Alteraciones-en-AP-1-MAPKs-y-ciclina-D1-inducidas-por-la-exposicion-subcronica-al-carcinogeno-renal-FeNTA-y-efecto-de-un-extracto-de-semillas-de-tamarindo-EST

Vista previa del material en texto

UNIVERSIDAD NACIONAL . . 
AUTONOMA DE MEXICO 
FACULTAD DE QUIMICA 
PROGRAMA DE MAESTRIA y DOCTORADO 
EN CIENCIAS BIOQUIMICAS 
ALTERACIONES EN AP-1, MAPKS y CICLlNA 
D1 INDUCIDAS POR LA EXPOSICiÓN 
SUBCRÓNICA AL CARCINÓGENO RENAL 
FENT A Y EFECTO DE UN EXTRACTO DE 
SEMILLAS DE TAMARINDO (EST) 
T E s 1 s 
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE: 
MAESTRO EN CIENCIAS (BIOQUÍMICAS) 
P R E S E N T A: 
FRANCISCO ANTONIO AGUILAR ALONSO 
Tutor: Dra. Ma. Elena Ibana Rubio 
MEXICO, D. F. ABRIL 2010 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
ALTERACIONES EN AP-1, MAPKS Y CICLINA D1 INDUCIDAS POR LA 
EXPOSICIÓN SUBCRÓNICA AL CARCINÓGENO RENAL FENTA Y EFECTO 
DE UN EXTRACTO DE SEMILLAS DE TAMARINDO (EST) 
 
RECONOCIMIENTOS 
Esta tesis se realizó bajo la dirección de la Doctora María Elena Ibarra Rubio en el 
laboratorio 120 del edificio F de la Facultad de Química de la Universidad Nacional 
Autónoma de México. 
El comité Tutoral que asesoró esta tesis estuvo conformado por: 
Dra. María Elena Ibarra Rubio 
Dra. Martha Robles Flores 
Dra. Martha Patricia Coello Coutiño 
El proyecto fue apoyado por la Dirección General de Asuntos del Personal 
Académico bajo el programa de PAPIIT número IN 214307 
El proyecto fue apoyado por la Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (número 
81026). 
Durante los estudios de Maestría el sustentante gozó de una beca otorgada por 
CONACYT (252642). 
En el desarrollo de esta tesis se contó con el apoyo otorgado por el Colegio de 
Profesores de la Facultad de Química y la sección 024 del AAPAUNAM por haber 
ganado la Cátedra “Alberto Urbina del Raso” en el semestre 2010-1. 
El jurado del examen para obtener el grado de Maestro en Ciencias Bioquímicas 
estuvo constituido por: 
Dra. Victoria Chagoya de Sánchez 
Dr. Alejandro García Carrancá 
Dra. Marina Macías Silva 
Dra. Martha Robles Flores 
Dra. Leticia Rocha Zavaleta 
 
 
DEDICATORIAS 
Esta tesis va con especial dedicatoria a los que ya no están: 
A mi mamá, que aunque no estés sé que me acompañas en cada uno de mis logros. 
A mi tío Memo, porque en vida me enseñaste que con humildad, esfuerzo y valentía se 
construyen los grandes logros. 
A mi tía Chepis, que con su cariño y compañía, en los tiempos más diros, me dio ánimos 
para seguir adelante. 
Al tío Jaime, que fue uno de mis primeros ejemplos que me mostraron que los éxitos se 
alcanzan con constancia y visión. 
También dedico esta tesis a los que aún me acompañan: 
A mi padre, porque tu esfuerzo y cariño siguen rindiendo frutos en mi persona. Gracias 
por nunca desertar. 
A mi hermana Rotz. Para ti no existen palabras que puedan describir mi gratitud, sabes 
que siempre estaré para ti, como tu lo has hecho para mí. 
A mi Ardillita Silvia, por levantarme con amor cuando todo se veía sin sentido,por 
cuidarme cuando enfermo y por SIEMPRE portarse bien. 
A mis tías Cata, Mokoken y Macuka por su interés, guía, apoyo y compañía. Sin ustedes 
no sería el que soy hoy. 
A mis primos Sirno, Rebe, Vítor, Karla, Hétor y Chich por darme tan bonitos momentos en 
el cotorreo y seriedad. Los quiero mucho. 
A mi muy mejor amiga Jill, que aunque no seamos como lapa, siempre has estado cuando 
más te necesito. 
A mi Brother Rodrigo, por tener la paciencia escuadriñar nuestros defectos, con la 
esperanza de un día ser mejores. 
A la banda de la FQ, Aarón, Kika, Pive, Tania, Temo, Sofy, Marco, Edna, John y Alice pro 
brindarme momentos tan gratos y su incondicional apoyo. 
A la Doc. María Elena Ibarra, por su paciencia, guía y confianza, que sin ella el proyecto 
no hubiera avanzado exitosamente. 
A los viejos compañeros de laboratorio, Chabetty, Fer y José, con los cuales, 
conformamos un excelente equipo de trabajo y cuando fue necesario un buen grupo de 
amigos. 
A los nuevos en el laboratorio, Karla, Telma, Alfredo, Luz e Ignacio, los cuales, han hecho 
mucho amena mi estancia en el laboratorio. 
1 
 
LISTA DE ABREVIATURAS 
ADN Ácido Desoxirribonucleico 
AP-1 Proteína Activadora 1 
BUN Nitrógeno Ureico 
CCR Carcinoma de Células Renales 
DEN Dietilnitrosamina 
DNPH Dinitrofenilhidrazina 
EMSA Ensayo de Retardo en la movilidad Electroforética 
ERK Cinasa Regulada por Señales Extracelulares 
ROS Especies Reactivas de Oxígeno 
EST Extracto de Semillas de Tamarindo 
FeNTA Nitrilotriacetato de Hierro 
iNOS Nítrico Oxido Sintasa 
JNK Cinasa del amino Terminal de c-Jun 
MAPKs Cinasas de Proteínas Activadas por Mitógenos 
mRNA Acido Ribonucleico mensajero 
NBT Nitroazul de tetrazolio WB Western Blot 
PCNA Factor Nuclear de Proliferación Celular 
SFB Suero Fetal Bovino 
WB Western Blot 
 
 
 
 
ÍNDICE 
 
 
Página
 Lista de abreviaturas 
1. Resumen 
 1 
 2 
2. Antecedentes 4 
 2.1 El cáncer y el estrés oxidante 4 
 2.2 Carcinoma de células renales 6 
2.3 Nitrilotriacetato de hierro (FeNTA) como modelo de estudio del 
 CCR 
 7 
2.4 Generalidades de AP-1 9 
2.5 c-Jun 11 
 2.6 Cinasas de proteínas activadas por mitógenos (MAPKs) y 
 cáncer 
13 
 2.6.1 Cinasa regulada por señales extracelulares (ERK) 14 
 2.6.2 Cinasa del amino terminal de c-Jun (JNK) 15 
 2.6.3 p38 16 
 2.7 Ciclina D1 17 
 2.8 Antioxidantes en el tamarindo 18 
3. Justificación 20 
4. Hipótesis 21 
5. Objetivos 21 
6. Material y métodos 22 
 6.1 Diseño experimental 22 
6.1.1 Administración del EST 23 
6.1.2 Preparación y administración de DEN 24 
6.1.3 Preparación y administración de FeNTA 
6.1.4 Día del sacrificio y toma de muestras 
24 
25 
 6.2 Métodos 26 
 6.2.1 Obtención del EST 26 
 6.2.2 Caracterización del EST 26 
 6.2.3 Función renal 28 
 6.2.4 Marcadores de estrés oxidante 29 
 6.2.5 Niveles de expresión y fosforilación (activación) de 
 distintas proteínas específicas por Western Blot 
29 
 6.2.6 Translocación nuclear de c-Jun 
 6.2.7 Ensayo de cambio en la movilidad electroforética (EMSA) 
 para AP-1 
31 
31 
 6.3 Análisis estadístico 31 
7. Resultados 32 
7.1 Caracterización del EST 32 
7.2 Desarrollo del protocolo 33 
7.3 Observaciones macroscópicas de los riñones 34 
7.4 Evaluación de la función renal 34 
7.5 Marcadores de estrés oxidante 35 
7.6 Niveles de expresión y fosforilación de c-Jun 36 
7.7 Translocación nuclear de c-Jun 37 
7.8 Actividad de AP-1 
7.9 Niveles de expresión de la ciclina D1 
7.10 Niveles de expresión y fosforilación de ERK 
38 
40 
41 
7.11 Niveles de expresión de JNK 
7.12 Niveles de expresión y fosforilación de p38 
43 
43 
8. Discusión de resultados 45 
9. Resumen de resultados 
10. Conclusiones 
51 
52 
11. Anexos 53 
12. Referencias 73 
 
 
 
 
 
2 
 
1. RESUMEN 
El cáncer es una patología multifactorial cuyo desarrollo se ha divido en tres etapas: 
iniciación, promoción y progresión, siendo las primeras dos etapas claves para el control de 
esta patología. Entre los factores que han sido vinculados con el desarrollo del cáncer están 
los niveles elevados de estrés oxidante, por lo cual se ha generado gran interés en el uso de 
agentes antioxidantes comoterapia contra el desarrollo de cáncer. 
El carcinoma de células renales (CCR) presenta una alta mortalidad debido a la dificultad de 
su diagnóstico y tratamiento. Aunque en la actualidad se conocen algunas alteraciones 
moleculares presentes en este tipo de neoplasia, aún se está muy lejos de comprenderla y 
se desconoce lo que sucede en etapas tempranas del desarrollo de esta enfermedad. Sin 
embargo, algunos autores han encontrado que en tumores de CCR que se encuentran en 
estadios menos avanzados existe una sobreexpresión de c-Jun, uno de los monómeros que 
forman el factor de transcripción AP-1, y que esta sobreexpresión disminuye o desaparece 
en tumores en estadios más avanzados, lo que sugiere que c-Jun podría jugar un papel 
importante en etapas tempranas del desarrollo de esta neoplasia. De igual forma, en los 
tumores ya formados se han observado alteraciones en la expresión y activación de las 
MAPKs ERK, JNK y p38, moléculas que están relacionadas con la expresión y activación de 
c-Jun, y en los niveles de la ciclina D1, gen característico como blanco de AP-1. 
El modelo experimental más utilizado para el estudio de CCR es aquél inducido por 
nitrilotriacetato de hierro (FeNTA). Se sabe que la administración intraperitoneal de FeNTA 
produce necrosis renal con incrementos en los niveles de estrés oxidante en estudios 
agudos, y que su administración de forma crónica lleva al desarrollo CCR en roedores. 
Aunque se ha demostrado la participación del estrés oxidante en la carcinogenicidad del 
FeNTA, aún no se han esclarecido los mecanismos moleculares responsables. 
Con base en estos antecedentes, y con la finalidad de determinar alteraciones moleculares 
que se den en etapas tempranas y que podrían estar involucradas en el posterior desarrollo 
de CCR, se consideró importante establecer un protocolo subcrónico de un mes de 
tratamiento con FeNTA y analizar si se presentan alteraciones en c-Jun, así como en las 
MAPKs ERK, p38 y JNK y en la expresión de la ciclina D1, y si un antioxidante protege 
contra estas alteraciones. El protocolo se llevó a cabo estudiando 5 grupos de ratas Wistar 
macho: Control (C) y tratados con: a) extracto de semillas de tamarindo (usado como 
3 
 
antioxidante) en el agua de beber durante todo el estudio (EST); b) 2,4-N-N-dietilnitrosamina 
(DEN, usado como iniciador tumoral); c) DEN+FeNTA (D+F) y EST+DEN+FeNTA (E+D+F). 
El protocolo se realizó con una sola administración del iniciador tumoral DEN, y repetidas 
administraciones de FeNTA, 2 veces a la semana durante 1 mes, con incrementos graduales 
en la dosis cada semana. Cabe mencionar que en nuestro laboratorio, se indujo CCR con 
este esquema de tratamiento, pero extendido durante cuatro meses de exposición a FeNTA. 
Para monitorear la función renal se determinaron los niveles de nitrógeno ureico sanguíneo 
(BUN) cada semana. En el tejido renal obtenido 48 h después de la última administración de 
FeNTA se determinaron los niveles de estrés oxidante. los niveles de proteína, fosforilación 
(p-Ser 63) y translocación nuclear de c-Jun, la actividad del factor de transcripción AP-1, así 
como los niveles de ciclina D1, ERK 1/2, p-ERK (Tyr 204), JNK, p38α/β y p-p38 (Thr 180/Tyr 
182). 
Los resultados obtenidos indican que los tratamientos con EST y DEN no afectan el 
crecimiento de los animales ni las demás variables analizadas. La exposición a DEN+FeNTA 
retarda el crecimiento de los animales y el EST no puede revertir dicho efecto. A diferencia 
de lo observado en estudios agudos, no se encontraron alteraciones en los marcadores de 
estrés oxidante, ni en los niveles de nitrógeno ureico sanguíneo (BUN), es decir no se 
presentaron fallas en la función renal. Por otra parte, se observó que el tratamiento 
subcrónico durante 1 mes con FeNTA induce un incremento significativo en los niveles de 
proteína y fosforilación de c-Jun, en la actividad del factor de transcripción AP-1, en los 
niveles de ciclina D1, ERK p44, p-ERK y p-p38, así como una disminución en los niveles de 
JNK y p38 α/β, sin embargo, el EST no pudo prevenir estas alteraciones. 
Nuestros resultados muestran que se estableció un protocolo de tratamiento subcrónico con 
FeNTA, que podría representar una etapa temprana en el desarrollo de CCR por FeNTA, en 
el que se inducen alteraciones en AP-1, ERK, JNK, p38 y ciclina D1, las cuales podrían estar 
vinculadas con la malignización de las células renales y ser objeto de estudio para la 
prevención o control de esta neoplasia. Además, se encontraron similitudes con el CCR 
humano, lo que sugiere al modelo como una herramienta valiosa para el estudio de esta 
neoplasia. 
 
4 
 
2. ANTECEDENTES 
2.1 El cáncer y el estrés oxidante 
El cáncer es una enfermedad genética que se caracteriza por un crecimiento tisular debido a 
la proliferación descontrolada y continua de células anormales, que en los estadios más 
avanzados adquieren la capacidad de invasión y colonización de otros tejidos (Alberts y 
cols., 2002). 
Cualquier célula es susceptible a desarrollar cáncer, y éste puede clasificarse de acuerdo al 
tipo de células que dió origen al tumor (Arbiser, 2004). Por ejemplo, si la primera célula que 
desarrolló una anormalidad funcional fue epitelial se le conoce con el nombre de carcinoma, 
mientras que si la célula progenitora fue del tejido conectivo o muscular se le conoce como 
sarcoma; además, existen otro tipo de neoplasias fuera de esta clasificación como serían las 
leucemias y los cánceres del sistema nervioso (Alberts y cols., 2002). 
El desarrollo de una neoplasia es un proceso muy complejo donde deben combinarse y 
acumularse una serie de alteraciones en el funcionamiento celular. Como se muestra en la 
figura 1A, este proceso se ha dividido en 3 etapas: a) iniciación, cuando las células sufren 
mutaciones no letales, esta etapa puede ser reversible mediante sistemas de reparación del 
DNA; b) promoción, cuando las células iniciadas comienzan, por mecanismos de inducción, 
a proliferar y a evitar mecanismos de apoptosis, dando como resultado una progenie de 
células en estado preneoplásico, que pueden ser controladas por procesos de senescencia 
o apoptosis, este proceso ya no es reversible pero es contenible; c) progresión, cuando las 
células preneoplásicas sufren alteraciones que les permitirán convertirse en células 
neoplásicas, las cuales tendrán una proliferación anormal que generará un tumor que 
posteriormente podrá diseminarse por un proceso llamado metástasis (Valko y cols.,2006). 
Entonces, para que una célula pueda malignizarse y convertirse en neoplásica deberá saltar 
todos los procesos de reparación genética y de control del ciclo celular, lo cual puede 
favorecerse por exposiciones a diversos factores. Entre estos factores destacan: a) 
compuestos químicos, que pueden ocasionar daño en el DNA (carcinógenos); b) radiaciones 
ionizantes que causan rupturas y translocaciones cromosomales; y c) alteraciones por virus, 
los cuales pueden insertar su DNA al material genético del hospedero, con información que 
permita la transformación de células (Alberts y cols., 2002). 
5 
 
 
El estrés oxidante se define como el aumento en la proporción de especies oxidantes con 
respecto a los niveles de las defensas antioxidantes de la célula (Zentella de Piña y cols., 
2005). Las principales moléculas responsables en el desarrollo del estrés oxidante son las 
especies reactivas de oxígeno (ROS). En los organismos aerobios la producción de ROS 
ocurre en el metabolismo normal de la célula; sin embargo, la exposición a diversos factores 
oxidantes puede incrementar los niveles de ROS, induciendo procesos patológicos como es 
el cáncer (Valko y cols., 2006). 
Como se muestra en la figura 1B, niveles de estrés oxidante moderados inducen 
mutagénesis, evento que puede darse en cualquier etapa del desarrollo del cáncer formando 
células tumorales (Valko y cols., 2006); también seobserva que niveles bajos son suficientes 
para promover el desarrollo tumoral; sin embargo, si se presentan niveles altos de estrés 
oxidante se induce apoptosis y/o necrosis (Valko y cols., 2006). 
Se han propuesto 3 mecanismos mediante los cuales se relaciona el cáncer con el aumento 
en el estrés oxidante: a) algunas ROS, como el H2O2, pueden funcionar como moléculas de 
señalización celular para la activación de algunas vías relacionadas con el desarrollo de 
células tumorales, b) el daño directo al DNA provoca mutaciones o alteraciones genéticas 
que llevan a la malignización celular; y c) algunos productos generados durante la 
lipoperoxidación pueden, también, producir daño al DNA y por lo tanto la inducción de 
neoplasias (Genestra, 2007). 
Los blancos de ROS en la señalización celular son muy diversos e incluyen enzimas y 
factores transcripción y de crecimiento. De hecho, se sabe que las cinasas y fosfatasas de 
proteínas en tirosina (PTK y PTP respectivamente), los factores de transcripción AP-1 y NF-
Figura 1. El desarrollo del 
cáncer se lleva a cabo en tres 
etapas, las cuales se han 
vinculado con diferentes 
niveles en el estrés oxidante. 
(Valko, 2006) 
6 
 
κB, así como algunas cascadas de señalización celular, específicamente las cinasas de 
proteína activadas por mitógenos (MAPKs) p38 y la cinasa de amino terminal de c-Jun (JNK) 
son reguladas, al menos en parte, por el estado redox, el cual, puede ser modulado por ROS 
(Genestra, 2007; Pan y cols., 2009), y se ha reportado que el estrés oxidante puede generar 
una activación sostenida de algunas de estas proteínas, lo que resulta en el mantenimiento 
de fenotipos transformados y la inducción de procesos como metástasis y proliferación (Hsu 
y cols., 2000). 
 
2.2 Carcinoma de células renales (CCR) 
El CCR representa el 3% del total de los casos de cáncer reportados a nivel mundial (Nelson 
y cols., 2007). Este tipo de cáncer abarca tumores de distintos tipos histológicos: de células 
claras (CCR cc), papilar tipos 1 y 2, cromófobo y oncocitoma. El CCR es asintomático, muy 
propenso a desarrollar metástasis y resistente a la quimio y radioterapia (Nelson y cols. 
2007), lo que dificulta su diagnóstico y lo hace una neoplasia con una alta tasa de mortalidad 
(81.7 % en México) (Dirección general de epidemiología, 2001). 
Cada tipo de CCR presenta alteraciones moleculares distintas y responde de manera 
diferente a las terapias, lo que ha hecho aún más complicado su tratamiento. El tipo más 
común es el CCR cc, con el 80% de incidencia del total de casos de CCR (Marston 2005). 
Aunque se conocen algunas alteraciones moleculares de cada tipo de CCR, aún no se tiene 
caracterizado aquellas que permiten que las células del CCR se desarrollen y proliferen, o 
cuál es el mecanismo que les permite ser tan propensas a desarrollar metástasis (Nelson y 
cols. 2007). 
En la búsqueda de terapias contra el CCR se han probado diversos fármacos. Entre los 
cuales se incluyen el Bevacumab, un anticuerpo contra el factor de crecimiento vascular 
epidérmico (VEFG), la terapia con altas dosis de interleucina e interferones, antibióticos con 
blancos en la ruta de mTOR como la rapamicina y, más recientemente, se han aprobado dos 
fármacos, llamados Sorafenib y Sinutinib (Nelson y cols., 2007). El Sorafenib es un fármaco 
de administración oral es un inhibidor de algunas MAPKs y de la proteína dependiente de 
GTP Ras, así como de los receptores del VEGF 2 y 3 (Larkin y cols. 2006). Mientras que el 
7 
 
Sinutinib, también de administración oral, inhibe principalmente a todos los receptores de 
VEGF (Nelson y cols., 2007). Sin embargo, la respuesta a estas terapias sigue siendo 
limitada para el control de CCR. 
Por otra parte, se ha observado que el estrés oxidante juega un papel en el mantenimiento 
de diversas líneas celulares de CCR. De hecho, se ha demostrado que algunas agentes 
antioxidantes naturales, como el ácido cafeico, puede disminuir la angiogénesis, en este tipo 
de células, por inhibir la fosforilación del factor de transcripción STAT3, posiblemente por los 
mecanismos relacionados con la activación de cinasas por ROS (Jung y cols., 2005). 
Asimismo, en estudios realizados en Italia se observó que en una muestra de 3000 personas 
con un consumo de productos naturales ricos en polifenoles, principalmente flavonas, eran 
menos propensas a desarrollar cáncer renal que aquellos que no llevaban un consumo 
habitual de dichos antioxidantes (Bosetti y cols., 2007). 
 
2.3 Nitrilotriacetato de hierro (FeNTA) como modelo para estudio del CCR 
El modelo experimental más usado para el estudio de carcinogénesis renal es el de CCR 
inducido por nitrilotriacetato de hierro (FeNTA). Se sabe que la administración intraperitoneal 
de FeNTA produce necrosis en estudios agudos, pero de forma crónica produce 
adenocarcinoma de células renales en ratas y ratones (Preece y cols., 1989). Se ha 
encontrado que en la orina de ratas tratadas con FeNTA, se excreta 8-oxo-desoxiguanosina 
(Bahnemann y cols., 1998), un marcador de daño oxidante al DNA; de la misma forma, se ha 
encontrado un papel importante en la formación de aldehídos carcinogénicos como 
productos de la lipoperoxidación en los efectos del FeNTA (Toyokuni y cols., 1994; Athar y 
cols., 1998; Ichihashi y cols., 2001; Fukuda y cols., 2005; Eybl y cols., 2008), lo que ha 
vinculado la carcinogenicidad de este compuesto al estrés oxidante. 
El nitrilotriacetrato (NTA) es un ácido monocarboxílico (figura 2) quelante de cationes bi y 
trivaleintes como Ca2+, Zn2+, Fe2+ y Fe3+. Es una molécula pequeña que, acomplejada con 
metales como hierro, puede inducir daño oxidante a proteínas, lípidos y DNA (Leibold y 
cols., 2002). 
8 
 
 
Como se observa en la figura 3, después de la administración intraperitoneal (i.p), el FeNTA 
es absorbido por el mesotelio hacia la vena porta y enviado a circulación después de su 
paso por el hígado. Cuando el FeNTA se encuentra en circulación es filtrado en el riñón por 
el glomérulo para ser llevado hacia el túbulo proximal. Dentro del túbulo proximal el Fe3+NTA 
es reducido, por acción del glutatión, a Fe2+NTA. En su estado reducido el FeNTA genera, 
mediante la reacción de Fenton-Haber Weiss, la formación de radical hidroxilo, que puede 
desencadenar el daño celular (Toyokuni y cols, 1998). 
 
 Figura 3. El FeNTA es filtrado hacia los túbulos proximales, en donde, es reducido por acción del glutatión 
(GSH), desencadenando la reacción de Fenton-Haber Weiss (izquierda). El hierro puede inducir la reacción 
de Fenton-Haber Weiss (derecha). GSH: Glutatión, γ-GTP: γ-Glutamil transpeptidasa. 
Una de las ventajas que ofrece la inducción de CCR por FeNTA es que hay evidencia de 
que los tumores renales inducidos parecen ser la contraparte del CCR humano y los datos 
histopatológicos indican que se trata del tipo de CCR más común, el de células claras (Li y 
cols, 1987, Vargas-Olvera, 2009). Por otro lado, se ha observado que utilizar 
dietilnitrosamina (DEN) como iniciador tumoral en el modelo de inducción de CCR por 
FeNTA reduce el tiempo de formación de tumores a solo 4 meses (Athar y cols. 1998), a 
Figura 2. La molécula de 
FeNTA es un complejo, 
donde el Fe3+ se encuentra 
quelado. 
9 
 
diferencia de otros modelos que tardan hasta 2 años en que se desarrolle la patología 
(Umemura y cols., 1995; Lash y cols., 2000). 
Por otro lado, se ha probado que con la administración de algunos extractos con actividad 
antioxidante, como sería el uso de propóleo brasileño (Kimoto T. y colbs. 2000), se 
disminuye la incidencia de CCR inducido por FeNTA (Zhao y cols., 1997; Kimoto y cols., 
2000; Eybl y cols, 2008). En estudios agudos realizados en nuestro laboratorio, se ha 
observado que la administración oral de un extracto de pulpa de tamarindo a una dosis de 
25 mgFenoles Totales(FT)/Kgpeso disminuye significativamente los niveles en los marcadores deestrés oxidante (MDA, proteínas oxidadas y H2O2) renal inducidos una hora después de la 
administración de una dosis de 9mgFe/Kgpeso de FeNTA (Torres-Martínez, 2007; López-
Ramos, 2007). De igual forma, en trabajos previos en nuestro laboratorio, se ha demostrado 
que un protocolo de tratamiento de forma crónica (4 meses) con FeNTA induce el desarrollo 
de tumores de CCR de células claras, y que la administración de 100 mgFT/Kgpeso/día de un 
extracto de semillas de tamarindo (EST) reduce la incidencia y retarda la progresión de CCR 
(Vargas-Olvera, 2009) 
A pesar de que este modelo ha sido el más utilizado para el estudio de carcinogénesis renal, 
se desconocen las alteraciones moleculares que llevan a la malignización celular y del 
desarrollo de CCR. 
Por otra parte, en estudios agudos in vivo, 1 hora después de la administración de FeNTA, 
no se han observado alteraciones en la expresión del gen de ciclina D1 (López-Ramos, 
2007), en la activación del factor de transcripción NF-kB (Torres-Martínez, 2007), ni en los 
niveles de IkB-α (Cruz-White, 2007), indicando que con este esquema y a este tiempo de 
tratamiento, estos marcadores moleculares no están vinculadas como mecanismos de 
respuesta al FeNTA. 
 
2.4 Generalidades de AP-1 
AP-1 es un factor de transcripción que regula la expresión de genes vinculados con 
diferentes procesos celulares como proliferación (Shaulian y cols., 2001), invasión (Eferl y 
cols., 2003), apoptosis (Shaulian y cols., 2001), síntesis de enzimas de defensa antioxidante 
10 
 
(Cheng y cols., 2006) y angiogénesis (Eferl y cols., 2003), entre otros. Es una proteína 
dimérica que puede estar formada por homodímeros de las proteínas de la familia JUN (c-
Jun, JUNB y JUND) o por heterodímeros de éstas con las proteínas de la familia FOS (c-
Fos, FOSB, Fra-1 y Fra-2), resultando en 18 isoformas posibles (Young y cols., 2006). Las 
modificaciones postraduccionales que llevan a la formación y activación de este complejo 
son principalmente fosforilaciones de las proteínas JUN y FOS mediadas por diversas 
cinasas, incluyendo las MAPKs JNK, ERK y p38 (Young y cols., 2006). Se sabe que c-Jun 
es una proteína que cuando no está fosforilada en su Ser 63 ó 73, además de ser inactiva, 
tiene una vida media de entre 20 min a 2 h en la mayoría de los tejidos (Kayahara y cols. 
2005; Dunn y cols., 2002). También, se ha reportado que la fosforilación en la serina 63 es 
suficiente para proteger a c-Jun de ser degradada (Fuchs y cols., 1997; Dunn y cols., 2002; 
Kayahara y cols., 2005; Raivich G., 2008). 
Se sabe que tras un estímulo mitogénico se promueve la expresión de c-fos y c-jun, los 
cuales al dimerizarse forman el complejo AP-1. Posteriormente, este complejo, induce la 
expresión de distintos genes para promover la proliferación celular (Hess y cols., 2004). Por 
otra parte, se ha observado que el promotor de c-jun y c-fos poseen sitios de 
reconocimiento de AP-1, lo que nos dice que este factor puede autoinducir la expresión de 
algunos de sus componentes (Shaulian y cols., 2001). 
Se ha reportado que AP-1 puede regular distintos procesos celulares dependiendo de la 
combinatoria de sus componentes. Es decir, se ha observado que cuando AP-1 se 
encuentra constituido por c-Jun se promueve la expresión de la ciclina D1 (Eferl y cols., 
2003; Mathews y cols., 2007) y se induce una disminución de inhibidores de las cinasas 
dependientes de ciclina (CDK), p21 y p16 (Hess y cols., 2004), lo que resulta en un 
incremento en la proliferación celular (Brehens y cols., 2002; Zenz y cols., 2003). Así mismo, 
la presencia de c-Jun en AP-1 puede disminuir la expresión de algunas proteínas 
antiapoptóticas, como Bcl 3, y regular negativamente la expresión de p53, lo que resulta en 
una estimulación de la proliferación e inhibición de apoptosis (Eferl y cols., 2003; Stepniak y 
cols., 2006; Lijian y cols., 2007). Por otra parte, se ha reportado que JUNB y JUND son 
reguladores negativos de ciclo celular (Meixner y cols., 2004). Por otro lado, se ha reportado 
que si este factor de transcripción se encuentra conformado por c-Fos puede inducir 
11 
 
enzimas de defensa antioxidante, como es el caso particular de la hemooxigenasa (Cheng y 
cols., 2006) o inducir la expresión de la proteína proapoptótica FASL (Eferl y cols., 2003). De 
esta forma, y como se esquematiza en la figura 4, AP-1 regulará distintos procesos celulares 
dependiendo de las proteínas que lo conformen. 
 
 
 
 
2.5 c-Jun 
De todos los componentes que pueden conformar a AP-1, se ha identificado a c-Jun como 
altamente oncogénico (Eferl y cols., 2003). Esta proteína fue identificada como la contraparte 
celular del oncogen v-jun contenida en el genoma del virus del sarcoma aviar (Eferl y cols., 
2003). c-Jun es una proteína de 37 kDa con diversos dominios de fosforliación que pueden 
ser activados principalmente por ERK, JNK y p38 (figura 5) (Raivich 2008); además, posee 
un dominio de activación por acetilaciones, las cuales pueden ser mediadas principalmente 
por la acetilasa p300 (Mathews y cols., 2007). Por otra parte, también cuenta con un dominio 
de regulación negativa, denominado dominio δ (figura 5), el cual es necesario para su 
degradación mediada por JNK. Se ha identificado que una de las diferencias entre c-Jun y v-
Figura 4. AP-1 puede regular diversos procesos celulares dependiendo de las proteínas que lo 
conformen. Jun B reprime el avance del ciclo celular, mientras que c-Jun favorece el avance del ciclo y 
reprime apoptosis. Por otra parte c-Fos puede inducir apoptosis y la síntesis de la hemo-oxigenasa 1 (HO-
1), como parte de la defensa antioxidante. 
12 
 
Jun es que éste último carece del domino δ, por lo cual su degradación no puede ser 
regulada por JNK (Eferl y cols. 2003), haciendo de v-Jun una proteína altamente oncogénica 
. 
 
 
Por otra parte, las ROS pueden mediar la activación de AP-1 ya sea por su efecto sobre las 
MAPKs responsables de la fosforilación de c-Jun y c-Fos, o bien, el estado redox puede 
afectar directamente a la cys-172 en JUN y cys-154 en FOS permitiendo la activación de 
dichas proteínas sin necesidad de ser fosforiladas (Hsu y cols., 2000). 
En cuanto a c-Jun en el tejido renal, se ha observado que: en riñones normales existen 
niveles bajos de expresión y activación de c-Jun, mientras que en pacientes con diversas 
patologías renales se ha observado una elevada expresión de c-Jun que se relaciona con el 
grado del daño, algunos procesos inflamatorios y una elevada proliferación celular (De Borst, 
2007). Esto sugiere que c-Jun no juega un papel principal en la fisiología normal del riñón, 
pero que se induce en respuesta a diversos procesos patológicos (De Borst, 2007). 
Por otra parte, se ha observado que los niveles de c-Jun varían en el desarrollo de los 
tumores de CCR. Por ejemplo, se ha encontrado que en tumores que se encuentran en 
etapas temprana, se presentan niveles elevados de esta proteína y que estos niveles 
disminuyen en aquellos tumores que se encuentran en etapas avanzadas, por lo que se ha 
sugerido que c-Jun podría jugar un papel clave en el desarrollo de CCR (Oya y cols., 2005; 
Shiina y cols., 2003). De igual forma, en los tumores de CCR inducidos con FeNTA sí se ha 
encontrado un incremento, a nivel de mRNA, de c-Jun; sin embargo, en este estudio no se 
reportan los niveles de ésta a nivel de proteína (Liu y cols., 2007). 
 
Figura 5. La proteína c-Jun posee un dominio de unión a JNK (δ) y un dominio de transactivación (TA) que 
puede ser fosforilado por diversas cinasas, como JNK, ERK y la caseín cinasa II (CKII). Además, posee un 
dominio de unión a DNA (DBD) y un motivo de zipper de leucina (LZ) necesario para la dimerización. 
13 
 
2.5 Cinasas de proteínas activadas por mitógenos (MAPKs) y cáncer. 
 
Las MAPKs son cinasas de residuos de serina y treonina, altamente conservadas en células 
eucariontes (Krishna y cols., 2008). Sehan identificado 6 MAPKs distintas en mamíferos: la 
cinasa activada por señales extracelulares1/2 (ERK 1/2 ó p44 y p42 respectivamente), la 
cinasa del amino terminal de c-Jun (JNK 1/2), p38 (isoformas α, β, δ y γ), ERK 3/4, ERK 5 (ó 
BMK1) y ERK 7/8 (Yoon y cols., 2006). De éstas últimas, aún no se ha identificado si ERK 
3/4 y 7/8 son activadas por cascadas de fosforilación similares a las de las otras MAPKs 
(Yoon y cols., 2006). 
Aunque cada una de las MAPK (JNK, p38 y ERK) tiene características propias, todas 
comparten ciertas similitudes. Por ejemplo, todas ellas se activan en respuesta a estímulos 
mitogénicos por cascadas de fosforilación (mediadas por sus cinasas correspondientes) y 
todas poseen sitios de unión a otras proteínas (Yoon y cols., 2006). 
Se sabe que las proteínas p38, JNK y ERK son las responsables de la activación de 
diversos factores de transcripción que regularán distintos procesos celulares. De hecho, se 
ha observado que estas 3 proteínas son capaces de inducir la activación de los 
componentes de AP-1, entre ellos a c-Jun (Fuchs y cols., 1997; Yoon, 2006; Krishna y cols., 
2008; Ramos, 2008; Stepniak y cols., 2008; Raivich, 2008). 
En la figura 6 se muestra que las MAPKs forman cascadas de señalización responsables 
del control de procesos relacionados con el desarrollo del cáncer. Se sabe que bajo ciertos 
estímulos, como la presencia de ROS, algunas cinasas activadoras de MAPK (MEK) se 
activan y fosforilan a las MAPKs, incluyendo a las ERK, JNK y p38 (Nelson y cols., 2007). 
La actividad anormal de estas cinasas ha sido relacionada con transformaciones malignas y 
la progresión de tumores, incluyendo el carcinoma de seno y tumores primarios de riñón, 
colon y pulmón (Huang, 2008). 
14 
 
 
Figura 6. Algunas de las vías de las MAPK. Estas cascadas de señalización responden a ciertos estímulos y 
regulan procesos relacionados con el cáncer, como proliferación, diferenciación, apoptosis e inflamación. 
Fuente: Dhillon y cols., 2007 
En estudios recientes se han identificado las vías de JNK, ERK y p38 como blancos para 
inhibir la proliferación en líneas celulares de CCR cc Caki I y Caki II (Huang y cols. 2008). 
De hecho, el uso de una toxina antrácica indujo una disminución en la fosforilación de estas 
proteínas que se relacionó con una disminución en la proliferación celular. Sin embargo, la 
restricción en la fosforilación de estas proteínas no mostró disminución en la supervivencia 
de dichas células (Huang y cols. 2008). 
2.5.1 Cinasa regulada por señales extracelulares (ERK) 
La cascada de señalización de la cinasa regulada por señales extracelulares (ERK por sus 
siglas en inglés) se encuentra presente en todos los organismo eucariontes (Pearson y cols., 
2001). En mamíferos se han identificado 8 isoformas de ERK, de las cuales las más 
estudiadas y vinculadas con procesos carcinogénicos, han sido ERK 1 y 2. Éstas son 
proteínas con una alta homología entre sí (85% de identidad) (Ramos y cols., 2008) y son 
activadas por la cascada de fosforilación de Ras/Raf, la cual activa a las cinasas de MAPK 1 
y 2 (MEK 1 y 2) (Meloche y cols., 2007), siendo éstas últimas las activadoras directas de 
15 
 
ERK (Yoon y cols., 2006). En la actualidad se ha descrito que la forma en que ERK puede 
regular distintos procesos celulares depende del estímulo y duración del mismo, su 
localización celular y de las interacciones que pueda tener con otras proteínas (Meloche y 
cols., 2007; Ramos, 2008). De hecho, se ha identificado que una activación sostenida de 
ERK puede inducir la activación de ciertos factores transcripcionales, como c-Jun, para 
inducir la expresión de algunas ciclinas, como la D1, y la exitosa transición de G1/S y la 
proliferación celular (Meloche y cols., 2007). Sin embargo, también se ha reportado que una 
activación intermitente de ERK es necesaria para una exitosa transición G2/M (Yamamoto y 
cols., 2006). Esto sugiere que una activación sostenida de ERK es necesaria en la transición 
G1/S, pero que este efecto debe apagarse para proseguir con el ciclo celular. 
En diversos tipos de cáncer se ha observado un incremento en la expresión y activación de 
ERK (Lee y cols, 2009). Asimismo, su actividad se ha vinculado con la supervivencia y 
capacidad de desarrollar metástasis de algunas líneas celulares de CCR humano (Hong y 
cols, 2005; Ambrose y cols., 2006; Lee y cols., 2009) y se ha relacionado una 
hiperfosforilación de ERK con el grado de avance del tumor y la recurrencia del mismo 
después de la nefrectomía en pacientes con CCR cc (Campbell y cols., 2009). 
2.5.2 Cinasa del amino terminal de c-Jun (JNK) 
Otra representante de las MAPKs es JNK. En mamíferos se han descrito 3 isoformas, JNK, 
1, 2 y 3. Se ha reportado que JNK 1 y 2 se expresan de forma ubicua, mientras que JNK 3 
se expresa solamente en cerebro (Davis, 2001). En células normales, JNK es activada por 
las MEK 4 y 7 (Wagner y cols., 2009), y terminado el estímulo son inactivadas por fosfatasas 
de serina y tirosina. Una vez activada JNK puede, dependiendo del estímulo, fosforilar 
ciertos factores de transcripción como p53, c-Jun (parte del complejo AP-1), ATF2, Elk-1 y c-
Myc (Saadeddin y cols., 2009), así como algunas proteínas pro y anti apoptóticas como BAD 
y Bcl-2 respectivamente. De igual manera, al inactivarse JNK puede unirse a las proteínas 
que activó para inducir su degradación (Bode y cols., 2007). Un caso específico de esto, es 
que cuando c-Jun no es necesario, JNK se une a su dominio δ, para transportarla 
nuevamente a citosol y presentarla al proteosoma (Fuchs y cols., 1997). De hecho, se ha 
observado que una depleción de JNK, o la carencia del domino δ, incrementa los niveles y la 
capacidad oncogénica de Jun (Fuchs y cols., 1997). 
16 
 
Por otra parte, se ha reportado que uno de los mecanismos de regulación de JNK es 
mediante la inactivación de las MEK 4 y 7 por p38 (Wagner y cols., 2009) y ERK (Yoon y 
cols., 2006), lo que induce la degradación de JNK (Laine y cols., 2005). Lo anterior se ha 
vinculado con diversos procesos procarcinogénicos, como una disminución en la apoptosis y 
un incremento en la proliferación celular (Wagner y cols., 2009). 
2.5.2 p38 
p38 es una proteína activada por las MEK 3, 4 y 6. En vertebrados se han encontrado cuatro 
isoformas, denominadas α, β, δ y γ (Han y cols., 2007) y se ha reportado que en células de 
tejido renal normal sólo están presentes α, β y γ (Polzer y cols., 2007). Esta proteína da el 
nombre a una vía relacionada con procesos de inflamación, progresión del ciclo celular, 
crecimiento, regulación de apoptosis, diferenciación y senescencia oncogénica (Han y cols., 
2007). 
Uno de los mecanismos propuestos mediante el cual se explica cómo p38 se activa para 
producir apoptosis y senescencia es por incrementos en los niveles de estrés oxidante. Se 
ha reportado que cuando existe una sobreactivación de ERK se activan ciertos factores de 
transcripción, que inducen la expresión de diversas enzimas prooxidantes, como la NADPH 
oxidasa (NOX), lo que produce un incremento en el estrés oxidante, lo cual puede activar a 
MEK 6 (cinasa activadora de p38) (Dolado y cols. 2007). Una vez activada p38 induce la 
actividad de ciertos supresores de tumores, como p53, para inducir apoptosis (Lijian y cols., 
2007). De hecho, se ha observado que en células transformadas e incapaces de expresar 
p38α, los niveles de ROS se acumulan facilitando la expresión del genotipo transformado 
(Dolado y cols. 2007; Han y cols., 2007). Por otra parte, se ha encontrado que en células de 
túbulo renal, el H2O2 induce una activación de p38 con una cinética variable y se ha sugerido 
que este efecto se debe a que el estrés oxidante produce una activación diferencial de las 
distintas isoformas de p38 en los tiempos estudiados (Xiao y cols., 2006). 
Por otra parte, se ha reportado que mientras p38α puede inhibir la actividad oncogénica deRas, la isoforma p38γ es inducida por Ras promoviendo el desarrollo de distintos tipos de 
cáncer (Qi y cols., 2007). Asimismo, se ha encontrado que en líneas celulares de CCR, 
específicamente en células 786-0, se encuentran presentes las isoformas α, β y γ (Ambrose 
y cols., 2006), y que la actividad de p38γ correlaciona con la hiperactivación de ERK; sin 
17 
 
embargo, no se ha encontrado evidencia que señale que la actividad de ambas proteínas 
puede interregularse (Ambrose y cols., 2006). 
 
2.6 Ciclina D1 
De los tres tipos de ciclinas D que existen en mamíferos, la ciclina D1 ha sido propuesta, por 
diversos autores, como un protooncogen (Alao y cols., 2007; Tashiro y cols., 2007; Klein y 
cols., 2008; Ravindran y cols., 2009). Esta ciclina participa en la transición G1/S mediante la 
activación de las cinasas dependientes de ciclina (CDK) 4 y 6, para posteriormente fosforilar 
a la proteína del retinoblastoma (Rb) y permitir la liberación del factor de transcripción E2F, 
el cual promueve la transcripción de genes cuyos productos son necesarios para una exitosa 
entrada a la fase S (Alberts y cols., 2002; Meloche y cols., 2007). 
La región promotora del gen de esta ciclina posee múltiples sitios de regulación, por lo cual 
su transcripción puede ser inducida por diversos factores de transcripción como serían: 
AP-1 (cuando está presente c-Jun), el factor de transcripción de células T-4 (TCF-4), STAT 3 
y 5 y NF-κB, entre otros (Klein y cols., 2008). Sin embargo, se ha identificado que la vía de 
señalización Raf/Ras/ERK es la principal responsable en la inducción de la expresión de la 
ciclina D1, por medio de la activación de AP-1 (Meloche y cols., 2007; Klein y cols., 2008; 
Melbratu y cols., 2009). 
Entre las alteraciones en la transición G1/S que se presentan en diferentes tipos de cáncer, 
los incrementos en la expresión y/o acumulación de la ciclina D1 es de las más comunes 
(Hedberg, 1999; Alberts y cols., 2002; Malumbres, 2001; Diehl, 2002; Hedberg, 2003; Fu, 
2007; Alao y cols., 2007). Esta sobreexpresión se ha observado en el desarrollo de diversos 
tipos de cáncer como el de pulmón, vejiga, esófago, mama (Alao, 2007) y en el CCR 
(Hedberg 1999; Hedberg 2003), por lo que se ha propuesto a esta ciclina como blanco de 
agentes quimiopreventivos (Alao, 2007). De igual forma, se ha reportado que los tumores de 
CCR inducidos con FeNTA, en ratas, presentan una sobreexpresión de esta ciclina (Liu y 
cols., 2007). 
 
18 
 
2.7 Antioxidantes en el tamarindo 
Entre las moléculas con mayor actividad antioxidante están los polifenoles. Éstos constituyen 
un gran grupo de fitoquímicos ampliamente distribuidos en productos de origen vegetal por 
lo que representan una parte integral de la dieta humana. Los polifenoles existen en diversas 
formas como fenoles simples, ácidos fenólicos, polímeros fenólicos (comúnmente conocidos 
como taninos) y flavonoides (Bravo, 1998). Éstos últimos son lo más comunes y los más 
estudiados. 
Uno de los productos ricos en polifenoles de alto consumo en México es el tamarindo 
(Tamarindus indica), el cual se ha usado en medicina tradicional de otros países como 
laxante, expectorante, antidiarréico y en el tratamiento de quemaduras (Sudjaroen y cols., 
2005). Se ha demostrado que el tegumento de la semilla y el pericarpio del tamarindo 
contienen altas cantidades de polifenoles (6 537 mg/kg y 2817 mg/kg respectivamente) 
(Sudjaroen y cols., 2005). 
Algunos de los compuestos polifenólicos contenidos en el tamarindo han mostrado actividad 
en la prevención de cáncer (Aggarwal y cols., 2007). A continuación se describen ejemplos 
de ellos: 
• La procianidina B2, principal polifenol contenido en la semilla del tamarindo, inhibe la 
oxidación del DNA en presencia de Fe2+ y H2O2 (Sakano y cols., 2005). Además, promueve 
la apoptosis en células de carcinoma de seno y próstata (Agarwal y cols., 2007), y activa la 
producción de caspasa-3 en células de melanoma (Sakano y cols., 2005). También se ha 
encontrado que esta procianidina puede regular negativamente a algunas cinasas como 
ERK, JNK y p38-MAPK, evitando la activación de oncogenes relacionados (Zhang y cols., 
2006). De la misma forma, puede estabilizar a IκB, un regulador de la actividad del factor de 
transcripción vinculado con carcinogénesis NF-κB (Zhang y cols., 2006). 
• La catequina es otro de los principales polifenoles contenidos en la pulpa y la semilla del 
tamarindo (231 mg/kg) (Sudjaroen y cols., 2005). Se ha encontrado que este flavonol 
disminuye los niveles intracelulares de •OH y H2O2, además de promover una estabilización 
de IκB (Aggarwal y cols., 2006). También se sabe que puede inducir la activación de p53, 
19 
 
permitiendo que se lleve a cabo la apoptosis en células malignas de cerebro N9 (Huang y 
cols., 2005; Mackenzie y cols., 2004). 
• La apigenina, también contenida en el tamarindo, puede inhibir a NF-κB en monocitos 
(Nicholas y cols., 2007) y en células de cáncer cervical (Zheng y cols., 2005), así como la 
expresión del factor inducido por hipoxia (HIF-1) y VEGF en células cancerosas de próstata 
(Fang y cols., 2006); también puede inducir apoptosis por incrementos en caspasa-3 en 
células de neuroblastoma (Torkin y cols., 2005). 
• Por otro lado, se ha observado que la luteolina promueve la apoptosis incrementando JNK y 
activando a TNF en células cancerosas de pulmón (Ju y cols., 2007), además de promover 
la apoptosis y suprimir el crecimiento en células de cáncer de próstata (Fang y cols., 2006). 
• Finalmente, la taxifolina incrementa la expresión de enzimas detoxificantes y de algunas 
enzimas antioxidantes por la activación de algunos genes que poseen elementos de 
respuesta a antioxidantes (AREs) (Lee y cols., 2007). 
En nuestro laboratorio se ha encontrado que el uso de algunos extractos con actividad 
antioxidante, como el extracto de semilla de uva, jugo concentrado de arándano, extractos 
del pericarpio y tegumento de la semilla del tamarindo, reducen los niveles de daño oxidante 
y previenen alteraciones en la función renal inducidos por el tratamiento de forma aguda con 
FeNTA, así como una disminución en la incidencia y retardo en el desarrollo de CCR (Cruz-
White, 2007; Dávalos-Salas, 2006; Torres-Martínez, 2007; Vargas-Olvera, 2009). 
 
 
 
 
 
 
 
 
20 
 
3. Justificación 
 
El desarrollo de cáncer se ha dividido en 3 etapas, siendo las etapas de iniciación y 
promoción claves para poder establecer terapias para su control. 
El CCR es uno de los tipos de cáncer menos estudiados, es una neoplasia asintomática, 
resistente a las terapias convencionales contra cáncer y muy propensa a desarrollar 
metástasis, por lo que presenta una alta mortalidad. 
El modelo más utilizado para el estudio de CCR es el de carcinogénesis inducida por 
FeNTA, en el cual está involucrado el estrés oxidante; sin embargo, en la actualidad no se 
han caracterizado los mecanismos moleculares responsables, ni las etapas de desarrollo del 
cáncer en este modelo. 
Por otra parte, se sabe que el factor de transcripción AP-1 formado por c-Jun participa en el 
desarrollo de distintos tipos de neoplasias y particularmente se ha encontrado que en 
tumores de CCR humano, los cuales se encuentran en etapas tempranas, se presenta un 
incremento en los niveles de c-Jun. 
Con base en todo lo anterior, se consideró de gran importancia identificar en etapas 
tempranas de este modelo de carcinogenicidad las alteraciones en la expresión y 
fosforilación de c-Jun, actividad de AP-1, el estado de las MAPKs ERK, p38 y JNK como 
probables vías responsables en la activación de dicho factor de transcripción y determinar 
los niveles de expresión de la ciclina D1, como gen blanco de AP-1 involucrado en procesos 
de carcinogénesis. Así mismo, se probará si un extracto de semillas de tamarindo rico en 
polifenoles puede prevenir los efectos inducidos por el tratamiento con FeNTA.21 
 
4. Hipótesis 
El tratamiento subcrónico durante 1 mes con FeNTA inducirá alteraciones en la expresión y 
fosforilación de c-Jun, en la actividad de AP-1, en los niveles de la ciclina D1 y las MAPKs 
ERK, JNK y p38. Debido a que se ha vinculado la carcinogenicidad del FeNTA con el estrés 
oxidante un EST con alta capacidad antioxidante disminuirá dichos efectos. 
 
5. Objetivos 
 
• Objetivo general: 
 Determinar si la exposición subcrónica a FeNTA (1 mes de tratamiento) induce 
alteraciones en los niveles de expresión y fosforilación de c-Jun, así como en la actividad 
de AP-1, en los niveles de la ciclina D1 y en las MAPKs ERK, JNK y p38, e investigar el 
efecto de un extracto de semillas de tamarindo, que posee una gran capacidad 
antioxidante, en dichas alteraciones. 
 
• Objetivos particulares: 
 En ratas expuestas de forma subcrónica a FeNTA durante un mes analizar la función 
renal y los siguientes parámetros en corteza renal: 
o Los niveles de estrés oxidante. 
o Los niveles de proteína y fosforilación de c-Jun. 
o La translocación nuclear de c-Jun. 
o La actividad de AP-1. 
o Los niveles de expresión y fosforilación de ERK, p38 y JNK. 
o Los niveles de proteína de ciclina D1. 
o Los efectos del EST sobre estos parámetros. 
 
 
 
 
 
 
22 
 
6. Material y métodos 
 
6.1 Diseño experimental 
En la figura 7 se presenta de manera general el diseño experimental desarrollado, el cual se 
eligió con base en la literatura (Toyokuni y cols., 1994; Liu y cols., 2007; Eybl y cols., 2008) y 
en observaciones en nuestro laboratorio (Dávalos-Salas, 2006; Torres-Martínez, 2007; Cruz-
White, 2007; Vargas-Olvera, 2009). Para desarrollar el protocolo subcrónico se utilizaron 30 
ratas Wistar macho con un peso inicial de 60-90 g y se agruparon como se muestra en la 
tabla 1. Cabe mencionar que este mismo esquema de tratamiento, pero con 
administraciones del carcinógeno durante 4 meses (estudio crónico), ha sido utilizado 
exitosamente en nuestro laboratorio para generar CCR (Vargas-Olvera, 2009). 
 
Figura 7. Resumen del diseño experimental. 
 
 
 
23 
 
Tabla 1. Esquema de tratamiento de los diferentes grupos estudiados 
 Grupo No. de 
Animales 
Esquema de tratamiento 
 
 Control (C) 
 
 
6 
 
Vehículos 
 
 
EST 
 
 
 
6 
 
Administración del EST en 
el agua de beber (100mg/Kg/día) 
15 días antes del inicio del estudio y durante todo el estudio 
 
 
 
DEN 
 
 
 
6 
 
Administración i.p. única de DEN 
(200 mg/Kg) 10 días antes 
del inicio del estudio 
 
DEN 
+ 
FeNTA 
(D+F) 
 
 
 
6 
 
Administración i.p. única de DEN (200 mg/Kg) 10 
días antes de la primera administración de FeNTA 
+ 
Administración i.p de FeNTA 2 
veces a la semana durante un mes 
. con incrementos graduales en la 
dosis cada semana (3, 5, 7 y 9 mgFe/Kg) 
 
 
 
EST 
+ 
DEN 
+ 
FeNTA 
(E+D+F) 
 
 
 
 
6 
 
Administración del EST en 
el agua de beber (100mg/Kg/día) 
15 días antes de DEN y durante el estudio 
+ 
Administración i.p. única de DEN (200 mg/Kg) 
10 días antes de la administración de FeNTA 
+ 
Administración i.p de FeNTA 2 
veces a la semana durante un mes 
. con incrementos graduales en la 
dosis cada semana (3, 5, 7 y 9 mgFe/Kg) 
 
 i.p.: Intraperitoneal; EST: Extracto de semillas de tamarindo; DEN: 2,4-N,N-Dietilnitrosmina; 
 FeNTA: Nitrilotriacetato de hierro 
 
 
 
6.1.1 Administración del EST: 
 
La obtención y caracterización del EST se describe en el apartado de “métodos 6.2”. 
 
Para la realización de este protocolo, y con base en la información obtenida en estudios 
previos en nuestro laboratorio (Torres, 2007; Vargas, 2009), se utilizó una dosis de EST de 
24 
 
100 mgfenoles totales (FT)/Kgpeso, ya que se observó que en estudios agudos con FeNTA esta es 
la dosis que presenta el mayor efecto antioxidante (Torres,-Martínez, 2007; Cruz-White, 
2007; Vargas-Olvera, 2009) y que dosis mayores de polifenoles pueden inducir efectos 
prooxidantes (Cruz-White, 2007; Vargas-Olvera, 2009). 
Durante el periodo de adaptación se determinó el volumen promedio de agua bebida por los 
animales. Para la administración del EST, se calcula la cantidad de EST que debe añadirse 
al agua de beber para que cada animal reciba una dosis de 100 mg/Kgpeso corporal /día. Debe 
recalcarse que durante todo el protocolo se continuó con el monitoreo del volumen de agua 
bebida, así como el peso de los animales a fin de ajustar la cantidad de EST que debe 
agregarse para mantener la dosis. 
 
6.1.2 Preparación y administración de DEN 
El DEN se obtuvo de Sigma Aldrich, Inc. (St. Louis MO, EUA) y se administró, a los grupos 
correspondientes, una dosis única de 200 mgDEN/Kgrata, la cual se seleccionó con base en la 
literatura y observaciones de nuestro laboratorio (Kahn y cols., 2005). La administración se 
llevó a cabo diluyendo el contenido del vial (1 mL de 990-999 mgDEN/mL) en 11 mL de 
solución salina y se ajustó el volumen a administrar dependiendo del peso de cada animal. 
 
6.1.3 Preparación y administración de FeNTA: 
El FeNTA se preparó siguiendo el método de Awai et al, con ligeras modificaciones. Se 
preparó una solución de Fe(NO3)3 (Sigma Aldrich, inc. (St. Louis MO, EUA)) 160mM y una 
solución de nitrilotriacetato de sodio (Sigma Aldrich, inc. (St. Louis MO, EUA)) 320 mM, 
utilizando en ambos casos una solución de Na2HCO3 120 mM como disolvente. Se mezcló 
un volumen de la solución de Fe(NO3)3 con 2 volúmenes de la solución de nitrilotriacetato de 
sodio. En agitación constante se ajustó el pH con Na2HCO3 hasta llegar a 7.4. Esta solución 
tiene una concentración final de hierro de 2.98 mgFe/mL. 
La administración de FeNTA se basó en la cantidad de hierro contenido en la solución y no 
la del complejo FeNTA. Para conocer la cantidad de hierro en la solución se efectuó el 
siguiente cálculo: 
 
 
25 
 
Si se deseaba administrar una dosis de 9 mgFe/Kgrata a una rata de 250 g: 
(1mL solución de FeNTA/2.98 mgFe) (9 mgFe/Kgrata)= (3.02 mL de solución de FeNTA/Kg)*(0.25 Kgrata)= 755 
μLde solución de FeNTA. 
 
6.1.4 Sacrificio y toma de muestras: 
48 h después de la última administración de FeNTA a los grupos correspondientes, las ratas 
de todos los grupos se sacrificaron por decapitación, recolectando la sangre para la posterior 
obtención de suero. Se obtuvieron los 2 riñones y se separó la corteza de la médula. La 
corteza se dividió en fracciones para las diferentes determinaciones: a) una fracción de 
muestra se utilizó para las determinaciones de marcadores moleculares (congeladas 
inmediatamente en nitrógeno líquido y almacenada posteriormente a -70°C hasta el día en 
que fueron analizadas); b) otra fracción se utilizó para determinar marcadores de estrés 
oxidante como H2O2, malondialdehído (MDA como marcador de lipoperoxidación) (estos 
tejido se homogenizaron inmediatamente, en el buffer correspondiente según las 
indicaciones de cada técnica, y se congeló a -70°C hasta el día de su análisis) ., y proteínas 
oxidadas (los tejidos usados para esta determinación fueron congelados inmediatamente en 
nitrógeno líquido y almacenada posteriormente a -70°C hasta el día en que fueron 
analizadas) 
En la figura 8 se resume el esquema de tratamiento seguido en el presente estudio. 
 
Fi
gura 8. Esquema de desarrollo del protocolo subcrónico a través del tiempo de estudio. 
 
 
26 
 
6.2 Métodos 
 
 
6.2.1 Obtención del EST. 
El EST se preparó como se ha descrito previamente (Vargas-Olvera, 2009) y como se 
explica en el anexo 11.1.1. 
 
6.2.2 Caracterización del EST. 
• Fenoles totales (FT) 
Al polvo obtenido se le determinó el contenido de fenoles totales por el método de Folín 
Ciocalteau (Singleton y cols., 1999) como se describe en el anexo 11.1.2. Los compuestos 
fenólicos reducen a los componentes del reactivo Folín-Ciocalteu, que está formado por una 
mezcla de ácido fosfotúngstico (H3W12O40) y ácido fosfomolíbdico (H3PMo12O40), los cualesforman una mezcla de óxidos azules de tungsteno (W8O23) y de molibdeno (Mo8O23) con 
absorbancia máxima a 765 nm. 
Para llevar a cabo la cuantificación de fenoles en el EST, se realizó una curva patrón con 
concentraciones conocidas de ácido gálico, en la que se interpolaron las absorbancias leídas 
de diferentes diluciones del EST. Los resultados se expresan en mgFT/mgEST. 
 
• Inactivación del radical superóxido 
La determinación para la inactivación del radical superóxido se describe ampliamente en el 
anexo 11.1.3. 
El radical superóxido que se genera enzimáticamente por acción de la xantina oxidasa sobre 
la xantina, y reacciona con el nitroazul de tetrazolio (NBT) para generar formazán, un 
compuesto colorido que absorbe a 560 nm. La inactivación del radical superóxido por acción 
de los polifenoles se detectó por la disminución de formazán generado debido a la 
disminución de radical superóxido disponible (Bielski y cols., 1980). El mecanismo de la 
reacción se describe en la figura 9. 
27 
 
 
 
 
El protocolo para determinar la capacidad de inactivación del radical superóxido se realizó 
de la siguiente manera: Se determinó la cantidad de formazán formado en la mezcla de 
reacción sin compuestos polifenólicos, a esta mezcla se le denominó como control positivo 
(C-100%). Posteriormente se realizó una curva con distintas concentraciones de EST (tabla 
2) a las que se les determinó el % de inactivación del radical O2•- con respecto al C-100%. A 
la curva obtenida se le realizó una regresión no lineal para calcular la dosis media inhibitoria 
(IC50) que se refiere a la cantidad de EST necesario para atrapar el 50 % del O2•- formado en 
el sistema xantina/xantina oxidasa. 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 9. Mecanismo de reacción para la determinación de la inactivación del radical 
superóxido 
28 
 
Tabla 2. Diluciones del EST para determinar la IC50 de inactivación de O2•- 
Dilución 
del 
stock 
[EST] 
µg/mL 
Agua (μL) μL de la 
dilución de 
EST 
Volumen final 
(μL) 
1:50 6.69 1960 40 del stock 2000 
1:75 4.46 1480 20 del stock 1500 
1:100 3.34 1000 1000 de 1:50 2000 
1:150 2.23 1000 1000 de 1:75 2000 
1:200 1.67 1000 1000 de 1:100 2000 
1:250 1.3 1494 6 del stock 1500 
1:300 1.11 1000 1000 de 1:150 2000 
1:400 0.83 1000 1000 de 1:200 2000 
1:500 0.66 500 500 de 1:250 1000 
1:600 0.55 500 500 de 1:300 1000 
 Stock: 0.334 mg/mL 
 
6.2.3 Función renal. 
Con la finalidad de determinar si en nuestras condiciones de tratamiento, el FeNTA tiene 
algún efecto en la función renal, se determinaron los niveles de nitrógeno ureico en sangre 
(BUN por sus siglas en inglés). La urea es un producto de desecho del metabolismo del 
nitrógeno, se transporta en la sangre y se filtra en el glomérulo para ser eliminada por la 
orina. Cuando existe una insuficiencia renal la urea no se elimina por orina, por lo que se 
observa un aumento en sus niveles sanguíneos. 
La determinación de la urea se realizó mediante el estuche comercial Urea-37 de la marca 
SPINREACT (Girona, España), el cual se basa en la reacción de la urea con o-ftalaldehído 
en medio ácido para formar un compuesto colorido que absorbe a 510 nm (Figura 10) 
(Kaplan, 1984). Los resultados se expresan como mg de BUN/dL de suero. 
29 
 
OO
 1,2-Benzenedicarboxaldehyde,
NH2
O
H2N
urea
+
H+
HN
isoindoline
ABS= 510 nm  
Figura 10. Mecanismo de reacción para la determinación de nitrógeno ureico sanguíneo con o-
ftalaldehído (1, 2-Benzendicarboxaldehído). 
 
 
6.2.4 Marcadores de estrés oxidante 
 
La metodología utilizada para la determinación de los marcadores de estrés oxidante se 
describe en el anexo 11.1.4. 
 
Cuantificación de peróxido de hidrógeno (anexo 11.4.1): Esta determinación se realizó 
mediante el método “hierro3+-naranja de xilenol”, el cual se basa en la oxidación de Fe2+ a 
Fe3+ por el peróxido de hidrógeno en condiciones ácidas. El ión férrico se une con el naranja 
de xilenol para formar un complejo que se puede detectar a 560 nm. Los resultados se 
calcularon a partir de una curva estándar de H2O2 y se expresan como nmolH2O2/mgproteína 
(Long y cols., 1999). 
Proteínas oxidadas (grupos carbonilo) (anexo 11.4.2): La determinación utilizada se basa 
en la reactividad de los grupos carbonilo con dinitrofenilhidrazina (DNPH) para formar 
hidrazonas de proteína, las cuales absorben la luz a 370 nm. Los resultados se expresan 
como nmolC=O/mgproteína (Sohal y cols., 1993; Levine y cols., 1994; Reznick y cols., 1994). 
Lipoperoxidación (niveles de malondialdheído) (anexo 11.1.4.3): Esta determinación se 
llevó a cabo con un método colorimétrico específico para MDA en el que esta molécula 
reacciona con N-metil 2-fenilindol generando un compuesto colorido que absorbe a 586 nm. 
Los resultados se calcularon a partir de un curva estándar de tetrametoxipropano y los valores 
obtenidos se expresan como nmolMDA/mgproteína (Eldelmeir y cols., 1998; Gerard-Monier ycols., 
1998) 
 
6.2.5 Niveles de expresión y fosforilación (activación) de distintas proteínas 
específicas por Western Blot. 
 
Las cortezas renales se obtuvieron como y se homogenizaron como se describe en el anexo 
I (11.5.1) y se les determinó el contenido de proteína mediante el método de Bradfford 
(anexo 11.5.2). Posteriormente se cargó en geles SDS-PAGE un volumen de homogenado 
30 
 
de corteza renal equivalente a 80 µg de proteína y se realizó la electroforesis como se 
describe en el anexo 11.1.5.5. Después de la separación de proteínas, éstas fueron 
transferidas a una membrana de PVDF (anexo 11.1.5.6) y se realizó la detección de distintas 
proteínas, como se describe en el anexo I (11.1.5.7), utilizando las condiciones descritas en 
la tabla 3. 
Tabla 3. Algunas condiciones experimentales para la detección de las proteínas estudiadas por Western 
Blot. 
 
 
 
Proteína 
 
 
 
Bloqueo 
Dilución 
usada del 
anticuerpo 
1ario 
Dilución 
Usada del 
anticuerpo
2ario 
 
 
 
Marca del anticuerpo 
 
c-Jun 
Suero fetal 
bovino al 10% (SFB)
 
1:1000 
 
 
1:40000 
 
Santa Cruz Biotech inc.
c-Jun (D); # cat: sc-44 
 
p-c-Jun 
(Ser 63) 
 
SFB al 10% 
 
1:300 
 
 
1:30000 
 
Santa Cruz Biotech inc.
p-c-Jun (KM-1) 
# cat: sc-822 
 
Tubulina 
Leche descremada
al 1% 
 
1:10000 
 
 
1:30000 
 
Santa Cruz Biotech inc.
Α-Tubulina (B-7) 
# cat: sc-5286 
 
ERK 
 
SFB al 10% 
 
1:500 
 
 
1:40000 
 
Santa Cruz Biotech inc.
ERK 1 (FL) 
# cat: sc-571 
 
p-ERK 
(Tyr 204) 
 
 
SFB al 10% 
 
1:1500 
 
1:60000 
Santa Cruz Biotech inc.
p-ERK (E4) 
# cat: sc-7383 
 
JNK 
 
SFB al 10 % 
 
1:1500 
 
 
1:60000 
 
Santa Cruz Biotech inc.
JNK 1 (K-23) 
# cat: sc-094 
 
p38 α/β 
 
SFB 10% 
 
1:1250 
 
1:50000 
Santa Cruz Biotech inc.
p38 α/β (H-147) 
# cat: sc-71149 
 
p-p38 
(Thr180/ 
Tyr 182) 
 
 
SFB 10% 
 
 
1:1000 
 
 
1:50000 
Santa Cruz Biotech inc.
p-p38 (Thr 180/Tyr 182)
-R 
# cat: sc-17852-R 
 
Ciclina D1 
 
SFB al 10% 
 
1:250 
 
 
1:40000 
 
Santa Cruz Biotech inc.
Cyclin D1 (H-295) 
# cat: sc-753 
PCNA Leche descremada
al 1% 
 
1:400 
 
 
1:30000 
 
Santa Cruz Biotech inc.
PCNA (F-2) 
# cat: sc-25280 
31 
 
6.2.6 Translocación nuclear de c-Jun. 
 
Se realizó la extracción de los núcleos como se describe en el anexo 11.1.6.1. A las 
fracciones citosólica y nuclear se les determinó la concentración de proteína y se realizó un 
WB para corroborar que la separación fue realizada exitosamente. Esto se realizó mediante 
la detección de proteínas específicas para cada fracción: α-tubulina como referencia 
citosólica y el antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA) como referencia nuclear. 
 
6.2.7 Ensayo de cambio en la movilidad electroforética (EMSA) para AP-1 
En los extractos nucleares obtenidos como se describe en el anexo I (11.1.6.1) se les 
determinó la actividad de unión de AP-1 a su secuencia consenso mediante el ensayo de 
EMSA (descrito en el anexo 11.1.7). Se utilizó la secuenciaconsenso de doble cadena 
reconocida por AP-1 cuando está conformado por c-Jun 5’-TGACTCA-3’ (Efferl y cols., 
2003). El oligonucleótido de doble cadena se marcó y se llevó a cabo el EMSA utilizando un 
estuche comercial como se indica en el anexo I (11.1.7) . El ensayo se realizó siguiendo las 
instrucciones del fabricante. En los casos correspondientes se utilizaron: 2 ng de oligo 
marcado, un volumen de fracción nuclear correspondiente a 15 µg de proteína. Así mismo se 
realizaron experimentos de superretardo se utilizando anticuerpos anti c-Jun o anti p-c-Jun. 
 
6.3 Análisis estadístico 
 
Los resultados se presentan como la media ± error estándar. La significancia estadística se 
estableció por análisis de varianza (ANOVA) y usando el método de comparación múltiple de 
Newman Keuls con p<0.05 utilizando el programa GraphPad Prisma Ver. 4.02. 
 
 
 
 
 
 
 
 
32 
 
7 RESULTADOS. 
 
7.1 Caracterización del EST. 
• Fenoles totales e inactivación del radical superóxido: 
El contenido de polifenoles en el EST se realizó interpolando los valores de absorbancia a 
765 nm, en una curva patrón de ácido gálico, cuya ecuación fue ABS=0.0044[FT] – 0.013 
(r2= 0.997). Los resultados obtenidos indican que el EST obtenido presenta un alto contenido 
de polifenoles(1.07 ± 0.027 mgFT/mgEST).  
 
Así mismo, se determinó la capacidad del EST para inactivar al anión O2•-. En la figura 11 se 
presenta la curva de inactivación de dicho radical a distintas concentraciones del EST, a 
partir de la cual se calculó la concentración a la que dicho extracto es capaz de inactivar el 
50% del O2•- formado (IC50), la cual fue de IC50=2.7±0.03 μgEST/mL. Esto nos indica una muy 
buena capacidad antioxidante, por parte del EST, si la comparamos por ejemplo con la de el 
ácido ascórbico (IC50=125 µgÁc, ascórbico/mL), glutatión (IC50=2.15 μgglutatión/mL) (Floriano y 
cols., 2006) u otros extractos polifenólicos, como los obtenidos de B. forficata (IC50=90 
µgextracto crudo/mL) (Khalil y cols., 2008), C. sicyoides (IC50=60 µgextracto crudo/mL) (Khalil y cols., 
2008). 
Curva de atrapamiento del radical superóxido por el EST
μg EST /mL
0 2 4 6 8
%
 d
e 
at
ra
pa
m
ie
nt
o 
de
 O
2-
-
0
20
40
60
80
100
 
Figura 11. Curva de inactivación del radical O2•- a diferentes concentraciones del EST. El EST 
posee una alta capacidad de inactivación del radical O2•- IC50=2.7 μgEST/mL. 
33 
 
7.2 Desarrollo del protocolo 
• Curva de crecimiento 
En la figura 12 se muestra la curva de crecimiento de las ratas a lo largo del estudio. El 
grupo tratado con EST no mostró una disminución significativa en su peso a lo largo del 
estudio. Los grupos tratados con DEN mostraron una disminución de peso corporal después 
de la administración del iniciador tumoral, pero a los 7 días presentaron un crecimiento 
normal, el cual se mantuvo a la par del grupo control hasta el final del estudio. Por otra parte, 
los grupos tratados con DEN+FeNTA sí mostraron una disminución en su crecimiento a lo 
largo del estudio y el EST no puede prevenir de este efecto. 
Días
-40 -20 0 20 40
P
es
o 
co
rp
or
al
 (g
)
50
100
150
200
250
300
350
400
C � n=4
EST � n=6
DEN � n=6
D+F � n=6 
E+D+F� n=6
 ADMINISTRACIÓN DE 
 DEN (200 mg/Kg)
INICIA LA ADMINISTRACIÓN
 DEL EST
INICIA LA ADMINISTRACIÓN 
 DE FeNTA 
 
 
 
 
Figura 12. Gráfico de crecimiento a lo largo del estudio. El tratamiento con DEN induce una 
disminución en el peso de los animales, sin embargo, se recuperan a los 7 días de su 
administración. Por otro lado el tratamiento con FeNTA retarda el crecimiento de los 
animales y el EST no puede prevenir este efecto 
34 
 
7.3 Observaciones macroscópicas de los de riñones 
Como puede observarse en la figura 13, no se presentaron diferencias en la apariencia 
macroscópica del riñón de los grupos EST y DEN con respecto al control. En cambio, el 
grupo D+F presentó alteraciones en la coloración del riñón e irritación medular, daño que no 
es prevenido por el EST en el grupo E+D+F. 
 
 
 
 
7.4 Evaluación de la función renal 
Con la finalidad de determinar si los tratamientos aplicados inducían alteraciones en la 
función renal, se analizaron los valores de nitrógeno ureico sanguíneo (BUN) a lo largo del 
estudio. En la figura 14 se observan los niveles de BUN determinados en todos los grupos a 
lo largo del estudio, estos resultados nos indican que con este esquema de tratamiento 
durante un mes no se inducen fallas en la función renal (figura 14). 
Figura 13. Fotogafías representativas de los riñones obtenidos el día del sacrificio. Se observa que 
los riñones de los grupos EST y DEN no muestran diferencias en la apariencia con respecto a los 
del grupo control. En cambio, los riñones obtenidos de los grupos D+F y E+D+F mostraron un 
daño evidente que se observa en la coloración de la corteza e irritación medular. 
35 
 
0
5
10
15
20
25
30
35
15 días después de EST
15 Días después de DEN
7 Días después de FeNTA 3mg/kg
7 Días después de FeNTA 5mg/kg
7 Días después de FeNTA 7mg/kg
Día del sacrificio
7 Días después de FeNTA 9mg/kg
 C EST DEN D+F E+D+F
B
U
N
 m
g/
dL
 
 
 
7.5 Marcadores de estrés oxidante. 
En este estudio, y como se muestra en la figura 15, en los tejidos tomados 48 horas después 
de la última administración de FeNTA no se encontró ninguna diferencia significativa en los 
niveles de los marcadores de estrés oxidante en ninguno de los grupos experimentales. 
 
 
Figura 15. Marcadores de estrés oxidante en la corteza renal. No existen diferencias significativas 
en los niveles de estos marcadores en los tejidos tomados 48h después de la última administración 
de FeNTA. H2O2: Peróxido de hidrógeno, C=O: Carbonilos, MDA: Malondialdehído. 
Figura14. Determinación de la función renal expresada como BUN durante el estudio. 
Ninguno de los grupos presentó fallas en la función renal a lo largo del estudio. 
36 
 
7.6 Niveles de expresión y fosforilación de c-Jun por Western Blot. 
 
Con la finalidad de investigar el efecto que tiene el tratamiento con DEN+FeNTA sobre los 
niveles de expresión y fosforilación de c-Jun se realizó un Western Blot para la detección 
de esta proteína. En la figura 16 se muestra que el tratamiento con DEN+FeNTA de 
manera subcrónica, induce notoriamente un incremento en los niveles de proteína (figura 
16) y fosforilación (figura 17) de c-Jun y que el EST no puede prevenir dicho efecto. 
 
 
C EST DEN D+F E+D+F
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
n=4 n=6 n=6 n=6n=6
 E+D+FD+FDEN
c-Jun 37 kDa
Tubulina 50 kDa
ESTControl
* *
El tratamiento DEN+FeNTA un incremento en los niveles de c-Jun
N
iv
el
es
 d
e 
c-
Ju
n
(U
D
R
/tu
bu
lin
a
vs
. C
on
tr
ol
)
 
 
 
   
 
Figura 16. (A) Western blot representativo para la detección en corteza renal de c-Jun, así 
como α-tubulina como patrón de carga. (B) Análisis densitométrico de las radiografías ajustado 
contra tubulina y con respecto al grupo control. Cada barra representa la media ± EE de n 
muestras. (*)Diferencia estadísticamente significativa con respecto al grupo control, EST y 
DEN (p<0.001). El tratamiento con DEN+FeNTA induce un incremento en los niveles de c-
Jun, el EST no puede proteger de dicho efecto. UDR: Unidades de densitometría relativa.
A 
B 
37 
 
C EST DEN D+F E+D+F
0
5
10
15
n=4 n=6 n=6 n=6n=6
 E+D+F D+FESTDEN
pc-Jun 37 kDa
Control
 Tubulina 50 kDa
* *
El tratamiento DEN+FeNTA induce un incremento en la fosforilación de c-Jun
N
iv
el
es
 d
e 
p-
c-
Ju
n
(U
D
R
/tu
bu
lin
a
 v
s.
 C
on
tr
ol
)
 
 
 
 
 
 
 
7.7 Translocación nuclear de c-Jun 
Una vez que la proteína c-Jun se encuentra activada es transportada al núcleo donde 
formará al complejo AP-1 y tendrá su actividad como factor transcripcional. Por otraparte, 
se sabe que si esta proteína no es requerida será degradada en el citosol. Por lo tanto, se 
realizó una separación de núcleos y se analizaron los niveles de c-Jun en las fracciones 
nuclear y citosólica. Los resultados obtenidos muestran que no existen alteraciones en los 
niveles de c-Jun en la fracción citosólica en ninguno de los grupos de estudio (figura 18 A y 
B), en cambio, el tratamiento con DEN+FeNTA sí induce su translocación al núcleo, efecto 
que no puede prevenirse por el EST (figura 18 C y D). 
 
 
 
 
    
Figura 17. (A) Western blot representativo para la detección en corteza renal de p-c-Jun (Ser 63), 
así como α-tubulina como patrón de carga. (B) Análisis densitométrico de las radiografías ajustado 
contra tubulina y con respecto al grupo control. Cada barra representa la media ± EE de n 
muestras. (*)Diferencia estadísticamente significativa con respecto al grupo control, EST y DEN 
(p<0.001). El tratamiento con DEN+FeNTA induce un incremento en los niveles de p-c-Jun, el 
EST no puede proteger de dicho efecto. UDR: Unidades de densitometría relativa. 
A 
B 
38 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
7.8 Actividad de AP-1 
Los resultados anteriores muestran que el tratamiento con DEN+FeNTA induce la expresión, 
fosforilación y translocación nuclear de c-Jun, sin embargo, no nos indican si la proteína está 
formando el complejo AP-1 activo y que por lo tanto pueda unirse a su secuencia consenso. 
Por esta razón, se decidió determinar si el tratamiento con DEN+FeNTA induce la actividad 
del factor de transcripción AP-1, para lo cual se realizó un EMSA usando la secuencia 
consenso de DNA específica para el complejo formado, cuando al menos uno de sus 
componentes es c-Jun. En la figura 19 se observa que el tratamiento con DEN+FeNTA 
efectivamente induce la actividad de AP-1 y que este efecto no puede prevenirse por el EST. 
C EST DEN D+F E+D+F
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
 n=3 n=3 n=4 n=4 n=4
E+D+FD+FDENControl EST
Tubulina 50 KDa
PCNA 38 KDa
c-Jun 37 KDa
N
iv
el
es
 d
e 
c-
Ju
n
(U
D
R
/tu
bu
lin
a
 v
s.
 c
on
tr
ol
)
Figura 18. (A) Western blot representativo para la detección en corteza renal de c-Jun en la 
fracción citosólica, así como α-tubulina como patrón de carga. (B) Análisis densitométrico de las 
radiografías de la detección de c-Jun en la fracción citosólica ajustado contra tubulina y con 
respecto al grupo control control. (C) Western blot representativo para la detección en la fracción 
nuclear de corteza renal, así como PCNA como patrón de carga. (B) Análisis densitométrico de las 
radiografías para la detección de c-Jun en la fracción nuclear ajustado contra PCNA y con respecto 
al grupo control control. Cada barra representa la media ± EE de n muestras. (*) Diferencia 
estadísticamente significativa con respecto al grupo control, EST y DEN (p<0.001). El 
tratamiento con DEN y FeNTA induce la translocación nuclear de c-Jun y el EST no puede 
prevenir dicho efecto. UDR: Unidades relativas de desnitometría, PCNA: antígeno de células en 
proliferación. 
A Citosol 
B 
C EST DEN D+F E+D+F
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
 n=3 n=3 n=4 n=4 n=4
 c-Jun 37 KDa
 PCNA 38 KDa
Control EST DEN D + F E+D+F
*
 Tubulina 50 KDa
*
N
iv
el
es
 d
e 
c-
Ju
n
(U
D
R
/P
C
N
A
vs
. c
on
tro
l)
C Núcleo 
D
39 
 
En los carriles 1-5 de la figura 19 se presentan los controles de la técnica utilizados para 
asegurar que la banda marcada se debe al retardo en la movilidad electroforética del oligo 
marcado unido a AP-1. En el carril 1 se presenta el oligo sin muestra, indicando la banda que 
se observa en los carriles con muestra es el retardo presentado por la unión del complejo a la 
secuencia de DNA; en el carril 2 se presenta la reacción del oligo marcado con un exceso de 
oligo sin marca (reacción de competencia), la ausencia de banda nos indica que AP-1 se une 
a la secuencia esté o no marcada; en el carril 3 se presenta el super retardo con el anticuerpo 
anti c-Jun, en el cual se observa que la banda del retardo desaparece, lo que nos confirma 
que el AP-1 detectado está formado por la oncoproteína c-Jun; en el carril 4 se presenta el 
super retardo con el anticuerpo anti p-c-Jun, en este experimento se observa que la banda 
del retardo desaparece, lo que nos indica que AP-1 está conformado preferentemente por un 
c-Jun activado por fosforilación y no por oxidación a su Cys-172; en el carril 5 se presenta la 
reacción de retardo en el cual se observa una sola banda que desaparece en los carriles 1, 2, 
3 y 4, confirmando que esa banda corresponde al retardo en la movilidad electroforética de la 
secuencia de DNA debido a la unión de AP-1. Cabe resaltar que en los carriles 2, 3, 4 y 5 se 
presenta el ensayo utilizando la misma muestra de fracción nuclear, con la finalidad de hacer 
comparativo el estudio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
40 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
7.9 Niveles de expresión de la ciclina D1. 
La ciclina D1 es una proteína de ciclo celular que regula la transición de G1/S y que 
alteraciones en su expresión han sido vinculados con la malignización celular en distintos 
tipos de cáncer. AP-1 es uno de los factores que pueden inducir la expresión de esta 
ciclina. Por este motivo, se determinó el efecto de los tratamientos sobre los niveles de esta 
Figura 19. (A) Imagen representativa del EMSA para AP-1. (1) Oligo sin muestra; (2) exceso de 
oligo frío (reacción de competencia); (3) muestra E+D+F + oligo + anticuerpo anti c-Jun (super 
retardo); (4) muestra E+D+F + oligo + anticuerpo anti pc-Jun (super retardo); (5) muestra E+D+F 
+ oligo. (B) Análisis densitométrico de las radiografías de los EMSA de AP-1. Cada barra 
representa la media ± EE de n muestras. (*) representa una diferencia estadísticamente 
significativa con respecto al control, EST y DEN (p<0.05). UDR: Unidades de densitometría 
relativa. El tratamiento con DEN+FeNTA induce un incremento en la actividad de AP-1 
conformado por un c-Jun activado por fosforilación (carril 3 y 4). El extracto no puede prevenir 
este efecto. 
A 
B 
41 
 
proteína. Los resultados muestran que el tratamiento con DEN+FeNTA induce un 
incremento en los niveles de la ciclina D1 y el EST no puede prevenir este efecto (figura 
20). 
C EST DEN D+F E+D+F
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
*
*
 E+D+F D+FDEN
Ciclina D1 37 kDa
Tubulina 50 kDa
Control EST
n=4 n=6 n=6 n=6 n=6
El tratamiento con DEN+FeNTA induce un incremento en los niveles de ciclina D1
N
iv
el
es
 d
e 
C
ic
lin
a 
D
1
(U
D
R
/tu
bu
lin
a
 v
s.
 c
on
tr
ol
)
 
 
 
 
 
 
 
7.10 Niveles de expresión y fosforilación de ERK 
ERK es una de las MAPKs vinculadas con la activación del factor de transcripción AP-1, 
por lo que se decidió analizar el efecto del tratamiento en su expresión. En la figura 21 se 
observa que la isoforma ERK 2 (p42) no presenta cambios significativos en la expresión 
debidos al tratamiento, en cambio, se puede observar que la expresión de la isoforma ERK 
1 (p44) se incrementa debido al tratamiento con DEN+FeNTA. Por otra parte, y como se 
muestra en la figura 22, el tratamiento con el carcinógeno induce un incremento en la 
fosforilación de ambas isoformas, aunque en una mayor proporción sobre la p44 que sobre 
p42 y el EST no es capaz de prevenir contra ninguno de los efectos antes mencionados. 
Figura 20. (A) Western blot representativo para la detección en corteza renal de ciclina D1, así 
como α-tubulina como patrón de carga. (B) Análisis densitométrico de las radiografías de la 
detección de ciclina D1 ajustados contra tubulina y con respecto al grupo control. Cada barra 
representa la media ± EE de n muestras. (*)Diferencia estadísticamente significativa con respecto