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Biología

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE QUÍMICA

“ANÁLISIS DE LA COEXPRESIÓN DE CCR5 Y MARCADORES DE
CÉLULAS TRONCALES EN CÉLULAS DE CÁNCER DE MAMA”

TESIS

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGA

PRESENTA
Alejandra Montes Luna

MÉXICO, Cd.Mx. 2016

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL

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JURADO ASIGNADO:

PRESIDENTE: Profesor: ATONATIU EDMUNDO GOMEZ MARTINEZ
VOCAL: Profesor: MONICA BERENICE HERAS CHAVARRIA
SECRETARIO: Profesor: NOHEMI SALINAS JAZMIN
1er. SUPLENTE: Profesor: JOSE IGNACIO PARAMO RAMIREZ
2° SUPLENTE: Profesor: MARIA EVA GONZALEZ TRUJANO

SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA:
UNIDAD DE DESARROLLO E INVESTIGACIÓN EN BIOPROCESOS. ESCUELA NACIONAL DE
CIENCIAS BIOLÓGICAS, IPN.

ASESOR DEL TEMA:
DRA. NOHEMÍ SALINAS JAZMIN

SUSTENTANTE (S):
ALEJANDRA MONTES LUNA

ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Características del cáncer. .................................................................................. 6
Figura 2. Cascada invasión metástasis. ............................................................................. 8
Figura 3. Alteraciones celulares durante el cáncer de mama. .......................................... 13
Figura 4.Sobrevivencia al cáncer de acuerdo al subtipo específico. ................................ 17
Figura 5. Algoritmo diagnóstico para CM ......................................................................... 19
Figura 6. Tratamientos para el Cáncer de mama.. ........................................................... 22
Figura 7. Estructura del receptor CD44 ............................................................................ 25
Figura 8. Receptor CCR5 ................................................................................................ 27
Figura 9. Mecanismo de CCL5 con su receptor CCR5. .................................................... 30
Figura 10. Esquema general de la célula con el fenotipo buscado ................................... 34
Figura 11. Selección de células ADLH positivas. ............................................................. 36
Figura 12. Espectros de emisión en los fluorocromos utilizados durante el ensayo. ........ 37
Figura 13.Método Directo de marcaje de anticuerpo con marcador fluorescente. ............ 38
Figura 14.Técnica para la tinción extracelular. ................................................................. 38
Figura 15. Ejemplo de la estrategia de análisis para la determinación CCR5 en células
SKBR3. ............................................................................................................................ 39
Figura 16. Estrategia de análisis para seleccionar y comparar células CCR5+ SKBR3. .. 40
Figura 17. Descripción de la expresión de CCR5+, CD24- ó CD44+ en las líneas
celulares. ......................................................................................................................... 41
Figura 18. Estrategia de análisis CD44+/ CD24- / CCR5+ en células SUM159T ............... 42
Figura 19. Análisis de la coexpresión de CD44, CD24 y/o CCR5 en diferentes líneas
celulares de cáncer de mama. ......................................................................................... 43
Figura 20. Estrategia de análisis ALDH(+) / CCR5(+) en MDA-MB-231 ........................... 44
Figura 21.Análisis de la coexpresión de ALDH y CCR5 en diferentes líneas celulares de
cáncer de mama. ............................................................................................................. 44
Figura 22. Estrategia de análisis ALDH(+) / CD44(+) / CD24(-) / CCR5(+)en células
HS578T ........................................................................................................................... 46
Figura 23. Análisis de la coexpresión de ADLH/CD44/CD24 y CCR5 en diferentes líneas
celulares de cáncer de mama. ......................................................................................... 47
Figura 24.Cuadrantes de la cámara de Neubauer. .......................................................... 54

INDICE DE TABLAS

Tabla 1.Características de las Lineas celulares empleadas durate el ensayo. ................. 32
Tabla 2. Medios de Cultivo y suplementos empleados durante el crecimiento de las lineas
celulares. ......................................................................................................................... 32
Tabla 3.Anticuerpos usados durante la tinción extracelular.............................................. 37
Tabla 4. Fenotipificación de las líneas celulares SKBR3, MDA-MB-361, MDA-MB-231,
Hs578T y SUM159T ........................................................................................................ 48

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2

I. ABREVIATURAS ........................................................................................................... 3
.
III. INTRODUCCIÓN ..............................................................................................................................5
3.1 GENERALIDADES DEL CÁNCER ........................................................................................... 5
3.1.1 DEFINICIÓN ................................................................................................................ 5
3.1.2 CARCINOGÉNESIS ....................................................................................................... 5
3.1.3 METÁSTASIS .............................................................................................................. 6
3.2 CÉLULAS MADRE ONCOGÉNICAS. ..................................................................................... 9
3.2.1 CARACTERÍSTICAS ...................................................................................................... 9
3.2.3 IMPORTANCIA DE LAS CMO EN LA PROGRESIÓN DEL CÁNCER ..................................... 11
3.3 CÁNCER DE MAMA ..........................................................................................................12
3.3.1 CARACTERÍSTICAS GENERALES DEL CM. ................................................................... 12
3.3.2 EPIDEMIOLOGÍA ....................................................................................................... 17
3.3.3 TRATAMIENTO PARA EL CM .................................................................................... 19
3.3.4 CMO EN CÁNCER DE MAMA .................................................................................... 23
3.3.4.1 FUNCIONES DE CD44 ............................................................................................. 24
3.3.4.2 FUNCIONES DE CD24 ............................................................................................. 26
3.4 CCR5 .............................................................................................................................. 26
3.4.1 CARACTERÍSTICAS GENERALES. ................................................................................ 26
3.4.2 PARTICIPACIÓN DE CCR5 EN CÁNCER. ...................................................................... 27

V.OBJETIVOS ................................................................................................................. 31
5.1 OBJETIVO GENERAL ......................................................................................................... 31
5.2 OBJETIVOS PARTICULARES .............................................................................................. 31

VI.MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................... 31
6.1 LÍNEAS CELULARES. ......................................................................................................... 31
6.2 CULTIVO CELULAR. .......................................................................................................... 32
6.3 TINCIONES CELULARES. ................................................................................................ 33
6.3.1 TINCIÓN CON ALDEFLUOR® ....................................................................................... 34
6.3.1.1 ANÁLISIS PARA LA TINCIÓN CON ALDEFLUOR® .................................................... 36
6.3.2 TINCIÓN DE MARCADORES EXTRACELULARES ............................................................... 36

VII. RESULTADOS .......................................................................................................... 39

VIII.DISCUCIÓN .............................................................................................................. 48
IX. CONCLUSIONES ....................................................................................................... 52
X. APENDICES ............................................................................................................... 53
APENDICE 1. CONTEO CELULAR ................................................................................ 53
XI. REFERENCIAS .......................................................................................................... 55
Margarita
Texto escrito a máquina
II. RESUMEN................................................................................................4
Margarita
Texto escrito a máquina
Margarita
Texto escrito a máquina
IV. JUSTIFICACIÓN E HIPÓTESIS ..............................................................30
3

I. ABREVIATURAS

AF Autofluorescencia
AINE Anti inflamatorios no esteroideos
Bmi-1 Siglas en inglés (Polycomb complex protein)
BRCA1 Siglas en inglés (Breast cancer 1)
CM Cáncer de mama
CMO Células madre oncogénicas.
COX-2 Inhibidores de la ciclooxigenasa 2
CXCL1 Siglas en inglés (chemokine (C-X-C motif) ligand 1)
EpCAM Siglas en inglés (Epithelial cell adhesion molecule)
ER Reeceptor de estrógeno
Hh Vía Hedgehog
HER2 receptor 2 de factor de crecimiento epidérmico humano.
IHQ Inmunohistoquimica
MEC Matriz extracelular .
NEDD9 Siglas en inglés (Neural Precursor Cell Expressed, Developmentally Down-Regulated 9.).
PR Receptor de progesterona
PTEN fosfatidilinositol-3,4,5-trisfosfato 3-fosfatasa
PTHRP Proteína relacionada con la hormona paratiroidea
RhoC Siglas en inglés (Ras Homolog Family Member C)
SDF1 Siglas en inglés ( stromal cell-derived factor 1)
TEM Transición epitelio-mesénquima
TGF-β Siglas en inglés (Transforming growth factor beta)
TME Transición mesénquima-epitelio
VIH Virus de inmunodeficiencia humana
WNT Siglas en inglés (wingless integrated )

Margarita
Texto escrito a máquina
4

II.RESUMEN
Actualmente el cáncer de mama en México es la primera causa de muerte por
neoplasia maligna entre las mujeres mayores de 25 años de edad, el tratamiento es,
en gran medida, ineficaz y ofrece, en el mejor de los casos, una extensión de la vida,
en lugar de una cura.
Las células cancerosas dentro de un tumor presentan heterogeneidad funcional, es
decir, diferentes células presentan diferente morfología, grado de diferenciación,
capacidad proliferativa e invasividad. Aunque un tratamiento puede tener éxito en
disminuir la cantidad de estas subpoblaciones de células, otras sobreviven y tienden a
originar un mayor grado de enfermedad en el paciente. Recientemente se ha
identificado una pequeña subpoblación de células con la característica de división
asimétrica y cuando se trasplantan a animales son capaces de generar un tumor que
presenta linajes heterogéneos y metástasis a otros tejidos. A estas células se les ha
llamado células madre oncogénicas (CMO). En el cáncer de mama humano, está
subpoblación se identifica mediante marcadores de superficie tales como CD44(+) y
CD24(-), aunque estos marcadores no son suficientes para caracterizarlas. La
aldehído deshidrogenasa (ALDH), es una enzima detoxificante asociada con células
madre hematopoyéticas y se ha identificado a su vez como marcador de CMO
mamarias, generalmente tienen un mal pronóstico.
Estudios previos han mostrado que los receptores de quimiocinas CXCR4 y CCR7
participan en la metástasis a otros tejidos en el cáncer de mama . De igual manera se
ha observado que la alteración en la expresión de CCL5 en pacientes con cáncer de
mama, correlacionan con la progresión de la enfermedad.
La búsqueda de modelos adecuados para evaluar fármacos dirigidos hacia las CMO
que expresen receptores celulares asociados a una mayor malignidad, tal como es el
caso del receptor CCR5 es el objetivo principal de este trabajo. Evaluamos el fenotipo
descrito anteriormente de CMO por citometría de flujo de cinco líneas celulares de
cáncer de mama y encontramos que las células que presentaban una subpoblación
(CD44+/CD24- , ALDH+, CCR5+) eran las células triple negativas (Hs578). Las cuales
se podrían usar como modelo y blanco terapéutico dirigido a las células más
agresivas dentro de un mismo tumor, mejorando la expectativa de vida en el cáncer
de mama.
5

III. INTRODUCCIÓN
3.1 Generalidades del cáncer
3.1.1 Definición

El cáncer abarca a un conjunto de enfermedades derivadas principalmente, de
mutaciones en células somáticas individuales que se desvían de las rutas
normales de proliferación. Dichas mutaciones también confieren a las células
características que les permiten migrar a tejidos adyacentes para culminar en
tumores secundarios en sitios diferentes al de origen.[1, 2]
3.1.2 Carcinogénesis

Las células cancerosas tienen defectos en los circuitos de regulación que rigen la
proliferación celular y la homeostasis. Todas estas diferencias son una
manifestación de seis alteraciones esenciales en la fisiología celular que dictan, en
su conjunto, un crecimiento celular maligno, estas se describen a continuación: i)
mantenimiento de la señalización proliferativa, ii) insensibilidad a las señales
inhibidoras delcrecimiento, iii) resistencia a la muerte celular programada
(apoptosis); lo que permite la inmortalidad replicativa, iv) angiogénesis, v) invasión
de tejidos y vi) metástasis.[3] La adquisición de las múltiples características
enumeradas anteriormente depende en gran parte de las constantes mutaciones
en los genomas de las células neoplásicas.
En el cáncer, la proliferación celular es crónica y en muchos casos incontrolada,
representa la esencia de la enfermedad neoplásica e implica no sólo la
desregulación de la proliferación celular, sino que también involucra ajustes en el
metabolismo energético con el fin de impulsar el crecimiento y la división celular.
Otras de las características de estas células cancerosas son la inestabilidad del
genoma, promoción del tumor e inflamación, la reprogramación del metabolismo
energético y la tendencia a evadir el sistema inmune.[4]

3.1.3 Metástasis

La metástasis es un proceso de múltiples pasos, implica la difusión de las células
cancerosas a órganos anatómicamente distantes y su posterior adaptación a
microambientes de otros tejidos. Cada uno de estos eventos es impulsado por la
adquisición de alteraciones genéticas y/o epigenéticas en las células tumorales
además de la cooperación de las células del estroma no neoplásicas, que en
conjunto, confieren a las células metastásicas iniciales con los rasgos necesarios
para generar metástasis macroscópicas.[5]
La cascada biológica de las metástasis involucra pasos concretos como pérdida
de adhesión celular, incremento en la capacidad motora e invasiva, entrada en la
circulación, salida hacia el parénquima de órganos distantes y, finalmente,
colonización de dichos órganos. Aunque todas las células de un tumor contienen
alteraciones oncogénicas, solamente unas pocas llegan a acumular todas las
funciones necesarias para completar la metástasis. Las células metastásicas
Autosuficiencia
proliferativa
Promoción del
tumor e inflamación
Inmortalización
Evasión de la
respuesta inmune
Insensibilidad a
señales antimitóticas
Invasión y
metástasis
Inestabilidad
Genómica
Inducción de
angiogénesis
Resistencia a
apoptosis
Desregulación
bioenergética
Figura 1. Características del cáncer.
Modificado de Hanahan, D. and Robert A. Weinberg, Hallmarks of Cancer: The Next
Generation. Cell. 144(5): p. 668.

provienen de la evolución de una población de células cancerosas genéticamente
modificadas por la presión selectiva de un entorno.[6]

Para diseminarse, las células tumorales deben ser capaces de romper sus lazos
con la estructura cohesiva del tejido de origen. La adhesión entre células se
reduce por la pérdida de proteínas de anclaje que las une, por ejemplo, E-
cadherina. La pérdida de esta proteína en tumores puede darse por varios
mecanismos, incluyendo mutaciones genéticas o silenciamiento epigenético del
gen que la codifica. La pérdida de acción de E-cadherina también ocurre como
parte de la transformación de células cancerosas de un estado epitelial a un
estado de mayor movilidad; un cambio conocido como transición epitelio-
mesénquima (TEM).[7]
Las células normales se mantienen en su lugar gracias a la acción de la matriz
extracelular, una estructura formada por colágeno y otras proteínas que forman
fibras a las que las células se unen a través de receptores denominados
integrinas. Estos contactos pueden retener a las células en su lugar, pero también
pueden estimularlas a formar extensiones para el movimiento migratorio. Varias
proteínas involucradas en cambios morfológicos de las células, como RhoC y
NEDD9, están implicadas en la invasión de células cancerígenas conduciendo a
un procesos metastásico.[8, 9]
Existe la hipótesis de que las células cancerosas se pueden diseminar
desde estadios muy tempranos, cuando el tumor es pequeño y todavía no ha sido
diagnosticado. También pueden diseminarse desde tumores metastásicos que, a
su vez, dan lugar a nuevas metástasis. Es posible que células tumorales en
circulación puedan reinfiltrarse en los mismos tumores de los que partieron.[6] De
acuerdo con esta hipótesis, los tumores pueden autoenriquecerse con su progenie
más agresiva, ofreciendo un mecanismo que asocia la habilidad metastásica con
el crecimiento del tumor. Esto explicaría la antigua correlación entre las
metástasis y el tamaño del tumor.
Para colonizar con éxito un sitio secundario, una célula cancerosa debe
completar una serie de pasos, antes de que sea una lesión clínicamente
detectable. Estos pasos incluyen típicamente:
8

I. La separación del tumor primario.
II. Invasión a través de los tejidos circundantes y las membranas basales.
III. Entrada y la supervivencia en la circulación, los vasos linfáticos o en el
espacio peritoneal y
IV. Detención en un órgano objetivo distante seguido de
V. La extravasación en el tejido circundante, la supervivencia en otro
microambiente, la proliferación y la inducción de la angiogénesis, al mismo
tiempo eludir la muerte apoptótica o respuesta inmunológica.[10]
Las metástasis generadas por carcinomas se forman tras la finalización de una
compleja sucesión de células biológicas eventos denominados colectivamente
como “cascada invasión-metástasis”, en la cual, las células epiteliales ubicadas en
tumores primarios tienden a: (1) invadir localmente a través de los alrededores de
la matriz extracelular (MEC) y las capas de células estromales, (2) intravasación a
los vasos sanguíneos, (3) sobrevivir a los rigores del transporte a través de la
vasculatura, (4) detención en los sitios de órganos distantes, (5) extravasación en
el parénquima de los tejidos distantes, (6) sobrevivencia inicialmente en estos
microambientes extranjeros con el fin de formar micrometástasis, y (7) reiniciar sus
programas de proliferación en los sitios metastásicos, lo que genera crecimientos
neoplásicos macroscópicos, clínicamente detectables (este paso también se
refiere a menudo como " colonización metastásica"). [5]. En la Figura 2 se
muestran los pasos por los cuales se lleva a cabo la metástasis:

Figura 2. Cascada invasión metástasis.
Modificado de Valastyan, S. and Robert A. Weinberg, Tumor Metastasis: Molecular Insights and
Evolving Paradigms. Cell, 2011. 147(2): p.276.

1. Formación del
tumor primario.
Invasión local. 2. Intravasación
3. Sobrevivencia en circulación
4. Detención en
un sitio distante.
5. Extravasación
6. Formación de
micrometástasis.
7. Colonización
metastásica.
8. Metástasis macroscópicas
clínicamente detectables.
9

3.2 Células madre oncogénicas.

3.2.1 Características

Las células cancerosas dentro de un tumor presentan heterogeneidad funcional,
es decir, diferentes células presentan diferente morfología, grado de
diferenciación, capacidad proliferativa, e invasividad.[11, 12]
Se ha descrito que no todas las células en un tumor son capaces de dividirse
infinitamente, ni tampoco todas las que han accedido al lugar de metástasis son
capaces de reiniciar el tumor. Este subgrupo de células tumorales, por sus
características comunes con las células madre normales, se les ha llamado
Células Madre Oncogénicas (CMO) que tiene la capacidad de actuar como células
propagadoras del tumor y se caracterizan por:
1. Dividirse asimétricamente, generando otra célula igual y una célula progenitora
(es decir se auto-renuevan);
2. Generar un tumor que presenta linajes heterogéneos, cuando se trasplantan a
animales.
Se cree que desempeñan un papel importante en la recurrencia de la enfermedad,
debido a la resistencia terapéutica intrínsecamente mejorada como resultado de la
reparación de mecanismos celulares y la alteración de la cinéticaen el ciclo
celular. [13, 14]
El modelo jerárquico de las CMO implica la existencia de una célula originaría del
tumor con propiedades de célula madre, capaz de proliferar y mantenerse en el
tumor de forma indefinida gracias a su capacidad autorrenovadora. En este
modelo, tan sólo la población de CMO tiene la capacidad de generar y mantener el
tumor, a diferencia del resto de células que lo forman que no tienen esa
habilidad.[13, 15]
Aunque no se sabe si las CMO derivan de células madre normales o de células
progenitoras que han adquirido la capacidad de autorenovación, ambos
10

escenarios consideran que las CMO adquieren sus características fenotípicas
mediante alteraciones genéticas. En conjunto, estas alteraciones hacen que sean
más resistentes a las terapias antineoplásicas que el resto de las células
tumorales. Las CMO que sobreviven a la terapia pueden ser capaces de repoblar
los tumores y producir una recaída. Además, dado que las mutaciones pueden
ser transmitidas a toda la progenie de las CMO, es probable que el nuevo tumor
muestre mayor resistencia, lo que permitiría la evolución hacia la malignidad. Por
tanto, ahora el reto de la industria farmacéutica está en identificar los blancos
terapéuticos que pueden atacar a estas células.
Se han propuesto diversas hipótesis sobre el origen de la CMO.
1. Pérdida de regulación por el microambiente.
El microambiente que rodea a las células madre parece tener un papel importante
en la regulación de su ciclo celular. Se ha descrito que las células madre de la
médula ósea que se encuentran en otros tejidos pueden originar procesos
neoplásicos en un contexto de inflamación crónica. También debe tenerse en
cuenta que el hecho de encontrarse fuera de su nicho habitual puede facilitar su
descontrol, al desaparecer las señales inhibitorias de la matriz extracelular.

2. Pérdida de la división asimétrica.
Este tipo de división es el que permite la capacidad auto-renovadora de la célula
madre. La célula madre se divide en dos células hijas diferentes, en la que sólo
una se parece a la célula madre. En las CMO la polaridad del eje apico-basal se
perdería y ambas células hijas serían idénticas a la célula madre, causando una
acumulación de células madre que conduce a su comportamiento maligno.

3. Fusión celular.
La fusión celular es un mecanismo fisiológico para las células musculares (fibra
muscular multinucleada), la unión de los gametos sexuales (formando el zigoto) y
en el tejido placentario. Este fenómeno también se encuentra presente en los
tumores; algunas células tumorales pueden derivar de la fusión de células
11

somáticas normales. Además, la fusión entre células tumorales y células
somáticas sanas puede generar células híbridas con mayor malignidad que las
células de las que provienen. Sin embargo, no toda fusión con una célula madre
termina en un tumor.

4 .Transferencia genética horizontal.
Se trata de un mecanismo similar al utilizado por las bacterias para transmitirse
genes de resistencia antibiótica. En el caso de la célula madre sería por su
capacidad fagocitaria que le permite introducir cuerpos apoptóticos que
reprogramen su carga genética convirtiéndola en tumoral, como podría ser por la
introducción de RNA reguladores de células malignas.[13]

5. Características fenotípicas de CMO
La identificación de las CMO de un tumor se realiza mediante la selección de las
células tumorales que expresan marcadores de célula madre normal asumiendo
que la CMO los sigue conservando. De esta forma se han definido diversos
marcadores de CMO en leucemia (Thy1- CD133+ CD34+), tumores cerebrales
(CD133+) y cáncer de mama (CD44+ CD24- or low). Diversas vías de señalización
que regulan los procesos de división, diferenciación y apoptosis se encuentran
alteradas en las CMO. Entre ellas se encuentran las vías de WNT, β-catenina,
PTEN, TGF-β, Hh, Notch y Bmi-13.[13]
3.2.3 Importancia de las CMO en la progresión del cáncer

Se ha descrito que las CMO desempeñan un papel importante en la recurrencia
de la enfermedad a causa de la resistencia terapéutica a los tratamientos
existentes en la actualidad. Uno de los factores que influyen este comportamiento
son; el aumento de la expresión de transportadores de fármacos y enzimas de
desintoxicación intracelulares que participan el flujo y el metabolismo de los
fármacos usados durante la terapia, la regulación de las proteínas antiapoptóticas,
el aumento de la eficiencia de reparación del ADN y alteraciones en la cinética del
12

ciclo celular , así como influencias del microambiente celular que favorecen su
establecimiento en tejidos distantes.[14, 16]
3.3 Cáncer de mama
3.3.1 Características generales del CM.

En condiciones fisiológicas normales, el epitelio de la glándula mamaria es una
estructura bien definida, donde las células epiteliales forman una capa
uniforme. En el caso particular de la mama, las células epiteliales forman el
revestimiento de conductos que son primordiales para el transporte de la leche
durante la lactancia. El carcinoma ductal es el tipo más común de CM, que se
producen tanto en las mujeres y los hombres, aunque su prevalencia es poco
frecuente en los hombres.[23]

En contraste con los tejidos sanos, las células dentro de los tumores sólidos
adquieren varias características fisiopatológicas que les confiere la supervivencia,
proliferación y capacidad migratoria. La progresión tumoral se caracteriza por una
masa formada por múltiples poblaciones de células con mecanismos capaces de
inhibir la apoptosis, mientras que la promoción de las vías de supervivencia y la
invasión de tejidos sanos a través de la circulación sanguínea y linfática. Las
alteraciones morfológicas de las células epiteliales, así como alteraciones de la
expresión de moléculas de superficie importantes, son cruciales para la iniciación
y el desarrollo del tumor. Además, las propiedades y eventos tales como hipoxia
intratumoral, la angiogénesis, la transición epitelio-mesenquima (TEM) y las
propiedades inmunosupresoras tumorales así como también el microambiente
tumoral son acontecimientos fundamentales en la malignidad celular. [24]

Figura 3. Alteraciones celulares durante el cáncer de mama.
Modificado de Videira, M., R.L. Reis, and M.A. Brito, Deconstructing breast cancer cell biology and the
mechanisms of multidrug resistance. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer, 2014.
1846(2): p. 313.

En la Figura 3, se representa a las células epiteliales mamarias polarizadas que recubren un conducto en una
matriz extracelular compatible (MEC) en la mama normal (A1); el establecimiento de uniones intercelulares
normales (uniones estrechas y adherentes) entre las células vecinas y el apego a la membrana basal por
integrinas promoviendo a su vez la inhibición de contacto, limitando la proliferación de células epiteliales y
asegurando la polaridad en células normales (A2). Un conducto en el cáncer de mama donde las células
epiteliales mamarias proliferan, migran y pierden la estructura polarizada es promovida por una matriz de
colágeno denso durante el cáncer de mama (B1); el microambiente tumoral es un complejo andamiaje de
MEC, las células cancerosas y varios otros tipos de células, como fibroblastos asociados con el cáncer y las
células del sistema inmunológico que promueve la autosuficiencia en las señales de crecimiento, así como un
ambiente pro-inflamatorio y pro-oxidante (B2).

El CM representa un grupo heterogéneo de enfermedades con diferentes
presentaciones clínicas y respuestas al tratamiento. Varios factores afectan el
diagnostico de esta enfermedad, tales como el tamaño del tumor, la afectación
ganglionar, grado nuclear, tipo histológico, marcadores moleculares, y los
márgenes quirúrgicos. Incluso teniendo en cuenta estosfactores, sigue existiendo
una gran variación en el comportamiento del CM, debido a esto, existe una gran
Adipocito
Célula epitelial mamaria
Célula tumoral
Célula inmune
Fibroblasto asociado a
cáncer
Célula endotelial
Pericito

Adipocito
MEC
Membrana basal
Integrinas
Quimiocinas
Especies reactivas de
oxigeno
Factor de crecimiento Pro-
angiogenico
Receptor del factor de crecimiento
Unión adherente
Unión estrecha
14

limitación durante el diagnostico por lo que se emplearon nuevas formas de
clasificar el CM mediante el desarrollo de perfiles de expresión génica del tejido
tumoral para tratar de clasificar a más tumores individuales y de esta manera
proporcionar información más fiable sobre la respuesta, el diagnóstico y dar un
tratamiento adecuado al paciente.

Se propuso que la diversidad fenotípica de tumores de mama también podría estar
asociada a diversos patrones de expresión génica. Posteriormente se demostró
que los tumores de CM se pueden dividir en cinco subtipos diferentes, basados en
la expresión de los receptores de estrógeno (ER) y los receptores de progesterona
(PR), y Her2 (receptor 2 de factor de crecimiento epidérmico humano). En general,
los tumores ER positivos son más comunes que los tumores ER negativos.[25]
Los subtipos moleculares son los siguientes: (i) luminal A, (ii) luminal B, (iii) de tipo
HER2+, y (iv) de tipo basal. Los dos subtipos luminales (luminal A y B)
comprenden la mayoría de los cánceres de mama ER+ y se caracterizan por una
alta expresión de receptor de la hormona (HR).

El subtipo de CM Luminal es el más común, representando el 50-60% de los
cánceres de mama. Se caracteriza por la expresión de genes activados por el
factor de transcripción ER que se expresa típicamente en el epitelio luminal que
recubre los conductos mamarios. También se asocia con una baja expresión de
genes relacionados con la proliferación celular. El perfil luminal A se caracteriza
por la expresión de ER +/- PR, una ausencia de expresión de Her2 una baja tasa
de proliferación medida por Ki67 (debe ser <14%). Las mujeres con este subtipo,
en etapa temprana, tienen el mejor pronóstico y recaídas poco frecuentes, que con
frecuencia, tienen preferencia por los huesos como primer sitio de metástasis.

Los tumores de tipo luminal B representan entre el 10 y el 20% de todos los
CM. En comparación con luminal A, tienen un fenotipo más agresivo, más alto
índice de proliferación, y un peor pronóstico. El patrón de recaída distante también
difiere, y aunque se han reportado casos con metástasis a hueso (30%), este
15

subtipo tiene una alta tasa de recurrencia en los sitios viscerales como el hígado
(13,8%). Además, la supervivencia desde el momento de la recaída es más baja
(1,6 años) en comparación con luminal A (2,2 años).[26] La principal diferencia
biológica entre los subtipos luminal A y B es un aumento expresión de genes de
proliferación. Desde el punto de vista inmunohistoquimico, ha habido intentos para
diferenciar entre luminal A y B luminal utilizando la expresión de la proteína de
Ki67 como un posible marcador. El subtipo luminal A se ha definido como ER+ /
Her2- y bajo Ki67, mientras que el subtipo luminal B tiene tumores con ER+ /
Her2- y alta Ki67 o ER+ / Her2+. También hay aproximadamente un 6% de los
tumores de tipo luminal B que son ER- y Her2-. También es importante tener en
cuenta que el punto de corte para Ki67 no se ha estandarizado. Dado que el
pronóstico de los tumores luminales B es diferente en comparación con el luminal
A, y solo se ha usado como un esfuerzo para identificar biomarcadores que
distinguen entre estos dos grupos.
Los cánceres de mama Her2 positivo, se caracterizan por la sobreexpresión del
gen Her2 y genes relacionados con la proliferación celular. Estos tumores son
altamente proliferativos y más del 40% tienen mutaciones de p53. Tumores
enriquecidos con Her2 tienen una alta tasa de recaída local (21% frente a un 8%
para luminal A); sin embargo, es importante señalar que estos datos se obtuvieron
antes de la utilización rutinaria del adyuvante Trastuzumab por lo que, su uso,
reduce notablemente la recurrencia local. Los pacientes con CM que
sobreexpresan el gen Her2 tienen una frecuencia más alta de desarrollar
metástasis cerebrales en comparación con otros subtipos, además de una mayor
metástasis en hígado y pulmón.

El subtipo basal normalmente expresa genes presentes en las células
mioepiteliales de mama normales, incluyendo citoqueratinas CK5 y CK17, P-
cadherina, CD44, y factor de crecimiento epidérmico EGFR. Clínicamente, los
tumores de tipo basal se caracterizan por la edad, al momento del diagnóstico,
tienen mayor frecuencia en las mujeres afroamericanas, el tamaño del tumor
durante el diagnostico, el alto grado histológico, y una alta frecuencia de
16

afectación ganglionar. Tumores de tipo basal tienden a tener un alto índice
mitótico y se asocian con necrosis tumoral. Se comportan de una manera
clínicamente agresiva con predominio en la participación de los órganos
viscerales, principalmente los pulmones, el sistema nervioso central y los ganglios
linfáticos. Tumores provenientes de este subtipo de CM, al igual que el CM triple
negativo, carecen de expresión de los tres receptores clave: ER, la sobreexpresión
del receptor PR, y Her2. En la práctica clínica, los términos basal y triple negativo,
a menudo se intercambian; sin embargo, no son sinónimos.[22, 27]
El CM triple negativo y basal ocurren con más frecuencia en mujeres jóvenes de
raza oscura y mujeres hispanas que en las mujeres jóvenes de otros grupos
raciales o étnicos.
BRCA1 es un gen importante que habla de la susceptibilidad al cáncer de
mama, más del 75% de los tumores que surgen en las mujeres con una mutación
en este gen tienen un fenotipo triple negativo, un fenotipo de tipo basal , o
ambos. [22]
Hasta hace poco, los requisitos estrictos de tejidos, los costos, la complejidad y
los desafíos técnicos han limitado la aplicación de perfiles de expresión génica en
la práctica clínica. Ahora, sin embargo, los ensayos disponibles comercialmente,
tales como Oncotype DX ® y MammaPrint ® se han vuelto más ampliamente
utilizados. En la actualidad se ha empleado la inmunohistoquímica (IHQ) como un
sustituto para los subtipos moleculares, utilizando diversos biomarcadores. IHQ es
un método más económico, fácilmente disponible, fiable, reproducible y
técnicamente sencilla. Los anticuerpos para receptor de estrógeno (ER), receptor
de progesterona (PR), Her2, citoqueratina 5/6 (CK 5/6), factor de crecimiento
epidérmico (EGFR), y Ki67 han sido ampliamente utilizados para clasificar los
subtipos de CM. [27]

Recientemente fueron evaluadas las características y los resultados de los
pacientes de acuerdo a los subtipos moleculares de cáncer de mama según la
clasificación en un panel de cuatro biomarcadores utilizando IHQ. Se midió la
expresión de los marcadores ER, PR, Her2, y Ki-67 a 1.066 pacientes con CM en
17

cuatro subgrupos. También se analizaron respectivamente datos demográficos,
patrones de recurrencia y la supervivencia. El resultado fue que los subtipos de
cáncer luminal A, luminal B, enriquecido Her2, y los tumores de tipo basal
representaron el 53,1, el 21,7, el 9,0 y el 16,2% de los casos,
respectivamente.[27]

Figura 4.Sobrevivencia al cáncer de acuerdo al subtipo específico.
Modificado de Foulkes, W.D., I.E. Smith, and J.S. Reis-Filho, Triple-Negative Breast Cancer. New England
Journal of Medicine, 2010. 363(20): p. 1938-1948.
3.3.2 Epidemiología

El cáncer de mama (CM) es el principal cáncer entre las mujeres en todo el mundo
representando el 16% de todos los cánceres femeninos.[17]
Se sabe que es la enfermedad maligna más común en las mujeres occidentales.
En estos pacientes,la principal causa de muerte no es el tumor primario, son sus
metástasis en sitios distantes. Recientemente, las tasas de metástasis y la
mortalidad en pacientes con cáncer de mama han disminuido como resultado del
diagnóstico oportuno mediante cribado mamográfico y la implementación de
sistémica terapias adyuvantes. La terapia adyuvante, en la mayoría de los casos,
puede ayudar a erradicar las células tumorales de mama que ya podría haberse
propagado a lugares distantes en el momento del diagnóstico.
En las mujeres con cáncer de mama que son menores de 50 años de edad, la
quimioterapia aumenta su tasa de supervivencia a 15 años en un 10%; en las
A. Supervivencia de acuerdo al subtipo
inmunohistoquimico en CM
Su
p
er
vi
ve
n
ci
a
es
p
ec
if
ic
a
en
C
M

Marcador Basal -
Marcador Basal +
Cáncer de mama
Triple Negativo
Cáncer de mama
No-Triple Negativo
B. Recurrencia para tasa de riesgo
Ta
sa
d
e
ri
es
go

Años después de diagnostico
18

mujeres de más edad el incremento es del 3%. Sin embargo, la quimioterapia
tiene una amplia gama de efectos secundarios agudos y de largo plazo que
afectan sustancialmente la calidad de vida del paciente. Como no es posible
predecir con exactitud el riesgo de desarrollo de metástasis en pacientes
individuales, hoy en día más de 80% de ellos reciben quimioterapia adyuvante,
aunque sólo aproximadamente el 40% de los pacientes recaen y finalmente
mueren de cáncer de mama metastásico. Por lo tanto, muchas mujeres que
podrían ser curadas por el tratamiento local solo, que incluye la cirugía y la
radioterapia, son de algún modo "sobretratadas" y sufren los efectos secundarios
tóxicos de la quimioterapia sin necesidad.[18] Es por esto que surge la necesidad
de proponer nuevos marcadores para identificar a los pacientes que están en el
mayor riesgo de desarrollar metástasis, lo que podría permitir a los oncólogos,
comenzar la adaptación de las estrategias de tratamiento para los pacientes
individualmente y dirigido a las células responsables de la propagación de los
tumores a órganos distintos al inicial.
La expresión genética de los tumores primarios de CM podría ser una manera de
identificar a los pacientes que tienen más probabilidades de desarrollar
metástasis, y podrían, por tanto, beneficiarse de la terapia adyuvante. Además, el
perfil de expresión génica y de marcadores extracelulares de células tumorales
provenientes de CM también puede ayudar a identificar nuevos blancos
terapéuticos.
En México, la incidencia del CM ha aumentado en las últimas décadas con 20,444
casos reportados en el 2012. Esto refleja una incidencia nacional de 35 por cada
100.000 mujeres en comparación con 93 por cada 100.000 mujeres en los
EE.UU., aunque las cifras en México se denuncian en menor cantidad debido a la
falta de un Registro Nacional de Cáncer.[19] Desde el año 2006 ha sido la
principal causa de mortalidad por cáncer en las mujeres mexicanas, que
representan el 14% de todas las muertes relacionadas con el cáncer femenino.[20]
Si bien la incidencia del CM en México es más bajo que en los EE.UU., la relación
mortalidad/ incidencia en México es casi el doble que en los EE.UU. (37% vs.
18,7%).[2]
19

Los cambios recientes en las políticas de atención de salud de México han
incorporado programas que abordan el acceso a cáncer de mama en etapas
tempranas, el diagnóstico y tratamiento como lo establece la Norma Oficial
Mexicana “NOM-041-SSA2-2011, Para la prevención, diagnóstico, tratamiento,
control y vigilancia epidemiológica del cáncer de mama.”

Figura 5. Algoritmo diagnóstico para CM
Tomado de la NOM-041-SSA2-2011, Para la prevención, diagnóstico, tratamiento, control y vigilancia
epidemiológica del cáncer de mama; Apéndice B.

La implementación del Seguro Popular, el Seguro de Salud de México en 2003,
fue parte de la reforma de salud destinado a proporcionar cobertura de salud para
personas con escasos recursos.
3.3.3 Tratamiento para el CM

Casi todas las muertes causadas por cánceres sólidos se producen como
resultado de la formación de metástasis a órganos distantes, tales como los
pulmones, el hígado, cerebro y hueso. Las estrategias actuales para tratar el
cáncer de mama mestastásico, tienen particular enfoque a las diferentes etapas
de crecimiento y progresión tumoral. Aparte de la erradicación del tumor, las
terapias que se clasifica en amplio espectro o dirigidas, y han demostrado ser
eficaces en algunos pacientes. Las terapias de amplio espectro (por ejemplo,
20

quimioterapia) están diseñados para prevenir el rebrote del tumor, eliminando
células que se dividen activamente, y son la única opción de tratamiento a nivel
sistémico actualmente disponible para el subtipo de CM triple negativo , por lo que
las terapias dirigidas actuales no son una opción. El uso de adyuvantes durante
las quimioterapias dio lugar a un aumento significativo en la tasa de supervivencia
de 15 años a los pacientes con cáncer de mama temprano, aunque la metástasis
sigue ocurriendo en un gran porcentaje de las pacientes.[43] Esto indica que
aunque estos fármacos ayudan a prolongar la supervivencia de pacientes con
cáncer de mama, no impiden de manera fiable el desarrollo de la enfermedad
secundaria. Los posibles oportunidades para la terapia dirigida de esta
enfermedad progresiva se muestran en la Figura 6.
Las células tumorales en el sitio primario se ven influidos por la interferencia con el
estroma, que provoca la ruptura de la membrana basal que a su vez permite la
migración y la invasión, posiblemente a través de mecanismos moleculares
similares a la transición epitelio-mesenquima (TEM). Los fibroblastos asociados
con el cáncer y las células inmunes, incluyendo los macrófagos y las células T
reguladoras, contribuyen a este proceso a través inmunoedición y mediante el
suministro de factores de crecimiento solubles. Las células tumorales pasan a los
vasos sanguíneos y linfáticos, que darán paso a la diseminación a distancia. Las
terapias actuales incluyen la quimioterapia, la terapia endocrina para el receptor
de estrógeno (ER) y trastuzumab para el cáncer Her2+. Otras intervenciones
posibles se muestran, incluyendo inhibidores de proteasa, para bloquear la ruptura
de la matriz extracelular (MEC) y invasión de células tumorales, inhibidores de la
angiogénesis e inhibidores de la inflamación, tales como Ciclooxigenasa-2 (COX-
2) y fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE). [21]
Los únicos tratamientos específicos de células cancerosas que están en uso
clínico son anticuerpos que van dirigidos al receptor del factor de crecimiento
epidérmico 2 (ErbB2, también conocida como Her2 o neu) o de la aromatasa.
Algunos, como el que se une al VEGF (bevacizumab) y anticuerpos dirigidos a al
ligando del receptor activador de NF-kB (denosumab -Prolia / Xgeva; Amgen), ya
21

están en uso clínico, mientras que otros están en fase de desarrollo preclínico o en
los primeros ensayos clínicos. Sin embargo, aunque fármacos como bevacizumab
están aprobados para su uso en Europa, su aprobación en los Estados Unidos
(para el tratamiento del cáncer de mama) se retiró recientemente por la FDA (Food
and Drug Administration).[43]
En el sitio secundario, las células tumorales circulantes se adhieren a los nichos
vasculares distantes y extravasan los tejidos. El tejido distante es un
microambiente diferente, y la mayoría de las células mueren debido a las
interacciones adhesivas y de crecimiento moleculares incompatibles. Las células
tumorales pueden permanecer latentes en el tejido, ya sea como células
individuales o en forma de micrometástasis clínicamente indetectables. Sólo una
pequeña fracción de las células tumorales desarrollan en metástasis evidentes.
Para establecer el crecimiento en el sitio secundario, se propone que las células
tumoralesse someten a una transición inversa de una célula mesenquimal a una
célula epitelial (TME) y reestablecen mecanismos proliferativos.
A continuación, el la Figura.6, se muestra un esquema con los tratamientos
usados en la actualidad para el CM, así como también, el mecanismo de los
mismos.
22

Figura 6. Tratamientos para el Cáncer de mama.
Modificado de Eckhardt, B.L., et al., Strategies for the discovery and development of therapies for
metastatic breast cancer. Nat Rev Drug Discov, 2012. 11(6): p. 479-497.
a. Sitio primario
b.Sitio secundario
TEM
Quimioterapia
Trastuzumab (HER 2+)
Terapia endocrina (ER+)

Célula endotelial
Membrana basal
Células mioepiteliales
Fibroblasto asociado
a cáncer.
Inflamación (Célula
inmune)
Célula tumoral.
Inhibidores de
angiogénesis
(bevacizumab)
Migración y/o Invasión
Reclutamiento vascular
Inhibidores de
proteasa
Liberación de
Factor de
crecimiento.
Inmunoedición

Inhibidores
de COX2 y
AINE
Inhibidores de proteasa
Antagonistas de integrinas
A circulación sistémica
Extravasación

De circulación
sistémica

OPG, antagonistas de
quimiocinas, RANK-Fc
Mantienen latencia Terapias paliativas (bisphosphonates)
La interacción dinámica entre la célula cancerosa y el
estroma secundario (implica endotelio, MEC local,
fibroblastos y otras células, así como la regulación inmune
a través de factores de crecimiento y quimiocinas)
Metástasis
evidente
Tratamiento específico para metástasis en
hueso (denosumab, bisphosphonates, anti-
PTHRP, anti-TGFβ and anti-ER)
Pérdida del
crecimiento y
displasia.
Ruptura de
MEC
Bloqueadores de
contactos adhesivos
para modificar la MEC
Plaquetas

Reinicia
proliferación
Establecimiento
de células
cancerosas
23

Las mujeres con cáncer de mama triple negativo no se b enefician de la terapia
endocrina o de fármacos como trastuzumab. La quimioterapia es actualmente el
pilar del tratamiento médico sistémico, aunque los pacientes con enfermedad triple
negativo, no tiene buenos resultados en todos los casos. La quimioterapia, sin
embargo, mejora el resultado en mayor medida cuando se utiliza en pacientes con
cáncer de mama triple negativo que cuando se utiliza en pacientes con el subtipo
mucho más común ER-positivo. El uso de neoadyuvantes, implican la
administración de quimioterapia antes de la cirugía, las estadísticas sugieren que
este tratamiento es muy eficaz en la minoría de mujeres con cáncer triple negativo
que tienen una respuesta patológica completa y por lo tanto un resultado
excelente; aunque este tratamiento no es efectivo para todos los casos
reportardos.[22]
3.3.4 CMO en cáncer de mama

La existencia de CMO en cáncer de mama se demostró por primera vez según la
presencia de los marcadores de membrana EpCAM y CD44 y la ausencia o baja
presencia del marcador CD24.[28] En este trabajo se demostró que tan sólo 200
células con este fenotipo eran capaces de formar tumores en ratones NOD/SCID,
a diferencia del resto de células del mismo tumor que, inyectadas en cantidades
hasta 100 veces mayores, no dieron lugar a tumores. Además, esta población
celular dio lugar a toda la heterogeneidad del tumor inicial.[13]
La aldehído deshidrogenasa (ALDH), es una enzima detoxificante asociada con
células madre hematopoyéticas y neurales, se ha identificado como marcador de
las CMO mamarias. Las células tumorales de mama positivas para ADLH tienen
la capacidad de generar tumores que asemejan la heterogeneidad de los tumores
parentales.[29] Congruentemente, un estudio en 577 muestras de pacientes con
carcinoma de mama mostró que la expresión de ALDH correlaciona con mal
pronóstico. En modelos murinos se han utilizado otros marcadores de células
madre para identificar las CMO mamarias. En líneas celulares tumorales
generadas de ratones deficientes de BRCA1, encontraron dos poblaciones
diferentes de posibles CMO: una con el fenotipo CD44+/CD24- y otra siendo
24

CD133+. Ambas subpoblaciones de células son capaces de repoblar las diferentes
fracciones celulares encontradas en las líneas parentales, producen mamo esferas
in vitro, generan tumores en ratones, y expresan el marcador de pluripotencialidad
Oct4. Estos datos, junto con el hecho de que CD133 se utiliza en la identificación
de CMO de colon y de carcinoma hepatocelular , indican que CD133 puede ser
utilizado como un marcador de CMO mamarias. De manera similar, la subunidad
β1 de integrinas (CD29) ha sido señalada como potencial marcador de CMO
mamarias. Las subpoblaciones de células CD24+/CD29+ aisladas de líneas
celulares tumorales generadas en ratones deficientes de BRCA1 muestran la
capacidad de auto-renovación, diferenciación, y tumorigenicidad. Sin embargo,
actualmente se desconoce si las subpoblaciones CD133+ o CD24+/CD29+ están
presentes en tumores humanos o si se superponen con otras poblaciones
previamente descritas.[12] Se ha descrito que la quimioterapia convencional
incrementa la población de células CD44+ CD24- y la capacidad de formar
mamosferas in vitro en tumores de mama avanzados[30], además, en otros
estudios se ha observado que la quimioterapia basada en paclitaxel y epirubicina
aumenta la población de células ALDH positivas en tumores de mama[31]. Por
otro lado, con el objetivo de asociar el contenido de CMO de los tumores de mama
y el pronóstico de la enfermedad, se examinó la presencia de la población CD44+
CD24- en tumores de mama y se observó que en algunos de los casos no había
asociación con un mal pronóstico [32]. Este resultado indica la necesidad de definir
correctamente las CMO para su futuro uso en la clínica.
3.3.4.1 Funciones de CD44
CD44 es una glicoproteína de transmembrana y actua como un receptor para una
amplia variedad de ligandos de MEC, tales como HA (ácido hialurónico), colágeno,
fibronectina, laminina y el factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina
(HB-EGF). El principal ligando de CD44 es el hialuronato. El extremo
aminoterminal de la molécula de CD44 es una fracción constante, muy preservada
en todas las isoformas de esta familia de moléculas. Es precisamente esta
fracción constante la que actúa como locus de unión al hialuronato. El extremo
aminoterminal de la molécula de CD44 es una fracción constante, muy preservada
25

en todas las isoformas de esta familia de moléculas. Estructuralmente, las
proteínas CD44 contienen un módulo de enlace de homología de unión a HA-N-
terminal, el tallo región, dominio transmembrana y un dominio citoplásmico C-
terminal corto como se muestra en la Figura 7. [61]

Modificado de Chanmee, T., Ontong, P., Kimata, K., & Itano, N. (2015). Key roles of hyaluronan and its CD44
receptor in the stemness and survival of cancer stem cells. Frontiers in oncology,
A la isoforma más prolífica de CD44 se le aplicó el término de CD44 estándar (CD44s). Los resultados
obtenidos parecen indicar que las células malignas tienden a expresar un patrón de isoformas variantes más
complejo que su contrapartida normal, incluyendo habitualmente el exón v(6), inicialmente relacionado con la
capacidad metastatásica en trabajos experimentales. Así pues, la expresión de CD44 y sus variantes se ha
correlacionado con la evolución clínica y el pronóstico de distintas neoplasias humanas.[61]

Es altamente expresado en casi todas las células del cáncer en su forma estándar
o variante. Se asocia principalmente con las proteínas que controlan la adhesión
celular, la proliferación, el crecimiento, la supervivencia, la motilidad, la migración,
la angiogénesis y la diferenciación .[33, 34] CD44 también interactúa con
osteopontina y regula sus funciones celulares que conducen a la progresión del
tumor.[35] CD44 se expresa en la superficie de células de cáncer y ayuda a la
diseminacióna torrente sanguíneo, mientras interactúa con P- o L-selectinas [36].
También está implicado en numerosas cascadas de señalización que conllevan a
mejorar iniciaciones tumorales mediante la interacción con los receptores de
vecinos como tirosina quinasa [37]. Las funciones antes mencionadas se
presentan tanto en células normales como cancerosas. Para promover la
Figura 7. Estructura del receptor CD44
Dominio Amino-terminal
Región variante
Dominio transmembranal
Dominio citoplasmático
26

tumorigenesis solo se requieren 100 células de mama CD44+ con propiedades de
células madre como la auto-renovación y diferenciación.[38]
CD44 juega un papel clave en la continuidad de muchas células tumorales
mediante la transmisión de señales anti-apoptóticas, resistencia al estrés oxidativo
y evasión del sistema inmune. [61]
3.3.4.2 Funciones de CD24
CD24 es una molécula de proteína de superficie de granulocitos maduros y células
B ancladas por glicosil-fosfotidil-inositol. En una amplia variedad de células
cancerosas está fuertemente glicosilada y afecta las interacciones con la matriz
celular. Está implicado en la adhesión celular y la metástasis[39]. Esto indica que
CD24 podría ser un marcador significativo en el pronóstico del tumor y el
diagnóstico. Funcionalmente, se identifica como un ligando alternativo para P-
selectina, un receptor de adhesión de plaquetas y células endoteliales [40], a
través del cual su interacción facilita el paso de las células tumorales en el torrente
sanguíneo durante la metástasis[41]. Las asociaciones metastásicos de CD24
aumentan su importancia como factor pronóstico y un nuevo marcador de CMO
[39]. También CD24 parece poseer menos expresión en las células progenitoras
en comparación con las células diferenciadas. Por lo tanto, se requieren estudios
sobre los mecanismos subyacentes en células diferenciadas y no diferenciadas.
[42]
3.4 CCR5

3.4.1 Características generales.

El receptor de quimioquinas, CCR5, es un receptor acoplado a proteína G
responsable de algunos de los efectos de las quimioquinas CCL3, CCL4 y CCL5.
También es uno de los co-receptores para la entrada de virus de la
inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1) en las células.[62]
El papel de CCR5 in vivo es muy variado, se expresa en las subpoblaciones de
linfocitos y monocitos / macrófagos en sangre periferica, los órganos linfoides
primarios y secundarios, y los tejidos no inflamados. En el sistema nervioso
27

central, CCR5 se expresa en neuronas, astrocitos y microglia. En otros tejidos,
CCR5 se expresa en el epitelio, endotelio, músculo liso vascular, y fibroblastos.
CCR5 también está implicado en la activación de células TH helper 1. A
continuación, en la Figura 8, se muestra un esquema del receptor. [62][63]

Figura 8. Receptor CCR5
Modificado de Jason Socrates Bardi. A Simple Strategy for Blocking HIV Transmission Proves Effective in
Pre-Clinical Trials. Vol 3. Issue 31 / News & Views Online weekly of the Scripps Research Institute. October
18, 2004.
3.4.2 Participación de CCR5 en cáncer.

Tal como se ha mencionado previamente el desarrollo y la progresión del cáncer
son procesos multifactoriales, en los que las propiedades intrínsecas de las
células tumorales se unen por factores microambientales, dando lugar a una
cascada perjudicial de eventos que conduce a la malignidad. De todos los
diferentes factores que regulan la tumorigénesis y la metástasis, se ha puesto
mayor énfasis en las quimiocinas y sus receptores. La participación de cada una
quimiocina en específico durante el desarrollo de tumores y la metástasis depende
en gran medida del tipo de tumor y del modelo o sistema que se esté estudiando y
refleja el equilibrio entre los efectos de la quimiocina sobre las células tumorales y
en las células del microambiente del tumor.[60]
Los estudios previos de CM humano en líneas celulares mostraron que los
receptores de quimiocinas CXCR4 y CCR7 se expresan en células de cáncer de
28

mama, tumores malignos de mama y metástasis. Sus ligandos relacionados,
CXCL12 (SDF1) y CCL21, también se expresan en el sitio de la
metástasis (8). Estudios posteriores identificaron la expresión alterada de CCL5
(RANTES) en pacientes con cáncer de mama y se correlacionó con la progresión
de la enfermedad.[43]
CCL5, se describe como un regulador clave de la migración de las células T a los
sitios inflamatorios, se estudió a fondo para sus actividades en el contexto
inmunológico. Esta quimiocina es considerada principalmente como un mediador
inflamatorio, dirigiendo la migración de las células T a sitios dañados o infectados,
la inducción de la coestimulación de células T, y posiblemente la inducción de la
proliferación de células T. CCR5 media las respuestas celulares a CCL5 en otros
tipos de células que expresan el receptor, incluyendo monocitos y macrófagos.[60]
Además se le ha asociado con enfermedades inflamatorias crónicas tales como
artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal y cáncer [44, 45]. Se le ha
atribuido una asociación a la expresión de este receptor en melanoma, cáncer de
pulmón, próstata y páncreas[46-48]. Los hallazgos más sorprendentes hasta el
momento han sido con cáncer de mama [46, 47]. Varias investigaciones han
informado de que CCL5 se detectó en muestras de pacientes con cáncer de
mama y que los niveles de expresión se correlacionaba con progresión de la
enfermedad.[46, 47]
CCR5 es uno de los tres receptores para CCL5, actuando en conjunto con CCR1 y
CCR3. De estos tres receptores, CCR5 es el mejor estudiado debido a su
implicación en la patogénesis del VIH. En similitud con todos los otros receptores
de quimiocinas,, CCR5 es un receptor acoplado a proteína G de siete asas
transmembranales, mediando diversas cascadas de señalización en respuesta a
sus ligandos. CCR5 es un receptor promiscuo, la unión con alta afinidad CCL5,
CCL3 (MIP-1a), y CCL4 (MIP-1b), todos ellos asociados con las respuestas en
células de tipo Th1.[60]
Se sabe que CCL5 puede ser expresada y secretada por las células, ya sea de
cáncer de mama [49] o por las células estromales no malignas en los sitios
29

primarios o metastásicos [50]. Sin embargo, los papeles de CCL5 y sus receptores
en el cáncer de mama aún no se han descrito totalmente. CCL5 facilita la
progresión de la enfermedad mediante el reclutamiento y la modulación de la
actividad de las células inflamatorias, que posteriormente modifican el
microambiente del tumor [51]. Además, el papel prominente de CCL5 en
quimioatracción de leucocitos ha planteado la posibilidad de que CCL5 determina
el tipo y los niveles de leucocitos infiltrados en los tumores, afectando la inmunidad
antitumoral. Por consiguiente, se puede decir que, la inhibición de su receptor
(CCR5) por un antagonista peptídico reduce la infiltración de leucocitos y el
crecimiento tumoral. [43] Se ha descrito, de igual manera, que la expresión
forzada de CCL5, aumentó la metástasis tumoral en aproximadamente 1,8 veces
más, en un estudio de la línea celular MDA-MB-231, pero no tuvo ningún efecto en
la línea celular de cáncer de mama 168. [50, 52]
CCL5 aumenta la migración de células de condrosarcoma. Uno de los
mecanismos que subyacen a la migración CCL5 dirigida era transcripcional
regulación de MMP-3 y la activación de CCR5, PI3K, Akt y vías de NF-kB. A
continuación se presenta un esquema de las vías de señalización implicadas en la
migración inducida por CCL5 y de expresión de MMP-3 en células de
condrosarcoma. La interacción de CCL5 y CCR5 activa PI3K y Akt, que a su vez
induce la activación de NF-kappa B, que conduce a la expresión de MMP-3 y
aumenta la migración de células de condrosarcoma humanas.[53]
La metástasis es un proceso que permite a las células tumorales invadir tejidos
adyacentes y distantes. Dichoproceso es regulado por quimiocinas y para el caso
del cáncer de mama se ha descrito la expresión y participación de CXCR4, CCR7
y CCL5 (RANTES). Recientemente se ha analizado la expresión y el papel de
CCR5 en células de cáncer de mama, colorectal, prostáta y pulmón, sugiriendo
que CCR5 es un receptor que participa en la invasividad y metástasis (Figura 9).
30

Figura 9. Mecanismo de CCL5 con su receptor CCR5.

La interacción de CCL5 y CCR5 activa la vía PI3K y Akt, que a su vez induce la activación de NF-Κb, qye
lleva a la expresión de MMP-3 e incrementa la migración de células provenientes de un condrosarcoma
humano

IV. JUSTIFICACIÓN E HIPÓTESIS
En la actualidad, existe evidencia para apoyar la idea de que el uso de los
marcadores de superficie CD44(+) y CD24(-) en combinación con la actividad la
enzima ALDH1, es el método más preciso para identificar y aislar células CMO
dentro de las poblaciones celulares encontradas en el cáncer de mama. Debido a
que tienen mal pronóstico, y no existe hasta el momento, terapias efectivas que
ayuden a erradicarlas, se buscan tratamientos que puedan ayudar a mejorar la
esperanza de vida de pacientes que las presentan. Por otro lado,se ha analizado
la expresión y el papel de CCR5 en células de cáncer de mama, sugiriendo que
CCR5 es un receptor que participa en la invasividad y metástasis. De tal manera
que si se comprueba su correlación con el fenotipo ya descrito para las CMO se
podrá usar como una nueva diana terapéutica dirigida a este receptor, que, a su
Figura 9. Mecanismo de CCL5 con su receptor CCR5.
Modificado de Tang, C.-H., et al., Involvement of matrix metalloproteinase-3 in CCL5/CCR5 pathway of
chondrosarcomas metastasis. Biochemical Pharmacology, 2010. 79(2): p. 209-217
31

vez, ayudaran a la obtención de un tratamiento más específico para este fenotipo
y de esta manera ayudar a la eliminación de estas pequeñas poblaciones que
pueden desencadenar recaídas y generación de metástasis en muchos de los
pacientes.
V.OBJETIVOS
5.1 Objetivo general

-Fenotipificar líneas celulares: MDA-MB-361, MDA-MB-231, SK-BR-3, Hs578T con
marcadores de CMO, como son CD44 y CD24 y la enzima Aldehído
deshidrogenasa así como evaluar la coexpresión con CCR5, con el objetivo de
que pudieran ser utilizadas como modelos para estudiar o evaluar fármacos contra
las células CMO.
5.2 Objetivos particulares

-Estandarizar la metodología Correspondiente al kit Aldefluor™, así como las
correspondientes a las tinciónes extracelulares realizadas durante el desarrollo de
la tesis.
-Determinar la actividad de la ALDH en las diferentes líneas celulares de CM.
-Determinar la expresión de cada uno de los marcadores de superficie y la
correlación existente del fenotipo deseado.
-Evaluar la coexpresión de los marcadores de CMO con CCR5 en las líneas de
cáncer de mama.
VI.MATERIALES Y MÉTODOS
6.1 Líneas celulares.

Las líneas celulares empleadas durante este trabajo fueron obtenidas de la
“American Type Culture Collection” (ATCC), con excepción de SUM159T, esta
última, es una donación proveniente del Laboratorio de Farmacología Molecular,
32

ubicado en la Facultad de Medicina; UNAM; a cargo del Dr. Marco A. Velasco V.
Cada línea tiene características muy específicas que son descritas a continuación:
Tabla 1.Características de las Lineas celulares empleadas durate el ensayo.
Línea Celular Sitio de Origen Patología1 Edad (años) Otras características
SKBR3
Glándula mamaria /
pecho; derivado del lugar
de la metástasis: derrame
pleural.
AC 43
Sobre expresa el
receptor Her2.

MDA-MB-361
Glándula mamaria /
pecho; derivado del lugar
de la metástasis: cerebro.
AC 40
-Sobre expresa el
receptor Her2.
-Expresa el receptor
ER
MDA-MB-231
Glándula mamaria /
pecho; derivado del lugar
de la metástasis: derrame
pleural.
AC 51 Triple negativa2
Hs578T
Glándula mamaria;
Proviene de un tumor
primario
IDC 74 Triple negativa2
SUM159T Glándula mamaria. IDC NA Triple negativa2
1Patología: AC, adenocarcinoma; IDC, Carcinoma lobular infiltrante.
2 No presenta ninguno de los receptores ER- PR- y Her2.
6.2 Cultivo celular.
Para realizar el crecimiento de las líneas celulares se usaron los medios y
condiciones de cultivo indicados por la ATCC para cada una en particular;
cuidando que la confluencia de los cultivos fuera menor al 70%y el número de
pase no mayor a 20. En la siguiente tabla se muestran los medios de cultivo,
suplementos y condiciones de incubación usados para cada línea:
Tabla 2. Medios de Cultivo y suplementos empleados durante el crecimiento de las lineas
celulares.
Línea
Celular Medio de cultivo Suplementos
SKBR3 McCoy´s (ATCC, Catálogo; 30-2007) 10% SFB (Gibco, Catálogo; 16000-044)
MDA-
MB-361
L-15 (ATCC,
Catálogo; 30-2007) 20% SFB (Gibco, Catálogo; 16000-044)
MDA-
MB-231
L-15 (ATCC,
Catálogo; 30-2007) 10% SFB(Gibco, Catálogo; 16000-044)
Hs578T DMEM (ATCC, Catálogo; 30-2002)
10% SFB (Gibco, Catálogo; 16000-044), 0.01mg/ml de
Insulina (Santa Cruz Catálogo;sc-360248 )
SUM150
PT
F12-HAM
(Invitrogen,
Catálogo;11765-
047)
10% SFB(Gibco, Catálogo; 16000-044), Insulina(Santa Cruz
Catálogo;sc-360248), Hidrocortisona (Sigma,
Catálogo;H0135-1MG).
33

Con el fin de preservar el material biológico utilizado, todos estos procedimientos
se realizaron en condiciones de esterilidad, en una cabina de bioseguridad de flujo
laminar, además, se cuidó en todo momento las condiciones de incubación de
cada una de las líneas empleadas.
Las líneas celulares se incubaron a 37ºC y con 5% de CO2 con excepción de las
Líneas MDA-MB-231 y MDA-MB-361 que se cultivan a la misma temperatura,
pero, sin CO2. Los cambios de medios se realizaron cada 3 a 4 días con el fin de
renovar los nutrientes necesarios para el crecimiento celular, disponiendo
previamente el medio en baño maría a 37ºC antes de utilizarlo para evitar
variaciones de temperatura durante su manipulación, además, antes de adicionar
el medio nuevo a las células, se realizaba un lavado con PBS (Gibco, Cat;70011-
069) a una concentración 1X ,este buffer consiste en una solución de agua y sales
que contiene Cloruro de Sodio (NaCl), fosfato de sodio (Na2HPO4), Cloruro de
potasio (KCl), y Dihidrógeno fosfato de potasio (KH2PO). Las condiciones de
osmolaridad y concentración de iones en la solución son similares a las
encontradas en el cuerpo humano (isotónicas), lo que permite el uso de este buffer
en los cultivos. Todas las líneas celulares empleadas son adherentes, por lo que,
para poder cosecharlas y obtener una suspensión celular totalmente homogénea y
de concentración conocida, se despegaron de la caja de cultivo donde se
mantenían creciendo. Este procedimiento no cambio entre cada línea celular, y se
realizó de acuerdo al ANEXO I.
6.3 Tinciones celulares.

Entre las principales características que se utilizan para identificar las CMO en
cáncer de mama se encuentran la expresión diferencial de diversos marcadores
de superficie como lo son CD44 y CD24. En cuanto a la expresión de actividad
celular, se usará la enzima ALDH como indicador de CMO. La actividad de ALDH
se demuestra comúnmente mediante un ensayo de citometría basado en el
reactivo ALDEFLUOR®. Por ello, la subpoblación de CMOs que presenta alta
actividad de ALDH, emite fluorescencia intensamente y puede ser detectada
34

mediante el citómetro. En el siguiente esquema se muestra un panorama general
de lo que buscaremos en cada una de las líneas celulares provenientes de CM.

Modificado de Vaz, A. P., Ponnusamy, M. P., Seshacharyulu, P., & Batra, S. K. (2014). A concise review on
the current understanding of pancreatic cancer stem cells.Journal of cancer stem cell research, 2.
6.3.1 Tinción con ALDEFLUOR®

El sistema ALDEFLUOR® es empleado para la identificación, evaluación,y el
aislamiento de las células madre y progenitoras en función de su expresión de la
enzima aldehído deshidrogenasa (ALDH), en lugar de usar solamente el fenotipo
de la superficie celular. El reactivo ALDEFLUOR® activado, BODIPY-
aminoacetaldehído (BAAA), es un sustrato no tóxico para la detección de ALDH,
que libremente se difunde a través de las células viables mediante sus
membranas intactas. En presencia de ALDH, BAAA es convertido en BODIPY-
aminoacetato (BAA), que está retenida en el interior las células. La cantidad de
producto de reacción fluorescente es proporcional a la actividad ALDH en las
células y se mide usando un citómetro de flujo. Se emplea un inhibidor de la
ALDH, dietilaminobenzaldehido (DEAB), como control negativo y de esta manera,
eliminar la fluorescencia de fondo.
El reactivo seco ALEDUFLUOR® (STEMCELL; Catalogo: 01700) se proporciona
en una forma inactiva estable por lo que para su uso deberá ser disuelto en DMSO
cambiándolo a la forma activada fluorescente mediante tratamiento con HCl 2N y
por ultimo diluyéndolo con tampón de ensayo incluido en el Kit.
Posteriormente se teñirán las muestras. Por cada una de ellas se deberá colocar
un control, de preferencia, todos los reactivos se deberán usar a una temperatura
CCR5
CD44
Figura 10. Esquema general de la célula con el fenotipo buscado

de 4ªC. En el tubo donde se realizará la tinción de la muestra se colocará una
cantidad de 500,000 células en un volumen final de 1mL de cada línea celular por
separado para después adicionarle 5μL de ALDEFLUOR® activado, se mezcla
perfectamente a una temperatura de 4°C y se pasan 500μL de esta suspensión a
otro tubo que se tomará como el control, previamente se debe añadir, a este
último, 7 μL de DEAB (incluido en el kit) que tiene la función de inhibir la actividad
de ALDH. Cada tubo deberá contener 250,000 células como concentración final.
Una vez realizado este procedimiento para cada línea celular se incubara durante
45 min a una temperatura de 37°C y protegiéndolo de la luz, las condiciones de
CO2 dependerán de la línea celular teñida, ya que unas lo requieren y otras no. A
continuación se muestra un esquema de la tinción antes descrita:

Añadir 5μL de
ALDEFLUOR
activado
Suspensión con
500,000 células/mL
Añadir 7μL de
Inhibidor DEAB
Transferir
0.5mL
Incubar a 37°C por 45 minutos
protegido de la luz.
Figura 11.Tinción de ALDH con el Kit ALDEFLUOR®.

Después de la incubación se centrifugara a 250 g durante 5min. Se desecha el
sobrenadante y el pellet se debe lavar con en 500μL de Buffer de ensayo incluido
en el Kit a una temperatura de 2-8°C y se centrifugó en las mismas condiciones y
se desechó el sobrenadante, se conservó el pellet resultante que será teñido
posteriormente. A partir de este momento es recomendable que las células se
manipulen con mucho cuidado y a una temperatura de 2-8°C ya que, variaciones
en la temperatura, pueden interferir con la tinción.
6.3.1.1 Análisis para la tinción con ALDEFLUOR®

En el citómetro FACSaria III se adquirieron los tubos con las muestras por
separado, uno de ellos corresponde a la tinción (Figura 9.1), uno más, al control
con inhibidor (DEAB) (Figura 9.2), además se incluyó un último tubo
correspondiente a la autofluorescencia (Figura 9.C). La selección de las
poblaciones se retomará en el apartado “VI.RESULTADOS”. En la figura 10 se
muestran los dot-plot obtenidos por el citómetro:

En la Figura 11.A se muestra un dot-plot , donde el parámetro SSC-A corresponde a la granularidad de las
células en una escala lineal contra FITC-A que nos evidencia la expresión de la enzima ALDH.
6.3.2 Tinción de marcadores extracelulares

Después de evidenciar la enzima ALDH con el kit ALDEFLUOR®, se realizó la
tinción de los receptores extracelulares de interés de las mismas muestras, con
Figura 11. Selección de células ADLH positivas.
C
FITC-A ALDH (+)
SS
C
-A

B A
37

anticuerpos marcados a diversos fluorocromos, como se indica en la siguiente
tabla:
Tabla 3.Anticuerpos usados durante la tinción extracelular.
Anticuerpo/ Fluorocromo Marca Catálogo Clona Volumen para teñir 250,000 células
Anti CD44-HORIZON V450 BD 562890 G44-26 0.5µL
Anti CD24-PE BD 555428 ML5 2.5µL
Anti CCR5-APC RyD FAB1802A CTC5 1.25µL

Cada anticuerpos se tituló para definir la cantidad mínima necesaria que se
requiere para observar la señal emitida por el fluorocromo acoplado al anticuerpo
dirigido para las moléculas en cuestión y de esta manera, optimizar el reactivo.
Para hacer una adecuada fenotipificación de realizo el panel de las señales de
emisión, de tal manera que no interfieran entre cada una de ellas. Este panel se
encuentra en la siguiente figura:

Se realizó el método directo, es decir, el anticuerpo marcado reacciona
directamente con el antígeno al que va dirigido, en este caso, el receptor que
estamos buscando. A continuación se muestra un esquema de la unión antígeno-
anticuerpo.
530nm 585nm 660nm 450nm
Figura 12. Espectros de emisión en los fluorocromos utilizados durante el ensayo.
Tomado de BD Biosciences; BD FLUORESCENCE SPECTRUM VIEWER; Recurso en línea
<http://www.bdbiosciences.com/us/s/spectrumviewer>
%
E
m
is
ió
n

Figura 13.Método Directo de marcaje de anticuerpo con marcador fluorescente.
Esquema modificado de Nitzipper ; Nanoimmunotech; inmunofluorescencia;
<http://dukesupport.in/projects/nitzipper/inmunofluorescencia/?lang=es>

Para la realización de esta técnica, se tomó en cuenta el número de células que se
tenían en el tubo, de tal manera, que alcanzara el anticuerpo para cada uno de las
muestras a teñir.
Se realizó un “pool” con todos los anticuerpos ya mencionados, tomado como
volumen final, 100μL por cada tubo del ensayo. Después de realizar el último
lavado, se añadieron los anticuerpos, se resuspendió el contenido del tubo y se
dejaron incubando por 30 min a una temperatura de 4ºC. Posteriormente se
lavaron las células teñidas con 1mL de buffer (Incluido en el kit de ALDEFLUOR®)
y centrifugando a 250 x g durante 5min. Se leyeron en fresco en un citómetro
FACSaria III, en todos los casos se procesaron inmediatamente después de ser
teñidas y de capturaron 100,000 eventos. Este procedimiento se ejemplifica en el
siguiente esquema:

Pool de
anticuerpos
Muestra
(Línea celular a
feontipificar)
100µL
Incubación
por 30min
4°C
Figura 14.Técnica para la tinción extracelular.
Esquema modificado de Nitzipper ; Nanoimmunotech; inmunofluorescencia;
<http://dukesupport.in/projects/nitzipper/inmunofluorescencia/?lang=es>
Lavado Adquisición
en citómetro
Anticuerpo
Receptor celular
Fluorocromo
39

VII. RESULTADOS
Los datos obtenidos del Citómetro FACSaria III fueron analizados con el software
Flowjo® 7.6 y se realizaron diferentes estrategias para evaluar la expresión de los
marcadores CD44+,CCR5+, la presencia de la enzima ALDH y la ausencia de
CD24-. Se usaron cinco líneas celulares en total: SKBR3 y MDA-MB361, son
HER2+, mientras que MDA-MB-231, SUM159T y HS578T son Triple negativas,
esto quiere decir que no expresan ER,PR, además de ser Her2-. Lo planeamos
así, debido a que queremos ver si la presencia de Her2 afecta directamente la
proporción de CMO con el fenotipo que estamos buscando, además, de poder
observar si este correlaciona con la presencia o ausencia del receptor CCR5.
a) Presencia de los receptores por cada línea celular.
Para ejemplificar esta selección se usó la línea celular SKBR3 (Figura15).

Figura 15. Ejemplo de la estrategia de análisis para la determinación CCR5 en células
SKBR3.
Con los parámetros tamaño-área (FSC-A) contra tamaño-altura (FSC-H) se seleccionaron los eventos únicos,