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Biología

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UNIVERSIDAD
NACIONAL
AUTÓNOMA

DE
MÉXICO

FACULTAD
DE
CIENCIAS

ANÁLISIS
DE
LA
FUNCIÓN
DE
LA
PROTEÍNA
DE
CLOROPLASTO
CLB19
(CHLOROPLAST
BIOGENESIS
19)
Y
LA
INTERACCIÓN
CON
SUS
BLANCOS

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PARA
OBTENER
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TÍTULO
DE:

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P
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E
S
E
N
T
A
:

ERNESTO
LLAMAS
PÁMANES

DIRECTOR
DE
TESIS:
DRA.
PATRICIA
LEÓN
MEJÍA
2012

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
Restricciones de uso

DERECHOS RESERVADOS ©
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL

Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México).
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el
respectivo titular de los Derechos de Autor.

ii
Hoja de datos del jurado

1. Datos del alumno
Llamas
Pámanes
Ernesto
Universidad Nacional Autónoma de
México
Facultad de Ciencias
Biología
408001285

2. Datos del tutor
Dra
León
Mejía
Patricia

3. Datos sinodal 1
Dr
Celis
Sandoval
Heliodoro

4. Datos sinodal 2
Dra
Loza
Tavera
Herminia de Jesús

5. Datos sinodal 3
Dr
Valdés
López
Víctor Manuel

6. Datos sinodal 4
Dr
Jiménez
García
Luis Felipe

7. Datos del trabajo escrito
Análisis de la función de la proteína de
cloroplasto CLB19 (Chloroplast
Biogenesis 19) y la interacción con sus
blancos
72p
2012

AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Patricia León Mejía por brindarme la oportunidad de realizar mi tesis de
Licenciatura en su laboratorio.

Un agradecimiento muy especial a la M. en C. Maricela Ramos Vega quien fue la
persona que siguió de cerca este trabajo, me instruyó en las técnicas de laboratorio y
me permitió aproximarme a la Biología Molecular. Gracias por todo el tiempo invertido
en mi formación.

Al Comité de sinodales: Dr. Heliodoro Celis Sandoval, Dra. Herminia de Jesús Loza
Tavera, Dr. Víctor Manuel Váldes López y Dr. Luis Felipe Jiménez García por el tiempo
dedicado a la revisión, críticas y contribuciones a esta tesis.

A la Dra. Elizabeth Cordoba Martínez por su ayuda, consejos y aportaciones en la
realización de esta tesis.

A la M. en C. Carolina San Román Roque (q.e.p.d.) por su apoyo en aspectos técnicos
del laboratorio.

A mis compañeros y amigos del laboratorio de la Dra. León y el Dr. Rocha, por su
ayuda y enseñanzas.

Este trabajo fue realizado en el Departamento de Biología Molecular de Plantas del
Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional Autónoma de México; con el
apoyo de una beca de alimentación y vivienda (Agosto 2010-Julio 2011).

iv
DEDICATORIAS

A mis padres, Ernesto Llamas Caballero y Patricia Pámanes Rojas y a mis hermanos,
Erick y Ricardo. Por todo el apoyo y amor brindado durante mi formación tanto personal
y académica. Sin ellos la realización de esta tesis no hubiera sido posible.

A todos mis amigos y maestros con quienes he compartido distintas etapas de mi vida,
en especial, a los que estuvieron durante mi estancia en la Ciudad de México.

v
RESUMEN

La transcripción de genes plastídicos, las diferentes modificaciones
postranscripcionales, la traducción y el ensamblaje de complejos proteicos median los
pasos críticos de la biogénesis y el desarrollo del cloroplasto. En la mayoría de las
plantas terrestres los transcritos de los plástidos sufren un procesamiento
postranscripcional denominado edición, que consiste en un cambio de una citidina
particular a una uridina en diferentes transcritos.

Se ha determinado que la proteína CLB19 participa en la edición de un sólo sitio en dos
transcritos cloroplásticos: rpoA y clpP1. Ambos mensajeros codifican proteínas de
función crítica en el desarrollo del cloroplasto. En la mutante clb19, la edición de estos
dos mensajeros está afectada, por lo que, en este trabajo, se planteó el objetivo de
evaluar qué parte del fenotipo, caracterizado previamente, se debe a la falta de edición
de rpoA o de clpP1 para esclarecer como afecta la falta de la proteínas RpoA o ClpP1
en el desarrollo del cloroplasto. Para esto, se usaron líneas transgénicas, que codifican
para alguno de los transcritos editados, con la finalidad de complementar la mutante
clb19. Estas líneas transgénicas no fueron capaces de complementar o mejorar el
fenotipo de la mutante clb19. Posteriormente, se generó una línea doble transgénica,
pero tampoco fue capaz de complementar o mejorar el fenotipo mutante. La
caracterización molecular de las líneas transgénicas indicó que la actividad de las
proteínas, codificadas por los transgenes editados de rpoA y clpP1, se encuentra
afectada, igual que en la mutante clb19. Estos resultados indican que las líneas no son
funcionales, por alguna razón técnica, por lo que se requieren estrategias más eficaces
para separar los fenotipos causados por la no edición de los dos transcritos.

Por otro lado, todos los factores sitio específicos de la edición de RNA, identificados
hasta la fecha, son proteínas PPR (pentatricopetide repeat protein) y se ha confirmado
que las proteínas PPR se unen a uno o varios blancos de RNA en la región -25/+10 con
respecto a la citidina a editar. CLB19 es una proteína PPR que pertenece al grupo E+
de la subfamilia PLS la cual está caracterizada por la presencia de una región

vi
conservada en el carboxilo terminal (domino EE+). Se ha demostrado que el dominio
EE+ tiene una función esencial en la edición de RNA pero no la de reconocer
secuencias específicas de RNA. Por lo que en este trabajo se expresó y se purificó una
proteína recombinante CLB19 truncada de los dominios EE+ que se analizará, en otro
trabajo, si ésta es capaz de unirse in vitro a sus blancos.

vii
CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 1
1.1. Desarrollo del cloroplasto ...................................................................................... 1
1.2. La regulación de la expresión genética en cloroplasto .......................................... 3
1.2.1. El genoma plastídico ....................................................................................... 3
1.2.2. La regulación transcripcional ...........................................................................4
1.3. Metabolismo del RNA en cloroplasto ..................................................................... 5
1.3.1. Maduración del RNA ....................................................................................... 6
1.3.2. Estabilidad del RNA ........................................................................................ 6
1.3.3. RNA splicing .................................................................................................... 7
1.4. Edición de RNA ...................................................................................................... 7
1.5. Proteínas involucradas en la regulación de la expresión de genes cloroplásticos
.................................................................................................................................... 10
1.6. Algunas proteínas PPR son requeridas para la edición de RNA en cloroplasto . 13
1.6.1. Los motivos E y E+ pueden tener una función común en la edición del RNA
................................................................................................................................ 15
1.7. La traducción en el cloroplasto ............................................................................ 18
1.8. Estabilidad y degradación de proteínas en el cloroplasto .................................... 19
1.8.1. La proteasa Clp ............................................................................................. 20
2. ANTECEDENTES ...................................................................................................... 23
2.1. Antecedentes directos ......................................................................................... 29
3. JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................ 31
4. OBJETIVOS ............................................................................................................... 32
5. MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................... 33
5.1. Material vegetal .................................................................................................... 33
5.2. Esterilización y estratificación de semillas ........................................................... 33
5.3. Crecimiento de A. thaliana en sustrato ................................................................ 34
5.4. Cruzas dirigidas ................................................................................................... 34
5.5. Extracción de DNA ............................................................................................... 34
5.6. Análisis por PCR .................................................................................................. 35

viii
5.6.1. Lista de oligonucleótidos ............................................................................... 35
5.6.2. Reactivos PCR .............................................................................................. 35
5.6.3. Programa general para las reacciones ......................................................... 36
5.7. Electroforesis de DNA en gel de Agarosa ........................................................... 36
5.8. Extracción de proteínas ....................................................................................... 36
5.9. SDS PAGE ........................................................................................................... 37
5.10. Western blot ....................................................................................................... 37
5.11. Extracción de RNA ............................................................................................. 38
5.12. Electroforesis de RNA ....................................................................................... 38
5.13. Northen blot ...................................................................................................... 39
5.13.1. Transferencia del RNA en el gel a la membrana de nylon .......................... 39
5.13.2. Amplificación del gene que se utiliza como sonda radioactiva ................... 39
5.13.3. Hibridación de la membrana ....................................................................... 40
5.14. RT-PCR ............................................................................................................. 40
5.14.1. Reverso transcripción .................................................................................. 40
5.14.2. Condiciones PCR ........................................................................................ 41
5.14.3. Lista de oligonucleótidos ............................................................................. 41
5.14.4. Programa general para la reacción ............................................................. 41
5.15. Clonación del gen CLB19 ΔEE+ ........................................................................ 42
5.15.1. Purificación de DNA a partir de gel de agarosa .......................................... 42
5.15.2. Clonación en el vector pENTR D-TOPO ..................................................... 42
5.15.3. Movilización de gene del vector de entrada a vector destino ...................... 42
5.16. Sobreexpresión de la proteína ........................................................................... 44
5.17. Purificación nativa de la proteína ....................................................................... 44
6. RESULTADOS ........................................................................................................... 46
6.1. Las versiones editadas de los genes rpoA y clpP en el fondo clb19, por separado
no son capaces de complementar el fenotipo ............................................................ 46
6.2. La presencia de ambos transgenes en plantas clb19 no complementa el fenotipo
de amarillamiento ........................................................................................................ 49

ix
6.3. Las plantas amarillas transgénicas para rpoAEd, clpPEd y la doble transgéncia
no muestran una diferencia en su morfología y desarrollo en comparación con clb19
.................................................................................................................................... 50
6.4. La actividad de la proteasa Clp no mejora en las líneas portadoras de clpP ...... 51
6.5. La actividad de PEP no mejora en las líneas portadoras de la versión editada de
rpoA ............................................................................................................................ 53
6.6. Obtención de la proteína nativa CLB19 sin los dominios E y E+ ......................... 54
7. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES .............................................................................. 59
8. APÉNDICE ................................................................................................................. 70
9. LITERATURA CITADA .............................................................................................. 73

1
1. INTRODUCCIÓN

1.1. Desarrollo del cloroplasto

Junto con las vacuolas y la pared celular, los plástidos son componentes característicos
de las células vegetales y están involucrados en procesos como la fotosíntesis y el
almacenamiento. Los plástidos están comúnmente clasificados por los tipos de
pigmentos que contienen (Figura 1), por ejemplo los cloroplastos contienen clorofilas y
los cromoplastos contienen carotenos acumulan grandes cantidades de pigmentos de
rojos a amarillos, responsables de brindar color a flores y frutos de las plantas.
Diversos plástidos carentes de pigmentos se agrupan como leucoplastos y dentro de
ellos tenemosaquellos que acumulan almidón (amiloplastos), aceites (oleinoplastos) o
proteínas (proteinoplastos). Estos plástidos son incoloros y están presentes
principalmente en tubérculos y semillas (Raven et al., 2003; León y Guevara-García,
2008).

Figura 1. Distintos tipos de plástidos presentes en plantas. Todos los plástidos provienen de los
proplástidos, la diferenciación de cada tipo de plástido depende de distintas señales (León y Guevara-
García, 2008).

2
En los cloroplastos maduros los pigmentos como clorofila y carotenos son receptores
de la energía lumínica necesaria para la fotosíntesis. En las plantas, los cloroplastos
son usualmente en forma de disco y miden entre cuatro y seis micrómetros de diámetro
(Raven et al., 2003). Una doble membrana, la interna y la externa, delimitan al
cloroplasto. Dentro del cloroplasto existen membranas fotosintéticas extensas también
llamadas tilacoides. Estas vesículas se extienden paralelamente al eje cloroplástico
principal, formando vesículas planas, algunas apareciendo individualmente (tilacoides
estromáticos) o como vesículas organizados en pilas o grana, conteniendo un espacio
interno o lumen (López-Juez y Pyke, 2005).

El proceso de diferenciación en cloroplastos involucra la contribución tanto del DNA
nuclear como del genoma plastídico; aunque el control general reside claramente en el
núcleo. Algunas proteínas cloroplásticas están codificadas en el DNA plastídico y son
sintetizadas dentro del cloroplasto la mayoría de las proteínas cloroplásticas están
codificadas en el DNA nuclear, son sintetizadas en el citosol y luego importadas al
cloroplasto (Raven et al., 2003).

La función de los organelos es esencial para la vida de los eucariontes. Esta función
depende de las actividades de proteínas sintetizadas tanto en los organelos como
importadas desde el citosol (codificadas en el núcleo). Muchas de estas funciones se
llevan a cabo por complejos enzimáticos con subunidades codificadas en ambos
compartimientos, por lo tanto la coordinación de la expresión de los genes
cloroplásticos tanto nucleares como organelares es de suma importancia (Fujii y Small,
2011).

La biogénesis y desarrollo del cloroplasto en plántulas puede ser descrito como el
proceso de diferenciación del plástido progenitor, el proplástido, a un cloroplasto
maduro, ya sea directamente o pasando por un intermediario generado en condiciones
de oscuridad conocido como etioplasto (Pogson y Albrecht, 2011). El desarrollo del
cloroplasto es un proceso complejo y altamente regulado. La transcripción de los genes
plastídicos, la diferentes modificaciones postranscripcionales (remoción de intrones,

3
edición del RNA mensajero (mRNA), etc.), la traducción y el ensamblaje de complejos
proteicos median los pasos críticos de la biogénesis del cloroplasto (Waters y Langdale,
2009).

Por lo tanto, la transcripción de genes en el cloroplasto, la maduración del RNA, la
traducción y modificación de proteínas tiene un gran impacto en la biogénesis y
desarrollo del cloroplasto (Pogson y Albrecht, 2011).

1.2. La regulación de la expresión genética en cloroplasto

1.2.1. El genoma plastídico

Los plástidos al igual que la mitocondria son organelos semiautónomos que llevan a
cabo varias funciones regulatorias y metabólicas. El genoma de los plástidos desde las
algas verdes hasta las plantas vasculares, es una molécula circular que contiene
aproximadamente 120 genes y que codifica diferentes proteínas plastídicas, para
tRNAs y para rRNAs. La gran mayoría de los productos de los genes plastídicos son
componentes de enzimas fotosintéticas o de la maquinaria basal de expresión de los
genes del plástido. Estos incluyen varios de las subunidades de los complejos de la
membrana tilacoidal como el fotosistema I (PSI), fotosistema II (PSII), citocromo b6f,
ATP sintasa y NADH deshidrogenasa; así como complejos solubles presentes en el
estroma como la enzima RUBISCO y para la accD (acetil CoA carboxilasa). También
están codificados en cloroplasto diferentes genes de mantenimiento (housekeeping),
así como varios rRNAS, subunidades de la RNA polimerasa (PEP) y de la proteasa
caseinolítica Clp (clpP1) (Sakamoto et al., 2008). De esta manera, deben de existir
mecanismos para asegurar la acumulación estequiométrica de las proteínas derivadas
de dos compartimientos físicamente separados (Barkan y Goldschmidt-Clermont, 2000).

Como las plantas son descendientes de cianobacterias ancestrales, muchos de los
genes mantienen características de estos procariontes y están organizados en
operones y son co-transcritos. A diferencia de los procariontes los cloroplastos, y

4
también las mitocondrias, tienen intrones del grupo I y II que probablemente surgieron
en el proceso de co-evolución. La producción de las especies maduras de transcritos
requiere eventos complejos de procesamiento policistrónico, procesamiento de intrones
y remoción de secuencias tanto en el 5’y 3’ de los transcritos, lo cual a veces es
complejo y lleva a la acumulación de varias moléculas de RNA (Sakamoto, et al., 2008).

La gran mayoría de los genes que se requieren para la función de los cloroplastos
están codificados en el núcleo y sus proteínas son importadas al cloroplasto. La
mayoría de las proteínas que se dirigen al cloroplasto entran vía el translocón de la
membrana externa del cloroplasto (TOC) y el translocón de la membrana interna (TIC).
Las proteínas son dirigidas a estos complejos por su péptido de tránsito al cloroplasto
por la HSP90 y TOC159. Una vez en el cloroplasto se procesan para remover su
péptido señal (Pogson y Albrecht, 2011).

1.2.2. La regulación transcripcional

La transcripción de genes cloroplásticos es catalizada por al menos dos distintas RNA
polimerasas. La primera, se parece a la RNA polimerasa de bacterias y consiste en una
enzima con varias subunidades codificadas en el plástido, las cuales se ensamblan con
factores accesorios codificados en el núcleo (Allison, 2000; Sakamoto et al., 2008). A
esta polimerasa se le conoce como PEP (por sus siglas en inglés: plastid-encoded
polymerase). La PEP es una holoenzima que consiste de cuatro subunidades (α, β,
β’1 and β’2), todas codificadas por genes plastídicos, rpoA, rpoB, rpoC1 y rpoC2,
respectivamente. Polimerasas eubacteriales como la PEP requieren de un factor
adicional (sigma), el cual facilita el reconocimiento del promotor. Estos factores no
están codificados en cloroplasto. En Arabidopsis se han identificado seis factores sigma
(SIG1 a SIG6) que se localizan en cloroplastos (Shiina et al., 2005). La PEP es
esencial para el desarrollo del cloroplasto y para las funciones fotosintéticas en
particular, ya que disrupciones en los genes de la PEP exhiben un fenotipo con
deficiencia de pigmentos seguido por una pérdida de membranas tilacoideas apiladas
(grana) y la pérdida de proteínas relacionadas con la fotosíntesis (Anamaru et al., 2004).

La segunda polimerasa es codificada totalmente por genes nucleares y está
relacionada con ciertas polimerasas de bacteriófagos. Como está codificada en el
genoma nuclear se le conoce como NEP (nucleus-encoded polymerase, por sus siglas
en inglés) (Sakamoto et al., 2008; Barkan y Goldschmidt-Clermont, 2000). En
Arabidopsis, tres genes que codifican la NEP han sido identificados: RpoT3 (o RpoTp)
para plástidos, RpoT1 (RpoTm) para mitocondria y RpoT2 (RpoTmp) para ambos
organelos (Sakamoto et al., 2008). NEP transcribe todos los genes de mantenimiento
(housekeeping) y metabólicos de los plástidos (Serino y Maliga, 1998).

Un concepto general aceptado para los papeles diferenciales de las polimerasas
durante el desarrollo del cloroplasto es el siguiente: en etapas tempranas, la NEP es
altamente expresada. A su vez, esta inducción de la NEPinicia la transcripción de una
serie de genes que codifican las subunidades de la PEP (genes rpo), RNAs
ribosomales, proteínas ribosomales y otras proteínas housekeeping (como clpP1). La
maquinaria para la síntesis de proteínas y degradación parece ser construida en esta
etapa. Mientras el cloroplasto se desarrolla, la PEP ya está activada y se vuelve la
polimerasa con mayor actividad en las etapas posteriores de diferenciación. Así la PEP
en combinación con varios factores SIG actúa para llevar a cabo la expresión de genes
involucrados en la formación de maquinarias fotosintéticas y la formación de
membranas tilacoideas (Sakamoto et al., 2008).

1.3. Metabolismo del RNA en el cloroplasto

Los productos de la transcripción de los dos tipos de polimerasas en el cloroplasto
son típicamente policistrónicos. La mayoría de los transcritos primarios se someten a
procesamientos de maduración de RNA (Barkan y Goldschmidt-Clermont, 2000). Este
procesamiento del RNA juega un papel muy importante en la expresión de los genes
organelares (Stern et al., 2010) y una amplia gama de proteína de unión a RNA
participan y son esenciales en este procesamiento (Fujii y Small, 2011).

6
El metabolismo del RNA cloroplástico tiene varias características semejantes al de los
procariontes, pero la existencia de intrones, la edición de RNA y los complejos patrones
de procesamiento de precursores policistrónicos son características totalmente
diferentes (Stern et al., 2010). La población de mRNAs maduros en el cloroplasto
contiene transcritos primarios y procesados. A continuación se mencionan los distintos
tipos de procesamiento del RNA cloroplásticos:

1.3.1. Maduración del RNA

-Maduración del extremo 5’
En muchos casos, el extremo 5’ maduro es generado por procesamiento del RNA, más
que por la iniciación de la transcripción. Han sido propuestos dos mecanismos que se
cree llevan a la formación del extremo 5’ y que resulta del procesamiento del RNA: una
vía exonucleolítica 5’3’ o una escisión sitio específica por una endoribonucleasa aún
no identificada (Stern et al., 2010).

-Maduración del extremo 3’
La mayoría de los extremos 3’ son generados por procesamiento, más que por la
terminación de la transcripción. Mecanismos exonucleolíticos o endonucleolíticos y
proteínas de unión a RNA parecen participar en la formación del 3’ (Stern et al., 2010).

1.3.2. Estabilidad del RNA

Una característica no procarióntica de los cloroplastos es que la vida media de sus
RNAs varían de 30 minutos hasta varios días. Se puede especular que proteínas de
unión a RNA que no se encuentran en procariontes regulan el decaimiento en la vida
media de los RNAs (Stern et al., 2010).

7
1.3.3. RNA splicing

Los genomas de los organelos en plantas contienen intrones de dos tipos: grupo I y
grupo II. Éstos se definen con base en sus distintos mecanismos de procesamiento y a
los elementos estructurales presentes. En cuanto a factores de splicing codificados en
el cloroplasto se sabe que algunos intrones de ambos grupos codifican para maturasas
que están involucradas en su propio splicing. En cuanto a factores de splicing
codificados en el núcleo, existen evidencias de que por lo menos 12 diferentes
proteínas están involucradas en el procesamiento de intrones en el cloroplasto. Muchas
de estas proteínas, llamadas CRMS (chloroplast RNA splicing and ribosome
maturation), pertenecen a una familia que contiene más de 4 dominios de unión a RNA
(Stern et al., 2010).

1.4. Edición de RNA

Además de los procesamientos de maduración revisados anteriormente, existe la
edición de RNA. Los transcritos de los plástidos pueden estar sujetos a este
mecanismo de procesamiento de RNA que cambia la identidad de nucleótidos
individuales y así altera la información del contenido del RNA mensajero. Este cambio
se le conoce como edición de RNA y es uno de los múltiples eventos de maduración
del RNA, que son requeridos antes de que los transcritos de plástidos sirvan como
moldes en la biosíntesis de proteínas plastídicas. La edición del RNA en cloroplasto
procede por la conversión de un residuo individual de citidina a uridina y, en algunas
briofitas, el evento inverso, transiciones de uridina a citidina. Ningún otro tipo de
sustitución de nucleótidos ha sido detectada en transcritos plastídicos; sugiriendo que
la edición del RNA cloroplástico está restringida a transiciones de pirimidinas (Bock,
2000).

La edición de RNA en general puede ser definida como el proceso que cambia la
secuencia del transcrito con respecto a la que está codificada en el DNA. La edición
incluye inserciones o deleciones sitio específicas de uno o varios nucleótidos (edición

8
de inserción/deleción) y también cambios específicos en la identidad de nucleótidos
individuales (edición de conversión) (Bock, 2000).

La edición de RNA fue descubierta en la mitocondria de Trypanosoma. Los
tripanosomas poseen una gran mitocondria llamada kinetoplasto. Las secuencias de
DNA de los genes del kinetoplasto parecían ser pseudogenes ya que a pesar de que
exhibían alta similitud con las diferentes subunidades de la cadena respiratoria, no
contaban con un marco continuo de lectura. Análisis de la secuencia de los mensajeros
correspondientes revelaron que en estos transcritos se habían restaurado los marcos
de lectura correctos en todos los casos. Esta reparación a nivel del transcrito ocurre a
través de la inserción o deleción post-transcripcional de residuos de uridina en sitios
altamente específicos (Benne et al., 1986).

Después del descubrimiento de la edición en tripanosomas, se detectaron procesos de
edición en mitocondria y plástidos de otros eucariontes. Mientras que la edición en los
kinetoplastidos es del tipo inserción/deleción, en los plástidos se da una edición del tipo
de conversión, es decir la identidad del residuo del nucleótido individual es cambiada
pero el tamaño de la molécula de RNA permanece sin cambios (Bock, 2000). La
edición en los plástidos fue descubierta en 1991 cuando se secuenció el genoma
cloroplástico del maíz. Cuando se alineó el gen rpl2 con los ortólogos de otras especies,
se descubrió que aparentemente este gen en maíz no tenía el codón de iniciación de la
traducción. El codón de inicio convencional ATG, el cual está presente en los genes
rpl2 de tabaco y de Marchantia polymorpha, estaba reemplazado por un codón ACG en
la posición homóloga del maíz y arroz. Sin embargo, la secuencia del cDNA de rpl2 de
maíz reveló que el codón ACG codificado en el genoma había sido reemplazado por el
codón correcto de inicio, AUG. Esto sugirió que el codón ACG codificado en el genoma
del cloroplasto para rpl2 sufre una modificación co- o post- transcripcional a través de
edición, que lo convierte en un codón de inicio AUG típico (Bock, 2000).

Evidencia obtenida en el sistema de edición en mitocondria de plantas ha indicado que
la unión azúcar-fosfato de la cadena del mRNA no es separada durante la reacción de

9
edición (Rajasekhar y Mulligan, 1993). Igualmente, el enlace N-glicosídico entre la
pentosa y la pirimidina parece permanecer intacto (Yu y Schuster, 1995). Estos
descubrimientos parecen excluir al mecanismo de escisión de nucleótidos y el de
sustitución de base en la edición de RNA en estos organelos. Por lo tanto, el
mecanismo más probable involucra una conversión enzimática de citidina a uridina
dada por una citidina desaminasa, capaz de actuar en sustratos de poliribonucleótidos
o, alternativamente, por una transaminasa (Figura 2) (Bock, 2000). Aunque la
evidencia bioquímica se obtuvo de mitocondrias de plantas, se cree que un mecanismo
similar ocurre en plástidos. Sin embargo, hasta ahora ninguna de las enzimas
involucradas en la edición en los organelos de plantasha sido aislada y caracterizada
(Bock, 2000).

Figura 2. Probable mecanismo de edición de RNA C-a-U en cloroplasto de plantas superiores. La
citidina puede ser convertida en uridina por una desaminación oxidativa en el carbono número seis del
anillo de pirimidina. La conversión enzimática de C-a-U puede ser llevada a cabo por una citidina
desaminasa o una transaminasa. Una reacción de transaminación requeriría un co-sustrato portando un
grupo ceto para aceptar el grupo amino liberado del residuo de citidina. Tomada de Bock, 2000.

Una pregunta que surge en el proceso de edición es la manera en la cual decenas de
sitios son reconocidos específicamente. Experimentos in vivo usando cloroplastos
transgénicos han mostrado que los sitios de edición son reconocidos por elementos en
cis que están localizados aproximadamente a unos 30 nucleótidos del sitio de edición.
Existe suficiente evidencia bioquímica que sugiere que los factores trans que se unen a
los elementos cis que rodean a los sitios a editar en organelos de plantas, son
proteínas (Hammani et al., 2009). La caracterización de mutantes de Arabidopsis que
muestran defectos en el proceso de edición ha sido de gran ayuda para identificar

10
algunos genes nucleares que se sospecha codifican factores involucrados en la edición
de RNA (Hammani et al., 2009).

1.5. Proteínas involucradas en la regulación de la expresión de genes
cloroplásticos

Recientemente se ha demostrado que varias proteínas codificadas en el núcleo que
pertenecen a una gran familia conocidas como PPRs (pentatricopetide repeat, por sus
siglas en inglés) participan en diversos mecanismos postranscripcionales incluyendo el
procesamiento del RNA, splicing, edición, estabilidad, maduración y traducción de los
mensajeros en organelos (Figura 3). Ésta es una de la familia de proteínas más grande
del genoma de plantas con más de 450 miembros en Arabidopsis thaliana y 560 en
arroz. En varios casos los fenotipos de las mutaciones en alguna de las proteínas PPR
son letales lo que demuestra que típicamente cada proteína PPR tiene una función
específica no redundante (Pogson y Albrecht, 2011).

Aunque las proteínas PPR han sido reportadas en todos los eucariontes, la cantidad de
estas proteínas es mucho mayor en plantas comparado con otros eucariontes. Por
ejemplo, Drosophila y Caenorhabditis elegans tienen sólo dos proteínas PPR (Saha et
al., 2007).

Figura 3. Esquema que representa la expresión genética y el ensamblaje de proteínas fotosintéticas.
Este proceso está dictado por la coordinación de la transcripción mediada por las polimerasas NEP y
PEP y por pasos regulatorios postranscripcionales mediados por las proteínas PPR. Tomado de
Sakamoto et al., 2008.

La familia PPR está caracterizada por tener el motivo distintivo degenerado de
repeticiones de 35 aminoácidos generalmente arreglado en tándem de 2 a 27
repeticiones por péptido (Luri et al., 2004; Small y Peeters, 2000). Basados en análisis
bioinformáticos, la mayoría de las proteínas PPR se pronostica que se dirigen a
mitocondria o a cloroplasto (Lurin et al., 2004).

La función más probable de la mayoría de las proteínas PPR es que son proteínas de
unión a RNA involucradas en modular la expresión de los genes de los organelos
procesando y/o estabilizando diferentes transcritos, así como regulando su traducción
(Saha et al., 2007). Por lo tanto los genes PPR en plantas juegan un papel esencial en
la embriogénesis vegetal y otros procesos del desarrollo de la planta (Saha et al., 2007).
En los casos analizados cada miembro de la familia de las PPR se une a un RNA

12
específico y al parecer recluta factores generales para su procesamiento, maduración y
traducción, regulando de esta manera su expresión (Saha et al., 2007).

La estructura típica de una proteína PPR contiene en el amino terminal una secuencia
de tránsito a organelos de tamaño variable y de 2 a 27 repeticiones PPR arregladas en
tándem (Figura 4). Estructuralmente, los motivos PPR se parecen a otro motivo de
repeticiones llamado tetratricopéptido (TPR) que se encuentra en diferentes proteínas
eucariónticas y que están implicadas en mediar interacciones proteína-proteína. (Saha
et al., 2007). Las proteínas TPR consisten en un par de hélices antiparalelas (Das et al,,
1998). Las repeticiones TPR organizadas en tándem forman un surco central que se
cree sirve como sitio de unión de otra proteína. Basados en esta conformación de las
TPR se predice que las repeticiones PPR forman también hélices que sirven como sitio
de unión para una molécula de cadena sencilla de RNA (Saha et al., 2007).

Figura 4. Un arreglo típico estructural de una proteína con repeticiones de pentatricopéptidos. Tomado
de Saha et al., 2007.

Las repeticiones PPR clásicas (designadas como motivos P) están arregladas en
tándem, pero en algunos casos pueden presentar gaps regularmente de no más de 70
aminoácidos. Alineamientos bioinformáticos de las secuencias entre PPRs de plantas
mostraron dos tipos de PPRs, unas cuyas secuencias repetidas contienen sólo 31
aminoácidos y otras en que el motivo PPR es un poco más largo, de 35-36
aminoácidos. Estos motivos fueron designados como PPR-S (por cortos “short”) y PPR-
L (por largos “long”) (Lurin et al., 2004). Así, con base en la longitud y arreglo de las
repeticiones de motivos, las proteínas PPR están agrupadas en dos subfamilias, las

13
proteínas PPR clásicas que contienen sólo motivos P y las proteínas combinatorias y
modulares de plantas (por sus siglas en inglés: PCMPs) con bloques repetidos de
motivos P-L-S, estas últimas sólo se encuentran en plantas (Aubourg et al., 2000;
Rivals et al., 2006).

El carboxilo terminal de las proteínas PPR es variable y algunas de ellas contienen
motivos no relacionados con los dominios PPR conocidos como E o E+ (de extendidos)
o DYW. Estos tres motivos están presentes en proteínas de la subfamilia PCMPs y no
en ninguna otra proteína de Arabidopsis (Lurin et al., 2004). Los motivos E y E+ no
tienen una secuencia conservada, mientras que el motivo DYW tiene una alta similitud
en secuencia de aminoácidos, particularmente en residuos de Cys e His (Aubourg et al.,
2000). Los tres motivos del carboxilo terminal siempre aparecen continuos y con un
orden conservado de E, E+ y DYW. La presencia de estos motivos en el carboxilo
terminal de proteínas PPR no es una regla, no se encuentra en las proteínas PPR
conocidas como “clásicas” y está usualmente asociado con proteínas de la subfamilia
PCMPs. Estos motivos ha sido implicados en el reclutamiento de factores catalíticos
para el procesamiento del RNA (Rivals et al., 2006).

Como se mencionó anteriormente por análisis computacionales se predice que la
mayoría de las proteínas PPR tienen una secuencia de tránsito a organelo, ya sea a
mitocondria o cloroplasto (Small y Peeters, 2000; Lurin et al., 2004).
Experimentalmente dicha localización subcelular se determina visualizando en la célula
la expresión de un gen reportero, como la proteína verde fluorescente (GFP) u otro
marcador visual, cuando éste es fusionado en fase con la proteína PPR de interés o
con una parte de ella y es introducido en células vegetales (Saha et al., 2007).

1.6. Algunas proteínas PPR son requeridas para la edición de RNA en
cloroplasto

La proteína CRR4 fue una de las primeras PPRs en identificarse como un factor
requerido para la edición de RNA en cloroplasto (Kotera et al., 2005) posteriormente

14
muchas proteínas PPR han sido identificadas como factores requeridos para la edición.
Estas proteínas PPR se agrupan dentro de la clase PLS, una posible excepción es la
proteína de Arabidopsis PPR596 quien pertenece a la clase P y que suprime la edición
de RNA en los transcritosmitocondriales del gen rps3 (Doniwa et al., 2010).

Se ha especulado que la mayoría de los miembros de la clase PLS podrían estar
involucrados en la edición de RNA (Tabla 1). Pero también existen otras proteínas de
esta clase que no están involucradas en la edición como: la proteína CRR2 que
pertenece a la clase DYW y que está involucrada en la escisión del RNA de un
transcrito cloroplástico (Okuda et al., 2009) y la proteína OTP70 de la subclase E, la
cual está involucrada en el splicing de los transcritos cloroplásticos del gen rpoC1
(Chateigner-Boutin et al., 2011).

Tabla 1. Factores de edición conocidos de organelos de plantas. Tomada de Fujii y Small, 2011.

Sólo pocas proteínas PPR se ha encontrado que pueden unirse a múltiples sitios
blanco, entre las más estudiadas se encuentran las proteínas de maíz (Zea mays)
CRP1 y la proteína PPR10 (Hammani et al., 2009). En estos dos casos sus sitios de
edición tienen una secuencia casi idéntica. Vale la pena señalar que hasta el momento
no se ha encontrado alguna característica en cuanto al tamaño, número de motivos o
algún otra característica en la secuencia o estructura de la proteína que pueda
distinguir entre las proteínas PPR que reconocen múltiples sitios blanco, de aquellas
que sólo reconocen uno (Figura 5) (Hammani et al., 2009).

1.6.1. Los motivos E y E+ pueden tener una función común en la edición del
RNA

La mutante crr4 de Arabidopsis es defectuosa en la edición del RNA del gen ndhD-1
del cloroplasto (Kotera et al., 2005) El gen ndhD codifica una subunidad del complejo
cloroplástico NAD(P)H deshidrogenasa, el cual está involucrado en el flujo cíclico de
electrones en el fotosistema I (Okuda et al., 2006). La proteína CRR4 contiene 11
motivos PPR, un motivo E y un motivo desconocido. El trabajo de Okuda y
colaboradores (2006) mostró que CRR4 interacciona directamente con el RNA de
ndhD-1. CRR4 se une específicamente a los 25 nucleótidos corriente arriba y los 10
nucleótidos corriente abajo del sitio de edición. Usando RNA pre-editado y post-editado
del transcrito mostró que la afinidad de unión de CRR4 al RNA pre-editado es
ligeramente menor. Sugiriendo que la citidina en el sitio de edición no es una
característica crítica para el factor activador en trans (Okuda et al., 2006). Estos datos
sugieren que esta proteína PPR actúa como un factor en trans para la edición de RNA
plastídico.

Figura 5. Estructura esquemática de proteínas PPR de plantas involucradas en editar transcritos de
cloroplasto o de mitocondria. Las proteínas PPR están agrupadas de acuerdo a su número de sitios
blanco (sencillo o múltiple). Tomado de Hammani et al., 2009.

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Posteriormente se descubrió otra proteína PPR denominada CRR21 que pertenece a la
clase E+ de la subfamilia PLS. Sin embargo, CRR21 y CRR4 no muestran una similitud
significativa en los motivos de PPR. Esto podría deberse a que distintos arreglos en
tándem de los motivos PPR son capaces de reconocer distintas secuencias específicas
de RNA. Los motivos E y E+ de estas proteínas se localizan hacia el carboxilo terminal
y están altamente conservados en secuencia entre CRR4 y CRR21. Aunque CRR4 y
CRR21 reconocen distintos blancos de RNA su similitud en los dominios E sugiere una
función común en ambas proteínas y no una función específica de reconocer distintas
secuencias de RNA. Cuando se intercambió el dominio E/E+ de CRR4 con el de
CRR21 el gen quimérico fue capaz de restaurar la edición de ndhD-1 en el fondo
mutante, aunque a niveles ligeramente menor que en una planta wt. En un experimento
recíproco también se restauró la edición de ndhD-2. Esto confirma que los dominios
E/E+ de las proteínas CRR4 y CRR21 tiene una función o mecanismo de acción similar
en la edición de RNA (Okuda et al., 2007).

Además en el trabajo de Okuda et al., 2007 se realizó un ensayo electroforético de
retraso (EMSA) usando un proteína recombinante CRR4 truncada del dominio E/E+ y
una sonda de RNA conteniendo la secuencia de reconocimiento de CRR4. En este
ensayo se observó una banda retardada cuando se incrementó la concentración de la
proteína recombinante con una Kd de 1.8 nM un valor muy similar a la afinidad de
unión de la proteína completa CRR4 (Figura 6). Estos resultados indicaron que el
dominio E/E+ no es importante para la unión de alta afinidad al RNA.

Figura 6. Ensayos electroforéticos de retraso con la proteína CRR4, CRR4 sin el dominio E/E+ y el RNA
blanco. A) representación esquemática de la sonda usada ndhD-1. B) Ensayos electroforéticos con
concentración fija de RNA (0.5 nM) con diferente concentración de proteínas. Tomado de Okuda et al.,
2007.

1.7. La traducción en cloroplasto

Una vez que el transcrito ha sufrido modificaciones postranscripcionales irreversibles
(splicing, edición, procesamiento) o reversibles (asociación con proteínas específicas)
está listo para ser traducido (Danon, 1997). La mayoría de los constituyentes de la
maquinaria de traducción en cloroplastos tiene similitud con los de procariontes Sin
embargo, también existen algunas diferencias. Los cloroplastos contienen ribosomas
propios del tipo 70S, el 5’ de los transcritos de los cloroplastos no presentan “capping”
con m7G y muchos son transcritos como unidades policistrónicas (Danon, 1997).

Una de las consecuencias de la transferencia de un gran número de genes del genoma
del cloroplasto al nuclear, es la necesidad de una regulación coordinada de ambos
genomas. Esta coordinación es crucial para modular y regular a los diferentes

19
componentes de los complejos proteicos cloroplásticos que están compuestos por
subunidades de origen tanto nuclear como plastídico (Danon, 1997).

1.8. Estabilidad y degradación de proteínas en cloroplasto

Existen evidencias que indican que las proteasas tienen un papel muy importante en la
transición de un tipo de plástido a otro. Además se sabe que el aparato fotosintético en
cloroplasto se encuentra sometido a un constante daño fotoxidativo por lo que algunas
proteínas deben ser continuamente removidas por proteasas (Sakamoto, 2006). Por lo
tanto la degradación de proteínas cloroplásticas es mantenida por un estricto control de
calidad, que puede ser considerado como el ajuste final en el último paso de la
expresión genética (Sakamoto et al., 2008).

En el citoplasma, generalmente se acepta que la degradación dependiente de
ubiquitina a través del proteosoma 26S es una vía importante regulatoria. Sin embargo,
en cloroplastos, esta vía no se encuentra y diversos estudios han revelado que los
cloroplastos tiene muchas proteasas tipo procariónticas algunas de las cuales son
dependientes de ATP y están relacionadas evolutivamente con el proteosoma 26S
(Adam et al., 2006). De las 3,000 a 3,500 proteínas que constituyen los cloroplastos,
incluyendo las que están codificadas en cloroplasto, el 5 % se cree que están
funcionalmente relacionadas con la degradación de proteínas tal y como se muestra en
la figura 7. Existen al menos once tipos diferentes de familias de proteasas y
peptidasas codificadas por más de 50 genes. Los diferentes tipos de proteasas
incluyen las serina-metaloproteasas y posiblemente cisteína y aspártico proteasas y
varias de ellas requieren ATP (Sakamoto et al., 2008). Las proteasas o peptidasas en
los plástidos tienen dos tipos de funciones. La primera función es su actividad
endopeptídica, que se encarga de removerel péptido de tránsito en el estroma de las
proteínas importadas a estos organelos y de eventos procesivos (degradación gradual
de oligopéptidos a aminoácidos) para el ensamblaje correcto del fotosistema II. La
segunda función de las proteasas plastídicas es la degradación procesiva o gradual de
proteínas. Este tipo de degradación se requiere para remover proteínas innecesarias

20
que están generadas en exceso, por errores de ensamblaje, daño por calor o
fotoxidativo (Sakamoto, 2006).

Uno de los tipos de proteasas mejor caracterizados son las proteasas dependientes de
ATP que incluyen a las proteasas Clp, FtsH y Lon y que son consideradas las enzimas
que están mayormente involucradas en la degradación procesiva. La estructura básica
de las proteasas dependientes de ATP en plantas es muy similar a la arquitectura de
proteasas bacterianas, pero estas enzimas plastídicas tienen un número extraordinario
de isómeros (Sakamoto, 2006).

Figura 7. Esquema de los tipos y funciones de las proteasas en plástidos. Una vez que los cloroplastos
están formados, el control de calidad de las proteínas es llevado a cabo principalmente por las proteasas
dependientes de ATP y son cruciales para el mantenimiento. La degradación procesiva es requerida
para la transición entre los distintos tipos de plástidos. Tomado de Sakamoto, 2006.

1.8.1. La proteasa Clp

Clp es una serina-proteasa dependiente de ATP cuyo modo de acción ha sido
caracterizado en E. coli. Clp consiste en un núcleo catalítico flanqueado en uno o
ambos lados por una chaperona HSP100. El núcleo proteolítico tiene forma de barril y

21
consiste en dos anillos heptaméricos formados por la subunidad ClpP1, cuyo sito
catalítico está situado dentro de la cavidad central como se muestra en la figura 8
(Wang et al., 1997). Adyacente a la entrada del núcleo proteolítico está un solo anillo
homogéneo hexamérico de ClpA o ClpX, dos miembros de las familia HSP100 de
chaperonas. Estos componentes confieren especificidad de sustrato a la proteasa y
desnaturalizan a la proteína sustrato de una manera dependiente de energía. Una vez
que los sustratos son desnaturalizados éstos son transferidos al núcleo proteolítico y
rápidamente degradados a pequeños fragmentos peptídicos (Sjögren et al., 2006).

Figura 8. Representación tridimensional del heptámetro ClpP en E. coli. A. Vista a la cavidad central del
heptaedro. D. Sección longitudinal del tetradecámero.

En contraste con E. coli, la Clp de Arabidopsis thaliana consta de al menos 23
proteínas individuales Clp (Peltier et al., 2004; Adam et al., 2001), de las cuales 10 son
chaperonas tipo HSP100 (ClpB1-4, ClpC1-2, ClpD y ClpX1-3), seis son parálogas a la
subunidad proteolítica ClpP (ClpP1-6) y cuatro son parálogas a la subunidad ClpP-like
(ClpR), la que aparentemente no forma parte de la tríada catalítica (ClpR1-4).
Adicionalmente a las anteriores, Arabidopsis posee dos proteínas Clp únicas, con
similitud de secuencia en el amino terminal a las HSP100. Estas proteínas fueron
designadas ClpS1 y ClpS2 (Peltier et al., 2004). La mayoría de las proteínas Clp en
Arabidopsis están localizadas en el estroma del cloroplasto y todas están codificadas
en el núcleo, excepto ClpP1. La mayor parte de las proteínas cloroplásticas ClpP se
asocian a un complejo núcleo proteolítico de 325 a 350 kDa el cual está conformado
por ClpP1, ClpP3-6 y por los parálogos ClpR1-4 junto con las dos proteínas ClpS1-2

22
(Peltier et al., 2004). Este complejo núcleo (ClpP/R/S) se forma como un doble anillo
heptamérico análogo al núcleo proteolítico de E. coli, (Figura 8) (Sjögren et al., 2006).

Las tasas de traducción y degradación de proteínas son importantes para el desarrollo
del cloroplasto. El complejo con multisubunidades ClpP/R/S tiene un rol central en
degradar proteínas y es requerido para la homeostasis de proteínas cloroplásticas. Las
pérdidas de las proteínas ClpP pueden llegar a ser embrión-plántula letales (Pogson y
Albrecht, 2011). En plantas todos las subunidades parecen ser esenciales para la
viabilidad, sugiriendo un papel único para cada una de ellas. Un estudio con una línea
knockdown de ClpP6 reveló posibles sustratos de ClpP, apoyando que esta proteasa
juega un rol en el control de calidad de las proteínas de mantenimiento
(“housekeeping”) del organelo, más que de proteínas fotosintéticas o de otras funciones
metabólicas (Sjögren et al., 2006).

23
2. ANTECEDENTES

En una búsqueda de mutantes afectadas en la biogénesis del cloroplasto, en el grupo
de investigación se identificó a la mutante clb19-1, que se caracteriza por desarrollar
cotiledones y hojas amarillo pálido cuando crece a condiciones estándar de luz y
mueren en un tiempo corto (Figura 9). En condiciones en las que clb19-1 puede
continuar su desarrollo, como en medio complementado con sacarosa como fuente de
carbono, la planta presenta niveles bajos de pigmentos, produce numerosas hojas,
tallos con inflorescencia, flores, silicuas, polen viable e incluso semillas viables (Figura
10). Aunque su desarrollo se da más lento en comparación con plantas de tipo silvestre
(wt) (Chateigner-Boutin et al., 2008).

Figura 9. (a) Morfología de planta silvestre (wt) de 15 días (b) morfología de la planta clb19 de 15 días
(c) comparación de wt con clb19. Tomada de Chateigner-Boutin et al., 2008.

Los plástidos de las hojas de clb19-1 tienen una forma irregular y son más pequeños
comparados con los cloroplastos de plantas silvestres (Figura 11). El desarrollo del
organelo está arrestado en una etapa temprana de la biogénesis del cloroplasto
(Vothknecht y Westhoff, 2001). Contiene pocas membranas internas en forma de
tilacoides alargados pero no hay apilamiento.

Figura 10. (f-h) Morfología de una planta clb19 de 60 días cultivada en medio de germinación,
mostrando hojas verde pálido (f) silicuas (g) y flores (h). Granos de polen teñidos con acetocarmine (i) .
La flecha en (g) indica la silicua. Tomada de Chateigner-Boutin et al., 2008.

Esta mutante se aisló de una colección generada por inserciones de T-DNA (Gutiérrez-
Nava et al., 2004) y el fenotipo mutante segrega como un gen único recesivo en
proporción 1:3. La identificación de la inserción en el genoma de esta planta mostró
que ésta afectaba al gen At1g05750 al cual se le denominó CLB19. También fue
corroborado que el fenotipo amarillo de la mutante era revertido por la expresión del
gen CLB19 silvestre y que su producto protéico se localiza en los cloroplastos
(Chateigner-Boutin et al., 2008).

La secuencia del gen CLB19 contiene 10 motivos PPR o tipo PPR (P, L, L2 o S) en
tándem (Lurin et al., 2004). Estos motivos están presentes en un arreglo triple (P-L-S)
(Figura 12). Además de los motivos PPR, el carboxi terminal de CLB19 contiene dos
motivos extras, E y E+; por lo que esta proteína pertenece a la subclase E/E+ según la
clasificación de Lurin et al. (2004).

Figura 11. Micrografías de transmisión electrónica de plástidos de hojas de 15 días de plantas silvestres
(a) y de clb19 (b). Barra de escala 1 µm. La flecha muestra estructuras membranales observadas en la
planta mutante. Tomado de Chateigner-Boutin et al., 2008.

El análisis de los perfiles de expresión de genes cloroplásticos entre clb19 y plantas
silvestres mostró que tanto el nivel como el patrón de expresión de varios transcritos
están afectadas en la mutante clb19. En general se observaron tres tipos de defectos
que incluyen: en genes como psbA y rrn16 se observó una disminución notable en los
niveles de sus transcritos maduros pero con un patrón indistinguible del de la planta
silvestre. En contraste para los genes como psbB, petD, psaB, rrn23 y rbcL además de
presentarniveles muy bajos del transcrito maduro se observó la acumulación de
especies de mayor peso molecular no presentes en plantas silvestres y que
corresponden probablemente a especies no maduras. Finalmente para genes como
atpB, atpE y accD se observó una mayor acumulación de sus transcritos comparados
con la planta silvestre (Figura 13). Estos cambios en los perfiles de transcripción se
reflejan también en bajos niveles de acumulación de diversas proteínas cloroplásticas
como RbcL y componentes de los fotosistemas (Chateigner-Boutin et al., 2008).

Figura 12. Representación esquemática de los motivos PPR en la proteína CLB19. cTP indica el péptido
de tránsito al plástido. Tomado de Chateigner-Boutin et al., 2008.

Figura 13. Análisis de la expresión de genes cloroplásticos en la mutante clb19 y plantas wt. Las barras
negras abajo del gel indican que el gene es transcrito por la PEP, las barras grises indican que el gen es
transcrito por la NEP y las barras negro/gris indican transcripción por PEP y NEP. Como control de carga
se muestra el rRNA 25S codificado en el núcleo. Tomado de Chateigner-Boutin et al., 2008.

El análisis de los patrones de expresión de los genes descritos anteriormente mostró
que todos los transcritos que se acumulan en niveles mayores en clb19 son transcritos
por la polimerasa NEP, mientras que los que muestran niveles menores y tienen
defectos de procesamiento se transcriben por la PEP o por ambas polimerasas
(Chateigner-Boutinn et al., 2008).

Un análisis más detallado de los transcritos de algunos genes como rbcL y accD a
través del uso de sondas secuenciales que abarcan tanto la región codificante como las
regiones 5’ y 3’ no codificantes mostraron de forma más precisa las alteraciones de sus
transcritos. En el caso del gen rbcL el transcrito maduro de 1.8 kb que se acumula en

27
las plantas silvestre es prácticamente indetectable en clb19. Sin embargo, en esta
mutante se detecta un transcrito de aproximadamente 4 kb a niveles bajos. Por lo tanto
los defectos de transcripción observados en clb19 son consistentes con alteraciones en
la actividad de polimerasa. Adicionalmente, los defectos en el procesamiento no son
consecuencia del arresto del cloroplasto en general, ya que estos defectos no se
observan en la mutante albina no relacionada clb6 (figura 14) (Chateigner-Boutin et al.,
2008).

Todos los defectos mencionados de la mutante clb19 pudieron ser explicados al
analizar los sitios de edición en esta mutante ya que presentó dos sitios no editados en
los transcritos de rpoA y clpP. En plantas silvestres la edición del codón 67 en el
transcrito rpoA, que codifica la subunidad alfa de la PEP polimerasa, resulta en el
cambio de una serina por una fenilalanina. Esta modificación portrascripcional no se
detecta en los alelos mutantes de clb19. Similarmente, la edición del codón 187 en el
transcrito para el gen clpP1, el cual codifica la subunidad catalítica de la serina
proteasa ClP dependiente de ATP, cambia una histidina a una tirosina en plantas
silvestres. Este cambio tampoco es detectado en la mutante clb19. La edición de
ambos sitios se restaura en plantas mutantes complementadas con el gen silvestre
CLB19. Ambos eventos de edición resultan en el cambio de codones para aminoácidos
que están altamente conservados en ambos genes en otros organismos, lo que sugiere
que estos aminoácidos probablemente son importantes para la función de las proteínas
RpoA y ClpP1 (Chateigner-Boutin et al., 2008).

Figura 14. Análisis de expresión de regiones de atpB, rbcL y accD en la mutante clb19. a)
representación esquemática de sondas usadas (1-7) en la figura b. Las flechas negras indican los
transcritos atpB y accD presentes en wt y clb19. La flecha gris claro indica el transcrito mayor de rbcL en
wt el cual está ausente en clb19. Las flechas gris oscuro indican los transcritos grandes que sólo se
detectan en clb19. b) Northen blots. Cada carril contiene 10 microgramos de RNA de plantas de 15 días
wt, clb19 o clb6. Las sondas usadas en cada caso están indicadas en a) sonatpB ORF (1), rbcL 5’ UTR
(2), rbcL ORF (3), rbcL 3’ UTR (4), accD 5’ UTR (5), accD ORF (6) y accD 3’ UTR (7). Marcador de peso
molecular (MW) y membrana teñida con azul de metileno (MB) mostrada como control de carga. Los
asteriscos y el signo (+) denotan el transcritos primarios o no procesados respectivamente. Tomada de
Cheteigner-Boutin et al., 2008.

Los defectos en la mutante clb19 pueden ser explicados por la falta de edición.
Primeramente, la edición del transcrito de rpoA cambia el codón que codifica a una
serina hidrofílica por una fenilalanina hidrofóbica. La fenilalanina está codificada en el
genoma cloroplástico de plantas como el arroz, maíz y briofitas, pero no en Arabidopsis,
en donde se genera por edición. En bacterias la proteína RpoA contiene en la posición
correspondiente una isoleucina, también hidrofóbica. En bacterias se sabe que la
región que comprende al carboxilo terminal de RpoA se encarga de unir al promotor

29
mientras que su amino terminal permite el ensamblaje con otras subunidades del
complejo de la polimerasa (Kimura et al., 1994). Si el modelo bacteriano se aplicara a
la PEP cloroplástica se puede especular que el cambio de aminoácido en la posición 67
en la parte del amino terminal en RpoA podría afectar el ensamblaje del complejo de
PEP en la mutante clb19. Segundo, la falta de edición del transcrito de clpP podría
causar defectos en la actividad del complejo catalítico ClpP/R/S de la proteasa Clp y
contribuir al fenotipo de las plantas clb19, ya que se ha visto que la falta de la
subunidad regulatoria clpR2 lleva a un fenotipo amarillo asociado con la reducción de la
acumulación del complejo ClpP/R/S (Rudella et al., 2006).

2.1. Antecedentes directos

Como se describió anteriormente la proteína CLB19 edita un sólo sitio en dos blancos
diferentes. Por lo tanto, no es claro qué parte del fenotipo de esta mutante se debe a la
falta de edición de rpoA y cuál a la de clpP. Para contestar esta pregunta se generaron
dos tipos de plantas transgénicas que portan las versiones editadas de los genes RpoA
y ClpP1 respectivamente. Ambos transcritos tenían fusionada la región que codifica el
amino terminal de la proteína, con la secuencia que codifica al péptido de tránsito al
cloroplasto (pTc) de la subunidad pequeña de la Rubisco (rbcS) y expresadas a partir
del promotor fuerte CaMV35S (Figura 15). Cada una de dichas construcciones se
introdujeron en plantas heterócigas para la mutación clb19. Líneas transgénicas
independientes para cada una de dichas construcciones fueron seleccionadas y de
ellas se obtuvo semilla y líneas homócigas (generación T2) para su análisis posterior.
Estas líneas transgénicas fueron el objeto de análisis de esta tesis.

Figura 15. Esquema del vector pFGC1008 que contiene las versiones editadas de los genes clpP y rpoA.
Cada una de las construcciones se introdujeron en plantas heterócigas para la mutación clb19.

31
3. JUSTIFICACIÓN

Aún no está claro si algunas proteínas PPR son requeridas como un factor sitio
específico para reconocer sitios de edición o si podrían tener funciones adicionales a la
de reconocer su RNA blanco (Okuda y Shikanai, 2012).

No existe, evidencia experimental de que la proteína CLB19 se une
específicamente a los transcritos clpP1 y rpoA. Por lo que de comprobarse será de
gran ayuda para entender como las proteínas PPR reconocen específicamente sus
sitios blancos.

Existe poca evidencia experimental en la que se haya probado que las PPR se
unen a la región específica a editar. Además el mecanismo de edición de C a U no se
conoce. Aunado aesto no se ha identificado a la enzima que realiza la edición, se cree
que pueden ser una transaminasa, citidina desaminasa o las proteínas PPR por sí
mismas. Un reto mayor está en identificar todos los factores relevantes involucrados en
la edición y elucidar el mecanismo exacto (Chateigner-Boutin y Small, 2011).

La edición en los transcritos de los plástidos probablemente corrige una
mutación que ocurrió en la evolución de su genoma (Chateigner-Boutin y Small, 2011).
En el genoma A. thaliana no se encuentra codificado el aminoácido correcto para tener
la proteína funcional de RpoA o ClpP, contrario a algunas otras especies de plantas,
donde el aminoácido correcto está codificado en su genoma (Chateigner-Boutin et al.,
2008). Por lo anterior, sería interesante conocer por qué se editan los transcritos clpP y
rpoA en A. thaliana.

La mayoría de las proteínas PPR son importadas a la mitocondria o al
cloroplasto, por lo que elucidar su función podría revelar muchas facetas importantes
de la interacción y/o comunicación entre el núcleo y los organelos en las plantas (Saha
et al., 2007).

32
4. OBJETIVOS

Objetivo general:

Análisis del mecanismo y función de la edición mediada por CLB19

Objetivos específicos:

• Caracterización fenotípica de plantas portadoras de las versiones editadas de
rpoA y clpP en el fondo genético de clb19

• Caracterización molecular de plantas portadoras del transgen con las versiones
editadas de cada uno de los blancos (rpoA y clpP).

• Análisis de la capacidad de unión de una versión truncada del dominio EE+ de
CLB19 a los transcritos rpoAEd y clpPEd in vitro.

33
5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1. Material vegetal

En los análisis realizados se utilizó el siguiente material vegetal:
a) Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia (Col-0)
b) La mutante clb19 cuyo fondo genético es Columbia
c) Líneas transgénicas T2 clpPEd:pFGC1008 numeradas de la siguiente manera:
1’-6, 3-4, 1’-4, 2-4, 4-1, 3-1 y líneas rpoAEd:pFGC1008: 1-5, 3-3, 2’-5, 1’-6, 2-5,
2’-1.

5.2. Esterilización y estratificación de semillas

Antes de someterse a experimentación las semillas pasan por un proceso de
esterilización y estratificación. El proceso de esterilización de semillas se realiza en una
campana de flujo laminar. Las semillas se embeben en agua por 30 minutos.
Posteriormente, se retira el agua y se añade un mililitro de etanol absoluto por un
minuto. Se retira el etanol y se añade un mililitro de solución de hipoclorito de sodio al
20%, se agita durante siete minutos. Se retira la solución de hipoclorito y se realizan 3
lavados con agua estéril. Finalmente se agrega un mililitro de agua estéril. Una vez
estériles pueden sembrarse en cajas Petri con medio GM (Apéndice I) que contiene las
sales minerales de Murashige y Skoog (MS) 0.2X con todos los nutriente necesarios
para el crecimiento de las plantas, suplementado con 0.6% de sacarosa y solidificado
con 1% de agar. El pH del medio se ajusta a 5.7 y se somete a esterilización en
autoclave (120°C y 15 lb de presión por 20 min). Una vez sembradas las semillas en
las cajas con medio someten a estratificación es decir, se colocan en total oscuridad a
4ºC durante cuatro días.

34
5.3. Crecimiento de A. thaliana en sustrato

Una vez transcurridos 10 días desde que se sembraron las semillas, las plántulas de
Arabidopsis son transferidas a sustrato Metromix 200, el cual tiene tres partes de tierra
y una de vermiculita. Las plantas se cultivan en un cuarto de crecimiento a 22ºC y con
un fotoperíodo de 16 horas de luz con 8 horas de oscuridad.

5.4. Cruzas dirigidas

Para realizar las cruzas y obtener plantas dobles transgénicas se utilizan plantas
adultas en etapa de floración. Para esto se toma el polen de la planta donadora y se
transfiere al carpelo de la receptora. Se realizaron cruzas recíprocas entre plantas
transgénicas rpoAEd y clpPEd. Las semillas se recolectan al madurar la silicua, de dos
a tres semanas después de realizar la cruza.

5.5. Extracción de DNA

Para el aislamiento de DNA genómico se utiliza la técnica de extracción por CTAB. De
acuerdo a los siguientes pasos:
• Pulverizar el tejido vegetal con la ayuda de pistilos y nitrógeno líquido en un tubo
eppendorf de 1.5 ml.
• Agregar 300 µl de buffer 2X CTAB (ver apéndice) e incubar a 65ºC por 30
minutos. Posteriormente se deja enfríar.
• Añadir 300 µl de cloroformo y vortexear.
• Centrifugar por dos minutos a 13,000 rpm para separar las fases.
• Transferir la fase acuosa de arriba a un nuevo tubo.
• Agregar 300 µl de 2-propanol y mezclar.
• Centrifugar por 10 minutos para formar una pastilla de DNA.
• Remover el sobrenadante y lavar la pastilla con 500 µl de etanol al 70%.
• Centrifugar por 10 minutos.
• Remover el etanol y se deja secar el tubo.

35
• Agregar 50 µl de agua y mezclar.
El DNA extraído se puede cuantificar en el nanodrop

5.6. Análisis por PCR

5.6.1. Lista de oligonucleótidos

Nombre del oligonucleótido Secuencia
CLB19-GW FW 5’-CAC CAT GGG TCT CCT TCC CGT-3’
CLB19-1102 RV 5’-ATT TGG CTT CAT TGG CAT GCT-3’
35s FW 5’-ATG ACG CAC AAT CC ACT ATC C-3’
rpoA Rv 5’-CTC TTC TT TTC ATT CCC-3’
APT1 FW 5’ TCC CAG AAT CGC TAA GAT TGC C 3’
APT1 RV 5’ CCT TTC CCT TAA GCT CTG 3’
clpP-574 RV 5’-TTA TTG AAC CGC TAC AAG-3’
clpP RV 5’-TTG AAC CGC TAC AAG ATC AAC-3’
T7 FW 5’-GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG-3’
198 35s up FW 5’-CCA ACC ACG TCT TCA AAG CAA G-3’
rpoA-231 Rv 5’-GAT TCT TGA ATA CCT GCT-3’
PTrbcL 5’- ATG GCC TCT ATG ATC AGT-3’
M13 FW 5’-GTA AAA CGA CGG CCA G-3’

5.6.2. Reactivos PCR

Buffer PCR 10X 2.5 µl
MgCl2 25 mM 2.5 µl
dNTPs 10 mM 0.25 µl
Oligo Fw (60 ng/µl) 1.0 µl
Oligo Rv (60 ng/µl) 1.0 µl

36
5.6.3. Programa general para las reacciones

Paso Temperatura ºC Tiempo Número de ciclos
Desnaturalización inicial 94 3 min 1
Desnaturalización 94 30 s
35 Alineamiento 52-56
(Dependiendo de
los oligos)
1 min
Extensión 68 1 min/kb
Extensión final 68 7 min 1

5.7. Electroforesis de DNA en gel de agarosa

Se funde agarosa al 1% (w/v) en buffer TAE (1X) (ver apéndice). Se agregan 2µl de
bromuro de etidio (10mg/ml) en 100ml de agarosa fundida y se mezcla de manera
homogénea. Se vierte la muestra en un portageles y se colca un peine de acuerdo al
volumen de carga. Se deja polimerizar el gel, posteriormente se retira el peine y el gel
se coloca en una cámara de electroforesis con TAE (1X). Se cargan las muestras de
DNA mezcladas con buffer de carga (ver apéndice). El gel se corre entre 70-100 V de
15 a 20 minutos.

5.8. Extracción de proteínas

El tejido vegetal recolectado se pulveriza con la ayuda de nitrógeno líquido en un tubo
eppendorf de 1.5 ml. Las muestras se resuspenden en proporción 1:1 v/v en un buffer
desnaturalizante de tipo Laemmli (Laemmli, 1970) (0.125 M Tris-Cl, pH 6.8, 20% v/v
glicerol, 4% v/v SDS, 2% v/v 2-mercaptoetanol y SDS 2X). Las muestras se incuban a
95ºC por cinco minutos. Los extractos de proteína se cuantifican con el método de
Bradford (Bradford, 1976). En celdas para espectrofotómetro, se agregan 800 µl de
agua destilada, 2 µl del extracto proteico y 200 µl de Bradford. Se agita la celda con su
contenido y se lee a 595 nm en el espectrofotómetro.

37
5.9. SDS PAGE

Para la electroforesis de proteínas las muestras y el marcador de peso molecular se
corren en un gel desnaturalizante SDS-poliacrilamida al 10% (ver apéndice) en un buffer
de corrida Tris-glicina (25 mM Tris-HCl, 250 mM glicina, 0.1% SDS). Los geles se corren
a 120 Volts durante aproximadamente 2 horas. El gel se puede teñir con azul brillante
Coomasie R-250 para la visualización de proteínas o se puede usar para electrotransferirlas proteínas a una membrana.

5.10. Western blot

Los extractos proteicos se separan por SDS-PAGE al 10% y luego son transferidas a
una membrana de nitrocelulosa por 90 minutos a 0.35 Amperes en una cámara de
electrotransferencia con buffer (ver apéndice) a 4ºC. La membrana que contiene las
proteínas se tiñe con Ponceau’s (ver apéndice) al 0.2% para verificar la presencia de
proteínas, la cual puede ser usada como control de carga. Se bloquea la membrana
con leche descremada al 5% en PBS (Ver apéndice) con Tween 20 al 0.1% por dos
horas. Posteriormente, se elimina el exceso de leche mediante tres lavados sucesivos
de al menos 5 minutos con la solución de lavado para Western blot (ver apéndice). Se
agrega el anticuerpo primario en la solución de lavado con 2% de leche descremada se
pone a incubar durante dos horas a temperatura ambiente. Se desecha la solución con
el anticuerpo primario y se lava la membrana con 3 lavados sucesivos de al menos 5
minutos con la solución de lavado para Western blot. Después, se agrega el anticuerpo
secundario (anti conejo o ratón) anti HRP con la solución de lavado durante 30 minutos
a temperatura ambiente. Se hacen tres lavados y por último un enjuague con agua. La
membrana se revela mediante quimioluminiscencia usando el kit de Lumigen: se
agrega 1 ml de Lumigen PS-3 detection reagent solution A y se le agrega 25 µl de
lumigen Ps-3 detection solution B. La mezcla se esparce en la membrana y se coloca
un film fotosensible.

38
5.11. Extracción de RNA

El tejido vegetal se muele en mortero con ayuda de nitrógeno líquido, hasta obtener un
polvo homogéneo, a 50-100 mg de este tejido pulverizado se le agrega TRIzol y se
mezcla con la ayuda de un vórtex, se deja reposar por 5 minutos a temperatura
ambiente, posteriormente se adicionan 200 µl de cloroformo por cada mililitro de TRIzol
utilizado y se agita en el vórtex, se centrifugan las muestras a 13,200 rpm durante 15
minutos a 4ºC. La parte acuosa se transfiere a un tubo eppendorff limpio y se adicionan
500 µl de alcohol isopropílico por cada mililitro de TRIzol utilizado, se mezcla
suavemente y se deja en reposo por 1 minuto a temperatura ambiente, se centrifuga
nuevamente a 13,200 rpm durante 10 minutos a 4ºC, se elimina el sobrenadante y se
lava la pastilla con 1 ml de etanol al 75% por cada mililitro de trizol utilizado. Se mezcla
en el vórtex y se centrifuga a 10,000 rpm por 5 minutos a 4ºC para eliminar el etanol.
Finalmente la pastilla se resuspende en 50 µl de agua miliQ estéril. Para determinar la
concentración y pureza del RNA se cuantifica en el nanodrop.

5.12. Electroforesis de RNA

El RNA extraído se separa en electroforesis en geles de agarosa al 1.8%. Se disuelve
agarosa en el buffer FA1X (ver apéndice) y se funde por calentamiento. La mezcla
fundida se mantiene a 65ºC en un baño de agua, se le adicionan 1.8 ml de
formaldehído al 37% y 1 µl de bromuro de etidio (10 mg/ml). La mezcla se vierte sobre
un molde de geles y se deja solidificar, el gel se coloca en la cámara de electroforesis
con buffer de corrida. Antes de cargar las muestras en el gel, al RNA se le agrega 3 µl
de buffer de carga y se calienta de 3-5 minutos a 65ºC. El gel se corre
aproximadamente a 100 V o 60 A durante al menos 1 hora (5-7 V por cm3) en buffer de
corrida 1X (ver apéndice). La integridad del RNA se corrobora visualizando el gel
usando el transiluminador de luz UV.

39
5.13. Northen blot

5.13.1. Transferencia del RNA en el gel a la membrana de nylon

Una vez corrido el gel de RNA se enjuaga con agua destilada y se coloca en un
sistema de transferencia por capilaridad que consiste en verter 200 ml de SSC 10X en
un recipiente rectangular, con ayuda de un soporte de acrílico se coloca un puente de
papel filtro (Wathman #1) cuyos extremos quedan en contacto con la solución de SSC
10X. Encima del puente en orden ascendente se colocan en el gel, con el fondo de los
pozos de carga hacia arriba, una membrana de nylon, dos recortes de papel filtro de la
misma medida del gel y una pila de papel absorbente de varios centímetros de espesor.
Para facilitar la transferencia se coloca encima un objeto pesado y el gel se deja
transfiriendo por alrededor de 12 horas. Terminada la transferencia se retira la
membrana junto con el gel y se marcan con lápiz los carriles de los pozos donde se
cargaron las muestras finalmente la membrana se fija con luz ultravioleta (1200 microJ)
y para verificar la transferencia, se tiñe con una solución al 0.1% de azul de metileno.
Una imagen fotográfica de la membrana teñida se utiliza como control de carga.

5.13.2. Amplificación del gene que se utiliza como sonda radioactiva

Los genes usados como sondas se obtuvieron por PCR tal y como se menciona en
(Chateigner-Boutin et al., 2008). Se utiliza un nucleótido marcado con fósforo radiactivo.
La mezcla de reacción se realiza de la manera siguiente: en un tubo eppendrof se
colocan 2 µl de una solución de 5 µg/ml de DNA, los oligonucleótidos de inicio y 12 µl
de agua, la mezcla se calienta a 95ºC por 5 minutos y se coloca en hielo se agrega
buffer de marcaje y la enzima Klenow. A continuación, en el área especialmente
acondicionada para trabajo con radiactividad, se agregan 3 µl de α32P-dCTP (10 µCi/µl,
act. esp. 370 MBq/ml). La mezcla de reacción se coloca en una caja de acrílico y se
incuba a 37ºC de 10 a 20 minutos. La sonda se desnaturaliza calentando a 95ºC por 10
minutos, se transfiere inmediatamente a hielo por 3 minutos y se centrifuga a 13,000
rpm por 30 segundos para recuperar la sonda y se agrega a la mezcla de hibridación.

40
5.13.3. Hibridación de la membrana

Las membranas se lavan con agua destilada para eliminar el exceso de azul de
metileno y se colocan en un tubo cilíndrico de vidrio con tapa de rosca. Donde se le
agrega una solución de prehibridación (ver apéndice) incubándose en agitación
continua a 65ºC por un mínimo de dos horas antes de agregar la sonda radiactiva
correspondiente. La membrana se deja hibridando de 6-24 horas en agitación continua
a 65ºC. Finalizada la hibridación, se retira la solución radiactiva y para eliminar la marca
no incorporada, las membranas se lavan sucesivamente en las mismas condiciones de
hibridación, con soluciones de SSC 2X, 0.5X y 0.1X con SDS 0.1% durante un mínimo
de 10 minutos en cada solución. Después de un enjuague final en SSC 0.1X sin SDS a
temperatura ambiente, las membranas húmedas se colocan en un cartucho fotográfico
para exponer una película radiográfica (Kodak film, Medical X-ray general purpose
Blue) a por al menos un día a -70ºC. La película se revela manualmente hasta la
aparición de la señal de autoradiografía.

5.14. RT-PCR

5.14.1. Reverso transcripción

Para la reverso transcripción del RNA (RT) y la amplificación por la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) se sigue el protocolo de M-MLV Reverse Transcriptase de
Invitrogen:
1.- Agregar 1 µl de oligo dT. De 1 ng a 5 µg de RNA total.1 µl de dNTPs 10 nM.
Llevar a 12 µl con agua destilada
2.- Calentar la mezcla a 65ºC por cinco minutos y transferir a hielo. Añadir 4 µl
de 5X First-Strand Buffer, 2 µl 0.1 M DTT y 1 µl de agua
3.- Mezclar suavemente los contenidos e incubar a 37ºC por dos minutos
4.-Añadir 1 µl de enzima M-MLV RT
5.- Incubar 50 minutos a 37ºC
6.- Inactivar la reacción incubando a 70ºC por 15 minutos.

Ahora el cDNA se puede usar como molde para la amplificación por PCR. El cDNA se
diluyó 1:10.

5.14.2. Condiciones PCR (alinear unidades debajo de unidades, etc)

H20 13.7 µl
Buffer PCR 10X 2.5 µl
MgCl2 50 nM 2.5 µl
dNTPs 10 mM 0.3 µl
Oligo Foward 1.0 µl
Oligo Reverse 1.0 µl
cDNA 1:10 2.0 µl
DNA polimerasa 2.0 µl

5.14.3. Lista de oligonucleótidos

Nombre del oligonucleótido