Analisis-de-la-beta-oxidacion-mitocondrial-en-celulas-tumorales-de-rapido-crecimiento

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
DE MÉXICO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FACULTAD DE CIENCIAS 
 
Análisis de la β-Oxidación mitocondrial 
en células tumorales de rápido 
crecimiento. 
 
 
 T E S I S---
------------------------------------------------------------- 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
 BIÓLOGA 
P R E S E N T A: 
NADIA ALEJANDRA RIVERO SEGURA 
 
TUTOR: 
Dra. Sara Rodríguez Enríquez 
Dr. Juan Carlos Gallardo Pérez 
 
MÉXICO 2013 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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1. DATOS DEL ALUMNO 
Rivero 
Segura 
Nadia Alejandra 
5617-6762 
Universidad Nacional Autónoma de México 
Facultad de Ciencias 
Biología 
306727551 
 
2. DATOS DEL TUTOR 
Doctor en Ciencias Biomédicas 
Sara 
Rodríguez 
Enríquez 
 
3. DATOS DEL SINODAL 1 
Dr. 
Marco Antonio 
Juárez 
Oropeza 
 
4. DATOS DEL SINODAL 2 
Dr. 
René de Jesús 
Cárdenas 
Vázquez 
 
5. DATOS DEL SINODAL 3 
Dr. 
Juan Carlos 
Gallardo 
Pérez 
 
6. DATOS DEL SINODAL 4 
Biól. 
Ana Paulina 
Mendoza 
von der Borch 
 
7. DATOS DEL TRABAJO ESCRITO. 
Análisis de la β-oxidación mitocondrial en células tumorales de rápido crecimiento. 
66 pp. 
2013 
 
 
I 
ANÁLISIS DE LA β-OXIDACIÓN MITOCONDRIAL EN CÉLULAS TUMORALES DE 
RÁPIDO CRECIMIENTO 
 
AGRADECIMIENTOS 
La presente tesis de licenciatura se realizó en su totalidad en el Departamento de 
Bioquímica del Instituto Nacional de Cardiología “Ignacio Chávez”, México. El trabajo 
experimental y escrito de la tesis se realizó bajo la tutoría del Dr, Juan Carlos Gallardo 
Pérez y la Dra. Sara Rodríguez Enríquez, a quienes agradezco su invaluable y constante 
apoyo, así como la mediación de los recursos materiales para que esto fuera posible. 
Agradezco también al Dr. Rafael Moreno Sánchez y al Dr. Álvaro Marín Hernández por 
compartir sus opiniones y conocimientos durante el desarrollo de esta tesis. 
 
 
 
Asesor 
 
 
Dra. Sara Rodríguez Enríquez 
Sustentante 
 
 
Nadia Alejandra Rivero Segura 
 
 
 
 
II 
DEDICATORIAS 
“Nadia! Esos geles van a salir, contigo, sin ti o a pesar de ti!!!” 
 Ánonimo 
Quiero dedicar este trabajo a todas aquellas personas que estuvieron conmigo de forma física, virtual o hasta 
espiritual, por el simple hecho de soportarme mientras sufría con la escritura de LA TESIS. A todos ustedes les dedico 
una página de éste trabajo, y quiero decirles que este es el primer éxito de muchos más, espero seguir contando con 
ustedes: 
 A mis padres y patrocinadores: Silvia M. Segura Hdz. y Leonel A. Rivero Ramírez, quienes me 
enseñaron que la constancia, la perseverancia y la honestidad son clave fundamental para alcanzar mis 
metas. Gracias por soportar mis desplantes, mi inutilidad en las labores de la casa y sobretodo por 
apoyarme en TOOOOODAS y cada una de mis locuras, esta es una de tantas y vamos por más, los 
quiero. 
 
 A mi hermana: Alethia I. Rivero Segura (Pato), quien ha sido mi motor para superarme día con día y 
ser mejor persona, gracias por enseñarme a soñar y alcanzar mis metas, por ser el mejor ejemplo a 
seguir, por apoyarme y patrocinar mis diversiones, por ser una segunda madre y padre, te quiero 
taaaaanto tanto tanto que cada éxito mío lo comparto contigo. 
 
 A mi Abuelita: Sra. Refugio Ramírez Rendón (RIP) en donde quiera que te encuentres, GRACIAS 
por quererme tanto, por consentirme demasiado, por cuidarme mientras mis padres trabajaban, gracias 
por estudiar conmigo por las tardes y por haber sido un gran ejemplo de trabajo, esfuerzo y coraje para 
salir adelante y conseguir tus objetivos. Te quiero mucho y te extraño demasiado. 
 
 A TOOOODOS mis amigos, de quienes he recibido grandes lecciones de vida, gracias por 
enseñarme a divertirme, por escucharme y regalarme un poquito de su sabiduría, por no dejarme rendir 
cuando las cosas se ponían feas, a Andieeee, Fernando, Coral (cogumelito da minha vida), Jimena, 
Mariana (Sweetwife), Martín, Marz, Alejandro, Mitzi, Jesyver, Arturo, Lupita, Lucía, Rich, Ray, Saddan 
(socio), y a todos lo que me hagan falta, ustedes saben quienes son, los quiero mucho. 
 
 A mis amiguitas del Laboratorio que siempre estuvieron conmigo en todos y cada uno de mis 
berrinches y desplantes o cuando estaba de PESADA, gracias por sus palabras de ánimo y buenos 
consejos, son muy especiales para mí y las quiero mucho señoritas. A Gloria que esta en los cielos, por su 
infinito conocimiento y grandes aportaciones al proyecto. 
 
 A mis tutores por su enorme paciencia y su dedicación, gracias por dedicarme tiempo, atención y 
por depositar su confianza en mi, los aprecio mucho. 
 
 Finalmente quiero agradecer a las ratas que dieron su vida para la realización de éste proyecto, 
ninguna fue maltratada. 
 
 
“May the Force be with you.” 
Star Wars 
 
III 
RESUMEN 
En las células tumorales existen características metabólicas que las distinguen de las 
células sanas, con respecto a ello, destaca su elevada actividad glucolítica en presencia 
de oxígeno. Aunque esta afirmación no se ha demostrado experimentalmente, se ha 
supuesto que la glucólisis es la vía de mayor contribución en el suministro de ATP, de tal 
forma que el estudio del metabolismo energético mitocondrial en células tumorales no se 
ha dilucidado totalmente. En estudios recientes se ha demostrado que algunos 
metabolitos mitocondriales como son la glutamina, la prolina, el piruvato y el propionato se 
oxidan activamente en un intervalo de 2-7 veces más en células y mitocondrias tumorales 
que en tejidos sanos. De hecho, las enzimas que intervienen en su oxidación como son la 
glutaminasa, la enzima málica, la prolina oxidasa y la succinil-CoA acetoacetil transferasa 
se encuentran en mayor concentración y con actividades máximas más elevadas que las 
reportadas en sus contrapartes normales. En conjunto, estas evidencias experimentales 
sugieren que el metabolismo mitocondrial es funcional y puede contribuir al aporte del 
ATP requerido para que la célula tumoral realice sus funciones. 
En un intento por explorar otras vías mitocondriales activas en tumores de rápido 
crecimiento evaluamos la β- oxidación mitocondrial, ya que bajo condiciones de estrés 
nutricional esta vía es el principal suministro de Acetil CoA en células no tumorales. En 
algunas líneas celulares tumorales como PC3 (cáncer de próstata), HCT115 (cáncer 
colorectal) y HepG2 (hepatocarcinoma humano) la β-oxidación ha sido parcialmente 
estudiada. Sin embargo, los análisis reportados en la literatura son incompletos debido a 
que solo se evaluó el contenido de transcritos y de proteínas. Por ello en este estudio se 
pretende realizar un análisis integral que contemple la evaluación de la β- oxidación 
 
IV 
mitocondrial midiendo directamente el flujo de la vía en presencia de ácidos grasos libres 
así como el contenido proteico del transportador y de las enzimas involucradas. 
Para perseguir estos objetivos se emplearon dos modelos: 1) Mitocondrias aisladas de 
hepatoma AS-30D (ex vivo) de rata, en el que se evaluó el contenido proteicodel 
transportador de grupos acil graso:Carinitinapalmitoil transferasa I(CPTI), así como delas 
enzimas de la β-oxidación mitocondrial: la SACAD(Acil-CoA deshidrogenasa), la ECHS1 
(Enoil-CoA hidratasa) y la EHHADH (3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa). El CPTI y la 
SACAD aumentaron significativamente (2 veces) vs el contenido en mitocondrias de 
hígado de rata (RLM, por sus siglas en inglés: rat liver mitochondria). En cuanto a la 
funcionalidad de la β-oxidación en mitocondrias aisladas de AS-30D se evaluó el pseudo 
estado 4, estado 3 y estado 4 mitocondrial, así como el control respiratorio y la relación 
ADP/O, parámetros que permiten dilucidar el grado de acoplamiento mitocondrial y la 
velocidad máxima de oxidación de los ácidos grasos: octanoil-DL carnitina, propionil-DL 
carnitina, octanoato y palmitoil-DL carnitina. Todos los ácidos grasos empleados se 
oxidaron en mitocondrias de hepatoma AS-30D a velocidades de estado 3 (100-150, n=3 
ngAO/min/mg prot) parecidas a las de hígado de rata sana (RLM) (120-150, n=3 
ngAO/min/mg prot). 2) En el segundo modelo, se utilizó una línea tumoral humana (HeLa) 
donde se encontró que diversos ácidos grasos saturados e insaturados endógenos 
(mirístico, palmítico, esteárico, palmitoléico, oléico, vaccénico, linoléico, y araquidónico) 
disminuyen su concentración de 2-5 veces en tiempos cortos (60 min). Con la intención de 
evaluar si su consumo es activo en procesos de alta demanda energética, se evaluaron 
las concentraciones de estos ácidos grasos durante la proliferación celular en cultivos 
tumorales humanos; comparando la fase proliferativa con la fase de latencia, los ácidos 
 
V 
grasos libres: mirístico, palmítico y esteárico, disminuyeron su concentración de 4 a 14 
veces, sugiriendo un activo consumo de ácidos grasos relacionado con la proliferación 
celular. 
Los resultados obtenidos indican que los tumores de rápido crecimiento son capaces de 
consumir ácidos grasos para mantener una activa proliferación celular y una homeostasis 
energética adecuada. Lo que permite proponer a las vías mitocondriales activas como un 
posible blanco terapéutico. 
 
 
 
VI 
ABREVIATURAS 
2-OG: 2-oxoglutarato 
AcAc: Acetoacetato 
SACAD: Acil Coenzima A deshidrogenasa de cadena corta 
AcCoA: Acetil Coenzima A 
ADN: Ácido desoxirribonucleico 
ADP: Adenosíndifosfato 
AGL: Ácidos grasos libres 
AMPK:AMP- Activated ProteinKinase (Proteína cinasa activada por AMP) 
mARN: Ácido ribonucleico mensajero 
ATP: Adenosíntrifosfato 
BHT: Butil-hidroxi-tolueno 
CK: Ciclo de Krebs 
CPTI: Isoforma I de la Carnitinapalmitoiltransferasa 
CPTII: Isoforma II de la Carnitinapalmitoiltransferasa 
ECHS1: Isoforma 1 de cadena corta de la Enoil Coenzima A hidratasa 
EDTA: Ácido etileno-diamino-tetra-acético 
EFAs:EssentialFattyAcids (Ácidos grasos esenciales) 
EGTA: Ácido tetra-acético-etilenglicol 
EHHADH: 3-hidroxiacil-Coenzima-deshidrogenasa 
FO: Fosforilación oxidativa 
GA: Glutaminasa 
GDH: Glutamato deshidrogenasa 
GLN: Glutamina 
GLUT1: Isoforma 1 del trasnportador de glucosa 
LACAD: Long chain Acyl-CoA Dehydrogenase (Acil-Coenzima A deshidrogenasa de 
cadena larga) 
MACAD:Medium chain Acyl-CoA Dehydrogenase (Acil-Coenzima A deshidrogenasa de 
cadena media) 
NADH: Nicotinamida adenina dinucleótido 
OAA: Oxaloacetato 
PMSF: Fluoruro de fenilmetilsulfonilo 
Pi: Fosfato inorgánico 
POX: Prolina oxidasa 
PPARs:Peroxisome Proliferator ActivatedReceptors (Receptores activados 
porproliferadoresde peroxisomas) 
PUFAs: Poli-Unsaturaded FattyAcids (ácidos grasos poli-insaturados) 
RLM: Rat liver mitochondria (mitocondrias de hígado de rata) 
SCAAT: Succinil Coenzima A acetoacetiltransferasa 
SACAD: Aci-lCoenzima A deshidrogenasa de cadena corta 
VLACAD:Acil-Coenzima A deshidrogenasa de cadena muy larga 
WB: Western Blot 
β-OHbut: β-hidroxibutirato 
 
 
VII 
Índice 
Capitulo I 
1. Introducción 
1.1 Epidemiología del cáncer en México 1 
1.2 Características del cáncer 1 
1.3 El Metabolismo energético en células tumorales de rápido 
crecimiento 2 
1.4 El metabolismo energético mitocondrial en células tumorales de rápido 
crecimiento 3 
1.5 -oxidación mitocondrial en células normales 7 
1.6 β-oxidación mitocondrial en células tumorales 11 
Capitulo II 
 
2.1 Justificación 14 
2.2 Hipótesis 14 
2.3 Objetivos: general y particulares 15 
 
Capitulo III 
 
3. Material y métodos 
3.1 Propagación del hepatoma AS-30D 16 
3.2 Aislamiento de células y mitocondrias de hepatoma AS-30D 16 
 
VIII 
3.4 Aislamiento de mitocondrias de hígado de rata (RLM) 17 
3.5 Cuantificación de proteína 17 
3.6 Determinación y cálculo de los flujos de oxidación de ácidos carboxílicos, 
ácidos grasos de cadena media y larga 17 
3.7 Cultivo y propagación de la línea celular HeLa 20 
3.7.1 Generación de curvas de crecimiento 20 
3.8 Preparación de las muestras de hepatoma AS-30D y HeLa obtenidas a 
diferentes tiempos de incubación para la separación e identificación de ácidos 
grasos por cromatografía de gases 21 
3.8.1 Tiempos cortos 
(consumo de ácidos grasos en minutos) 21 
3.8.2 Tiempos largos 
(Consumo de ácidos grasos en minutos) 21 
3.9 Cuantificación de ácidos grasos libres (AGL) 22 
3.10 Extracción, procesamiento y análisis de proteínas de la β-oxidación por 
Western Blot. 22 
Capítulo IV 
 
Resultados 24 
 
 
 
 
 
IX 
 
Capítulo V 
 
Discusión 42 
 
Capítulo VI 
 
Conclusiones 52 
 
Referencias. 55 
 
ANEXO 67 
 
 
 
1 
CAPÍTULO i 
1. INTRODUCCIÓN 
 
1.1 Epidemiología del cáncer en México 
El cáncer es una enfermedad con altos índices de mortalidad a nivel mundial, representa 
el 21% del total de las defunciones registradas en 2011, lo que la ubica como la 2° causa 
de muerte [OMS, 2013]. Aunque el cáncer cervicouterino es completamente previsible y 
con esquemas de tratamiento relativamente exitosos, en paísesen vías de desarrollo 
como México representa la segunda causa de defunciones en la población femenina y en 
la última década el número de muertes se ha incrementado significativamente, esto se 
debe en gran medida a la baja cobertura geográfica de los servicios de salud, así como a 
los bajos estándares de calidad en los programas de detección temprana [SINAIS,2011]. 
 
1.2 Características moleculares del cáncer 
En general los tumores sólidos presentan mutaciones en el material genético (DNA), las 
cuales favorecen (1) la expresión de oncogenes (H-Ras, c-Myc, MKi-67), y (2) la mutación 
en genes supresores de tumores (PTEN, P53), así como mutaciones en genes que 
mantienen la de estabilidad genética (BCRA1/2, BLM, ATM, ATR) [Vogelstein et al. 2004]. 
Lo anterior induce desregulación en los puntos de verificación del ciclo celular 
(checkpoints) [Weinert y Lydall., 1993; Kastan et al. 2004] permitiendo una proliferación 
descontrolada y progresión en fases tardías de la enfermedad a metástasis. Estas 
modificaciones se relacionan con la reprogramación en la regulación de distintos procesos 
celulares, llamados por Hanahan y Weinberg [2011] hallmarks o sellos característicos de 
las células cancerígenas. En el cáncer se han identificado once hallmarks entre los que 
destacan los relacionados con el control de la proliferación celular, la apoptosis, la 
senescencia, la reparación del DNA, la angiogénesis e interesantemente, el aceleramiento 
de la glucólisis aún en condiciones saturantes de oxígeno. 
La acelerada capacidad de proliferación de las células tumorales implica una alta 
demanda de energía, por lo que numerosos estudios se han apoyado en el supuesto de 
 
2 
que el metabolismo glucolítico tumoral debe ser la vía a partir de la cual la síntesis de ATP 
se ve favorecida [Warburg,1956; Garber et al.2006].De hecho, se ha demostrado que la 
acelerada glucólisis tumoral es dependiente de la expresión de ciertos oncogenes y 
factores de transcripción pero es independiente del estatus de mutaciones en ellos 
[Vogelstein et al., 2004] lo que la hace una característica intrínseca importante para el 
crecimiento tumoral. 
 
1.3 El metabolismo energético en células tumorales de rápido crecimiento 
En 1956, el bioquímico alemán Otto Warburg determinó que en células de hepatoma de 
rata, la glucólisis aerobia aumenta de 2-60 veces con respecto a células sanas de hígado 
de roedor, dando lugar a la suposición de que en todos los tipos de neoplasias la 
glucólisis es la vía energética preferentemente empleada para la síntesis de ATP (Efecto 
Warburg) [Warburg, 1956]. Durante algunas décadas una vasta cantidad de autores 
interpretaron los estudios de Warburg como sinónimo de daño en la función mitocondrial, 
por lo que el estudio del metabolismo energético de este organulo fue soslayado. Sin 
embargo, evidencias experimentales recientes indican que la mitocondria es activa en 
varios tipos de células cancerígenas de rápido crecimiento tanto de roedor 
(hepatocarcinomas de rata AS30D, Morris y fibrosarcoma) como de humano (sarcoma, 
carcinoma de mama (MCF7) y de cérvix (HeLa), donde el principal aporte de ATP celular 
(>80-90%) lo suministra la fosforilación oxidativa (FO) [Rodríguez-Enríquez et al., 2000; 
Zu y Guppy, 2004; Moreno-Sánchez et al. 2007; Rodríguez-Enríquez et al., 2010].Estas 
evidencias han permitido proponer que el efecto Warburg no se aplica de manera general 
a todos los tipos de neoplasias y pone en evidencia que el estudio de la bioenergética 
mitocondrial debe ser un campo de investigación en cáncer. 
 
 
 
 
3 
1.4 El metabolismo energético mitocondrial en células tumorales de rápido 
crecimiento 
En la Tabla 1 y en la Figura 1 se representan algunas vías del metabolismo mitocondrial 
que sustentan la propuesta de que la FO se encuentra activa [Phang et al., 2008; 
Rodriguez-Enriquez et al., 2011]. La actividad del transportador de glutamina y algunas 
enzimas de la glutaminolisis (oxidación de glutamina hasta la generación de lactato) en 
hepatocarcinomas humanos y de roedor, así como en carcinoma humano de pulmón 
aumentan significativamente: (A) el transportador de glutamina (gln) al interior de la matriz 
mitocondrial en comparación con el transporte reportado en mitocondrias aisladas de 
cerebro e hígado de rata aumenta de 10-20 veces [Molina et al. 1995];(B) la glutaminasa 
(GA) en hepatoma Erlich aumenta 50-60 veces comparada con la actividad reportada en 
el hígado humano normal; de la misma forma que la actividad de (C) la glutamato 
deshidrogenasa (GDH) que aumenta 20 veces en mitocondrias aisladas de hepatoma 
Erlich, con respecto a la actividad encontrada en leucocitos humanos [Rivera et al. 1988], 
finalmente (D) la enzima málica (EM) mitocondrial también muestra un aumento de 25-80 
veces en diversos tipos de hepatocarcinomas humano y de rata versus hepatocitos de 
rata [Moreadith et al.1984]. Otra vía activa en la mitocondria del tumor, es la oxidación de 
prolina, un iminoácido que proporciona intermediarios del Ciclo de Krebs como 2-
oxoglutarato (2-OG). En esta vía se ha documentado que la prolina oxidasa (POX) 
aumenta 10 veces en una amplia variedad de hepatocarcinomas de rata, comparada con 
su tejido de origen [Cooperet al.,2008]. La succinil-CoA-acetoacetil transfersa (SCAAT), 
involucrada en la degradación de cuerpos cetónicos (Acetoacetato (AcAc); β-
hidroxibutirato (β-OHbut)) para formar Acetil CoA (un intermediario del Ciclo de Krebs) 
[Zhang et al.1990]; también presenta alta actividad (10-200 veces) en cáncer humano 
colorectal en comparación con la actividad reportada en hepatocitos de rata. Aunado a la 
oxidación de aminoácidos, iminoácidos y cuerpos cetónicos, también se ha determinado 
en mitocondrias aisladas de AS-30D una eficiente oxidación de sustratos provenientes de 
la oxidación aeróbica de la glucosa como es piruvato y otros que alimentan directamente 
el ciclo de Krebs (2-oxoglutarato, malato, prolina) cuyas velocidades son de 2 a 5 veces 
más altas que en mitocondrias aisladas de RLM [Rivero-Segura et al., manuscrito en 
preparación]. Lo anterior indica que las mitocondrias del tumor se encuentran 
 
4 
metabólicamente activas, y son capaces de oxidar sustratos tan eficientemente como las 
mitocondrias de hígado de rata.. 
 
 
5 
Tabla 1. Actividades enzimáticas de proteínas mitocondriales en células tumorales versus 
células no tumorales. 
 
 
 
 
Enzima o 
Transportador 
Incremento en tejido 
tumoral vs tejido no 
tumoral(veces) 
Tipo tumoral Referencia 
Transporte de 
Glutamina 
≈10-20 Sk-Hep , Ascitis 
Ehrlich 
[Molina et al. 1995] 
Glutaminasa 
(GA) 
≈50-60 Lewis , Carcinoma 
humano de pulmón 
 
[Rivera et al.1988] 
Glutamato 
deshidrogenasa 
(GDH) 
≈20 Ascitis Erhrlich 
(mitocondrias) vs 
linfocitos de humano 
Enzima málica 
mitocondrial 
≈25-80 Hepatocarcinomas 
humanos y de roedor 
[Moreadith et al.1984] 
Prolina oxidasa 
(POX) 
≈10 Cáncer colorectal [Cooperet al.2008] 
Succinil CoA-Aceto 
Acetil Transferasa 
(SCAAT) 
≈10-200 Hepatorcinomas de 
roedor 
[Zhanget al.1990] 
 
6 
 
 
Figura 1. Se esquematizan algunas de las vías metabólicas mitocondriales más estudiadas en 
tumores: (1) Glutaminólisis,(2) Oxidación de prolina y (3) Degradación de cuerpos cetónicos. 
AcAc, acetoacetil; AcAcCoA, acetoacetil-CoA; AcCoA, acetil-CoA; ADP, Adenosindifosfato; 
ATP, Adenosintrifosfato; EM, enzima málica; Gln, glutamina; GA, glutaminasa; Pro, prolina; 
POX, prolina oxidasa; P5C, pirrolina-5-carboxilato; γ-GS, γ-glutamato-semialdehído; γ-GSDH, 
γ-glutamato-semialdehído deshidrogenasa; Glut, glutamato; GDH, glutamato deshidrogenasa; 
2OG, 2-oxoglutarato; β-OHbut, β-hidroxibutirato; SCAAT, succinil-CoAacetoacetiltransferasa; 
CK, Ciclo de Krebs; Succ, Succinato; Fum, Fumarato; Pi, Fosfato inorgánico; Q, Poza de 
quinona; I,NADH-ubiquinona oxidoreductasa (Complejo I); II, Succinato ubiquinona 
oxidorreductasa(Complejo II); III, Ubiquinol citocromo c oxidorreductasa (complejo III); IV, 
Citocromo c oxidasa(Complejo IV); V, ATP sintetasa (Complejo V). 
[Modificado de Rodríguez –Enriquez et al. 2011] 
(3) 
(1) 
(2) 
(1) 
 
7 
Las vías previamente mencionadas no son las únicas encargadas de proveer de 
intermediarios que participen en la formación de ATP, y muchas de ellas no se han 
explorado completamente o de forma integral. Por tanto, otras vías metabólicas 
mitocondriales alternas pueden ser activas, eficientes, y capaces de mantener a las 
principales funciones dependientes de ATP en células tumorales privadas de fuentes de 
carbono como glucosa y glutamina [Nelson y Cox, 2009]. En el hígado, la β-oxidación 
mitocondrial aporta más de 100 moléculas de ATP por la oxidación de cada ácido graso 
en comparación con las 2 moléculas de ATP generadas por la glucólisis [Nelson y Cox, 
2009]. Sin embargo, en células tumorales, no se ha realizado un análisis global donde se 
evalúe simultáneamente la cantidad proteica con los flujos de oxidación de los ácidos 
grasos. Lo anterior toma relevancia porque no siempre las variaciones en el contenido de 
proteína reflejan cambios en las actividades de las enzimas y en las velocidades de los 
flujos metabólicos. 
 
1.5 -oxidación de ácidos grasos en células normales 
En células de mamífero, la β-oxidación es la vía metabólica encargada de la oxidación de 
los ácidos grasos saturados e insaturados de cadena corta, mediana y larga. Las 
reacciones involucradas en esta vía, se llevan a cabo en orgánulos celulares como la 
mitocondria o en el peroxisoma [Eaton, et al., 1996]. Aunque el proceso de oxidación es 
similar en ambos orgánulos, existen algunas diferencias en cuanto a (1) la preferencia del 
peroxisoma por ácidos grasos de cadenas muy largas y largas, así como por ácidos 
grasos ramificados como los mono-, di-, y/o tri-acilgliceroles [Eaton et al.1996], los cuales 
no pueden ser oxidados directamente por las enzimas de la β-oxidación mitocondrial [Liu 
et al. 2004]. Otra diferencia se refiere (2) al destino de los compuestos generados, por 
ejemplo: en peroxisomas los ácidos grasos al ser acortados generan H2O2, que es 
neutralizada por la catalasa peroxisomal, y Acetil CoA, exportado al citosol para 
enriquecer la poza citosólica de Acetil CoA/CoA [Lazarowet al.1978; Nelson y Cox, 2009]. 
Mientras que en la mitocondria, los ácidos grasos son oxidados para generar NADH y 
Acetil CoA. 
 
8 
Cabe mencionar que de acuerdo con la IUPAC los ácidos grasos se clasifican mediante la 
longitud de su cadena de carbonos de tal forma que pueden ser de cadena corta (C4-C6), 
cadena media(C8-C12), cadena larga (C14-C18)y cadena muy larga (>C20); también pueden 
clasificarse por la presencia (saturados) o ausencia de dobles enlaces (insaturados). 
[Eaton et al.,1996; Nelson y Cox,2009; Fahy et al., 2005]. 
Como se mencionó anteriormente, bajo estrés nutricional la -oxidación mitocondrial tiene 
como objetivo degradar los acil-CoA grasos importados desde el citosol al interior de la 
matriz mitocondrial para generar NADH y FADH2, que alimentarán a los complejos I y II de 
la cadena respiratoria, y el Acetil-CoA, que condensado con OAA forman citrato para 
incorporarse al Ciclo de Krebs y generar equivalentes reductores que serán 
posteriormente redirigidos para la síntesis de ATP [Eaton et al.,1996]. Dependiendo de la 
longitud de la cadena del ácido graso oxidado, la cantidad de moléculas de ATP puede 
variar, sin embargo se ha estimado que la oxidación del ácido palmítico rinde 
aproximadamente 120 moléculas de ATP. [Nelson y Cox 2009] 
Las reacciones relacionadas con la oxidación mitocondrial de ácidos grasos se pueden 
resumir en tres procesos: (1) Activación, (2) Transporte y (3) β-oxidación (i.e., 
degradación de ácidos grasos). Para llevarlos a cabo se requieren de enzimas 
específicas, encargadas de catalizar estas reacciones (Figura 2): 
1) Activación. Durante la activación de los ácidos grasos se requiere de un Acil-CoA 
sintetasa, encargada de incorporar un CoA-SH al extremo carboxilo de los ácidos 
grasos, dando lugar a un acil-CoA graso que será transportado al interior de la matriz 
mitocondrial. 
2) Transporte. Para el transporte del acil-CoA graso se requiere de un sistema de 
transporte formado por dos isoformas de la Carnitina Palmitoil Transferasas: CPTI y 
CPTII, ambas se encuentran adosadas a las membranas mitocondriales externa e 
interna, respectivamente [Weis et al., 1994; Clarke et al., 1981]. La CPTI, toma al 
Acil-CoA graso y le retira el Acil-CoA sustituyéndola por una amina cuaternaria 
(carnitina), que permite su fácil transporte a la matriz mitocondrial. En la matriz, la 
 
9 
CPTII toma a la carnitina y la sustituye por unCoA para regenerar el Acil-CoA graso y 
comenzar su oxidación. 
3) β-oxidación. En células de hígado y músculo esquelético se han reportado cuatro 
tipos de enzimas relacionadas con la oxidación de ácidos grasos:(A) Acil-CoA 
deshidrogenasa (ACAD). En mamíferos se han caracterizado cuatro isoformas que 
deshidrogenan específicamente ácidos grasos con diferentes longitudes de cadena 
hidrocarbonada: Acil-CoA deshidrogenasa de cadena corta (SACAD), Acil-CoA 
deshidrogenasa de cadena media (MACAD), Acil-CoA de cadena larga (LACAD) y 
Acil-CoA deshidrogenasa de cadena muy larga (VLACAD); todas ellas se encuentran 
ubicadas en la matriz mitocondrial, excepto la VLACAD que se encuentra unida a la 
cara interna dela membrana interna mitocondrial [Nelson y Cox,2009; Eaton, et al., 
1996; Izai et al., 1992; Ikeda, et al., 1985; Finocchiario, et al., 1987; Furuta, et al., 
1981]. La siguiente enzima en la vía es la (B) Enoil-CoA-hidratasa (ECH), de ella se 
han reportado dos isoformas activas en hígado de humano (también específicas 
para diferentes longitudes ácidos grasos): la Enoil-CoA-hidratasa de cadena corta 
(ECHs) y la Enoil-CoA-hidratasa de cadena larga [Hasset al.1969]. La tercer enzima 
involucrada es la (C) β-hidroxiacil-CoA-deshidrogenasa (EHHADH) encargada de 
realizar una segunda deshidrogenación en el acil graso [Uchida et al.1992] y 
finalmente, (D) la Acil CoA-acetiltransferasa (ACAA) encargada de catalizar la 
ruptura tiólica de la que se obtienen una cadena de acil graso con dos carbonos 
menos, y una molécula de AcCoA, que alimentará al Ciclo de Krebs [Gehring, y 
Repertinger 1968] 
Como se observa en la Figura 2, la finalidad de la β-oxidación mitocondrial es la obtención 
de NADH y Acetil-CoA, que posteriormente y a partir del Ciclo de Krebs generará más 
equivalentes reductores (NADH, FADH2), en conjunto serán los encargados de impulsar la 
síntesis de ATP a través de su oxidación en el Complejo 1 (Succinato ubiquinona oxido 
reductasa) y en el Complejo 2 (NADH ubiquinona oxidoreductasa) de la cadena 
transportadora de electrones, respectivamente [Eaton et al.,1996]. Por estas razones, la 
β-oxidación mitocondrial es considerada como una vía alterna para el suministro de 
energía bajo condiciones de estrés nutricional [DeBerardinis et al., 2008]. 
 
10 
Figura 2. Reacciones de la β-oxidación mitocondrial en células normales. 
(1) Activación, (2), Transporte, y (3) Oxidación de los ácidos grasos en el interior de la 
matriz mitocondrial. CPTI: Carnitina Palmitoil Transferasa I, CPTII: Carnitina 
palmitoiltransferasa II, CoA: Coenzima A, ACAD: Acetil CoA deshidrogenasa, ECH: 
EnoilCoAhidratasa, EHHADH: β-hidroxiacil-CoA-deshidrogenasa, ACAA: β-
cetoacilCoAtiolasa, CoA-SH: Acil-CoA. CK: Ciclo de Krebs. 
 
 
 
 
11 
1.6 β-oxidación mitocondrial en células tumorales 
Los reportes relacionados con la oxidación mitocondrial de ácidos grasos en células 
tumorales son escasos, y la mayoría de ellos no son concluyentes. Respecto a ello y bajo 
la suposición de que las propiedades cinéticas de la CPTI son semejantes a las de una 
célula normal, se ha reportado que en células tumorales la CPTIpodría encontrarse 
fuertemente inhibida por el malonil-CoA generado durante la activa lipogénesis tumoral 
[Thupari et al., 2001], imposibilitando la internalización de los ácidos grasos a la matriz 
mitocondrial. Desafortunadamente, en células tumorales no se ha realizado ninguna 
aproximación experimental cinética donde se haya evaluado la sensibilidad de la CPTI por 
malonil-CoA. 
En otros estudios, sólo se ha evaluado la expresión del mRNA del sistema transportador 
de ácidos grasos carnitina/acil-carnitina de la membrana plasmática (CD36/FAT) en 
células tumorales de páncreas de ratón [Tamai et al., 1998], también se ha evaluado la 
expresión del mRNA del transportador CPTI [Khasawneh et al., 2009], el cual se 
encuentra elevado lo que hace suponer que ambas enzimas son activas. Sin embargo, la 
evaluación de la expresión del transcrito no asegura que el contenido y la actividad de la 
proteína para la que codifica aumenten proporcionalmente, pues las modificaciones post-
traduccionales podrían inactivarla o inducir su degradación. Por lo tanto, el aumento en la 
expresión de los mRNA del sistema de transporte de ácidos grasos o de cualquier otro 
componente relacionado con la β-oxidación mitocondrial no es indicativo de que éstos se 
encuentren activos. 
Aunado a lo anterior, en la actualidad se ha establecido una correlación directa entre la 
oxidación de ácidos grasos libres y la proliferación celular en cáncer, pues se ha 
determinado que en carcinoma de próstata, una dieta rica en grasas disminuye la 
glucólisis tumoral induciendo una disminución en la expresión del transportador GLUT1, 
quizá esto se debe a que la glucosa no es requerida para las células tumorales 
andrógeno-dependiente (LNCaP), tal como ocurre para HCT15 y PC3 [Liu et al., 2006; 
Candler ,2003; Singh et al. 1999]. Lo anterior sugiere que la oxidación de ácidos grasos 
libres puede ser empleada como una vía alterna cuando la glucólisis no es activa. Aunque 
en éste estudio se analizó de forma indirecta la capacidad de sostener la proliferación 
 
12 
celular a partir del consumo de palmitato (C16:0), no se realizó un análisis metabólico (de 
contenidos de proteínas y flujos) para demostrar una activa β-oxidación en estas 
condiciones. Por estas razones no existen evidencias concluyentes que postulen a la β-
oxidación mitocondrial como una vía metabólica activa y capaz de suplementar de 
intermediarios como AcCoA y NADH para la subsecuente síntesis de ATP en células 
tumorales en condiciones de estrés nutricional como la hipoglucemia (Tabla 2). 
Dados los antecedentes previos, mi trabajo experimental propone un análisis global que 
demuestre que la -oxidación es activa en las mitocondrias y en las células tumorales. Lo 
anterior permitirá esclarecer vías activas en tumores que puedan en un futuro, ser 
propuestas como blancos terapéuticos [Rodríguez-Enríquez et al., 2011]. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
13 
 
 
 
 
 
 
 
Tabla 2. Evidencias experimentales de la -oxidación en células tumorales. 
β-oxidación de los ácidos grasos en tumores 
Función Producto 
evaluado 
Incremento 
(veces) 
Tipo celular Ref. 
Sistema 
transporte 
carnitina/acil-
carnitina (CPTI) 
Expresión de 
mRNA 
≈4 Hepatocarcinomas 
humano 
Walker 256, 
MelanomaG361, 
Carcinoma de 
Pulmón 
A549,Carcinoma 
Colorectal SW480, 
LeucemiaK-562, 
Cáncer 
cervicouterinoHeLa 
S3 
 
 
 
Tamai et al., 
1998 
Expresión del 
transportador de 
ácidos grasos a 
través de la 
membrana 
celular. 
Inmunohistoquímic
a para CD36/FAT 
Presenta un 
aumento 
significativo 
Células tumorales de 
páncreas de ratón 
 
 
 
 
 
Khasawneh et 
al. 2009. 
Expresión de 
CD36/FAT 
CPTI 
Expresión de 
mRNA 
3-4 Células tumorales de 
páncreas de ratón 
 
14 
CAPITULO II 
2.1 JUSTIFICACIÓN 
La hipótesis de Warburg no aplica para todos los tipos de neoplasias; evidencia 
experimental indica que diversos tumores de rápido crecimiento tanto de humanos como 
de roedor, mantienen un metabolismo mitocondrial activo. Sin embargo, no se ha 
realizado un análisis integral que evidencie a la β-oxidación como una vía capaz de 
abastecer de Acetil CoA y de equivalentes reductores, fundamentales para la síntesis de 
ATP en células tumorales que se encuentren bajo estrés nutricional. 
 
 
2.2 HIPÓTESIS 
La oxidación mitocondrial de ácidos grasos (β-oxidación) es funcional en células 
tumorales de rápido crecimiento, por lo que su funcionamiento puede mantener activa la 
proliferación de las células tumorales aún en condiciones de estrés nutricional. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
15 
2.3 OBJETIVOS 
General 
Evaluar la vía de la β-oxidación en tumores de rápido crecimiento en mitocondrias ex vivo 
(AS-30D) e in situ (AS-30D y HeLa). 
Particulares 
En mitocondrias aisladas de hepatoma AS-30D (Sistema ex vivo): 
1. Determinar los niveles de expresión de las enzimas de la β-oxidación (Carnitina 
palmitoil transferasa (CPTI), Acil-CoA deshidrogenasa de cadena corta (SACAD), 
Enoil-CoA hidratasa de cadena corta (ECHS1), Enoil 3-hidroxiacil-CoA 
deshidrogenasa (EHHADH). 
2. Determinar la velocidad de oxidación de ácidos grasos de cadena larga y mediana 
3. Determinar los objetivos 1 y 2 en mitocondrias de hígado de rata sana (RLM; Rat 
Liver Mitochondria). 
En mitocondrias in situ de células AS-30D y células HeLa (Sistema in situ): 
1. Determinar el consumo de ácidos grasos libres en células de hepatoma AS-30D y 
HeLa a tiempos cortos (60 min). 
2. Determinar la dependencia del crecimiento de HeLa a la oxidación de diferentes 
ácidos grasos. 
3. Evaluar el contenido de las enzimas de la β-Oxidación (Carnitina palmitoil 
transferasa (CPTI), Acil-CoA deshidrogenasa de cadena corta (SACAD), Enoil-
CoA-hitratasa de cadena corta (ECHS1), Enoil-3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa 
(EHHADH).en células de hepatoma AS-30D y HeLa. 
 
 
16 
CAPÍTULO III 
 
3. MATERIALES Y MÉTODOS 
 
3.1 Propagación del hepatoma AS30D 
Se inocularon intraperitonealmente ratas hembras de la cepa Wistar con un peso 
aproximado de 250-280 g. con 1x109 células/mL de hepatoma AS-30D [Rodríguez-
Enriquez et al. 2000; Marín-Hernández et al. 2006]. Al final de 5-6 días de crecimiento se 
obtuvieron 60mL de hepatoma con una densidad celular de 1x109células/ mL [Rodríguez 
Enríquez et al., 2000] 
3.2 Asilamiento de células y mitocondrias de hepatoma AS-30D 
Las células se aislaron de acuerdo con la técnica estandarizada y descrita por [Rodríguez-
Enríquez et al., 2000).Una vez extraídas, las células fueron lavadas con medio NKT (NaCl 
150mM, KCl 5mM, Tris 10mM, pH 7.5 con KOH), y se centrifugaron (2,000 rpm) durante 
10 minutos a 4°C. El botón celular se resuspendió en medio SHE (Sacarosa 250mM, 
HEPES 9mM, EGTA 1mM, pH 7.3 con KOH). La obtención de mitocondrias se realizó 
permeabilizando con digitonina (10µg/mg de proteína) y albúmina sérica bovina (0.4%) en 
medio SHE en agitación suave y constante por 3 minutos. Posteriormente, la fracción 
celular se diluyó con medio SHE y se centrifugo a 2,500 rpm por 10 minutos. El botón 
celular se resuspendió en 75 mL de medio SHE, se homogeneizó y se centrifugó a 2,500 
rpm por 5 minutos. El sobrenadante recolectado (aproximadamente 200mL) se centrifugó 
a 9,500 rpm durante 10 minutos a 4°C. El botón mitocondrial resultante se incubó con 
0.1% de BSA deslipidada y 1mM de ADP por 10 minutos. La reacción se detuvo con 
medio SHE frío, y el sobrenadante se centrifugó a 9,500 rpm durante 10 minutos. Al botón 
mitocondrial resultante se le determinó proteína por el método de Biuret [Gornall et al. 
1949]. 
 
 
 
17 
3.4 Aislamiento de mitocondrias de hígado de rata (RLM) 
De una rata hembra sana de la cepa Wistar con un peso de entre 250-280 g se extrajo el 
hígado y se cortó en fragmentos pequeños empleando medio SHE [Marín-Hernández et 
al., 2006]. Posteriormente se homogeneizó en hielo y se centrifugóa 2,500 rpm por 10 
minutos a 4°C, el sobrenadante se filtró con una gasa y se centrifugó a 9,800 rpm durante 
10 minutos a 4°C, el botón mitocondrial se resuspendió en SHE y se incubó con 0.1% de 
BSA deslipidada y 1mM de ADP, por 10 minutos en hielo. La reacción se detuvo con 
40mL de medio SHE frío y se centrifugó a 9,800 rpm durante 10 min a 4°C. El botón 
mitocondrial se resuspendió en 300 μL de medio SHE y se cuantificó proteína total de las 
mitocondrias por el método de Biuret. 
 
3.5 Cuantificación de proteína 
Se realizó empleando el método de Biuret a partir de 100µL de CuSo4 (1%), 50µl de DOC 
(0.4%), 2mL de NaOH (10%) y 800µL (H2O destilada) [Gornall et al. 1949]. Se tomaron 
10-20μL de muestra (células o mitocondrias) y se determinó el contenido de proteína a 
540nm en un espectrofotómetro (Turner 340, USA). Se normalizó a una curva estándar de 
albúmina sérica bovina (0-2mg/mL). 
 
3.6 Determinación y cálculo de los flujos de oxidación de ácidos carboxílicos, 
ácidos grasos de cadena media y larga 
El consumo mitocondrial de oxígeno se realizó polarográficamente a una temperatura de 
37°C con un electrodo tipo Clark (YSI, Yellow Springs) en 1.9mL de medio KME (KCl 
120mM, MOPS 20mM y EGTA 0.5mM, pH 7.2 con KOH) saturado con aire en presencia 
de 1 mg/mL de proteína mitocondrial y 2 mM de H2PO4. Como sustrato control se utilizó 
5mM de Glutamato en ambos tipos de mitocondrias [Rodriguez-Enriquez et al., 2000] y 
5mM ó 0.1mM de malato para RLM y AS-3OD, respectivamente. Los sustratos empleados 
para la β-oxidación, fueron octanoato 5mM y carnitina 0.1mM, octanoil DL carnitina 
0.1mM, palmitoil DL carnitina 0.05mM y propionil DL carnitina0.5mM. 
 
18 
El cero químico se obtuvo por la reducción de oxígeno en la cámara del oxímetro con 
ditionita. 
Para calcular la velocidad de oxidación de los ácidos grasos oxidados se consideró que a 
la altura de la Ciudad de México a 37°C se encuentran 380 nanogramos átomos de 
Oxígeno (ngAtO) por mL de KME. 
A partir de lo anterior se determinó la velocidad de los diferentes estados mitocondriales: 
(1) pseudo-estado 4 (pEdo 4) que representa la oxidación del sustrato en presencia de Pi 
y ADP endógeno (2) Estado 3 (Edo 3), que representa la máxima velocidad de oxidación 
de los sustratos estimulada por la adición de ADP (600nmoles), y (3) el Estado 4 (Edo 4) 
que representa la oxidación del sustrato en presencia de Pi y ADP exhausto. [Nicholls, 
1987] (Figura 3). El cociente del estado 3 entre el estado 4 determina el grado de 
acoplamiento de las mitocondrias es decir, su estado energético funcional (control 
respiratorio). 
 
 
19 
 
Figura 3. Trazo representativo de la oxidación mitocondrial de sustratos en mitocondrias 
aisladas. La figura representa el Pseudoestado 4 (PseudoEdo4), el Estado 3 (Edo3) y el 
Estado 4 (Edo4) a través del tiempo. 
 
 
 
 
 
20 
3.7 Cultivo y propagación de la línea celular HeLa. 
Las células HeLa fueron obtenidas del American Type Culture Collection (ATCC) y se 
cultivaron en cajas petri de 60x15 mm (Sarstedt,Alemania) con una alícuota inicial de 
1x106 células por caja en 15 mL de medio DMEM (Dubelcco´s Modified Eagle´s Medium) 
suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) (GIBCO, USA) y 10 unidades de 
ampicilina/ estreptomicina, 25mM de Glucosa y 4mM de Glutamina. Las células fueron 
incubadas a 37°C y 5% de CO2, con recambios de medio fresco cada 48 horas. 
Una vez alcanzado el 80-90% de confluencia, las células se cosecharon para 
posteriormente ser resembradas en cajas petri grado cultivo celular de 150x20mm 
(Sarstedt, Alemania), y así obtener biomasa (16x106cells/mL) suficiente para poder 
realizar los experimentos que a continuación se describen. 
3.7.1 Generación de curvas de crecimiento. 
Las células HeLa previamente cultivadas se desprendieron de la superficie adherente con 
3mL de 0.25% tripsina/EDTA(GIBCO,USA), la reacción de la tripsina se detuvo con Buffer 
de fosfatos (PBS) a temperatura ambiente y pH 7.2. Las células se centrifugaron a 2,500 
rpm durante 5 minutos y se retiró el sobrenadante, el botón celular fue resuspendido en 
1mL de DMEM. Las células fueron contadas con de una cámara de Neubauer, y se 
calculó el número de células contenidas en 1mL de medio DMEM. A partir de una alícuota 
equivalente a 50x103células se resembraron cajas petri de 60x15mm con 5mL de medio 
DMEM. Después de 8 horas de cultivo se retiró el medio y se suplementó por medio con 
las condiciones descritas en la Tabla 3. 
Tabla 3. Condiciones para las curvas de crecimiento en HeLa. 
 
1. DMEM 25mM Glucosa + 4mM Glutamina (Control) 
2. DMEM 25mM Glucosa + 4mM Glutamina + 0.1-5mM Octanoato 
3. DMEM sin Glucosa + 4mM Glutamina (Control) 
4. DMEM sin Glucosa + 4mM Glutamina + 0.1-5mM Octanoato 
 
 
21 
Cada 24 horas se contó el número de células contenidas en cada condición hasta 
completar un total de 96 horas en donde se determinó la viabilidad celular empleando el 
método de exclusión por azul tripano [Rodríguez-Enríquezet al., 2006].Para la elaboración 
de la curva de crecimiento se empleo el software OriginPro 8©. Los tiempos de 
duplicación y número de generaciones se determino de acuerdo con [Davis y McAteer, 
1994]. 
3.8 Preparación de las muestras de hepatoma AS-30D y HeLa a diferentes tiempos 
de incubación para cromatografía de gases 
 
3.8.1 Tiempos cortos (consumo de ácidos grasos en minutos) 
Las células de hepatoma AS-30D y HeLa se cosecharon después de 5 días de ser 
inoculadas y hasta alcanzar una confluencia del 80-90% en cultivo. Posteriormente, las 
células se lavaron y se incubaron en 2mL de medio Ringer-Krebs (pH 7.4) en agitación 
orbital a 150 rpm y 37°C. Se tomaron dos alícuotas equivalentes a 4mg/mL de proteína, a 
los 5 minutos (t0) y 60 minutos (t60); y se adicionó butil-hidroxi-tolueno (BHT) al 0.002%, 
las muestras se congelaron a -20°C hasta su uso [El-Hafidi et al 2004., 2011; Díaz-
Almeyda et al., 2011]. 
3.8.2 Tiempos largos (consumo de ácidos grasos en días durante proliferación 
celular) 
Debido a que las células de AS-30D no se pueden crecer en cultivo celular, éste objetivo 
fue determinado en células de HeLa. El consumo de diferentes ácidos grasos se registró 
durante la fase de latencia (48 h) y la fase de proliferación celular (108h). Las células de 
cada fase de crecimiento se cosecharon y concentraron en 1mL de medio Ringer-Krebs 
más butil-hidroxi-tolueno (BHT) al 0.002% (v/v), posteriormente se congelaron a -20°C 
hasta su uso. 
 
 
 
22 
3.9 Cuantificación de ácidos grasos libres (AGL) 
La determinación de los AGL en tiempos cortos y largos se realizó siguiendo la 
metodología propuesta por [El-Hafidi et al., 2011]. La extracción de los ácidos grasos se 
realizó utilizando una mezcla orgánica 2:1 de cloroformo-etanol. Posteriormente, la 
muestra se concentró en una atmósfera de N2 puro y se disolvió en una solución de 
H2SO4/metanol 2%. Las muestras de 10µL se inyectaron en una columna polar acoplada 
a un cromatógrafo de gases (Shimadzu, Japón). Con una velocidad de corrida de 0.52-
0.72cm/min por 25 min. Los cromatogramas obtenidos de los diferentes AGL se 
compararon con el cromatograma del estándar interno ácido mirístico (C17:0) que se 
añadió a una concentración final de 20 g. El análisis y obtención de los espectros de 
absorción de los diferentes AGL se realizó con ayuda del Dr. Mohammed El Hafidi del 
Dpto. de Medicina Cardiovascular del Instituto Nacional de Cardiología Ignacio Chávez. 
Para la cuantificación del contenido de los diferentes AGL, se determinaron las áreas bajo 
la curva de cada cromatograma, utilizando la siguiente expresión matemática: 
 
 
3.10 Extracción y procesamiento de proteínas de la β-oxidación por Western Blot 
Alícuotas de 40 mg/mL de RLM, y de mitocondrias aisladas de hepatoma AS-30D, así 
como de células de hepatoma AS-30D y HeLa se incubaron en 100 µL de buffer de lisis 
RIPA (PBS 1x pH7.2, IGEPAL-NP 40 1%, SDS 25%, desoxicolato de sodio 0.05%) más 
100µM PMSF y se homogeneizaron mecánicamente utilizando jeringas de insulina. 
Posteriormente, las muestras se centrifugaron a 10,000rpm durante 30 minutos a 4°C. El 
botón celular se diluyó en buffer de carga que contiene azul de Coomasie y 5% β-
mercaptoetanol y se hirvió durante 3 minutos. Se cargaron 40g/mL de proteína en geles 
de poliacrilamida al 12.5 % en un equipo de electroforesis (BioRad,CA, USA). 
 
23 
Las proteínas fueron transferidas (297mA, 15 volts, 30min) a una membrana de PVDF 
(BioRad, CA, USA) y se bloquearon en una solución TBS 1X (TBS 10X: Tris-HCl 5M pH 
7.5 y NaCl 1.5M), con leche libre de grasa (5%) y Tween-20 (1%) durante una hora. Y se 
incubó por 12horas con el anticuerpo monoclonal primario específico para cada una de las 
siguientes proteínas con su respectiva dilución: CPTI (1:200), ACAD3 (1:200), ECHS1 
(1:200), EHHADH (1:200), NDI (1:1000), y α-Tubulina (1:1000) (Santa Cruz 
Biotechnology, CA, USA). 
Posterior a la incubación con el anticuerpo primario se realizaron lavados de las 
membranas en una solución de TBS 1X con 500μL de Tween-20, con recambio del buffer 
cada 15 minutos durante una hora. A continuación las membranas se incubaron con su 
anticuerpo secundario correspondiente a temperatura ambiente y con agitación suave 14-
16rpm y se realizaron lavados con una solución de TBS 1X con 500μL de Tween-20 
durante hora y media con recambios de la solución cada 10 minutos. Al finalizar los 
lavados se les agregó la solución de quimioluminiscencia (GE, USA) y se reveló en placas 
fotográficas (KODAK, USA). 
El análisis densitométrico se llevo a cabo sobre las bandas reveladas con ayuda del 
programa ScionImage para Windows [Gallardo-Pérez et al.,2009]. 
 
 
24 
CAPITULO IV 
 
4. RESULTADOS. 
Modelo Ex vivo 
Determinación del contenido de algunas enzimas involucradas en la β- oxidación en 
mitocondrias aisladas 
En la figura 4 se muestra el contenido de proteínas de la -oxidación en mitocondrias de 
hígado y del hepatoma AS-30D. Como control de carga se empleó al complejo I de la 
cadena respiratoria (ND1) cuyo contenido al parecer es similar en ambos tipos de 
mitocondrias. La densitometría de cada proteína se comparó con la ND1 que 
correspondió al 100%. El contenido de la Carnitina palmitoil tranferasa I (CPTI), 
transportador reportado como el controlador en la oxidación mitocondrial de ácidos grasos 
en células cardíacas y musculares [Eaton et al., 2002] fue mayor (4 veces) en 
mitocondrias de hepatoma AS-30D que en mitocondrias de hígado de rata (RLM). De 
manera similar, el contenido del resto de las enzimas de la β-Oxidación mitocondrial 
(SACAD, ECHS1 y EHHADH) también fue mayor (2 veces) en las mitocondrias del 
hepatoma AS-30Dvs hígado de rata (RLM). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
25 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4.Contenido proteico del transportador y de las enzimas involucradas en la β-
Oxidación en mitocondrias aisladas de Hepatoma de roedor AS-30D y mitocondrias 
aisladas de hígado de rata. 
(A) Imagen representativa de 3 experimentos independientes. (B) Análisis densitométrico. 
Abreviaturas: CPTI: Carnitina palmitoil transferasa I, SACAD: Acil Co A deshidrogenasa, 
ECHS1: Enoil CoA hidratrasa, EHHADH: 3-hidroxiacil CoA deshidrogenasa. Como interno y 
para normalizar el análisis se utilizó ND1. α-Tubulina fue empleada como control negativo de 
mitocondrias aisladas. Análisis estadístico: t-Student, diferencia significativa para CPTI y 
SACAD en AS-30D (M) vs RLM.*P<0.05. 
 
 
26 
Consumo de oxígeno mitocondrial en presencia de sustratos de la β-oxidación, 
ácidos carboxílicos y malato en mitocondrias aisladas de AS-30D y RLM 
Debido a que el contenido de proteína no es indicativo de la actividad de la enzima y en 
consecuencia de la actividad de toda la vía, se evaluó la velocidad de respiración 
mitocondrial sostenida por sustratos de la β-oxidación y se comparó con la respiración 
mitocondrial sostenida por sustratos del Ciclo de Krebs como glutamato, sustrato que es 
altamente consumido por las mitocondrias de hígado [Quagliarello et al., 1965]. 
Oxidación de Malato.- En mitocondrias de hígado, la adición de malato acelera la 
oxidación de los demás sustratos externos (piruvato, glutamato, α-cetoglutarato, FFA, 
etc). En ausencia de sustratos externos, el malato es pobremente oxidado (Tabla 4) aún 
en concentraciones altas (5mM). Por el contrario, en diferentes tipos de tumor, la enzima 
málica que oxida malato a piruvato es muy activa comparada con hígado enmascarando 
la oxidación de los otros sustratos externos (Moreadith, et al. 1984; Rodríguez-Enríquez et 
al., 2011). Por lo anterior, se encontró que la mínima concentración de malato requerida 
para impulsar la oxidación de otros sustratos exógenos (Tabla 4) en tumores es 0.1 mM. 
Concentraciones mayores de 0.5 mM de malato aumentan el Edo 3 respiratorio más del 
50%.Tanto 0.1 mM (AS-30D) como 5 mM (RLM) no estimulan el Edo. 3 mitocondrial, 
indicativo de que el malato no se oxida a estas concentraciones pero que puede impulsar 
la oxidación del resto de sustratos oxidables. 
Oxidación de ácidos carboxílicos, ácidos grasos de cadena media y larga.-En la 
Tabla 5 se muestra el consumo de diferentes ácidos grasos en mitocondrias de aisladas 
de AS-30D y RLM. En ambos tipos de mitocondrias, tanto el Estado 3, como los Estados 
4 y pseudoedo 4 fueron similares en presencia de octanoil DL-carnitna, y octanoato DL 
carnitina lo que indica que las enzimas encargadas de llevar a cabo la oxidación de ácidos 
grasos, también se encuentran activas en mitocondrias tumorales. 
 
27 
Tabla 4.Oxidación de Malato en Mitocondrias aisladas de AS30D y en Mitocondrias 
aisladas de Hígado de Rata. 
 
 
 
 
 
 
ND, No determinado; CR, control respiratorio, n: representa el número de experimentos 
realizados 
Malato (AS-30D: 0.1mM/ RLM: 5mM) 
Mitocondria pseudoEdo 4 Edo 3 Edo 4 CR ADP/O n 
ng•AtO•min•mg-1 
AS-30D 30±12 32.5±27 26±12 1.2±0.4 ND 7 
RLM ND 28±10 12±3 2.6±0.6 ND 6 
 
28 
Tabla 5. Oxidación de ácidos carboxílicos, ácidos grasos de cadena media y larga, en 
mitocondrias aisladas de hepatoma AS-30D y mitocondrias aisladas de hígado de rata 
(RLM). 
CR, control respiratorio, n: representa el número de experimentos realizados 
 
 
Propionil DL carnitina 0.5 mM + Mal (AS-3D: 0.1/RLM: 5mM) 
Mitocondria pEstado 4 Estado 3 Estado 4 CR ADP/O n 
ng•AtO•min•mg-1 
AS-30D 26 ± 0.3 149 ± 35 37 ± 7 4 ± 0.2 2.3 ± 0.1 3 
RLM 47 138 36 4 2.1 2 
Octanoato0.05 mM + carnitina0.1 mM + Mal(AS-30D: 0.1mM/ RLM: 5mM) 
AS-30D 36 100 46 2.1 1.9 1 
RLM 31.5 90 40 2.3 1.3 2 
Octanoil DL carnitina0.1 mM +Mal(AS-30D: 0.1mM/ RLM: 5mM) 
AS-30D 52 ± 5 154 ± 10 58 ± 29 3.2 ± 1.3 2.2±0.25 3 
RLM 51± 10 120 ± 35 34 ± 5 3.4 ± 0.7 1.7 ± 0.2 3 
Palmitoil DL carnitina0.05 mM +Mal(AS-30D: 0.1mM/ RLM: 5mM) 
AS-30D 54 ± 25 103 ± 24 61 ± 32 2.1 ± 1.3 2.6 ± 0.5 5 
RLM 57 ± 19 150 ± 56 39 ±21 4.3 ± 2 1.7 ± 0.1 4 
 
29 
Modelos In situ 
Determinación del contenido proteico en células de hepatoma AS-30D y HeLa 
Como una primera aproximación para dilucidar el estado de la β-oxidación en células 
tumorales, se realizó la determinación del contenido proteico del transportador de grupos 
acil graso y de las enzimas encargadas de catalizar las reacciones de ésta vía. Tanto en 
células tumorales de rata como de humano, se determino un gran contenido para las 
enzimas: CPTI, SACAD y EHHADH, sin embargo el contenido de la ECHS1 se encontró 
en menor proporción que el resto de las enzimas (Figura 5). Una vez establecido el perfil 
del contenido proteico para la enzimas de la β-oxidación se determinó el contenido de 
ácidos grasos en ambos tipos de mitocondrias en tiempos cortos (minutos) debido a que 
se ha reportado que algunos metabolitos como glucosa, glutamina y cuerpos cetónicos 
son activamente consumidos por las célulastumorales (Rodríguez-Enríquez et al., 2001). 
 
Determinación de ácidos grasos libres endógenos en células de hepatoma AS-30D 
y HeLa a tiempos cortos (0-60 min) 
Para demostrar que las mitocondrias in situ en hepatoma AS-30D son capaces de oxidar 
sus ácidos grasos endógenos, se determinó el contenido de diferentes ácidos grasos a 
tiempos cortos (0-60min) por cromatografía de gases (Figura 6) en células aisladas de 
AS-30D [El Hafidi et al., 2004; Díaz-Almeyda et al., 2011] utilizando como estándar interno 
al ácido margártico (C:17:0). Como AS-30D es un modelo de tumor animal y podría no 
reflejar la fisiología de un tumor sólido, en paralelo se determinó el contenido de los 
ácidos grasos endógenos en células de tumor humano de HeLa. La concentración de los 
ácidos grasos saturados e insaturados disminuyó 2 veces después de 60 minutos de 
incubación (Tabla 6). 
 
 
30 
 
Figura 5. Contenido proteico del transportador y de las enzimas involucradas en la 
β-Oxidación en células de hepatoma de roedor AS-30D y células HeLa. 
(A) Imagen representativa de 3 experimentos independientes. (B) Análisis 
densitométrico. Abreviaturas: CPTI: Carnitina palmitoil transferasa I, SACADs: 
Acil Co A deshidrogenasa, ECHS1: Enoil CoA hidratrasa, EHHADH: 3-hidroxiacil 
CoA deshidrogenasa.; como control interno y para normalizar el análisis 
densitométrico se utilizó α-Tubulina. Análisis estadístico: T-student P<0.05 vs α-
Tubulina. 
 
 
A B 
 
31 
 
Figura 6. Cromatograma representativo de los espectros de absorción de diferentes 
ácidos grasos obtenidos a partir de la cromatografía de gases. 
 
32 
Tabla 6. Contenidos de ácidos grasos endógenos saturados e insaturados cuantificados 
en células de hepatoma AS-30D y HeLa después de 60 minutos de incubación. 
 AS-30D HeLa 
Ac. Graso t0(min) t60(min) t0(min) t60(min) 
nmol/mg prot 
 
Ácidos grasos 
saturados 
Mirístico 14:0 ND 0.5±0.2 5±4 3.3±2 
Palmítico 16:0 ND 0.4±0.2 41±5 20.5±13* 
Esteárico 18:0 10±0.21 0.65±0.5 3±0.6 1.5±0.4 
 
 
Ácidos grasos 
insaturados 
Palmitoléico 16:1(ω-
7) 
41±12 3±1* 109±21 35±8* 
Oléico 18:1(ω-9) ND ND 16±0.4 7±3* 
Vaccénico 18:1(ω-7) 0.06±0.03 ND 0.4±0.1 0.1±0.0* 
Linoléico 18:2(ω-3) 0.8±0.1 0.2±0.1* 5±1 3±0.4* 
Araquidónico20:4 (ω-
6) 
2.1±1.2 0.3±0.2 11±5 2.3±0.4* 
ND=No detectados;ω=posición de la insaturación más cercana al metilo terminal;n=3. 
T-Student *P<0.05 vs t60 
 
33 
Determinación de ácidos grasos libres endógenos en células de Hela durante la 
fase de latencia y proliferativa 
Las células tumorales de humano y de roedor fueron capaces de consumir ácidos grasos 
libres que podrían ser utilizados en el suministro de ATP [Garber et al., 2006] para 
sostener procesos de alta demanda energética, fenómenos de transporte y homeostasis 
celular, y proliferación celular [Simopoulos 1991]. Para establecer una correlación entre el 
consumo de ácidos grasos libres en la célula tumoral y un proceso de alta demanda 
celular como la proliferación celular, se realizaron curvas de crecimiento de la línea celular 
de cáncer cérvico-uterino (HeLa) durante 144 horas (Figura 7). AS-30D no se utilizó 
debido a su dificultad para crecer en cultivo en monocapa (Rodríguez-Enríquez et al., 
2001). En la curva de crecimiento se identificaron la fase de latencia de las 24h a las 48h 
y la fase proliferativa de las 72h a las 100h. De cada fase de crecimiento se obtuvieron 
muestras para (1) la determinación de los contenidos de proteínas de la -oxidación 
(Figura 8) y (2) la extracción de ácidos grasos libres (Tabla 7). Se determinó un aumento 
significativo de 3 veces en el contenido de CPTI y de 5-9 veces en el contenido de las 
enzimas ECHS1, SACAD y EHHADH en la fase proliferativa vs la fase de latencia, lo que 
indica que durante los procesos de duplicación celular y activación del ciclo celular se 
requiere de un aporte substancial de ATP [Carracedoet al. 2013], provisto aparentemente 
por la activación de la -oxidación. En paralelo se determinaron los contenidos de algunos 
ácidos grasos libres en ambas etapas de crecimiento. El análisis de los cromatogramas 
similares al de la Figura 6 muestran una disminución y un presumible consumo de ácidos 
grasos saturados de cadena larga como el mirístico (14:0), palmítico (16:0) y esteárico 
(18:0), tal como se muestra en la Tabla 7. No obstante, durante la fase proliferativa se hay 
un aumento en la concentración de los ácidos grasos insaturados como el palmitoléico 
(16:1 ω-7), oléico (18:1 ω-9), γ-Lioléico (18:3 ω-3) y Araquidónico (20:4 ω-6), llamando 
nuestra atención principalmente en los ω6, involucrados en la biosíntesis de membranas 
celulares [Simopoulos et al. 1991] 
 
 
100hrs 
 
34 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7. Curva de crecimiento HeLa en condiciones óptimas de cultivo, 25mM de 
glucosa y 4mM de glutamina. Las flechas indican el tiempo de recolección de las 
muestras para la determinación de ácidos grasos libres y el contenido de proteínas de la 
β-Oxidación, fase de latencia (48h) y fase proliferativa (100h) 
 
48hrs 
(h) 
 
35 
 
 
Figura 8.Contenido proteico del transportador y de las enzimas involucradas en la 
β-Oxidación en células HeLa en fase de latencia (L) y fase proliferativa (P). 
(A) Imagen representativa de 3 experimentos independientes. (B) Análisis densitométrico. 
Abreviaturas: CPTI: Carnitina palmitoil transferasa I, SACAD: Acil-CoA deshidrogenasa, 
ECHS1: Enoil-CoA hidratrasa, EHHADH: 3-hidroxiacil CoA deshidrogenasa. Como control 
interno y para normalizar el análisis densitométrico se utilizó α-Tubulina. Análisis 
estadístico: t-Student diferencia significativa para SACAD, ECHS1 y EHHADH en fase 
proliferativa vs fase de latencia, P*<0.05, n=3. 
 
A B 
L 
 
36 
Tabla 7. Concentraciones de ácidos grasos endógenos saturados e insaturados en 
células HeLa en fase de latencia (48h) y en fase proliferativa (100h). 
 HeLa 
 Latencia 
(48h) 
Proliferativa 
(100h) 
nmol/mg prot 
 
Ácidos grasos 
saturados 
Mirístico 14:0 5.5±2 0.4±0.1* 
Palmítico 16:0 50±13 3.5± 1.5* 
Esteárico 18:0 1.8±0.5 0.4 ±0.1 
 
 
Ácidos grasos 
insaturados 
Palmitoléico 16:1 
(ω-7) 
22±15 35±12 
Oléico 18:1 (ω-9) 38±13 55±15 
Vaccénico 18:1(ω-
7) 
27±12 28 ±10 
Linoléico 18:2 (ω-3) 11± 3 5± 0.4* 
γ-Linoléico 18:3 (ω 
3) 
2.4± 1 18±0.6 
 Araquidónico20:4 
(ω-6) 
7± 3 14±2* 
ND=No detectados;ω= posición de la insaturación más cercana al metilo terminal n=3.t-
Student. *P0.05. 
 
37 
Efecto del octanoato sobre el crecimiento de las células de tumor humano HeLa. 
Para dilucidar el efecto de algunos ácidos grasos exógenos sobre el crecimiento de 
células tumorales de HeLa se realizaron curvas de crecimiento en presencia de diferentes 
concentraciones de octanoato (0.1, 0.5, 1 y 5 mM) en dos medios: (1) Uno enriquecido 
con glucosa (25 mM) y 4mM de glutamina, es decir un medio con fuente glucolítica y 
mitocondrial de energía; y (2) otro en ausencia de glucosa y 4mM de glutamina, es decir 
un medio con sólo una fuente mitocondrial. Como se observa en la Figura 9A, en 
presencia de glucosa y octanoato: 0.1 y 0.5 mM la velocidad de proliferación celular 
disminuye ligeramente, mientras que en presencia de glucosa y octanoato: 1 y 5 mM, la 
velocidad de crecimiento disminuye abruptamente. Debido a que HeLa es una línea 
tumoral altamente dependiente del metabolismo mitocondrial, es decir, más del 90% del 
ATP proviene de la mitocondria para procesos de proliferación celular (Rodríguez-
Enríquez et al., 2006), el octanoato podría estar actuando como un desacoplante 
mitocondrial disminuyendo el aporte de ATP, en consecuencia la proliferación del tumor 
se ve afectada negativamente (ver fotografías de la derecha de la Figura 9). De hecho, la 
viabilidad celular en presencia de concentraciones crecientes de octanoato 0.1, 0.5, 1 y 5 
mM fue del 60-70% en r, comparado con el 98% observado en la condiciónsin octanoato. 
En ausencia de glucosa externa y como está reportado, las células de HeLa no proliferan 
debido a que la oxidación de la glucosa es esencial para suministrar esqueletos 
carbonados para la síntesis de ATP citosólico, aminoácidos, fosfolípidos, ribosa fosfato, 
glicosilación de proteínas, y síntesis de serina (Rodríguez-Enríquez et al., 2006; Christofk, 
et al., 2008; Locasale et al., 2011; Vander Heiden et al., 2010; Hitosugi, 2012). El 
octanoato a concentraciones de 0.1, 0.5 y 5 mM no recuperaron la proliferación de HeLa. 
Sin embargo, el octanoato a 1mM en ausencia de glucosa (Figura 10) fue capaz de 
recobrar el estatus proliferativo de HeLa incrementando el número de generaciones por 
día (de 1.2±0.4 a 2.09±0.9 en 0 y 1 mM octanoato, respectivamente). Actualmente se 
están realizando experimentos para dilucidar porqué el octanoato deja de comportarse 
como un desacoplante para actuar como un sustrato del metabolismo mitocondrial y así 
sostener la proliferación tumoral, en ausencia de glucosa. 
 
 
38 
 
Figura 9.Efecto del octanoato sobre el crecimiento de HeLa en condiciones enriquecidas 
con glucosa 25 mM. A la derecha se muestran micrografías de las células a las 96 h de 
cultivo. Barra=100µm 
 
39 
 
Figura 10.Efecto del octanoato sobre el crecimiento de HeLa en ausencia de glucosa. A la 
derecha se muestran micrografías de las células a las 96 h de cultivo. Barra=100µm 
 
40 
Determinación del contenido de las enzimas de la β-oxidación mitocondrial en 
células de HeLa en presencia y ausencia de octanoato 
Una vez identificado el efecto del octanoato sobre el crecimiento de las células Hela en 
condiciones sin glucosa, se analizó el nivel de enzimas de la β-oxidación mitocondrial por 
Western Blot y se comparó con los niveles de las proteínas en condiciones control 
(glucosa 25mM) y en ausencia de glucosa y octanoato (Figura 10) a las 96 h. En ausencia 
de glucosa, no se encontró señal de las proteínas de la -oxidación, excepto para la 
EHHADH cuyo nivel fue muy bajo comparado con la condición control con glucosa 25mM. 
Sin embargo, la adición de octanoato 1 mM en ausencia de glucosa promovió que el nivel 
de CPTI, enzima encargada del transporte de ácidos grasos al interior de la mitocondria, y 
de las SACAD y EHHADH, enzimas involucradas en 2 deshidrogenaciones del ácido 
graso y con la formación de FADH2 y NADH, aumentaran de 2 a 7.5 veces, comparado 
con la condición en ausencia de glucosa (Figura 11).Lo anterior puede sugerir que antes 
de 96 h, el octanoato induce un aumento en los niveles de las proteínas de la β-oxidación, 
promoviendo su internalización y quizá oxidación para el abastecimiento de ATP 
requerido en la duplicación del tumor. 
 
 
 
 
41 
 
Figura 11.Contenido proteico del transportador y de las enzimas involucradas en la β-
Oxidación en células HeLa bajo condiciones: Glucosa 25mM (+Glu), Sin Glucosa (-Glu) y Sin 
Glucosa+ 1mM Octanoato (-Glu+1mMOct). 
(A)Imagen representativa de 3 experimentos independientes (B) Análisis densitométrico. 
Abreviaturas: Carnitina palmitoil transferasa I (CPTI), Acil Co A deshidrogenasa (SACAD), la 
Enoil-CoA-hidratrasa (ECHS1) y la 3 hidroxiacil-CoA deshidrogenasa (EHHADH). Como control 
interno y para normalizar el análisis densitométrico se utilizó α-Tubulina. Análisis estadístico: t-
Student diferencia significativa para CPTI, ECHS1 y EHHADH en -Glu vs+Glu, P*<0.05, n=3 
0 24 48 72 96 120 144
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
1
x
1
0
6
 c
é
lu
la
s
Dias de Cultivo (hrs)
 S/Glucosa
 S/Glucosa+Octanoato1mM
 
 
42 
CAPÍTULO V 
DISCUSIÓN 
Una de las principales características en células tumorales es su excesiva proliferación, la 
cual representa un gasto energético muy alto. En condiciones de estrés nutricional, como 
es la privación de glucosa (hipoglucemia), fuentes de carbono mitocondriales como la 
oxidación de glutamina, glutamato y cuerpos cetónicos pueden abastecer la poza de ATP 
[Rodríguez-Enríquez et al., 2006]. En este estudio, se evidencia que la administración de 
ácidos grasos como una fuente alterna de energía puede abastecer del ATP requerido 
para la duplicación de las células tumorales. En órganos aeróbicos como hígado, cerebro 
y músculo esquelético la β-Oxidación mitocondrial proporciona una gran cantidad de 
equivalentes reductores como NADH y FADH2, así como de AcCoA contribuyendo en 
gran medida a la síntesis de ATP [Carracedoet al.2013]. Por ser una vía capaz de proveer 
de abundantes cantidades de AcCoA y de equivalente reductores, es posible predecir que 
en células tumorales esta vía también se encuentre activa. En tumores sólidos, la 
inestable y caótica red de vasos capilares que se generan durante el crecimiento del 
tumor, promueven que el suministro de glucosa y oxígeno no sea constante en el 
microambiente tumoral; por tanto, los ácidos grasos provenientes de la dieta así como de 
los que se encuentran almacenados intracelularmente (lipid droplets), podrían ser una 
potencial fuente de energía encargada de alimentar las funciones dependientes de ATP 
en las células tumorales[Carracedo et al. 2013; Hamilton et al., 1999] 
Las mitocondrias aisladas de hepatoma AS30D tienen altos niveles de proteínas 
funcionales de la -oxidación 
La mayoría de los estudios metabólicos realizados sobre células tumorales pretenden 
relacionar la actividad enzimática con la sobreexpresión de mRNA (qPCRo microarreglos) 
con el aumento de los contenidos proteicos (Western blot), desafortunadamente estas 
técnicas no aseguran que las enzimas analizadas se encuentren activas; por ello es 
necesario acompañarlas con la determinación de la velocidad de flujo y/o por la 
determinación de las concentraciones de los metabolitos en estado estacionario [Moreno-
Sánchez et al., 2007; Moreno-Sánchez et al., 2009], de tal forma que los resultados 
 
43 
obtenidos por un análisis indirecto se vean robustecidos con la determinación de las 
actividades enzimáticas correspondientes. 
En el modelo ex vivo (mitocondrias aisladas de hepatoma AS-30D) se obtuvo por Western 
Blot que el transportador de ácidos grasos (CPTI) y la primer enzima de la β-oxidación 
mitocondrial (SACAD), aumentaron de manera significativa 2 veces (Figura 4), 
correlacionando con una activa oxidación de ácidos grasos, determinada a partir de las 
velocidad de oxidación de sustratos (Edo 3) como son ácidos carboxílicos: propionil DL 
carnitina (149 ±35 ng•AtO•min•mg-1), ácidos grasos de cadena media: octanoil DL 
carnitina (154 ±10ng•AtO•min•mg-1), octanoato (100ng•AtO•min•mg-1) y de cadena larga: 
palmitoil-DL carnitina (103 ± 24ng•AtO•min•mg-1). Estos resultados empatan con lo 
reportado en la literatura donde mitocondrias de riñón, corazón e hígado, mantienen una 
activa internalización de ácidos grasos a la matriz mitocondrial para su posterior oxidación 
[Benton et al., 2007]. Se ha observado que al administrar 10µM de palmitato las 
velocidades de oxidación en mitocondrias aisladas de hígado de rata son de 11.4±0.6-
12.9±0.7nmoles∙O∙min-1∙mg-1 [Andreyev,et al. 1988], aunque las velocidades son 10 veces 
menores a las determinadas en nuestras RLM, debemos hacer énfasis en que el palmitato 
es un ácido graso de 16 carbonos, por lo que se considera como ácido graso de cadena 
larga y requiere carnitina para poder ingresar a la matriz mitocondrial y ser oxidado, en el 
estudio de Andreyev y colaboradores, no se especifica si hubo adición exógena de 
carnitina o sí el ácido graso ya lo tenía incorporado, por ello podríamos sugerir que las 
velocidades reportadas están subestimadas y por ello no correlacionan con las obtenidas 
por nosotros. Sin embargo, en otro tipo de mitocondrias como son las de corazón de rata 
se han reportado velocidades aproximadas de 264±15 y 161±7.5 ng∙AtO∙min-1∙mg-1 para 
palmitoil-L-carnitina (0.02mM) + malato(0.5 mM) y octanoato (0.1mM) + malato (0.5mM), 
respectivamente [Hansfordet al. 1978],éstas velocidades son más parecidas a las 
nuestras, lo que viene a corroborar la activa oxidación de ácidos grasos en RLM. 
Con los datos recabados de la literatura y las velocidades de oxidación en estado 3 
determinadas en nuestras RLM (Tablas 4 y 5), se puede determinar que no hay 
diferencias entre las velocidades de oxidación de sustratos; para el propionil DL carnitina 
la velocidad en estado 3 es de 138ng•AtO•min•mg-1, mientras que para los ácidos grasos 
 
44 
de cadena media las velocidades son de: 90 y 120± 35 ng•AtO•min•mg-1, finalmente el 
palmitoil DL carnitina tiene una velocidad de oxidación de 150±56 ng•AtO•min•mg-1. 
Aunque las diferencias no sean evidentes, se aprecia una tendencia a ser mayor la 
respiración en las mitocondrias de hepatoma AS-30D que en las RLM, indicando que la 
oxidación de ácidos grasos es tan funcional en mitocondrias de hepatoma AS-30D como 
en RLM. Esta sugerencia se confirma al comparar los parámetros bioenergéticos tales 
como son el control respiratorio (CR) y el cociente ADP/O, ambos parámetros hacen 
referencia a la integridad de la fracción de mitocondrias empleadas, es decir el grado de 
acoplamiento entre la respiración y la síntesis máxima de ATP estimulada por ADP 
exógeno [Nicholls, 1985]. Los valores calculados para el CR en las mitocondrias de 
hepatoma AS-30D mostrados en las Tablas 4 y 5 son mayores a 1, valor promedio 
reportado para la literatura [Villalobo et al., 1980; Murphy, et al. 1990; Kovacevic et al., 
1991] mientras que para RLM los CR obtenidos son aproximadamente de 2 y 3, en 
mitocondrias aisladas de células normales como hígado, riñón y corazón, el CR reportado 
en la literatura oscila entre 3-15 [Nicholls,1985], lo que indica que las mitocondrias 
utilizadas se encontraban acopladas y por tanto eran capaces de oxidar ácidos 
carboxílicos, ácidos grasos de cadena larga y media, conduciendo a la síntesis de ATP. El 
cociente resultante de la relación ADP/O, se evaluó para atribuir la oxidación de estos 
sustratos a la síntesis de ATP, en promedio se calculó que eran de 1-2 veces más altos 
en hepatoma de rata que en RLM, indicando que la capacidad de síntesis de ATP a partir 
de ADP exógeno es eficiente comparada con los cocientes obtenidos para las RLM, de tal 
forma que la oxidación de ácidos grasos efectivamente puede culminar en la síntesis de 
ATP en mitocondrias de hepatoma AS-30D. 
Es importante mencionar que fue necesario adicionar carnitina o emplear ácidos grasos 
con carnitina previamente adosada, para poder permitir el ingreso de los sustratos al 
interior de la matriz mitocondrial y asegurar su oxidación por las enzimas de la β-oxidación 
[Nelson y Cox, 2009; Viollet et al. 2007; Dobryznet al.,2004]. 
Por otro lado en la figura 4 se determinó un bajo contenido de ECHS1, el cual sugiere que 
las mitocondrias aisladas de hepatoma y de hígado están parcialmente purificadas, se 
encuentran libres de contaminación peroxisomal, tal como se ha demostrado en estudios 
 
45 
de Stern et al. 1956 y Li et al., 1991, donde el anticuerpo empleado para la detección de 
está enzima emite señal preferencialmente para la isoforma de origen peroxisomal, por lo 
que las velocidades de oxidación de ácidos grasos efectivamente corresponden a la β-
oxidación mitocondrial. 
Los datos de la Figura 4 y de la Tabla 5 demuestran que la oxidación de ácidos grasos 
puede llevarse a cabo en células tumorales; contrario a lo reportado en escasos estudios 
realizados sobre la β-oxidación en células tumorales, donde esta vía se ha descartado 
como un suministro alterno de ATP. De hecho, se ha sugerido que la mayoría de las 
neoplasias y algunas líneas celulares tumorales de rápido crecimiento (PC3, HCT15, 
HepG2) son incapaces de oxidar ácidos grasos (i.e., propionato, docosahexanóico, 
eicosapentanoico y ácido araquidónico) [Gamet et al., 2006] debido a que mantienen una 
alta actividad lipogénica. En células de mamífero provenientes de hígado de rata y 
humano, se han determinado bajas concentraciones de malonil-CoA (2-3µM), producto 
importante de la lipogénesis, el cual actúa como inhibidor alostérico de la CPTI, lo que 
compromete el transporte de los ácidos grasos al interior de la matriz mitocondrial 
[McGarry et al. 1983; Ruderman et al. 1999; DeBerandinis et al. 2008]. 
Desafortunadamente, en tumores no se ha dilucidado si los niveles de malonil-CoA, 
inhiben a la CPTI tumoral, y está ampliamente documentado que algunas enzimas en 
tumores cambian sus propiedades cinéticas para favorecer la actividad de dicha enzima. 
La PFK1 en células tumorales HeLa y MCF7 son un ejemplo de ello [Moreno-Sánchezet 
al. 2012] 
Desafortunadamente, los experimentos en mitocondrias aisladas de roedor son difíciles 
de realizar en mitocondrias aisladas de células de cultivo humanas, ya que para el 
aislamiento de mitocondrias se requiere de una cantidad de biomasa inicial que supera los 
100 mg proteína total, es decir, se requiere de al menos 15-20 cajas de petri de 150x 60 
mm con células al 90% de confluencia, alimentadas con 20 mL de medio enriquecido con 
suero fetal bovino, lo que resulta costoso. Sin embargo, se logró estandarizar las técnicas 
de consumo de ácidos grasos en los dos tipos de células tumorales demostrando la 
participación de la β-oxidación. 
 
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Las células tumorales de AS30D y de HeLa mantienen un activo consumo de ácidos 
grasos 
El empleo de un sistema fisiológico como la célula aislada (mitocondria in situ) permite 
evaluar el comportamiento de cualquier proceso biológico mitocondrial en condiciones 
cercanas a las fisiológicas, eliminado variables como son la concentración de sustratos 
oxidables y las interacciones entre las vías metabólicas. De tal forma, que la vía de la β-
oxidación se analizó midiendo la concentración de ácidos grasos libres a través del 
tiempo. Si bien es cierto que la cuantificación de metabolitos puede no estar asociada a 
su oxidación, se ha observado una estrecha relación entre la disminución de algunos 
sustratos endógenos (glucosa, glutamato, cuerpos cetónicos) con la activación de vías 
que los utilizan como substratos (glucólisis, glutaminólisis, fosforilación oxidativa) 
[Rodríguez-Enríquez et al., 2006]. 
Por lo anterior, nuestra propuesta fue que la disminución de los ácidos grasos libres 
podría relacionarse con una activación de la -oxidación. En la Tabla 6 se muestra el 
contenido de ácidos grasos libres saturados e insaturados presentes en células tumorales 
de rata (AS-30D) y de humano (HeLa). En hepatoma AS-30D, al tiempo inicial (t0) no se 
detectaron los ácidos mirístico, palmímitico y oleico. Mientras que en células HeLa al 
tiempo inicial (t0) la concentración de los ácidos insaturados: palmítico, mirístico y linoléico 
mantienen una concentración de 3-40 nmoles /mg prot, estas concentraciones son 
similares a las reportadas en células de hígado, riñón y músculo esquelético [Simopoulos, 
et al. 1991]. Interesantemente, en células de hepatoma AS-30D el contenido de ácido 
esteárico, palmitoléico, linoléico y araquidónico, disminuyó de 15-4 veces después de una 
incubación de 60 min (t60), de la misma forma en células tumorales HeLa el contenido 
tanto de ácidos grasos saturados como insaturados también disminuyó de 2-4 veces al t60. 
Estos datos sugirieren que los ácidos grasos podrían estar oxidándose; 
desafortunadamente en la literatura no se han reportado variaciones en la concentración 
de ácidos grasos a través del tiempo, en células tumorales o normales. No obstante se ha 
propuesto la movilización de ellos para su posterior consumo, dicha señal puede ser 
promovida por la diferencia entre la proporción AMP/ATP intracelular, involucrando 
directamente a la vía PI3K/Akt [Buzzai et al.2005; DeBerardinis et al. 2006], tal como se 
 
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ha observado en células de cáncer de próstata, en donde el principal la oxidación de 
ácidos grasos se ve estimulada por ésta vía.