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Biología

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
FACULTAD DE CIENCIAS
BIOLOGÍA EXPERIMENTAL
Análisis de la expresión de catalasas de Debaryomyces hansenii en
Saccharomyces cerevisiae

TESIS
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:
MAESTRA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
PRESENTA:
Ileana de la Fuente Colmenares

TUTORA PRINCIPAL DE TESIS:
Dra. Claudia Andrea Segal Kischinevzky
Laboratorio de Biología Molecular y Genómica, Facultad de Ciencias, UNAM

COMITÉ TUTOR:
Dra. María Alicia González Manjarrez
Instituto de Fisiología Celular, UNAM
Dr. Arturo Carlos II Becerra Bracho
Laboratorio de Origen de la Vida, Facultad de Ciencias, UNAM

CIUDAD DE MÉXICO, JUNIO DE 2017
UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis
Digitales Restricciones de uso

DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA
SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL
Todo el material contenido en esta tesis está
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Autor (LFDA) de los Estados Unidos
Mexicanos (México).
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demás material que sea objeto de protección
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para fines educativos e informativos y deberá
citar la fuente donde la obtuvo mencionando el
autor o autores. Cualquier uso distinto como el
lucro, reproducción, edición o modificación,
será perseguido y sancionado por el respectivo
titular de los Derechos de Autor.

UN 1\1 1\
I . ,
Ciencia."t Biológica,
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
FACULTAD DE CIENCIAS
DIVISiÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO
COORDINACIÓ:-l
OFICIO FCIE/DEP/337/2017
ASUNTO Oficio de Jurado
Lic. Ivonne Ramirez Wence
Directora General de Adm inistración Escolar, UNAM
Presente
Me permito Informar a usted que en la reunión ordinaria del Comité Académico del Posgrado en
Ciencias Biológicas celebrada el dia 13 de marzo de 2017 se aprobó el sigUiente jurado para el
examen de grado de MAESTRA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS en el campo de conoCimiento de
Biologia Experimental del (la) alumno(a) DE LA FUENTE COLMENARES ILEANA con numero
de cuenta 407075896 con la tesis titulada " Anális is de la expresión de catalasa. de
Debaryomyces hansenil en Saccharomyces cerevisiae", realizada baJo la dirección del (la)
DRA. CLAUDIA ANDREA SEGAL KISCHINEVZKY:
PresIdente
Vocal
Secretario
Suplente'
Suplente.
DR GEOVANI LOPEZ ORTlz
DRA LUISAALVARINAALBA LOIS
DRA MARIA ALICIA GONZALEZ MANJARREZ
DR ARTURO CARLOS 11 BECERRA BRACHO
DR ROBERTO ALEJANDRO ARREGUIN ESPINOSA DE LOS MONTEROS
Sin otro particular, me es grato enviarle un cordial saludo
r:OORDINACIÓN
MCAAlMJ FM/ASRlgrf'
ATENTAMENTE
" POR MI RAZA HABLARA EL EspíRITU"
Ciudad UniVersitaria, Cd Mx, a 9 de mayo de 2017
DRA. MARIA DEL CORO ARIZMENDI ARRIAGA
COORDINADORA DEL PROGRAMA
Lni dad de PO"igradu ' Coordinad on dt" l Po"l"líIdo t'n Ciencib BiololZicas Edificio D, l e r. Pi 'tO, C il"C"uilo de- Posgrado!!i Cd. Lnivrrsitaria
Delegar ion CO)-oilu.:an C.P ().15 10 Men eo. D.F Tcl. >623 7002 ht1:p:flpebiol.posgrado.unam.mx

Agradecimientos

Agradezco primeramente al Posgrado en Ciencias Biológicas de la UNAM por aceptarme
como estudiante de maestría y brindarme las herramientas y oportunidades para poder
culminar este trabajo de investigación. En segundo lugar, quisiera agradecer al CONACYT
por el apoyo que me brindó con la beca nacional para estudios de maestría, con el CVU
número 620472; apoyo sin el cual no habría sido posible la dedicación que fue necesaria
para realizar mis experimentos.
Agradezco también a la Dra. Claudia Andrea Segal Kischinevzky por dirigir mis estudios de
maestría como tutora principal, brindándome lo necesario para poder llevar a cabo mi
proyecto de investigación, por su apoyo incondicional, por sus consejos y por toda la
paciencia y las enseñanzas que me ha dado durante estos años. Agradezco a la Dra. María
Alicia González Manjarrez, miembro de mi Comité tutor, quien mostró una excelente
disposición, siempre me apoyó y estuvo presente para aconsejar, discutir y enriquecer este
trabajo con su experiencia en la genética y microbiología de levaduras y por último al Dr.
Arturo Carlos II Becerra Bracho, miembro de mi Comité tutor, quien me brindó su apoyo
desde el primer día que decidí ingresar al posgrado, aportando comentarios constructivos
y motivando mi capacidad de análisis para poder realizar este trabajo.

Agradecimientos a título personal
Estoy muy contenta de poder terminar este trabajo, que no hubiera sido posible sin la ayuda
y el apoyo de mi esposo Osvaldo; gracias por estar ahí en los triunfos y en las derrotas y
ser mi pilar de apoyo principal; a mi hijo Ilán, por todas esas veces que me acompañaste al
Laboratorio y esperaste pacientemente a que yo terminara mis experimentos y por ser la
fuerza que mueve mi día a día. A mi familia, especialmente a mis papás Felipe y Elsa,
quienes me han apoyado incondicionalmente desde siempre, cómo olvidar el semestre que
mi mamá estuvo viniendo un día a la semana para cuidar a su nieto mientras yo estudiaba.
A mis hermanas, Fer, Luci y sobretodo a María: estaré eternamente agradecida por todas
las tardes que pasaste cuidando a Ilán y siendo una excelente tía con él.
Agradezco también a mis abuelas Alicia y Mónica, quienes han estado al pendiente de mi
trayectoria académica y me han apoyado con todo su cariño, a mis tíos Octavio, Mónica,
José Manuel, Leilah, Aimeé, Raúl y Jorge y a toda mi familia y amigos en general, quienes
han mostrado su apoyo y entusiasmo con mis estudios en Biología experimental en todo
momento. A mis suegros Francisco y Martha, cuyo apoyo constante ha sido y es primordial
para el desarrollo de mis estudios en la UNAM.
Me gustaría resaltar mi agradecimiento especial y más importante referente a la técnica y
el trabajo experimental desarrollado para la escritura de esta tesis a la Química Viviana
Escobar, quien me enseñó todo lo necesario para llevar a cabo mi proyecto, desde la
preparación de las soluciones amortiguadoras y los reactivos necesarios, pasando por las
técnicas de biología molecular hasta el análisis de los resultados obtenidos. A la Dra. Luisa
Alba Lois por todo el apoyo que me ha brindado a través de clases, seminarios, discusiones
y pláticas en torno a la microbiología de las levaduras, así como los comentarios pertinentes
para la versión final de esta tesis. Al Dr. Geovani López, gracias enormes por todo el apoyo
que mostraste desde el inicio de este proyecto hasta su culiminación. Al Dr. Roberto
Arreguín, por todos los comentarios importantes hacia mi trabajo y por su excelente apoyo
como revisor.
Al Dr. Victor Valdés por sus enseñanzas sobre biología molecular, al Mtro. Alfonso Vilchis,
por sus comentarios enriquecedores durante las discusiones de mi trabajo, y al Laboratorio
de Biología Molecular y Genómica de la Facultad de Ciencias, incluyendo a Moni, Román,
Diana, Daniel, Jorge, Paulina, Avelardo, Aristides, Tamara, Osmar y Columba ¡gracias!

Dedico esta tesis a las dos mujeres que me enseñaron que para
cumplir tus sueños es necesario trabajar duro y mantener la frente en
alto a pesar de las adversidades, con mucho cariño, a mis abuelas
Mónica y Alicia.

ABREVIATURAS
µg - Microgramo
µL - Microlitro
µm - Micrómetro
A260 - Índice de absorbancia a 260 nm
A280 - Índice de absorbancia a 280 nm
AP-1 - Protetína activadora 1
BamHI - Enzima de restricción BamHI
Bgl II - Enzima de restricción Bgl II
BLA - Gen que codifica para la enzima β-
lactamasa, que confiere resistencia a
ampicilina
BSA - Proteína de albúmina de suero bovino
(Bovine Serum Albumin)
CTA - Catalasa A
CTA - Gen que codifica a la catalasa A,
peroxisómica
ctaΔ/cttΔ - genotipo acatalasémico
CTT - Catalasa T
CTT - Gen que codifica a la catalasaT,
citoplasmática
D. hansenii - Debaryomyces hansenii
Dh/ScCTT1 - gen quimérico con el promotor
del gen DhCTT y región codificante
del gen ScCTT1
DhCTT - Gen que codifica a la catalasa T de
D. hansenii
DMSO - Dimetilsulfóxido
DNA - Ácido desoxirribonucleico
dNTPs - Desoxinucleótidos trifosfatados
DO600nm - Densidad óptica a 600 nm
E. coli - Escherichia coli
EDTA - Ácido etilendiaminotetraacético
EROs - Especies reactivas del oxígeno
g - Gramos
GCN4 - Factor de transcripción de
biosíntesis de aminoácidos
(GeneralControl Nonderepressible)
H2O - Agua
H2O2 - Peróxido de hidrógeno
HindIII - Enzima de restricción Hind III
HSF1 - Factor de transcripción de choque
térmico (Heat Shock transcription
Factor)
K - lisina
Krpm - Millares de revoluciones por minuto
L - Leucina
LB - Lysogenic broth
M - Metionina
mg - Miligramo
mL - Mililitro
mM - Milimolar
Msn2 - Factor de transcripción de respuesta
al estrés (Multicopy suppressor of
SNF1 mutation 2)
Msn4 - Factor de transcripción de respuesta
al estrés (Multicopy suppressor of
SNF1 mutation 4)
NaCl - Cloruro de Sodio
NADPH+ - Nicotinamida adenina dinucleótido
fosfato, en su forma reducida.
ng - nanogramos
nm - nanómetros
O2 - Oxígeno molecular
O2
. - Anión superóxido
OH- - Radical hidroxilo
OxyR - Factor de transcripción de respuesta
al peróxido de hidrógeno (Hydrogen
peroxide-inducible genes activator)
PCR - Reacción de la polimerasa en cadena
PEG 4000 - Polietilenglicol 4000

ROX1 - Factor de transcripción de respuesta
al oxígeno (Regulation by OXygen)
rpm - revoluciones por minuto
S. cerevisiae - Saccharomyces cerevisiae
SalI - Enzima de restricción SalI
Sc/DhCTT - gen quimérico con el promotor
del gen ScCTT1 y región codificante
del gen DhCTT
ScCTA1 - Gen que codifica a la catalasa A de
S. cerevisiae
ScCTT1 - Gen que codifica a la catalasa T de
S. cerevisiae
SD - Medio mínimo Synthetic Dextrose
SKN-7 - Factor transcripcional para genes de
respuesta a choque térmico en
respuesta a estrés oxidante
(Suppressor of Kre Null)
SOD - Superóxido dismutasa
SoxR/S OxyR - Factor de transcripción de
respuesta al anión superóxido
(Redox-sensitive transcriptional
activator)
STRE - Elemento de respuesta al estrés
Taq - DNA polimerasa de Thermus
aquaticus

TE - Solución amortiguadora de Tris-EDTA
TEL - Solución amortiguadora Tris-EDTA y
acetato de litio
TELP - Solución amortiguadora de Tris-
EDTA, actetato de litio y PEG 4000
Tm – Temperatura de desnaturalización de un
segmento de DNA dado
Ura - Uracilo
YAP1 - Proteína activadora 1 de levadura
(Yeast Activator Protein 1)
YPAD - Medio rico Yeast, Peptone, Adenine,
Dextrose
YPD - Medio rico Yeast, Peptone, Dextrose.
ΔCTA - genotipo mutante sencilla sin catalasa
A
ΔCTT - genotipo mutante sencilla sin catalasa
T

ÍNDICE
............................................................................................................................................................. 1
RESUMEN ......................................................................................................................................... 1
ABSTRACT ....................................................................................................................................... 2
INTRODUCCIÓN .............................................................................................................................. 3
Formación de EROs: fuentes endógenas y exógenas de especies reactivas del
oxígeno ......................................................................................................................................... 4
Reacciones de oxidación y reducción en los seres vivos .............................................. 5
Daños oxidantes ......................................................................................................................... 6
Oxidación de lípidos ................................................................................................................. 6
Oxidación de proteínas ............................................................................................................ 6
Oxidación de ácidos nucleicos ............................................................................................... 7
Los cambios de estado redox vistos como sistema informacional: transducción
de señales redox ........................................................................................................................ 8
Peróxido de hidrógeno ........................................................................................................... 10
Mecanismos de defensa celular ante el estrés oxidante ............................................... 10
Regulación genética de la respuesta al estrés oxidante ............................................... 11
Regulación de las catalasas mediada por peróxido de hidrógeno ................................. 13
Catalasas .................................................................................................................................... 13
Debaryomyces hansenii, una levadura no convencional .............................................. 14
Saccharomyces cerevisiae .................................................................................................... 14
Comparación de las catalasas de Debaryomyces hansenii y Saccharomyces
cerevisiae ................................................................................................................................... 15
OBJETIVOS .................................................................................................................................... 17
ANTECEDENTES .......................................................................................................................... 18
MATERIAL Y MÉTODOS .............................................................................................................. 20
RESULTADOS ................................................................................................................................ 45
Discusión ......................................................................................................................................... 67
CONCLUSIONES ........................................................................................................................... 75
LITERATURA CITADA .................................................................................................................. 76
Anexo I. Protocolos experimentales ................................................................................................ 80
1. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO ................................................................................. 80
2. ESTRIADO DE CULTIVOS SÓLIDOS EN MEDIO CON AGAR ........................................................ 82
3. PRE-CULTIVO OVERNIGHT O DE FIN DE SEMANA Y LAVADO DE CÉLULAS. .............................. 83

4. PRUEBAS DE AUXOTROFÍAS EN PLACAS DE MEDIO MÍNIMO SUPLEMENTADO ....................... 85
5. INICIO DE UN CULTIVO LÍQUIDO CON CRECIMIENTO MONITOREADO .................................... 86
6. PREPARACIÓN DE EXTRACTOS CRUDOS DE PROTEÍNA ........................................................... 87
7. PREPARACIÓN DE ALÍCUOTAS PARA CURVA PATRÓN DE BSA PARA MÉTODO BRADFORD DE
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS. ........................................................................................... 88
8. MÉTODO DE BRADFORD PARA CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS. .......................................... 89
9. ENSAYO DE DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ESPECÍFICA DE CATALASA ................................. 90
10. PAGE NATIVO .........................................................................................................................91
11. ZIMOGRAMA CON TINCIÓN ESPECÍFICA PARA ACTIVIDAD DE CATALASA. .............................. 93
12. EXTRACCIÓN DE DNA GENÓMICO DE S. cerevisiae Y D. hansenii ............................................ 94
13. OBTENCIÓN DE DNA PLASMÍDICO A PEQUEÑA ESCALA (MINIPREP) ....................................... 96
14. CUANTIFICACIÓN DE DNA EN NANOESPECTROFOTÓMETRO NANOPHOTOMETER PEARL ...... 97
15. VERIFICACIÓN DE CALIDAD DEL DNA EN GEL DE AGAROSA al 1% ........................................... 97
16. LAVADO DE MICROPERLAS DE VIDRIO PARA SU REUSO Y ESTERILIZACIÓN. ............................ 98
17. TRANSFORMACIÓN DE Saccharomyces cerevisiae .................................................................. 99

Índice de figuras
Figura 1. Química redox del agua y formación de las especies reactivas del oxígeno………….......5
Figura 2. Mecanismo global de señalización redox en residuos de cisteína…….. ……………………9
Figura 3. Sistema de reciclaje de proteínas con residuos de cisteínas mediante la ruta de las
pentosas fosfato y las peroxirredoxinas que funcionan como un interruptor biestable……………….9
Figura 4. Estrategia de clonación de las secuencias de referencia ScCTT1 y
DhCTT………………………………………………………………………………………..…………..….26
Figura 5. Estrategia de clonación de las quimeras Dh/ScCTT1 y Sc/DhCTT………………….……27
Figura 6. Mapa del plásmido pRS316::DhCTT ejemplificando el patrón de secuenciación a seguir,
denotado con números de colores las regiones que se espera cubrir con cada lectura y su dirección
según el primer utilizado para cada reacción de secuenciación…………………………………..…36
Figura 7. Ejemplo de la prueba rápida de actividad de catalasa mostrando una prueba positiva (1) y
una negativa (2)……………………………………………………………………………………………39
Figura 8. Prueba de auxotrofía para uracilo en la tétrada a utilizar………………………………….45
Figura 9. Actividad específica de catalasa (mmolH2O2oxidado/min/mg proteína) de extractos
proteicos de la fracción soluble obtenida de de las variantes de la cepa BY4743 acatalasémica,
silvestre, ΔCTA, ΔCTT y S288c silvestre……………………………………………………………….47
Figura 10. Zimogramas con tinción específica para actividad de catalasa. CC= catalasa comercial,
Sc = S288c, ΔCTA = ΔA, ΔCTT = ΔT, Wt = silvestre y acat = acatalasémica.
……………………………………………………………………………………………………..47
Figura 11. Curvas de crecimiento en medio YPD y YPD NaCl (0.6M)………………………..…….48
Figura 12. Curvas de crecimiento en medio SD HMLKUra de las variedades silvestre, acatalasémica,
ΔCTA, ΔCTT de la cepa BY4743………………………………………………………………….…….49
Figura 13.Geles de agarosa al 1% teñidos con 0.3% de GelRed con los productos de PCR
purificados: A) 1) DhCTT, 2) ScCTT1 y 3) Axygen DNA ladder 100 pb; B) 1) Axygen DNA ladder
100pb, 2) promotor DhCTT, 3) promotor ScCTT1, 4) ORF DhCTT y 5) ORF
ScCTT1……………………………………………………………………………………………….…….50
Figura 14. Gel de agarosa al 1% teñido con 0.05% de GelRed con los productos del PCR de
sobrelape después de su purificación mediante columna 1) Axygen DNA ladder 100 pb, 2) Dh-
ScCTT1 (3210 pb) y 3) Sc-DhCTT (3195 pb)……………………………………………………….…..51
Figura 15. Gel de agarosa al 1% con los productos del PCR de colonia…………….………………52
Figura 16. Gel de agarosa al 1% con el resultado de las reacciones de digestión dobles (BamHI-BglII
y BamHI-HindIII) de dos minipreps de cada plásmido (pRS316::DhCTT, pRS316::ScCTT1,
pRS316::Dh/ScCTT1 y pRS316::Sc/DhCTT) y su comparación con los plásmidos sin
digerir…………………………………………………………………………………………………………54
Figura 17. Prueba rápida de actividad de catalasa para clonas transformadas con el juego de
plásmidos construido y el vector vacío como control. 1) BY4743 ctaΔ/cttΔ::pRS316, 2)
pRS316::DhCTT, 3) pRS316::ScCTT1, 4) pRS316::Dh/ScCTT1 y 5) pRS316::Sc/DhCT……….…55
Figura 18. Mapas de secuenciación de los plásmidos pRS316::DhCTTR, pRS316::DhCTTi,
pRS316::ScCTT1, pRS316::Sc/DhCTT y pRS316::Dh/ScCTT………………………………………..57

Figura 19. Curvas de crecimiento en medio A) YPD con NaCl 0.6M y B) YPD……………………..59
Figura 20. Curvas de crecimiento en medio mínimo suplementado con y sin sal. A) medio SD+HMLK
y B) medio SD+HMLK con NaCl 0.6M para las cepas D. hansenii, S. cerevisiae S288c, S. cerevisiae
BY4743 variedad silvestre, acatalasémica y ΔCTA y la cepa acatalasémica transformada con los
plásmidos pRS316::DhCTT, pRS316::ScCTT1, pRS316::Dh/ScCTT1 y
pRS316::Sc/DhCTT……………………………………………………………………………………..….60
Figura 21. Gráfica de barras mostrando la actividad específica de catalasa calculada a partir de
extractos crudos de S. cerevisiae S288c y BY4743 variedades silvestre, ctaΔ/CTT, acatalasémica
(ctaΔ/cttΔ) y cuatro clonas ctaΔ/cttΔ transformadas con los plásmidos pRS316::DhCTT,
pRS316::ScCTT1, pRS316::Dh/ScCTT1 y pRS316::Sc/DhCTT, crecidas en medio YPD o YPD NaCl
0.6 M……………………………………………………………………………………………………….…62
Figura 22. Gráfica de barras mostrando la actividad específica de catalasa calculada a partir de
extractos crudos de S. cerevisiae BY4743 variedades silvestre, acatalasémica (ctaΔ/cttΔ) y cuatro
clonas ctaΔ/cttΔ transformadas con los plásmidos pRS316::DhCTT, pRS316::ScCTT1,
pRS316::Dh/ScCTT1 y pRS316::Sc/DhCTT, crecidas en medio SD o SD NaCl 0.6
M………………………………………………………………………………………………………………62
Figura 23. Placas de medio YPD con crecimiento en diluciones seriales a partir de células de fase
exponencial después de un choque de H2O2 en concentraciones desde 0 a 20 mM para clonas de
S. cerevisiae BY4743 con los genotipos acatalasémica (ctaΔ/cttΔ), silvestre (CTA/CTT) y
transformadas con los plásmidos pRS316::DhCTT, pRS316::ScCTT1, pRS316::Dh/ScCTT1 y
pRS316::Sc/DhCTT…………………………………………………………………………………………64
Figura 24. Comparación de los dominios proteícos de DhCTT y ScCTT1 (obtenida de
www.pfam.xfam.org).........................................................................................................................65
Índice de tablas
Tabla 1. Patrón de crecimiento esperado en las pruebas de auxotrofías a las variantes BY4743. .. 22
Tabla 2. Plásmidos de referencia y quimeras de los genes de catalasa T de D. hansenii y S.
cerevisiae. ....................................................................................................................................................... 25
Tabla 3. Oligonucleótidos utilizados para la amplificación de las secuencias necesarias para las
construcciones. .............................................................................................................................................. 28
Tabla 4. Oligonucleótidos para la secuenciación de las construcciones en cada plásmido mediante
secuenciación de Sanger. ............................................................................................................................ 35
Tabla 5. Cantidades de peróxido en cada tubo identificador .................................................................. 42
Tabla 6. Listado de variantes del cruce de las cepas BY4741 y BY4742, su genotipo con respecto a
la presencia o ausencia de las catalasas A y T y su descripción. ......................................................... 46
Tabla 7. Tiempo de duplicación (TD) y tasa de crecimiento (TC) de la fase exponencial de cultivos
en medio YPD, YPD+NaCl0.6M y SD de las variedades BY4743 silvestre, acatalasémica, ΔCTA y
ΔCTT. .............................................................................................................................................................. 49
Tabla 8. Patrón de restricción esperado para cada plásmido con digestiones dobles. ...................... 53
Tabla 9. Tiempos de duplicación y tasas de crecimiento calculadas para las cepas mencionadas en
medio YPD y YPD NaCl 0.6M. .................................................................................................................... 58
Tabla 10. Tiempos de duplicación y tasas de crecimiento calculadas para las cepas mencionadas
en medio SD HMLK y SD HMLK NaCl 0.6M. ............................................................................................60
Tabla 11. Comparación de las cajas reguladoras putativas presentes o ausentes en la región -1167
pb hasta -1 con respecto al sitio de inicio de los genes ScCTT1 y DhCTT. ......................................... 65

RESUMEN
En Saccharomyces cerevisiae, la inducción de la catalasa T, o citosólica, constituye gran
parte de la respuesta directa contra el estrés oxidante, siendo, junto con las superóxido
dismutasas, las enzimas que se encargan de disminuir directamente la cantidad de
especies reactivas del oxígeno. Éstas degradan el peróxido de hidrógeno a agua y son
inducibles ante distintos tipos de estrés, entre ellos choque térmico, etanol, iones metálicos,
alta osmolaridad y oxidantes, permitiendo a la célula regresar a condiciones normales de
no estrés, o bien, adaptarse a mayores concentraciones de especies reactivas en su medio
(Costa y Moradas-Ferreira, 2001).
En el laboratorio de Biología Molecular y Genómica de la Facultad de Ciencias, se ha
estudiado la actividad de catalasa de la levadura eurihalina y osmotolerante Debaryomyces
hansenii, que ha mostrado ser hasta 24 veces mayor a la de S. cerevisiae en medio rico
(0.73 ± 0.16 vs 0.03 ± 0.009 mM de H2O2oxidado/min/mg de proteína); esta actividad
enzimática es debida en las dos especies de levadura a dos isoformas de catalasa (T y A)
codificadas por dos genes distintos: CTT y CTA, que en D. hansenii presentan una
regulación diferencial dependiente de la fuente de carbono y además, la presencia de NaCl
disminuye la actividad de catalasa, ambos comportamientos opuestos a lo observado en S.
cerevisiae donde la presencia de NaCl incrementa la actividad. Las catalasas, al ser de las
principales enzimas antioxidantes, se encuentran reguladas principalmente a nivel de la
transcripción (Segal-Kischinevzky, et al; 2011).Se evaluó la expresión de los genes
homólogos ScCTT y DhCTT, así como la de dos genes quiméricos obtenidos a partir del
intercambio de las regiones promotoras de ambas secuencias (Dh/ScCTT1 and Sc/DhCTT),
mediante su inserción en el plásmido pRS316 y su transformación en una cepa
acatalasémica (ctaΔ/cttΔ) de S. cerevisiae logrando la complementación heteróloga;
encontrando que la la región río arriba de las regiones codificantes juega un papel
fundamental para su expresión y que la adición de sal al medio incrementa la actividad de
catalasa; además se realizó un análisis bioinformático de la región que abarca
aproximadamente 1000 pares de bases río arriba utilizando la base de datos de promotores
de S. cerevisiae (http://rulai.cshl.edu/SCPD/), en donde, a pesar de la ausencia del
elemento de respuesta al estrés STRE en el promotor de D. hansenii, están presentes
varias cajas de regulación que en S. cerevisiae han sido reportadas en la respuesta al estrés
(YAP-1, GCN4) (Mascarenhas et al; 2008), al choque térmico (HSF1), inducción mediada
por oxígeno y grupo hemo (ROX1) (Costa y Moradas-Ferreira, 2001).

ABSTRACT

Catalase T induction constitutes one of the main responses to oxidative stress in
Saccharomyces cerevisiae; along with superoxide dismutases, catalases are the
enzymes required to mount an effective response to overcome oxidative stress.
Catalases degrade hydrogen peroxide up to water and O2; these enzymes are
inducible with different types of stresses, such as thermal shock, osmotic stress, high
salinity, etc., which lead to the adaptation and resistance to higher doses of this
stressors (Costa and Moradas-Ferreira, 2001).
At the Laboratorio de Biología Molecular y Genómica from Facultad de Ciencias
UNAM, we are studying the catalase activity of the non-conventional euryhaline and
halotolerant yeast Debaryomices hansenii, which is 24 times higher than S.
cerevisiae in rich media (0.73 ± 0.16 vs 0.03 ± 0.009 mM de H2O2oxidado/min/mg of
protein). In both yeasts, this enzymatic activity is produced by two isoforms of
catalase (T y A), encoded by two genes: CTA and CTT. In D. hansenii these genes
have a carbon-source dependent regulation and a decrease in catalase activity is
shown with NaCl, an opposite behavior compared to S. cerevisiae where catalase
activity increases when NaCl is added. Catalases are important antioxidant enzymes
and are mainly regulated at transcriptional level (Segal-Kischinevzky, et al; 2011).
Expression of the homologue genes ScCTT and DhCTT were evaluated by the
construction of four plasmids: one with DhCTT, one with ScCTT1 and two chimeras
made of the former ORFs with swapped promoters Dh/ScCTT1 and Sc/DhCTT, and
their transformation in an acatalasemic strain of S. cerevisiae ctaΔ/cttΔ, achieving
heterologous complementation successfully. We found out that the upstream region
of each construction plays a fundamental role on its expression, and that adding salt
to the media increases catalase activity. Additionally, a bioinformatic analysis was
performed on the 1000 bp upstream region, using the Saccharomyces cerevisiae
promoter database algorithm to predict putative regulation elements, finding that
despite the absence of STRE element in D. hansenii DhCTT promoter, there are
many other regulatory elements present that have been related to stress response
in yeast, such as YAP-1 and GCN4, HSF1 box related to heat shock and ROX1
involved in oxygen and heme induction. Y las referencias?

INTRODUCCIÓN

Hace 2.3 mil millones de años, cuando un grupo de cianobacterias comenzó a transformar
la atmósfera de reductiva a oxidante, surgió una infraestructura química que permitió a
algunos organismos encontrar un modo casi 20 veces más eficiente de obtener su energía1
al utilizar el producto de la hidrólisis del agua: el oxígeno molecular, dando origen a los
organismos aerobios (Schmitt et al; 2014). Sin embargo, al utilizar este elemento en sus
rutas metabólicas, han estado constantemente expuestos a las especies reactivas del
oxígeno (EROs) que resultan de su reducción parcial, como lo son el superóxido (O-), el
peróxido de hidrógeno (H2O2) y los radicales hidroxilo (OH-). La alta reactividad de estas
especies con las biomoléculas puede causar daños estructurales potencialmente letales
(Diezmann, 2014). Esta constante exposición a través de millones de años debió
representar una gran presión de selección, ya que la capacidad de responder ante el estrés
oxidante de un modo eficaz, permitió a diferentes organismos poder sobrevivir al cambio
atmosférico tan extremo, adaptarse e inclusive acoplar a su metabolismo las reacciones
que ocurren en presencia de oxígeno (Schmitt et al; 2014).
Tanto en levaduras como en eucariontes superiores las especies reactivas del oxígeno se
producen como productos normales del metabolismo celular. En condiciones fisiológicas
los mecanismos de defensa celular son capaces de prevenir los daños celulares asociados
a estas especies reactivas, debido a que se encuentran en una homeostasis redox; sin
embargo, cuando las levaduras son expuestas a diversas condiciones de estrés, tales como
la presencia de oxidantes, hipertermia, etanol y iones metálicos, este balance se rompe,
pudiendo provocar daños celulares severos, cuya acumulación excesiva se asocia a la
muerte celular (Costa y Moradas-Ferreira, 2002).
Es interesante notar que las levaduras poseen los mismos mecanismos de defensa ante el
estrés oxidante que otros eucariontes superiores, y, gracias a su facilidad de cultivo, rápido
tiempo generacional y la disponibilidad de varios genomas completamente secuenciados,
es posible utilizarlas para acercamientos experimentales a escala genómica. Por ello, las
levaduras representan un modelo de célula eucarionte ideal en donde se puede estudiar el
control celular redox y el metabolismo de las especies reactivas del oxígeno (Dröge, 2002).

1. Comparando la eficiencia en la producción de ATP del metabolismo anaerobio contra el aerobio, ya queen la glucólisis anaerobia se producen 2 moléculas de ATP por cada molécula de glucosa contra 38 que se
obtienen mediante el metabolismo aerobio que utiliza la glucólisis mediada por oxígeno, el ciclo de Krebs y
la fosforilación oxidativa (Nelson and Cox, 2004).

Formación de EROs: fuentes endógenas y exógenas de especies reactivas
del oxígeno
Las EROs son moléculas provenientes de la reducción parcial del oxígeno molecular,
debido a que presentan un electrón sin aparear en su última capa electrónica son altamente
reactivas cuando interaccionan con otras moléculas.
La configuración electrónica de la molécula de oxígeno O2 en su estado fundamental (el
estado de energía más bajo posible) está caracterizado por un espín triplete, que se denota
con el símbolo 3Σg−, en este estado los electrones del oxígeno tienen el mismo espín, por
lo que el espín total de la molécula es S=1, lo que evita que reaccione con moléculas de
espín singulete. Debido a que los estados fundamentales de la mayoría de las biomoléculas
como proteínas, lípidos o carbohidratos poseen una capa electrónica externa cerrada, con
configuración de espín singulete, se dice que la oxidación de una molécula con espín
singulete por el oxígeno 3Σg− está restringida y solo ocurre lentamente a temperatura
ambiente. Esta situación puede cambiar por dos tipos de reacciones que transforman el
inerte 3Σg− O2 en especies altamente reactivas del oxígeno. La primera es la excitación
electrónica que provoca la formación de dos formas de oxígeno singulete, caracterizadas
por los símbolos 1Δg y 1Σg (el cual rápidamente se relaja a 1Δg O2) o por la reducción química
del 3Σg− O2 por radicales con estado de espín incompleto o por agentes reductores como el
ácido ascórbico, que provocan la formación del radical superóxido O2−•, el cual luego es
transformado a H2O2 y OH- mediante reacciones subsecuentes (Schmitt et al; 2014).
Las EROs son ubicuas y se difunden fácilmente en el contexto celular aerobio. Éstas se
originan tanto por fuentes endógenas como por el metabolismo celular asociado, como en
la cadena respiratoria mitocondrial y/o en la cadena de transporte de electrones de la
fotosíntesis, o por fuentes exógenas como radiación ionizante, drogas que alteran el ciclo
redox celular o a xenobióticos que forman radicales libres in situ (Segal-Kischinevzky,
2011).
La cantidad de EROs intracelulares depende de sus tasas relativas de generación y
degradación dentro de las células, las cuales están controladas por enzimas antioxidantes
y por antioxidantes de bajo peso molecular como el ácido ascórbico, glutatión, tocoferoles,
carotenoides, flavonoides, entre otros (Schmitt et al; 2014). En la figura 1 se ejemplifican
las reacciones que generan especies reactivas del oxígeno a partir del metabolismo
aerobio.

Figura 1. Química redox del agua y formación de las especies reactivas del oxígeno. SOD
denota a la enzima superóxido dismutasa (adaptado de Schmitt et al; 2014).
Reacciones de oxidación y reducción en los seres vivos

La naturaleza de las reacciones químicas que ejercen las especies reactivas del oxígeno
sobre las biomoléculas que constituyen a los seres vivos pueden ser reversibles o
irreversibles. El primer caso es el de aquellas reacciones que provocan cambios
conformacionales transitorios que pueden ir de un estado reducido a oxidado y regresar al
reducido por medio de varios sistemas de reciclaje celulares (González-Segura y Muñoz-
Clares, 2003). Este tipo de reacciones, al ser transitorias, pueden funcionar como
interruptores celulares o segundos mensajeros como se explicará posteriormente.
Las reacciones irreversibles constituyen aquellas que una vez oxidadas, no pueden volver
al estado reducido y pierden su función, por lo que son degradadas mediante rutas
degradativas como la de proteólisis, o bien, se acumulan formando aductos (Costa y
Moradas-Ferreira, 2001).

Daños oxidantes
Las EROs pueden oxidar lípidos, proteínas o ácidos nucleicos, alterando su estructura
terciaria y por consiguiente, modificando su función. Estos cambios son específicos para
cada tipo de biomolécula.
Oxidación de lípidos
Los daños causados por las especies reactivas a los lípidos involucran la oxidación de
ácidos grasos poliinsaturados mediante un proceso autocatalítico, que lleva a la producción
de hidroperóxidos de ácidos grasos (lipoperoxidación), los cuales se pueden fragmentar y
generar una variedad de productos altamente reactivos tales como epóxidos, aldehídos y
alcanos. Algunos de estos productos son fácilmente diseminables y pueden provocar
eventos mediados por radicales libres que dañan al DNA y a las proteínas.
Debido a que las levaduras son incapaces de sintetizar ácidos grasos poliinsaturadoslos
obtienen del medio y se localizan en las membranas, por lo cual, la lipoperoxidación
depende de la cantidad de ácidos grasos poliinsaturados presentes en las membranas. La
toxicidad de los hidroperóxidos lipídicos se ha asociado con descensos en los niveles de
coenzima Q y glutatión (Costa y Moradas-Ferreira, 2001).
Oxidación de proteínas
Las proteínas se oxidan directamente por todas las EROs y pueden ser modificadas al
reaccionar con los productos de la lipoperoxidación. Cada tipo de radical lleva a cabo
diferentes reacciones de oxidación en las proteínas. El anión superóxido, por ejemplo, oxida
clusters de 4Fe-S de enzimas como la aconitasa, homoaconitasa o isopropil malato
isomerasa, del ciclo de Krebs.
Cuando los centros 4Fe-S se oxidan, se libera el Fe y se inactivan las enzimas dañadas de
un modo irreversible. Este hierro libre queda en una forma que no puede utilizarse por las
células (Fe+3), acumulándose en las vacuolas, en donde puede causar daño oxidante a este
organelo (al reaccionar con el peróxido de hidrógeno en las reacciones de Fenton),
provocando su fragmentación y liberación del Fe al ambiente intracelular, lo que genera
sensibilidad a condiciones de estrés pleiotrópicas (cambios de pH, limitación de nutrientes
y metales), e inclusive la inducción de la muerte celular programada.
El peróxido de hidrógeno, a pesar de ser un oxidante débil, es capaz de inactivar algunas
enzimas al oxidar residuos aminoácidos de cisteínas o metioninas, o al formar grupos
carbonilos.

De estos residuos aminoácidos, los de cisteína poseen grupos tioles lábiles que pueden
pasar de un estado reducido a cuatro diferentes estados oxidados: el ácido sulfénico (-
SOH), el ácido sulfínico (-SO2H), el ácido sulfónico (-SO3H) y el puente disulfuro (-S-S-),
que es un enlace covalente. Tanto la oxidación a ácido sulfénico como la que conlleva la
formación de un puente disulfuro entre dos residuos de cisteína, son revertidos por agentes
reductores como las glutatión peroxidasas, mientras que los otros dos estados de oxidación,
ácidos sulfínico y sulfónico, no pueden ser reducidos a cisteína, ya que son los estados de
mayor oxidación en donde el azufre (S) forma dos dobles enlaces con dos átomos de
Oxígeno (O) que, al estar fuertemente unidos, son difíciles de romper. (González-Segura y
Muñoz-Clares, 2003; Ray et al; 2012). Por otra parte, los residuos de metionina son
oxidados a sulfóxido de metionina o metionina sulfónica, los cuales pueden ser reparados
por la metionín sulfóxido reductasa.
Por último, el peróxido de hidrógeno puede producir radicales hidroxilos en presencia de
iones metálicos como Fe2+ o Cu2+ por la reacción de Fenton. Los radicales hidroxilos forman
derivados de carbonilos, los cuales son producto de la oxidación de residuos aminoácidos
específicos (arginina, prolina, lisina e histidina) o por la escisión de la cadena polipeptídica
(en residuos de prolina, glutamato o aspartato).
Se ha demostrado que la carbonilación de las proteínas inducida por peróxido de hidrógeno
es específica, siendo sus principales blancosinactivados la gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa y algunas enzimas mitocondriales (Costa et al; 2002).
La inactivación de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa produce un efecto protector
al incrementar los niveles de glucosa-6-fosfato para utilizarse en la vía de las pentosas y
así incrementar la producción de NADPH, regenerando poder reductor para hacer frente a
las condiciones oxidantes.
Cuando las proteínas sufren inactivación irreversible mediante la formación de sulfona de
metionina y carbonilos, no pueden ser reparadas, por lo que estas proteínas tienen que
direccionarse a rutas de proteólisis para su degradación. Se sabe que en S. cerevisiae
varios componentes de la ruta ubiquitina-26s-proteasa son inducidas por peróxido de
hidrógeno, lo cual es consistente con esta degradación de proteínas oxidadas.
Oxidación de ácidos nucleicos
La oxidación de ácidos nucleicos provoca daños en las bases nitrogenadas o en el
esqueleto de azúcar-fosfato, rompimientos de una sola hebra, sitios abásicos y

entrecruzamientos entre el DNA y las proteínas. La modificación de bases debida a la
oxidación constituye una de las lesiones más importantes debido a sus efectos letales o
mutagénicos. Se ha descrito que la falla en el mantenimiento de la integridad del genoma
está asociada con el envejecimiento y enfermedades degenerativas, incluyendo el cáncer.
El DNA mitocondrial es particularmente susceptible a la oxidación puesno posee histonas
protectoras (Costa y Moradas-Ferreira, 2001).
Los cambios de estado redox vistos como sistema informacional:
transducción de señales redox
La base de estos sistemas de detección-respuesta recae en la naturaleza reversible de las
interacciones entre EROs y algunas biomoléculas, en donde la oxidación de residuos
específicos (de cisteínas o metioninas) en las proteínas desencadena su activación o
inhibición a partir de cambios en la estructura que generan cambios de función, los cuales
pueden ser reducidos nuevamente por enzimas como las tiorredoxinas, la glutatión
peroxidasa o la metionín sulfóxido reductasa, entre otras. Estos cambios de estado
(reducido-oxidado) conocidos como interfase redox, además de constituir una respuesta
efectiva al estrés oxidante, resultan en una buena alternativa para la transmisión de
señales, como se ha observado en diferentes respuestas celulares tales como la
diferenciación, respuesta inmunológica, patogenicidad, cambios de fase del ciclo celular,
adhesión celular, apoptosis o carcinogénesis, debido a que su carácter biestable funciona
como un interruptor fácilmente ajustable, como se esquematiza en las figuras 2 y 3 (Ray et
al; 2012).

Figura 2. Mecanismo global de señalización redox en residuos de cisteína.

Figura 3. Sistema de reciclaje de proteínas con residuos de cisteínas mediante la ruta de las
pentosas fosfato y las peroxirredoxinas que funcionan como un interruptor biestable.

Peróxido de hidrógeno
El peróxido de hidrógeno es un mensajero producido por las células durante la respiración
aeróbica. A bajos niveles, esta molécula activa la respuesta adaptativa que incrementa la
resistencia celular contra agentes oxidantes, al provocar el aumento en la expresión de las
enzimas antioxidantes y proteínas relacionadas con el estrés. Sin embargo, en altas
concentraciones es tóxico, pues desencadena la muerte celular programada y genera
radical hidroxilo en presencia de metales de transición (Martins y English, 2014).
Cualquier sistema biológico que genere aniones O2.- produce H2O2 por dismutación. Son
varias las enzimas que producen peróxido de hidrógeno, como algunas xantinas oxidasas
y urato-oxidasas, pero la principal productora del mismo es la SOD, que descompone al
radical superóxido convirtiéndolo en peróxido, esta enzima se localiza en la mitocondria (Li,
et al; 2009).

Mecanismos de defensa celular ante el estrés oxidante
Las defensas antioxidantes presentes en las células que se encuentran bajo condiciones
fisiológicas les dan a éstas una capacidad limitada para resistir a una agresión oxidante
repentina, como un choque directo de peróxido de hidrógeno. Para poder sobrevivir a estas
condiciones, las levaduras deben inducir la producción de más defensas antioxidantes, así
como otros factores de protección u otras proteínas relacionadas; este mecanismo se
conoce como respuesta al estrés oxidante, que se sobrepone considerablemente con la
respuesta general al estrés, debido a que cualquier tipo de estrés desencadena un estado
pro-oxidante en las células.
Las especies reactivas del oxígeno, al ser productos químicos del metabolismo, se
encuentran de modo ubicuo en las células, y, aunque no están en equilibrio, sí existe un
rango de concentración que se considera estable para la célula. Sin embargo, cuando su
concentración se incrementa por arriba de la considerada estable, se puede originar estrés
oxidante , si persiste, daños celulares que finalmente llevan a la muerte. Este incremento
en la concentración de EROs puede ocurrir por cuatro razones principales:
i) la transición de condiciones anaeróbicas a aeróbicas
ii) incremento en la actividad de la cadena respiratoria mitocondrial
iii) exposición de las células a bajas concentraciones de oxidantes como
peróxido de hidrógeno, o a drogas que generan radicales superóxido, o

iv) el decremento de las defensas antioxidantes.
El primer paso de la respuesta al estrés consiste en la detección del incremento de especies
reactivas del oxígeno para su posterior neutralización o abatimiento mediante respuestas
tempranas y respuestas tardías. Las primeras constituyen reacciones enzimáticas para la
degradación de EROs o bien con la síntesis de moléculas antioxidantes, las cuales brindan
una protección inmediata contra condiciones de estrés subletales, y las respuestas tardías
que permiten una protección más eficiente ante estrés severo, pues permiten a las células
prepararse y poder regresar a condiciones normales en un modo ordenado, mediante
programas transcripcionales específicos (Costa y Moradas-Ferreira,, 2001).
El sistema de defensa antioxidante está constituido por diversos componentes, los cuales
se pueden categorizar en tres líneas: 1) quelantes de metales, 2) enzimas antioxidantes y
3) sistemas de reparación.
La adaptación enzimática para contender con el estrés oxidativo se lleva a cabo mediante
la acción concertada de la superóxido dismutasa y las catalasas, las cuales degradan las
EROs a oxígeno molecular y agua (Segal-Kischinevzky, et al; 2011).
Regulación genética de la respuesta al estrés oxidante
La respuesta al estrés oxidante parece estar regulada a nivel transcripcional y tiene una
considerable sobreposición con las respuestas ante otros tipos de estrés, permitiendo a la
célula reconocer de una manera integrada a varios tipos de agresiones ambientales
simultáneas, proceso que se conoce como respuesta general al estrés (Segal-Kischinevzky,
et al; 2011; González y Peña, 2002).
La respuesta general al estrés es un sistema que regula la acción coordinada de muchos
genes al ser inducido por diferentes cambios ambientales o de estrés metabólico. En las
bacterias se han identificado dos regulones: OxyR y SoxR/S. Ambos son regulados
positivamente ante la presencia de radicales específicos: el primero responde ante peróxido
de hidrógeno y el segundo ante el anión superóxido, provocando que la expresión de los
genes regulados por estos factores solamente se presente ante la exposición al radical libre
que los activa. El OxyR regula a genes que están involucrados en la descomposición de
peróxidos, tales como los que codifican para catalasa, alquil hidroperóxido reductasa y
glutatión reductasa, mientras que SoxR/S regula genes que codifican para proteínas
involucradas en la descomposición del superóxido. Ambos regulonestambién pueden ser
activados por especies reactivas del nitrógeno, como el peroxinitrito o los nitroso tioles.

En eucariontes, la mayor parte del conocimiento obtenido referente al tema ha sido a partir
de investigaciones de este fenómeno en la levadura S. cerevisiae. Al igual que en bacterias,
hay una sobreposición considerable entre las respuestas provocadas por distintos tipos de
estrés, sugiriendo que diversas condiciones generan conjuntamente un estado
hiperoxidante (Segal-Kischinevzky, 2011).
Mediante la identificación de proteínas utilizando 35S y 3H como marcadores radioactivos,
con geles de dos dimensiones y cuantificación de transcritos mediante RT-PCR; se han
identificado al menos 115 proteínas que son sintetizadas en respuesta a peróxido de
hidrógeno en S. cerevisiae, de las cuales 71 son activadas y 44 inhibidas, además 12 de
ellas fueron identificadas como proteínas antioxidantes. En concreto, las funciones
celulares que son principalmente afectadas durante el estrés oxidante son las propias
defensas antioxidantes, de choque calórico, chaperonas, proteínas del sistema
traduccional, algunas proteasas y el metabolismo de carbohidratos (Godon, et al; 1998).
Se ha encontrado un elementro cis común en el promotor de genes con funciones de
protección, conocido como caja STRE, que activa la transcripción inducida por varios tipos
de estrés (González y Peña, 2002). Entre los factores de transcripción que activan la caja
STRE se encuentran Msn2 y Msn4. Aunque se ha identificado este elemento, los
mecanismos que intervienen en su activación son en gran parte, desconocidos y a pesar
de que muchos genes están regulados por este mecanismo, también hay evidencias que
sugieren la existencia de mecanismos independientes que regulan el estrés (Martínez-
Pastor, et al; 1996).
A partir de análisis fenotípicos en cepas sensibles al estrés oxidante, se han logrado
caracterizar los factores de transcripción YAP-1, considerado similar al regulón OxyR de
procariontes y el SKN-7, que regula la expresión de genes que codifican para proteínas
antioxidantes como la catalasa, la citocromo c peroxidasa, la tiorredoxina, entre otras.
Se ha reportado que la mayoría de los genes que codifican para proteínas antioxidantes
aumentan su expresión en las últimas fases del desarrollo, o etapa estacionaria de
crecimiento, cuando existen mayores concentraciones de EROs en el ambiente celular.
En eucariontes más complejos, la respuesta a estrés oxidante es más complicada; se cree
que está regulada por un mayor número de efectores, pero se conoce muy poco de ellos
(Segal-Kischinevzky, 2011).

Regulación de las catalasas mediada por peróxido de hidrógeno
Análisis del estímulo que provoca el H2O2 en las levaduras revelaron que cuando las células
eran expuestas a esta especie reactiva, los niveles de catalasa peroxisómica, Cta1,
permanecen sin cambios, pero los de la catalasa citosólica Ctt1 incrementan hasta 15 veces
después de ser sujetas a un choque de peróxido de hidrógeno. Esto sugiere que Ctt1 posee
un papel importante para combatir el estrés causado por peróxidos, y aunque la deleción
de CTT1 o CTT1 y CTA1 no provocan ninguna sensibilidad en células de fase exponencial
expuestas a concentraciones bajas de H2O2, estas mutantes son incapaces de mostrar una
respuesta adaptativa a concentraciones mayores de peróxido de hidrógeno.
Experimentos de viabilidad y actividad enzimática de catalasa realizados en células de S.
cerevisiae, demostraron que la inducción previa de la catalasa T es necesaria para la
adaptación a mayores concentraciones de peróxido de hidrógeno, y que esta inducción
requiere de nutrientes disponibles en el medio (Martins e English, 2014).

Catalasas
Las catalasas forman parte de una de las familias de enzimas que protegen a la célula del
estrés oxidante, pues se encargan de transformar al peróxido de hidrógeno en agua y
oxígeno (Díaz, 2003); la importancia de las catalasas para degradar el H2O2 se debe a que
ésta molécula proviene principalmente de la reducción del radical superóxido, siguiendo la
detoxificación enzimática del exceso de EROs intracelulares, además de que es un
potencial generador de radicales libres (al generar radicales hidroxilo en presencia de Fe2+
mediante las reacciones de Fenton) (Hansberg, 2008).
2H2O2 →2H2O + O2
A pesar de sus diferentes orígenes, todas las catalasas realizan la misma reacción, con una
kcat/Km de entre 106 o 107 M-1s-1 (Martins y English, 2014). Es posible distinguir entre cuatro
grupos o subfamilias: 1. Catalasas monofuncionales (típicas), 2. catalasa –peroxidasas
bifuncionales, 3. catalasas no hemo y 4. catalasas menores. De entre estos tipos de
catalasas, las más comunes son las monofuncionales (Chelicani, et al; 2005).
Las catalasas monofuncionales son proteínas homotetraméricas ya sea con subunidades
grandes (de 80 a 84 kDa) o pequeñas (de 55 a 65 kDa). El centro activo de estas enzimas
consiste en un grupo hemo enterrado profundamente dentro del tetrámero y cuyo acceso
es a través de canales largos que lo conectan a la superficie molecular (Chelicani, et al;

2005). Tanto las catalasas de S. cerevisiae como las de D. hansenii pertenecen al grupo de
las catalasas monofuncionales, con subunidades pequeñas (Segal-Kischinevzky, 2011).
Se ha reportado que en la levadura S. cerevisiae la catalasa T es necesaria para la
adaptación a peróxido de hidrógeno y confiere resistencia cruzada contra otras condiciones
de estrés como el osmótico y térmico, esto debido a que su inducción es parte de la
respuesta general al estrés, en donde la exposición a bajas concentraciones de H2O2
desencadena su transcripción y provoca un incremento en la actividad de catalasa, lo cual
permite a las levaduras resistir mayores concentraciones de agentes estresantes (Martins
y English, 2014).
Debaryomyces hansenii, una levadura no convencional
Debaryomyces hansenii ha sido clasificada como una de las levaduras “no convencionales”
(Spencer, et al; 2002) y posee varias características metabólicas muy particulares: puede
crecer en un medio con concentraciones de hasta 4 M de NaCl (24% de salinidad), inclusive
su crecimiento es estimulado en 0.5 M de sal, además es osmotolerante, resiste las bajas
temperaturas, soporta un amplio rango de acidez/alcalinidad, creciendo en valores de pH
desde 3.6 hasta 10, aunque prolifera mejor en condiciones alcalinas y tolera la presencia
de metales pesados, pesticidas e hidrocarburos aromáticos (Prista et al; 2005; Segal-
Kischinevzky, et al; 2011); estas características le confieren un gran potencial
biotecnológico para su uso en procesos agropecuarios, industriales o de biorremediación,
ya que intervienen en los procesos de maduración de quesos y embutidos, así como la
producción de salsa de soya, entre otros (González-Hernández y Peña, 2002; Noriega-
Samaniego, 2012).
Debido a que posee un metabolismo variado, se considera a D. hansenii como un buen
modelo para entender los mecanismos de defensa celular ante distintas agresiones
ambientales; sin embargo, existen fuertes limitaciones para llevar a cabo manipulación
genética clásica: es homotálica y haploide (www.genolevures.org), por lo que no ha sido
posible realizar cruzas, no cuenta con cepas auxótrofas y no es posible transformarla con
DNA recombinante. Una solución para estudiar sus redes genéticas es mediante la
complementación de mutantes de S. cerevisiae con los genes de interés (Noriega-
Samaniego, 2012; Prista et al; 2002; Sharma y Mondal, 2005).
Saccharomyces cerevisiae
La levadura Saccharomyces cerevisiae, posee los mismos mecanismos de defensa que
eucariontes más complejos, su genoma completo está disponible en línea en la base de

datos “Saccharomyces Genome Database” (disponible en: http://www.yeastgenome.org/),
y han sido caracterizadosen las últimas décadas muchos de sus sistemas de regulación,
vías metabólicas y proteínas importantes; además su cultivo es relativamente sencillo y se
han desarrollado distintas cepas auxótrofas para aminoácidos específicos como método de
selección de transformantes. Por todas estas características, se ha convertido en el
organismo modelo para el estudio de varios procesos celulares básicos en células
eucariontes como la expresión génica, tráfico de proteínas y control del ciclo celular (Godon,
et al; 1998; Funk, et al; 2002).
S. cerevisiae se puede adaptar a distintas concentraciones de H2O2 y O2- mediante la
inducción de dos distintos estímulos pero que se sobrelapan, por ello es posible estudiar el
control de reacciones de óxido-reducción y el metabolismo de las EROs en esta levadura
(Godon,1998).
Comparación de las catalasas de Debaryomyces hansenii y Saccharomyces
cerevisiae
En la levadura S. cerevisiae se ha demostrado la existencia de dos enzimas con actividad
de catalasa: una citoplasmática, denominada T por típica (T) y otra peroxisómica,
denominada A por atípica (A), y cuyos genes ya han sido clonados y secuenciados. La
catalasa T tiene la función de proteger a la célula contra diferentes tipos de estrés y su
transcripción es inducible; mientras que la catalasa A, se encarga de remover el H2O2
generado durante la β-oxidación de los ácidos grasos. Solamente la doble mutante sin
ninguno de los dos genes es sensible al estrés oxidante, mientras que las mutantes simples
(con la falta de sólo uno de los genes) no muestran un fenotipo relacionado con sensibilidad
al estrés, esto indica que la actividad de ambas enzimas es parcialmente redundante
(Segal-Kischinevzky et al; 2011; Castillo-Díaz, 2013).
La levadura eurihalina D. hansenii también tiene dos catalasas: DhCTT y DhCTA; a
diferencia de las de S. cerevisiae, presentan una regulación diferencial dependiente de la
fuente de carbono y de la presencia de NaCl. Cada una de ellas, incluyendo a su promotor,
ha sido clonada e introducida en una cepa acatalasémica de S. cerevisiae, encontrando
que sí hay expresión heteróloga en ambos casos, y que la DhCTT provoca que la levadura
hospedera crezca hasta alcanzar una mayor masa (densidad óptica) y que resista mayores
concentraciones de peróxido de hidrógeno que S. cerevisiae silvestre (Noriega-Samaniego,
2012; Castillo-Díaz, 2013; García-Campos, 2014).

Los estudios previos muestran que la regulación de la expresión de las catalasas ocurre
principalmente a nivel de la transcripción (Segal-Kischinevzky, et al; 2011). Nuestro grupo
analizó los promotores de los genes que codifican para las catalasas de D. hansenii,
encontrando pocos elementos en común con S. cerevisiae, destacando la ausencia de
STRE. A pesar de esto, la cepa acatalasémica de S. cerevisiae sí fue transformada con los
genes que codifican a las catalasas de D. hansenii, incluyendo a su promotor; la regulación
de la transformante DhCTA es similar, aunque con magnitudes diferentes, a la de D.
hansenii, mientras que la de DhCTT es similar a la de S. cerevisiae aunque con las
magnitudes de D. hansenii (Castillo-Díaz, 2013; García-Campos, 2014). No se ha realizado
la caracterización de los factores que regulan la transcripción en D. hansenii ni, hasta donde
sabemos, existen reportes al respecto.

OBJETIVOS

 Evaluar la expresión del gen que codifica a la catalasa T de D. hansenii (DhCTT)
mediante el diseño y la construcción de cuatro plásmidos transformados en una cepa
acatalasémica de S. cerevisiae BY4743.
 Reestablecer la actividad de catalasa en la cepa acatalasémica de BY4743.
 Comparar la secuencia de los promotores de la catalasa T de D. hansenii y S. cerevisiae,
hasta1167 pb río arriba del sitio de inicio de la traducción.

Objetivos particulares:
1. Construir dos quimeras genéticas para los genes de catalasa DhCTT y ScCTT1
intercambiando las regiones promotoras del gen de D. hansenii con el de S. cerevisiae,
obteniendo dos cepas recombinantes:

a) Promotor ScCTT1 + ORF DhCTT (ScCTTpDhCTT)
b) Promotor DhCTT + ORF ScCTT1 (DhCTTpScCTT1)

Y dos secuencias completa de cada gen:
c) Promotor DhCTT+ORF DhCTT (DhCTTpDhCTT)
d) Promotor ScCTT + ORF ScCTT (ScCTTpScCTT1)

2. Introducir estas construcciones en un plásmido monocopia para transformar a una cepa
acatalasémica de S. cerevisiae logrando la complementación heteróloga.
3. Cuantificar la actividad específica de catalasa.
4. Comparar los parámetros medidos en las cepas quiméricas contra los de las cepas no
quiméricas.
5. Analizar la curva de crecimiento y la viabilidad celular de todas las cepas después de un
choque con peróxido de hidrógeno.

ANTECEDENTES
D. hansenii es capaz de vivir en diversos tipos de ambientes extremos, por lo que es de
suponer que ha desarrollado estrategias adaptativas para contender ante distintos tipos de
estrés tales como falta de nutrientes, choque térmico, estrés oxidante, entre otros. Mediante
un análisis bioinformático comparativo de las secuencias de aminoácidos de D. hansenii y
S. cerevisiae se encontró que ambas catalasas de D. hansenii presentan cambios en sus
secuencias de aminoácidos del tipo 8, asociado a organismos halofílicos: mayor cantidad
de aminoácidos ácidos y serina, así como menor cantidad de aminoácidos hidrofóbicos,
comparada con las secuencias de S. cerevisiae (García-Campos, 2014).
En la levadura S. cerevisiae, la regulación de la catalasa T ocurre principalmente a nivel de
la transcripción, estando atenuada en condiciones normales (medio YPD) y se induce ante
condiciones de estrés, permitiendo a la célula contender contra el incremento del estado
oxidante intracelular. Sin embargo, esta contención es limitada y transitoria ( Costa, et al;
2002).
Se ha descrito la capacidad de S. cerevisiae para adaptarse a mayores concentraciones de
peróxido mediante el tratamiento previo con esta especie reactiva (Godon, et al; 1998);
como se sugiere que las catalasas de D. hansenii son más eficientes (Segal-Kischinevzky,
et al; 2011), es importante verificar si los genes que las codifican confieren una mayor
adaptabilidad ante un choque de peróxido en S. cerevisiae.
Debido a que las catalasas son las principales enzimas encargadas de remediar el estrés
por incremento de peróxido en el medio, resultan un punto clave para el estudio de la
respuesta ante el estrés oxidante en levaduras.
Considerando que las catalasas provenientes de D. hansenii poseen una actividad basal
24 veces mayor que sus ortólogos en S. cerevisiae (0.73 ± 0.16 vs 0.03 ± 0.009 mM de
H2O2oxidado/min/mg de proteína), queremos observar si esta mayor actividad se origina a
nivel de su transcripción o por cambios conformacionales entre las proteínas codificadas.
El porcentaje de identidad entre las secuencias de nucleótidos de los ortólogos de catalasas
de S. cerevisiae y D. hansenii es de 79% de identidad entre ScCTA1 y DhCTA 67% entre
ScCTT1 y DhCTT), indicando diferencias a nivel de proteína, el análisis previo de sus
regiones promotoras muestra cajas de regulación distintas, por lo que además es probable
que posean factores transcripcionales diferentes.

Cada gen de catalasa de D. hansenii, incluyendo a su promotor, ha sido clonado e
introducido en una cepa acatalasémica de S. cerevisiae, encontrando que sí hay expresión
heteróloga. En particular la cepa transformada con DhCTT muestra un fenotipo
sobresaliente, pues se observó que la actividad de catalasa posee una regulación similar a
la de S. cerevisiae, pero con magnitudes cercanas a las de D. hansenii, es decir, se induce
con sal (en D. hansenii no es así) pero en mucho mayor magnitud; además provoca que la
levadura hospedera crezca hasta alcanzar una mayor masa (densidad óptica) y que resista
mayores concentraciones de peróxido de hidrógeno,todas estas características
comparadas con respecto a la cepa silvestre de Saccharomyces (Castillo, 2013; García-
Campos, 2014).
Debido al comportamiento de la cepa transformada con DhCTT, es interesante dilucidar si
los cambios en la actividad de catalasa de S. cerevisiae ocurren por el incremento de la
tasa de transcripción del gen que la codifica, o bien, por la traducción y activación de una
enzima más eficaz.
En este trabajo se analizó la regulación del gen que codifica a la catalasa T de D. hansenii
(DhCTT) mediante la construcción de quimeras recíprocas y su expresión en una cepa
acatalasémica de S. cerevisiae BY4743. Asimismo, se llevó a cabo un análisis
bioinformático de sus promotores, hasta 1167 pb río arriba del sitio de inicio de la traducción.

MATERIAL Y MÉTODOS
1. Organismos utilizados (cepas de levaduras y de bacteria)
Se utilizaron dos especies de levadura: Saccharomyces cerevisiae (S288c y BY4743) y
Debaryomyces hansenii (Y7426).
De la especie S. cerevisiae, variedad BY4743, se utilizaron las cepas con cada una de las
deleciones de los genes que codifican a las catalasas de S. cerevisiae, las cuales fueron
compradas en Euroscarf por el Laboratorio de Biología Molecular y Genómica de la
Facultad de Ciencias de la UNAM. Son la BY4741CTT (MATa; his3Δ 1; leu2Δ 0; met15Δ
0; ura3Δ 0 YGR088w::kanMX4) y la BY4742 CTA (MATα ; his3Δ 1; leu2Δ 0; lys2Δ 0; ura3Δ
0 YDR256c::kanMX4), ambas derivadas de la S288c. Estas cepas fueron cruzadas
previamente en el laboratorio, donde se realizó la disección de tétradas, las cuales fueron
congeladas. No todas las tétradas preservadas en el cepario del laboratorio estaban
identificadas por sus genotipos, y al contaminarse la tétrada caracterizada, se procedió a
identificar un nuevo juego de cuatro variantes.
De las variedades BY4743 se utilizaron las mutantes denominadas silvestre (CTA/CTT),
acatalasémica (ctaΔ/cttΔ) y CTT (ctaΔ/CTT). La cepa acatalasémica fue transformada con
los cuatro plásmidos (pRS316::DhCTT, pRS316::ScCTT1, pRS316::Dh/ScCTT1 y
pRS316::Sc/DhCTT), generando cuatro variantes analizadas en este trabajo, denominadas
DhCTT, ScCTT1, Dh/ScCTT1 y Sc/DhCTT.
Para la transformación y amplificación de los plásmidos se utilizó Escherichia coli XL1Blue.
2. Medios de cultivo
Los medios de cultivo utilizados fueron el medio rico en glucosa YPD (extracto de levadura
al 1%, glucosa al 2% y peptona de caseína al 2%) con y sin sal (NaCl 0.6M p/v), el medio
mínimo SD constituido de Yeast Nitrogen Base al 0.17% (sin aminoácidos ni sulfato de
amonio), sulfato de amonio al 0.5% y glucosa al 2% suplementado con o sin NaCl 0.6M p/v,
con o sin uracilo (20 mg/L) y los siguientes aminoácidos: histidina (20mg/L), metionina (20
mg/L), leucina (30 mg/L) y lisina (30 mg/L).
Todos los medios de cultivo fueron preparados con agua de grado milliQ, esterilizados en
autoclave a 1 atm de presión y 120°C durante 20 minutos o por filtración con un filtro de 22
 estéril, utilizando tapones de algodón y gasa cubiertos por papel aluminio o cubiertas de

papel aluminio bien selladas. El procedimiento paso por paso de preparación de medios de
cultivo puede consultarse en el anexo de protocolos experimentales, protocolo 1.
3. Caracterización de la tétrada de S. cerevisiae BY4743
A partir de gliceroles congelados, se obtuvieron las tétradas 4 y 12; se transfirieron
directamente desde el glicerol a cajas de medio YPD, se les hicieron tres pases de
purificación, crecidas a 28°C durante tres días y se mantuvieron separadas en caja
individuales a 4°C.
Cada variante fue sometida a pruebas de auxotrofía, además se analizó la actividad de
catalasa mediante ensayo de actividad de catalasa a partir de extractos crudos,
zimogramas con tinción específica de catalasa y curvas de crecimiento en medio rico (YPD),
medio mínimo suplementado (SD HMLKUra). Se eligió la tétrada 4 para obtener las cuatro
cepas haploides con las que trabajamos: silvestre (CTA/CTT), acatalasémica (ctt/cta),
CTA (CTA/ctt y CTT (CTT/cta
Algunas de las variantes sufrieron contaminación por una bacteria cocoide no identificada,
por lo cual se realizó una purificación utilizando medio YPD-agar-ampicilina (50 μg/mL)
durante tres pases.
Pruebas de auxotrofías
Las cepas fueron construidas con auxotrofías para histidina (H), lisina (K), leucina (L),
metionina (M) y uracilo (Ura); para verificar la presencia de éstas se realizó una prueba de
auxotrofías, que consistió en la siembra de cada variante de la tétrada previamente
caracterizada y otras dos tétradas en medio mínimo suplementado con todas las auxotrofías
excepto una, obteniendo 7 variantes de medio mínimo (SD+HMLK+ Ura; SD+ HML+Ura;
SD+ HMK + Ura; SD + HLK+ Ura; SD+ MLK+Ura; SD+HMLK -ura y SD sin suplementos).
A partir de las auxotrofías esperadas se describe el patrón de crecimiento esperado en la
siguiente tabla.

MEDIO

Suplementos
Patrón de crecimiento esperado
(x no crece,  sí crece)
Silvestre
(CTA/CTT)
Acatalasémica
(cta/ctt)
CTA/ctt Cta/CTT
SD HMLK + Uracilo    
SD HML + Uracilo x x x x
SD HMK + Uracilo x x x x
SD HLK + Uracilo x x x x
SD MLK + Uracilo x x x x
SD HMLK x x x x
SD -------- x x x x
Tabla 1. Patrón de crecimiento esperado en las pruebas de auxotrofías a las variantes
BY4743.
El control positivo consistió en medio mínimo suplementado con todos los aminoácidos para
los que presenta auxotrofías y el control negativo fue medio mínimo sin suplementos. Todas
las cajas de medio mínimo se hicieron con agar noble y antes de inocularlas se lavaron las
células dos veces con agua destilada estéril para quitar cualquier nutriente remanente,
como se especifica en el protocolo de lavado de células, en el anexo de protocolos
experimentales (ver anexo, protocolo 2).
Ensayos de actividad de catalasa y zimogramas con tinción específica para actividad
de catalasa

Actividad específica de catalasa.
Se llevaron a cabo ensayos de actividad de catalasa siguiendo la extinción del H2O2 a 240
nm en un espectrofotómetro Beckman durante 120 segundos con intervalos de medición
de 15 segundos, utilizando celdas de cuarzo de 3 mL con 2.9 mL de amortiguador de
fosfatos de sodio (NaH2PO4·H2O y Na2HPO4) 100 mM pH 7.0 con tritón al 0.0001%, 100 µL
de una solución de H2O2 500 mM y de 1 µL a 50µL de extracto crudo de proteínas solubles,
obtenido a partir de cultivos estacionarios (de 72 horas) (ver anexo, protocolo 3) mediante
lisis con microperlas de vidrio y amortiguador Tris-glicerol. Las especificaciones de la
obtención de los extractos crudos, así como del ensayo de actividad de catalasa se
encuentran en el anexo de protocolos experimentales (protocolos 3 y 6). Para determinar

la actividad específica de catalasa en actividad por µg de proteína se realizó la
cuantificación de los extractos crudos utilizando el método de Bradford (protocolos 5 y 6).
La actividad específica de catalasa se calculó con la siguiente fórmula:
AE = [mmin/ɛH2O2 240nm/alícuota en mL]/mgP/mL
Dónde:
AE= actividad específica
mmin= pendiente por minuto
ɛH2O2 240nm= coeficiente de extinción molar del H2O2 a 240 nm
tomado como 0.0422 M-1s-1
Alícuota en mL= mililitros cargados del extracto crudo
mgP/mL= concentración de proteína total de los extractos crudos

Zimogramas con tinción para actividad de catalasa
Se probó cualitativamente la actividad de catalasa de extractos crudos de las variantes de
BY4741 y S. cerevisiae S288c y catalasa comercial como referencia, utilizando el método
de Gregory y Fridovich del año 1974 (ver anexo de protocolos experimentales protocolo
13); para ello se hizo un gel PAGE nativo al 7.5% de acrilamida cargando 20 mg de extracto
crudo de proteína soluble total y se corrió durante 12 horas a 12 V. Después de correr el
gel, se lavó tres veces conagua de la llave y se incubó 15 minutos en una solución de H2O2
100 mM. Después del periodo de incubación se eliminó el peróxido lavando el gel tres veces
con agua de la llave y se sumergió en una solución1:1 de ferricianuro de potasio:cloruro
férrico, cada uno al 1%, preparada justo antes de usarse, y se agitó durante 5-10 minutos
hasta revelar las bandas de actividad (Gregory y Fridovich, 1974),
Cuantificación de proteínas por el método de Bradford.
Para obtener las concentraciones de proteínas (mg de proteína/mL) de los extractos crudos
se realizaron ensayos de cuantificación de proteínas utilizando el método de Bradford y se
estimaron con una regresión lineal a partir de una curva estándar de BSA con
concentraciones entre 0.05 mg/mL y 0.75 mg/mL (ver anexo de protocolos experimentales,
protocolo 9).

Curvas de crecimiento

Se realizaron curvas de crecimiento de la tétrada elegida en tres distintos medios de cultivo
(YPD, YPD-NaCl 0.6M, SD+HMLKUra y SD+HMLKUra-NaCl 0.6 M) a partir de cultivos de
100 mL con una D0600nm inicial aproximada a 0.05 y se midió su absorbancia a 600 nm
durante 48 horas, tomando muestras a intervalos de 2 ó 3 horas, haciendo las diluciones
necesarias para lograr medidas entre 0.05 y 0.5, que es el rango lineal entre la DO600nm y
la cantidad de células.
Tiempo de duplicación y tasa de crecimiento específica

Utilizando los datos de crecimiento de la fase exponencial se calculó la tasa de crecimiento
y el tiempo de duplicación para cada variante en cada uno de los tres medios de cultivo.
Para este resultado se utilizó la herramienta disponible en línea “ENDMEMO Population
Growth Rate Calculator”, la cual calcula la regresión exponencial a partir de varios puntos
y la ajusta a la ecuación de crecimiento exponencial (fórmula 1).
Fórmula 1.
Xt = (X0 )ekt
En donde:
Xt = concentración celular en tiempo t
X0 = concentración celular inicial
k= tasa de crecimiento
t= tiempo

Una vez obtenida la tasa de crecimiento k, se obtuvo el tiempo de duplicación con la
siguiente formula:
Fórmula 2.
Td= ln(2)/ k
En donde:
Td= tiempo de duplicación
k= tasa de crecimiento
Purificación y mantenimiento de las variantes de la tétrada
Para purificar cada cepa utilizada se hicieron tres pases a partir de su obtención de glicerol
mediante su siembra consecutiva en cajas de YPD-agar y se mantuvieron en cajas
independientes.
Para su mantenimiento se prepararon gliceroles de cada variante con medio YPAD y
glicerol al 15% y se mantuvieron a – 80°C, además se mantuvo cada variante en cajas de

YPD-agar y se resembró una vez al mes, utilizando células de no más de 6 pases, ya que
cada 6 meses se volvieron a obtener de glicerol, ya purificadas e identificadas.
Diseño, construcción y verificación de plásmidos.
Se construyeron cuatro plásmidos: dos con los genes de referencia abarcando desde la
secuencia promotora, y dos quimeras recíprocas, intercambiando el promotor de S.
cerevisiae con el de D. hansenii.
Se utilizaron plásmidos monocopia pRS316 que complementan la auxotrofía por uracilo, y
contienen el gen BLA que confiere resistencia a ampicilina, con origen de replicación tanto
para E. coli como para levadura. Para abarcar las regiones promotoras de cada gen se
tomaron 1167 bases río arriba a partir del marco de lectura y 333 bases río abajo para
mantener los extremos UTRs. Las características de cada plásmido se muestran en la tabla
2.
NOMBRE pRS316::DhCTT pRS316::ScCTT1 pRS316::Dh-
ScCTT1
pRS316::Sc-
DhCTT
DESCRIPCIÓN
Gen de catalasa
T de D. hansenii
(referencia 1)
DhCTT
DEHA2B16214g
Gen de catalasa
T de S.
cerevisiae
(referencia 2)
YGR088W
Promotor D.
hansenii CTT +
marco de lectura
de S. cerevisiae
CTT1
(quimera 1)
Promotor S.
cerevisiae CTT +
marco de lectura
de D. hansenii
CTT
(quimera 2)
LONGITUD 8022 pb 8037 pb 8037 pb 8022 pb
VECTOR pRS316 pRS316 pRS316 pRS316
MARCADOR DE
SELECCIÓN
Ampicilina
Uracilo
Ampicilina
Uracilo
Ampicilina
Uracilo
Ampicilina
Uracilo
Tabla 2. Plásmidos de referencia y quimeras de los genes de catalasa T de D. hansenii y S.
cerevisiae.
Construcción de los insertos (quimeras recíprocas y sus genes de referencia)
Todas las construcciones, incluyendo secuencias, primers y plásmidos se diseñaron
utilizando el programa Snapgene en donde, además, se simularon las amplificaciones,
ligaciones e inserciones en el vector (www.snapgene.com).
Para la construcción de los plásmidos utilizados en este trabajo fue necesario ensamblar
los insertos, esto se hizo mediante su amplificación por PCR utilizando una enzima de alta
fidelidad (Phusion Flash polymerase, Thermoscientific), y con PCR de sobrelape para el
caso de las secuencias quiméricas.

Estrategia de clonación
La estrategia de clonación se resume en los siguientes dos diagramas, el primero detalla la
obtención de los genes completos DhCTT y ScCTT1 (figura 4) y el segundo la de las
quimeras Dh/ScCTT1 y Sc/DhCTT (figura 5).
Figura 4. Estrategia de clonación de las secuencias de referencia CTT1 y DhCTT.

Figura 5. Estrategia de clonación de las quimeras Dh/ScCTT1 y Sc/DhCTT.
1) Aislamiento de DNA genómico de D. hansenii y S. cerevisiae
gen: DEHA2B16214g gen: YGR088W
codifica para: catalasa T codifica para: cala lasa T
organismo: D. hansenii organismo: S. cerevisiae
cromosoma: 28 cromosoma: VII
-"""2~== ~==:; - ; .... .... ....
promotor región codificante promotor región codificante
2) Amplificación de fragmentos especificos, añadiendo sitios de corte y
fragmentos complementarios al promotor de la otra construcción.
l l l
I BamH1 I BamH1 San¡
I BamH1
.. ~ ________ ~Isan _ L --== :::::llsan
4) PCR de extensión por sobrelape en una reacción equimolar de
cada pareja de megaprimers con una polimerasa de alta fidelidad.
X 15 ciclos
5) Parar la reacción de PCR y añadir oligonucleótidos de los extremos
por 15 ciclos más (PCR de purificación).
6) Purificar productos del PCR de sobrelape y proceder a digerir para ligar
y transformar en E. coli
¡BamH1 San I ¡BamH1 San I
quimera Dh/ScCTT quimera ScIDhCTT1

Diseño de oligonucleótidos para amplificación de las secuencias deseadas
Para amplificar las secuencias deseadas, se utilizaron ocho primers, mostrados en la tabla
3. De éstos, seis fueron oligonucleótidos nuevos y los dos restantes ya estaban disponibles
en el laboratorio, ya que fueron previamente utilizados para la amplificación de DhCTT.
Para construir las secuencias de los genes que codifican la catalasa T de D. hansenii y S.
cerevisiae se utilizaron dos parejas de primers análogas entre sí: un forward que hibride
en la región -1167 bases río arriba del codón de inicio con la secuencia de reconocimiento
de BamHI y un reverse que hibride en la región -333 bases río abajo después del codón de
paro con la secuencia de reconocimiento para SalI, en cada gen (DhCTT y ScCTT1) para
contar con construcciones análogas.

Para la construcción de las quimeras, se utilizaron los mismos oligonucléotidos en sentido
forward para añadir el sitio BamHI, dos pequeños primers reverse que hibridan en la región
antes del codón de inicio de cada construcción para amplificar ambos promotores, y dos
forward “largos” (aproximadamente 60 bases) que hibridan desde el codón de inicio hasta
40 bases río abajo con 20 bases añadidos antes del ATG que sean idénticos a la secuencia
promotora de la construcción ortóloga, es decir, para amplificar el ORF de D. hansenii se
añadirán 20 pb de la región promotora del gen que codifica para la catalasa de S. cerevisiae
y viceversa.

Tabla 3. Oligonucleótidos utilizados para la amplificación de las secuencias necesarias para
las construcciones.

Para probar la especificidad de cada primer se hizo un blast contra el grupo de
Ascomycetos, encontrando