Analisis-de-la-fluorescencia-de-la-clorofila-a-en-la-busqueda-de-metabolitos-secundarios-con-posible-actividad-inhibitoria-en-la-fotosntesis-en-Guazuma-ulmifolia

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
 DE MÉXICO 
 
 FACULTAD DE CIENCIAS 
 
“ANÁLISIS DE LA FLUORESCENCIA DE LA 
CLOROFILA a EN LA BÚSQUEDA DE 
METABOLITOS SECUNDARIOS CON POSIBLE 
ACTIVIDAD INHIBITORIA EN LA FOTOSÍNTESIS 
EN Guazuma ulmifolia” 
 
 
 
 
 
 
T E S I S 
 
 QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
 BIOLOGO 
 P R E S E N T A : 
 
 ALONSO ZAVALETA FERNÁNDEZ DE 
CÓRDOVA 
 
 
 
 
 
 
 
DIRECTOR DE TESIS: 
DR. BLAS LOTINA HENNSEN 
2011 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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1. Datos del alumno. 1. Datos del alumno. 
Apellido paterno Zavaleta 
Apellido materno Fernández de Córdova 
Nombre(s) Alonso 
Teléfono 53 56 33 00 
Universidad Universidad Nacional Autónoma de México 
Facultad o escuela Facultad de Ciencias 
Carrera Biología 
Número de cuenta 404055413 
 
2. Datos del tutor 2. Datos del tutor 
Apellido paterno Lotina 
Apellido materno Hennnsen 
Nombre(s) Blas 
 
3. Datos del sinodal 1 3. Datos del sinodal 1 
Apellido paterno González 
Apellido materno Halphen 
Nombre(s) Diego 
 
4. Datos del sinodal 2 4. Datos del sinodal 2 
Apellido paterno Gavilanes 
Apellido materno Ruíz 
Nombre(s) Marina 
 
5. Datos del sinodal 3 5. Datos del sinodal 3 
Apellido paterno Iriarte 
Apellido materno Vivar Balderrama 
Nombre(s) María Silvia 
 
6. Datos del sinodal 4 6. Datos del sinodal 4 
Apellido paterno Cruz 
Apellido materno Ortega 
Nombre(s) Rocío 
 
7. Datos del trabajo escrito. 7. Datos del trabajo escrito 
Título Análisis de la fluorescencia de la clorofila a en 
la búsqueda de metabolitos secundarios con 
posible actividad inhibitoria en la fotosíntesis 
en Guazuma ulmifolia. 
Número de páginas 130 p 
Año 2011 
 
 
 
Reconocimientos: 
El presente trabajo se desarrollo en: 
Laboratorio 115, del Departamento de Bioquímica conjunto “E”, 
Facultad de Química de la UNAM, 
Ciudad Universitaria, D.F., México. 
Laboratorio de Bioenergética, Universidad de Ginebra, 
 Ginebra, Suiza. 
Alonso Zavaleta Fernández de Córdova recibió becas otorgadas por CONACYT (Proyecto 101521) y 
SEP Titulación (Folio: 20100083093, programa “Fortalecimiento al Programa de Becas 2010”). 
El presente trabajo fue financiado por el proyecto PAPPIT-DGAPA-UNAM (IN211309) 
Al Dr. Reto J. Strasser la asesoría brindada, supervisión, apoyo técnico y logístico durante la 
estancia realizada en el Laboratorio de Bioenergética de la Universidad de Ginebra, para el 
estudio de la fluorescencia de la clorofila a y la prueba de JIP. 
A la M. en C. Beatriz King Díaz, por el apoyo técnico brindado a lo largo de la realización del 
presente trabajo. 
A la Dra. Marina Gavilanes Ruíz por su asesoría para darle forma final al presente trabajo. 
Se agradece a la Dra. María Isabel Aguilar Laurents y al Dr. José Fausto Cruz por su apoyo 
técnico en los estudios fitoquímicos realizados para el presente trabajo. 
Agradecimientos: 
Primero que nada a mis Padres, quienes me apoyaron con su amor, tiempo y dedicación, además fueron los 
principales benefactores de todos mis proyectos. 
A continuación enlisto en orden cronológico a partir de los más recientes a las personas que contribuyeron 
para la culminación de mi Licenciatura. Menciono primero a las damas y después a los caballeros. 
A la Dra. Marina por su apoyo total, guía y tiempo que ha dedicado para mi formación y superación profesional. 
Incluyendo el apoyo económico brindado en múltiples ocasiones. 
Al Dr. Reto quien me “adoptó” como aprendiz, guiándome en el mundo de la fotosíntesis y ha confiado 
incondicionalmente en mí. 
A mi amigo Jorge quien ha sido confidente, compañero de batallas y con quien he compartido las derrotas y 
victorias en toda la carrera. 
A Flor, al Dr. Aceves y Lic. Guillen quienes me ayudaron para terminar en tiempo mis objetivos. 
A los Dres. Lupita Ortiz y el Dr. Javier Plascencia quienes me ofrecieron su ayuda incondicional sin ser su alumno. 
A mi amigo Ernesto Navarro quien me apoyo en mi estancia en el Lab. 115. Al igual que a Erick quien me ayudo 
muchas veces en mi travesía. 
Al Dr. Blas por abrirme las puertas de su laboratorio, brindarme la oportunidad de conocer el fascinante mundo 
científico internacional y guiarme durante la realización del presente trabajo. 
A la Profra. Bety King por invitarme a participar en el Lab. 115 asesorándome en todo momento. Así como 
introducirme al mundo de la fotosíntesis y la fluorescencia, pues sin esto, no habrían sido posibles los logros 
alcanzados con el presente trabajo. 
A los incontables compañeros que atravesaron las puertas de nuestro Lab. en estos últimos tres años. 
Al Dr. Rodrigo Garnica quien me permitió que recuperara el control de mi propia mente. 
A mis amigos Oliver, Mariana y Deborah que siempre estuvieron apoyándome desde que nos conocimos. 
A la Dra. Gloria Soberón quien fue mi primera tutora al recibirme en su laboratorio y me enseño las primeras bases 
de la investigación biológica. 
Finalmente a Michelle y Pedro. Michelle fue quien me introdujo al mundo de la Ciencia. Y a Pedro quien me “forzó” 
a abrazar la Ciencia como profesión y que sin ellos no estaría donde me encuentro actualmente. 
 i
CONTENIDO 
 
 
 
CONTENIDO i 
Índice de Figuras ii 
Índice de Tablas iii 
 
RESUMEN vi 
 
Capítulo 1. INTRODUCCIÓN 1 
 
Capítulo 2. ANTECEDENTES 3 
2.1 Agentes herbicidas. Definición, importancia y problemática actual. 3 
2.2. Metabolismo secundario de las plantas como fuente para el descubrimiento 
de nuevos compuestos herbicidas. 
5 
 
2.2.1. Metabolismo secundario y su estudio fitoquímico. 5 
2.2.2. Alelopatía. 7 
2.3. Fotosíntesis como blanco de acción de agentes herbicidas. 10 
2.3.1. El proceso fotosintético. 10 
2.3.2. La emisión de la fluorescencia de la clorofila a como metodología para el 
estudio de la fotosíntesis. 
13 
2.3.3. Prueba de JIP. 18 
2.3.4. Análisis de la prueba de JIP 25 
2.4. Guazuma ulmifolia. 26 
2.4.1. Biología de la planta G.ulmifolia 26 
2.4.2. Usos de la G.ulmifolia 28 
2.4.3. Fitoquimica de la G.ulmifolia 29 
2.4.4. Consideraciones finales a la fitoquímica de la G.ulmifolia. 32 
 
Capítulo 3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y OBJETIVOS 33 
3.1. Planteamiento del problema. 33 
3.2. Hipótesis 33 
3.2 Objetivo general 33 
3.3 Objetivos particulares 34 
 
Capítulo 4. DESARROLLO EXPERIMENTAL 35 
4.1. Material vegetal 35 
4.2. Fase 1: Ensayos tamizado. 35 
4.2.1. Fraccionamiento primario de la planta G.ulmifolia 35 
4.2.2. Prueba de síntesis de ATP in vitro en cloroplastos aislados de espinaca 
(Spinacea olereaceae L.). 
35 
4.2.2.1. Aislamiento de los cloroplastos de espinaca 35 
4.2.2.2. Cuantificación de la clorofila 36 
4.2.2.3. Medición de la síntesis de ATP 36 
4.2.3. Ensayo de la prueba de JIP para extractos orgánicos activos. 37 
4.2.3.1. Preparación con material vegetal para las pruebas in vivo. 37 
4.2.3.2. Ensayos in vivo de la prueba de JIP en T. alexandrinum y E. crussgalli. 38 
4.2.3.3. Ensayos in vivo de la prueba de JIP en Phaseolus vulgaris. 38 
4.2.3.4. Ensayos in vivo de la prueba de JIP en Lemna valdiviana. 39 
4.2.3.5.Procesamiento matemático y estadístico de los datos de la prueba de JIP. 39 
4.2.3.6 Determinación de la biomasa seca. 39 
4.3. Fase 2: Fraccionamiento biodirigido del extracto clorofórmico de hojas de la 
planta G.ulmifolia. 
40 
4.3.1. Fraccionamiento cromatográfico. 40 
 ii
4.3.2. Detección de la fracción activa del extracto clorofórmico de hojas de 
G.ulmifolia. 
41 
4.4. Fase 3: Determinación del mecanismo de acción de la fracción activa. 42 
4.4.1. Preparación del material vegetal plantas de chile (Capsicum annum) 42 
4.4.2. Ensayos in vivo de la prueba de JIP en plantas de chile: prueba de los 
Alelotubos 
43 
4.4.3. Ensayos de la prueba de JIP en discos de hojas de plantas de chile. 44 
4.4.4. Análisis matemático y estadístico de los datos de la prueba JIP. 45 
4.5 Fase 4: Purificación de la fracción activa y corroboración del mecanismo de 
acción. 
45 
4.5.1. Purificación de la fracción activa. 46 
4.5.2. Pruebas para la identificación de los componentes de la fracción activa 46 
4.5.3. Análisis espectroscópicos. 46 
 
Capítulo 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 47 
5.1 Esquema metodológico para la caracterización de aleloquímicos inhibitorios 
en la fotosíntesis. 
47 
5.1.2 Selección de la G.ulmifolia 47 
5.2. Ensayo de síntesis de ATP 49 
5.3. Ensayos in vivo con prueba de JIP y análisis estadístico de los mismos. 49 
5.4. Determinación del mecanismo de acción de los extractos orgánicos. 58 
5.5 Consideraciones al procesamiento estadístico de los datos: exploración, 
limpieza y validación. 
62 
5.5 .1. El caso de los índices de desempeño fotosintético. 68 
5.6 Ensayo de síntesis de ATP para el fraccionamiento biodirigido 69 
5.7 Prueba de los alelotubos y análisis estadístico de los mismos. 71 
5.8 Prueba de JIP en discos de hoja y análisis estadístico de los mismos. 80 
5.9 Mecanismo de acción de la fracción activa Fb 82 
5.10 Corroboración de mecanismos entre extracto y Fb. 89 
5.11 Rendimiento e Identidad de la fracción activa Fb. 90 
5.12 Propuesta para la caracterización de aleloquímicos inhibitorios en la 
fotosíntesis. 
91 
 
Capítulo 6. CONCLUSIONES 98 
 
APENDICES 100 
Apéndice 1: Información etnobotánica de G.ulmifolia 101 
Apéndice 2: Medios 104 
Apéndice 3: Parámetros de la prueba de JIP 105 
Apéndice 4: Apéndice 4: Espectro del infrarojo de la Fb. 108 
 
Referencias 109 
 
 
Índice de Figuras 
 
Figura 1 Funciones ecológicas del metabolismo secundario 6 
Figura 2 
Inducción de compuestos aleloquímicos por estrés ambiental y formas 
de difusión 9 
 
Figura 3 
 
(a) Estructura del cloroplasto de plantas vasculares. (b) Micrografía de 
un cloroplasto 11 
Figura 4 Diagrama Z de la fotosíntesis. 13 
 
Figura 5 
Espectros de absorción de algunos pigmentos y emisión de la 
fluorescencia de la clorofila a 16 
 iii
 
Figura 6 Curva de inducción de la fluorescencia de la clorofila a de Kautsky 20 
Figura 7 
 
Curva OJIP de inducción de la fluorescencia de la clorofila a vista en 
escala no logarítmica 20 
Figura 8 Curva OJIP de inducción de la fluorescencia de la clorofila a. 21 
Figura 9 
 
Relación entre procesos fotosintéticos con la curva OJIP de inducción 
de la fluorescencia de la clorofila a. 23 
Figura 10 Relación entre la curva OJIP y el esquema Z. 24 
 
Figura 11 
 
Cascada energética de la fotosíntesis y las ecuaciones derivadas para 
el cálculo de los rendimientos entre los flujos energéticos. 25 
 
Figura 12 
 
Fotografía de G.ulmifolia 27 
Figura 13 
 
Distribución geográfica de G.ulmifolia en la Republica Mexicana. En rojo 
se marcan los estados en donde se ha reportado la existencia de la 
G.ulmifolia. 
28 
 
Figura 14 
 
Cromatogramas obtenidos para la Fb tras el fraccionamiento primario. 42 
 
Figura 15 
 
 Sistema experimental 43 
Figura 16 
 
A. Diagrama de medición de la hoja de chile tratado. B Iluminación 
verde empleada para determinar fluorescencia. 44 
Figura 17 Sistema experimental para prueba en discos de hoja. 45 
 
Figura 18 
 
Diagrama de la ruta critica. 48 
 
Figura 19 
 
Curva de inhibición en la síntesis de ATP. 49 
 
Figura 20 
 
Valores promedio ± D.E de los puntos O, L, K, J, I y P de los ensayos 
en T. alexandrinum a lo largo de las 72 h de tratamiento. 50 
 
Figura 21 
 
Valores promedio ± D.E de los puntos O, L, K, J, I y P de los ensayos 
en E. crussgalli a lo largo de las 72 h de tratamiento. 51 
Figura 22 
Valores promedio ± D.E de los puntos O, L, K, J, I y P de los ensayos 
en P. vulgaris a lo largo de las 72 h de tratamiento. 52 
 
Figura 23 
 
Valores promedio ± D.E de los puntos O, L, K, J, I y P de los ensayos 
en L. valdiviana a lo largo de las 72 h de tratamiento. 53 
Figura 24 Curva OJIP promedio para T.alexandrinum para las 72 h de tratamiento 55 
Figura 25 Curva OJIP promedio para E.crussgalli para las 72 h de tratamiento. 55 
Figura 26 Curva OJIP promedio para P.vulgaris para las 72 h de tratamiento. 56 
Figura 27 Curva OJIP promedio para L.valviviana para las 72 h de tratamiento. 56 
Figura 28 
 
Gráficas de radar que muestran los valores de los parámetros 
fotosintéticos basados en las curvas promedio para a.)T. alexandrinum 
b.) E. crussgalli. c) P. vulgaris y d) L. valviviana. 
59 
Figura 29 Curvas experimentales y promedio de un tratamiento x 65 
 
65 
A
Q −⎡ ⎤⎣ ⎦
 iv
 
Figura 30 
Gráfica de cajas mostrando la dispersión de los datos de los pasos O, 
L, K, J, I y P 66 
 
Figura 31 
 
Gráfica de barras en donde se compara el promedio del set completo y 
filtrado para cada unos de los pasos de la Curva OJIP ± D.E. 67 
 
Figura 32 
 
Curva de inhibición en la síntesis de ATP en función a la concentración 
en ppm para la fracción Fb. 71 
 
Figura 33 
 
Valores promedio ± D.E de los puntos O, L, K, J, I y P de los ensayos 
en C. annum a lo largo de las 72 h de tratamiento. 72 
 
Figura 34 
 
Gráfico de Q-Q para los pasos O, L, K, J, I y P de una población control 
de C. annum . 76 
Figura 35 Curvas promedio para cada tiempo de las plantas tratadas con Fb. 79 
 
Figura 36 
 
Gráfica de radar para los valores promedio de control y tratamiento de 
50 ppm de Fb de los pasos O, L, K, J, I y P normalizados al tiempo 0 h 
para los discos de hoja. 
80 
 
Figura 37 
 
Tabla de MANOVA con post hoc de Bonferrioni para el control en donde 
se compara el tiempo de 0 h con respecto a los demás. 82 
Figura 38 
 
Gráfica de radar para los valores promedio de control y tratamiento de 
50 ppm de Fb lavada de los pasos O, L, K, J, I y P normalizados al 
tiempo 0 para los discos de hoja 
82 
Figura 39 
 
Cinética promedio de los cambios en fluorescencia de la clorofila a 
expresada fluorescencia variable relativa del tratamiento de Fb a las 48 
horas. 
85 
Figura 40 
 
Cinética promedio de los cambios en fluorescencia de la clorofila a 
expresada fluorescencia variable relativa del tratamiento de Fb a las 48 
horas. Calculo obtenido con una ganancia de 15. 
86 
Figura 41 Mecanismo de acción. 88 
 
Índice de Tablas 
 
Tabla 1 Compuestos reportados producidos por G.ulmifolia. 30
 
Tabla 2 
 
Fracciones de la columna cromatográfica abierta del extracto 
clorofórmico de hojas. 41
Tabla 3 Valores del I50 de los extractos orgánicos en la síntesis de ATP 49
Tabla 4 
 
Comparativa de algunos parámetros de la fluorescencia y de la prueba 
JIP calculados a partir de la media lineal de cada parámetro y la curva 
promedio 
65
Tabla 5 
 
Comparativa de algunos parámetros de la fluorescencia y de la prueba 
JIP calculados a partir de la media lineal de cada parámetro y la curva 
promedio 
68
 
Tabla 6 
 
Fracciones obtenidas con rendimientos suficientes. 70
 
Tabla 7 
 
Tabla de MANOVA con post hoc de Bonferrioni para el control en 
donde se compara el tiempo de 0 horas con respecto a los demás 77
 
Tabla 8 
 
Tabla de MANOVA con post hoc de Bonferrioni para el control en 
donde se compara el tiempo de 0 horas con respecto a los demás. 78
 v
Tabla 9 
 
Tabla de MANOVA conpost hoc de Bonferrioni para el control en 
donde se compara el tiempo de 0 horas con respecto a los demás. El 
valor a p < 0.05. 
81
 
 vi
RESUMEN 
 
La producción suficiente de alimento es una de las preocupaciones constantes en el modelo 
productivo de la agricultura. Para optimizar la producción se han desarrollado métodos y 
herramientas, siendo un ejemplo de éstos el uso de herbicidas. Los herbicidas son químicos que 
tienen como finalidad el combatir a las malezas alterando los procesos fisiológicos. Sin embargo, 
estos químicos por lo general son dañinos para otros organismos y afectan el equilibrio ecológico 
del medio, además de que después de un uso intensivo, las malezas sometidas a éstos pueden 
generar resistencia. Por tanto, es necesaria la búsqueda de nuevas moléculas herbicidas 
químicas, menos contaminantes y con mecanismos de acción novedosos. Uno de los posibles 
sitios de acción es la fotosíntesis, la cual es el proceso fisiológico de las plantas más importante ya 
que les provee de energía. Por tanto, moléculas que tengan como blanco de acción de este 
proceso, son deseables para el desarrollo de futuros herbicidas. 
El principal problema en el estudio los mecanismos de acción de compuestos en la fotosíntesis 
radica en que generalmente es necesario analizar sus componentes in vitro. Una alternativa son 
los métodos que emplean la emisión de fluorescencia de la clorofila a, los cuales son métodos 
altamente precisos y no invasivos. Dentro de éstos se encuentra la prueba de JIP, la cual es un 
método poderoso que permite calcular el flujo energético de los principales procesos que ocurren 
en los fotosistemas I y II. 
La prueba de JIP en la caracterización del efecto inhibitorio de moléculas ha sido ampliamente 
empleados, sin embargo el uso de ésta como principal prueba en el fraccionamiento biodirigido en 
la búsqueda de nuevos compuestos inhibitorios han sido escasos. De hecho dicha metodología ha 
sido empelada esencialmente como un método accesorio o simplemente confirmación. 
El presente trabajo propone una metodología para el empleo de la prueba de JIP como principal 
prueba en el fraccionamiento biodirigido de compuestos vegetales, empleando el ejemplo de la 
planta Guazuma ulmifolia. Se describen pruebas experimentales, implicaciones teóricas, así como 
la toma de decisiones basada en criterios estadísticos que son apliados en el uso del 
fraccionamiento biodirido. El trabajo se enfoca en la caracterización del efecto inhibitorio de 
extractos y fracciones activas de Guazuma ulmifolia utilizando la prueba de JIP, para que en el 
futuro pueda ser empleada en la búsqueda de metabolitos secundarios con posible actividad 
herbicida. 
 1
I. INTRODUCCIÓN 
 
Una de las actividades más antiguas de la humanidad ha sido la agricultura, de hecho, fue 
ésta la responsable de la sedentarización de las primeras comunidades humanas que dieron 
origen a las primeras civilizaciones. Tras varios milenios de poner en práctica esta actividad, 
el ser humano ha desarrollado un conjunto de técnicas que garantizan la producción de 
alimentos (Welch & Graham 1999). Durante la Segunda Guerra Mundial apareció un 
compuesto conocido como el acido 2,4-diclorofenoxiacético, el cual garantizaba un aumento 
en la productividad y la disminución de trabajo h hombre, pues eliminaba de forma eficiente a 
las malezas en los campos de cultivos. Este descubrimiento dio pie al desarrollo de un 
conjunto de compuestos llamados herbicidas (Sung & Quatsel 1979). Los compuestos 
garantizaban la eliminación de maleza para así disminuir la competencia de éstas con 
respecto a las plantas cultivadas. Sin embargo su uso intensivo durante el siglo XX acarreó 
una serie de problemas ambientales como: contaminación de cuerpos de agua, extinción de 
especies, infertilidad de suelos, entre otras, los cúales generaron a su vez problemas sociales 
de la salud pública debido a la la toxicidad y bioacumulación de los compuestos herbicidas en 
los cultivos de consumo, llegando la situación a un punto crítico a mediados de los años 
noventa (Readman et al. 1993). Desde entonces, el mercado ha estado en una constante 
búsqueda de nuevos y más seguros herbicidas. 
A principios de los años noventa un conjunto de investigadores propusieron que una forma 
de obtener nuevos herbicidas y más seguros era a través del desarrollo de la investigación de 
los aleloquímicos (Macías 1995), los cuales son compuestos naturales producidos por las 
plantas. Sin embargo su caracterización, extracción y búsqueda es complicada debido a que 
cada compuesto tiene mecanismos de acción y sitios blanco diferentes en la fisiología de los 
organismos. Por lo anterior es necesario tener un “arsenal” de técnicas y metodologías que 
permitan identificar de forma precisa y rápida la posible existencia y sitio de interacción de 
estas moléculas. 
Siendo que la fotosíntesis es el proceso energético y metabólico más importante de las 
plantas, pues provee energía y acumulación de biomasa (Archer y Barber 2004), herbicidas 
que tengan como sitio de acción este proceso son deseables. La localización y 
caracterización de aleloquímicos inhibitorios es por tanto un campo fértil de investigación. 
Existe un inconveniente en la búsqueda de los aleloquímicos con posible actividad herbicida 
en la fotosíntesis, ya que su identificación y caracterización es compleja. Ésto se debe a que 
la mayor parte de las metodologías para el estudio de la fotosíntesis requiere un equipo 
especializado, generalmente muy costoso y que en su mayoría sólo permiten acceder a la 
maquinaria fotosintética a nivel molecular, lo cual solamente se lograba unicamente a partir 
de técnicas in vitro para la fase luminosa de la fotosíntesis. Sin embargo, este problema tuvo 
 2
una nueva alternativa cuando Strasser et al. en 1995, desarrollaron un nuevo método que 
permite el análisis de la eficiencia fotosintética que podría ser usada in vivo e in vitro, 
denominada prueba de JIP (nombre tomado a partir de la curva de inducción de fluorescencia 
de la clorofila a OJIP). Este análisis fue posteriormente empleado por Lotina-Hennsen et al. 
(2007) para el estudio de aleloquímicos con actividad herbicida sobre la fotosíntesis. 
La prueba de JIP utiliza la señal fluorescente que emite la molécula de clorofila a al ser 
irradiada por un haz de luz actínica. Dicha señal describe una curva polifásica que puede ser 
analizada para conocer el estado de los eventos fotosintéticos tanto del fotosistema I como 
del II (PSI y PSII) (Strasser et al. 1995, 2000, 2004, Schansker et al. 2005, Tsimilli-Michael 
and Strasser 2008). Sin embargo, el análisis de la información es extenso y complejo, lo que 
dificulta el tratamiento estadístico de los datos producto de la misma heterogeneidad de la 
muestra de cloroplastos en un tejido fotosintético, se puede ocultar el efecto de los 
herbicidas. Por tanto es importante tener un método estandarizado que permita caracterizar 
de una manera precisa y verídica el efecto de los posibles aleloquímicos con actividad en la 
fotosíntesis. 
El presente estudio está dirigido hacia la búsqueda de aleloquímicos con actividad herbicida 
en la fotosíntesis que puedan ser estudiados mediante la metodología de la prueba de JIP. 
Por tanto, el fin del presente trabajo es mostrar cómo la información de esta prueba debe ser 
procesada y empleada para la identificación de futuros compuestos. Para ello, primero se 
realizó un fraccionamiento biodirigido en la búsqueda de nuevos quimicos con actividad 
herbicida en Guazuma ulmifolia, como ejemplo del uso de esta metodología en la búsqueda 
de nuevos químicos responsables de la actividad herbicida. Es destacable en este punto, que 
si bien este estudio está intrínsecamente relacionados con los estudios fotoquímicos, pues en 
el presente trabajo se empleó tanto un extracto orgánico y una fracción activa de este 
fraccionamiento,el propósito no es la caracterización de un compuesto en específico, sino en 
ilustrar cómo es que la prueba de JIP debe de ser utilizada para la identificación de tales 
compuestos. 
 
 
 3
II. ANTECEDENTES 
 
2.1 Agentes herbicidas. Definición, importancia y problemática actual. 
 
El continúo aumento tanto en el tamaño de la población como en la demanda de alimento son 
dos problemas que van íntimamente ligados. Por ello, el aumentar o mantener los niveles de 
producción agrícola es uno de los objetivos centrales en la agricultura moderna. En los 
últimos años, la humanidad ha adicionado un segundo objetivo a la producción agrícola, que 
es vivir en un medio más sano (Acuña Chinchilla 2000). Al parecer, el concepto de alta 
productividad y bajo impacto ambiental ha demostrado ser prácticamente incompatibles. Por 
tanto es menester (primario) encontrar nuevos y más seguros herbicidas y pesticidas, para 
así aumentar la productividad agropecuaria, sin que ésto comprometa su rendimiento neto 
(Levin 2006). Para dicho objetivo se ha promovido la capacitación, la investigación, la 
certificación y la inspección para inducir un uso racional de plaguicidas. (Acuña Chinchilla 
2000). Los herbicidas utilizados en cualquier producción agrícola son parte inherente de ese 
sistema de producción, al cual Hart (1985) conceptualiza como “[…] una unidad funcional 
conformada por el suelo, el cultivo, las enfermedades, las plagas y las malezas […]” 
considerando los aspectos socioeconómicos como complemento (Acuña Chinchilla 2000). 
Por tanto es importante definir dos conceptos centrales para el presente trabajo: herbicidas y 
malezas. 
Un herbicida se define como una sustancia química, normalmente orgánica, que interfiere en 
mayor o menor grado en el normal desarrollo de las plantas (García y Fernández – 
Quintanilla 1991, Acuña Chinchilla 2000). Mientras que una maleza se define como una 
especie de planta en un lugar inadecuado o indeseable; o que compite con los cultivos. 
(García y Fernández – Quintanilla 1991, Acuña Chinchilla 2000). 
Al tener claros estos conceptos, es posible entender que los herbicidas forman parte de los 
factores que intervienen en un agro-ecosistema, y por lo tanto, se requiere no sólo tomar en 
cuenta los factores productivos, sino que también los ambientales (Acuña Chinchilla 2000). 
Las pérdidas anuales causadas por las malezas en la agricultura de los países en desarrollo 
han sido estimadas en el orden de 125 millones de toneladas de alimentos, cantidad 
suficiente para alimentar 250 millones de personas (Parker y Fryer 1975). Esto es debido a 
que las malezas compiten con las plantas cultivables por los nutrientes del suelo, agua y luz 
(Labrada y Parker 1996). Estas plantas indeseables también sirven de hospederas a insectos 
y patógenos dañinos a las plantas cultivables (Labrada y Parker 1996), y sus exudados 
radicales y lixiviados foliares resultan ser tóxicos a las plantas cultivables (ver Apartado 2.2.2. 
Alelopatía) (Labrada y Parker 1996). Las malezas también obstruyen el proceso de cosecha y 
aumentan los costos de operaciones. Además, al momento de la cosecha, las semillas de las 
 4
malezas contaminan la producción obtenida (Labrada y Parker 1996). De esta forma, la 
presencia de las malezas en áreas cultivables reduce la eficiencia de la fertilización y la 
irrigación, facilita el aumento en la densidad de otras plagas y al final, los rendimientos 
agrícolas y su calidad decrecen severamente (Labrada y Parker 1996). 
Por tanto se puede apreciar que el uso de los herbicidas no es algo de lo que la agricultura 
pueda prescindir simplemente. Los granjeros, como todo hombre de negocios, tomaran 
decisiones en el contexto de su empresa y el uso de herbicidas probablemente sea una 
constante en su diseño productivo. 
Si bien existen varios métodos de control de malezas (Labrada y Parker 1996) el control 
químico ha demostrado ser la clave del éxito en la agricultura de los países desarrollados en 
las últimas décadas. Sin embargo, los herbicidas presentan dos problemáticas 
fundamentales: el desarrollo de resistencia por parte de las malezas y la toxicidad de los 
mismos. Antes de que un nuevo herbicida pueda venderse en cualquier país (en teoría), 
tienen que suministrarse datos adecuados que demuestren que es seguro para que sea 
manipulado por el operador, y que los consumidores de los cultivos tratados no están bajo 
riesgo (Caseley 1996). La toxicidad también debe ser contemplada en relación al ambiente, 
ya que el uso de estos agroquímicos pueden difundirse a los cuerpos de agua o pueden estar 
presente en la parte cosechada del cultivo y ser consumidos directamente o a través de 
productos animales y a su vez afectar a otros organismos (como insectos, peces, aves y 
mamíferos) (Caseley 1996, Acuña Chinchilla 2000) También pueden ser biotransformados en 
nuevos compuestos que pueden resultar tóxicos en algunos de los niveles de un ecosistema 
(García y Fernández – Quintanilla 1991, Acuña Chinchilla 2000). 
Por otro lado, el uso intensivo de herbicidas tiende generalmente a provocar la presencia de 
especies tolerantes o resistentes (Labrada y Parker 1996) conllevando a problemas graves 
que se tornan en desbalances ecológicos a nivel trófico difíciles de solucionar. (Acuña 
Chinchilla 2000). Si se genera resistencia, será necesaria una aplicación herbicida post-
emergente suplementaria (Labrada R. y Parker C. 1996), lo que genera un círculo vicioso 
pues aumenta: costos, la concentración del compuesto en el ambiente y los riesgos 
anteriormente mencionados (Caseley1996, Labrada y Parker 1996, Acuña Chinchilla 2000). 
Adicional a lo anterior, otra de las características deseables es la selectividad, la cual se 
define como aquel agente herbicida activo sobre ciertas especies (susceptibles) y no sobre 
otras (tolerantes) a las dosis recomendadas. Cuando se emplean dosis muy elevadas, los 
herbicidas selectivos pueden comportarse como no selectivos o totales (García y Fernández 
– Quintanilla 1991, Acuña Chinchilla 2000). 
Por todo lo anterior es necesaria la constante búsqueda de nuevas moléculas herbicidas 
pues existe una carrera “armamentista” entre la agricultura y las malezas, y que además de 
buscar sitios y mecanismos de acción novedosos ofrezcan una baja toxicidad tanto para el 
 5
humano como para el medio ambiente gracias a la imperiosa necesidad de sanear las 
actividades humanas para mantener el equilibrio de la naturaleza. 
 
2.2. Metabolismo secundario de las plantas como fuente para el descubrimiento de 
nuevos compuestos herbicidas. 
 
2.2.1. Metabolismo secundario y su estudio fitoquímico. 
 
Una forma que se tiene para encontrar nuevos herbicidas es la investigación Fitoquímica, que 
tiene como finalidad describir nuevos compuestos que pueden tener actividad biológica útil. 
(Pieters y Vlietinck, 2005). Esto se logra analizando los diferentes compuestos que 
naturalmente son producidos por las plantas. Estas moléculas, generalmente denominados 
productos naturales o metabolitos secundarios (Hartmann, 2007), juegan un papel 
importante en la fisiología y relaciones ecológicas de los organismos que los producen. 
(Rosenthal 1982, 1991; Hartman 2007). Durante las ultimas dos décadas la razón por la cual 
a estos compuestos se les denomina “secundarios” ha sido objeto de controversias, ya que 
en un principio se les designó así ya que se son productos del metabolismo que no 
pertenecen a las rutas metabólicas para la formación de nuevas células (rutas del 
metabolismo primario) (Hartmann 2007). Originalmente, la existencia de estos compuestos 
se explicaba como simples desechos o productos de destoxificación (Peach 1950; Reznik 
1960; Hartman 2007), hasta que en la década de los ochentas se les consideró como 
productos del mecanismo de desviación metabólica, o como una simple expresión de la 
diversidad bioquímica de lasplantas, o como vestigios de las rutas metabólicas ancestrales y 
como el “patio de evolución bioquímica” (Hartman 2007). Sin embargo, con el avance y 
desarrollo de la Ecología Química se le dio a los metabolitos secundarios una función 
ecológica y su origen fue finalmente atribuido a las presiones de selección a las cuales las 
plantas están sometidas (Hartman 2007). 
Si bien se le conoce como metabolito secundario a cualquier producto de las rutas 
metabólicas que no son vitales para la supervivencia del organismo que las posee, con el 
avance científico se han llegado a esclarecer las posibles funciones que denominamos como 
“no vitales” y que juegan un papel importante en la adecuación de la especie que las posea. 
Reznik en 1960 propuso un esquema que englobara los procesos funcionales del 
metabolismo secundario en las plantas, dicho esquema fue posteriormente actualizado por 
Hartman en 1996 y en el presente texto se presentan dos modificaciones más a este 
esquema, con el fin de actualizar las ideas sobre la posición de la Alelopatía en el aspecto 
funcional de las plantas. La primera con el fin de destacar a la producción de compuestos 
herbicidas como método de competencia y la segunda otorgándole una función de 
 6
estimulación y comunicación, lo cual se explicara a mayor detalle en el apartado 2.2.2. 
(Figura 1.) 
 
Figura 1. Funciones ecológicas del metabolismo secundario propuestas por Reznik (1960), ampliado por Hartman 
(1996) y por modificado para presente trabajo. En el círculo central se encierra la ruta energética que suministra 
energía y biomasa, seguido de los grupos de rutas del metabolismo primario que se encargan de procesar a las 
biomoleculas. Los derivados de cada uno de estos grupos se muestran en el círculo exterior. En amarillo se 
marcan los grupos de las principales las funciones ecológicas. En rosa se mencionan algunos ejemplos de 
funciones en las que los metabolitos secundarios están implicados. 
 Las características inherentes de los metabolitos secundarios al poseer una alta 
plasticidad genética y diversidad, garantizan adaptaciones flexibles para las plantas (ya que 
al no ser vitales pueden ser modificadas de forma continua), las cuales son necesarias en un 
medio cambiante (Hartman 2007). 
Se cree que a nivel evolutivo estas rutas surgieron como modificaciones de las rutas 
primarias, pues genes que codificaban a enzimas del metabolismo primario se duplicaron y 
posteriormente adquirieron modificaciones a sus funciones originales (posiblemente 
favorecida por la diversidad funcional de la familia de genes) o funciones radicalmente 
nuevas (Hartman 2007). Así el metabolismo secundario surge por la necesidad intrínseca de 
los organismos para responder a las exigencias del medio ambiente. 
Como se puede apreciar en la Figura 1, uno de los tantos componentes de las funciones de 
metabolismo secundario en plantas es la Alelopatía. En el siguiente apartado se desarrollará 
más a detalle este concepto, pero es importante resaltar en este punto que, al gozar de toda 
una diversidad metabólica de compuestos con actividad biológica, las plantas, por tanto, 
deben tener al menos un ejemplo de compuestos que les permitan competir directamente 
 7
entre ellas. Y que a nivel evolutivo, el poseer dichas características ofrecerá evidentemente 
una ventaja sobre aquellas que carezcan de éstas. Por tanto, tras el surgimiento de una ruta 
metabólica de algún compuesto fitotóxico, éste sería fijado por la selección natural. 
 
2.2.2. Alelopatía. 
 
Generalmente la Alelopatía es entendida como el efecto dañino de una planta sobre otra 
planta mediante la liberación de químicos en el ambiente. Sin embargo, han existido 
modificaciones a este concepto a lo largo del tiempo y existe en la actualidad una confusión 
en el uso de este término (Willis 2007). Para fines prácticos de este trabajo, este concepto es 
suficientemente valido, sin embargo una breve explicación se dará en este apartado. 
El término Alelopatía surge de la palabra alemana Allelopathie y fue acuñado por el Prof. 
Hans Molisch, un fisiólogo vegetal austriaco en 1937 (Willis 2007). Las raíces griegas de este 
concepto son: allelon, que significa “mutuo” o “entre ambos”, y pathos, que significa 
“sufrimiento” o “sensación” (Willis 2007). Dicho concepto tenía originalmente la connotación 
del efecto que ejerce una planta sobre otra (Willis 2007), aunque sería incorrecto pensar que 
Molisch fuese el fundador de la Alelopatía moderna, como explica Willis en su libro History of 
Allelopathy. 
 Molisch, sin embrago, concibió, tanto el efecto estimulatorio, como el efecto inhibitorio, ya 
que sabia que casi cualquier sustancia que es un inhibidor de algún proceso de la fisiología 
de un organismo expuesto a ésta, a una concentración en particular será muy probablemente 
un estimulante a una concentración sumamente mayor y viceversa (Willis 2007). Este efecto 
dual de las sustancias es comúnmente denominado hormesis, y fue descrito por Paracelusus 
en el siglo XVI (Duke et al 2006, Willis 2007). Por tanto el efecto solamente negativo, 
comúnmente encontrado en los textos no especializados en el tema sólo definen una cara del 
fenómeno de la Alelopatía. 
 En 1968, un subcomité del International Biological Program, hizo el primer intento de 
homogeneizar el concepto entre la comunidad científica y llegó al acuerdo de introducir el 
concepto de aleloquímicos, el cual era más global e incluía también los aspectos 
estimulatorios producidos exclusivamente por las plantas que afectaran a otras plantas y 
animales (Willis 2007). Whittaker y Fenney (1971) publicaron en Science un trabajo en 
donde definían a los aleloquímicos como el dominio de todas las interacciones entre 
organismos (Willis 2007). Posteriormente, Rice (1984) redefinió a la Alelopatía como 
“cualquier efecto directo e indirecto, nocivo o benéfico por una planta (incluyendo 
microorganismos) sobre algún otro a través de la producción de compuestos químicos que 
escapan hacia el ambiente” (Willis 2007). Willis (ver Willis 2007) explica ampliamente la 
controversia entre los estudiosos del tema, aunque probablemente lo más acertado por el 
 8
momento sea aceptar la definición de Alelopatía de la Asociación Internacional de Alelopatía 
que la define como “Cualquier proceso que involucra la producción de metabolitos 
secundarios producidos por plantas, bacterias, algas y hongos que influencie el crecimiento y 
desarrollo de un sistema de agricultura o biológico” (esta definición surgió en el 1er Congreso 
de Alelopatía, para mayor información consultar Reigosa et al. 2006). 
Debido a que este trabajo esta orientado a la búsqueda de moléculas con potencial herbicida 
producidas por una planta en particular, principalmente nos enfocaremos en la parte de la 
Alelopatía en donde la interacción es planta-planta y de tipo dañina. 
La competencia y la Alelopatía son mecanismos de interacción planta-planta que han sido 
demostrados, tanto en campo, como a nivel experimental (Myster 1992) y generalmente uno 
de ambos procesos puede verse eclipsado por el otro, ya que las plantas están sometidas a 
la competencia (al igual que todos los organismos), pues ésta es una constante en la 
existencia misma. Y la existencia de aleloquímicos en una planta seguramente garantizaría 
ventajas en la competencia por luz, nutrientes y agua. Por lo cual es difícil muchas veces 
identificar la ocurrencia de la Alelopatía. 
Willis definió en 1985 seis criterios básicos para identificar un aleloquímico, los cuales son 
difíciles de reunir en la mayoría de los estudios (Blum 1999), y son: 
1. Debe de existir un patrón de inhibición de una especie a otra. 
2. El agresor putativo debe producir una toxina. 
3. Debe existir un modo de liberación de la toxina. 
4. Debe exisitir transporte o acumulación de la toxina en el medio. 
5. La planta afectada debe de tenermedios para absorber la toxina. 
6. El patrón de inhibición observado de inhibición no debe ser producto de competencia 
física u otro factor biótico. 
Adicional a todo lo anterior se encuentran reportes sobre la aparición de Alelopatía, pues se 
ha observado que ésta se da generalmente ante un estímulo o una situación en particular. Un 
ejemplo de ésto sería el caso del Oryza sativa (arroz) el cual se ha visto, que produce 
metabolitos secundarios en ciertas condiciones de estrés (Kim y Shin 2004). Esto dificulta 
aun más el reconocer la presencia de algunos metabolitos secundarios. 
Por tanto, es extremadamente difícil demostrar la influencia de la Alelopatía en la naturaleza 
dada la complejidad de la interferencia de las plantas, la cual incluye efectos positivos, 
negativos y neutros entre las mismas (Christensen, 1993). 
Los compuestos alelopáticos producidos por las plantas son liberados de éstas al ambiente 
por medio de la exudación de las raíces, lixiviación, volatilización o descomposición de los 
residuos de las plantas en el suelo (Kim y Shin 2004) (ver Figura 2) 
 9
 
Figura 2: Procesos de inducción (por diferentes estímulos), producción, transporte, exposición y respuesta 
alelopática de compuestos producidos por plantas. (Tomada de Kim y Shin 2004) 
 
De tal forma que la interacción planta-planta que originalmente se concibe como una 
competencia, en realidad es un proceso producto de la combinación de la competencia por 
los recursos (natural) y la producción de compuestos alelopáticos que suprime los 
competidores (Duke et al. 2001). 
Las implicaciones económicas de la Alelopatía y la investigación sobre ésta pueden ser 
resumidas en tres puntos: 
• El conocimiento de nuevos aleloquímicos y su mecanismo de acción es clave para 
la exploración del uso de los mismos como herbicidas. Ésto usualmente ofrece 
herramientas para combatir la evolución de resistencias a biocidas de malezas 
actualmente utilizados y alternativas para aquellos para los cuales la resistencia 
ya existe (Harper 2005, Macias et al. 2008). 
• La posibilidad de incorporar características alelopáticas en cultivares mejorados 
podrían reducir la necesidad de aplicar herbicidas a los cultivares (Khush, 1996). 
• Las malezas con efecto alelopático tienen un mayor grado de dispersión, daño y 
por ende el impacto económico aumenta, además de que disminuye la posibilidad 
de su erradicación (Mercado y Manuel 1978; Browmik y Doll 1982; Browmik y Doll 
1983; Rodriguez-Tineo 2000) 
Una última consideración que se debe incluir en este apartado es que muchos de los 
aleloquímicos conocidos no tienen potencial para convertirse en herbicidas comerciales 
per se, por tanto, la Alelopatía no es la panacea para los herbicidas, sin embargo su papel 
más importante está en la búsqueda de nuevos químicos y modos de acción, 
Estímulos que inducen 
producción de 
aleloquímicos. 
 10
proveyendo de bases estructurales para modificaciones futuras en el desarrollo de herbicidas 
comerciales viables (Harper 2005) 
2.3. Fotosíntesis como blanco de acción de agentes herbicidas. 
 
En los apartados anteriores se desarrolló la importancia de los herbicidas y su relación con 
procesos fisiológicos como la fotosíntesis, por tanto es conveniente revisar de forma rápida el 
proceso fotosintético como tal, pues es justo parte del objeto de estudio el presente trabajo. 
 
2.3.1. El proceso fotosintético. 
 
La fotosíntesis es probablemente el proceso metabólico más importante del planeta. Es la 
ruta metabólica clave para adquirir energía en la biosfera. Los organismos fotosintéticos, 
plantas, algas y algunas bacterias, son capaces de colectar energía solar y convertirla en 
energía de síntesis para compuestos orgánicos complejos (Archer & Barber 2004). El 
proceso de fotosíntesis es importante ya que mantiene a casi todas las formas de vida a nivel 
trófico y es un mecanismo que sostiene la productividad primaria de todos los ecosistemas. 
(Kozlovsky 1968) 
Existen varios tipos de fotosíntesis, cada uno difiere en el uso de moléculas, tipos de 
estructuras y productos (Nelson & Cox, 2000). En esencia la fotosíntesis es un proceso de 
fotoconversión para almacenar energía química. En un escenario simplificado, este proceso 
metabólico consiste en la absorción de la energía luminosa por pigmentos y la generación de 
excitones, atrapados como especies reactivas. Estos excitones proveen la fuerza 
electromotriz para el transporte de electrones durante las reacciones fotosintéticas. La fuente 
de estos electrones debe ser una molécula donadora, que sufre una reacción de oxidación 
química (Hillier & Wydrzynski 2008). 
Debido a que este trabajo se centra en la fotosíntesis vegetal (o sea de plantas) nos 
enfocaremos únicamente en explicar el proceso fotosintético conocido como fotosíntesis 
oxigénica. Este proceso que se lleva a cabo en un organelo conocido como cloroplasto o en 
las membranas celulares de las cianobacterias. En el caso de las plantas y de las algas 
eucariontes el cloroplasto se compone de varias membranas, por lo general dos (Carmona-
Jiménez et al. 2004): una externa y una interna (a veces varias), separadas por un espacio 
intermembranal. Para fines prácticos del presente trabajo, en plantas vasculares existen 
únicamente dos membranas y la fotosíntesis oxigénica se lleva acabo en el cloroplasto. 
Macroestructuralmente, el cloroplasto, está compuesto por el plegamiento de las membranas 
internas que dan origen a unas estructuras en forma de disco llamados tilacoides, en donde 
se llevan a cabo la reacciones de transferencia de electrones que corresponden al proceso 
de la fase luminosa. A su vez, los tilacoides se encuentran apilados en estructuras conocidas 
 11
como grana. El espacio que se encuentra entre el grana y la membrana externa del 
cloroplasto es denominado estroma, en el cual se llevan a cabo la reacciones de 
condensación orgánica de la fase oscura de la fotosíntesis (Nelson & Cox, 2000). (Ver Figura 
3) 
 
Figura 3: (a) Esquema del cloroplasto de plantas vasculares. (b) Micrografía de un cloroplasto. (Modificado a partir 
de Nelson & Cox 2000). 
 
Como se mencionó anteriormente, en las reacciones de la fotosíntesis se requiere de una 
molécula donadora de electrones, que para el caso de la fotosíntesis oxigénica es la molécula 
del agua (H2O), la cual químicamente es separada por una reacción de oxidación catalizada 
por los componentes del Fotosistema II. El producto químico de esta reacción es el de 
dioxígeno (también conocido como oxígeno molecular O2) el cual aparece libre en la 
atmósfera (Wydrzynski 2008). Esta maquinaria es definida como un dominio en el 
Fotosistema II denominada complejo productor de oxígeno, conocido como OEC (por sus 
siglas en inglés de Oxygen Evolving Complex) (Williamson 2008). Al proceso de producción 
de O2 se le denomina Evolución de Oxígeno, por dicha razón es llamada Fotosíntesis 
Oxigénica (ver Eq .1). 
+
2 22H O+hv 4H O 4e
−→ + + Eq. 1 
Eq.1: Ecuación general de la fotolisis del agua. 
Una vez que la molécula de agua dona los electrones, ésta se rompe en protones 
provenientes del hidrógeno, oxígeno y electrones. Los electrones son transportados a lo largo 
de una cadena de aceptores temporales, mientras que los protones, productos del 
rompimiento del agua, contribuyen a producir un gradiente protón motriz que se utilizará para 
la síntesis de ATP. Los electrones a su vez fluyen a lo largo de dos cascadas de transporte 
de electrones independientes pero acopladas, hasta que esta energía es condensada a 
manera de poder reductor en la forma de NADPH. 
La gran mayoría de los organismos con fotosíntesis oxigénica poseen dos clases de 
fotosistemas (Nelson & Cox, 2000). Debido a que el presente trabajo es un estudio que se 
focaliza en plantas hablaremos de los complejos moleculares que componen a fotosistemas 
 12
de plantas, sin embargoalgas y algunas cianobacterias presentan modificaciones a los 
componentes que a continuación se describen. Los fotosistemas son las unidades 
funcionales a nivel molecular de la fotosíntesis, y existen dos tipos de ellos: Fotosistema I 
(abreviado PSI por sus siglas en inglés Photosystem I) y Fotosistema II (PSII por sus siglas 
en ingles Photosystem II). Ambos están compuestos funcionalmente por un complejo antena, 
un centro de reacción propio, y moléculas donadoras y aceptoras. Las membranas de los 
tilacoides tienen diferentes tipos de fotosistemas. Los dos sistemas tienen funciones distintas 
y complementarias (Nelson & Cox, 2000). 
El PSII es de tipo Feofitin-Quinona (como el fotosistema de bacterias púrpuras) y contiene 
más o menos la misma cantidad de clorofila a y b. Su centro de reacción es denominado 
P680 debido a que es activado a 680 nm. La excitación de los centros reactivos P680 provee 
de electrones a través del complejo citocromo b6f con movimientos concomitantes de 
protones a través de la membrana tilacoidal (Nelson & Cox 2000). Mientras que PSI es de 
tipo ferredoxina (que es estructural y funcionalmente relacionado con los centros reactivos de 
las bacterias verde sulfurosas) y posee concentraciones variables de clorofila a y b. En el 
caso del PSI el centro de reacción es denominado p700, debido a que es activado a una 
longitud de onda de 700 nm. En el PSI el centro de reacción pasa su energía a una proteína 
Fe-S ferredoxina, la cual a su vez pasa electrones a NADP+, produciendo NADPH (Nelson & 
Cox 2000). 
Los dos centros reactivos funcionales en plantas actúan en tándem para catalizar la luz y 
producir así el movimiento electrones desde la molécula de agua hasta NADP+ y los 
electrones son llevados entre los dos fotosistemas por una proteína soluble conocida como 
plastocianina (Nelson & Cox 2000). 
Se cree, con base en las características biofísicas de cada uno de los sistemas, que PSI y 
PSII están especialmente separados entre ellos para así prevenir el flujo de excitones entre 
los dos fotosistemas. De hecho, el PSII se encuentra localizado única y exclusivamente en la 
región es altamente condensada de la membrana tilacoide, mientras que PSI y la ATPsintasa 
se encuentran localizadas principalmente en las zonas no apiladas del tilacoide. Por su parte, 
el complejo citocromo b6f se encuentra distribuido ampliamente en toda la membrana 
tilacoidal (Nelson & Cox 2000). 
Generalmente la forma diagramatica para representar la transferencia de electrones y cada 
uno de los sectores temporales de éstos es llamado esquema Z (Figura 4), el cual ilustra de 
manera general como es que se llevan a cabo las reacciones y la relación energética entre 
cada uno de los sectores. 
 13
 
Figura 4: Diagrama Z de la Fotosíntesis. (Modificado a partir de Nelson & Cox 2000) 
 
Se estima que por cada 2 fotones absorbidos (por cada uno de los fotosistemas), un electrón 
es transferido de la molécula de agua al NADP+. Para formar la molécula O2 anteriormente 
mencionada se requiere la transferencia de otros dos electrones de otras dos moléculas de 
agua y de otros dos NADP+, para obtener un total de ocho fotones absorbidos para llevar a 
cabo cuatro veces la reacción en torno a los fotosistemas (ver Eq 2.). 
 
+
2 22H O+NADP +8 fotones O NADPH +2H
+→ + Eq. 2 
Eq.2: Ecuación de la fotólisis del agua y la formación de NADPH. 
 
2.3.2. La emisión de la fluorescencia de la clorofila a como metodología para el estudio 
de la fotosíntesis. 
 
Existen muchos enfoques metodológicos para el estudio de la fotosíntesis. Algunas de éstas 
se enfocan exclusivamente a la fase luminosa orientada a conocer las causas de la variación 
en la eficiencia de captura de fotones y su conversión a NADPH y ATP. Mientras que otras 
se enfocan a la fase obscura, orientada a conocer la velocidad de captura de CO2, la 
actividad de la Rubisco y/o su conversión a carbohidratos. En cuanto a las técnicas para el 
 14
estudio de la fase luminosa, la gran mayoría requiere que se disgregue el material 
fotosintético en sus componentes básicos moleculares, por tanto, la mayoría de los estudios 
son de tipo in vitro. Sin embargo existe un grupo de metodologías que nos permite estudiar 
con detalle la fotosíntesis sin destruir un tejido fotosintético y se basan en la cuantificación de 
la emisión de fluorescencia de la clorofila a. En los últimos años, estas metodologías han 
permitido llevar a cabo una gran variedad de estudios in vivo del aparato fotosintético en 
diversos sistemas biológicos. El procedimiento es un método indirecto, pero altamente 
preciso, económico, rápido y no invasivo. Dichas características ofrecen, cuantificar procesos 
en sistemas fotosintéticos integros en su entorno fisiologico intacto (Papageorgiou & 
Govindjee 2005). 
La fluorescencia de la clorofila a es un fenómeno cuántico propio del aparato fotosintético 
(Govindjee 2004). Existen diversas formas de estudiar y entender lo que la señal fluorescente 
refleja de un sistema biológico (para mayor información consultar Papageorgiou & Govindjee 
2004), y muchos grupos de investigación han desarrollado metodologías que permiten 
acceder a esta información que de otra manera sería imposible tener. Por tanto, en este 
apartado se desarrollará el concepto de fluorescencia de la clorofila a, así como sus 
implicaciones biológicas para posteriormente centrarse en una de las escuelas de 
determinación y analisis de la fluorescencia que es la de la prueba de JIP. 
Para poder entender cuál es el principio de este conjunto de metodologías debemos de 
revisar el concepto de fluorescencia. La fluorescencia es una propiedad que podemos 
englobar dentro de la luminiscencia (Valeur 2002). Se define como la propiedad de una 
sustancia para emitir luz cuando es expuesta a radiaciones de tipo ultravioleta, rayos 
catódicos, rayos X y luz visible (Lakowicz, 2006). En este proceso, una molécula absorbe un 
fotón de alta energía, el cual es emitido en forma de un fotón de baja energía. La diferencia 
de energía entre la absorción y la emisión se disipa a manera de calor por vibraciones 
moleculares (Valeur 2002). A nivel cuántico, las moléculas excitadas emiten luz cuando los 
electrones de las capas más dístales se encuentran en estados excitados que son 
termodinámicamente inestables, pues poseen mayor energía de la que les corresponde 
cuánticamente. Para poder regresar a un estado con energía basal, los electrones deben 
deshacerse del exceso de energía liberando ésta a manera de un fotón (Valeur 2002). En 
otras palabras, la emisión de este fotón genera luz. A diferencia de otros procesos 
luminiscentes, como la fosforescencia, el fenómeno fluoreciente dura millonésimas de 
segundo, y en términos prácticos depende de que el estímulo causante esté presente al 
tiempo en que se emite y se observa la señal luminosa (Valeur 2002). Dependiendo el tipo 
de molécula fluorescente serán los requisitos lumínicos para absorber, excitar y emitir 
fluorescencia (Valeur 2002). 
 15
El fenómeno tiene una eficiencia neta para que se lleve a cabo el proceso fluorescente, a 
este proceso se le denomina rendimiento cuántico o quantum yield (Valeur 2002). Y se define 
como la proporción de fotones emitidos sobre el número de fotones absorbidos (ver ecuación 
3). El máximo rendimiento cuántico de fluorescencia esperado es uno ó 100% en donde cada 
fotón absorbido resulta en un fotón emitido. De acuerdo a la regla de Kasha, la emisión de un 
fotón ocurre en una tasa de producción apreciable únicamente desde el estado excitado más 
bajo de una multiplicidad dada (o sea los diferentes estados de energía degenerados de la 
función de onda que difieren únicamente en su momento angular de espín). Además de que 
de acuerdo a la regla de Kasha-Vavilov, el rendimiento cuántico de la luminiscencia es 
independiente generalmente de la longitud de onda de excitación (McNaught& Wilkinson 
1997). 
 
#
#
emitidos
absorbidos
hv
hv
φ =
 
Eq.3: Ecuación general del rendimiento quántico para un fenómeno fluorescente. 
 
Si bien este último párrafo puede parecer un mero tecnicismo de la Mecánica Cuántica y 
poco aplicable al estudio de sistemas biológicos, en realidad es la base de toda la teoría de la 
fluorescencia, y explica el principio básico de cómo es que se lee y se deben entender la 
emisión de la fluorescencia de la clorofila a. 
La clorofila a es un pigmento verde que se encuentra en plantas, algas y cianobacterias y es 
un elemento conspicuo y central de la fotosíntesis oxigénica (Govindjee 2004). Como se 
explicó anteriormente, la fotosíntesis es un conjunto de procesos parciales acoplados, 
iniciados por la absorción de la luz para la conversión de la energía de los fotones en energía 
almacenada: ATP, voltaje transmembranal y un gradiente de protones. La clorofila, es el 
cromóforo principal del sistema de proteínas y pigmentos, y se encarga de colectar fotones, 
en una distribución regulada de energía de excitación cuya principal conversión es en un 
potencial redox y en un gradiente de protones (Govindjee 2004). Aunque este proceso tiene 
una alta eficiencia cuántica, una pequeña fracción de fotones absorbida vuelve a ser remitida 
a manera de fluorescencia color rojo. Esta fracción varía en el estado metabólico, y provee 
las bases para la medición de la fotosíntesis a través de la fluorescencia (Govindjee 2004). 
 
hv = fotones. 
Ф = Rendimiento quántico (quantum yield) 
 16
 
Figura 5: Espectros de absorción de algunos pigmentos y emisión de la Fluorescencia de la Clorofila a (Creado a 
partir de Nelson & Cox 2000 y Govindjee 2004.) 
 
La razón por la cual la fluorescencia de la clorofila a y la suma de la fluorescencia de todos 
los tipos de clorofila son usadas, es debido a que la clorofila a tiene un papel central en la 
fotosíntesis oxigénica. De hecho, el centro de reacción está construido por un par de 
moléculas clorofila a modificadas (Papageorgiou 2004). Como ya se mencionó, todo 
fenómeno fluorescente viene acompañado también de una liberación de energía a manera de 
calor y en el caso de la fluorescencia la clorofila a no es diferente. Algunos autores sugieren 
que esta propiedad de la clorofila fue seleccionada evolutivamente ya que ofrece ventajas 
para evitar el fotodaño producido por del exceso de energía en el aparato fotosintético 
(Govindjee 2004, Bussotti et al. 2007). 
La absorción de luz, es llevada acabo por las moléculas de clorofila empotradas en los 
complejos clorofila-proteína del PSII, las cuales contienen muchas moléculas de clorofila que 
pasan a los estados excitados de la clorofila conocidos como estado singulete (Chl*), y que 
decaen al estado basal por varios caminos (Govindjee 2004). El rendimiento cuántico de este 
proceso “i” del ensamble de las moléculas de clorofila está relacionado con una constante de 
rendimiento y con varios estados de desexcitación: fluorescencia (F), fotoquímica (P) y 
algunos otros como el calor (O). Los cuales pueden ser representados por la siguiente 
ecuación: 
 
 17
i
i
F P O
k
k k k
φ =
+ + 
Eq.4: Ecuación del rendimiento cuántico para cualquier proceso del ensamble de las moléculas de clorofila. 
 
Como se observa, esta constante corresponde a una reacción de primer orden, y representa 
el número de transiciones por segundo o el número de eventos por segundo. Cada uno de 
estos rendimientos cuánticos puede ser a su vez calculado para cada uno los procesos 
fotosintéticos, es decir, es posible calcular el rendimiento cuántico de fotoquímica (Eq. 5), el 
rendimiento quántico de fluorescencia la clorofila a (Eq. 6) o el rendimiento cuántico de la 
fluorescencia máxima de la clorofila (Eq. 7). En el caso del rendimiento quántico de 
fluorescencia la clorofila a, es decir, cuando la fotoquímica esté en un mínimo (cerca de cero) 
puede ser estudiado cuando se alcanza la saturación de excitación por luz. 
F
P
F P O
k
k k k
φ =
+ + 0
F
F
F P O
k
k k k
φ =
+ + M
f
F
F O
k
k k
φ =
+ 
 Cuando 0pk → 
 Eq.5 Eq.6 Eq.7 
 
Usando estas ecuaciones, es posible igualar la diferencia entre el rendimiento cuántico de la 
fluorescencia máxima de la clorofila, MFφ ,y de la fluorescencia mínima, 0Fφ , normalizada al 
rendimiento cuántico de la clorofila máxima con respecto a los valores de la fluorescencia 
variable. La fuorescencia variable se define como la diferencia entre la fluorescencia máxima 
y mínima. Todo esto con el fin de determinar el rendimiento cuántico de la fotoquímica del 
PSII, como se demuestra a continuación: 
0 0
( ) ( )M
M
F F M V
F M M
F F F
F F
φ φ
φ
− −
= = Eq.8 
Si sustituimos las Eq.6 y Eq.7. en la Eq.8 tenemos que 
 
f F
F O F P O
F
F P O
k k
k k k k k
k
k k k
⎡ ⎤ ⎡ ⎤
−⎢ ⎥ ⎢ ⎥+ + +⎣ ⎦ ⎣ ⎦
⎡ ⎤
⎢ ⎥+ +⎣ ⎦
 Eq. 9 
Y al dividir los numeradores entre los denominadores se obtiene: 
 
Eq. 4 
 18
1 F O P P
F P O P F O
k k k
k k k k k k
φ
⎧ ⎫+
− = =⎨ ⎬+ + + +⎩ ⎭
 Eq. 10 
 
Así, el cociente de fluorescencia variable sobre fluorescencia máxima es considerado como el 
rendimiento cuántico de la fotoquímica del PSII, siendo que la mayor parte de la 
fluorescencia de la clorofila a a temperatura ambiente corresponde únicamente a este 
fotosistema (Govindjee 2004). Este último hecho es justamente la base teórica y matemática 
de todas las escuelas de fluorescencia de la clorofila a. 
Resumiendo, la base teórica de la fluorescencia de la clorofila a, descansa en los principios 
básicos de la Mecánica Cuántica. Que en otras palabras consiste en medir toda la energía 
que la maquinaria fotosintética no procesada para conocer cuanta energía está siendo usada. 
Podríamos verlos como “dime que basura tiras y te diré como vives” La emisión de la 
fluorescencia de clorofila a corresponde a una pequeña fracción de energía disipada del 
aparato fotosintético y es ampliamente aceptado que provee información para acceder al 
entendimiento y estructura de las funciones del mismo (Papageorgiou & Govindjee 2004, 
Govindjee 2004, Strasser et al. 2004). 
 
2.3.3. Prueba de JIP. 
 
Como se menciona en el apartado anterior existen varias escuelas que estudian la emisión 
de fluorescencia la clorofila a para entender una muestra fotosintética (consultar 
Papageorgiou & Govindjee 2004 para obtener información detallada de cada una de éstas). 
Una de estas escuelas corresponde a la de la prueba de JIP desarrollada por Strasser a lo 
largo de mas de 15 años. 
La prueba de JIP consiste en el análisis de los transientes de la fluorescencia de la clorofila a 
traduciendo la información que se encuentra en estos a parámetros biofísicos que determinan 
el comportamiento del PSII y PSI de manera cuantitativa (Strasser et al. 1995, 2000, 2004, 
Schansker et al. 2005, Tsimilli-Michael & Strasser 2008). Se denomina JIP debido a la curva 
de inducción polifásica de la fluorescencia de la clorofila a denominada OJIP, cada letra 
representa uno de los pasos (puntos) de la curva (los cuales se explican a detalle 
posteriormente). De esta manera la prueba de JIP provee información acerca del 
comportamiento, estructura, conformación y funciones del aparato fotosintético en cualquier 
estado fisiológico (Strasser et al. 2004). 
 
 
 
 19
La prueba parte de tres supuestos básicos (Strasser et al. 2004): 
1) Los estados de los centros reactivos (RCs) del PSII están definidos únicamente por el 
estado redox del aceptor primario del PSII: Plastoquinona A (QA), con base en la teoría 
de Duysens and Sweers (1963). 
2) Cuando QA en un RC es reducido, el RC se cierra y la fluorescencia de la clorofila es 
alta, mientras que cuando QA se encuentra en estado oxidado, el RC se abre y la señal 
fluorescente de la antenaes atenuada (QuenchIng en el slang de las señales 
fluorescentes). 
3) A temperatura ambiente la presencia de la clorofila a en plantas algas y cianobacteria, 
se encuentra en la región de los 680 a 740 nm y es emitida principalmente por el PSII. 
De esta manera, la señal fluorescente puede fungir como una sonda para conocer el estado 
de excitación de la muestra. 
Sin embargo existen varias formas de inducir la señal fluorescente y por ende cada método 
posee una cinética diferente. Ésto es dependiente del tipo de fluorómetro que se utilice ocupe 
ya que cada uno posee métodos de captura e inducción propios. A grandes rasgos existen 
dos tipos de fluorómetros usados para estos estudios, los que captan las señales 
fluorecentes inducidas de manera continua, y otros en la que la cual es inducida por 
excitación modulada. Ha existido controversia entre las ventajas y desventajas de ambas 
técnicas. Sin embargo, debido a que ambas miden la señal de fluorescencia emitida por el 
aparato fotosintético, la información obtenida de ambos métodos no puede ser contradictoria 
(Strasser et al 2004). La prueba de JIP sin embargo, requiere que la excitación sea continua y 
que la resolución temporal sea alta (Strasser et al. 1995). 
A lo largo de más de 40 años, Strasser y colaboradores han desarrollado un conjunto teórico 
que asocia la biofísica del aparato fotosintético y la señal fluorescente que ha derivado en las 
formulaciones analíticas basadas en la Teoría Energética de Flujo en las Biomembranas 
(Strasser 1978, 1981) y en el concepto básico de que el rendimiento cuántico de la 
fluorescencia del PSII es determinado por el estado -abierto o cerrado- de los RC´s. El uso de 
las ecuaciones de flujo derivan en ecuaciones algebraicas que expresan el total de flujo de 
energía (influjo y eflujo) de un sistema de pigmentos (Strasser et al. 2004). 
Si bien el propósito del presente apartado no es desarrollar en detalle el método de la prueba 
de JIP, es recomendable acudir a la publicación de Strasser et al. (2004) que viene citada en 
las referencia del presente trabajo para profundizar mas en el tema. 
A continuación se hablara de de algunos de los principios básicos de esta metodología y 
posteriormente en el capítulo de Resultados y Discusiones desarrollaré más a detalle algunos 
de los conceptos que son relevantes para el presente trabajo. 
La inducción continua de la fluorescencia describe una curva polifásica (que fue descrita en 
1931 por Kautsky y Hirsch), en donde reportaron por primera vez el comportamiento de 
 20
transientes de la emisión de fluorescencia de la clorofila a, reconociendo tres puntos o pasos: 
O (punto inicial de la fluorescencia), P (punto máximo de la señal) y S (estado en el que las 
señal decae) (ver Figura 6). Delimitaron la ocurrencia de los tres pasos en dos fases: la fase 
O-P con una duración menor a 1 segundo y la subsecuente fase P-S que describe el 
decremento de la señal, el cual ocurría en una escala de tiempo mayor (segundos a minutos) 
con varios estados intermedios. Comúnmente se acepta que la primer fase, O-P, refleja cómo 
se cierran los RC’s, sin presentar ningún cambio conformacional. Po su parte, el transiente P-
S refleja cambios conformacionales como son cambios en la excitación los pigmentos antena 
y en la poza de los RC’s cerrados (Strasser et al. 2004). 
 
Figura 6: Curva de inducción de la Fluorescencia de la Clorofila a de Kautsky Modificado a partir de (Strasser et 
al. 2004.) 
 
Sesenta años después se pudo detectar que existían más fases dentro de la fase O-P. Con el 
aumento en la resolución temporal de los instrumentos de captura se logro ver que existía 
otros dos puntos en el aumento polifásico encontrado entre los puntos O y P, uno a los 2 ms 
y otro a los 30 ms los cuales fueron denominados como J e I respectivamente. Las letras J e 
I fueron asignadas de forma arbitraria, aunque en secuencia invertida o de manera opuesta 
su secuencia en el abecedario (como regla nemotécnica). Fue entonces cuando la curva que 
fue denominada O-J-I-P (Strasser & Govindjee 1992) 
 
Figura 7: Curva OJIP de inducción de la Fluorescencia de la Clorofila a vista en escala no logarítmica (Creado a 
partir de de Strasser et al. 2004.) 
 
 21
Con los avances sobre las nuevas fases, en 1995 Strasser et al. desarrollaron un análisis 
cuantitativo del la cinética de los puntos O-J-I-P inducido por luz actínica roja con pico a los 
650 nm que corresponde a la prueba de JIP moderna. Basándose en la información de cada 
punto almacenada en los transientes O-J-I-P es posible determinar la información estructural 
y funcional para medir el comportamiento del aparato fotosintético, a los cuales se les 
agregaron nuevos pasos que estan presentes en ciertos estados fisiológicos denominados K, 
L, H y G (estos dos últimos solamente en corales y foraminíferos) (Strasser et al. 1995). La 
asignación de las letras K, L, H y G para estas bandas se debe a la regla nemotécnica 
anteriormente explicada basada a la posición en invertida en las letras del abecedario. De tal 
manera que las bandas K y L ocurren antes de paso J, y las bandas G y H ocurren después 
del paso I. Es decir, el orden de los pasos es inverso a la secuencia del abecedario. 
 
Figura 8: Curva OJIP de inducción de la fluorescencia de la clorofila a. El tiempo se muestra en escala logarítmica. Los colores 
representan las diferentes fases y se relacionan con el esquema de la derecha que representa la cascada de flujo que resume 
los principales procesos fotosintéticos. ABS significa absorción de fotones, TR trapping o atrapamiento de la energía a manera 
de excitones, ET transporte de electrones y RE reducción de aceptores finales. 
 
Se demostró que cada una de las fases de la curva está correlacionada con procesos de flujo 
energético a lo largo de la fotosíntesis (Ver Figura 8). La primera fase, denominada O-J 
contiene información relacionada con el proceso denominado absorción (captura de fotones) 
y trapping (atrapamiento de los electrones en forma de excitones), seguido de la fase J-I que 
describe el transporte de electrones (Strasser et al 2004) y finalmente la fase I-P que nos 
describe los eventos que ocurren en la reducción de los aceptores finales correlacionados 
con el funcionamiento del PSI (Schansker et al. 2005, Tsimilli-Michael and Strasser 2008) (ver 
Figura 8) .En relación a esto último, en otras metodologías de medición de fluorescencia, la 
 22
señal de PSI es solamente diferenciable a bajas temperaturas, o en los métodos de 
excitación modulada a temperatura ambiente, la señal describe solamente al PSII(Strasser et 
al. 2004). 
 
Generalmente el punto O se sitúa a los 50 µs aunque varía dependiendo el tipo de 
fluorómetro; L se localiza a los 150 µs; K a los 300 µs; J a los 2 ms; I a los 30 ms; P es 
variable y depende de la muestra analizada. Alcanzar el estado estacionario S puede tardar 
varios minutos. 
El fundamento de la prueba de JIP se basa en las ecuaciones algebraicas que surgen a partir 
de la Eq 10 y de la modelación de Paillotin de (1976), donde un rendimiento quántico en 
cualquier tiempo puede ser calculado con base en: 
1
t
t t
P
M M
F F
F F
φ
⎡ ⎤∆
= = − ⎢ ⎥
⎣ ⎦ 
Eq 11: Ecuación del rendimiento cuántico para cualquier punto en el tiempo usando la señal fluorescente 
(Paillotin 1976) 
 
A través de los años, las investigaciones de Strasser et al. permitieron determinar la relación 
entre fluorescencia y los procesos fotosintéticos que derivaron en las expresiones usadas en 
esta prueba. Pero todas ellas se centran en la forma de la curva. Nótese en la Figura 8 que 
entre cada uno de los pasos existe un aumento exponencial que tiende a atenuarse conforme 
se aproxima al siguiente paso. Esta atenuación, se manifiesta como un decremento de la 
pendiente de la curva de fluorescencia. A cada uno de estos procesos se le denomina 
“quenching” o apagamiento, yestá en función al estado de QA. Cada vez que la poza de RC 
se cierra, y por ende QA se reduce, la pendiente aumenta, y cada vez que se oxida la 
pendiente se reduce y se forma un paso de la curva O-J-I-P. En la Figura 9 se esquematiza 
en la curva hasta donde llega la energía en cada paso. Por ejemplo en el caso de J la energía 
llega hasta plastocianina (PC), por tanto, al haber flujo “libre” de la energía, la señal 
fluorescente se atenúa, ya que no hay necesidad de dispersar energía de esta manera, ya 
que esta siendo eficientemente transportada. Sin embargo, en este punto, el flujo queda 
bloqueado una vez más, ya que todavía no se han dado los cambios conformacionales que 
permiten transportar la energía a PSI, lo que hace que se acumule la energía una vez más. 
Esta acumulación tiene un efecto en cadena que llega hasta QA que no puede reducirse más, 
ya que todo QB está reducido, por lo que no puede donar sus electrones al complejo b6f que 
tampoco puede donarlos a PC, todo esto conlleva a que RC se cierre y aumente la señal 
fluorescente dando origen a la fase J-I. El valor P indica cuándo el sistema se ha saturado por 
completo y ha llegado a un segundo “cuello de botella” (asumiendo que QA es el primero) y 
 23
que está relacionado con la fase obscura de la fotosíntesis. Aunque no desarrolló esto a 
detalle en el apartado 2.3.1, la fase obscura no es totalmente independiente de la Luz y el 
principal protagonista de esta operación es la RUBISCO, que es la enzima que condensa la 
energía química en materia orgánica. Y aunque el nombre “Fase Obscura” implique que no 
es dependiente de la luz, la RUBISCO necesita de esta para sufrir cambios conformacionales 
que le permitan ser activa. Por lo general, para poder tener una forma “estándar” de la Curva 
de JIP, es necesario adaptar las muestras a la obscuridad. De esta forma nos aseguramos 
que la RUBUISCO esté inactiva y por ende la energía química acumulada no sea usada para 
la fijación de carbono. De esta manera se satura la maquinaria fotosintética de energía 
acumulada y aumenta así la emisión de fluorescencia. Conforme se continúa la iluminación, 
la RUBISCO se activa y se abre paso al flujo de energía que conlleva a un segundo 
apagamiento de la fluorescencia que corresponde en parte a la fase P-S. En la siguiente 
Figura se ilustra el estado de QA con respecto a la curva OJIP (Strasser et al. 2004). 
 
Figura 9: Relación entre los procesos fotosintéticos con la curva OJIP de inducción de la Fluorescencia de la 
clorofila a. Donde se muestra 
A
Q−⎡ ⎤⎣ ⎦ se indica cuando la posa de QA se ha reducido en su totalidad. Note que 
cuando esto ocurre se definen claramente los pasos O-J-I-P. Las secuencias de [QA ,QB, PQ, Cytb6f, PC], [QB, PQ, 
Cytb6f, PC] y [Fd, NADPH y CO2] desde que inicia el flujo de la energía y hasta donde llega en cada paso. Por 
ejemplo, en el caso del paso I la energía va desde QB, hasta plastociana, mientras que en el paso P llega de Fd 
hasta CO2., estos últimos son eventos del PSI. 
 
 24
Con el fin de asociar la curva OJIP con el esquema Z se muestra la Figura 10 en donde se 
ilustra el transporte de electrones con respecto a cada uno de los pasos. 
 
Figura 10: Relación entre la curva OJIP y el esquema Z. Las fases de la curva OJIP son representadas a manera de 
flechas de los colores respectivos en el esquema Z indicando el inicio y fin de cada una de ellas. 
 
De esta forma usando la Eq.11, cualquiera de las ecuaciones de flujo puede ser derivada para 
conocer los rendimientos entre cada paso. Por ejemplo: Sea t cualquier tiempo. Usemos J 
entonces 2t J ms= = por lo tanto: 
1
t J
J
P P
M
F
F
φ φ
⎡ ⎤
= − =⎢ ⎥
⎣ ⎦ Eq.12 
Siendo que 
JP
φ se define como el rendimiento quántico hasta el paso J, entonces tenemos 
que: 
 J
J
P
O
E
E
φ =
 
Que de acuerdo a la Teoría Energética de Flujo en las Biomembranas puede ser visto como: 
0
0
JP E
ET
ABS
φ φ= =
 Eq.14 
Esta ecuación, nivel conceptual nos indica cuánto del 100% de la energía total de fotones 
absorbidos por un ensamble de pigmentos (ABS) es transportada a lo largo de la cadena de 
transporte de electrones (ET) al inicio del proceso (denotado por el número 0). 
Así sucesivamente se pueden calcular los rendimientos de cada uno de los flujos entre cada 
paso fotosintético usando la información almacenado en la curva de OJIP (ver Figura 11). 
EJ = Energía en el paso J 
E0 = Energía total inicial administrada al sistema 
 
Eq.13 
Eq.12 
 25
 
Figura 11: Cascada energética de la fotosíntesis y las ecuaciones derivadas para el cálculo de los rendimientos 
entre los flujos energéticos. 
 
2.3.4. Análisis de la Prueba de JIP 
 
Como ya se mencionó la prueba de JIP es un modelo estandarizado, el cual fue desarrollado 
ampliamente por Strasser et al. (1995, 2004), y ampliado en 2008 con las ecuaciones de 
Reducción de Aceptores Finales (Tsimilli-Michael and Strasser 2008). En dichos trabajos se 
desarrollan ampliamente las rutinas basicas para la interpretación de los datos. Sin embargo, 
el análisis estadístico de los datos de la prueba de JIP ha sido realizado de diversas maneras 
por diferentes grupos de investigación. En la gran mayoría de los casos no se ha explicado la 
razón por la cual usa algún procesamiento estadístico y en la actualidad solamente existe un 
artículo abocado a las propiedades estadísticas de las señales fluorescentes (Lazar & Naus 
1998). 
 En la mayoría de los trabajos con la prueba de JIP reportados hasta la fecha se utiliza 
principalmente la estadística descriptiva para demostrar las diferencias entre tratamientos, es 
decir técnicas descriptivas para el análisis de datos. Por ejemplo en Van Hermans et al. 
(2004) se utilizan las desviaciones estándar (D.E.) de las señales para demostrar las 
diferencias, mientras que Heerden et al. (2004) utiliza los valores promedio de los 
parámetros derivados. Por su parte Jiang et al (2008) usan la dispersión neta de las curvas, 
de una manera similar a lo se que muestra en la Figura 30 en este trabajo. En otros trabajos 
se emplean técnicas predictivas para el análisis de datos como son los ANOVA’s (Gonçalves 
et al. 2007, Ripley et al 2004, Sun et al 2004, Thach et al. 2007, Chitu et al. 2009, Jian et al. 
2008), aunque en la mayoría de los trabajos el uso de la estadística es omitida. 
 26
Por tanto cabe preguntarse ¿Cuáles son los mejores métodos estadísticos para procesar los 
datos arrojados por esta prueba? Además de ¿Cuáles son las variables que deben 
contemplarse en dicho análisis? Lo que conlleva al siguiente cuestionamiento: Si la prueba de 
JIP es un método estándar de interpretación de las señales fluorescentes ¿Por qué cada 
grupo emplea diferentes métodos? 
Tal vez la respuesta de esto radique en que a pesar de que la prueba de JIP es un estándar 
avalado por varios trabajos (no sólo de Strasser et al.), cada fenómeno a estudiar (por 
ejemplo estrés oxidativo, hídrico, herbicidas, etc.) emplea un método de muestreo y un 
esquema de extracción de conocimiento a partir de datos (ó KDD por sus siglas en ingles 
Knownledge Database Discovery) diferentes (Valderrrey et al. 2010). Si bien es válido afirmar 
que existan ciertas variantes del esquema de un mismo fenómeno medido por un mismo 
instrumento (en este caso Prueba de JIP) debe existir un “tronco común” entre todos los 
estudios para que estos puedan ser comparados (Valderrey 2010). 
Respecto a lo anterior, Lazar & Naus (1998) concluyen que ninguno de los parámetros de la 
prueba de JIP responde a una distribución normal y que ellos proponen lo que llaman “una 
mejor representación para el análisis de los datos”. De ser cierta dicha aseveración, basados 
en la teoría básica de la Estadística, los métodos paramétricos no pueden ser aplicados en 
este caso, lo que conlleva a que ninguna de las pruebas ANOVA y de D.E. son análisis 
válidos para evaluar