR, utilizando
el siguiente razonamiento:
El peso molecular de un par de bases es de 660 daltones, cada mol contiene 6.022X1023
moléculas y utilizando la siguiente fórmula se obtuvo una aproximación del número de
copias presentes en los productos de amplificación de PCR:
Copias/ng = (n x MW) / NA x 1 x 109), donde:
n= tamaño del producto amplificado
MW= peso molecular, 660 daltones por cada par de bases
NA= número de Avogadro 6.022 x 1023
Para determinar los niveles relativos de concentración de RNA en las muestras, se
prepararon curvas estándar para la reacción de PCR en tiempo real utilizando diluciones
28

seriales de diez veces al cDNA amplificado por PCR, cubriendo un rango de
concentraciones equivalentes desde 1010 copias de RNA hasta 101 copias(33,35).
Los componentes de las mezclas de reacción y las condiciones de corrida para las PCRs de
los distintos genes (Gen ribosomal 18s, MMP-1, MMP-7, TIMP-1 y TGF-β1) fueron:
Reactivo Cantidad (µl)
MgCl 2 (25mM) 0.6
Buffer 10x 1.5
dNTP´s (50µM) 1
Sonda Taqman 0.15
Taq 0.15
H2O 7.6
Cdna 4
Total 15

94° C/2’ [ 94°C/30’ 60°C/1’’ ] 72°C/5’
Análisis estadístico.
La evaluación estadística se realizó mediante análisis de varianza (ANOVA) y una prueba
múltiple de comparación de DUNNETT, realizadas con el programa inerSTAT-a v 1.7 b.

(50 ciclos)

Medición de osmolaridad.
Se midió la osmolaridad de los medios condicionados a 3, 6 y 12 horas y 3 y 5 días para
conocer su concentración de soluto. Como se observa en la siguiente gráfica, los medios
condicionados a los que se les adicionó glucosa y manitol a una concentración 30mmol/l
tienen una osmolaridad mayor que los controles, pero sus valores son virtualmente
idénticos.

0
0.5
1
1.5
2
2.5
C
o
n
tr
o
l
G
lu
c
o
s
a
M
a
n
it
o
l
C
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n
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l
3
h
G
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3
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M
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o
l
3
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C
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6
h
G
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c
o
s
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6
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M
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6
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C
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1
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3
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s
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d
ía
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5
d
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s
M
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l
5
d
ía
s
%
(
g
r/
1
0
0
m
)
Medición de osmolaridad
Gráfica1.- Medición de osmolaridad de medios condicionados.

Resultados
Análisis de tasa de crecimiento
En experimentos pilotos habíamos observado que en los cultivos de células epiteliales
A549 tanto en glucosa 30mM como manitol 30mM disminuía sustancialmente el número
de células. En este contexto, se decidió realizar un análisis de la curva de crecimiento
cuyos resultados se muestran a continuación (Gráfica 2).

Como puede observarse, las
significativa de la tasa de crecimiento a partir de los dos días en comparación con las
células epiteliales que no recibieron ningún tratamiento (

Gráfica
Tasa de crecimiento de c
* p <0.001
30
Análisis de tasa de crecimiento
En experimentos pilotos habíamos observado que en los cultivos de células epiteliales
A549 tanto en glucosa 30mM como manitol 30mM disminuía sustancialmente el número
de células. En este contexto, se decidió realizar un análisis de la curva de crecimiento
muestran a continuación (Gráfica 2).
Como puede observarse, las células tratadas con glucosa y manitol muestran una reducción
significativa de la tasa de crecimiento a partir de los dos días en comparación con las
células epiteliales que no recibieron ningún tratamiento (p< 0.001).
Gráfica 2.- Tasa de crecimiento celular
Tasa de crecimiento de células epiteliales A549
p <0.001
* p <0.001
* p <0.001
En experimentos pilotos habíamos observado que en los cultivos de células epiteliales
A549 tanto en glucosa 30mM como manitol 30mM disminuía sustancialmente el número
de células. En este contexto, se decidió realizar un análisis de la curva de crecimiento
células tratadas con glucosa y manitol muestran una reducción
significativa de la tasa de crecimiento a partir de los dos días en comparación con las
30mM
30mM
31

Expresión de MMP-1
Se evaluó la expresión génica de MMP-1 por PCR en tiempo real en las células epiteliales
A549 en dos experimentos independientes. Como puede observarse en las gráficas 3 y 4, a
las tres y seis horas se observó un incremento significativo en los niveles de expresión de
esta enzima en las células que fueron tratadas con alta concentración de glucosa
(30mmol/l). En cambio, el manitol no tuvo ningún efecto. A las doce horas post tratamiento
con glucosa los niveles de expresión de MMP-1 regresaron a su basal (Gráfica5).

0.00E+00
5.00E-05
1.00E-04
1.50E-04
2.00E-04
2.50E-04
3.00E-04
3.50E-04
4.00E-04
4.50E-04
Ctrl 3h Gluc 3h Man 3h'
M
M
P
-1
/1
8
s
MMP-1
Gráfica 3.- Expresión génica de MMP-1 a 3 horas
* p< 0.01
32

Posteriormente se examinó la expresión de la proteína MMP-1 por Western blot en
extractos obtenidos de las células epiteliales A549 después de 3 días de estímulo con
glucosa y manitol y no se observaron diferencias. Los resultados fueron ajustados a la
expresión de β-tubulina (Figura 3). También se realizó el análisis en medios condicionados,
0.00E+00
5.00E-02
1.00E-01
1.50E-01
2.00E-01
2.50E-01
3.00E-01
Ctrl 6h Gluc 6 h Man 6 h
M
M
P
-1
/1
8s
MMP-1
0.00E+00
5.00E-02
1.00E-01
1.50E-01
2.00E-01
2.50E-01
Ctrl 12h Gluc 12h Man 12 h
M
M
P
-1
/1
8s
MMP-1
Gráfica 4.- Expresión génica de MMP-1 a 6 horas
Gráfica 5.- Expresión génica de MMP-1 a 12 horas
* p< 0.005

teniendo como resultado que no hay presencia de la proteína MMP
ambos experimentos se utilizó como control positivo medio condicionado de fib
estimulados con el factor de crecimiento de fibroblastos FGF
de esta enzima.
Lisados Celulares

1
β-Tubulina
MMP-1
Figura 3.
Carril 1:
Carril 2:
Carril 3:
Carril 4:
33
teniendo como resultado que no hay presencia de la proteína MMP-1 en ellos (Figura 4). En
os experimentos se utilizó como control positivo medio condicionado de fib
estimulados con el factor de crecimiento de fibroblastos FGF-1, que es un potente inductor

2 3
Figura 3.- Western Blot MMP-1 de lisados celulares
Carril 1: Control positivo Fibroblastos estimulados con FGF
Carril 2: Células epiteliales A549 control
Carril 3: Células epiteliales A549 en glucosa 30Mm.
Carril 4: Células epiteliales A549 en manitol30mM
1 en ellos (Figura 4). En
os experimentos se utilizó como control positivo medio condicionado de fibroblastos
1, que es un potente inductor

4
Fibroblastos estimulados con FGF-1.
34

Medios Condicionados

1 2 3 4 5

Expresión de MMP-7
La expresión génica de la enzima MMP-7 se evaluó por PCR en tiempo real en las células
epiteliales A549 en dos experimentos independientes. En contraste con lo observado con la
expresión de MMP-1, a las tres y seis horas se observó una disminución significativa en la
expresión de esta enzima en las células que fueron expuestas a una concentración de
30mmol/l de glucosa (Gráficas 6 y 7). Las células estimuladas con manitol no presentaron
diferencias con el control. A las doce horas, los niveles de expresión de MMP-7 regresaron
a los valores de expresión observados en las células epiteliales control (Gráfica 8).

MMP-1
Figura 4.- Western Blot MMP-1 de medios condicionados
Carril 1: Control positivo Fibroblastos estimulados con FGF-1.
Carril 2: Células epiteliales A549 control
Carril 3: Células epiteliales A549 en glucosa 30Mm.
Carril 4: Células epiteliales A549 en manitol 30Mm.
Carril 5: Control positivo Fibroblastos estimulados con FGF-1.

0.00E+00
5.00E-04
1.00E-03
1.50E-03
2.00E-03
2.50E-03
3.00E-03
Ctrl 3h Gluc 3h Man 3h
M
M
P
-7
/1
8
s
MMP-7
0.00E+00
5.00E-02
1.00E-01
1.50E-01
2.00E-01
2.50E-01
3.00E-01
3.50E-01
4.00E-01
4.50E-01
5.00E-01
Ctrl 6h Gluc 6 h Man 6 h
M
M
P
-7
/1
8s
MMP-7
Gráfica 6.- Expresión génica de MMP-7 a 3 horas
Gráfica 7.- Expresión génica de MMP-7 a 6 horas
* p< 0.005
* p< 0.005
36

Por otro lado, y de manera similar a lo que observamos con la MMP-1, la expresión de la
proteína MMP-7 evaluada por Western blot en lisados obtenidos de las células A549
después de 3 días de estímulo con glucosa o manitol, no mostró diferencias con las células
control (Figura 5).
1 2 3

0.00E+00
2.00E-01
4.00E-01
6.00E-01
8.00E-01
1.00E+00
1.20E+00
Ctrl 12h Gluc 12h Man 12 h
M
M
P
-7
/1
8s
MMP-7
MMP-7
Β-Tubulina
Figura 5.- Western Blot de MMP-7 de lisados celulares
Carril 1: Células epiteliales A549 control
Carril 2: Células epiteliales A549 en glucosa 30 mM
Carril 3:Células epiteliales A549 en manitol 30 mM

Gráfica 8.- Expresión génica de MMP-7 a 12 horas
37

Resultados similares se obtuvieron cuando el estudio se hizo en los medios condicionados.
Como se observa en la figura 6, no hubo cambios en la cantidad de proteína entre los
grupos comparados.

Expresión de TIMP-1
El análisis de expresión génica de TIMP-1 por medio de PCR en tiempo real realizado en
dos experimentos independientes, mostró un aumento significativo de este inhibidor de
MMPs a las tres horas de estimulación con glucosa (Gráfica 9). En contraste, a las seis y
doce horas de estimulación no se observaron diferencias significativas en los niveles de
expresión de TIMP-1 (Gráficas 10 y 11).

1 2 3
MMP-7
Figura 6.- Western Blot de MMP-7 de medios condicionados
Carril 1: Células epiteliales A549 control
Carril 2: Células epiteliales A549 en glucosa 30mM
Carril 3: Células epiteliales A549 en manitol 30mM

0.00E+00
1.00E-01
2.00E-01
3.00E-01
4.00E-01
5.00E-01
6.00E-01
7.00E-01
8.00E-01
9.00E-01
Ctrl 3h
T
IM
P
-1
/1
8
s
0.00E+00
2.00E-01
4.00E-01
6.00E-01
8.00E-01
1.00E+00
1.20E+00
Ctrl 6h
T
IM
P
-1
/1
8
s
Gráfica
Gráfica
38
Ctrl 3h Gluc 3h Man 3h
TIMP-1
Ctrl 6h Gluc 6 h Man 6 h
TIMP-1
Gráfica 9.- Expresión génica deTIMP1 a 3 horas
Gráfica 10.- Expresión génica deTIMP1 a 6 horas
* p< 0.01

0.00E+00
2.00E-01
4.00E-01
6.00E-01
8.00E-01
1.00E+00
1.20E+00
1.40E+00
1.60E+00
Ctrl 12h
T
IM
P
-1
/1
8
s
39

Ctrl 12h Gluc 12h Man 12 h
TIMP-1
Gráfica 11.- Expresión génica deTIMP1 a 12 horasénica deTIMP1 a 12 horas

Transición epitelio mesénquima
En este experimento, células epiteliales A549 fueron
experimental por cinco días y de ellas se obtuvieron lisados celulares que se procesaron
mediante la técnica de Western blot para determinar la presencia de la E
un marcador de células epiteliales y
Como puede observarse, un ambiente rico en glucosa produjo una disminución significativa
(y en algunos experimentos la desaparición) de la banda inferior de la E
células estimuladas con TGF
concuerda con que el TGF-

E-Caderina
β-Tubulina
Figura 7
Carril 1: Células A549 control.
Carril 2: Células A549 en glucosa 30mM
Carril 3: Células A549 en manitol30 mM
Carril 4: Células A549 estimuladas con TGF

40
Transición epitelio mesénquima
En este experimento, células epiteliales A549 fueron cultivadas de acuerdo al diseño
experimental por cinco días y de ellas se obtuvieron lisados celulares que se procesaron
mediante la técnica de Western blot para determinar la presencia de la E
un marcador de células epiteliales y β-tubulina usado como control de
Como puede observarse, un ambiente rico en glucosa produjo una disminución significativa
(y en algunos experimentos la desaparición) de la banda inferior de la E
células estimuladas con TGF-β1 perdieron el marcador de células epiteliales lo que
-β1 induce transición epitelio mesénquima (Figura 7).
2 3
Figura 7.- Western Blot E-Caderina y β-Tubulina
Carril 1: Células A549 control.
Carril 2: Células A549 en glucosa 30mM
Carril 3: Células A549 en manitol30 mM
Carril 4: Células A549 estimuladas con TGF-β-1
cultivadas de acuerdo al diseño
experimental por cinco días y de ellas se obtuvieron lisados celulares que se procesaron
mediante la técnica de Western blot para determinar la presencia de la E-Caderina, que es
na usado como control de carga (Figura 7).
Como puede observarse, un ambiente rico en glucosa produjo una disminución significativa
(y en algunos experimentos la desaparición) de la banda inferior de la E-caderina. Las
ron el marcador de células epiteliales lo que
ón epitelio mesénquima (Figura 7).
4

Sin embargo, el análisis de la alfa actina de músculo liso, que es un marcador de células
mesenquimatosas y que debe aparecer o incrementarse durante la TEM en las células
epiteliales no mostró diferencias entre las células sometidas a glucosa y manitol con
respecto al control. Por el contrario, las células epiteliales estimuladas con TGF
presentaron el proceso de transición epitelio
en la expresión de la α-AML

Con base en este resultado, se decidió analizar la expresión génica de la E
experimentos independientes. A las tres horas se observó un incremento significativo en el
nivel de esta proteína en las células estimuladas con glucosa y ma
α-AML
β-Tubulina
Figura 8
Carril 1: Células A549 control.
Carril 2: Células A549 en glucosa 30mM
Carril 3: Células A549 en manitol30 mM
Carril 4: Células A549 estimuladas con TGF

41
Sin embargo, el análisis de la alfa actina de músculo liso, que es un marcador de células
que debe aparecer o incrementarse durante la TEM en las células
epiteliales no mostró diferencias entre las células sometidas a glucosa y manitol con
respecto al control. Por el contrario, las células epiteliales estimuladas con TGF
eso de transición epitelio-mesénquima y muestran un claro incremento
AML (Figura 8).
2 3
Con base en este resultado, se decidió analizar la expresión génica de la E
independientes. A las tres horas se observó un incremento significativo en el
nivel de esta proteína en las células estimuladas con glucosa y manitol (gráfica 12). A las
Figura 8.- Western Blot de α-AML de lisados celulares
Carril 1: Células A549 control.
Carril 2: Células A549 en glucosa 30mM
Carril 3: Células A549 en manitol30 mM
Carril 4: Células A549 estimuladas con TGF-β-1
Sin embargo,el análisis de la alfa actina de músculo liso, que es un marcador de células
que debe aparecer o incrementarse durante la TEM en las células
epiteliales no mostró diferencias entre las células sometidas a glucosa y manitol con
respecto al control. Por el contrario, las células epiteliales estimuladas con TGF-β1
mesénquima y muestran un claro incremento
4

Con base en este resultado, se decidió analizar la expresión génica de la E-caderina en dos
independientes. A las tres horas se observó un incremento significativo en el
nitol (gráfica 12). A las
42

seis horas no se observaron cambios significativos (gráfica 13) mientras que a las doce
horas se encontró una disminución en los niveles de E-caderina en las células estimuladas
con manitol (Gráfica 14).

0.00E+00
5.00E-03
1.00E-02
1.50E-02
2.00E-02
2.50E-02
ctrl 3h gluc3h man3h
E
-C
a
d
h
e
ri
n
a
/1
8
s
E-caderina
0.00E+00
1.00E-02
2.00E-02
3.00E-02
4.00E-02
5.00E-02
6.00E-02
7.00E-02
8.00E-02
Ctrl 6h Gluc 6h Man 6 h
E
-c
a
d
h
e
ri
n
a
/1
8
s
E-caderina
Gráfica 12.- Expresión génica de E-caderina a 3 horas
Gráfica 13.- Expresión génica de E-caderina a 6 horas
* p< 0.005
* p< 0.05
43

Posteriormente se analizó la expresión génica de α-AML a las mismas horas en las que se
evaluó la expresión de E-caderina. Como se puede apreciar en las gráficas 15, 16 y 17, no
se observó ningún efecto significativo en las células estimuladas con glucosa y manitol.

0.00E+00
1.00E-02
2.00E-02
3.00E-02
4.00E-02
5.00E-02
6.00E-02
7.00E-02
8.00E-02
9.00E-02
1.00E-01
Ctrl 12h Gluc 12h Man 12h
E
-c
a
d
h
e
ri
n
a
/1
8
s
E-caderina
0.00E+00
5.00E-04
1.00E-03
1.50E-03
2.00E-03
2.50E-03
3.00E-03
3h ctr 3h glu 3h mani
α
-A
M
L/
18
s
α-AML
Gráfica 14.- Expresión génica de E-caderina a 12 horas
Gráfica 15.- Expresión génica de α-AML a 3 horas
* p< 0.005
44

0.00E+00
2.00E-03
4.00E-03
6.00E-03
8.00E-03
1.00E-02
1.20E-02
1.40E-02
Ctrl 6h Gluc 6h Man 6h
α
-A
M
L/
1
8
s
α-AML
0.00E+00
2.00E-03
4.00E-03
6.00E-03
8.00E-03
1.00E-02
1.20E-02
1.40E-02
1.60E-02
Ctrl 12 Gluc 12 Man 12h
α
-A
M
L/
18
s
α-AML
Gráfica 17.- Expresión génica de α-AML a 12 horas
Gráfica 16.- Expresión génica de α-AML a 6 horas
45

Expresión de TGF- β1
Se analizó la expresión génica del TGF-β1 por PCR en tiempo real en dos experimentos
independientes. A las tres horas no se observó ningún efecto en las células estimuladas con
glucosa y manitol (Gráfica 18). De manera interesante, a las seis y doce horas de estimulo
con manitol se observó un incremento significativo en la expresión de este factor de
crecimiento (Gráficas 19 y 20). Las células estimuladas con glucosa no presentaron
diferencias con el control (Gráfica 20).

0.00E+00
2.00E-03
4.00E-03
6.00E-03
8.00E-03
1.00E-02
1.20E-02
1.40E-02
1.60E-02
1.80E-02
2.00E-02
3h ctr 3h glu 3h mani
T
G
F
-β
1
/1
8
s
TGF-β1
Gráfica 18.- Expresión génica de TGF-β1 a 3 horas
* p< 0.01
46

0.00E+00
2.00E-03
4.00E-03
6.00E-03
8.00E-03
1.00E-02
1.20E-02
1.40E-02
1.60E-02
6h ctr 6h glu 6h mani
T
G
F
-β
1/
18
s
TGF-β1
0.00E+00
5.00E-01
1.00E+00
1.50E+00
2.00E+00
2.50E+00
3.00E+00
3.50E+00
4.00E+00
Ctrl 12h Gluc 12h Man 12 h
T
G
F
-b
/1
8s
TGF-β1
Gráfica 20.- Expresión génica de TGF-β1 a 12 horas
* p< 0.01
* p< 0.0001
Gráfica 19.- Expresión génica de TGF-β1 a 6 horas
47

Discusión
La fibrosis pulmonar idiopática es la más agresiva de las neumopatías intersticiales y, en
este sentido, se caracteriza por ser progresiva irreversible y letal en un periodo
relativamente breve de tiempo(1,2). Sus mecanismos patogénicos no se conocen con
precisión, pero se estima que la enfermedad ocurre por daño y activación de las células del
epitelio alveolar que secretan diferentes mediadores que promueven la migración y
proliferación de fibroblastos y su diferenciación a miofibroblastos, los cuales se agrupan en
focos de fibroblastos/miofibroblastos y son los responsables de la acumulación excesiva de
MEC y en consecuencia de la destrucción de la arquitectura del parénquima pulmonar(3,4).
Existen evidencias obtenidas por microarreglos, inmunohistoquímica y otros métodos, de
que durante el desarrollo de la FPI las células epiteliales expresan anormalmente, tanto al
nivel del gen como de la proteína, por lo menos dos metaloproteasas de matriz, la MMP-1 y
la MMP-7, las cuales han sido involucradas en la remodelación anormal de la matriz
extracelular del pulmón(5,7). Así mismo, el epitelio alveolar pierde su capacidad funcional
de suprimir la actividad de los fibroblastos y produce quimiocinas responsables de atraer
fibroblastos circulantes al pulmón que facilitan en desarrollo de la enfermedad (7,8).
Las causas del daño/activación epitelial no se conocen con exactitud pero se ha propuesto
que la enfermedad ocurre por una combinación entre factores genéticos y ambientales. El
papel de la susceptibilidad genética y su interacción con factores ambientales se desconoce,
y los estudios que han examinado diferentes polimorfismos genéticos han sido negativos o
con resultados no concluyentes (5,7). Sin embargo, existen evidencias de que un cierto
número de pacientes con FPI aparentemente esporádica tiene algún familiar con el mismo
padecimiento (39,40). Así por ejemplo, en una revisión retrospectiva de 13 años en el
48

Programa de Trasplante Pulmonar en Vanderbilt, se encontró que el 19% de los pacientes
con FPI trasplantados tenían una historia familiar de parientes con la misma enfermedad
(41). Asimismo, alrededor de 10% de FPI familiar se identificó recientemente en una
cohorte de 229 pacientes con FPI (42). La mayoría de estos estudios sugieren un patron de
transmisión autosómico dominante, con penetrancia reducida (43).
De los factores ambientales destacan el tabaquismo y diferentes tipos de exposición
ocupacional y ambiental a diversas partículas orgánicas e inorgánicas y compuestos
químicos. También la infección viral crónica, en especial el virus Epstein-Barr y las
microaspiraciones por reflujo gastroesofágico han sido considerados como posibles factores
de riesgo(32) .
La incidencia de FPI se incrementa con la edad y el envejecimiento y también se relaciona
con otras enfermedades donde se involucra el estilo de vida, por lo que es posible que
trastornos relacionados con la DM2 pueden afectar en la iniciación o progresión de la FPI.
En este contexto, se han realizado tres estudios en diferentes poblaciones étnicas donde se
ha observado que la DM2 parece ser un factor de riesgo para desarrollar FPI (32).
Uno de los estudios realizado en el Reino Unido, mostró que la FPI está relacionada
significativamente con la DM2 y resultados similares fueron reportados en una
investigación desarrollada en Japón donde 65 pacientes con FPI fueron comparados con
184 sujetos control. En este trabajo se encontró que el 32.7% de los pacientes con FPI y
11.4% de los controles presentaron DM2. En nuestra población, se realizó un estudio
similar evaluando la frecuencia de varios factores de riesgo, incluyendo la DM2, que
abarcó a 97 pacientes con FPI y 560 pacientes que padecían diferentes padecimientos
49

respiratorios. Después de ajustar por diferentes variables se encontró que la DM2
incrementa significativamente el riesgo a desarrollar FPI (32).
Los mecanismos patogénicos implicados en la asociación de DM2 y FPI son actualmente
desconocidos por lo que este estudio fue diseñado para investigar algunos de los
mecanismos que podrían estar involucrados.
Con este propósito, evaluamos in vitro si un ambiente rico en glucosa induciría un fenotipo
profibrótico en las células epiteliales, para lo cual se examinó la expresión de MMP-1,
MMP-7, TGF-β y TIMP-1,moléculas que se han relacionado con el desarrollo de la
fibrosis, así como un análisis de la TEM, proceso clave en el desarrollo de la FPI.
Nuestros resultados mostraron que las células sometidas a una condición de hiperglucemia
mostraron un aumento en la expresión génica de MMP-1 lo que muestra relación con
estudios in vivo donde se ha observado por microarreglos de oligonucleótidos una
sobreexpresión de esta enzima en células epiteliales activadas en pacientes con FPI(36),
mientras en general muestra un nivel bajo de expresión en condiciones fisiológicas
normales (44,46). El papel de la MMP-1, una enzima encargada principalmente de la
degradación de las colágenas intersticiales, en el epitelio alveolar no se conoce, pero podría
tener un efecto en la migración celular como se ha descrito en el caso de queratinocitos
(44). Nuestros resultados también apoyan diversos estudios realizados en líneas de
macrófagos donde se ha observado un aumento en la secreción y en la expresión génica de
MMP-1 en condiciones de hiperglucemia (37,38)
De manera interesante, la MMP-7 mostró un comportamiento contrario y disminuyó
cuando las células epiteliales pulmonares fueron sometidas a altas concentraciones de
glucosa. Este hallazgo es diferente a lo que se ha reportado in vivo en pulmones con FPI,
50

donde esta enzima se ha encontrado sobreexpresada (46). Esta disminución quizá se deba a
modificaciones en el patrón de expresión de proteínas que se coexpresan con la MMP-7 e
inducen su expresión, como por ejemplo la osteopontina (46). En FPI, estudios con células
epiteliales provenientes de pacientes con FPI han mostrado una relación bidireccional entre
estas dos proteínas en donde la MMP-7 es inducida y activada por la osteopontina,
mientras que la última es cortada y activada por la MMP-7 (45). Una disminución de esta
enzima ha sido reportada en anillos de aorta cocultivados con fibroblastos, y se asume que
ésto podría tener un efecto en el desarrollo de algunos padecimientos vasculares (47).
Sin embargo, las modificaciones génicas de expresión de MMP-1 y MMP-7 no pudieron
ser corroborados a nivel de proteína, lo que podría deberse a modificaciones en la
degradación de los RNA mensajeros, o que las modificaciones génicas temporales fueron
insuficientes para reflejarse en la evaluación de las proteínas por Western blot.
El TIMP-1 un potente inhibidor de MMPs se incrementó cuando las células epiteliales de
pulmón se sometieron a un ambiente enriquecido en glucosa. Este inhibidor ha sido
señalado como un fuerte mediador profibrogénico en modelos experimentales y en FPI, lo
cual concuerda con un posible ambiente profibrótico generado por la hiperglicemia (18).
Un hallazgo interesante en este estudio fue la observación de una notable disminución en la
expresión de la banda inferior de la E-Caderina, llamada forma inmadura, que corresponde
al segmento intracelular de la proteína la cual interactúa con γ-catenina y está relacionada
con proteínas del citoesqueleto. Esta disminución se ha observado en algunas células
tumorales en condiciones de hiperglicemia (48,49). Esta alteración puede afectar la
estabilidad del complejo caderina-catenina, lo que puede favorecer un cambio en el
contacto célula-célula o en la motilidad celular (49). Estos resultados no parecen
51

corresponder a un proceso de transición epitelio-mesénquima dado que no pudimos
encontrar que concomitantemente a la disminución o desaparición de esta banda de E-
caderina, existiera un incremento en la expresión de α-AML la cual es una proteína
característica de células mesenquimatosas y un indicador de que la TEM está
ocurriendo(50). Este fenómeno se ha reportado en células provenientes de tumores y se le
atribuye a un aumento en el metabolismo de la glucosa con una sobreexpresión del
transportador de glucosa Glut-1 lo cual produce un cambio en la respiración, de aeróbica a
anaeróbica, lo que provoca un incremento en la producción de lactato. Esta reducción de
respiración mitocondrial combinado con la producción de lactato provoca una acidificación
del medio. La acidificación causa un deterioro de la matriz extracelular posiblemente
debido a una activación de MMPs lo que puede promover la migración o proliferación de
las células tumorales. Por el contrario, se ha observado que esto no ocurre en células
provenientes de epitelio sano ya que éstas mueren (48,49).
Sorprendentemente, el manitol indujo la expresión de TGF-β. Las razones las
desconocemos, ya que no se puede atribuir a la presión hiperosmótica que ejerció sobre las
células epiteliales (que puede inducir la expresión de citocinas y factores de crecimiento)
(51,52), dado que este efecto no se observó con la glucosa que provocó una
hiperosmolaridad similar.
En resumen nuestros hallazgos muestran un aumento en la expresión génica de MMP-1 en
condiciones de hiperglucemia, la cual es una enzima que se ha encontrada sobrexpresada en
pacientes con FPI, así mismo una disminución en la expresión de MMP-7. Por otro lado,
una alta concentración de glucosa indujo un decremento en la isoforma inmadura de la e-
caderina que interactúa con proteínas del citoesqueleto, lo cual no se podría considerar
52

como un proceso de TEM ya que no se encontró α-AML. También encontramos un
aumento en la expresión del TIMP-1 un inhibidor que se incrementa en los pulmones de
pacientes con FPI.
53

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