Analisis-de-la-expresion-de-la-O-glicosilacion-reconocida-por-la-lectina-de-Amaranthus-leucocarpus-ALL-en-linfocitos-T-murinos-CD4-y-CD8

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas 
Facultad de Medicina 
Glicoinmunobiología 
 
 
 
ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE LA O-GLICOSILACIÓN RECONOCIDA 
POR LA LECTINA DE Amaranthus leucocarpus (ALL) EN LINFOCITOS 
T MURINOS CD4+ Y CD8+ 
 
 
TESIS 
 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
Maestro en Ciencias 
 
 
PRESENTA: 
WILTON ALBERIO GóMEZ HENAO 
 
 
TUTOR PRINCIPAL 
DR. EDGAR ZENTENO GALINDO 
FAC. DE MEDICINA, DEPTO. DE BIOQUÍMICA 
 
MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR 
DRA GLORIA SOLDEVILA MALGAREJO 
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMEDICAS 
DRA. EDA PATRICIA TENORIO ZUMARRAGA 
FAC. DE MEDICINA, DEPTO. DE BIOQUÍMICA 
 
Ciudad de México. Febrero, 2018 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
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reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
2 
 
 
 
 
 
 
 
El presente trabajo fue realizado en el laboratorio 9 de inmunoquímica del 
departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina, Universidad Nacional 
Autónoma de México, bajo la asesoría del Dr. Edgar Zenteno Galindo y la Doctora 
Eda Tenorio Zumárraga, con el financiamiento del programa UNAM- PAPIIT (IN 
204315), DGAPA-PAPIIT-IA204616. 
 
Agradezco el apoyo proporcionado por la beca CONACyT con el número de 
registro de Becario 742472 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Agradecimientos Académicos 
 
Al departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina, especialmente al 
laboratorio 9 por haber aportado el material, los espacios y conocimiento 
necesarios para desarrollar el proyecto. 
 
A mi Tutor y al Comité tutoral, 
Por sus criticas, y guía para la realización de este trabajo. 
 
Dr. Edgar Zenteno 
Dra. Eda Tenorio Zumárraga 
Dra. Gloria Soldevila 
 
Al jurado para examen de grado 
 
Dra. Blanca Haydé Ruiz Ordaz. 
Dra. Leonor Huerta Hernández 
Dr. Yonathan Garfías Becerra 
Dr. Francisco Raúl Chávez 
Dr. Roberto Arreguín Espinosa de los Monteros. 
 
Al personal del Bioterio de la facultad de medicina. 
 
Al Dr. Rafael Saavedra por brindarme los espacios de su laboratorio y su 
conocimiento para llevar a cabo parte de mi procedimiento experimental, al igual 
que a su técnico la Dra. Jacquelina Fernández Vargas. 
 
 
 
 
 
4 
 
Agradecimientos personales. 
 
 
A Dios, pues a través de sus bendiciones he podido cumplir sueños, metas y 
objetivos. 
 
A mis padres, hermanos y sobrinos. Que fueron el motor que alentaron mi partida 
de casa en busca de experiencias y sueños, que son las personas que me 
alientan desde la distancia a no desfallecer en los momentos difíciles en medio de 
la lejanía de mi tierra, que son mi mayor orgullo y mi bendición. GRACIAS A 
TODOS ELLOS!!!!!!! 
 
A mi jefe, el Doctor Zenteno, que desde mí llegada a México y a la universidad ha 
estado presto a brindarme apoyo, permitiéndome estar con el mejor equipo de 
trabajo que pude haber encontrado y que me permite formarme como Bioquímico. 
 
A la Doctora Eda que me ha enseñado la forma de hacer buena ciencia, que me 
ha corregido y ha procurado mi crecimiento académico. 
 
Al Doctor Chávez que con su inmenso conocimiento ha hecho grandes aportes a 
mi proyecto estando siempre atento y dispuesto a discutir con migo mis 
inquietudes académicas. 
 
Al Doctor Lacurain y a la Doctora Guadalupe Maldonado por el conocimiento 
compartido. 
 
A mis amigos en Colombia. Caro, Madrigal, Charlie, Javi y Mónica que desde la 
distancia siempre me han enviado buenos deseos y palabras de aliento en el 
momento perfecto. 
 
5 
 
A mis amigos Mexicanos. Ana López, Ivan, Daniel Miriles, Viry y Oscar pues en 
ellos he encontrado personas muy valiosas que hicieron mi estancia en México 
más llevadera, además me han enseñado lo hermoso de este país. 
 
A México, a este maravilloso país y a su gente pues todos ellos, desde el 
campesino hasta los grandes empresarios han aportado en la generación de 
recursos que permiten la investigación científica y el apoyo económico de mi 
estancia estudiantil. 
 
 
A la Glorioso Universidad Nacional Autónoma De México UNAM, que es el 
espacio académico al cual siempre desee llegar. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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“Los locos somos los que abrimos los caminos que más adelante recorrerán 
los cuerdos” 
Wilton Gómez 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
7 
 
Contenido 
 
 
 
Resumen ............................................................................................................... 10 
1. Introducción. ................................................................................................... 11 
1.1 La glicosilación como mecanismo de modificación postraduccional. ....... 12 
1.2 Clasificación de las glicoproteínas. .......................................................... 16 
1.3 Lectinas .................................................................................................... 19 
1.4 La lectina de Amaranthus leucocarpus. ................................................... 20 
1.5 Linfocitos T. .............................................................................................. 20 
1.6 Importancia de la O-glicosilación en la respuesta inmune. ...................... 25 
2 Antecedentes. ................................................................................................. 28 
3 Justificación. ................................................................................................... 33 
4 Hipótesis. ........................................................................................................ 34 
5 Objetivo general. ............................................................................................. 34 
6 Objetivos específicos. ..................................................................................... 34 
7 Materiales y métodos. ..................................................................................... 35 
7.1 Soluciones usadas en extracción y biotinilación de la lectina. ................. 35 
7.2 Purificación de la ALL. .............................................................................. 35 
7.3 Evaluación de actividad de ALL. .............................................................. 37 
7.4 Biotinilación de la ALL. ............................................................................. 38 
7.5 Fenotipificación de linfocitos T usando ALL. ............................................ 39 
7.6 Software, programas de cómputo y estadística ...................................... 43 
8 Resultados ...................................................................................................... 44 
8.1 Extracción, purificación y evaluación de la actividad de la ALL. ............... 44 
8.2 ALL como herramienta en la identificación de O-glicanos en ensayos de 
citometría. .......................................................................................................... 50 
8.3 Análisis de la expresión de la proteína gpALL en linfocitos T CD4+ y en 
linfocitos T CD8+. ............................................................................................... 52 
8.4 Predicción de posibles sitios de O-glicosilación en moesina. ...................... 60 
9 Discusión. .......................................................................................................62 
10 Conclusiones. .............................................................................................. 69 
11 Perspectivas. ............................................................................................... 70 
12 Bibliografía................................................................................................... 71 
 
 
 
 
 
 
 
 
8 
 
Abreviaturas 
 
aa aminoácidos 
AG agitación contante 
ALL lectina de amaranto leucocarpus 
APC célula presentadora de antígeno 
Asp asparagina 
CFSE éster de succinimidil-carboxifluoresceína 
ConA concanavalina A 
DO densidad óptica 
FERM familia de proteínas denominada (Familia Ezrina, Radixina, 
Moesina) 
FNR fracciones no retenidas 
FR fracción retenida 
Fuc fucosa 
Gal galactosa 
GalNAc N-acetilgalactosamina 
GalNAc-T N-acetilgalactosaminil-transferasa 
GlcNAc N- acetilglucosamina 
gpALL lectina de Amaranthus leucocarpus 
Man manosa 
MHC complejo principal histocompatibilidad 
MM materiales y métodos 
PKC proteína cinasa C 
PNA lectina aglutinante obtenida de cacahuate 
Pro prolina 
PTM modificación postraduccional 
OMAS genoma, el transcriptoma y el proteoma 
Ser/Thr serinas o treoninas 
SiA ácido siálico 
sLex glicano sialil lewis X 
9 
 
SS solución salina 0.9% 
TA temperatura ambiente 
TCR receptor del linfocito T 
Trp triptófano 
Xyl xilosa 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
10 
 
Resumen 
 
Las glicoproteínas son biomoléculas modificadas postraduccionalmente por 
la adición de carbohidratos a la cadena peptídica, influyendo en las propiedades 
fisicoquímicas, estructurales y biológicas del glicoconjugado, por ejemplo en la 
activación de los linfocitos T se da una serie de cambios y reacciones moleculares 
que señalizan y facilitan la proliferación y el desarrollo de las funciones efectoras 
de cada subpoblación celular, donde se ha podido establecer que algunas 
glicosilaciones se adicionan sobre algunas proteínas que participan de estos 
procesos como mecanismo moduladores de la actividad de las biomoléculas. 
En linfocitos T CD4+ purificados se ha identificado una O-glicoproteína 
(gpALL), de 70kDa con dominios homólogos a moesina, que se asocia a balsas 
lipídicas y con función co-estimuladora similar a CD28, lo cual ha permitido sugerir 
que esta glicoproteína participa en mecanismos alternos de activación celular. La 
expresión de esta proteína aún no se ha definido en linfocitos T CD8+, una 
subpoblación celular con importancia en la eliminación de células tumorales y de 
células infectadas por virus y bacterias. 
Este trabajo tiene como objetivo evaluar en linfocitos T CD4+ y CD8+ 
murinos la dinámica de expresión de la O-glicoproteína reconocida por la lectina 
Amaranthus leucocarpus durante la activación celular con anticuerpos anti-CD3 y 
anti CD28 (anti-CD3/CD28). 
Nuestros resultados, evidencian que en condiciones basales el 30% de 
linfocitos T CD4+ expresan gpALL y a las 48h posactivación el numero de células 
CD4+gpALL+ se incrementa hasta el 98%; Contrastando, en linfocitos T CD8+ no 
activados aproximadamente el 90% de las células son CD8+gpALL+ 
manteniéndose estos niveles durante las siguientes 72h posactivación con 
pequeñas variaciones (3-7%), sin embargo, en términos de las MFI ambas 
subpoblaciones tienen comportamientos similares aumentando los niveles de 
expresión y manteniéndose constante durante toda la cinética. Esto permite 
proponer que gpALL es una glicoproteína inducible en linfocitos CD4+ y 
constitutiva en linfocitos CD8+. Por otro lado, al determinar la expresión de 
11 
 
moesina usando un anticuerpo especifico encontramos que el porcentaje de 
células CD4+moesina+ como de CD8+moesina+ se incrementa tras el estimulo 
alcanzando su máximo a las 48h, en ambas poblaciones la MFI de moesina 
aumenta a partir de las 24h manteniéndose constante hasta las 72h. 
Mediante análisis de predicción bioinformática se pudo encontrar que la 
proteína moesina posee 6 sitios posibles de ser O-glicosilados uno de los cuales 
es la Thr 558, un aminoácido con importancia durante la activación y desarrollo de 
la función de la proteína, estos sitios son congruentes con 6 posibles glicanos 
asociados a la moesina, dos glicanos del tipo SiA-Galβ-1,3GalNAcα1-O-Ser/Thr y 
cuatro glicanos GalNAcα1-O-Ser/Thr. 
Nuestros resultados permitieron establecer que gpALL posee un mecanismo 
de expresión dinámica en la superficie de los linfocitos T estimulados con anti-
CD3/CD28, teniendo en cuenta los antecedentes y contratándolos con nuestros 
resultados pensamos que posiblemente gpALL es una molécula con función co-
estimuladora de los mecanismos efectores propios de cada subpoblación celular 
tras la activación inmunológica, por otra parte los resultados presentados aquí 
permitieron evidenciar la expresión de la proteína moesina en la membrana celular 
de linfocitos T cuya translocación a través de la membrana se da tras la activación 
celular con anti-CD3/CD28, algo hasta ahora no reportado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
12 
 
1.1 La glicosilación como mecanismo de modificación postraduccional. 
 
Las proteínas son biomoléculas fundamentales para el desarrollo de 
cualquier organismo, conforman los diferentes tejidos y participan en la mayoría de 
los procesos biológicos. Gran parte de las proteínas son modificadas durante o 
después de su síntesis mediante la adición de moléculas o grupos funcionales 
sobre aminoácidos puntuales y específicos, a este proceso se le conoce como 
modificación postraduccional (PTM) [1]. 
Las PTMs son cruciales para la regulación de las funciones en muchas 
proteínas como por ejemplo proliferación celular, diferenciación, apoptosis, 
desarrollo y homeostasis [2, 3]; el desequilibrio o el incorrecto procesamiento 
proteínico en la adición de PTMs puede contribuir al desarrollo de enfermedades 
tales como la generación de células cancerígenas, entre otras [4]. Estas 
modificaciones en las proteínas generan cambios estructurales y fisicoquímicos en 
las biomoléculas, modulando su actividad, localización, disponibilidad, interacción 
molecular y tiempo de vida media, pero estos cambios son dependientes tanto del 
tipo de PTM como de la estabilidad del enlace entre la proteína y la molécula 
adicionada[5]. Por ejemplo, la proteína cinasa C (PKC) en algunos casos es 
regulada mediante la adición o remoción de grupos fosfatos [6, 7], otro ejemplo 
característico es la ubiquitinación sobre algunas proteínas como mecanismo de 
señalización para la degradación enzimática y reciclaje de molecular de 
aminoácidos [8], otros ejemplos se resumen en la tabla 1. 
La glicosilación es una PTM ampliamente descrita que se caracteriza por la 
formación de enlaces covalentes entre una porción sacarídica y biomoléculas 
aceptoras como lípidos y proteínas cuyo producto es denominado glicolípido o 
glicoproteína respectivamente o de forma general glicoconjugado, su síntesis es 
regulada por glicosiltransferasas y por la disponibilidad de sustrato [9]. La porción 
sacarídica adicionada se denomina glicano y se compone comúnmente de 
manosa (Man), galactosa (Gal), N- acetilglucosamina (GlcNAc), ácido siálico (SiA), 
fucosa (Fuc), xilosa (Xyl) y N-acetilgalactosamina (GalNAc), entre otros (Figura 1) 
[10]. Los glicanos adicionados pueden ser tanto monosacáridos como 
Margarita
Texto escrito a máquina
1. Introducción. 
13 
 
oligosacaridos y en muchas glicoconjugados estos comprenden una porción 
sustancial de la masa y del volumen de la estructura cuaternaria del 
glicoconjugados [11]. 
 
Tabla1. PTM frecuentes en proteínas 
 Tipo de 
Modificación 
Estabilidad Funciones y Notas 
Fosforilación 
Tyr +++ PTM reversible, activación/inactivación de la actividad 
enzimática, modulación de interacciones moleculares,señalización. 
Ser, 
Thr 
+/++ 
Acetilación 
+++ Estabilidad de proteínas, protección de N terminal. 
Regulación de interacción Proteína-DNA (Histonas). 
Metilación +++ Regulación de la expresión genética 
Acilación, modificación 
de ácidos grasos 
+++ Señalización y localización celular, mediador interacción 
proteína-proteína 
Glicosilación. 
 
+/++ Excreción de proteínas, reconocimiento/señalización célula 
- célula, reversible, funciones regulatorias. 
Anclas GPI 
++ Anclaje a membrana de enzimas y receptores, 
principalmente hacia la cara externa de la membrana 
plasmática. 
Hidroxiprolina 
+++ Estabilidad de la proteína e interacciones proteínas 
ligando. 
Sulfidración 
+ Modulación de interacciones proteína-proteína, proteína-
receptor 
Formación de enlace 
disulfuro 
++ Plegamiento e interacción intra e intermolecular, 
estabilidad de la proteína 
Desaminación 
+++ Posible regulador de regulación proteína-proteína, 
proteína-ligando. 
Acido proteoglutamico +++ Estabilidad de la proteína, bloqueo del N-terminal 
Ubiquitinación +/++ Señalización de destrucción y reciclaje 
Nitración de la tirosina +/++ Daño oxidativo durante la inflamación 
+. Baja estabilidad, ++ Moderadamente estable, +++ Estable, +/++ Su estabilidad es dependiente de su acople al tipo de 
proteína. 
La estabilidad es determinada como la facilidad con el que puede ser disociado o removido un enlace formado entre una 
molécula o grupo funcional y una aminoácido puntual, es decir, la estabilidad es medida en términos de la reversibilidad 
de la modificación postraduccional. 
Tomada y modificada de: “Proteomic analysis of post-translational modifications” [5]. 
 
14 
 
Figura 1. Carbohidratos comunes en las glicosilaciones de biomoléculas. Estructuras 
moleculares de los carbohidratos comunes en la formación de glicanos; frecuentemente los 
azucares GlcNAc, GalNAc forman el enlace covalente entre el péptido y la porción sacarídica y de 
forma menos común también lo hace la Man (C-Glicosilación), Man y Gal están implicadas en la 
elongación del glicano, el SiA se une al final de la secuencia sacarídica y Fuc o Xyl se pueden unir 
a lo largo del glicano modificando la conformación y propiedades de la glicosilación pero no hacen 
parte de la elongación de la estructura principal [Realizado con Chem Bio Draw Profesional]. 
 
Muchas proteínas llevan a cabo sus funciones en la membrana de la célula 
expuestas hacia la matriz extracelular, pero algunas de ellas debido a su 
estructura química y propiedades moleculares son biomoléculas altamente 
hidrofóbicas, estas proteínas pueden modificar su solubilidad mediante la adición 
de glicanos que debido a la presencia de grupos hidroxilos y grupos funcionales 
polares confiere un carácter hidrofílico a los glicoconjugados favoreciendo la 
relocalización proteica en ambientes acuosos tales como la matriz extracelular, por 
lo tanto, la superficie de la mayoría de las células está cubierta con un denso 
recubrimiento de glicoconjugados, lo que se denomina glicocálix (Figura 2), el cual 
alberga glicoproteínas con funciones de anclaje, reconocimiento molecular, 
inductoras de señales, entre otras funciones [12]. 
15 
 
 
Figura. 2 Glicocalix. Micrografía electrónica (120.000x) que muestra el glicocalix de fibroblastos 
de hamster teñidos con rojo de rutenio, específico para glicanos. Se observa la densidad del 
glicocalix sobre la membrana celular. Tomada y modificada de: “Ultrastructural Modifications of the 
Cell Surface and Intercellular Contacts of Some Transformed Cell Strains” [13]. 
 
La glicosilación amplía la diversidad estructural, flexibilidad y funcional de 
las proteínas pues cambia de forma dramática sus propiedades fisicoquímicas. 
Los glicanos pueden ser adicionados en múltiples posiciones del péptido y una 
misma proteína puede tener múltiples glicosilaciones, cada una de las cuales 
podrá modificar en cierta medida a la proteína, esto hace de la glicosilación un 
mecanismo con alto potencial químico de trasporte de información en relación con 
la capacidad del genoma, el transcriptoma y el proteoma (OMAS), esto se debe a 
que los OMAS al provenir de una plantilla se limitan a la información codificada por 
la secuencia o molde a partir del cual fueron formados, mientras que las 
glicosilaciones no están limitadas a plantillas si no que son dependientes de 
contextos y motivos estructurales [14], de esta manera las glicosilaciones, al ser 
PTMs recurrentes se constituyen en el glicoma, el cual proporciona acceso 
biológico a un amplio espectro de información a un costo genético mínimo ver 
figura 3 [15]. 
16 
 
 
Figura 3. Comparación del potencial químico de contenido de información entre genoma, 
transcriptoma, proteoma y glicoma. Tomado de: “Emerging glycomics technologies”. [15]. 
 
1.2 Clasificación de las glicoproteínas. 
 
Las glicoproteínas se clasifican dependiendo del tipo de enlace formado entre 
el péptido y el glicano: 
a. N-glicosilación. 
Es la formación de enlaces químicos entre el grupo amino del residuo asparagina 
(Asp) con la GlcNAc formando GlcNAcβ1–Asn. La formación de N-glicanos tiene 
selectividad por secuencias consenso del tipo Asp-X-Ser/Thr, siendo X cualquier 
aminoácido a excepción del aminoácido Prolina (Pro) [16]. Los N-glicanos se 
subclasifican en: 
 N-glicanos altos en Man extendidos solo por residuos de Man 
 N-glicanos complejos donde las antenas son iniciadas y extendidas por dos 
GlcNAc 
 N-glicanos híbridos donde una Man extiende una antena del núcleo y uno o 
dos Man extienden la otra antena (Figura 4) [17]. 
 
b. C-Glicosilación 
Se caracteriza por tener un residuo de Man unido al carbono C2 del grupo Indol 
del triptófano (Trp) mediante la formación de un enlace carbono-carbono, este tipo 
de glicoproteínas se encuentra principalmente en levaduras.[18, 19]. 
17 
 
 
Figura 4. Subclasificación y estructura de N-glicanos. Cuadros azules representan GlcNAc, 
círculos verdes representan Man, círculos amarillos Gal, rombos rojos SiA, triangulo rojo Fuc. 
Tomado de: “Essentials of Glycobiology” [17]. 
 
c. O-GlcNAcilación (O-GlcNAc) 
Su síntesis suele darse en citosol o en mitocondria y es mediada por la 
transferencia del monosacárido GlcNAc a residuos de serinas o treoninas 
(Ser/Thr) formando un enlace tipo O (O-GlcNAc). Se ha evidenciado que este tipo 
de glicosilación se relaciona con la fosforilación regulando ambos la función de la 
proteína sobre la cual son adicionados, en algunos casos ambas modificaciones 
son necesarias para el correcto funcionamiento de la proteína y en otros ambas 
modificaciones se excluyen mutuamente modulando la función proteínica [7, 20]. 
Otra característica de este tipo de glicosilación es que no sufre elongación de los 
carbohidratos, es decir, no se da la oligomerización del glicano [21]. 
d. O-glicosilación de tipo mucínico 
Se caracteriza por la formación de un enlace entre la GalNAc y el grupo -OH de 
Ser/Thr, a este tipo de estructuras comúnmente se les denomina mucinas y son 
parte de tejidos mucosos como el tracto gastrointestinal, genitourinario y 
respiratorio, donde protegen las superficies epiteliales contra daños físicos, 
químicos e infecciones por patógenos [22]. Los O-glicanos también se han 
descrito en la membrana celular de linfocitos y otros tipos celulares del sistema 
inmune [23]. 
18 
 
En las O-glicosilaciones, los oligosacáridos están conformados por tres 
regiones llamadas núcleo o región de unión con la cadena peptídica, la región de 
esqueleto o de elongación del oligosacarido presente sólo en O-glicanos de alto 
peso molecular y la región periférica o externa donde se halla habitualmente la Gal 
y/o el SiA (Figura 5) [17, 24]. 
 
Figura 5. Estructura de un O-glicano. Cuadros azules representan GlcNAc, círculos amarillos 
Glu, rombos rojos SiA, cuadros amarillos representan GalNAc. Tomado de: “Essentials of 
Glycobiology”[17] 
 
La síntesis de O-glicanos inicia con la formación del enlace entre el C1 de la 
GalNAc con el grupo –OH del aminoácido de Ser/Thr, esta formación del enlace 
covalente es mediado por la acción enzimática de la N-acetilgalactosaminil-
transferasa (GalNAc-T) la cual usa como sustrato donador el UDP-GalNAc, Al 
producto de esta primera reacción se le conoce como antígeno Tn, posteriormente 
se adiciona una Gal sobre el GlaNAc formado así el disacárido conocido como 
núcleo 1 o antígeno T el cual es el precursor de los demás núcleos de O-glicanos 
existentes. (Tabla 2) [17, 25]. 
Tabla 2. Núcleos estructurales en la formación de O-glicanos 
O-Glicanos Estructura 
antígeno Tn GalNAcαSer/Thr 
Sialil - antígeno Tn Siaα2-6GalNAcαSer/Thr 
Núcleo 1 ó antígeno T Galβ1-3GalNAcαSer/Thr 
Núcleo 2 GlcNAcβ1-6(Galβ1-3)GalNAcαSer/Thr 
Núcleo 3 GlcNAcβ1-3GalNAcαSer/Thr 
Núcleo 4 GlcNAcβ1-6(GlcNAcβ1-3)GalNAcαSer/Thr 
Núcleo 5 GalNAcα1-3GalNAcαSer/Thr 
Núcleo 6 GlcNAcβ1-6GalNAcαSer/Thr 
Núcleo 7 GalNAcα1-6GalNAcαSer/Thr 
Núcleo 8 Galα1-3GalNAcαSer/Thr 
Tomado de: “Essentials of Glycobiology” [17]. 
 
19 
 
1.3 Lectinas. 
 
Las lectinas son proteínas con capacidad de reconocer glicoconjugados 
uniéndose de manera específica a la porción sacarídica y cuya interacción es 
facilitada por la estereoquímica y estructura del glicano. Su afinidad por los 
carbohidratos es específica y reversible, comparable con el tipo de unión y 
reconocimiento observados entre anticuerpos y antígenos [26]. Estas proteínas 
han sido de gran utilidad en la caracterización y la determinación de la función 
biológica de diversas estructuras glicosiladas. 
Gran parte de las lectinas usadas de forma experimental son aisladas y 
purificadas de diferentes organismos como plantas, hongos, líquenes, etc. y se ha 
demostrado que algunas de ellas tienen la capacidad de activar linfocitos T in vitro, 
por lo que son usadas en sistemas experimentales como mitógenos. Por ejemplo, 
la lectina Concanavalina A (ConA), especifica para Man, se une a la glicoproteína 
CD3 (una proteína manosilada) que se acompleja con el receptor del linfocito T 
(TCR) favoreciendo el entrecruzándolo e induciendo la señalización que culmina 
en activación celular y producción de citocinas [27]. Las lectinas también son 
usadas para estudiar procesos que implican cambios estructurales y expresión de 
glicoconjugados, en la fenotipificación celular y como herramienta para el 
seguimiento de la síntesis y metabolismo de oligosacaridos; Las técnicas 
experimentales en la cuales son usadas las lectinas van desde la citometría de 
flujo, la histoquímica, ensayos de hemaglutinación, la microscopia, entre otras [28], 
por ejemplo, la lectina aglutinante obtenida de cacahuate (PNA), debido a su 
capacidad de reconocer O-glicosilaciones del tipo Gal-β(1-3)-GalNAc o Núcleo 1 
(tabla 3), es usada para identificar poblaciones celulares y biomarcadores 
asociados a estructuras celulares como orgánulos presentes en espermatozoides 
o proteínas de membrana celular [29, 30]. 
 
 
 
20 
 
1.4 La lectina de Amaranthus leucocarpus. 
 
Diseños experimentales en el uso y aprovechamiento de productos naturales 
han permitido obtener extractos vegetales de algunas plantas que pertenecen a la 
familia de las Amarantáceas de donde se ha podido identificar y aislar lectinas en 
Amaranthus caudatus [31], Amaranthus cruentus [32] y en Amaranthus 
leucocarpus. Zenteno, Ochoa y et al. reportaron la obtención Lectina de 
Amaranthus leucocarpus (ALL) a partir de la semilla de la planta, caracterizando a 
su vez un método para la extracción y la purificación [33]. 
ALL posee un peso molecular de 35KDa y su estructura primaria está 
compuesta principalmente por lisina, leucina, valina, fenilalanina y treonina, esta 
lectina tiene especificidad por O-glicanos asociados a GalNAc como el 
Galβ(1,3)GalNAcα1,O-Ser/Thr y GalNAcα1,O-Ser/Thr con una conformación 
estérica particular en relación al péptido de unión del O-glicano (tabla 3) [34, 35]. 
 
Tabla 3. O-glicanos reconocidos por ALL y por PNA. 
Nombre Símbolo Glicanos que reconoce Característica 
Peanut agglutinin PNA -Galβ(1-3)GalNAc α1,O-Ser/Thr -La unión lectina-glicano es 
inhibida por la presencia de SiA. 
- PNA interactúa con -OH en C4 
de la Gal. 
Lectina de 
Amaranthus 
leucocarpus 
ALL -SiAGalβ(1,3)GalNAcα1,O-
Ser/Thr 
 
-SiAGalNAcα1,O-Ser/Thr 
-La presencia de SiA no interfiere 
con la especificidad de la lectina. 
- ALL interactúa con -OH en C4 
de la Gal y con la acetamida en 
C2 de GalNAc. 
 
1.5 Linfocitos T. 
 
Los linfocitos son las células principales que participan en la respuesta 
inmunitaria adaptativa, comprenden entre el 30 y 40% de los leucocitos circulantes 
y se clasifican en linfocitos B, linfocitos NK y linfocitos T, estos últimos se 
caracterizan por expresar una proteína de membrana denominada TCR, la cual 
tiene la capacidad de reconocer péptidos antigénicos asociados a moléculas del 
complejo principal histocompatibilidad (MHC) expresado por las células 
presentadoras de antígeno, lo que promueve su activación y funcionalidad. Este 
21 
 
tipo de células son denominadas linfocitos T, debido a que su proceso de 
maduración ocurre en un órgano llamado timo [36, 37]. 
 El timo es un órgano bilobulado en donde cada lóbulo está compuesto de 
una corteza externa y una medula interna. Las células comprometidas en la línea 
del linfocito T salen de la medula ósea, llegan al timo e ingresan a través de la 
corteza tímica donde inician su proceso de maduración celular en dirección hacia 
la médula tímica, proceso que lleva en promedio de 3 semanas, al finalizar la 
maduración aproximadamente solo el 90% de las células que ingresaron a través 
de la corteza fueron eliminadas como parte de su selección y solo un 10% o 
menos saldrán a circulación como linfocitos T maduros vírgenes, esta razón 
explica porque mediante técnicas histológicas es posible observar una mayor 
densidad celular en la corteza en comparación con la medula timica [38]. 
Las células progenitoras de T, que salen de la medula ósea son atraídos 
hacia el timo por la acción de quimiocinas e ingresan al órgano a través de la 
corteza timica, en este punto se caracterizan fenotípicamente como dobles 
negativos (CD4- CD8-), careciendo además de moléculas de superficie como el 
CD3 entre otras y presentando dinámicas de recambio en otras proteínas de 
membrana que evidencian el avance hacia la maduración en varias etapas (tabla 
4) entre ellas CD117 o receptor para factor de crecimiento de células troncales, 
CD25 o cadena alfa del receptor para IL-2, CD44 una glicoproteína implicada en 
procesos de adhesión celular [39]. 
 
Tabla 4. Características fenotípicas en el desarrollo de timocitos doble negativos [39]. 
Etapa Genotipo Ubicación 
Dobles negativos 1 CD117++, CD44+, CD25- De la medula ósea al timo 
Dobles negativos 2 CD117++, CD44+, CD25+ Corteza subcasular 
Dobles negativos 3 CD117+, CD44-, CD25+ Corteza subcasular 
Dobles negativos 4 CD117low/-, CD44-, CD25- De la corteza subcasular a la corteza 
 
Mientras avanza la etapa de maduración se va iniciando la expresión de 
proteínas de membrana características de las células T, tales como el CD3 y el 
TCR, además de los marcadores moleculares CD4 y CD8 por lo cual 
22 
 
fenotípicamente al finalizar esta etapa se identifican como linfocitos T dobles 
positivos (linfocitos con fenotipo CD4+CD8+). 
 Ya en este punto los linfocitos T CD4+CD8+ expresan el complejo TCR/CD3 
y continúan con el desarrollo de la maduración celular a través de dos procesos de 
selección, la selección positiva, caracterizada por seleccionar linfocitos T con la 
capacidad de unirse a moléculas de MHC propio y la selección negativa, que 
elimina linfocitos T que expresan receptores con alta afinidad por el complejo 
MHC-péptido propio. Después de la selección negativa y positiva secalcula que 
solo alrededor del 2% de las células logran pasar ambos procesos de tamizaje 
celular, lo que quiere decir que aproximadamente el 98% de las células son 
eliminadas mediante procesos de apoptosis al interior del timo. Mientras va 
ocurriendo el proceso de selección positiva y negativa los linfocitos además se van 
comprometiendo con una línea celular específica expresando la glicoproteína CD4 
o la CD8 a lo que se le conoce como compromiso de línea. 
Cuando las células han alcanzado todos los eventos descritos, los linfocitos 
llegan a la medula timica y están listos para su egreso del órgano, en este punto 
se les se caracterizan por ser células maduras vírgenes listas para entrar a 
circulación, el término virgen se refiere a que aún la celula no han encontrado su 
antígeno especifico y de esta manera se movilizan a través de la sangre, la linfa y 
los órganos linfoides secundarios en busca del antígeno por el cual son reactivas, 
del total de linfocitos T que lograron madurar y salir a circulación una tercera parte 
corresponde a linfocitos T CD8+ y los demás a linfocitos T CD4+, es decir, los 
linfocitos TCD4+ y TCD8+ que salen de circulación se calculan en una relación de 
2:1 respectivamente. 
En el momento en que el linfocito T encuentra una célula presentadora de 
antígeno (APC) que exponga en su MHC un péptido especifico al cual pueda 
unirse se da inicio a una serie de eventos que desencadenan en la activación 
celular de la célula T, una característica importante radica en que el linfocito T 
CD4+ reconocerá antígenos asociados a MHC de clase II, mientras que el linfocito 
T CD8+ reconocerá antígenos asociados a MHC clase I 
23 
 
La activación de linfocitos T es mediada por tres señales moleculares, La 
primera señal corresponde al reconocimiento del antígeno peptídico asociado al 
MHC por parte del TCR, la segunda señal corresponde a la co-estimulación a 
través del CD28 en el linfocito T el cual se une al receptor CD80/CD86 presente 
en la APC y cuya función es incrementar la señalización intracelular inducida por 
el complejo TCR/CD3 asegurando además que la célula T no se vuelva enérgica, 
la tercera señal está mediada por IL-2 sintetizada por la propia célula T, así como 
la expresión del receptor de alta afinidad para esta citocina, producto de las 
activación de las cascadas de señalización. Las dos primeras señales se dan 
durante la sinapsis inmunológica la cual consiste en un reacomodo de las 
proteínas de membrana en los linfocitos T en las balsas lipídicas donde se dan las 
interacciones célula-célula necesarias para la activación celular, esta activación da 
lugar a un incremento repentino y acentuado de la proliferación celular, 
generación de células efectoras, y después una disminución notoria de ellas 
(eliminando mediante muerte por apoptosis el 90% de las células de memoria), la 
población remanente de células de memoria tendrá la capacidad de responder 
frente a exposición subsiguiente del antígeno por el cual son reactivas. 
El microambiente que asegura la interacción célula -célula en la activación de 
linfocito T CD4+ también tiene como consecuencia la producción de moléculas 
efectoras que favorecen la supervivencia celular, la entrada al ciclo celular y la 
diferenciación de la célula hacia un tipo de respuesta especifica. Este tipo de 
especificidad en la respuesta es propiciado por la interacción entre receptores 
asociados a la célula T y ligandos solubles presentes en el contexto molecular en 
donde se está llevando a cabo la activación favoreciendo la trascripción de genes 
de citocinas o moléculas efectoras las cuales son especificas en respuesta a cada 
tipo de infección o daño frente al cual deben responder. Dependiendo del tipo de 
respuesta, es posible clasificar los linfocitos T CD4+ en Th1, Th2, TH17, Th9, 
Th22, Treg ó Tfh a este proceso diferenciador se le conoce como polarización 
(tabla 5) 
 
 
24 
 
Tabla 5. Características de la polarización de los linfocitos T. 
Tipo de 
polarización 
Citocinas inductoras 
de la polarización 
Citocinas 
efectoras 
Polarización en respuesta a 
Th1 IL-2, IL-12 IFN-γ 
Eliminación de bacterias y virus 
intracelulares, inmunidad antitumoral; 
autoinmunidad órgano-específico; 
activación y reclutamiento de monocitos. 
Th2 IL-2, IL-4 
IL-2, IL-4, 
IL-5, IL-6, 
IL13 
Eliminación de parásitos helmínticos y en 
enfermedades alérgicas 
Th17 IL-2, IL-23, IL-6, TGF-β 
IL-17A, IL-
17F, IL-22 
Eliminación de bacterias extracelulares; 
autoinmunidad órgano-específico; 
movilización y quimiotaxia de neutrófilos. 
Th9 IL-2,TGF-ß, IL4 IL-9 
Eliminación de parásitos; asma; 
proliferación y activación de mastocitos 
Th22 IL-2,IL-6, TNF IL-22 
Inducción de respuestas inmunes 
epidérmicas; remodelación de tejidos 
Treg TGF-β 
TGF-β, IL-
10 
Regulación de la respuesta inmune 
proinflmatoria 
Tfh IL-6, IL-21 IL-21 
Cooperación con las células B, en los de 
centros germinales. 
 
Para que la célula CD4+ sea diferenciada y llegue a un estado efector debe 
transcurrir la sinapsis y activación inmunológica, posteriormente la proliferación 
celular y expansión clonal y por último la polarización celular desencadenando en 
la producción de citocinas efectoras según las características descritas; El proceso 
de polarización celular a su vez es dividido en tres momentos, la inducción de la 
polarización que implica la estimulación de la trascripción de genes específicos 
para las citocinas características, el compromiso de la vía de polarización 
específica y la amplificación de la señal que inhibe a su vez las demás vías de 
trascripción de las otras citocinas [43]. 
Por otro lado, los linfocitos T CD8+ activados adquieren la capacidad de 
reconocer células blanco que han sido infectadas por el agente patógeno que dio 
lugar a su activación, además también tiene la capacidad de reconocer células 
cancerígenas y tumorales. Al reconocer la célula blanco, el linfocito T CD8+ induce 
la eliminación mediante la secreción de moléculas enzimáticas, sin embargo 
cuando el linfocito T CD8+ responde contra infecciones víricas latentes, 
trasplantes de órganos y células tumorales es necesario, en algunas ocasiones, la 
cooperación de los linfocitos T CD4+ a través de citocinas o como activadores de 
APC que promuevan la diferenciación de la célula CD8+ virgen hacia células 
25 
 
citotóxicas [44]. Los mecanismos de respuesta del linfocito T CD8+ se da 
mediante la producción de gránulos citoplasmáticos que en su interior contienen 
proteínas como la perforina y la granzima, las cuales tienen la capacidad de 
formar hoyos y aberturas sobre la superficie de la célula a eliminar llevándola a su 
destrucción y por ende a la eliminación del agente patógeno hospedado en su 
interior [45]. 
Como se mencionó previamente, los linfocitos T CD4+ responden frente a 
ciertos microambientes moleculares que les permiten diferenciarse hacia 
polarización especifica, proceso que puede durar algunas horas, contrariamente, 
algunos experimentos han demostrado que los mecanismos efectores citotóxicos 
del linfocito T CD8+ (producción de gránulos y moléculas efectoras) se generan de 
manera extremadamente rápida, casi al instante en que el linfocito T es activado a 
través del su TCR que reconoce al antígeno asociado al MHC-I de las células 
dendríticas, incluso se ha podido evidenciar que estos mecanismos citotóxicos se 
generan antes de la división celular [46, 47]. 
 
1.6 Importancia de la O-glicosilación en la respuesta inmune. 
 
La glicosilación es un proceso que afecta la expresión, localización y función 
de numerosas proteínas requeridas para los procesos biológicos, esta PTM tiene 
un efecto estérico en los glicoconjugados limitando así las interacciones 
inespecíficas entre proteínas y favoreciendo la orientación correcta de los 
dominios implicados en el reconocimiento ligando-receptor, por lo tanto,mutaciones en los genes que afectan la maquinaria de la glicosilación 
desencadenan en desordenes congénitos que pueden tener consecuencias, 
fisiológicas, patológicas e inmunológicas [48]. 
En el desarrollo de la respuesta inmune, la expresión de glicoconjugados en 
las células favorece la interacción celular y por ende el desarrollo de los procesos 
inmunobiológicos requeridos, como por ejemplo en la respuesta inflamatoria, 
donde las células efectoras de la respuesta migran hacia los sitios de inflamación, 
este desplazamiento sobre el endotelio es mediado por receptores como la 
26 
 
selectinas P-selectina (PSGL1) expresada en el tejido endotelial vascular [49, 50]. 
Las selectinas, reconocen al glicano sialil lewis X (sLex, Neu5Acα2-3Galβ1-
4[Fucα1-3]GlcNAcβ) expresado en la membrana los leucocitos [51, 52], este 
reconocimiento lectina-ligando favorece el frenando de la célula sobre el tejido, 
disminuyendo no solo su velocidad en el sitio de infección o daño, sino además 
favoreciendo al interacción de las integrinas con las moléculas CAMS las cuales 
finalmente favorecen la unión de la célula en el sitio de infección migrando 
posteriormente del espacio intravascular a los tejidos adyacentes. La ausencia de 
sLex, debido a mutaciones en el gen SLC35C1, produce deficiencia de adhesión 
leucocitaria conocida como Inmunodeficiencia primaria LAD2, afectando la 
respuesta inflamatoria. 
CD4 y CD8, CTLA-4, receptores Notch y otras moléculas críticas para la 
funciones de las células T son glicoproteínas que dependen, entre otros factores, 
de una correcta glicosilación para su regulación y actividad biológica. Por lo tanto 
en los linfocitos T la glicosilación regula las decisiones y la diversidad del destino 
celular durante el desarrollo temprano del linfocito [53, 54], Por ejemplo la lectina 
tipo C galentina-1 expresada en el timo modula la expresión del TCR y contribuye 
a la selección negativa [55]. También se ha demostrado en modelos de ratón que 
la alteración en motivos de glicanos específicos tiene efectos significativos en los 
repertorios de TCR [56]. 
CD43 es una glicoproteína que ejemplifica la importancia de las O-
glicosilaciones en células T durante los procesos de activación celular. Esta 
proteína rica en residuos de Ser/Thr se O-glicosila cuando los linfocitos T se 
activan, aumentando su porción de glicanos lo que modifica su masa molecular 
pasando de 115kDa a 135kDa, este cambio en su glicosilación permite que CD43 
lleve a cabo correctamente su función como molécula de adhesión (Figura 6) [57]; 
en consecuencia, pacientes con alteraciones en la glicosilación de CD43 
presentan un cuadro clínico conocido como el Síndrome de Wiskott-Aldrich, una 
enfermedad que se caracteriza por presentar infecciones recurrentes, eczema, y 
disminución del número de plaquetas en sangre (trombocitopenia) [58]. 
27 
 
 
Figura 6. Glicosilación diferencial de CD43 durante la activación de linfocitos T. Se calcula 
que CD43 posee aproximadamente 40 unidades de O-glicanos, los cuales son modificados durante 
la activación. Tomado y Modificado de: “Essentials of Glycobiology” [17] 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
28 
 
2 Antecedentes. 
 
 Una de las metodologías usadas en el estudio de glicoproteínas es el uso 
de lectinas específicas por glicanos, estas pueden ser usadas en técnicas como la 
microscopia, la inmunodetección, la cromatografía y la citometría de flujo. 
ALL es una lectina aislada de la semilla del amaranto, tiene capacidad de 
reconocer O-glicosilaciones y presenta afinidad por el carbohidrato GalNAc como 
el Galβ-1,3GalNAcα1, O-Ser/Thr y GalNAcα1,O-Ser/Thr. Se ha evidenciado que 
ALL reconoce O-glicoproteínas asociadas a diferentes tejidos y poblaciones 
celulares tales como macrófagos [59] y linfocitos T [60]. Por histoquímica se 
determinó que la ALL se une específicamente a los timocitos presentes en la 
médula timica, mientras que las células reconocidas por PNA (que también se une 
específicamente a la estructura Galβ1, 3GalNAc), se encuentran básicamente 
distribuidas en la corteza, lo cual indica que ALL podría reconocer glicoproteínas 
asociadas a procesos de maduración en el timo (Figura 7) [61]. 
 
Figura 7. Imunohistoquímica de timo murino. ALL-FITC (verde) y PNA-streptavidina Cy3(rojo). 
PNA se marca células de la corteza timica (C), algunas en la región corticomedular CM y 
ocasionalmente en la medula (M), ALL marca células en la región CM y en M [61]. 
 
Mediante ensayos de inmunodetección en extractos celulares de linfocitos 
T, se pudo determinar que ALL reconocía una O-glicoproteína de peso molecular 
de 70kDa y con prevalencia de residuos de Ser, característico de las proteínas O-
glicosiladas [62]. Mediante ensayos de activación celular in vitro se reportó que 
29 
 
linfocitos CD4+ estimulados con anti-CD3 y ALL proliferan y producen la citocina 
IL-2 de forma similar a lo observado en células activadas con anti-CD3 y anti 
CD28, sugiriendo que la glicoproteína reconocida por la lectina de Amaranthus 
leucocarpus (gpALL) tiene la capacidad de co-estimular durante la activación de 
células T CD4+ como lo hace la glicoproteína CD28 (figura 8A, 8B) [63], también 
se evidenció que mediante el estímulo con ALL se da un aumento del flujo de 
calcio intracelular, y la expresión de las proteínas ki67, CD69 fenómenos 
característicos de procesos de activación celular (Figura 8C, 8D) [64]. 
Figura 8. Efectos de la estimulación con ALL en linfocitos T CD4+. A. Histogramas que 
representan la proliferación celular in vitro de linfocitos T CD4+ teñidos con éster de succinimidil-
carboxifluoresceína (CFSE) y cultivados durante 72h en presencia de diferentes estímulos (parte 
superior de cada recuadro), se puede apreciar que la proliferación celular entre los linfocitos T 
estimulados con anti-CD3/ALL es similar a la proliferación de los linfocitos estimulados con anti-
CD3/CD28 (forma clásica de activación in vitro), B. Producción de IL-2 por linfocitos T CD4+ 
estimulados con anti-CD3/CD28 o con anti-CD3/ALL, C. Gráficos dot plot de la expresión de ALL/ 
CD69 (paneles superiores), ALL/Ki-67(paneles inferiores) en linfocitos T CD4+ activados in vitro con 
anti-CD3/CD28, D. Aumento del flujo de calcio intracelular en linfocitos T CD4+ activados in vitro 
con diferentes estímulos (indicados para cada línea en el panel de resultados), la flecha gruesa 
indica el inicio de la medición. Figuras A-B Tomado de: “Amaranthus leucocarpus lectin 
recognizes a moesin-like O-glycoprotein and costimulates murine CD3-activated CD4(+) T 
cells” [63], Figuras C-D Tomado de: “The Amaranthus leucocarpus Lectin Enhances the Anti-
CD3 Antibody-Mediated Activation of Human Peripheral Blood CD4+ T Cells” [64]. 
 
30 
 
 Las balsas lipídicas en linfocitos T albergan proteínas como CD3, CD28, 
TCR y otras necesarias para la activación inmunológica, por lo tanto estas 
estructuras lipídicas facilitan la convergencia de las moléculas que participan en la 
sinapsis inmunológica; una de las estrategias para estudiar la presencia de 
moléculas asociadas a balsas lipídicas es mediante la depleción de estas 
estructuras lipídicas permitiendo disgregar la convergencia de las proteínas y 
demás moléculas ancladas a las balsas, el oligosacarido denominado β-Metil 
ciclodextrina es una de las moléculas usadas para dicho fin, su conformación 
molecular se asemeja a una estructura toroidal con una región hidrófilica en su 
exterior e hidrofóbica en su interior, esto le permite ser soluble en un medio 
acuoso y a su vez tener la capacidad de secuestrar en su interior (del lado 
hidrofóbico) las moléculas de colesterol que conforman las balsas lipídicas. 
Experimentos reportados por nuestro laboratorio evidenciaron como en linfocitos T 
CD4+ in vitro estimulados con anti-CD3/CD28 y expuestos a la β-Metil ciclodextrina 
la expresión de gpALL era nula en comparacióncon las células estimuladas con 
anti-CD3/CD28 sin la presencia de la β- Metil ciclodextrina, sugiriendo que la 
gpALL se localiza en las balsas lipídicas de dicha población celular. (Figura 9) [63]. 
 
 
Figura 9. Expresión de gpALL en linfocitos T tratados con β-Metil ciclodextrina. Linfocitos T 
CD4+ fueron estimulados con anti-CD3, anti-CD3/CD28 o con anti-CD3/ALL y tratados con β-Metil 
ciclodextrina (línea azul) o sin β-Metil ciclodextrina (línea negra), posteriormente se verifico la 
expresión de gpALL en la membrana celular mediante el uso de ALL por citometría de flujo; los 
resultados muestran que cuando las células son tratadas con β-Metil ciclodextrina la expresión de 
gpALL desaparece llevando a pensar que esta O-glicoproteína se encuentra asociada a balsas 
lipídicas. La línea Gris representa el control del fluorocromo secundario usado en la tinción. 
Tomado de: “Amaranthus leucocarpus lectin recognizes a moesin-like O-glycoprotein and 
costimulates murine CD3-activated CD4(+) T cells” [63] 
 
31 
 
Mediante análisis bioinformáticos se evidenció que gpALL tiene un 40% de 
dominios homólogos con la proteína moesina [63], esta proteína citosólica 
expresada en linfocitos T tiene un peso molecular de 67.7KDa, compuesta de 
577 residuos de aminoácidos (aa) y pertenece a la familia de proteínas 
denominada FERM (Familia Ezrina, Radixina, Moesina) su función y localización 
se asocia clásicamente a procesos citosólicos favoreciendo la polimerización de 
actina y no está descrita funcionalmente en la membrana celular [65, 66]. Las 
proteínas FERM poseen regiones homólogas en su estructura proteica, además 
de que la mayoría de sus funciones son redundantes entre sí, sin embargo, cada 
una de las proteínas de asocia a diferentes tipos de células y tejidos (Figura 10) 
[66-69]. 
 
Figura 10. Estructura general de las proteínas pertenecientes a la familia FERM. Esquema de 
las proteínas FERM, Ezrina, Radixina, Moesina. Todas las proteínas comparten características 
estructurales comunes, una región homologa del domino N terminal, un dominio α-helicoidal, se 
denota el aa que es fosforilado durante la forma activa de la proteína. [67] 
 
En linfocitos T CD4+ purificados se evidencio mediante microscopía de 
fluorescencia una colocalización en membrana celular de las proteínas 
reconocidas por ALL y por el anticuerpo anti-FERM, esta colocalización se 
32 
 
concentra en las zonas de contacto intercelular, apoyando la idea de que 
posiblemente gpALL podría ser una glicoforma de la moesina la cual era 
translocada a la balsa lipídica desde el interior de la célula anclándose a las balsas 
en respuesta a la glicosilación de la proteína (figura11) [63]. 
 
Figura 11. Colocalización de las proteína reconocidas por la lectina ALL y por el anticuerpo 
anti-FERM en Linfocitos T CD4+ estimulados con anti-CD3/CD28. A. Linfocitos T teñidos con 
ALL-biotina seguida de estreptavidina-FITC (verde) , B. Linfocitos T teñidos con anti-FERM seguido 
del fluorocromo Alexa Fluor 546 (rojo), C. colocalización de imágenes obtenidas de linfocitos T 
marcados con ALL y anti-FERM, D-F. Tinción nuclear DAPI (azul) se uso como contra tinción 
nuclear, G. Linfocitos T teñidos con DAPI usados control, H-I. Linfocitos T teñidos con fluorocromos 
secundarios FITC y Alexa Fluor 546 respectivamente usados como control. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
33 
 
3 Justificación. 
 
Debido a la importancia de las células T existe un interés en investigación 
básica y clínica por conocer las vías que participan en su activación y regulación 
de la respuesta en la diferenciación celular y en las respuestas efectoras. 
Los procesos de activación en los linfocitos T son dependientes de la 
interacción de sus proteínas de membrana con las de la APC, siendo muchas de 
estas interacciones mediadas por glicoproteínas y ligandos tipo lectinas que 
favorecen la activación de vías de señalización, la proliferación celular y la síntesis 
de moléculas efectoras de la respuesta inmune. La sinapsis inmunológica implica 
una reestructuración molecular de proteínas que modulan los procesos propios de 
la activación celular y participan directamente en las vías de señalización que 
desencadenan en la respuesta efectora de las células T. 
gpALL es una O-glicoproteína descrita en linfocitos T CD4+, con dominios 
homólogos a la proteína moesina, además gpALL es reconocida por ALL y al 
parecer tiene funciones co-estimuladoras similares a CD28, lo que sugiere un 
mecanismo alterno de activación celular aun no descrito, con potencial en 
investigación básica y aplicaciones farmacológicas relacionadas con la respuesta 
inmunológica, la autoinmunidad y la defensa contra agentes patógenos. 
Nuestro trabajo busca evaluar la expresión de gpALL en linfocitos T CD4+, y 
T CD8+, estas últimas tienen un rol fundamental durante la respuesta inmunológica 
contra infecciones víricas, parasitarias, bacterianas intracelulares y la eliminación 
de células tumorales, además establecerán si la gpALL se expresa dinámicamente 
en la membrana de los linfocitos T durante la activación celular aportando 
conocimiento al desarrollo de una teoría que formula la importancia y función de la 
O-glicoproteína gpALL en la respuesta inmunológica. 
Por otra parte, explorar la posibilidad de que gpALL sea una glicoforma de 
la proteína moesina abre un campo de investigación en el cual la O-glicosilación 
puede competir con otras PTMs en la regulación de las funciones proteinicas. 
 
34 
 
4 Hipótesis. 
 
La O-glicoproteína reconocida por la lectina Amaranthus leucocarpus (gpALL) se 
expresa diferencialmente en linfocitos T CD4+ y en linfocitos T CD8+ y los niveles 
de su expresión son modulados en respuesta a la activación con anti-CD3/CD28. 
 
5 Objetivo general. 
 
Evaluar en linfocitos T CD4+ y CD8+ murinos la dinámica de expresión de la O-
glicoproteína reconocida por la lectina Amaranthus leucocarpus (gpALL) durante la 
activación celular. 
 
6 Objetivos específicos. 
 
a) Estandarizar el uso de la lectina de la lectina Amaranthus leucocarpus (ALL) 
en ensayos de citometría de flujo. 
b) Evaluar la expresión de la O-glicoproteína reconocida por la lectina 
Amaranthus leucocarpus (gpALL) en linfocitos T CD4+ y en linfocitos T 
CD8+ sin estimular. 
c) Medir la cinética de expresión in vitro de la gpALL en la membrana celular 
de linfocitos T CD4+ y en linfocitos T CD8+ activados con anti-CD3/CD28. 
d) Comparar la expresión de la moesina en linfocitos T CD4+ y en linfocitos T 
CD8+ en una cinética de activación in vitro con anti-CD3/CD28. 
e) Determinar los posibles sitios de O-glicosilación de la proteína moesina. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
35 
 
7 Materiales y métodos. 
 
7.1 Soluciones usadas en extracción y biotinilación de la lectina. 
 
Tabla 6. Soluciones y diluciones. 
Solución Formulación Concentración 
Buffer de sales de fosfatos (PBS) 
NaCl(s) 
KCl(s) 
Na2HPO4(s) 
KH2PO4(s) 
H2O(l) MQ, pH 7.4. 
138 mM 
2.7mM 
8.1 mM 
1.2 mM 
Solución salina 0.9% (SS) 
NaCl 
H2O(l) MQ. 
0.9% 
Solución de bloqueo para blot, 
Tween 20 
Leche en polvo libre de grasa 
PBS 
0.01% 
5 %. 
1x 
Solución de lavado para blot 
Tween 
PBS 
0.01 % 
1x 
Solución de glicina C2H5NO2 1M 
Solución acida para digestión 
digestión 
H2SO4 0.001N 
Solución de glutaraldéhido C5H8O2 1.5% 
 
7.2 Purificación de la ALL. 
 
La lectina de Amaranthus leucocarpus se extrajo a partir de semillas frescas de 
Amaranthus leucocarpus obtenida en Tulyehualco (México) mediante 
cromatografía de afinidad usando como fase estacionaria estroma de eritrocitos 
del tipo sanguíneo O+ como se indica a continuación. 
 
7.2.1 Obtención del estroma para la fase estacionaria. 
 
Para obtener el estroma sanguíneo se usaron eritrocitos del tipo O+, este tipo 
sanguíneo posee el antígeno T en su membrana el cual es el glicano reconocido 
por ALL (Galβ1-3GalNAcαSer/Thr),otros tipos sanguíneos también poseen este 
glicano, sin embargo la preparación del estroma solo se debe llevar a cabo con un 
solo tipo de eritrocitos para evitar reacciones de las moléculas del complemento 
presentes en el plasma de cada tipo sanguíneo. 
36 
 
El contenido de un paquete eritrocitario de 500 ml fue lavado 2 veces con PBS 
estéril durante 5 min en agitación, posteriormente las células fueron lisadas en 
H2O(l) MQ. destilada durante 4 h en agitación contante (AG) a temperatura ambiente 
(TA). Luego el lisado se centrifugó a 15000 rmp 10 min 4°C (BECKMAN J2-21 
Centrifuge) y el pellet obtenido fue lavado 15 veces alternando H2O(l) MQ y PBS 
hasta obtener una solución translucida de color rojizo, característico de la 
eliminación de la hemoglobina y el contenido citoplasmático, dejando sólo las 
membranas celulares denominadas fantasmas de eritrocitos o estroma 
eritrocitario. 
El estroma se trató con solución de glutaraldehido (SIGMA Co,St Louis Mo, 
USA), seguido de glicina 1 M y posterior tratamiento con acido sulfúrico 0.0005 N 
por 1 h en ebullición y AG. Posteriormente el estoma fue lavado con 500 ml de 
PBS suspendiendo al final en esta misma solución. 
Para la preparación fase estacionaría se usó una columna de vidrio con 
capacidad de 150 ml, la fase estacionaria se preparó mezclando estroma y 
sephadex G-25 (GE Healthcare, Suecia) activado previamente durante 24 h a TA 
con H2O(l) MQ en relación 1:3, el empaquetamiento de la columna se realizó hasta 
la capacidad volumétrica media de la columna. La columna se equilibró con 500 ml 
de solución salina 0.9% (SS) al inicio y entre cada corrido cromatográfico para 
garantizar la estandarización y la no saturación de la fase estacionaria con el 
analito. Se estableció un flujo constante a temperatura ambiente de 20 ml/h. 
Las semillas de amaranto fueron molidas en un molino con capacidad de 20 g 
por molienda, se realizarón pulsos cortos y sucesivos para evitar el incremento de 
la temperatura hasta obtener una harina uniforme. La harina se sometió a 
extracción ácida en SS en relación 1 gr/10 ml y se dejó en agitación 24 h a 4°C. 
Se ajustó el pH a 4 con adición de ácido acético glacial (Baker Analyzed, México), 
se dejó en agitación 24 h a 4°C. Este proceso permite flocular los lípidos de la 
harina. La suspensión obtenida se decantó y se filtró para recuperar la fracción 
soluble, la cual se centrifugó a 10,000 rpm durante 4°C 10 min para eliminar micro 
partículas. El extracto crudo se almacenó a 4°C en oscuridad hasta la separación 
cromatografíca [33]. 
37 
 
7.2.2 Elución cromatográfica. 
 
La columna cromatográfica se equilibró con 500 ml solución salina 0.9%, 
posteriormente se aplicaron 50 ml de extracto de amaranto (extracto crudo) 
seguidos de 350 ml de SS, la colección de fracciones se realizó usando un 
colector LKB Multitrac 211 y un Rack B para 20 tubos con flujo de 20 ml/h, TA, 200 
gotas por tubo; la elución de la ALL se realizó con 5 ml de CH3COOH 5% y 200 ml 
de H2O(l) MQ, se determinó la absorbancia de cada una de las fracciones colectadas 
a una longitud de onda de 280 nm. (Spetrophotometer Beckman Du 640). 
 
7.2.3 Electroforesis. 
 
La lectina purificada fue corrida en una electroforesis de una dimensión, la 
muestra se corrió en una cámara electroforética Mini Protean 3 por 1h, a 100Amp 
en solución amortiguador de corrida. Cada carril contiene 30ug de proteína 
diluidos 1:1 en amortiguador de carga, se emplearon estándares de peso 
molecular conocido Precision Plus Dual Color (BIO RAD, Germany). Una vez que 
la migración electroforética llego a su término, se tiño el gel con azul de Comasiee. 
 
7.3 Evaluación de actividad de ALL. 
 
7.3.1 Ensayo de Hemaglutinación. 
 
Se realizó por el método de doble dilución seriada empleado eritrocitos 
humanos del tipo O+. En cada pozo de una placa de 96 pozos (Costar, NY) se 
colocaron 25 l de PBS, posteriormente en el primer pozo de cada fila se 
agregaron 25 l de cada fracción colectada y se realizaron diluciones sucesivas 
con el mismo volumen. Finalmente se agregó a cada pozo 25 l de una 
suspensión de eritrocitos al 2% en PBS y se incubó la placa durante toda la noche 
a temperatura ambiente. Se determinó el título de hemaglutinación de cada 
38 
 
fracción y se reportó como el inverso de la última dilución con actividad 
aglutinante. 
 
7.3.2 Concentración de proteína eluida. 
 
Las fracciones eluídas de la columna con actividad aglutinante fueron 
mezcladas para ser concentradas y determinar su calidad funcional y 
concentración. De igual manera se mezclaron las fracciones no retenidas (1-40). 
Las proteínas se concentraron mediante filtración presurizada usando el sistema 
amicon (Millipore, Jaffrey), usando un disco de ultrafiltración Ultracel® 10KDa. 
 
7.3.3 Ecuaciones de cálculo para determinación de parámetros de calidad 
funcional de la lectina. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
7.4 Biotinilación de la ALL. 
 
ALL fue biotinilada usando el kit EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin (Thermo scientific, 
Germany). La biotina fue resuspendida en H2O(l) MQ, posteriormente se mezcló en 
relación 1:5 con ALL a una concentración de 2 mg/ml y se incubo por 48 h, luego 
se dializó la lectina biotinilada y se procedió a evaluar la unión de la biotina a la 
39 
 
lectina. La reacción de unión de la biotina a la proteína es altamente estable e 
irreversible y según datos del proveedor alcanza una eficiencia superior al 90%, 
por lo tanto se calcula que por cada molécula de ALL existen aproximadamente 5 
unidades de biotina unida a su estructura cuaternaria. Para evaluar la biotinilación 
de la lectina se realizó un ensayo de Dot blot sembrando 2 l de ALL-b sobre una 
membrana de nitrocelulosa (Millipore, USA), la cual se sumergió en solución de 
bloqueo para blot durante 2 h TA con AG, se lavó la membrana 2 veces con 
solución de lavado para blot durante 5 min y se incubó con Avidina-HRP (Jakson 
inmune research, USA) en solución de lavado para blot 2h. La membrana se lavó 
4 veces con solución de lavado para blot durante 5 min y finalmente se reveló 
sumergiéndola en una solución de Diamino bencidina (SIGMA, USA) durante 5 
min tiempo en el cual se sumerge en H2O(l) MQ, para parar la reacción. 
 
7.5 Fenotipificación de linfocitos T usando ALL. 
 
7.5.1 Animales. 
 
Se utilizaron ratones de la cepa Balb/c machos de 6 a 8 semanas de edad y 
con un peso de entre 28-30 g. Los animales son mantenidos en condiciones de 
esterilidad y libres de patógenos en el bioterio de la facultad de medicina de la 
U.N.A.M con ciclos fijos de luz y obscuridad. Todos los protocolos fueron 
aprobados por la comisión de ética para la investigación con animales de la 
facultad de medicina bajo el proyecto número 099602-08. 
 
 
 
 
 
 
 
40 
 
7.5.2 Medios de cultivo y soluciones usadas para fenotipificación. 
 
Tabla 7. Medios de cultivo y soluciones usadas en fenotipificación. 
Solución Formulación Concentración 
Solución de lavado para 
Inmunoflurescencias (SLI) 
SBF1% 
NaN3 0.1% 
PBS 
1% 
0.1% 
1X 
Solución de fijado de 
paraformaldehído (PFD) 
PFD 4% (fijaciones x 
20min) 
PFD 1% (fijaciones >20min) 
solución de Di-amino 
bencidina (DAB) 
H2O2 30% 
DAB 
0.02x 
0.1x 
RPMI-1640 Completo 
Piruvato de sodio (GIBCO, USA) 
L-Glutamina (GIBCO,USA) 
HEPES (GIBCO,USA) 
Aminoácidos no esenciales (GIBCO,USA) 
Suero bovino fetal (SFB) (Byproductos, 
México) 
Penicilina (GIBCO,USA) 
Estreptomicina (GIBCO,USA) 
β-mercaptoetanol (SIGMA,USA) 
RMPI-1640 (GIBCO,USA) 
1mM 
2mM 
25 mM 
0.1mM 
10% 
 
100 U/ml 
100 ug/ml 
50mM 
 
7.5.3 Obtención de esplenocitos. 
 
Los animales se sacrificaron por dislocación cervical siguiendo la norma oficial 
Mexicana NOM-062-ZOO-1999 que describe Especificaciones técnicas para la 
producción, cuidado, uso y sacrificio de los animales de laboratorio y se extrajeronlos bazos en condiciones de esterilidad colocándolos en una caja petri con 2 ml de 
PBS. Cada órgano se perfundió con 10 ml de PBS, la suspensión celular se 
trasfirió a un tubo de 15 ml y se dejó sedimentar a temperatura ambiente durante 
10 min, posteriormente se recuperó el sobrenadante y se centrifugó a 1500 rpm 
durante 5 min, posteriormente se retiró el sobrenadante y se continuó trabajando 
con el pellet celular. Las células se suspendieron en 1.5 ml de solución de lisis de 
eritrocitos y se incubaron por 3.5 min, TA y oscuridad, se paró la lisis celular con 
10 ml de PBS, se centrifugó y se realizaron 2 lavados con PBS. El conteo celular 
se realizó con azul de tripano (Gibco, USA) en un hemocitómetro o cámara de 
Neubauer. 
 
41 
 
7.5.4 Activación de linfocitos T. 
 
Se sembraron cien mil células esplenocitos por pozo de una placa de 96 pozos 
(Sarstedt, USA) y fueron estimulados con 3 g/ml de anti-CD3 y con 0.3ug/ml de 
anti-CD28 (clona 37.51, TOMBO biosciencies, San Diego CA) en un volumen final 
de 200 l de RPMI 1640 Completo y se incubaron a 37h, 37°C, 5% CO2. 
 
7.5.5 Inmunofluorescencia directa. 
 
Cien mil células se resuspendieron en 100 l de SLI con la mezcla de 
anticuerpos acoplados a diferentes fluorocromos indicada para cada experimento 
y se incubaron 30 min, 4°C, oscuridad, finalmente se realizaron dos lavados con 
100 l de SLI y se resuspendieron las células en 200 l. 
 
7.5.6 Inmunofluorescencia indirecta. 
 
Cien mil células se resuspendieron en 100 l de SLI 0.67 μg de ALL, 30 min, 
4°C, en oscuridad, se realizaron dos lavados con 100 l de SLI y se centrifugaron 
a 1500 rmp durante 5 min. Después, las células fueron resuspendidas en 100 l 
de SLI con 0.015 ug de Streptavidina B.V 421, se incubaron 30 min, 4°C, 
oscuridad, se realizaron dos lavados con 100 l de SLI y resuspendieron en un 
volumen final de 100 μl de DPBS. 
 
7.5.7 Tinción de viabilidad. 
 
Cien mil células se incubaron con 100 l de una dilución de Ghost Dye Red 
780 en PBS 1:1000 durante 10 min en oscuridad, la reacción se paró con 100 l 
de SLI, se realizaron dos lavados con 100 l de SLI y se resuspendieron en 200 
l de PBS o PFA 1%. 
 
42 
 
7.5.8 Citometría de flujo. 
 
Se usó un clitómetro de flujo MACS QUANT Analyzer 10 (Miltenyi Biotec, 
Germany) con las siguientes características. 
Tabla 8. Características del componente óptico del citómetro de flujo usado. 
Laser Canales de detección Filtro (nm) 
Laser violeta 405 nm V1 450/50 
 
 
Laser azul 488 nm 
B1 525/50 
B2 655/40 
B3 655-730 
B4 750 lp 
Laser rojo 635 nm R1 655-730 
R2 750 LP 
Laser azul 488 nm FSC 488/10 
SSC 488/10 
 
7.5.9 Anticuerpos, lectinas y colorantes. 
 
Tabla 9. Características de anticuerpos usados en la tinción de moléculas de superficie. 
 Anticuerpos contra moléculas de superficie e Intracelulares 
Especificidad Clona Fluoroforo Fabricante 
CD4 RM4-5 APC TONBO, USA 
CD8 53.67 PE-Vio770 Miltenyi Biotec, Germany 
Moesina EP1863Y PE Abcam, USA 
 
Tabla 10. Características de ALL y fluorocromo usado en la determinación de gpALL. 
 Tinción para ALL 
Especificidad Tipo de Molécula Fluoroforo Fabricante 
GalNac Lectina biotinilada Ninguno NA 
Biotina Streptavidina Brillant Violet 421 Biolegend, USA 
 
Tabla 11. Características de fluorocromo usado selección de células viables. 
Colorantes para evaluar viabilidad 
Ghost Dye Red 780 TONBO 
 
Tabla 12. Características de λ de excitación y emisión de cada fluorocromo. 
Características de los fluorocromos 
Fluorocromo Excitación 
Máxima 
(nm) 
Emisión 
Máxima 
(nm) 
Laser de 
Excitación (nm) 
Canal de 
Detección 
BV421 407 421 405 V1 
PE 496 488 488 B2 
PE-Vio770 565 775 488 B4 
APC 650 660 640 R1 
Ghost Dye 780 633 780 640 R2 
 
43 
 
7.6 Software, programas de cómputo y estadística 
 
7.6.1 Software para análisis de citometría. 
 
El análisis de las muestras se citometría se realizó con el programa FlowJo 
V. 10.2 de Tree Star (Becton dickinson). 
 
7.6.2 Diseño de estructuras moleculares. 
 
Para el diseño de estructuras moleculares se uso programa ChemBioDraw 
Ultra 13.0. (PerkinElmer Informatics). 
 
7.6.3 Predicción de O-glicosilación. 
 
La predicción de los sitios O-glicosilación se usó el servidor NetOGlyc 4.0 
server. http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/ (11/12/2017). 
 
7.6.4 El análisis estadístico. 
 
El análisis estadístico se realizó con el programa Prism 5 (GraphPad 
Software, USA). Para determinar diferencias significativas entre dos grupos se 
utilizó la prueba t de Student con un intervalo de confianza del 95%. Se realizaron 
dos experimentos independientes cada uno con tres repeticiones. Para comparar 
más de dos grupos se usó una prueba de análisis de varianza (ANOVA) con un 
intervalo de confianza del 95% y una prueba posterior de comparación múltiple de 
Bonferroni. En todos los casos se consideraron estadísticamente significativos los 
valores p<0.05. 
 
 
 
 
44 
 
8 Resultados. 
 
8.1 Extracción, purificación y evaluación de la actividad de la ALL. 
 
8.1.1 Perfil cromatográfico de la extracción de la ALL. 
 
La cromatografía de afinidad es un tipo de cromatografía de líquidos que se 
basa en la unión reversible entre el analito de interés y un ligando específico sobre 
la fase estacionaria. Cuando la muestra pasa a través de la columna solo son 
retenidas las moléculas que se unen de manera selectiva por el ligando y las que 
no quedan retenidas avanzan con la fase móvil (SS) denominadas fracciones no 
retenidas (FNR). Después, el analito retenido es separado de la fase estacionaria 
mediante el cambio de fase móvil, para nuestro caso 50 ml de ácido acético 
(CH3COOH) al 5% seguido de H2OMQ, a esta elución se le conoce como fracción 
retenida (FR). 
Con el fin de purificar la lectina se realizó una cromatografía de afinidad 
usando como fase estacionaria estroma sanguíneo bajos las condiciones de 
separación indicadas en materiales y métodos (MM). La separación 
cromatografíca se realizó con la elución de un volumen saturante de extracto 
crudo por cada corrido cromatográfico. Se colectaron volúmenes de 10 ml en 60 
tubos que se clasificaron en FNR (primeros 40 tubos) y FR (tubos del 41-60). A 
cada fracción se le determinó el título aglutinante y la densidad óptica (DO) a λ 
280nm, el cual es un parámetro que se relaciona directamente con la 
concentración de proteína. 
La figura 12 corresponde al perfil cromatográfico de la extracción de la ALL, 
la DO (línea azul) muestra una alta concentración de proteína, inclusive por 
encima de la escala de medición en las primeras 30 FNR, posteriormente tras la 
acidificación de la fase móvil, la DO Incrementa en las FR 47-55 
aproximadamente, lo cual era de esperarse, pues el cambio en el pH disminuye la 
interacción de la lectina con fase estacionaria haciendo posible su elución. 
45 
 
El título aglutinante (línea roja) es la última dilución de la lectina capaz de 
aglutinar eritrocitos en el ensayo de hemaglutinación; Se observa un titulo 
aglutinante de mínimo de 1 en las FNR 13-16, fracciones con alta concentración 
de proteína, por lo tanto este valor de aglutinación puede ser interpretado como 
analito no retenido en la fase estacionaria debido a las condiciones saturantes del 
sistema; Por el contrario, en las FR 47-53 se empieza a apreciar un título 
aglutinante por encima de la unidad, lo cual concuerda con la elución de la ALL 
retenida. Esta gráfica muestra también que la DO y el título aglutinante tienen una 
relación inversa tanto para las FNR como para las FR, ya que a mayor DO menos 
título aglutinante y viceversa. 
 
Figura 12. Perfil cromatográfico de la extracción de ALL por cromatografía de afinidad. 50 ml 
de extracto crudo de semilla de amaranto fueron eluídos a través de una columna cromatográfica 
de estroma sanguíneo O+ como fase estacionaria. La elución de las fracciones no retenidas(FNR 
1-40) se realizó con SS 0.9%, las fracciones retenidas (FR 41-60) fueron eluídas después de la 
acidificación con CH3COOH al 5%. El gráfico muestra la medición de la DO. (Línea azul) y la 
determinación del título aglutinante (línea roja). 
 
 
Posteriormente se realizó un análisis de electroforesis (Figura 13) en una 
dimensión para verificar la purificación de la lectina en nuestro sistema, en vista de 
46 
 
que las FR 41-46 y 54-60 no presentaban titulo aglutinante fueron mezcladas. A 
cada carril se le adicionaron 3ug de proteína total siendo el carril 1 FR 47-53, carril 
2 mezcla de FR 41-46 y 54-60, carril 3 FNR, carril 4 extracto crudo y carril 5 los 
marcadores estándar de peso molecular. Los resultados muestran que en la 
fracción FR 47-53 se observa una alta concentración de una proteína con un peso 
molecular de aproximadamente 35KDa correspondiente esto a lo reportado por 
nuestro laboratorio como se expuso en el capítulo de antecedentes. 
 
 
 
Figura 13. Electroforesis 1D para determinar la purificación de ALL. 3ug de muestra por poso 
fueron adicionado a a cada carril, la electroforesis se realizó como se indica en materiales y 
métodos y la tinción se realizó usando colorante azul de comassie. Carril 1 FR 47-53, carril 2 
mezcla se FR 41-46 y 54-60, carril 3 FNR, carril 4 extracto crudo y carril 5 
marcadores estándar de peso molecular. 
 
47 
 
8.1.2 Eficiencia de la extracción de la ALL 
 
La semilla de amaranto fue sometida a un proceso de extracción ácida 
obteniéndose 142.96 mg de proteína total por cada gramo de semilla de amaranto. 
Reportes previos indican que, en promedio, las amarantáceas tienen entre 150 y 
180mg de proteína total por gramo de semilla [70, 71], por lo tanto, nuestro 
sistema de extracción permite obtener cantidades proteicas cercanas a lo 
reportado en la literatura (95-80%). 
Con respecto a la separación cromatografíca, Los tubos colectados 
correspondientes a la FNR fueron mezclados y concentrados, lo mismo se realizó 
con las muestras de las FR pero estas últimas se dividieron en tres grupos FR41-
46, FR47-53, FR54-60 de acuerdo a los datos del perfil cromatográfico, 
posteriormente se determinó la concentración de proteína de cada fracción y se 
evaluó la eficiencia de la extracción (Tabla 13), el extracto crudo se tomó como 
valor de referencia para evaluar los porcentajes de recuperación de la proteína a 
partir de 50 ml del extracto crudo eluído. 
La FNR cuenta con el 90.73% de la proteína total, las fracciones FR41-46 y 
FR54-60 tienen el 0.26% y 0.19% respectivamente y la fracción FR47-53 (FR con 
titulo aglutinante en el perfil cromatográfico) posee un 6.28% de la proteína inicial, 
lo cual concuerda con el perfil cromatográfico. La sumatoria de los porcentajes de 
todas las fracciones indica el porcentaje de recuperación de la proteína en la 
separación cromatografíca el cual es del 97.46%. 
 
Tabla 13. Cálculos de eficiencia de la extracción. 
Fracción 
Proteína 
Total. [mg] 
% 
Proteína 
%Recuperación mg Proteína /g Amaranto % Proteína /g Amaranto 
Extracto crudo 714.8 100.00 No aplica 142.96 14.30 
FNR 648.5 90.73 
97.46 
129.70 12.97 
FR41-46 1.9 0.26 0.37 0.04 
FR47-53 44.9 6.28 8.98 0.90 
FR54-60 1.4 0.19 0.28 0.03 
 A cada muestra se le determinó la concentración de proteína por el método Bradford. Los 
algoritmos de cálculo se encuentran en el apartado MM Algoritmos de cálculo. 
 
48 
 
Los resultados mostraron que tanto la extracción proteica a partir de la semilla 
de amaranto como la separación cromatografíca tienen índices altos de 
recuperación, pues la extracción proteica logro obtener una concentración de 
proteína cercana a los valores reportados en la literatura y la separación 
cromatografíca tuvo una eficiencia superior al 95% comparada con la cantidad de 
proteína inicial. 
 
8.1.3 Evaluación de la actividad de la ALL 
 
Con el objetivo de verificar las características de la fracción obtenida 
correspondiente a ALL evaluamos los parámetros de calidad, unidades 
aglutinantes, actividad específica, porcentaje de rendimiento de las unidades 
aglutinantes y el factor de purificación. Debido a que solo la FNR y la FR47-53 
poseen actividad aglutinante y concentraciones de proteína por encima del 1% 
solo se presentan los resultados para estas dos fracciones. 
La actividad de la ALL define como su la capacidad de interacción entre la 
lectina y su ligando glicosídico, esta medición se lleva a cabo por ensayos de 
hemaglutinación. En la tabla 14 observamos que la FNR presenta un titulo 
aglutinante de 1, es decir, la aglutinación de eritrocitos se dio a la máxima 
concentración de proteína evaluada durante el ensayo de hemaglutinación y en 
comparación con el extracto crudo fue de 32 veces menor, por otro lado, en la FR 
el titulo aglutinante es de 256, ocho veces más que el valor en del título 
aglutinante en extracto crudo. 
Las unidades aglutinantes determinadas en el ensayo de hemaglutinación 
fueron 960, 30 y 7680 en el extracto crudo, FNR y en la FR, respectivamente lo 
que indica que en comparación la FR tiene 8 veces más unidades aglutinantes de 
ALL que en el extracto crudo, en cambio la FNR tiene 32 veces menos unidades 
aglutinantes igualmente en comparación con el extracto crudo (tabla 14). 
 La actividad específica relaciona las unidades aglutinantes con la cantidad 
de proteína en miligramos. Los datos muestran que la actividad en la FR es 10 
49 
 
veces mayor que la del extracto crudo. También se observa un valor de 8 veces 
menos en la FNR en comparación con el extracto crudo (tabla 14). 
El porcentaje de rendimiento de las unidades aglutinantes nos indica el 
porcentaje de recuperación de ALL con actividad aglutinante. Al realizar la 
sumatoria de estos porcentajes (10.625%+ 64%) encontramos que sólo un 
74.625% de lectina fue recuperado en comparación a las unidades presentes en 
los 50 ml de extracto crudo, pues este fue el volumen eluido en la separación 
cromatografíca, indicando que el porcentaje restante se quedó remanente en la 
fase estacionaria producto de la interacción de la proteína con el estroma (tabla 
14). Finalmente, el factor de purificación indica la pureza en términos de actividad 
de ALL en cada muestra, tomando como unidad el extracto crudo. En las FNR, 
este factor disminuyó hasta un valor cercano a cero, mientras que en la FR 
incrementó 10 veces por encima del valor de referencia (tabla 14). 
La lectina obtenida en la separación cromatografíca evidencia, a través de 
los resultados anteriores, la capacidad de reconocer glicanos (presentes en la 
membrana de los eritrocitos presentes en los ensayos de hemaglutinación, 
recordando la presencia del antígeno T sobre estas células), lo cual permite que 
sea funcional como herramienta en el estudio de glicosilaciones por diferentes 
técnicas experimentales. 
 
Tabla 14. Evaluación de la calidad de ALL. 
Fracción 
Título 
Aglutinante 
Unidades 
Aglutinantes 
totales 
Actividad 
especifica 
% 
Rendimiento 
unidades 
Aglutinantes 
Factor de 
purificación 
Extracto Crudo 32 64000 89.53 100 1.00 
FNR 1 6800 10.48 10.625 0.11 
FR 256 40960 912.2 64 10.19 
 Los cálculos se realizaron a partir de cada título aglutinante de cada fracción. Los algoritmos 
de cálculo se encuentran en el apartado MM Algoritmo de cálculo. 
 
Después de evaluar los parámetros de calidad de ALL, se biotiniló la lectina 
presente en la FR como se describe en MM y se verificó de nuevo su actividad, la 
cual no presentó variaciones significativas con respecto a los parámetros 
establecidos en la all no biotinilada. La biotina o también llamada vitamina H, es 
50 
 
una molécula usada en biología molecular en el marcaje de proteínas mediante la 
formación de un enlace covalente altamente estable e irreversible entre las aminas 
primarias de los aminoácidos peptídicos, principalmente con la grupo amino 
épsilon