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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE CIENCIAS Análisis comparativo del efecto protector del extracto acuoso de caña de azúcar vs ácido ferúlico en C. elegans T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: BIÓLOGA P R E S E N T A : GLORIA ALINE COLONNELLO MONTERO DIRECTOR DE TESIS: DOCTOR ABEL SANTAMARÍA DEL ÁNGEL 2018 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. HOJA DE DATOS DEL JURADO 1. Datos del Alumno Colonnello Montero Gloria Aline 5516409686 Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Ciencias Biología 311665839 2. Datos del Tutor Dr. Abel Santamaría Del Ángel 3. Datos del Sinodal 1 Dr. Julio Eduardo Roque Morán Andrade 4. Datos del Sinodal 2 M. en C. Laura Silvia Salinas Velázquez 5. Datos del Sinodal 3Dra. Dra. Sonia Galván Arzate 6. Datos del Sinodal 4 Dra. Ana Laura Colín González 7. Datos del trabajo escrito Análisis comparativo del efecto protector del extracto acuoso de caña de azúcar vs ácido ferúlico en C. elegans 68 p 2018 DEDICATORIAS Dedico esta tesis a mis padres (Maricarmen y Mario), aunque prácticamente durante toda mi especialización en el área de las Neurociencias y el desarrollo de mi proyecto de tesis, nunca entendieron bien a bien en lo que consistía mi trabajo y proyecto de investigación hahahahaha, pues pensaban que consistía únicamente en estudiar al “gusanito” (como así lo llaman ustedes) como entidad biológica y no como un modelo de aplicación a la investigación en Neurociencias Toxicología, pero al final eso no importa porque gracias a ustedes y todas las oportunidades que me han brindado es que he sido capaz de llegar hasta este punto en mi vida y por ello estoy y siempre estaré inmensamente agradecida con ustedes por todo el apoyo durante mi carrera. Mamá, tú sabes que durante estos cuatro años y medio de carrera, desde presentar el examen de admisión a la UNAM, hasta la culminación de mi carrera con esta tesis, tú has sido mi más grande apoyo emocional, tú me has levantado cuando me siento fatal y frustrada por “x” o “y” razón, tú hablas conmigo y me haces ver las cosas de diferente modo, me haces ver que no es el fin del mundo, que siempre hay soluciones para todo y que con calma y paciencia todo se puede; no me tienes lástima, al contrario, me impulsas a seguir y no dejas que me ahogue en un vaso de agua. Quizá tú no estudiaste para los exámenes por mí o hiciste mis tareas, pero sinceramente sin todo tu apoyo en todo momento no hubiera llegado hasta este punto, al menos no de esta manera y por eso te agradezco infinitamente como hija y esta tesis tiene dedicatoria especial para ti. Te Amo! Papá, aunque no hablamos mucho de mis asuntos estudiantiles, de mil maneras me estuviste apoyando durante toda la carrera, el simple hecho de preguntarme de vez en cuando en la comida que tal estuvo mi día como voy con las materias, con las clases, que me falta hacer, como van mis calificaciones, cuáles son mis planes para futuro con eso fue suficiente para mí para saber que siempre estuviste ahí como apoyo y por eso te agradezco infinitamente! Ti voglio molto bene! Grazie per tutto! Dedico también esta tesis a mi abuela (Canela): Abuelita, no hay nada mejor que el amor incondicional de una abuela, desde que tengo memoria me has consentido como a nadie y hasta la fecha sigues siendo la mejor! Eres hermosa preciosa y maravillosa aunque digas que no! Y sin ti y tu hermosa presencia no hubiera podido llegar tan lejos, porque me haces feliz, tenerte con nosotros me hace muy feliz y eso me impulsa a hacer las cosas, me gustaba mucho hacer la tarea ahí contigo en tu cuarto, tu simple presencia hacía la tarea más amena. Por todo esto y más mil gracias!!!!!! Te amo mi chihuahueñita hermosa!!! I also dedicate this thesis to the love of my life: Jesse. Love I just met you 2 years ago, and you became one of the most important people to me, you became my inspiration, my strength, my energy to keep going day by day with my studies, with my frustrations, with my tiredness; you woke me up those difficult mornings at 6 am and only with hearing your voice you made my day better, you were there all the time giving me your unconditional support, impulsing me every day giving me the strength to endure the tiredness, the routine; you were very important part of my career, and also thanks to you I made it, I finished my career and this thesis. Thank you for everything, for your love and support. I love you very very much!!!!!! Finalmente dedico esta tesis a mis amigos: Gus, Aranxa, Diana, Yas y Ricardo, todos ustedes son geniales, hemos tenido una larga y hermosa amistad! Los quiero mucho a todos!!! AGREDECIMIENTOS Al Dr. Abel Santamaría Del Ángel, por ser excelente tutor, apoyarme incondicionalmente y confiar en mí. Muchas gracias por la confianza y permitirme participar en más de un proyecto de investigación, gracias por darme la oportunidad de ejercer como académico y guiar los proyectos de los nuevos chicos y de las chicas de la estancia de verano e instruirlos; gracias por la maravillosa oportunidad de experimentar lo que es la investigación y permitirme aprender por mí misma, muchas gracias por permitirme diseñar y desarrollar mi propio proyecto; pero sobretodo agradezco por todas las enseñanzas de vida profesional que tuve durante mi estancia en el laboratorio de Aminoácidos excitadores. A mis sinodales: Dr. Julio Eduardo Roque Morán Andrade M. en C. Laura Silvia Salinas Velázquez Dra. Sonia Galván Arzate Dra. Ana Laura Colín González Muchas gracias por todas sus valiosas observaciones y sabios consejos A la Dra. Sonia Galván Arzate por su apoyo, colaboración y guía durante este y otros proyectos, gracias por ser tan linda, amable y atenta conmigo A mis compañeros del Lab: Ilan, Gaby, Sol y Fer, con los cuales conviví 3 años durante toda mi estancia en el laboratorio y compartimos platicas random durante los seminarios. Ilan voy a extrañar nuestras pláticas raras durante los tratamientos con los gusanos y nuestras discusiones que muchas veces eran de cosas sin sentido o importancia hahaha A mis alumnos del Taller de Calcio y Estrés Oxidativo en Modelos de Daño Neuronal: Ester y Leo, chicos, son geniales! Son mis primeros alumnos de tesis y por eso ustedes siempre tendrán un lugar especial conmigo, gracias por hacer tan divertidas y amenas las sesiones de clases y prácticas, gracias por su confianza y entrega conmigo y gracias por permitirme enseñarles lo que se y gracias por ser tan buenos alumnos y hacer más fácil mi trabajo :P Agradezco infinitamente a la M. En C. Marisol Maya López, a mi primo el Dr. Daniel Montero y a mi amigo el M. en C. Arturo Verduzco Ramírez por revisar mi trabajo escrito y hacer observaciones sobre el mismo con la finalidad de presentar un mejor proyecto. A CONACYT por otorgarme la beca como ayudante deinvestigador del SNI y así brindarme el apoyo para realizar mis trabajos y proyectos durante mi estancia en el laboratorio. ÍNDICE RESUMEN 1-. ABREVIATURAS……………………………………………………………………………………1 2-. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………………………4 2.1-. Estrés oxidante………………………………………………………………………… 4 2.1.1-. Especies reactivas de oxígeno (ERO)…………………........................ 4 2.2-. Sulfato ferroso y la producción de ERO mediante la reacción de Fenton………. 5 2.3-. 6-Hidroxidopamina (6-OHDA)………………………………………………………... 6 2.3.1-. Mecanismo de toxicidad……………….…………………………………. 7 2.4-. Ácido quinolínico (QUIN)………… ………… ……………….……………………… 8 2.4.1-. QUIN y excitotoxicidad…………………………………………………… 9 2.5-. Vía Nrf2…………………………………………………………………………………. 11 2.6-. Antioxidantes como mecanismo de defensa para prevenir el EO…..……………. 13 2.7-. Caña de azúcar (Saccharum officinarum L.)……………………………………….. 14 2.7.1-. Propiedades terapéuticas y antioxidantes……………………………… 14 2.7.2-. Composición química…………………………………………………….. 15 2.8-. Ácido ferúlico (AF)……………………………………………..………………………. 18 2.8.1-. Biosíntesis del AF……………………………………..………………….. 20 2.8.2-. Efectos protectores……………………………….………………………. 22 2.9-. C. elegans como modelo…...……………………………………..………………….. 22 2.9.1-. Ciclo de vida de C. elegans……………………………………………… 25 2.9.2-. Sistema nervioso de C. elegans………………………………………… 27 2.9.3-. C. elegans y estrés oxidante…………………………………………….. 29 2.9.4-. Vía SKN-1…………………………………..……………………………… 30 3-. JUSTIFICACIÓN…………………………………………………………………………………… 33 4-. HIPÓTESIS………………………………………………………………………………...………. 33 5.1-. OBJETIVOS……………………………………………………………………………….……… 33 5.2-. Objetivos particulares………………………………………..………………………... 33 6-. MATERIALES Y METODOS…………………………………………………………..……......... 34 6.1-. Preparación del extracto acuoso de caña de azúcar (EACA)…………………….. 34 6.2-. FRAP: ensayo de actividad reductora…………………………….………………… 35 6.3-. Ensayo de polifenoles totales………………………….…………………………….. 35 6.4-. Medios de cultivo, mantenimiento y sincronización de C. elegans………………. 35 6.5-. Tratamientos protectores y tóxicos………………………………………………….. 36 6.6-. Ensayo de supervivencia con la cepa N2……………………………………….….. 37 6.7-. Ensayo de supervivencia con la cepa skn-1(ok2315)…………………..…………. 37 6.8-. Locomoción con la cepa N2………………………………………………………….. 37 6.9-. Reproducción con la cepa N2……………..………………………………………... 38 6.10-. Análisis estadístico…………………….…………………………………………….. 38 6.11-. Diagrama de Flujo……………………………………………………………………. 39 7-. RESULTADOS…………………………………………………………………………….............. 40 7.1-. El potencial reductor de hierro del AF y del EACA………………………………… 40 7.2-. Concentración total de polifenoles en el EACA…………………………………….. 41 7.3-. El efecto protector del EACA y del AF sobre la toxicidad inducida por QUIN, 6-OHDA o FeSO4 en las cepas N2 y skn-1(ok2315): supervivencia, tasa de locomoción, tasa de fertilidad…………………………………………………………………………….…..…….. 42 7.3.1-. El EACA y el AF aminoran el porcentaje de mortalidad en colonias de gusanos de la cepa N2 tratados con QUIN, 6-OHDA o FeSO4………………. 42 7.3.2-. El AF no mejora la supervivencia en ausencia de la vía SKN-1 en gusanos de la cepa skn-1(ok2315) tratados con QUIN, 6-OHDA o FeSO4………………………………………………………………………………. 44 7.3.3-. El EACA y el AF mejoran el movimiento en gusanos de la cepa N2 tratados con QUIN, 6-OHDA O FeSO4………………………………….………. 45 7.3.4-. El EACA y el AF no modifican en el proceso reproductivo en gusanos de la cepa N2 tratados con QUIN, 6-OHDA o FeSO4…………………………….. 47 8-. DISCUSIÓN……………………………………………………………………………………........ 49 9-. CONCLUSIONES………………………………………………………………………………….. 59 10-. PERSPECTIVAS…………………………………………………………………………………. 60 11-. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………………………. 61 ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS Figura 1…………………………………………………………………………………………………… 5 Figura 2……………………………………...................................................................................... 5 Figura 3………………………………………................................................................................... 6 Figura 4………………………………………................................................................................... 8 Figura 5………………………………………................................................................................... 9 Figura 6………………………………………................................................................................... 10 Figura 7…………………………………………............................................................................... 12 Tabla 1……………………………………………………………………………………………………. 15 Tabla 2……………………………………………………………………………………………………. 16 Tabla 3…………………………………………………………………………………………………… 16 Tabla 4……………………………………………………………………………………………………. 17 Tabla 5……………………………………………………………………………………………………. 17 Figura 8…………………………………………………………………………………………………… 18 Figura 9…………………………………………………………………………………………………… 19 Figura 10………………………………………………………………………………………………….. 21 Figura 11………………………………………………………………………………………………….. 23 Tabla 6……………………………………………………………………………………………………. 24 Figura 12………………………………………………………………………………………………….. 27 Figura 13………………………………………………………………………………………………….. 31 Figura 14………………………………………………………………………………………………….. 41 Figura 15………………………………………………………………………………………………….. 42 Figura 16………………………………………………………………………………………………….. 44 Figura 17………………………………………………………………………………………………….. 45 Figura 18………………………………………………………………………………………………….. 46 Figura 19………………………………………………………………………………………………….. 48 RESUMEN El estrés oxidante (EO) es una condición nociva para las células ocasionada por las especies reactivas del oxígeno (ERO). Por esta razón, se han desarrollado modelos neurotóxicos productores de ERO para inducir daño celular y muerte celular y así estudiar estos fenómenos. Algunas de las toxinas que producen daño en el Sistema nervioso central (SNC) son el ácido quinolínico (QUIN), el cual es un agonista de los receptores para N-metíl-D-aspartato (NMDAr) y generador de excitotoxicidad; la 6-hidroxidopamina (6-OHDA), que causa degeneración de neuronas dopaminérgicas (DA) e inhibe la cadena respiratoria mitocondrial; y el sulfato ferroso (FeSO4), que induce la formación selectiva del radical hidroxilo (•OH). La caña de azúcar actúa como un antioxidante ya que contiene flavonoides como el ácido ferúlico (AF), un compuesto dotado de una fuerte actividad citoprotectora debido a su capacidad de eliminar ERO. En el presente trabajo se evaluaron los efectos del extracto acuoso de caña de azúcar (EACA) y del AF en tres modelos neurotóxicos: 1) un modelo excitotóxico y pro-oxidante (QUIN, 100 mM); 2) un modelo de degeneración dopaminérgica y pro-oxidante (6-OHDA, 25 mM); y 3) un modelo exclusivamente pro-oxidante (FeSO4, 15 mM). Después de exponer a los nematodos a los agentes protectores AF o EACA se expuso a los organismos al insulto tóxico (QUIN, 6-OHDA o FeSO4) y 24, 48 o 72 horas después de la exposición, se evaluaron parámetros como la supervivencia en las cepas N2 y skn-1(ok2315), la locomoción y la reproducción en la cepa N2. Los resultados evidencian que los nematodos tratados con EACA o AF y expuestos a toxinas mostraron un aumento en la supervivencia en comparación con los tratados con QUIN, 6- OHDA y FeSO4. La locomoción fue mejorada en todos los modelos tóxicos por el EACA y el AF. Los nematodos tratados con FeSO4 y pretratados con EACA y aquellos tratados con 6-OHDA o QUIN y pretratados con AF mostraron mejoría en los marcadores tóxicos; sin embargo, el AF no mostró potencial protector en los gusanos de la cepa mutante skn-1(ok2315), la cual carece de la vía antioxidante SKN-1 en C. elegans (homóloga a la vía Nrf2 en mamíferos), pues en todos los casos no hubo ningún aumento en la supervivencia. El AF y el EACA ejercieron efectos protectores en la cepa silvestre, posiblemente relacionados con la actividad antioxidante contra la 6-OHDA, el QUIN y el FeSO4. Estosefectos se evidenciaron a través de parámetros de supervivencia y locomoción. Es posible que el AF no tuviera efectos protectores en la cepa carente de la vía SKN- 1 debido a que dicho compuesto requiere la presencia de la vía para ejercer su potencial protector. Estos efectos antioxidantes sugieren que el diseño de terapias antioxidantes contra la degeneración neuronal es una estrategia potencialmente viable en la biomedicina. 1 1-. ABREVIATURAS 2,4,6-Tri (2-piridil) -s-triazina............................................................………….…….. TPTZ 3, 3’5,5’-tetrametilbenzidina……………………………………………….....................TMB 6-Hidroxidopamina……………………………………………………………................ 6-OHDA Acetilcolina………………………………………………………………….......... ACh Ácido 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoico…........................................................................ DTNB Ácido γ-aminobutírico………………………………………………….…………........... GABA Ácido clorhídrico………………………………………………..………….…………...... HCl Ácido desoxiribonucleico………….………….………….………….………….……….. ADN Ácido ferúlico……………………………………………………………….…………….. AF Ácido quinolínico……………………………….………….………….………………….. QUIN Adenosín trifosfato………………………………………..………….…………………... ATP Aminoácidos excitadores…………………………………………….………………….. AAEs Caenorhabditis elegans………………………………………..………….…………….. C. elegans Catalasa…………………………………………………………..………….……………. CAT Cierre de leucinas…………………………………….………….………….…………… bZIP Citocromo P450……………………………………………………….………………….. CYP Cloruro de calcio……………………………………..………….………….……………. CaCl2 Cloruro férrico………………………………………………………………….…………. FeCl3 Cloruro de sodio…………………………………………………………….……………. NaCl Deshidrogenasas de cadena corta……………………………………………………... SDHs Doble enlace de carbono………………………………………………………………... C-C Enfermedad de Huntington…………………………………...………….………………EH Enfermedad de Parkinson………………………………………….…………………… EP Error estándar………………………………………………………….…………………. ES Escherichia coli.…………………………… ……………………………….…………… E. coli Especies reactivas de nitrógeno……………………………………….……………….. ERN Especies reactivas de oxígeno……………………………...………….………………. ERO Estrés nitrosativo………………………………………………………….……………… EN Estrés oxidante……………………………………………………….…………………... EO 2 Extracto acuoso…………………………………………………………………………... EA Extracto acuoso de caña de azúcar..........................................................…………. EACA Factor de crecimiento similar a la insulina……………………………………............. IGF Factor de crecimiento transformante-β………………………………………………… TGF-β Factor nuclear (derivado de eritroide 2)……………… ………………………………. Nrf2 Ferulato de sodio......................................................................................................FS Fosfato de potasio dibásico......................................................................................K2HPO4 Fosfato de potasio monobásico............................................................................... KH2PO4 Fosfato de sodio....................................................................................................... Na2PO4 Glucógeno sintasa quinasa 3β…………………………………………....................... GSK3β Glucuronosil............................................................................................................. UDP Glucuronosil/glucosil transferasas……………………………………………………… UGT Glutamato…………………………………………………………………………………. Glu Glutatión…………………………………………………………………………………… GSH Glutatión - S – transferasa……………………………………..................................... GST Hemo-oxigenasa 1……………………………………………………………………….. HO-1 Hemo-oxigenasa / biliverdina reductasa………………………………………………. HO / BVR Hidróxido de sodio....................................................................................................NaOH Hipoclorito de sodio.................................................................................................. NaClO Ion calcio……………………………………………………………….………………….. Ca2+ Ion hidrógeno........................................................................................................... H+ Ion hierro………………………………………………………………………………….. Fe2+ Ion hierro oxidado………………………………………………………………………… Fe3+ Monoamino oxidasa……………………………………………………………………… MAO N-metíl-D-aspartato………………………………………………………………………. NMDA Neuronas dopaminérgicas………………………………………………………………. DA Oxígeno atómico………………………………………………………........................... O Oxígeno molecular……………………………………………………………………….. O2 Oxígeno en singulete…………………………………………………........................... 1O2 Paraquat…………………………………………………………………………………… PQ Peroxidasa de glutatión……………………………………………............................... GPx 3 Peróxido de hidrógeno…………………………………………………………………… H2O2 Peroxinitrito…………………………………………………………............................... ONOO- Proteína chaperona de choque térmico………………………………..……………… Hsp70 Proteína Huntingtina…………………………………………………………………….. HTT Radical hidroxilo………………………………………………………………………….. •OH Radical peroxilo…………………………………………………………………………... ROO• Radical superóxido………………………………………………….............................. O2 -• Receptor hormonal nuclear……………………………………………………………… NR Receptores ionotrópicos de glutamato………………………………………………… iGluRs Receptores a NMDA................................................................................................ NMDAr S-alilcisteína……………………………………………………..................................... SAC S-alilmercaptocisteína……………………………………………................................. SAMC Sistema Nervioso Central………………………………………………........................ SNC Sulfato ferroso…………………………………………………………........................... FeSO4 Sulfato de magnesio………………………………………………………..................... MgSO4 Superóxido dismutasa…………………………………………………………............... SOD Tacrina 2-ácido ferúlico……………………………………………………….................T2FA Tetrahidropiridina…………………………………………………………...................... MPTP Vía de señalización de insulina…………………………………………………………. ILS 4 2-. INTRODUCCIÓN 2.1. Estrés oxidante El estrés oxidante (EO) y el estrés nitrosativo (EN) desempeñan un papel determinante en el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas, ya que no solo son responsables de alterar la estructura y la función de diversas biomoléculas, sino que también son las causantes de producir radicales libres y especies reactivas de oxígeno (ERO), así como también especies reactivas de nitrógeno (ERN), que a su vez sirven como mediadores potenciales de activación de cascadas de señalización que llevan a la muerte neuronal en condiciones patológicas (Robledo-Arratia, 2010). El EO se refiere a una condición nociva para las células que es ocasionado por ERO/ERN generados como productos del metabolismo celular; se refiere también al desbalance entre los procesos bioquímicos que permiten la producción excesiva de ERO y las moléculas responsables de la remoción de los mismos: los sistemas de defensa antioxidante (Coyle & Puttfarcken, 1993). 2.1.1. Especies reactivas de oxígeno (ERO) La mayor parte del oxígeno celular es reducido a través de reacciones enzimáticas, sin embargo entre 2-5% escapa a esta reducción y esto resulta en la formación de ERO. Se consideran ERO al oxígeno atómico (O), al oxígeno molecular (O2), al oxígeno singulete (1O2), al radical superóxido (O2 -•), al peróxido de hidrógeno (H2O2), al radical peroxilo (ROO•), al peroxinitrito (ONOO-) y al radical hidroxilo (•OH). Las ERO no siempre son tóxicas, pues su toxicidad depende de su concentración y del ambiente en que se produzcan (Könisberg, 2008). El radical •OH se genera por el rompimiento del H2O2 mediante la reacción de Fenton. Este radical tiene una alta reactividad, siendo así muy nocivo y con una vida media promedio muy corta in vivo, por lo que cuando se produce, reacciona cerca de su sitio de formación. La producción de este 5 radical está ligada a condiciones deestrés, ya que un exceso de O2 -• lleva a una liberación de hierro oxidado a partir de moléculas que contengan al metal (Elinos-Calderón, 2009). 2.2. Sulfato ferroso y producción de ERO mediante la reacción de Fenton Durante la reacción de Fenton, el hierro (Fe2+) del sulfato ferroso (FeSO4) (Figura 1) es oxidado por el H2O2 a hierro oxidado (Fe3+), formando un •OH y un ion hidroxilo (Figura 2). El •OH generado en esta reacción puede oxidar al 3,3’5,5’-tetrametilbenzidina (TMB) para producir una coloración azul que indica que ésta ha sido llevada a cabo (Lai et al., 2016). Figura 1. Estructura química de FeSO4. Tomado de Fuentes-Bello, 2011. El H2O2 reacciona con sales metálicas de Fe2+ para generar •OH, una especie reactiva con gran potencial oxidativo. Estos radicales son capaces de oxidar gran cantidad de compuestos orgánicos de forma no selectiva y con altas velocidades de reacción. Después de que el Fe2+ descompone al H2O2, los •OH siguen reaccionando con el Fe2+, hasta que éste se convierte totalmente a Fe3+ (Salas, 2010). Figura 2. Reacción de Fenton. Tomado de Fuentes-Bello, 2011. Este proceso induce la formación de ERO, aunque mayoritariamente esta molécula induce la producción del •OH, el cual es considerado como uno de los más tóxicos a nivel celular (Fuentes- Bello, 2011). 6 2.3. 6-Hidroxidopamina (6-OHDA) La neurotoxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA) (Figura 3) es comúnmente utilizada como modelo de la enfermedad de Parkinson (EP). La neuropatología de la EP se caracteriza por una pérdida neuronal selectiva asociada con la acumulación y agregación de alfa-sinucleína en cuerpos de Lewy en neuronas de regiones cerebrales específicas, incluyendo el tronco encefálico y la región cortical (Deng et al., 2018). La EP se asocia con la muerte celular progresiva de las neuronas dopaminérgicas (DA) selectivamente vulnerables del mesencéfalo lo que produce un deterioro permanente del control motor y rigidez muscular; esta neurodegeneración se relaciona también con disfunciones celulares aparentemente dispares que incluyen la acumulación de nucleófilos reactivos, alteraciones en la dopamina, tráfico vesicular anormal y homeostasis de ciertas proteínas alterada (Martinez et al., 2017). A la fecha, se ha establecido que si bien el modelo neurodegenerativo inducido por la 6-OHDA no reproduce la totalidad de síntomas de la enfermedad, sí replica mecanismos celulares de daño tales como el EO, la neurodegeneración, la neuroinflamación y la muerte neuronal por apoptosis (Hernández-Baltazar, 2015). La 6-OHDA produce una destrucción selectiva de neuronas catecolaminérgicas. Esta especificidad es debida a su alta afinidad por el sistema de transporte de catecolaminas (Luquin, 1998). Figura 3. Estructura química de la 6-OHDA. Tomado de Luquin, 1998. 7 2.3.1. Mecanismo de toxicidad de la 6-OHDA La 6-OHDA es una molécula que utiliza el mismo sistema de transporte que la dopamina para llegar al dominio intracelular y producir la degeneración específica en las DA (Silva-Adaya, 2010). La inyección intracerebral de 6-OHDA en ratas causa degeneración de la vía dopaminérgica con una dramática pérdida de dopamina en el estriado, así como también la pérdida de la inmunoreactividad a la tirosina hidroxilasa, la cual es la principal enzima involucrada en la síntesis de dopamina (Silva-Adaya, 2010). Mediante la inhibición del Complejo I mitocondrial (NADH deshidrogenasa) por diferentes toxinas mitocondriales, se detiene el flujo de protones hacia los otros complejos mitocondriales y es entonces cuando se detiene la producción de energía en forma de adenosina trifosfato (ATP) (Silva-Adaya, 2010). Este modelo induce la disfunción mitocondrial derivada del déficit en la producción de ATP y por lo tanto genera neurotoxicidad en los sistemas biológicos (Luquin, 1998) (Figura 4). Aunque existen estudios que demuestran que la 6-OHDA posee una potente acción inhibidora de la cadena respiratoria mitocondrial conocida como NADH deshidrogenasa, se sabe que la muerte neuronal de DA inducida por 6-OHDA está ligada fundamentalmente a la formación de H2O2, radicales libres tipo •OH, ortoquinonas y quinonas que se producen en su degradación (Figura 4). Así, sustancias antioxidantes y captadoras de radicales libres tales como la vitamina E o la N- acetil-cisteína, inhibidores de la monoamino oxidasa (MAO) y quelantes de hierro como la desferroxamina, protegen a las DA de la acción neurotóxica de la 6-OHDA (Luquin, 1998). El metabolismo de la 6-OHDA genera una serie de ERO y ERN a pH fisiológico, incluyendo H2O2, para-quinonas, ortoquinonas, quinonas y radicales O2-• y •OH. El papel de estas especies oxidantes en la toxicidad de la 6-OHDA y sus sitios de acción intracelulares permanecen poco 8 claros, sin embargo, se sabe que el efecto tóxico de la 6-OHDA puede ser bloqueado por antioxidantes los cuales previenen secuelas tóxicas y muerte celular (Tobón-Velasco et al., 2012). Figura 4. Mecanismo de toxicidad de la 6-OHDA. Modificado de Silva-Adaya, 2010. 2.4. Ácido quinolínico (QUIN) El ácido quinolínico (QUIN o ácido 2,3-piridín dicarboxílico) (Figura 5) es un metabolito endógeno de la degradación del triptófano presente en la vía de la kinurenina y también es una excitotoxina que actúa como agonista en los receptores para N-metil-D-aspartato (NMDAr) (Pérez-Severiano et al., 2004). El QUIN es un ácido débil (pKa= 0.29) y agonista competitivo de los NMDAr, los cuales contienen subunidades NR1, NR2A y NR2B, con baja afinidad receptora (Fuentes-Bello, 2011). 9 El QUIN evoca un patrón de degeneración neuronal y cambios neuroquímicos en el tejido nervioso de los mamíferos similares al daño neuronal observado en los cerebros de pacientes con la enfermedad de Huntington (EH) (Pérez-Severiano et al., 2004). La EH es una enfermedad neurodegenerativa autosómica causada por la expansión de la repetición del triplete CAG en el exón 1 del gen de la Huntingtina; esta mutación genera un tracto de poliglutamina expandido en la proteína Huntingtina (HTT) y da como resultado una forma mutante de la HTT que interrumpe múltiples funciones celulares. Patológicamente, la EH se caracteriza por una muerte neuronal profunda en el estriado y otras regiones cerebrales, lo que causa descontrol de movimientos (coreas), anomalías del comportamiento y deterioro cognitivo (Child et al., 2018). Figura 5. Estructura química de QUIN. Tomado de Fuentes-Bello, 2011. 2.4.1. QUIN y excitotoxicidad El glutamato (Glu) es el principal neurotransmisor excitador en el SNC (Rueda et al., 2016), se encuentra en la mayoría de las sinapsis químicas del cerebro (aproximadamente en el 50%) y en la médula espinal a concentraciones milimolares. Esta molécula excita a la mayoría de las neuronas centrales, pero una sobre-exposición al mismo puede ser letal para las neuronas tanto in vivo como in vitro (Burd et al., 2016). La hipótesis de la excitotoxicidad por acción del Glu comprende tres supuestos: 1) la despolarización de la neurona produciendo la liberación de aminoácidos excitadores (AAEs); 2) la presencia de un receptor para AAEs común en el botón post-sináptico, regulando la excitación y 10 la toxicidad; y 3) la propagación de la cadena de eventos de excitación, generando disfunción neuronal y muerte celular (Pérez-Carrera, 2010) (Figura 6). Figura 6. Mecanismo de excitotoxicidad de QUIN. Modificado de Zeng et al., 2015. La excitotoxicidad producida por la estimulación sostenida de los NMDAr por QUIN se relaciona directamente con el incremento de las concentraciones de Ca2+ citosólico, el agotamiento del ATP y del ácido γ-aminobutírico (GABA), así como en la muerte de neuronas colinérgicas y el daño celular oxidativo (Pérez-Severiano et al., 2004). La razón por la cual el QUIN genera estos efectos sobre elSNC se debe a que provoca una sostenida estimulación de los NMDAr, lo que incrementa notablemente la permeabilidad al Ca2+, disminuye la formación de energía en forma de ATP, 11 produce ERO/ERN y finalmente conduce a la muerte celular por apoptosis o necrosis (Pérez- Carrera, 2010) (Figura 6). 2.5. Vía Nrf2 La Vía Nrf2 [Factor nuclear (derivado de eritroide 2)] es un factor de transcripción perteneciente a la familia de proteínas Nrf. El grupo de las Nrf2, pertenece a un conjunto de proteínas con un cierre de leucinas (bZIP) ubicado en la región C-terminal del péptido. La región río arriba de este bZIP es el responsable de unirse al ADN. (Königsberg, 2007). Este grupo de proteínas realiza una gran variedad de funciones de mantenimiento y protección celular. (Blackwell, et al., 2015). El Nrf2 se expresa de manera integrativa en la mayoría de las células, de tal forma que su actividad está continuamente regulada, pues no se encuentra libre y activo en cualquier momento, ya que dichas proteínas se activan únicamente en condiciones de EO (Königsberg, 2007). El Nrf2 es mejor conocido como el regulador de la defensa antioxidante, pero recientemente se ha implicado en mecanismos que incluyen la proteostasis y la regulación metabólica. El Nrf2 se encuentra constitutivamente reprimido debido a su unión con la proteína citoplásmica Keap1, y al citoesqueleto. Mediante la unión de este factor de transcripción a una secuencia específica del ADN conocida como ARE (por sus siglas en inglés "Antioxidant Response Element"), la cual se puede activar por diversos compuestos oxidantes tales como el •OH, se activa una serie se señales que dan como respuesta la activación de enzimas antioxidantes (Königsberg, 2007). 12 Figura 7. Vía Nrf2. Tomado de Königsberg, 2007. Estudios previos han comprobado que no únicamente la interacción de Keap1 (por medio del dominio Kelch) con Nrf2 (vía Neh2) es suficiente para mantener al Nrf2 en el citosol. Se ha reportado también que Keap1 se une al mismo tiempo con el citoesqueleto. Se ha visto que Keap1 está como un homodímero y es así como se une a Nrf2, a través de dos sitios de reconocimiento con distinta afinidad en el dominio Neh2. (Königsberg, 2007) (Figura 7). La presencia de ERO oxida los sulfhidrilos de las cisteínas en el dominio IVR de Keap1, promoviendo la disociación del complejo Nrf2-Keap1. Los oxidantes también inducen la fosforilación del residuo de serina 40 del Nrf2 y dichos eventos finalizan en la translocación de Nrf2 hacia el núcleo. (Königsberg, 2007) (Figura 7). 13 2.6. Antioxidantes como mecanismo de defensa para prevenir el EO La oxidación es una reacción química que puede producir radicales libres, lo que conlleva a reacciones en cadena que pueden dañar a las células (Percival, 1998). Una paradoja en el metabolismo es que, aunque la gran mayoría de la vida compleja en la Tierra requiere oxígeno para su existencia, el oxígeno es una molécula altamente reactiva que daña a los sistemas al producir ERO; en consecuencia, los organismos poseen una red compleja de metabolitos y enzimas antioxidantes que trabajan en conjunto para prevenir el daño oxidativo de componentes celulares tales como el ácido desoxirribonucleico (ADN), las proteínas y los lípidos (Sies, 1997; Vertuani et al., 2004). Los antioxidantes son el principal mecanismo de defensa contra el daño provocado por los radicales libres y son esenciales para mantener en equilibrio la homeostasis celular (Percival, 1998). Los antioxidantes son moléculas que inhiben la oxidación de otras moléculas principalmente proteínas, lípidos y ADN (Sies, 1997). Los antioxidantes se clasifican en dos grandes divisiones, dependiendo de si son solubles en agua (hidrofílicos) o en lípidos (lipofílicos); en general, los antioxidantes solubles en agua reaccionan con los oxidantes en el citosol celular y el plasma sanguíneo, mientras que los antioxidantes solubles en lípidos protegen las membranas celulares de la peroxidación de los lípidos (Sies, 1997; Vertuani et al., 2004). La importancia y las interacciones entre los diferentes antioxidantes es una cuestión muy compleja, ya que los diversos metabolitos y sistemas enzimáticos pueden tener efectos sinérgicos e interdependientes entre sí, por lo tanto la acción de un antioxidante puede depender de la función de otros antioxidantes. La mayoría de los antioxidantes actúan como agentes reductores y pueden ser reversiblemente oxidados y reducidos debido a que en su estructura química poseen gran cantidad de átomos de hidrógeno lo que les otorga la capacidad de reducir gran cantidad de ERO (Vertuani et al., 2004). 14 2.7. Caña de azúcar (Saccharum officinarum L.) Saccharum officinarum L., mejor conocida como caña de azúcar, pertenece a la familia Poaceae, es una planta es originaria de Asia pero se ha adaptado muy bien a climas tropicales y subtropicales en todo el mundo. Brasil es el mayor productor de caña de azúcar en el mundo seguido por China, India, Tailandia y Australia (Freitas-Andrade & Colodette, 2013). Es una hierba perenne cuyo sistema radicular está compuesto de raíces adventicias y permanentes. Sus tallos cilíndricos pueden alcanzar hasta 6 m de altura y 6 cm de diámetro; son más o menos erectos, arqueados en la base, nudosos y ligeramente más gruesos en los entrenudos, siempre prominentes, pero irregularmente espaciados, en colores amarillo, verde, rojo oscuro o violeta en color (dependiendo de la variedad). Las hojas son alternas, opuestas, distintas, planas, lineales, agudas en el ápice hasta 140 cm de largo y 6 cm de ancho, serradas y ásperas. La inflorescencia de la caña de azúcar es una panícula ramificada, conoidal, con un tronco principal, llamado raquis, que es la continuación del entrenudo anterior. Finalmente, los frutos son secos y cada uno de ellos contiene una sola semilla (Gamberini et al., 2014). 2.7.1. Propiedades terapéuticas y antioxidantes Saccharum officinarum L., es conocida en la medicina popular por sus múltiples propiedades terapéuticas. Se ha reportado que actúa como antídoto, antiséptico, antioxidante, antiviral, bactericida, cardiotónico, diurético y laxante, entre otros. Es un remedio tradicional para la artritis, úlceras, cáncer, resfriados, control de diarreas, disentería, inflamaciones, llagas en la piel, tumores benignos así como para tratar heridas debido a sus propiedades antisépticas, e incluso en el tratamiento de algunas infecciones de transmisión sexual tales como la gonorrea (Gamberini et al., 2014, Abbas et al., 2014). En consecuencia, los antioxidantes abundantes en la comida han recibido gran atención y han sido estudiados extensivamente, pues se ha observado que dichas 15 moléculas son capaces de reducir el riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares y prevenir algunos tipos de cáncer (Abbas et al., 2014). 2.7.2. Composición química En relación a la composición química de la caña de azúcar (médula y fibras), la pulpa o bagazo consiste aproximadamente de un 40% a un 50% de celulosa, de un 20% a un 30% de hemicelulosa y de un 18% a un 25% de lignina. La xilosa es el principal carbohidrato encontrado en la fracción de hemicelulosa, ya que representa aproximadamente el 80% de ésta (Freitas-Andrade & Colodette, 2013) (Tabla 1). Los contenidos de los componentes estructurales de la pared celular (celulosa, hemicelulosa y lignina) en la médula, fibras y el bagazo entero varían significativamente, puesto que en la médula se observan altas concentraciones de lignina y bajas de xilosa y glucanos en comparación con las fibras (Freitas-Andrade & Colodette, 2013). Análisis % Bagazo entero Médula Bagazo sin médula Lignina Klason 21.3 23.2 20.2 Lignina soluble en ácido 1.2 1.0 1.4 Lignina total 22.5 24.2 21.6 Lignina H: G: S 1.0:1.9:1.9 1.0:1.6:1.8 1.0:2.1:2.0 Glucanos41.6 37.8 43.4 Xilanos 18.9 12.4 22.1 Galactanos 0.5 0.6 0.5 Mananos 0.0 0.0 0.0 Arabinanos 1.2 0.9 1.4 Ácidos urónicos 1.0 0.9 1.0 Acetilo 1.9 0.5 2.6 Azúcares totales 65.0 52.9 71.1 Ceniza 4.0 9.5 1.3 Sílice 2.7 7.5 0.4 Extractivos 8.5 13.4 6.1 Totalidad % 100 100 100 Tabla 1. Composición química del bagazo entero, fibras y médula de la caña de azúcar. Modificado de Freitas-Andrade & Colodette, 2013. 16 La composición química general del jugo de caña de azúcar se caracteriza por presentar a la sacarosa como el componente más importante y abundante, ya que comprende del 76.55% al 89.48%, seguida por los azúcares reductores que componen de un 3.69% a un 10.5% (Tabla 2), los componentes minerales de 0.3% a 3.6% los cuales incluyen principalmente potasio, cloro y calcio (Tabla 3), proteínas entre 0.37% al 1.7% y finalmente grasas entre 0% y 0.01%. No se encuentra la presencia de fibra (Jaffè, 2015) (Tabla 2). En el jugo de caña de azúcar se ha identificado la presencia de vitamina A, ácido fólico, tiamina, riboflavina, niacina, beta caroteno, vitamina B5, B6, C, D y E, sin embargo hasta el momento no hay reportes que indiquen la presencia de vitaminas B12 y K (Jaffè, 2015) (Tabla 4). El jugo de la caña de azúcar, en especial el extracto de la misma llamado también jugo, posee flavonoides como la apigenina, la luteolina y los derivados de la tricina. Posee también ácidos fenólicos tales como el gálico, clorogénico y ferúlico lo que representa un contenido total de alrededor de 160 mg/L (Abbas et al., 2014) (Tabla 5). Componente % Media DE Mediana Rango Min Rango Max Carbohidratos 91.28 4.54 91.20 83.90 97.20 Azúcares totales 92.08 3.22 92.45 87.50 95.40 Sacarosa 84.49 5.83 85.96 76.55 89.48 Azúcares reductores 7.33 2.81 7.57 3.69 10.50 Fibra 0.00 0.00 0.00 Proteína 0.64 0.42 0.60 0.37 1.70 Grasas 0.13 0.19 0.10 0.00 0.10 Humedad 5.00 3.92 3.40 1.50 15.80 Ceniza 1.47 0.89 1.35 0.30 3.60 Tabla 2. Composición química general del jugo de caña de azúcar. Modificado de Jaffè, 2015. Minerales: Mineral Cantidad Media DE Mediana Rango Min Rango Max x 100 g Calcio mg 102.62 76.00 92.00 13.70 240.00 Cloro mg 125.48 127.16 123.30 5.30 250.00 Cobalto µg 9.90 9.90 9.90 9.90 17 Cobre mg 1.47 2.85 0.52 0.17 8.50 Cromo µg 13.95 2.90 13.95 11.90 16.00 Yodo µg 0.01 0.01 0.01 0.01 Hierro mg 4.98 3.48 4.30 1.60 12.50 Magnesio mg 65.51 30.02 56.50 31.00 120.00 Manganeso mg 0.80 0.54 0.50 0.35 1.66 Fósforo mg 57.54 35.43 72.00 2.00 125.00 Potasio mg 531.26 370.33 479.50 14.05 1100.00 Selenio µg Tr 0.00 0.00 Sodio mg 37.31 20.48 30.88 15.50 79.00 Zinc mg 0.61 0.52 0.49 0.10 1.76 Tabla 3. Minerales presentes en el jugo de caña de azúcar. Modificado de Jaffè, 2015 Vitaminas: Vitamina Cantidad Media DE Mediana Rango Min Rango Max x 100 g A mg 1.90 2.69 1.90 0.00 3.8 Beta caroteno µg 80.75 114.20 80.75 0.00 161.5 B1 (Tiamina) mg 0.03 0.02 0.02 0.01 0.05 B2 (Riboflavina) mg 0.07 0.03 0.07 0.04 0.11 B3 (Niacina) mg 2.14 2.83 0.63 0.08 7.00 B5 (Ácido Pantoténico) mg 0.70 0.97 0.70 0.01 1.38 B6 (Piridoxina) mg 0.21 0.30 0.04 0.01 0.72 B9 (Ácido Fólico) µg 3.33 5.77 0.00 0.00 10.00 B12 (Cobalamina) µg 0.00 0.00 C mg 4.23 6.41 2.00 0.00 17.6 D2 mg 2.17 3.75 0.00 0.00 6.5 E mg 55.65 55.65 0.00 55.65 K µg 0.00 0.00 Tabla 4. Vitaminas presentes en el jugo de caña de azúcar. Modificado de Jaffè, 2015. Fenoles: Nombre Flavonoides agliconos 3-Hidroxi-1-(4-hidroxi-3.5-dimetroxifenil)-1-propanol Ácido 4-Hidroxifenilacético Ácido benzoico Ácido clorogénico Alcohol coniferílico Ácido ferúlico Ácido gálico Ácido gentísico 18 Ácido p-cumárico Ácido p-hidroxi benzoico Ácido protocatecuico Alcohol sinapílico Siringaresinol Ácido siríngico Ácido vanílico Tabla 5. Flavonoides presentes en el jugo de caña de azúcar. Modificado de Jaffè, 2015. 2.8. Ácido Ferúlico (AF) Uno de los compuestos que le confiere propiedades antioxidantes a la caña de azúcar es el ácido ferúlico (AF) (Kumar & Pruthi, 2014). El AF [Ácido 4-hidroxi-3-metoxicinámico] (Figura 8) es un derivado del ácido caféico encontrado en una amplia gama de vegetales, frutas y algunas bebidas tales como el café y la cerveza (Mancuso & Santangelo, 2013). Figura 8. Estructura química del ácido ferúlico. Tomado de Vargas-Álvarez, 2013. El extracto de pulpa de caña de azúcar, según Kumar & Pruthi, 2014, contiene 8000 mg/kg de AF en su composición química, además de ser el compuesto fenólico mayoritario en la caña de azúcar (Abbas et al., 2014) (Figura 9). 19 Figura 9. Perfil fenólico por HPLC de la infusión de Saccharum officinarum. Ácido gálico (pico 1), catequina (pico 2), ácido clorogénico (pico 3), ácido cafeico (pico 4), ácido férulico (pico 5), epicatequina (pico 6), ácido elágico (pico 7), ácido cumárico (pico8), rutina (pico 9), quercitrina (pico 10), isoquercitrina (pico 11) y quercetina (pico12) * mAU= unidad de absorción mili. Tomado de Abbas et al., 2014. Este compuesto fue aislado por primera vez a partir de la planta Ferula foetida, por lo que el nombre de este compuesto se basó en el nombre botánico de esta planta (Kumar & Pruthi, 2014). Está principalmente conjugado con mono- y oligosacáridos, poliaminas, lípidos y polisacáridos y rara vez se presenta en un estado libre en las plantas. El AF es insoluble en agua, pero el ferulato de sodio (FS) es soluble en agua, estable y puede prepararse mediante síntesis química; también es soluble casi en cualquier medio básico, pues al ser un compuesto ácido, requiere un medio con baja concentración de iones hidrógeno (H+) (Yu et al., 2005). El AF fue propuesto como un compuesto antioxidante dotado con una fuerte actividad citoprotectora debido a su habilidad de eliminar radicales libres y activar las respuestas de estrés de las células (Mancuso & Santangelo, 2013). Los efectos citoprotectores del AF pueden ser atribuibles a la regulación de las vías implicadas en muerte celular y en la regulación de genes/proteínas que son capaces de mejorar la respuesta de la célula al estrés, es decir, mejorar la respuesta del sistema antioxidante endógeno (Mancuso & Santangelo, 2013). 20 El AF es un compuesto fenólico originado a partir del metabolismo de la fenilalanina y la tirosina y se presenta en mayor concentración en semillas, hojas y tallos, tanto en su forma libre como unido covalentemente a la lignina y a otros biopolímeros (Vargas-Álvarez, 2013). Este compuesto presenta dos formas isoméricas: cis y trans (Kumar & Pruthi, 2014). 2.8.1. Biosíntesis del AF En cuanto a la biosíntesis del AF, su formación en las plantas ocurre a través de la ruta metabólica de la vía del shikimato, comenzando por los aminoácidos aromáticos L-fenilalanina y L-tirosina como las entidades clave de la reacción (Kumar & Pruthi, 2014). Inicialmente, la fenilalanina y la tirosina son convertidas en ácido cinámico y ácido p-cumárico con ayuda de las enzimas fenilalanina amonialiasa y tirosina amonialiasa, respectivamente. Posteriormente el ácido p-cumárico se convierte en AF por reacciones de hidroxilación y metilación. La oxidación y metilación del AF y otros compuestos aromáticos otorgan los complejos di- y tri-hidroxi derivados del ácido cinámico, los cuales toman parte en la formación de lignina junto con el AF (Kumar & Pruthi, 2014) (Figura 10). 21 Figura 10. Ruta metabólica del ácido ferúlico. Modificado de Kumar & Pruthi, 2014. Estudios in vivo del metabolismo del AF sugieren que puede convertirse en una variedad de metabolitos, como por ejemplo el ácido ferúlico-sulfato, el ácido ferúlico-glucurónido, el ácido dihidroferúlico y el ácido vanílico, entre otros (Kumar & Pruthi, 2014). 22 2.8.2.Efectos protectores El AF inhibe eficientemente la peroxidación lipídica generada por los radicales ROO• o ONOO-, esta evidencia in vitro demuestra como el AF atenúa significativamente la peroxidación que induce muerte celular en neuronas hipocampales (Mancuso & Santangelo, 2013). Dada su propiedad antioxidante, el AF posee tres grupos funcionales que contribuyen a esta actividad. La presencia de dos grupos electrodonadores en el anillo de benceno (3-metoxi y 4- hidroxi) le proporcionan la propiedad de inhibir las reacciones en cadena producidas por radicales libres. A su vez, el ácido carboxílico en el AF, adyacente a un doble enlace de carbono (C-C), provee sitios adicionales de ataque a los radicales libres, lo que contribuye a evitar que dañen las membranas celulares. Además, este grupo carboxilo también actúa como un ancla cuando se une a la bicapa lipídica, proporcionando cierta protección contra la peroxidación lipídica (Vargas- Álvarez, 2013). Como otros fenoles, el AF exhibe la actividad de antioxidante en respuesta a la presencia de radicales libres mediante la donación de un átomo de hidrógeno de su grupo hidroxilo fenólico y como resultado muestra una fuerte actividad anti-inflamatoria en modelos in vivo (Kumar & Pruthi, 2014). Además de la propiedad antioxidante que posee este compuesto fenólico, es importante mencionar otras propiedades, tales como su actividad neuroprotectora debida a su actividad antioxidante, aunque también se ha encontrado que puede actuar como antiinflamatorio, antimicrobiano, antialérgico, antidiabético, antiapoptótico, previene el cáncer y es hepatoprotector, entre muchos otros (Kumar & Pruthi, 2014). 2.9. C. elegans como modelo Desde su introducción en la década de 1970, el nematodo Caenorhabditis elegans (C. elegans) (Nematoda: Rhabditidae) ha sido clave como una plataforma para la investigación biológica y la 23 aplicación de una amplia gama de tecnologías (Rodriguez et al., 2013). Es un organismo eucariótico, eutélico, hermafrodita y saprofítico que a menudo se ha descrito habitando el suelo y los ambientes de lechada de hojas en muchas partes del mundo (Leung et al., 2008) (Figura 11). Con un genoma completamente secuenciado, el nematodo es un modelo económico y simple debido a ventajas tales como un tamaño pequeño, transparencia, tiempo de reproducción corto, facilidad de creación de cepas transgénicas a partir de la cepa silvestre N2 así como el bajo costo de mantenimiento (Shashikumar et al., 2015). Este animal ha sido utilizado ampliamente en muchas áreas de la genética, el desarrollo y la biología evolutiva así como en la investigación de enfermedades, debido a que sirve como un modelo importante para las enfermedades humanas tales como la EH, la EP, la diabetes, entre otras ya que posee muchas características biológicas en común con los seres humanos, como el desarrollo de los músculos, de los nervios del tracto digestivo y la producción de espermatozoides, ovocitos y embriones (Rodríguez et al., 2013). Figura 11. C. elegans. Tomado de Prahlad & Morimoto, 2008. Otras características de este modelo animal que han contribuido a su éxito incluyen su fácil manipulación genética, un programa de desarrollo invariante y completamente descrito, un genoma bien caracterizado, la facilidad de mantenimiento y un ciclo de vida corto y prolífico (Leung et al., 2008). El C. elegans presenta muchas vías moleculares conservadas y mecanismos celulares con mamíferos y ofrecen paradigmas experimentales económicos pero estratégicos que permiten un análisis rápido de los factores de susceptibilidad (Harrington et al., 2010). Los homólogos de C. elegans se han identificado aproximadamente para el 60-80% de los genes 24 humanos y 12 de las 17 rutas de transducción de señales conocidas desde la embriogénesis hasta la diferenciación celular en etapa adulta se conservan entre el C. elegans y los humanos (Leung et al., 2008) (Tabla 6). Vías de Transducción de Señales Conservadas en Nematodos y Vertebrados Vías involucradas en el desarrollo temprano Vía de las Wnt a través de la β-catenina Vía del receptor serina/treonina cinasa (receptor del factor de crecimiento tumoral β) Vía del receptor tirosin cinasa (pequeñas proteínas G vinculadas) Vía de señalización Notch-Delta Vía del receptor acoplado a la tirosin cinasa citoplásmica (citocina) Vías de señailización involucradas en desarrollo tardío (organogénesis y renovación tisular) Vía de la apoptosis (muerte celular programada) Vía del receptor de la proteína tirosina fosfatasa Vías de señalización involucradas en la función fisiológica de células diferenciadas en fetos, juveniles y adultos Vía del receptor acoplado a proteína G Vía de las integrinas Vía de las cadherinas Vía de las uniones Gap Vía de los canales de cationes controlados por ligandos Tabla 6. Vías de señalización en C. elegans conservadas en vertebrados. Modificado de Leung et al., 2008. Adicionalmente, el nematodo C. elegans es fácil y barato de mantener en condiciones de laboratorio con una dieta de Escherichia coli (E. coli) y un reducido tamaño (0.75-1mm) lo cual permite un fácil almacenamiento en pequeñas áreas de laboratorio. Su transparencia facilita la visualización bajo un microscopio y su corto ciclo de vida permite la evaluación de varias generaciones en pocos días, haciendo posible estudios genéticos relacionados con trastornos hereditarios en un marco de tiempo relativamente corto (McVey et al., 2012). 25 Un atributo muy ventajoso que ofrece C. elegans es la capacidad de realizar un análisis genético a gran escala. Este nematodo fue el primer organismo multicelular en tener su genoma completamente secuenciado. Además, un gran número de cepas mutantes están disponibles dentro de la comunidad de C. elegans permitiendo a los investigadores estudiar el efecto de varias proteínas y vías in vivo (Harrington et al., 2010). El CGC (por sus siglas en inglés “Caenorhabditis Genetics Center”) se estableció en la Universidad de Missouri, Columbia en 1979. En 1992, el CGC se mudó de Missouri a la Universidad de Minnesota donde reside actualmente. El principal objetivo del CGC es proporcionar cepas e información de C. elegans a los científicos que inician o continúan una investigación utilizando al nematodo. Este centro adquiere y se encarga de tener disponibilidad de cepas que representen al menos un alelo mutante de cada gen publicado y todos los reordenamientos cromosómicos tales como deleciones, duplicaciones, translocaciones e inversiones (CGC, 2017). 2.9.1. Ciclo de vida de C. elegans C. elegans es un organismo estrictamente hermafrodita, es decir produce gametas femeninas y masculinas, posee gónadas tanto femeninas y masculinas y es capaz de autofecundarse. El ciclo de vida de este nematodo es relativamente corto, pues dura entre 3.5-4 días y comprende la embriogénesis, cuatro estadios larvales: L1-L4 y la fase adulta (Leung et al., 2008). A continuación se detalla cada etapa del ciclo de vida de C. elegans: a) Embriogénesis: Dura aproximadamente 16 horas. En este proceso se da una serie de divisiones mitóticas que dan paso a la organogénesis. La primera división mitótica se lleva a cabo al interior del útero mientras que el resto de las divisiones mitóticas, gastrulación, coma y los pliegues se llevan a cabo fuera del útero (Raizen et al., 2008) (Figura 12). b) Estadio L1: Dura aproximadamente 12 horas. Una vez que la embriogénesis concluyó, el embrión eclosiona y da origen a una larva L1 la cual censa la ausencia de alimento, sobrepoblación o altas temperaturas. Cuando el animal L1 procesa la señal, 26 automáticamente entra en una fase de hibernación llamada “dauer”, en la cual el organismo es capaz de resistir las condiciones adversas y el envejecimiento (Hu, 2007) (Figura 12). c) EstadioL2: Dura aproximadamente 8 horas. En este estadio el animal aumenta su tamaño y sigue desarrollando órganos vitales. Si las condiciones son adversas el organismo permanece en fase “dauer” hasta que las condiciones sean apropiadas (Hu, 2007) (Figura 12). d) Estadio L3: Dura aproximadamente 8 horas. En este proceso las gónadas se comienzan a formar y la epidermis del nematodo comienza a segregar colágena para formar la cutícula, la cual proteje al animal del medio (Raizen et al., 2008) (Figura 12). e) Estadio L4: Dura aproximadamente 10 horas. En este estadio el nematodo ya es capaz de producir gametas y las gónadas y los órganos ya están completamente formados (Raizen et al., 2008) (Figura 12). f) Fase adulta: Dura aproximadamente 8 horas. En esta fase, el animal llega a su máximo tamaño, la cutícula de colágena está totalmente formada y es capaz de autofecundarse para producir embriones (Raizen et al., 2008). Cada adulto puede producir entre 200-300 embriones. El gran número de la descendencia permite la producción a gran escala de animales en un corto período de tiempo (Leung et al., 2008) (Figura 12). 27 Figura 12. Ciclo de vida de C. elegans. Tomado de WORMATLAS, 2015. 2.9.2. Sistema nervioso de C. elegans A mediados de los años 90’s, C. elegans se convirtió en el modelo más ampliamente utilizado en la comunidad de neurotoxicología. Esto se debió en parte a la simplicidad de su sistema nervioso, que es una red neuronal relativamente pequeña y simple. El organismo hermafrodita posee exactamente 302 neuronas (Harrington et al., 2010; McVey et al., 2012) y 56 células gliales [por ejemplo, glándula de vaina de CEP (Es un grupo de neuronas dopaminérgicas que funcionan detectando el estímulo mecanosensorial de las bacterias y mediando el circuito motor para controlar este cambio de comportamiento)] (Sawin et al., 2000), las cuales constituyen el sistema nervioso del hermafrodita, mientras que los machos tienen 383 neuronas y 92 células gliales. 28 Como en los organismos modelo más complejos tales como los roedores, las neuronas del C. elegans están involucradas en múltiples contactos sinápticos, incluyendo sinapsis químicas, sinapsis eléctricas, uniones GAP y uniones neuromusculares. Aproximadamente la mitad de los cuerpos neuronales se encuentran en la cabeza, rodeando el anillo del nervio dorsal, mientras que el resto se encuentran a lo largo del cordón ventral y en los ganglios de la cola (McVey et al., 2012). El sistema nervioso de C. elegans se divide en un sistema nervioso faríngeo que contiene 20 neuronas y un sistema nervioso somático que contiene 282 neuronas. En conjunto, se ha construido un diagrama de cableado de red que consta de 6393 sinapsis químicas, 890 uniones GAP y 1410 uniones neuromusculares (McVey et al., 2012). El sistema neurotransmisor de este nematodo está compuesto por siete neurotransmisores, de los cuales cinco comparten homología con los humanos. La octopamina se encarga de modular respuestas de comportamiento frente a cambios ambientales y la tiramina la cual modula la inhibición de las oscilaciones de la cabeza en respuesta a un estímulo de contacto en la porción anterior del cuerpo, la inhibición de la puesta de huevos y la modulación de reversiones espontáneas (Chen et al., 2006). Estos dos neurotransmisores no son homólogos a los humanos. A continuación se detalla el papel de los neurotransmisores presentes en C. elegans y que tienen homología con humanos: a) Dopamina: Este neurotransmisor se encuentra en 8 neuronas en el hermafrodita de C. elegans. Se cree que el papel de las DA en este organismo es predominantemente de naturaleza mecanosensorial (Chen et al., 2006). b) Serotonina: La señalización serotonérgica en C. elegans, presente en 11 neuronas, modula la inhibición de la defecación y locomoción y también promueve el bombeo faríngeo y la ovoposición (McVey et al., 2012). 29 c) GABA: De las 302 neuronas en el nematodo, 26 de ellas son GABAérgicas. Este neurotransmisor funciona principalmente en las uniones neuromusculares. Sus funciones principales son relajar los músculos durante la locomoción y la modulación de la defecación (Chen et al., 2006). d) Glutamato: Este sistema se encuentra en 7 neuronas glutamatérgicas en uniones neuromusculares y su función principal consiste en modular la inhibición y la excitación de la locomoción. La mayoría de las respuestas excitatorias son mediadas por los receptores ionotrópicos de glutamato (iGluRs) los cuales juegan un papel en la reversión después de tocar la punta de la cabeza (McVey et al., 2012). e) Acetilcolina: El neurotransmisor acetilcolina (ACh) es excitador en estos gusanos. Se encuentra en las uniones neuromusculares y provoca contracciones en la pared muscular. La ACh es también un neurotransmisor modulador que desempeña un papel en la locomoción, la puesta de huevos, el bombeo faríngeo, el ciclo de defecación y el apareamiento masculino (McVey et al., 2012). 2.9.3. C. elegans y estrés oxidante Las altas concentraciones de ERO causan EO en todo sistema biológico. En la mayoría de las células, la fuente primaria de ERO es la mitocondria, debido a las ineficiencias en la fosforilación oxidativa. El daño oxidativo es especialmente conocido por interrumpir la proteostasis, pero también puede afectar a los lípidos, membranas y al ADN. En C. elegans, las perturbaciones ambientales que inducen a la formación de ERO pueden conducir a niveles reducidos de dopamina (Rodríguez et al., 2013). En cuanto a los mecanismos de respuesta de este organismo al EO, dicha respuesta está siendo regulada principalmente por el factor de transcripción SKN-1, el cual juega también un importante papel en el desarrollo intestinal del nematodo (Park et al., 2009); aunque los genes de longevidad 30 tales como age-1, old-1, clk-1, spe-26 (Johnson et al., 2002), entre otros también median una mayor resistencia al EO (Park et al., 2009). La sobreexpresión de DAF-16, un factor de transcripción que regula muchas vías de longevidad como por ejemplo la IGF-1, TOR y genes de autofagia tales como bec-1, unc-51 y atg-18 (Tóth et al., 2008), resulta también en una mayor resistencia al EO, además de extender la esperanza de vida (Henderson & Johnson, 2001). OLD-1, es un factor de transcripción que confiere extensión de vida y aumento de los fenotipos de resistencia al EO cuando se sobreexpresa en el C. elegans (Park et al., 2009). OLD-1 Y DAF-16 guardan una estrecha relación entre sí, pues la síntesis de OLD-1 es directamente dependiente de DAF-16. En otras palabras, en los mutantes de daf-16 los niveles de OLD-1 están reducidos significativamente, lo que sugiere que OLD-1 se encuentra bajo el estricto control de DAF-16 y es dependiente sobre el papel de DAF-16 como un factor de transcripción (Johnson et al., 2002). 2.9.4. Vía SKN-1 SKN-1 es un factor de transcripción que se encuentra en el núcleo y es requerido para la respuesta al EO en C. elegans. El factor de transcripción SKN-1 se une al ADN por medio de una región de unión WDR-23/DDB1, que se basa en una versión similar a la de Nrf2 (en mamíferos). El dominio Kelch de SKN-1 forma una estructura helicoidal relativamente estable, junto con un motivo peptídico adicional con el que SKN-1 reconoce bases en el surco menor del ADN (Figura 13), la homología entre SKN-1 y Nrf2 se observa por un residuo llamado DIDLID su dominio adyacente que es muy similar al de las proteínas Nrf2, así que SKN-1 se une sus sitios afines por sí mismo con una afinidad comparable a la de un dímero bZIP y promueve la transcripción de enzimas desintoxicantes y antioxidantes para mitigar los efectos nocivos de ERO y el EO (Ghose, et al., 2013). 31 Figura 13. Comparación entre la vía SKN-1 y la vía Nrf2. Modificado de Choe et al., 2012. De acuerdo con la literatura enel modelo de C. elegans se describen 3 fases en el que el factor SKN-1 realiza la respuesta contra EO, En la Fase I, lipófila, xenobióticos o endobióticos son degradados por enzimas tales como el citocromo P450 (CYP) y las deshidrogenasas de cadena corta (SDHs). Los productos reactivos generados por estos u otros procesos son desintoxicados por la fase II del sistema, en la fase II, una amplia categoría de enzimas que sintetizan el agente reductor glutatión (GSH), metabolizan moléculas reactivas o grupos reactivos conjugados, enzimas como glutatión - S - transferasas (GST) y glucuronosil (UDP) / glucosil transferasas (UGT) realizan estas funciones enzimáticas. Finalmente, las toxinas conjugadas se exportan de las células mediante las proteínas de la Fase III incluyendo el ABC por sus siglas en inglés (ATP- binding cassette) y otros transportadores (Blackwell, et al., 2015). SKN-1 también funciona continuamente para mantener la homeostasis de diversos procesos. Las primeras ideas sobre las funciones post-embrionarias de SKN-1 arribaron con el hallazgo de que, al igual que Nrf2, SKN-1 regula la Fase II de genes de desintoxicación y es necesaria para 32 defenderse ante insultos tóxicos generados a partir del estrés agudo de oxidación. Como podría esperarse, los nematodos que presentan una deleción o mutación en la vía SKN-1 tales como los organismos de la cepa mutante skn-1(ok2315), los cuales poseen una deleción en el gen que codifica para el factor de transcripción SKN-1, son considerablemente menos resistentes que los nematodos de tipo silvestre (N2) a la exposición al EO o xenobiótico (Blackwell, et al., 2015). 33 3. JUSTIFICACIÓN Debido a que no existen reportes previos del uso de EACA y AF en C. elegans como modelo biológico expuesto a neurotoxinas, este proyecto pretende evaluar los posibles efectos protectores de estos dos agentes en diversos marcadores de la fisiología del nematodo. En conjunto, los resultados de este trabajo podrían proporcionar información valiosa sobre las capacidades antioxidantes y posiblemente neuroprotectoras del EACA y AF en condiciones in vivo. 4. HIPÓTESIS El EACA ejercerá efectos protectores en el modelo de C. elegans debido a la presencia de diversos polifenoles, particularmente de AF, el cual por su parte mostrará un efecto protector mayor que el EACA, dado que este compuesto fenólico tendrá actividad antioxidante directa, pues al atrapar radicales producidos por diversas toxinas libres, se espera reduzca la producción de ERO y la muerte celular. 5.1 OBJETIVO GENERAL Comparar el posible efecto antioxidante y protector del EACA contra el AF en el nematodo C. elegans ante el daño ejercido por diversos modelos neurotóxicos inductores de estrés oxidante: 6- OHDA, QUIN y FeSO4. 5.2. Objetivos particulares Evaluar el potencial de reducción de hierro del EACA y AF Evaluar los compuestos fenólicos totales del EACA por el método de Folín-Ciocalteau’s Probar el posible efecto protector del EACA o AF sobre los parámetros fisiológicos de supervivencia, comportamiento y fertilidad en la cepa N2 de C. elegans Evaluar el efecto antioxidante del AF en ausencia de la vía SKN-1 sobre el parámetro fisiológico de supervivencia en la cepa mutante skn-1(ok2315) de C. elegans 34 6. MATERIALES Y METODOS 6-OHDA, QUIN, FeSO4, FA y Folín-Ciocalteau’s fenol se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). El cloruro férrico (FeCl3), el ácido acético y el de carbonato de calcio (CaCO3), se adquirieron de Golden Bell Reactivos (México). El ácido clorhídrico (HCl) se obtuvo de J. Baker (México). El 2,4,6-Tri (2-piridil) -s-triazina (TPTZ) se adquirió de MP Biomedicals, LLC (Solon, OH). Las cepas de C. elegans tipo silvestre N2 (RRID: WB-STRAIN: RWK40N2) y tipo mutante skn-1(ok2315) se obtuvieron del Caenorhabditis Genetics Center (CGC). Las cepas de E. coli (OP50-uracil auxótrofa y NA22 protótrofa) se obtuvieron de cultivos actuales en el Laboratorio de Bacteriología (Facultad de Medicina, UNAM, México). La cepa mutante skn-1(ok2315) [(skn-1(ok2315)IV/nT1[qIs51](IV;V))] es knockout de la vía SKN- 1 y posee una deleción en el alelo ok2315 que codifica para el gen skn-1 (CGC, 2017).No codifica el factor de transcripción bZip ortólogo a los factores de transcripción Nrf de mamífero (Blackwell, et al., 2015). Consiste en una población de heterocigotos tipo silvestre con señal de GFP en la faringe, homocigotos con un cromosoma de deleción en el gen skn-1 viable/enfermiza/con algunos embriones que no eclosionan equilibrado por una translocación marcada con GFP o aneuploides (CGC, 2017).Debe considerarse que cada vez que se trabaja con esta cepa mutante se trata de una población heterogénea. 6.1. Preparación del extracto acuoso de caña de azúcar (EACA) Los tallos frescos de Saccharum officinarum L. (100 g) fueron sometidos a extracción con 1 litro de agua destilada (75ºC x 40 min), obteniéndose el extracto acuoso (EA). Después se recolectó el EA en tubos Eppendorf® de 1.5 ml y se congeló a -20º C en tubos Eppendorf (2 mL c/u) hasta que fuera necesario su uso. La temperatura (-20 º C) a la que se mantuvo el EA no alteró su efecto protector. 35 6.2. FRAP: ensayo de actividad reductora En una placa Costar 96® se disolvieron 40 μl de agua destilada, 10 μl de AF (1: 100) o de EACA (1:05, 1:10, 1:50) y 200 μl de solución de FRAP (buffer de acetatos 3,1 mg de acetato de sodio y 16 ml de ácido acético), 25 ml de HCl, 40 mM; TPTZ, 10 mM y FeCl3, 20 mM se incubaron 8 minutos a 37º C. Posteriormente, se leyó la absorbancia a una intensidad de 530/600 nm y los valores obtenidos se restaron del blanco (grupo control) y se interpolaron con la curva estándar de FeSO4 (100, 250, 500, 750 y 1000 μM) para obtener los resultados finales, que se expresaron como micromoles de FeSO4 reducido. 6.3. Ensayo de polifenoles totales Se transfirieron diferentes concentraciones de EACA (100, 150, 200, 250, 300 y 350 μl) a tubos Eppendorf® de 2 ml y posteriormente fueron aforados a 400 µl con agua destilada. Se añadieron 800 μl de reactivo de Folin-Ciocalteau’s fenol diluido 1:10 en los tubos; estos tubos se dejaron reposar durante 5 minutos y luego se añadieron 800 μl de solución acuosa al 7% p/v de CaCO3. El volumen en los tubos se preparó con agua destilada hasta 2 ml y se dejó reposar durante 2 horas a temperatura ambiente. La absorbancia se leyó a una intensidad de 760 nm en una placa Costar 96® y los valores obtenidos se restaron del blanco (grupo control) y se interpolaron con la curva estándar de AF (1000, 1500, 2000, 3000, 5000, 7000 y 10000 μM) para obtener los resultados finales, que se expresaron como mg/μL de extracto de polifenoles totales por cada concentración. 6.4. Medios de cultivo, mantenimiento y sincronización de C. elegans Las cepas de C. elegans N2 (silvestre) y skn-1(ok2315) se cultivaron en placas con medio de crecimiento de nematodos (NGM) que contienen para 200 ml: 0,6 g de cloruro de sodio (NaCl), 3.4 g de agar (DIBICO, México), 0.5 g de Bacto peptona (Becton Dickinson, México), fosfato de potasio monobásico (KH2PO4, 0.5 M, pH 6), sulfato de magnesio (MgSO4, 1 M), cloruro de calcio (CaCl2, 1 M), colesterol (5 mg/ml), Nistatina (1 mg/ml, Perrigo Lab., México) y Estreptomicina (5 36 mg/ml, PiSA, México) sembradas con la cepa de E. coli (OP50). La bacteria OP50 es un organismo auxótrofo incapaz de sintetizar uracilo, por lo cual requiere medios ricos en uracilo para crecer. Provee los nutrientes esenciales y básicos para el desarrollo y crecimiento normales del nematodo. Las placas con medio de sincronización 8P (Para 200 ml: 0.6 g de NaCl, 5 g de agar, 4 g de Bacto peptona, KH2PO4 0.5 M, pH6, MgSO4 1 M, CaCl2 1 M, colesterol 5 mg/ml y Nistatina 1 mg/ml) fueron sembradas con la cepa de E. coli (NA22).La bacteria NA22 es un organismo prototrófo que sintetiza todos los compuestos necesarios para su crecimiento. Sintetiza los nutrientes requeridos para el máximo desarrollo y crecimiento de los nematodos, por lo cual se utiliza como complemento nutrimental. Transcurridos cuatro días desde que las placas fueron sembradas, se lavaron con agua destilada y luego se lisaron aproximadamente 20,000 animales en fase adulta en una solución de hidróxido de sodio (NaOH, 10 M)/hipoclorito de sodio (NaClO), agitando vigorosamente durante 7 minutos con la finalidad de romper las cutículas. Posteriormente se adicionó buffer M9 (3 g de fosfato de potasio dibásico (K2HPO4), 6 g de fosfato de sodio (Na2PO4), 5 g de NaCl y 1 ml de MgSO4 para neutralizar el medio). A continuación se adicionaron 30 ml de sacarosa al 30% p/v con la finalidad de flotar los embriones del resto. Finalmente se realizó un último lavado con agua destilada para obtener los embriones, los cuales 24 horas después alcanzan el estadio L1 requerido para hacer los tratamientos. 6.5. Tratamientos protectores y tóxicos Las cepas C. elegans N2 (silvestre) y skn-1(ok2315) se expusieron a los siguientes tratamientos tóxicos: 6-OHDA 25 mM, FeSO4 15 mM y QUIN 100 mM, en exposiciones de 30 minutos después de los tratamientos protectores (30 minutos) con AF 38 mM (dicha concentración se determinó a partir del contenido total de AF en la caña de azúcar, pues según Kumar & Pruthi, 2014 la caña de azúcar contiene 800 mg/kg de AF, lo cual es equivalente a la concentración aquí presentada) o EACA concentrado (aproximadamente 13.5 mM de polifenoles totales, de los cuales se considera que la mayor parte corresponde al AF). La cepa 37 skn-1(ok2315) se expuso únicamente al AF 38 mM, debido a que el EACA se agotó y fue imposible reponerlo, ya que la caña de azúcar se cosecha únicamente entre los meses de noviembre a enero y durante el periodo en que se realizaba este experimento no fue posible conseguir el recurso para fabricar más EACA. Posteriormente se cultivaron en placas de NGM previamente sembradas con E. coli (OP50). 6.6. Ensayo de supervivencia con la cepa N2 Después de 24 horas de exposición, se contaron 3 celdas con gran densidad de gusanos y 3 celdas con poca densidad de gusanos; el promedio obtenido se multiplicó por el número total de celdas y se dividió entre 64 (total de celdas por placa) para obtener el número de gusanos en la placa. Se consideraron seis placas de cada tratamiento para esta prueba y el procedimiento se repitió tres veces por duplicado. 6.7. Ensayo de supervivencia con la cepa skn-1(ok2315) Pasadas 24 horas después de la exposición, se contaron 4 celdas con gran densidad de gusanos y 4 celdas con poca densidad de gusanos, esto debido a la menor cantidad de gusanos presentes en las placas con respecto a la densidad de la cepa N2; el promedio obtenido se multiplicó por el número total de celdas y se dividió entre 64 (total de celdas por placa) para obtener el número de gusanos en la placa. Se consideraron seis placas de cada tratamiento para esta prueba y el procedimiento se repitió tres veces por duplicado. 6.8. Locomoción con la cepa N2 Cuarenta y ocho horas después de la exposición a las toxinas, la velocidad de locomoción se controló en los gusanos en términos del número de "curvaturas de cuerpo" hechas por cada gusano (Shashikumar et al., 2015). Cada gusano se recogió de la placa de agar NGM-OP50 y se transfirió a otra placa NGM sin bacteria. Se permitió al gusano adaptarse al medio ambiente durante 1 minuto y luego, el número de curvaturas del cuerpo en 1 minuto se cuantificó bajo el microscopio estereoscópico. Una curvatura del cuerpo fue contada solamente como tal cuando el 38 gusano hizo un movimiento ondulatorio con la cabeza hacia el lado derecho. Se analizaron 12 gusanos de cada grupo; las pruebas se repitieron seis veces por duplicado. 6.9. Reproducción con la cepa N2 Setenta y dos horas después de la exposición a las toxinas, la prueba de fertilidad se realizó en términos de "tamaño de la descendencia" (huevos y larvas). Cada gusano se transfirió a una placa de NGM y se cultivó sólo en el centro con bacteria OP50. El número total de huevos y larvas se cuantificó al día siguiente de la transferencia y el mismo gusano fue transferido de nuevo a una nueva placa en las mismas condiciones, hasta que su tasa reproductiva cayó a cero; es decir, aproximadamente dos días después de la transferencia. Se probaron cuatro gusanos de cada grupo y el ensayo se repitió cuatro veces por duplicado. 6.10. Análisis estadístico Cada experimento se realizó al menos por triplicado. Se determinaron la media y el error estándar (ES) para todos los parámetros. La significancia estadística entre los grupos se evaluó mediante análisis de varianza de una vía (ANOVA), seguido de análisis post-hoc de Tukey (GraphPad Prism 6.0). Los niveles de significancia fueron establecidos a p<0.05. 39 6.11. Diagrama de Flujo 72 horas 24 horas Ensayo de potencial reductor del EACA (1:50, 1:10 y 1:05) y AF (1:100): FRAP Ensayo de polifenoles totales en el EACA (100, 150, 200, 250, 300 y 350 µL en 400 µL de agua) Sincronización de nematodos (fase adulta) después de 4 días de incubación Tratamientos protectores (30 minutos) AF (38 mM), EACA concentrado Tratamientos tóxicos (30 minutos) QUIN (100 µM), FeSO4 (15 µM), 6-OHDA (25 µM) Test de Supervivencia N2 skn-1(ok2315) (pretratado únicamente con AF) Test de Locomoción Test de Fertilidad 48 horas 40 7. RESULTADOS 7.1. El potencial reductor de hierro del AF y el EAECA En la figura 14 se observa la capacidad reductora de iones Fe3+ a iones Fe2+ de 3 diferentes diluciones de EACA (1:50, 1:10 y 1:05) a partir del EACA y de una dilución de AF (1:100/380 µM) a partir de la concentración original de AF 38 mM. En la gráfica se aprecia claramente como existe una relación de concentración-reducción; es decir, mientras mayor sea la concentración en dicha dilución, mayor es el potencial reductor de las diluciones. En la dilución menos concentrada de EACA (1:50), la capacidad reductora, expresada en micromoles de FeSO4 fue de 53 ± 0.05 µM, lo cual indica que el potencial de reducción de hierro de esta dilución es bajo; en las siguientes diluciones de EACA (1:10 y 1:05) se puede apreciar un notorio aumento del potencial reductor (212 ± 0.05 µM y 436 ± 0.14 µM); se observa que es la dilución de AF (1:100/38 mM) se observa que es la que mayor potencial reductor posee, pues con una media de 660 ± 0.12 µM de FeSO4 reducido, es el compuesto fenólico que presenta mejor actividad reductora de hierro por encima del EACA, el cual posee diversos fenoles en su composición química. 41 C a p a c id a d r e d u c to ra d e l A F y E A C A R e d u c c ió n d e h ie r r o ( µ M F e S O 4 ) E A C A 1 :5 0 E A C A 1 :1 0 E A C A 1 :0 5 A F 1 :1 0 0 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 Figura 14. Capacidad reductora de hierro del AF y el EACA en diversas concentraciones. Los valores representan medias (n = 12 por experimento). 7.2. Concentración total de polifenoles en el EACA En la figura 15 se observa un aumento creciente de la concentración de polifenoles totales presentes en el EACA; es decir, mientras mayor sea la concentración del EACA en una solución, mayor contenido de fenoles estarán presentes en la misma. Los resultados fueron expresados en micromoles de AF. La media obtenida a partir de la dilución menor (100 µL de EACA en 400 µL de agua) fue de 3.097 µM de AF; es decir que en dicha dilución hay en total un promedio de 3 mM de compuestos fenólicos presentes; las medias de las siguientes diluciones (150, 200, 250
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