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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE CIENCIAS ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE MAD2 BETA EN LÍNEAS CELULARES DE CÁNCER Y CULTIVOS PRIMARIOS T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: BIÓLOGA P R E S E N T A : JULIETA DOMÍNGUEZ ORTIZ DIRECTOR DE TESIS: M. en C. ALEJANDRO LÓPEZ SAAVEDRA 2010 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. Hoja de Datos del Jurado Formato 1. Datos del alumno Apellido paterno Apellido materno Nombre(s) Teléfono Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Ciencias Carrera Número de cuenta 1. Datos del alumno Domínguez Ortiz Julieta 56 79 92 44 Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Ciencias Biología 0302501557 2. Datos del tutor Grado Nombre(s) Apellido paterno Apellido materno 2. Datos del tutor M en C Alejandro López Saavedra 3. Datos del sinodal 1 Grado Nombre(s) Apellido paterno Apellido materno 3. Datos del sinodal 1 Dr Luis Alonso Herrera Montalvo 4. Datos del sinodal 2 Grado Nombre(s) Apellido paterno Apellido materno 4. Datos del sinodal 2 M en IBB Clementina Castro Hernández 5. Datos del sinodal 3 5. Datos del sinodal 3 Grado Nombre(s) Apellido paterno Apellido materno Biól Marco Alonso Andonegui Elguera 6. Datos del sinodal 4 Grado Nombre(s) Apellido paterno Apellido materno 6. Datos del sinodal 4 Biól Julia Rosalinda Mendoza Pérez 7. Datos del trabajo escrito. Título Subtitulo Número de páginas Año 7. Datos del trabajo escrito Análisis de la expresión de MAD2 Beta en líneas celulares de cáncer y cultivos primarios 78 p 2010 "Imagination is more important than knowledge. Knowledge is limited. Imagination encircles the world." Albert Einstein El presente trabajo fue realizado en el Laboratorio de Carcinogénesis de la Unidad de Investigación Biomédica en Cáncer del Instituto de Investigaciones Biomédicas en el Instituto Nacional de Cancerología bajo la Tutela del Dr. Luis Alonso Herrera Montalvo y el M. en C. Alejandro López Saavedra con el apoyo de DGAPA con el PAPIIT (IN221708) para su realización. Agradecimientos A mis padres, los primeros amigos y familia, en resumen todo mi mundo. Les dedico esta tesis con toda la intensión de que sea el inicio para dedicarles una vida entera de trabajo y entrega por la carrera que he elegido para disfrutar en la vida. Son los maestros más grandes y amorosos que afortunadamente acompañaron cada uno de mis pasos, agradezco el día en que sus genes se encontraron. Josecito, se que ha sido difícil este camino juntos pero es gracias a que siento tu mano y tus pasos al lado de los míos que yo encuentro en cada día la mayor seguridad de que estamos y estaremos bien. Má, mi Julieta, eres la más fuerte y grande mujer que he conocido y no dudo que tu existencia fue la mejor cosa que le pudo pasar a todo el que te conoció. Sabes que aún cuando no pueda abrazarte te tengo presente cada instante hasta el día en que ya no pueda abrazar a nadie; tu sabiduría y temple son las herencias más grandes y mis pertenencias más preciadas, que solo puedo comparar con el recuerdo de tu sonrisa. Gracias por darme el carácter para afrontar cualquier cosa, incluso tu ausencia y sobre todas las cosas por demostrarme que la muerte no es el fin, sino un gran bazinga. Gracias a mis tías por pensar en mi y seguir cuidándome, particularmente a mi tía Elsa por ser la mamá de los pollitos y a sobre todas las personas a mi tía Paty por ser mi segunda mamá. Gracias Yesi por estar al pendiente y cuidarme. Gracias Paty por considerarme y tratarme como tu hermanita, sabes que siento lo mismo por ti. A mi tía Pilar, a mi tío Chucho, a mis primos y sobrinos Pino, de los cuales sé que puedo esperar siempre una mano que me ayude. A mi tía Ofelia, porque sabe que fue arquitecta de mis pilares para pensar y decidir de las mejores maneras. Afrontar los momentos más difíciles fue posible por tus centradas palabras. A mis padrinos Octavio y Tere por ser ejemplo ayer, hoy y mañana. Siempre pienso en ustedes cuando quiero recordar que no hay límites y que los amigos son familia. Gracias Pablo, por ayudarme a poner el punto final a esta tesis, espero poder cangrejear contigo siempre. Gracias Alis (we have to be sneaky, alis, sneaky) Eleonor (con sus listones de colores), y Pau (con dragón incluido) por ser las primeras amigas de esta larga carrera que iniciamos juntas y las más fieles confidentes en ciencia y en la vida. Gracias Nene por apoyarme y ayudarme a seguir en otra etapa de mi vida con tu alegría y conocimiento, a la Nena por tu compañía y apoyo en todo. Gracias Dianita por la sonrisa que pones siempre y las veces que me has guiado con gran humor. Gracias Paty por ser la primera amiga de mi vida y continuar a mi lado 24 años después, sabes que eres parte de mi familia. Gracias Vivis por ser la amiga que me da calma, grandes consejos y un chocolate. Gracias Vero, siempre estás en mi pensamiento y confío que sin importar el tiempo que no nos veamos sabemos que la otra estará siempre cuando la necesitemos. A Didi, Domi, Fish, Bety, Yuri, María, Brenda, Paula, Xarini, Ness, Nicasio, a todos los amigos que le dan alegría y fuerza a mis días, buenos o malos, ustedes siempre están allí con su compañía y consejo. Gracias Felipe por ser secreto y por ayudarme en mi ignorancia computacional. Se te quiere. A la UNAM y a la Facultad de Ciencias por ser mi hogar durante más de cuatro años y el inicio de toda una vida. Alma y Ale tengo grandes sonrisas guardadas en mi memoria por ustedes, espero tenerlas en contacto siempre. Especialmente tú, pingüina. Al Labo, que me dio mi primera experiencia de trabajar en un laboratorio especializado y la convivencia de grandes compañeros. Son gente que estimo y espero volver a encontrar en este pequeño mundo para poder intercambiar experiencia y conocimiento. Gracias Ro, Julia, Clemen, Sae y Marco por sus consejos y por hacer de mi estancia toda una experiencia, son gente maravillosa. Al Dr. Herrera por las lecciones que solo un Jefe puede darte. Su confianza y oportunidad para desarrollar este trabajo en su laboratorio serán siempre agradecidas y recordadas. Alex, esta tesis no hubiera existido sin ti, eres el principio de ella y el contribuyente más importante. Me acompañaste a cada paso, eres el maestro que sentó las bases de mi desarrollo profesional. Eres gran ejemplo de dedicación y entrega, en conclusión eres una persona que ha hecho parte aguas en mi vida. Por todo esto y mucho más GRACIAS. 1 INDICE ABREVIATURAS.……………………………………………………………… …….3 ABREVIATURAS DE MEDIDAS.……………………………………………...……3 RESUMEN.…………………………………………………………………………….4 1. INTRODUCCIÓN.……………………………………………..…………………...6 1.1. MITOSIS EN CÉLULAS EUCARIONTES.……………………………..6 1.2. PUNTO DE MONITOREO DE MITOSIS..…………………………….10 1.3. MAD2.………………………………………………….………………….13 1.4. EL PROCESAMIENTO ALTERNATIVO DEL RNAM Y MAD2ß….15 2. JUSTIFICACIÓN...………………………………………………………………23 3. HIPÓTESIS.………………………………………………………………………23 4. OBJETIVO GENERAL.…………………………………………………………24 4.1. OBJETIVOS PARTICULARES.…………………………………………24 5. MATERIALES Y MÉTODOS.…………………...………………………………25 5.1. CARACTERÍSTICAS Y ORIGEN DE LAS CÉLULAS EMPLEADAS EN ESTE TRABAJO……………………………………………………………....25 5.2. CULTIVOS CELULARES DE HELA, FIBROBLASTOS Y LINFOCITOS DE SANGRE PERIFÉRICA…………………………………….25 5.3. DETERMINACIÓNDE LA EXPRESIÓN BASAL DE LA VARIANTE MAD2ß EN LÍNEAS CELULARES Y CULTIVOS PRIMARIOS………….…25 5.4. DETERMINACIÓN DEL IC50 DE VINBLASTINA Y CISPLATINO………………………………………………………………….…..28 5.5. CONSTRUCCIÓN DE VECTORES DE MAD2ß CON UNA PROTEÍNA FLUORESCENTE………………………………………………….30 5.6. LOCALIZACIÓN CELULAR BASAL DE MAD2ß USANDO LOS VECTORES MAD2ß-DSRED Y MAD2ß-YFP………………………………….35 5.7. EXPRESIÓN DE LA ISOFORMA MAD2ß EN CÉLULAS TRATADAS CON VINBLASTINA Y CISPLATINO………………………………………….35 5.8. LOCALIZACIÓN CELULAR DE MAD2ß EN CÉLULAS TRATADAS USANDO LOS VECTORES MAD2ß-DSRED Y MAD2ß-YFP………………...37 6. RESULTADOS…………………………………………………………………….39 6.1. AMPLIFICACIÓN DE LA VARIANTE MAD2ß EN LÍNEAS CELULARES Y CULTIVOS PRIMARIOS……………………………………...39 6.2. DETERMINACIÓN DEL IC50 PARA VINBLASTINA Y CISPLATINO EN CULTIVOS PRIMARIOS DE FIBROBLASTOS Y CÉLULAS HELA…………………………………………………………………..40 2 6.3. EXPRESIÓN DE LA VARIANTE MAD2ß EN LAS CÉLULAS TRATADAS………………………………………………………………………...42 6.4. CONSTRUCCIÓN DE VECTORES DE MAD2ß FUSIONADA A LAS PROTEÍNAS FLUORESCENTES YFP Y DSRED……………………………...48 6.5. LOCALIZACIÓN CELULAR BASAL DE MAD2ß USANDO LOS VECTORES MAD2ß-DSRED Y MAD2ß-YFP………………………………….52 7. DISCUSIÓN………………………………………………………………….…….61 8. CONCLUSIONES…………………………………………………………….…...65 9. PERSPECTIVAS…………………………………………………………….……66 10. ANEXOS…………………………………………………………………….…….67 10.1. ANEXO 1…………………………………………………………….…...67 10.2. ANEXO 2…………………………………………………………….…...68 10.3. ANEXO 3…………………………………………………………….…...69 10.4. ANEXO 4…………………………………………………………….…...70 10.5. ANEXO 5…………………………………………………………….…...71 10.6. ANEXO 6…………………………………………………………….…...72 10.7. ANEXO 7…………………………………………………………….…...73 10.8. ANEXO 8……………………………………………………………….…73 10. GLOSARIO……………………………………………………………………....75 11. REFERENCIAS………………………………………………………………....76 3 ABREVIATURAS CMM Complejo del Punto de Monitoreo de la Mitosis C-Terminal Carboxilo terminal RNAm RNA mensajero N-Terminal Amino terminal PCR Reacción en cadena de la polimerasa PMM Punto de monitoreo de mitosis Rpm Revoluciones por minuto ABREVIATURAS DE MEDIDAS µg Microgramos µl Microlitros µM Micromoles g Gramos h Horas Kb Kilobases L Litros M Moles mg Miligramos min Minutos ml Mililitos mM Milimoles ng Nanogramos nM Nanomoles pb Pares de bases 4 RESUMEN Durante el ciclo celular se observa un conjunto ordenado de procesos que conducen al crecimiento y división celular. Dentro de estos procesos se puede reconocer uno conocido como mitosis, en el que se da el reparto equitativo del material genético organizado en cromosomas. Para asegurar una correcta segregación en el reparto del material genético durante la mitosis es activado el punto de monitoreo de la mitosis, el cual detecta continuamente el correcto anclaje y tensión de los microtúbulos a los cinetocoros. Existen varias proteínas involucradas en el punto de monitoreo de la mitosis, entre las cuales se encuentra MAD2. MAD2 es una proteína de 205 aminoácidos con un dominio HORMA en su extremo N- terminal. Se localiza cerca de la envoltura nuclear durante la interfase y una vez que inicia la mitosis es transportada a los cinetocoros de los cromosomas en donde modifica su configuración (de abierta a cerrada) para volverse activa por medio de una interacción con la proteína MAD1, formando un heterodímero y posteriormente liberándose de MAD2 puede seguir activando más unidades de MAD2 por homodímeros. La activación de MAD2 (en su configuración cerrada) le permite unirse con CDC20, Bub3 y BUBR1 y formar el complejo del punto de monitoreo que es capaz de inhibir la activación de APC/C y con ello la ubiquitinación de la securina y del complejo CDK1/ciclina B, las cuales en cambio permitirían la acción de la separasa en el rompimiento de cohesinas y la procesión a la segregación cromosómica en la anafase. En el 2004 es descrita una variante transcripcional de MAD2 nombrada MAD2β. De acuerdo a la secuencia reportada de Mad2ß (273 pb), tanto la secuencia tanto de Mad2ß como la de Mad2 difieren entre sí, principalmente por el splicing que escinde el exón 3 y que une los exones 2-4 del transcrito de MAD2. Generando un cambio en marco de lectura que crea un codón de paro en el exón 4 y por tanto una proteína más pequeña, de alrededor de 90 aa (en contraste con MAD2 de alrededor de 205 aa), con dominio C- terminal diferente a MAD2, pero mantiene una homología entre el dominio N-terminal y el dominio HORMA. Esta isoforma se le asocia una función de promover un fenotipo quimioresistente en células de cáncer gástrico. En un estudio preliminar en el laboratorio de Carcinogénesis de la Unidad de Investigación Biomédica en Cáncer del Instituto de Investigaciones Biomédicas en el Instituto Nacional de Cancerología se observó la expresión de Mad2β en cultivos primarios de tejido sano de linfocitos y fibroblastos. En este trabajo se consideró importante estudiar los cambios de expresión de Mad2β en células de cáncer (HeLa, HCT116 y SW 480) y en células sanas (fibroblastos y linfocitos) por RT-PCR, así como cambios en la expresión de Mad2β en HeLa y fibroblastos al ser expuestas a tratamientos con agentes químicos con mecanismos de acción distintos entre sí, aneugénico y clastogénico (vinblastina y cisplatino) que pudieran orientarnos a una función diferente a la ya propuesta. Los tratamientos se realizaron con tres dosis diferentes (dosis correspondientes al IC10, IC30, IC40 de cada tipo celular) y en tres tiempos (24h, 48h, y 72h) usando de control el gen constitutivo YWHAZ. El análisis se hizo por medio de QRT-PCR, empleando el método Delta CT. Por otra parte se decidió abordar la falta de una descripción en la localización celular de 5 MAD2β por medio de vectores que incorporaran el transcrito de Mad2β unido al transcrito que codifica para una proteína fluorescente (DsRed) y observar la localización de esta proteína quimérica en células de cáncer (HeLa) y en células sanas (fibroblastos) por microscopía confocal empleando el sistema LSM710 Duo de Carl Zeiss. Esta observación se hizo en células sin tratamiento con agentes químicos, con tres dosis diferentes de dos agentes químicos (vinblastina y cisplatino) que corresponden al IC10, IC30, IC40 de cada tipo celular y en interfase y mitosis. Los resultados obtenidos en los cambios de expresión observados por RT-PCR muestran que hay un aumento de expresión en HeLa comparada a fibroblastos y un notable aumento de expresión en linfocitos estimulados con fitohemaglutinina comparada a la expresión casi nula en linfocitos no estimulados con ningún agente. Los resultados obtenidos por el QRT-PCR mostraron inconsistencias al analizar los CT de los tratamientos y los controles por medio del método Delta CT y los datos iniciales, antes de estandarizar el valor de los controles a 1. Esta diferencia se atribuyó a una variación en el gen control YWHAZ y se descartó un error metodológico al mantener una similitud entre las réplicas en cada experimento. Al no poder determinar si existe un cambio de expresión por los tratamientos se analizaron las variaciones que presentan entre sí los controles y se observó que hay un aumento en la expresión de Mad2β en HeLa comparada con la expresión en fibroblastos, así como una tendencia a incrementar su expresión en ambos tipos celulares al transcurrir más horas. La localización de MAD2β por microscopía confocal muestran una localización citoplasmática en ambos tipos celulares, tanto en interfase como en mitosis, pero con un patrón donde la proteína se concentra alrededor del núcleo en las células HeLa interfásicas. Los tratamientos no indujeron cambios en la localización. En conclusión, la expresión de Mad2β es mayor en células HeLa comparada a la expresión en fibroblastos, también es mayor en linfocitos estimulados con fitoheglutinina en comparación a los linfocitos no estimulados (consideramos que cuando se fomenta la división celular la expresión se ve aumentada) y tiene una tendencia a aumentar con el tiempo en que se deja un cultivocrecer. Proponemos que tiene una localización citoplasmática tanto en interfase como en mitosis y que puede verse influenciada por el tipo celular, al observar una mayor congregación de la proteína cerca del núcleo en las células HeLa. 1. INTRODUCCIÓN 1.1 Mitosis en células eucariontes La mitosis es el proceso de división celular que produce células genéticamente idénticas, convirtiéndoSe en el fundamento del crecimiento celular, de la reparación tisular y de la reproducción asexual. Este proceso es nevado a cabo en células somáticas, es decir, células que . contribuyen a la formación de estructuras corporales y abarca una parte muy pequeña del ciclo de la célula. El periodo comprendido entre dos mitosis sucesivas se denomina interfase; se divide en fase Gr, fase S, fase Gz Y es el periodo en que la célula pasa la mayor parte de su vida (Fíg.l.1). Cada fase, incluyendo el proceSo. de mitosis, tiene puntos de monitoreo que regulan la continuación del ciclo celulario ,::¡';z~'flát~(j~ ;:~l4ir!~f;a~ Fig .. 1.1 Ciclo de vida celular con tiempos estimados de duración entre cada fase, así ·como número de las cromatidas de un cromosdma en cada fase del ciclo celular (Thompson & Thompson Genética en Medicina). acto principal que se neva a cabo en la mitosis es la repartición equitativa de cromátidas hermanas entre las células hijas2• Este proceso se conoce como segregación cromosómÍca yes realizado por un mecanismo complejo. La mitosis es un proceso continuo en el que se distinguen cinco etapas: profase, prometafase,metafase,· anafase y telofase 1.3). Projase. Esta etapa es la más larga de la mitosis. Se caracteriza por una condensación gradual de la cromatina (que ha sido duplicada previamente en la fase S) hasta formar estructuras organizadas llamadas cromosomas. Los cromoSomas replicados están 6 fonnados por dos cromátidas hennanas que se unen a través de un centrómero y por un 1 · d ., 'd h' 13 comp e.J0 e protemas conOCI o como co esmas' . En el momento más temprano de la profase inicia la migración de los centrosomas duplicados hacia los opuestos en la célula5,6. La duplicación· del centrosoma, inicia en la transición de la faseGl-S y se consuma en la fase S del ciclo celular; resultando en dos centro somas hijos (Fig.1.2). Los centroS amaS actúan como centros· organizadores de microtúbulos, controlando la polarizacióllde éstos durante su polimerización y fomando focos que irradian mÍcrotúbulos durante la mitosis5,6. Oe:;pt;;¡¡!'s lÍe: la mit~sts, dUfilnti la Jnterf.as.e;.:s.e encuentra!, :j~t~ibuí(¡(l;;:¡ 1.:1'1 ¡:;~nt'~jJjc-f!n cada ·c.é:llr~¡¡; hifa. .$~:l~W.P.'~~~ ,f,<f, t,!~ (:!;{14~~;!:.~ ~~~*: 1.;~.,;W-::t~ t::~~::~~~~::l:" ~i { .. ~*-:1i~;: ~'5'~;'>;~.l":o;.*-<r Fig; 1.2 Ciclo de duplicación de Centrosomas durante el ciclo celular. thttp://webs.uvigo.es/mmegias/5- ,;:dulas/amplia¡;iones/R-centro,;onm-ciclo.php, 10/05i2010) En la profase tardia comienza a desorganizarse la envoltura nuclear. Prometafase. Durante. esta . etapa la envoltura nuclear ya no está presente y los micrótúbulos que prOvienen del centrosoma pueden llegar a la zona donde se . encuentran los cromosomas. Este tipo de mitosis donde no hay envoltura nuclear se le conoce como mitosis abierta y se da en la mayoría de los organismos multicelulares, entre ellos el ser humano. Unido al centrómero de las cromátidas hennanas se encuentran dos enormes ensambles . de proteínas conocidoS como cinetocoros, uno en cada cromátida hermana, a los cuales se anclarán los microtúbulos del uso mitótico10,1l. Los cinetocoros presentan varías 7 motores moleculares que se activan al entrar en contacto con los microtúbulosll. Estos motores emplean energía obtenida de la hidrólisis de moléculas de ATP para unir el microtúbulo con el centrosoma al que se encuentran ensamblados, de modo que su acción motora aunada a la capacidad de polimerización y despolimerizacíón de los microtúbulos permiten lograr posteriormente el desplazamiento de los cromosomas12,13. A partir de este momento se comienza a formar el huso mitótico mientras se asocian los microtúbulos a los cinetocoros desde los centrosomas14• La condensación de los cromosomas aún continúa y éstos ya se encuentran dispersos por la célula l . Metajase. Mientras los microtúbulos se anclan a los cinetocorós, los centrómeros de los cromosomas se movilizan al centro de la célnla y se congregan en la "placa metafásica" o también llamada la ''placa ecuatorial", que consiste en .unaJinea imaginariaqu¡;; es equidistante de los doscentrosomas que forman los polos del huso, localizados los extremos opuestos de lacé1n1a l,8,15. Este alineamiel1to debe ser equilibrado por fuerzas iguales y opuestas en la tensión que se genera en los cinetocoros de las cromátidas. Por tanto este proceso implica una regulación compleja donde intervienen diferentes proteínas que monitorean constantemente las señales que se generen para evitar la progresión prematura hacia la anafase y con ello una segregación incorrecta cromosómica. Este proceso de monitoreo de una unión y tensión correcta entre las fibras de los :micrombulos 110s cinetocoros de cada cromátida, se le conoce como pUhto de monítoreo de mitosis'4.,L . Anajase. Una vez que se ha asegurado un anclaje correcto entre los microtúbulos de huso y los cmetocoros almeados de las cromátldas, se hienden las unidades que componen a la coheSina y se separan las cromátidashermanas (fase temprana). Cada cromátida se considera un cromosoma 1,4. Posteriormente los microtúbulos asociados a ··105· centrosomas se acortan· por un ensamblaje rápido empujando a los centrosomas hacia los extremos opuestos de la célula y jalando primero al centrómero asociado en su otro extremo, seguido con cielto rezago por el resto del cromosoma (fase tardía)R. Telojase. Finalmente los cromosomas se asocian al polo donde fueron llevados, junto a un centro soma y comienza a formarse una envoltura nuclear alrededor de ellos. Cada Juego de cromosomas de cada polo forma un núcleo nuevo, se descondensan nuevamente en cromatina yconduye el proceso llamado cariocinesis 1,8. 8 Fig. 1.3 Micrografías COIl marcajesfluorecentes del proceso de mitosis en una célula el.lcarionte donde se muestran los ti<mipos de. duradon de cada etapa (tiempos aproximados que dependell deL tipo celular) y se observan los o:UCTombuIOs·er¡. verde, las aomitidas en azul y los cilletocoros en rojo. A, Proíl¡¡;e B. Prol11etafase C. Metafase D. Anafase E; Télofase (http://es.wik:ipedia.org/wik:iiMitosis, 10/0512010). 9 1.2 Punto de monitoreo de mitosis. El punto de monitoreo de mitosis (PMM) es un proceso en. el que se inhibe la progresión de la anafase y con ello de la separación de las cromátidas hermanas hasta tener asegurada la alineación de todos los cromosomas en el plato metafásico, así como un correcto anclaje y tensión de los microtúbulos a todos los cinetocoros2• El PMM resulta vital para una segregación correcta y bien organizada que permite evitar errores en la distribución del material genético entre las células hijas2• Recordemos que inicialmente las cl'Omátidas hermanas se encuentran unidas por un complejomultiprotéico llamado cohesina. Para poder proceder ala anafase y separar las crolllátidas hennanas es necesaria una proteolisis de·lassubunidades de la cohesina por medio de una proteasa Hamada separasa. La separasa se va a mantener inactivada por un inhibidor llamado securina, hasta que se dé la señal de que el punto de monitoreo de la mitosis ha sido detenido al obtener el anclaje correcto y tensión de los microtúbulos a los cinetocoros. La securina por su parte, solo puede ser destruida luego de ser ubiquitinizada por APC/C, una multí-subunidad E3 de unbiquitin ligasa. Sin embatgo, APe/C (por su nombre en inglés,anaphase promoting complexlcyclosome, complejo promotor de la anafase) requiere de un eoofactot, la proteína CDC20 (de su nombre en inglés, cell-:division-cyc1e 20homologue, ciclo de división celular 20 homóloga) para poder reconocer e interactuar con. sus sustratos, corno son la dclina B y la securina. De :modo que la progresión de la anafase depende de la disponibilidad deCDC20 2,4 (FigJ.4). Pig. 1.4 Esquema del proceso de separacíót! de cromátidas hermanas por la degradaciót! de la cohes¡na por medio de la separasa y la activacíón.de esta por la degradación de la 8e4;urula por el complejo APC/CcnC2G. Fuente: Bharadw'aj, R, & Yu, H. The spindle cbeckpoint, anenploidy, and cancer. ()¡WQgene 23, 2Q 1 7(2004). 10 El PMM inicia cuando los cinetocoros activan vías de señalización que alertan la falta de anclaje o de una tensión insuficiente con los microtúbulos del huso. Estas señales reclutart componentes del punto de monitoreo de mitosis al cmetocoro donde eatalizan modificaciones en su configuración que los activan. Una vez activos, algunos de componentes son liberados de ·10s cinetocoros y se unen . founando un complejo conocido como el complejo del punto de monitoreo de la mitosis (CMM) 2,4,10,15. Los principales ~omponentes reclutados los cinetocoros son MADI, MAD2, BUBI, BUBRI (MAD3), BUB3. Los primeros componentes identifieados, inicialmente en l~vaduras, fueron BUB 1-3 (por su nombre en inglés budding inhibíted by benzimidazole, gemación inhibida por benzimidazol). En vertebrados se encontraron cinasas análogas de BUBl, así como otros componentes;MAD 1-2 (por su nombre en inglés,mitotic arrestdeficient, arresto de mitosis deficiente), BUB3, la cmasa BUBRl . (un híbrido de MAD3 y BUB1 codificado porun solo gen, BUB1B) t;; CENPE (por su nombre en inglés, centromere protem E, proteína E del centrómero i,4, 5. La activación de. los componentes en los cinetocoros se da por la unión de CENPE a BUBRI, promoviendo su actividad cinasa. Esta actividad cinasa es requerida para el reclutamiento de MADI yla sllbsecuenteuruón de MAD2 a MADI (formando un heterodimeroestable)que en combinación a otros componentes cambia de configuración aMAD2 yes activada2,4 (Pigl.S). . .' ....... .. Hg. 1.5 Esquema del reclutamiento de los componentes del punto de nIDrutoreo de la mitosis en un cinetocoro no anclado a los micro1úbulds y de la activación de los componentes del complejo del punto de morutorco de la mitosis. Fuente: Kops, G.J.P.L, 'IVeaver, B.A.A. &. eleve]an(\, D.W. On Ibe road [O cancer: aneuploidy and the mítotic checkpoint. Nat. Rev. Caneer 5, 777(2005). 11 Una vez modificada la configuración de algunos de los componentes y activados, son rápidamente~.berados de lo~ci~etocoros para unirse entre si y fonnar el complejo del punto de moMJtoreo de la mItosIS o CMM. El CM1\,1 se compone de MAD2, BUBRl Y BUB3. y ei el principal mecanismo por el que se detiene la separación de las cromátidashermanas ya que se encarga de secuestrar a CDC20, previniendo la fonnadón del complejo APC/CCDC20, su activación como ubiquitín ligasa y la consecuente destrucción de la securina que mantiene inactivada a la separasa2,4 (Figl.6). ----_/ Complejo del punto de monitor60 de la mitosis (CMM) Flg. L6 FormaciÓn del complejo del punto de ínonitoreode la lllÍtosis formado por MAD2, BUB3, BUBRl y CDC20. Fuente: Kops, G.J.P.L, Weavel', B.A.A. & Cleveland, D.W. On the ruad to cance!': l1lleuploidy áruJ the mitoticcheckpoint. Nat. Rev. Ca¡¡cer 5, 777(2005). Una vez obtenida la tensión y el anclaje correcto de los microtúbulos se detiene la señalización de los cinetocoros he inicia la progresión a la· anafase y la consecuente separación de las cromátidas hennanas. El principal complejo encargado de silenciar el C:tvIM es p31 c{)met¡CMT2 que funciona como un antagonista de MAD2, uniéndose a este último y 1iberandoCDC202 (Fíg.1.1). Fig. 1.7 Inhibición del ClYIM por el complejo p31 comem/CMT2 y procesión de la separación de las ctomátida. hermanas. Fuente: Kops, G.J.P.L, Weaver, B.A.A. & Cleveland, D.W. On ¡he TOad to cancer: aneuploidy and the mitotic ch\:ckpomt. ?VaL Rey. Calleer 5, 777(2005). 12 Una vez presentados los componentes del PMr\.1, es necesario resaltar la importancia de uno de ellos en particular, MAD2. Ésta proteína es uno de los participantes más importantes del CMM ya que cumple la función de uni.rse directamente con CDC20 en un motivo de. 12 aminoácidos localizado en su extremo amino terminal (acción sinergizada por BUBRl) convirtiéndose directamente en la responsable de inhibir la 4 . anafa,se.· . Para lograr que MAD2 tenga una configuracion (a la que se le llama configuración cerrada) que le pClmita formar el complejo del PMM y unirse a CUCZO es ,necesaria su interacción con la proteína MAD 1, que se encuentra en los cinetocoros de los cromosomas, y que es llevada a cabo con el extremo C-termial de MAD2Hí• Un PMM deficiente, permite una división celular con anormalidades en la distribución delmaterial genético, 10 que puede provocar aneupIoidias, es decir pérdida o ganancia de cromosomas en número distinto al complemento haploide, fenómeno muy común en distintos tipos de cáncer2• 1.3MAD2 La proteína MAD2 (mitotic anest deficient 2,· anesto mitótico deficiente 2), también conocida como MAD2Ll, (mitotic anest deficient 2, yeast, human homolog like-l), fue encontrada por primera vez en levaduras y se observó que está evolutivamente cons~ada hasta los humanos17. El gen que codifica esta proteina seencuentTa localizado en el cromosoma 4q27 y consta de 1453 pares dé bases de las cuales se obtiene un transcrito maduro de RNAm de cinco exones con un total de 649 nucleótidos que traducen 205 aminoácidosI 8,19. Durante la mayor parte del ciclo celular, MAD2 se encuentra cerca de la envoltura nuclear. Confonne la envoltura nuclear se ve desíntegraday los cromosomas Ubres por la célula en 'la prometafase, MAD2 es reclutado a los cinetocoros que activan vías de señalización que indican Un anclaje ausente oincorrecto de los micrombulos a éstos'6.IS. La unión de MADZa los c1netocoros se da específicamente con la proteína MAD1, formando un heterodímero, que permitirá el cambio conformacional de MAD2 para su activación y liberación de los cmetocoros para formar el CMM que detenga la progresión a la anafase l6• La actividad de MAD2 se encuentra controlada por el cambio continuo de dos confonhaciortes, MAD2 abierta (O-:tvIAD2, open, que hace referencia a la, forma inactiva de MAD2) y MAD2 cenada (C~MAD2, clase, que hace referencia' a la forma activa de MAD2). Antes de iniciar el PMM existen monómeros libres de MAD2en su confonnación O-MAD2., El cambio conformacional del libre e inactivo O-MAD2 al activo y libre C-MAD2 es catalizado por la interacción que Se da en la unión de O~ MAD2 con la sub unidad MAD 1, anclada a los cineíocoros que aún no han sido anclados conectamentepor los mictotúbulos del huso. Las formas recién convertidas de C-MAD2 son las liberadas del heterodÍmero MAD2-MADl para formar el CMM2/},16. Sin embargo aún resulta tema de investigación la manera en que este cambio de 13 configuracíónes llevado a cabo, puesto que exi~te una gran "barrera" cinética entre ambas confol111aciones que impide una transición espontánea, que hace este cambio sumamente lento4,16. El cambio conformacÍonal de O~MAD2 a C-MADl involucra un rearreglo complejo de la estructura terciaria y cuaternaría de la protefna,al incluírel movimiento de lugar de 60a 205 aminoác.idos que forman parte de la prote1'na. En la configuración O-MAD2,eI segmento de la terminación amino forma un largo ~azo y un hebra ~(~l)muy corta; en el cambio aC-MAD2 este segmento pierde s,+ conformación ~ y se reconfigura adicionando dos vueltas a la cadena de aminoácido~ provocando un cambio a una hélice a. (nA). Por otra parte, la tenninación carboxilo sufre un cambio mucho más drástico. En su configuración O-MAD2 el segmento c-tel111inal fOl111a las hebras 137 y 138, conectadas por un lazo, que se ancla en la hebra 136. Cuando se cambia auna conformación C-MAD2 el segmento completo es movido alIadoopuesto de la hebra 13 mas grande (138) formando dos nuevas hebras, PS' y 138" y una tercera 131' corriente arriba, cerca de la hebra 136 (Figl.8). Estos cambios confieren propiedades de unión a otros elementos, completamente diferente. Por tanto, la transición a C-MAD2 reubica el segmento del amino ter:rninal para poder dar espacio al segmento desplazado del catboxilo terniinal y con ello poder exponer el sitid de interacción a otras proteínas (que se encontraba ocluido en O-MAD2) para aumentar su capacidad de relacionarse y vdlverse activa 16,21. B. Fig 1.8 Esquema de la estructura de ¡\. O-MAD2 Y B. C-MAD2 40nde se muestra la localización de 105 extremos amino terminal (en azul) y carboxil0 .cerminal (en rojo). Fuence:,Skinner, J.I. et al. The Mad2 partial utlfolding mude!: regulating mitosis ¡hrough Mad2 conformationat switching. J CeIl Bjol183, 762 (2008). 14 Este cambio de conformación facilita la unión de otras O-MAD2 al heíerodímero C- MAD2-MADl (l\tlADl es Uno de los componentes que adquiere mucha mayor afrnidad al\1AD2 ruando ha tenido ya un cambio conformacional) así como la unión del objetivo más importante, CDC20. Aunque MAD1 y CDC20 parecen no estar relacionados entre sí, su sitio de interacción con MAD2 presenta una alta homología, ya que ambos interaccionan con las hebras ~6 y BT16 (Fig.1.9). Fig. 1.9 Modelo de la inrer..lcciónentre MADl y C-},fAD2 donde se muestr..lla localización de los extremos amillo terminal (en azul) y carboxílo terminal (enrojo) de MAD2 yen verde la proteína MADI. Fuente: Skinner, 1,J. et al. The Mad2 partíal unfolding mOdel: regulating mitosis t.'1rougl1 Mad2 conformational switching. J Cf!ll 8io1l83, 763 (2008). 1.4 El procesamiento alternativo del RNAm y MAD26 En el genoma existen variantes transcripcionales que consisten en diíerentes proteínas traducidas a partir de diferentes secuencias de RNAm obtenidas a partir del transcrito de un mismo gen22• Estas variantes se forman a través de un proceso llamado procesamiento alternativodelRNAm (altemative splicing). El procesamiento altemativoes un proceso por el cual los exones de un RNAm producido por la transcripción de un gen son reconectados en diferentes maneras durante la maduraCión de eseRNA, resultando en diferentes RNAm que traducen a diferentes productos como . las ísoformas de una proteina. De modo que. un solo gen puede codificar a múltiples 15 proteínas, incrementando su diversidad:!!. En el 2004 un grupo de científicos en China reportó una variante transcripcional genenlda a partir del splicing alternativo del transcrito que codifica para la proteína MAD2, alque nombraron MAD2J3. Esta variante transcripcional fue encontrada por primera vez ensubUneas celulares de cáncer gástrico quimioresistente l9• De acuerdo a la secuencia reportada de Mad2B (273 pb), tanto la secuencia de Mad2B como la de MAD2 difieren entre sí, principalmente por el procesamiento alternativo que escinde el exón 3 y que une los exones 2-4 del transcrito de MAD2, generando un cambio en marco de lectura que crea un codón de paro en el exón 4 y por tanto una proteína más pequeña, de alrededor de 90 aa (en contraste conMAD2 de alrededor de 205 aa), con dominio C-terminal diferente a MAD219• A continuación se señala en las secuencias de nucleótidos los exones que traducen las proteínas de Mad2 y Mad2B, marcando la unión de los exones 2 y 4 de ésta última (Fig.l.10). • A * V • E F • • P 8 I ~ • 1~: ~~'.R*~~~lf~íi~~~~f~l~_~@#.~~ • L Y o •• I f .• ~. 1 PI" ~m aW~lci~¡~¡mmr_M1~sa§i*;¡ii'i~ <! ~ !!¡ 'f íl ~ 't·t t. v f'f ~ 1... ~~ ~1¡1*_~*~~~rtw.~~ttt::: .:. ,', ~~~~';»$~ t,m~ t~:«':~~ s:~:;::?~~ ~;l.':~;)'1 ~í>!:<~t ~ ~«::t4 ~:@~ ~:t:'(;;~ Hg. 1.10 Seeuenciade nucleótidos que codifican para A. MAD2 Y para B. MAD21l con la división de los exónes que les corresponden en colores y la secuencia de aminoácidos que codifican. Fuente: Yin, F, et al. Madlbeta, an alternative variam of Mad2 reducing mitotic arl'e,;t aud apoptosis induced by adriam.ydn in gas trie cancel' cells. Life 3d 78, 12i!O(2006). 16 Con la secuencia de aminoácidos es posible hacer una proyección de la probable estructura 3D de Mad2Bcon la cual se puede observar sus· diferencias con Mad2 (Fig.1.1 I). A. O~Mad2IMAD2Ll (estructura 3D) R Mad2'pIMAD2Ll VAR1ANT (estructUl'a 3D) Frente Vista superior Vista deLado Fig. L 11 A. Proyección de la proteína MAD2 (esta proteína ya ha sido cristalizada). B. Proyección de la posible configuracióllde M AD2/J. Fuente: Programa de modelado de proteíl1lill a partir de la secuencia de aminoácidos de la ha:.e de datos Genome Browser correspondiente a la Dese Genome Bioinformath::s, http://genome.ucsc.edu/index.html?org=Human&db=hg19&hgsid= 15 6354375. Este cambio entre estructuras sugieren que MAD2(3 podría no interactuar con MADI o CDC20, principalmente por el cambio efl la terminación del dominio C-teoninaI (dominio que le permitía a MAD2 su interacción con MADI y CDC20) así como un tamaño muy distinta (con una diferencia de 105 aa aproximadamente entre ambas proteínas) 1 9. Sin embargo, en una comparación entre las secuencias de nucleótidos de Mad2 y Mad2~ se puede ohservar una homología del 42.06% entre ambas. A sí como también una homología del 35.6% entre las secuencias de aminoácidos de MAD2y MAD2p, principalmente en extremo N-tenninal. Al arializár la homología que aún mantienen entre sí MAD2 y MAD2p por medio del programa Pfam, disponible en la página http://pfam.sanger.ac.ukJsearch/sequence,se 17 pudo identificar en ambas secuencia de aminoácidos el dominio HORMA. La alineación se encontró a partir del aminoácido 12 al 71 en la secuencia de MAD2 ~ con una alta sígníficancia. El dominio HORMA se ha sugerido como un dominio que reconoce estados de cromatina resultantes de aductos en el DNA, rompimientos de doble c.adena y de una falta de unión de los microtúbulos del huso al cinetocoro. Este dominio actúa como un adaptador que permite reclutar proteínas 23 • Para poder proponer una función de MAD2~ el grupo que describió porprimera vez esta variante, realizó diferentes ensayos funcionales en las células donde se observó la expresión de MAD2f}. Las cuales corresponden a las líneas· celulares de cáncer gástrico resistentes a adriamicina y vincristina, así como también corresistentes a mitomicina, cisplatino, etopósidoy 5-fluorouracil0 (SGC7901iADR y SGC7901NCR) obtenidas a partir de lineas celulares de cáncer gástrico (SGC7901y GC7901) de un banco de células en Chinal9• El estudio· preliminar de Mad2~ consistió en un análisis por medio de RT -PCR y Westem blott de su expresión en lineas de cáncer gástrico resistentes a adriamicina y vincristina; en una línea de cáncer gástrico no resistente transíectada con un vector que contiene e1.transcrito de Mad2f} (pcDNAiMad2f}) y eh la observación de su ausencia de expresión en la línea de cáncer gástrico no resistente, incluso mientras eran tratada por periodos de 24h, 48h Y 72h con adriamicina 19 (Fig. 1.12) 18 A. «.: ...... ........ ""' ...... » . *x<<s ... _~ w .. ·.» .. ~ ...... F""r""ión delRNAm de Mad2 y Mad2jl en una linea celular de cáncer gástrico (SGC7901) y sublíneas de cáncer resistentes a adriamicina y vmcristina (SGC7901/ADR y SGC790INCR, respectivamente). B.Expresióu.del RNAm de únicamente Mad2 en la línea celular de cáncer gástrico (SGC7901) sin tratamientos de ningún fármaco y eon tratamientos de 2411, 48h Y 72h con adriaillicina. C. Expresión del RNAm de Mad2 y Mad2~ en una·lí:p.ea ceJ:ulm: de cáncer gástrico (SGC7901) y en una línea celular de cáncer gástrico transfectada con el vector pcDNAjMad2~ (SGC790IlMad2~). D. Expresión de Mad2 y Mad2~ por Westcm bIot en las Jincascclularcs de cánccr gástrico rcsl&tentcs a adrianúciua y vÍllcrisína (SGC7901lADR y SGC790INCR) yen la linca de cáncer 19 gástrico no resistente transfeetada con el véctor pcDNA/JI"fad2JJ (SGC790 IlMad2JJ). Expresión de sólo Madl en la linea:de cáncer gásttico n.o resistente (SGC790l). Ambas variantes, Madl y Mad2p detectadas usando el anticuCl.'po N-19, Fu.cntc:Yin, F. el aL Madlbcta, an alternativc VlIliant ofMadl rcducing rllitotic arrcstand apoptosisindllccd by adrismycin in gastriccanccr cclls.Life Sci 78, 1279 Y 1281 (2006). Se realizaron también ensayos de citotoxicidad en la linea de cáncer gástrico no resistente (SGC7901). resistentes a adriamicina (SGC790l/ADR) y transfectadas con el vector pcDNAlMad2~ (SGC7901IMad2~) para determinar suIC50 en adriamicina y víncristina. Resultando ,en un aumento del ICSO para SGC7901lADR y SOC7901 /Mad2~, en comparación con SGC7901 19 (Fig.l.13). L1n<*t;¡; C.¡;luJruz·ez SfiC]9n 1 S(:lC7~,~} ¡iM~d2¡) l/ACm, veR ],30:t:U,42 12.62·',O.t~$, ¡ Ci61li::(),17 ADR (1.50t.:f:UJ L22',!:{U4 4.11Ht26 MMC ftjt}:t:~) J 7' U9t,0.2.t l;91;}:t n J I CfJOP L61 ;\:0.15 vAH +ü.IJ 1.%+(L21 Fig. J ,13 Tabl,il de valores para el TeSO de adriamicina, vinel'istina, mitomicina C y cisplatino en la línea de cáncer gástrico no resis+..ente (SGC7901), resistentes a adriamicina (SGC7901/ADR) ytransfectadas con el vector pcDNA/.Madlp (SGC790 lIMadlp) Yin, F. et al. Madlbeta, an alternative variam of Madl reducing mitanc arrcst and apoptosis induccd by adriamycin in gastric cancel'CenS, Life Sci 78, 1281 (2006). Aparte se realizaron análisis por citometrla de flujo del ciclo celular, índices de apoptosis e índices de mitosis. Que mostraron una reducc,ión del arresto mitótico y en el porcentaje de apoptosis en las líneas transfectadas con pcDNAJMAD2~ y en las lineas de cáncer gastrico resistentes19 (Fig. 1.14). A. ,U,',,:' "~~ 20 B. ~ ~.~ .4@ ;)$ ltJ Z$ ;!~ 1$ í., $ (f ~tl~~~;~ ~~~*,~~~~ , •• "C" -ifíil!' "'fi'" --. ¡'"t'""·' l' ~~ $4h ~~a~~4~ 4:$~ .(lh a~li; .4,,~ Hg. 1.14 A. índices mitóticos de SGC7901/M'ad2~ y sus céltdas control. Las células fueron tratadas con' adríamicina (0,5, I Y 1.5 rnglL respectivamente) por 24h. B. Índice. de apoptosis en la línea de. cáncer gástrico no resistente (SGC7901), resistentes a adriamicina (SGC7901/ADR) y transfectadas con el vector pcDNA/M'ad2¡J (SGC7901/M'ad2~) tratadas con I mg/L de .adriamicina por Oh, 24h Y 48h. Los m1cleos fueron observados usando DAPI.· Fuente: Yin, F .. ct aL Mad2bcta, an artClnativc vanant of Mad2 rcducing mitotic arrcst and apoptosÍli induccd by adriamycinin gastric cancel' cells. Lije Sd 78, 1282 {20M). Finalmente se. hizo un análisis de la distribución y acumulación intracelular de adriamicína, por medio de un eseaneo con láser por microscopía confocal, donde se observa, en las líneas de cáncer gástrico no resistente, una acumulación de adl;amlcina en toda la célula" tanto en el núcleo como en el citoplasma, y una acumulación sólo en el citoplasma en las líneas de cáncer gástrico resistentes y transíectadas con pcDNAlMad2~19 (Fig. 1.J5). 21 Fig. 1.15 Distribuc.ión intracelular de adriamicina en A. SGC7901 B.SGC7901 NCR C. SGC7901l ADR D. SGC7901/Mad2p E. Línea celulal' de cáncer gástrico transfectadacoo el vector pcDNA sin el transcriw de M ad2p como control de . la presencia del vector no está alterando los resultados, Fuente: Yin, F. el al Mad2beta, an alternative vanant of Mad2 reducing mitotic R,."Test and apoptosis induced by adriamycin in gamc canea cens, Life Sci 78, IZ84 (2006). Todos SUS resultados los llevaron a la conclusión de que MAD2p puede incrementar en células de cáncer gástrico la resistencia a agentes químicos y contribuir al desarrollo de un fenotipoquimio·resistente. Propusieron que la expresión de MAD213 resulta en un relativo decremento de la expresión de 1\:IAD2, laeual es necesaria para la sensibilidad de la célula a ¡;iertos agentes químicos aneugénicos, como el TaxoI19,24, ocasionando que MAD2~ indirectamente sea responsable de la disminución en la sensibiJidad de la célUla a estos agentes y favorezca así el fenotipo quimioresistente. Estudiasen el laboratorio de Carcinogénesis de la Unidad de Investigación Biomédica en Cáncer del I1lstitUto de Investigaciones Biomédicas en el Instituto Nacional de Cancerología han mostrado la expresión de Mad2(} en linfocitos de sangre periférica y fibroblastos primarios, que no fueron expuestos a ningún agente químico. 22 2. JUSTIFICACIÓN En el trabajo de Fang Yin y col (2006) se reportó que MAD2j3 fue asociada principalmente a quimiorresistencia en líneas celulares de cáncer gástrico ya que solo se expresaba en estas células y no así en aquellas no quimiorresistentes. Sin embargo, nosotros encontramos que ésta isoforma también se expresa, no sólo en líneas celulares de otroS tipos de cáncer, sino también en cultivos primarios normales como 10 son fibroblastos aislados de prepucios de neonatos y linfocitos de sangre periférica. Esto nos sugiere que MAD2j3puede tener otras funciones no relacionadas con el desarrollo del fenotipo quimionesistente a fánnacos antineoplásicos. La exposición a agentes químicos que inducen la respuesta al daño del DN A, . como es el caso de cisplatino, ° bien la activación del punto de monitoreo del huso mitótico, como es el caso de v"inblastina, . pueden . provocar cambios en la expresión de productos génicos cuya función esté. involucrada en dichos procesos celulares. Por tanto, los posibles cambios en la expresión de MAD2j3 que pudieran ser inducidos por alguno de estos agentes químicos podrían sugerir una función de esta iso forma en alguno de ·los procesos celulart<s ya mencionados. Por otro lado, MAD2p se genera a partir del procesamiento alternativo del transcrito que codifica para la proteína MAD2, bien caracterizada por su función en el punto de monitoreo del huso mitótico. También se sabe que en células normales MAD2 se encuentra localizada tanto en citoplasma como en el núcleo, además de hallarse tambien junto· con MAD 1 en la envolturanl.lclear durante la interfase· donde aparentemente podría estar participando en el tráfico de proteínas entre núcleo y citoplasma. En contraste, la localización de MAD2 en células de cáncer gástrico es principalmente l1uc1ear{referencia de Fang Vin y coI2009). Aunque MAD2~ sea homóloga a MAD2 en ciert~s dominios como son el dominio N terminal y el dominio HORMA no sabemos si puedin tener funciones similares. Estudiar la localización intracelular de MAD2 p en diferentes estadios. del cicló celulal' puede arrojarnos una primera pista sobre la . posibilidad de que MA02j3 tuviera alguna función similar a su isoforma mayor MAD2. ! 3. HIPÓTESIS El tratamiento con cisplatino y vinblastina induce cambios en Ja expresión de Mad2~ que sugieren una función de esta isoforma ya sea en la respuesta al daño del DNA o bien la activación del punto de control del huso mitático. La proteína MAD2p puede presentar una localización similar a la reportada de MAD2, es decir nuclear y citoplasmática, por la homología que comparten ambas isoformas en su domitrio N-tenninal yen un dominio HORMA. 23 4. OBJETIVO GENER4.L Estudiar la expresión de Mad2B en líneas celulares de cáncer y cultivos primarios normales,en condiciones de tratamientos con vinblastina, cisplatino y sin 11ingún tratanliento. Observar la localización de MAD2p en líneas celulares de cáncer y cultivos primarios normales,en condiciones de tratamientos con vinblastina, cisplatino y sin ningún tratamiento. 4.1 OBJETIVOS PARTICULARES .:. Estudiar la expresión de Mad2B en líneas celulares de cáncer como HeLa, Hct 116, SW 480 y en cultivos primarios de tejido sano, fibroblastos y linfocitos de sangre periférica, en condiciones sin tratamiento . • :.. Estudiar la expresión de Mad2B en células tratados con vinblastina y cisplatino en la linea ce1lllarHeLa y en cultivos primarios de células sanas, fibroblastos . • :. Estudiar la localización de MAD2p por microscopia de fluorescencia y confocal en HeLa, He1a-TubGFP y fibroblastos sin y con tratamiento con vinblastina y cisplatino. 24 5. MATERIALES Y MÉTODOS5.1 Características y origen de las células empleadas en este trabajo. HeLa. Línea celular de adenocarcinoma de cérvix aislada en 1951. Contiene secuencias de VPH18 integradas a su genoma25. HeLa/TubGFP. Línea modificada de la línea celular HeLa obtenida en la Unidad Biomédica de investigación en Cáncer del Instituto de Investigaciones Biomédicas de la UNAM en el Instituto Nacional de Cancerología. Esta línea expresa de forma constitutiva alfa tubulina fusionada a la proteína verde fluorescente GFP. Hct116 Línea celular de carcinoma co1orrectal con un número cromosómico cercano al diploide, con una mutación en el codón 13 del oncogen Ras26• SW480. Línea celular de carcinoma de colón con resistencia a vinblastina27 y alta inestabilidad cromosómica2R• Fibroblastos. Células normales obtenidas a partir de cultivos primarios de prepucio de individuos sanos. Linfocitos de sangre periferica. Células normales obtenidas a partir de la toma de sangre periférica de individuos sanos (se emplearon viales de linfocitos previamente aislados congelados a -70°C). 5.2 Cultivos celulares de HeLa, fibroblastos y linfocitos de sangre periférica. Se mantuvieron cultivos de HeLa y de fibmblastos en medio DMEM High Glucose y DMEM F 12 con 15% de suero fetal bovino para fibroblastos y 10% de suero de crecimiento bovino para HeLa, 1 % de antibiótico/ antimicótico y 1 % de aminoácidos no esenciales a 5% de C02 y 37°C. Así como también linfocitos de sangre periférica estimulados con fitohemaglutinina 2% y linfocitos de sangre periférica no estimulados en medio RPMI con aminoácidos no esenciales, 10% suero de crecimiento bovino y 1% de antibiótico/ antimicótico a 5% de C02 y 37°C. 5.3 Determinación de la expresión basal de la variante Mad2Jl en líneas celulares y cultivos primarios. El punto de partida para la realización de esta tesis fue determinar la presencia de la variante Mad213 en líneas celulares de cáncer y en los cultivos primarios, para ello se empleo el método de RT-PCR en HeLa, HCT 116, SW480, fibroblastos, linfocitos estimulados con fitohemag1utinina 2% y linfocitos no estimulados. El RT -PCR nos permitió observar la presencia del RNAm de esta isoforma y con ello deducir que las 25 células se encontraban traduciendo nuestra proteína de interés. Con los cultivos de las diferentes líneas celulares se pudo extraer el RNA total de cada línea por medio del Kit Rneasy Mini Kit de QIAGEN, No. de catálogo 74106 con lote No. U0825, usando el método Iso tiocianato de guanidina que desnaturaliza proteínas y provoca ruptura de la membrana plasmática. Pru:a la extracción de RNA las células fueron cultivadas en cajas circulares de 60 mm de diámetro. Postcrionnente se procedió a las indicaciones del Kit empleado para la extl"acción del RNA y se comprobó la integridad del RNA extraído por electroforesis en condiciones desnaturalizantes, de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Con el RNAm presente en el RNA total se sintetizó cDNA a partir de 1 Jlg de RNA total. Para la Síntesis del cDNA se empleó el kit dé INVITROGEN, Super script III Platinum Two-Step qRT.PCR Kit with SYBR Green, No. de catálogo 11735-04D con lote No. 1363085. A partir del cDNA se amplificó Mad2~ utilizando los oligonuc1eótidos diseñados para ello. Uno de los OHgonuc1eótidos sentido se localiza en el exón 2. Esto amplifica, dos productos; uno de ellos es MAD2 de 371pb al incluir el exón 3 y el otro es Mad26 de 250pb. };- Sentido ~GCAGA.~TACGGACTCACCTTGCTTG };- Antisentido (Exón 5) ACTCTTCCCA TTTTTCAGGT ACAAC El otro Oligonucleótido sentido amplificaba solamente la reglOn de Mad2B comprendida entre el empalme (exón 2- exón 4) y el exón 5; obteniendo un único producto de 174 pb. };- Sentido (Exón 2·Exón 4) CAACTGAAAGTGCACCCAGAG };- Antisentido (EXÓll 5) ACTCTTCCCATTTTTCAGGTACAAC Para la selección del gen control que funcionara como un punto de referencia para observar cambios de expresión en los transcritos que codifican para MAd2~ y MAD2 se realizaron pruebas a varios genes (actlna, GPDH, YWHAZ y B2M) hasta encontrar el que no variara sin importar que fueran controles o células tratadas. El gen control elegido para este trabajo se le conoce como YVlHAZ. El cual es un gen que se expresa constitutivamente, codificando una proteína perteneciente a la familia de proteínas 14-3-3, cuyos miembros median en la transducción de señales por unión a proteínas que contengan residuos de fosfoserina29• Los oligonucleótidos empleados para amplificar el gen YWHAZ en las reacciones de RT-PCR y QRT-PCR se basaron en los reportados en el artículo de Jo Vandesompele et al., 2002 con un producto de 94 pb30• 26 ).> Sentido ACTTTTGGTACATTGTGGCTTCAA ).> Antlsenlidll CCGCCAGGAC.'\AACCAGTAT Uso de llT-PCR para estudiar la exp,'esión del transCl'Uo de MAD2 y MAD2p. Para la RT-PCR se emplearon los reactivos de INVITROGEN, Platinum Taq DNA Polymerase, No. de catálogo 10966-030 con lote No. XABBlc el MgCh 50mM, lote No. Wl\¡'KB I d Y dNTP 1 OmM con lote No. 060309. Las condiciones empleadas para la amplificación de Mad2B por RT -PCR fueron: 25 ciclos IMAD2 I 94 oc 94 oc I 61°C I noc noc I 4°C I 25 ciclos I Mad2B I 94"C 94°C I 62°C I noc 72QC I 4°C I 23 ciclos I YWHAZ I 94°C 94°C I 60°C I 72°C 72°C I 4°C I La mezcla de los reactivos de la RT -PCR se realizó en un mix donde se consideró tanto el .uúmero de transcritos que se deseaban amplificar (MAD2~, MAD2 Y YWHAZ) como el número de cUNAs de cada tipo celular (seis tipos) en que se quería estudiar su expresión: Lista de 1X reactivos BufferlOX M 150mM dNTP lOmM 01 f\parte en un segundo mÍX donde se volvió a considerar el número de transcritos que se deseaban amplificar (11AD2~, MAD2 Y YWHAZ) y el número de cDNAs de cada tipo celular ( seis tipos) se mezcló el par de .oligonudeótidos que amplificaban cada gen. Finalmente en cada tubo donde se haría la reacción se repartió 0.1111 de cDNA de cada 27 tipo celular y la cantidad correspondiente de cada mix que llevara cada reacción a 25 f.ll. Amplificado el producto de Mad2B se observó en un gel· de agarosa al 2% por electroforesis y se purificó con el Kit de QIAGEN, QIAquick Gel Extraction Kit, No. de catálogo 28706 con lote No. 42473610 a partir de un gel de.agarosa al 1.2% para poder secuenciarlo en el Tnstituto de Tnvestigaciones Biomédicas, UNAM y demostrar que efectivamente era la isofonna que su buscaba amplificar, al comparar su secuencia con la registrada en las bases de datos. 5.4 Determinación del leso de Vinblastina y Cisplatino. El Te50 representa la concentración de una sustancia requerida para disminuir en un 50% la población celular que se esté estudiando. Es importante detenninar este valor para poder estandarizar las concentraciones de los distintos agentes químicos con los que se tratarían los cultivos celulares para analizar posibles cambios en la expresión de la isoforma Mad2B. Para detenninar el leSO en HeLa y fibroblastos se montaron cultivos de estas células hasta una confluencia del 80% en cajas de 150 cm2 para propagación. Obtenida suficiente cantidad de cada tipo celular para montar los experimentos, se prepararon tres pares de cajas de 24 pozos con 80 mil células/pozo en el caso de HeLa y 40 mil células/pozo en el caso de fibroblastos. En cada par, una caja era para ver la acción de los agentes químicos a las 12h y la otra caja para ver la acción a las 24h. En cada caja se consideraron tres réplicas por control y concentración de agente químico para obtener un valor representativo de Te50 (Fig. 5.1). 1 ••• 110001 ro o 01[0 Q Q] [000110001 IQQQlroQQI 12 h 000000 000000 000000 000000 24 h Fig.5.l Par de cajas que en conjunto son un experimento con una duración de l2b. y 24h. Cada rectángulo rojo marca las tres réplicas de cada una de las siete concentraciones de los agentes químicos y del control (los controles se marcan de rosa) .. Las concentraciones de de los agentes químicos fueronvariando confonne Se establecía el rango donde se encontraba el ICSO. Pasados los tiempos de tratamiento en cada experimento, se fijaron las células tratadas y se cuantificó la densidad celular de cada pozo (ANEXO 1), se graficaron las curvas de 28 densidad celular VS. concentración de los agentes químicos· y se estableció en que concentración se obtenía el cincuenta por ciento de la población muerta. Los agentes químicos de interés en este trabajo, para los cuales se determinaron las curvas de viabilidad tanto en HeLa como en fibroblastos, eran de carácter clastogénicos yaneugénicos, tal como los reportados por Fang Ying (2004). Esto fue para damos una posible idea de la función de MAD2~. Cisplatino. Es un fánnaco compuesto por un complejo inorgánico que reacciona a la presencia de DNA, específicamente a la interacción con el sitio N7de las bases puricas, principalmente 1,2-intracaterlaria Guanina/Guanina, intercalándose entre las hebras (intercatenario en su mayoría) y ocasionando aductos que lleven a un rompimiento en la hebra3132, El cisplatino se considera:un agente clastogénico por su capacidad de ocasionar rupturas cromosómicas32, Para este estudio se empleó la marca Blastolem (LEMERY). ~H.l"" ,el /Pt, , ~U~ (J Ci:¡¡;I) laUn Vinblastini4 Es un alcaloide, originalmente obtenido de la Catharanthus roseus, que posee un dominio de unión a la ~-tubu1ina localizada cerca de los sitios de unión de GTP intercambiable, en los microtúbulos. Esta afinidad de unión a los microtúbulos se presenta principalmente en sus terminaciones. De modo que ocasiona desestabilizacÍón y una consecuente despolimerización33• La vinblastina es considerado un agente aneugénieo, por su capacidad de impedir el anclaje de los microtúbulos al cinetocoro de los cromosomas y evitando la segregación cromosómÍca. Para este estudio se empleó el Sulfato de Vinblastína de Sigma, V1377. 29 5.5 Construcción de Vectores de Mad26 con una proteína fluorescente. Para. sugerir la localización de lvfAD2~ en la célula y poder estudiar un posible cambio de su posición en interface celular y en mitosis, se optó por el uso de proteínas rep011etas por medio de la constmcción de vectores que contuvieran el transcrito que codíficaMAD2~unido al transcrito que codifica para YFPlDsRed. Las ventajas que presentaba el uso de proteínas reporteras incluía la posibilidad de· su detección in vivo. debido a que no depende de actividades en;zimáticas o catalíticas, y que la célula no requiere ningúfltratamiento· especifico. As! como su inocuidad para la célula que la expresa 34. Para comenzar la construcción de vectores que codificaran a MAD2~ unida a una protefua fluorescente se emplearon oligonucleótidos que incluyeran secuencias de reconocimiento para las enzimas de restricción Bam Hl y Hínd m; así como también que amplificaran la isoforma de MadlB completa. Los oligonucleótidos diseñados fueron tres, un oligonucleótido sentido con la secuencia de Hinrl III y dosantisentido C011 la· secuencia de Bam Hl, donde .uno de ellos incluye nn codón de paro (R2) El producto obtenido es de 174pb. }> Hind m F (Sentido) 5'- T AAGCTT AAGCCATGGCGCTGCAGCTC -3' }> Bam Hl Rt (Antisentido) 5'- CGGATCCTCACTGAACGGATTTCATCC-3' }> Bam Hl R2 (Antisentido) 5'- GCGGATCCAACTGAACGGATTTCATCC -3' De modo que al amplificar Mad2Bcon cada uno de los dos oligonucleótidos antisentido, se pudo insertar dentro de la secuencia del vector en distintas posiciones dependiendo de C1.ial antisentido se usó. Las diferentes posiciones donde se colocó el transcrito de Mad2~ dió como consecuencia una posición diferente de la unión de la proteína fluorescente a la. proteína de MAD2~, ya sea en su terminal amino (DsRed) o en.su terminal carboxilo (YFP). Esta diferencia entre vectores es importante ya que nos permite descartar si los. cambios observados en la localización y en la expresión de MAD2~ se debía a la presencia de la protefua fluorescente en uno de sus extremos. La amplificación del producto de PCR, Hind llT-Mad2B-Bam Hl, se introdujo en el vector pTZ57R/Tcon la intención de transformar bacterias Dllill competentes con este vector, multiplicarlo y aumentar la cantidad del inserto Hind I1I-Mad2B-Bam HL Este proceso se inició con la purificación del producto de la PCR, Hind I1I-Mad2B-Bam Hl. Posteriormente se digirió el vector con las enzimas Hind TTT y Bam Hl y para abrir el vector en su región con sitio de c10naje múltiple y poder lograr la ligación entre el vector pTZ57RJT y el inSerto Mad2B. Para la ligación se consideró el tamaño/peso de ambos (ANEXO 2) Y se utilizaron cantidades más pequeñas de· reactivos a las especificadas en el Kit de Fermentas, InsTAclone PCR Clorung Kit, <No. de. catálogo K1214, con lote No. 00048384, pero siempre manteniendo la relación 3:1 entre el Inserto:Vector (Fig. 5.2). 30 Bufter Total L-__ ~~ __ ~ ____ ~ __ ~ 5.2 Esquema del plásmido pTz57R/T de la empresa InsTAclone donde se muestran los sitios de reconocimíent\l para e112imas de restJ;cción. Hecha lareaccíón de ligación setransfonnaron bacterias competentes (ANEXO 3) para la multiplicación del vector (Fig. 5.3). 31 Wi> l'1r:J Fig. 5.3 Esquema del procedimiento de ligación y transformación en células competentes del inserto de interés con IusTAclone PCR Cloning Kit (ANEXO 9). Posteriormente las colonias obtenidas de esta transformación fueron seleccionadas en . medios LB-agar con Ampicílina. Estas colonias que adquirieron el vector fueron analizadas. por PCR de colonias.(ANEXO 4) l)ara verificar en cuales de ellas sus vectores se habían ligado con el inserto de Mad2.B. Las condiciones del PCR de colonias fueron: .! MAD2B Lista de lX reactivos Buffer lOX 2.5 ¡.Ll MgCh50mM Q.751l1 (1.5mM) dNTP 10mM 0.5 ).11 (200mM) Taqpol 0.2 ).11 !H2O 18 ).11 PrimerF 1.5 ).11 (L3I-lM) PrimerR 1.5 ).11 (1.3 IlM) Mad213 se emplearon los primers: Hind III F (Sentido) y Bam Hl RIIR2 (Antlsentido) Una vez teniendo varios tubos donde se dividiera el Mix de la PCR se procedió a seleccionar las colonias. 32 Las colonias cOnÍmnadas, donde Mad2fi se encontraba ligado al vector, se crecieron por Las colonias confirmadas, donde Mad2B se encontraba. ligado al vector, se crecieron 18h en medio selectivo y se les extrajeron los plásmidos por medio del kit de QIAGEN, QIAprep Spin Miniprep, No. de catálogo 27106 con No. de lote 133212722. Los plásmidos se digirieron con enzimas de restricción para revelar las colonias que solo habían incorporado un inserto por plásmido. Las enzimas de restricción elegidas para verificar el inserto fueron HindIlI y BarnH 1. Con esta segunda selección se crecieron nuevas colonias y se purificaron los plásmidos para digerirlos y liberar 300ng de inserto Mad2/J del vector pTZ57RIT que sirvieran de stock. Estos insertos liberados se purificaron y se votvierona incorporar a los vectores que codiíican las proteínas tluorescentes DsRed y YFP (vectores con resistencia a Kanamicina) por medio de una reacción de ligación que volviera a considerar la relación 3:1 de Tnserto:Vectol' (Fig. 5.4). Vector Buffer Mad2fi Inserto HzO nucleasafree T4 DNA Ligasa Total ~--~~----~--~~--~ Fig. 5.4 Esquema del plásmido DsRed-Cl y YFP·Nlde la marca CLONTECH donde se muestran los sitios que representan los lugares de inserción del transcrito M.ad.2B. El producto de la ligación se transformó nuevamente en bacterias DH5a competentes (ANEXO 3), las cuales fueron sembradas en medios con Kanamicina para la selección de colonias que contuvieran el vector (Fig. 5.5). A las colonias seleccionadas se les extrajeron los plásmidos y nuevamente por PCR de colonias se hizo una segunda selección de las colonias que adquirieron vectores con inserto. Para asegurar que solo adquirieron un solo inserto por vector se usó una digestión con las enzimas de restricción Hind III y Bam Hl. 33 Eg. A. Caja con medio LB agar selectivo (con Kanamicina) donde se encuentra uncrecimiento de colonias que adquirieron el vector •. B. Colonias preseleccionadas para realizar un PCR de colonias. Finalmente obtenidos ambos vectores con el' inserto de Mad2B, se mandaron a secuenciar y se compararon a las secuencias reportadas en las bases de datos por BLAST(BasicLocal Alignment Search Tool)35 para asegurar total fidelidad y descartar cambios en las proteínas. Estos vectores ya podrían 'ser usados en las transfecciones en HeLa, HeLa.:.GFP rubulina y fibroblastos (Fig. 5.6) . . ~~~~~*;s¡:~::;:;:;;::~'~*~~~;.:r *,,,;,,:,~ Fig. 5.6 Diagrama de l\lcJJ.n~tru~lón de los,vectores1vÚld2B-dsIted y Mad213c YFP, su trl\lli5fección y secuenclación. Se realizó una Criopres~tvación de Bacterias engliceról (ANEXO 5) a dichas colonias para procurar un stock de los vectol-es y el inserto en el1aboratorio. 34 5.6 Localización ceJular basal de Mad20 usando Jos vectores Mad2B-DsRed y Mad2fi-YFP. Posterior a la obtención de los vectores Mad2B-DsRed y Mad2B-YPP se realizaron Transfecciónes (ANEXO 6) el1 células HeLa, HeLa tubulina-GFP y fibroblastos por medio de PLUS-Reagent y Lipofectamine LTX (INVITROGEN). Se esperó 24h posterior a la transfección para pennitir la expresión del vector y se fijaron en laminillas con formaldehído al 3.7% y DAPI (ANEXO 7) para observarlas por medio de . microscopía confocal empleando el sistema LSM710 Duo de Car1 Zeiss con el láser 561nm, 514nm y 700nm para observar la fluorescencia de DsRed, YFP y DAPI respectivamente, con el objetivo Plan-Apochromat 63x/L40 Oil DIe 1'v127 y un pinhole de 55 Jl m para la fluorecencia de DsRed y de 39 Jlm para DAPI y YFP. De las laminillas se obtuvieron fotografías y se pudieron obtenerporcentajes de células que presentaban una localización similar, de MAD2~, en las células. También se realizaron seguimientos en vivo de células HeLa transfectadas con el vector Mad2~-DsRed pat·u hacer un seguimiento de la proteína en tiemporea1. 5.7 Expresión de la isoforma Mad20 en células tratadas con VinbJastina y Cisplatino. Se decidió estandarizar las dosis de trabajo por ICs comunes que permitieran poder comparar los resultados entre Hneas y fármacos. De este modo se pensó en ICs que pennanecierall por debajo del IC50y que comprendieran un rango cercano al control (lelO), intermedio (IC30) y el más cercano al marcado como límite (lC40). I Cis)!latino Vinblastina ICIO ! IC30 IC40 ICIO lC30 IC40 1 HeLa 2.5¡.¡,M I 6.8¡.¡,M 8JlM 11.6nM 15nM 18.6nM I Fibroblastos 23J1M I 65.5JlM 68.3)!M . 290nM 810nM 850nM Establecidas las dosis de tratamiento. se sembraron por duplicado cuatro experimentos; células HeLatratadas con vinblastina y cisplatino y células de Fibroblastos tratados con vinblastinay cisplatino (Fig. 5.7 y Pig. 5.8). Los tiempos de tratamiento se establecieron hasta 72h ya que es hasta ese momento que el cultivo mantenía una confluencia menor a19Q%. 35 Control 24h 48h 72h 0000 0000 0000 IClO IC30 Cisplatino HeLa Fibroblastos Fig.5.7 Esquema del experimentos de células HeLa y Fibroblastostratadas con tres dosis de cisplatino (TClO, TeJO e TC40), en [os tiempos que se manejaron (24h, 48h, 72h). Control 24h 48h 72h 0000 0000 0000 IClO IC30 Vinblastina HeLa Fibroblastos Fig. 5.8 Esquema del experimentos de células HeLa y Fibroblastos u'atadas con tres dosis deVÍnblastina (lelO, le30 eIC40), culos tiempos que se manejaron (24h, 48b, 72h). Una veziniciadoeJ tratamiento se extrajo el RNA total cada 24h, se cuantificó y se sintetizó cDNA a partir de 1 J.l.g de RNA total. Con el cDNA de las células tratadas primero se realizó un RT -PCR (se emplearon las mismas condiciones que las usadas en el reconocimiento de la .isoforma Mad2B)de una de las líneas, HeLa, y uno de los tratamientos, vinblastina, para ver si observábamos preHmillarmente.diferencias en la expresión. Para el análisis formal de la expresión del transcrito· de MatUB y el control YWHAZ en HeLa y fibroblastos con cisplatino y vinblastina se optó por la PCR tiempo real con cada experimento por triplicado. Para la PCR tiempo real se empleó el kit de INVITROGEN, Superscriptill Platinum . Two·Step qRT.PCR Kit with SYBR Green. No. de catálogo 11735-040 con lote No. 1363085, 36 Las condiciones delPCR tiempo real se establecieron en base al Kit y a una estandarización donde. se obtuviera una curva de amplificación con la temperatura más restringente posible. Se empleó el SYBR Green como marcador para la detecCÍón de la amplificación. 45 ciclos como máximo I Mad26 I 94 oC 94°C I 60°C I noc noc I 4°C I 45 ciclos como máximo !YWHAzj 94°C 94°C I 62"C I noe noc I 4"C I Para realizar la mezcla de los reactivos del PCR tiempo real se realizó un mix donde se triplicaran los reactivos por cada muestra de cDNA· Esto para cada gen que se iba a amplificar (Mad2B y su control): Lista de reactivos 1X SuperMix 2.5 Jll DMSO 1fJl (2mM) ! Oligonuc1eótidoF 1 fJ1 (O.2JlM) Oligonucleótido R 1 fll (O.2IlM) cONA 1 Jlg 2.7 III (2.7 Ilg) H20 7.8 III Para amplificar Mad213 se emplearon los oligonuc1eótidos: Sentido (E2-E4) y Antisentido (E5). Las gráficas y los valores registrados de los CT (tbreshold cyc1e por sus siglas en inglés ociclo delpunto de cruce) de cada repetición, de cada experimento, se analizaron por el método de DeltaCT36,30 (ANEXO 9). Al ser el método de análisis más simple debe considerarse Jos resultados con un margen de error. 5.8 Localización celular de Mad26 en células tratadas usando los vectores Mad2U- DsRed y Mad2fl-YFP • . Se realizaron Transfecciónes (ANEXO 6) de Mad2B-DsRed y Mad2B-YFPen células HeLá.; HeLa tubulina'-GFP y Fibroblastos por medio de PLUS .. Reagent y Lipofectamine LTX (INVITROGEN). Se esperó 24h posterior a la transfeccióu y se trataron las células transfectadas con cisplatino y vinblastina con las dosis ya estandarizadas de lelO. lC30 e IC40. Pasadas 24h de tratamie~to se fijaron en laminillas con formaldehido al 3.7% y OAPI37 (ANEXO 7) Y se observaron por medio de microscopía confocal empleando el sistema LSM710 Duo de Carl Zeiss con el láser 561mn, 514nrn y 700mn para observar la fluorescencia de DsRed, YFP y DAPI respectivamente, . con el objetivo Plan- Apochromat 63x/l.40 Oi! prc M27 y un pinhole de 55 ¡..¡.m para la fluorescencia de DsRed y de 39 /lmpara DAPI y YFP. 37 De las laminillas se obtuvieron fotografías y se pudieron obtener porcentajes de células que presentaron una localización similar, de MAD213, en las células. Para la transfección de1 vector Mad2B-YFP solo se emple6 un tratamiento ya que al compararse con la transfeccÍón Mad2J3-DsRed no se observaron clllUbios en la posición de la proteína. 38 6. RESULTADOS 6.1 Amplifl.cación de la variante Mad28 en líneas celulares y cultivos primarios. Por medio de la RT-PCR se amplificó tanto el transcrito de Mad2 como su variante Mad2B en las lineas celulares de cáncer HeLa, HCTl16, SW480 y en cultivos primarios defibroblastos y linfocitos estimulados y no estimulados (Fig. 6.1). El análisis de expresión por R T -PCR se llevó a cabo con diferentes genes control, como GPDH, B2M, Actina· y YWHAZ. Sin embargo el que destacó por su expreslOn constante en todas las líneas fue YWHAZ, de modo que todos los experimentos siguientes se estandarizaron con él. . jl R '" ''''' ..... .. ji "" '~ ~ Q ;» ~ 1 ~ - ~ ~ ~~ S . ... ~ :;¡: i1 :.:: ·~d2 Fig.6.1 Expresión de la isotbrmaMadlB en las líneas celulares HeLa, fibroblastos, linfocitos estimulados y no estimulados. Como puede verse en la figura 6.1 la expresión basal de Mad2B se ve aum.entada en las líneas SW 480 y en HeLa. Por el contrario se ve casi nula en los linfocitos no estimulados. El producto amplificado Mad2B se verificó por medio de secuenclaclOn que efectivamente se trataba de la variante de interés, es decir, se identificó la unión entre los exones dos y cuatro, así como una complementariedad total a la secuencia reportada. 39 GCTTT CTGAGACTTTTCTCTGGGTGCACT T TCAGACFig. 6.2 SecuenGÍación del producto amplificado y pUlificado de Mad213, con la unión de los exónes 2 y 4 marcado en rojo. 6.2 Determinación del leSO para vinblasiina y cisplatino en cultivos primarios de fibroblastos y células HeLa. Paradetenninar el leSO se graficóla densidad celular de cada tipo celular versus la dosis de; cada agente quimico. Las gráficas a partir de las cuales se determinaron las dosis correspondientes al 50% de la población celular se utilizaron para establecer las dosÍs que se usarían en este trabajo (Fig. 6.3-Fig. 6.6). 1.4 1.2 .... 1 .!2 :::¡ 0.8 'i) u 0.6 " la 0.4 " Vi 0.2 e CIJ Q O Fibroblastos leso de fibroblastos tratados con Vinblastina 40 1600 C~:mcel1tración de Vinblastina (nM) -+-Fib 24h Fig. 6.3 Gráfica de densidad celular de fibroblastos versus concentración de vinblastina donde se marca la concentración a la que.se encuentra el leSO. 40 lCSO de fibroblastos tratados con Cisplatino :;·A .:( ... ' .. , ... ,."',.',.,.,"."".", .. ,', ..... '.',.,' ...... ,., .. ' .. ,' .. ,,' .. , ... , ... , ... , .. , ....... ' .... ,.,.,., ..... , ... , ..... , ....... , ..... , .............................. ' .. ,' ........... ' ....... ,' ... ' .......... ,',.',' ....... ' ..... "' ........ , ..... , ... ,"""" .. ,' .... , ... , '" ~ "':i; ~. (~.j "" .~ (i',.:':' :': •• , .... ,., .• , ..... , •.•. 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" ........ : Fig. 6.5 Gráfica de densidad celular de HeLa versus concentración de vinblastina donde se marca la concentración a la que se encuentra el TeSO. 41 ICSO de HeLa tratadas con Clsplatlno Fig. 6.6 Gráfica de densidad celular de HeLa versus concentración de cisplatino donde se marca la concentración ala que se encuentra elIC50. Las dosis obtenidas de las gráficas de ICSO se mueStran en la siguiente tabla: Cisplatino Vinblastina Tipo celular IClO IC30 IC40 ICSO JClO IC30 JC40 IC50 HeLa . 2.5flM 6.8¡¡M 8J.1.M 8.7¡¡M 11.6nM 15nM 18.6nM 19.5nM Fibrobbstos 23 ¡¡M 65.5¡tM 68.3JlM 70JlM 290nM 810nM 850nM 8~5nM Se observo que en general se necesita de una mayor concentración de dsplatino para alcanzar el IC50tanto en células HeLa como enfibroblastos, mientras que en el caso de la vinblastina esta cOI1centración fue mucho menor en ambos tipos celulares. Además se observa que los fibroblastos. toleran concentraciones mucho más elevadas de ambos agentes químicos que las células HeLa. 6.3 Expresión de la variante Mad2D en las células tratadas. En la figura 6.7 se muestra la evaluaci6n inicial de la expresión de Mad26 por una RT - PCR en células HeLa tratadas con diferentes dosis de\'Ínblastina durante 24h, 48h Y 72h. Corno control se utilizó YWHAZ y se compararon las handasmostradas en un gel de agarosa. 42 ICIO ICJO IC40 ~~."" .. Mad28 ~ . ~. ~., ' .. ~~·~.;k":li;W ' .. ~::m..':s;::';~:~::" " . Y\VHAZ 24h 48h 72h 24h 48117211 24h 4811 72h 24h 48h 72h Fig. 6.7 Expresión de I.a isoforma Mad2B en la línea celular HeLa, tratada con dosis de vinblastina TCI O, rC30, TC40 y un control sin tratamiento de vinblastina, en tres tiempos, 24h, 4gh Y 72h. En la figura 6.7 no se observa un cambio aparente en la expresión de Mad.28 entre los distintos tiempos de cada dosis con las que se trato a las células HeLa. Tampoco se observó diferencia entre las diferentes dosis. Para descartal' un problema de sensibilidad en el método utilizado, se opto por realizar el "análisis del cambio de expresión de ambos tipos celulares con sus tratamientos por medio del QRT -PCR En el QRT -PCR sc obtuvo un promedio de las tres repeticiones de cada experimento (valor CT) con el que se determinó los valores LlCT y se "normalizó la relación de Mad2B con YWHAZ. Esto permitió obtener el valor de Ll(LlCT) entre controles (Mad2B no tratado) y tratados (Mad2B tratados) Tabla 6.1. ACT = CT (Mad2¡3)-CT (YWHAZ) A(ACT) ACT (Mad2¡3 tratado)-ACT (Mad2¡3 no "tratado) 43 FibrobJastos Cisplatino Vinblatina Promedio de PromedIo de repeticiones (Cn repeticiones (Cn Mad2~ YWHAZ t.CT ti(LKT) Mad2~ YWHAZ tiCT t.(t.CT) Control 24 h 28.33 21.11 7.21 28.45 20.99 7.45 48 h 30.06 21.22 8.84 31.06 21.39 9.67 7211 30.83 22.15 8.68 31.89 22.65 9.23 IC10 2411 28.28 20.68 7.60 0.39 28.39 . 21.26 7.13 -0.32 4811 29.15 20.82 8.33 -0.51 29.07 21.39 7.67 -1.99 7211 29.42 21.59 7.83 -0.85 29.38 21.32 8.07 -1.17 lC30 2411 28.27 20.78 7.50 0.28 28.29 21.24 7.05 -OAO 4811 29.22 20.77 8.45 -0.39 29.15 21.19 7.96 -1.71 7211 30.38 21.33 9.05 0.37 29.73 21.21 8.52 -0.71 IC40 2411 28.67 21.49 7.18 -0.03 28.64 . 21.84 6.80 -0.65 4811 29.47 21.19 8.28 -0.56 29.24 21.38 7.86 -1.81 72h 29.65 21.30 8.35 ~0.33 29.89 21.58 8.31 -0.92 HeLa Cisplatino Vinblatina Promedio de Promedio de repeticiones (CT) repeticiones (CT) Mad2~ YWHAZ t.CT t.(t.CT) Mad2~ YWHAZ t.CT b.(b.CT) Control 24 h I 27.88 22.34 5.54 25. [3 20.97 4.[7 4811 27.37 21.03 6.34 24.83 20.74 4.09 7211 28.40 22.25 6.15 25.39 21.57 3.82 IC10 2411 27.37 21.36 6.01 0.47 24.96 20.68 4.28 0.12 4811 27.17 21.44 5.73 -0.61 24.77 20.82 3.95 -0.14 7211 27.68 22.48 5.20 -0.95 24.96 21.59 3.37 -0.45 IC30 2411 27.03 21.42 5.61 0.07 26.49 20.44 6.05 1.88 48 h 26.58 21.22 5.36 -0.98 26.56 20.63 5.94 1.85 72h 27.05 22.59 4.45 -1.70 27.14 21.92 5.23 1.41 IC40 24h 26.71 20.57 6.14 0.60 26.57 20.46 6.11 1.94 48 h 26.40 20.57 5.83 -0.51 26.20 21.08 5.12 1.03 72h 26.80 22.12 4.68 -1.47 26.93 20.87 6.06 2.24 t.CT = CT (YWHAZ)-CT (Mad2j3) Mb.CT) = b.CT (YWHAZ)-LlCT{Mad2~) 44 Tabla 6,1 Tabla donde se resume los promedios de los CT de las tres repeticiones de cada experimento, los ¿lCT de cada experimento y los A{ACT) de cada experimento en Fibroblastos y HeLa con los agentes químicos cisplatino y vinbla;;tina. Los valores de .6{LlCT) permitieron aplicar la fórmula 2-Á(ÁCT) y finalmente obtener la relación de la expresión entre Mad2B sin tratamiento (controles con valores constantes de uno) y Mad2B con tratamientos (valores superiores a uno, sobreexpresión, o inferiort:s a uno, subexpresión) Tabla 6.2. rA(ACT) Fibl'Oblastos HeLa Cisplatino Vinblastina Císplatíno I Vinblastina Control 24h 1 1 1 1 48h J 1 1 1 . 72h 1 1 . 1 1 ICIO 24h 0.76 1.25 0.72 0.92 48 h 1.42 3.98 1,5:2 1.10 nh 1.81 2.24 1.94 1.36 lC30 24h 0.82 1.32 0.95 0.27 48h 1.31 3.27 1.97 0.28 72h 0.78 1.64 3.24 0.38 IC40 24h 1.02 1.57 0.66 0.26 4gh 1.47 3.51 1.42 0.49 72h 1.26 1.90 1.76 0.21 Tabla 6.2 Tabla donde se resume el valor de 2,A¡ACT) de cada experimento en Fibroblastos y HeLa tratados con cisplatino y vinblastina. 45 Los resultados de la tabla 6,2 se graficaron (Fig. 6.8). ~ ••••••••••••••••••••••••••••• , ••••••••••••••••••••••• ............................ 04 .................................................................................. " , Diferencias de expresión de Mad2j3 I 4.50 4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00 (2-a{aCT)) ¡ ................................ ;~~", ....•.. , ..... ,.,",.,.,,:,::,"""""""'.""""."'''.'''''''''''''''''''''' .... , ....... Cisplatino Vinblastina Cisplatino Vinblastina .24 hielO I lIlIi48 h
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