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1 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas Análisis de la interacción entre el hígado y el núcleo supraquiasmático: vías sensoriales autónomas TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: Maestro en Ciencias PRESENTA: Fernando Cázarez Márquez TUTOR PRINCIPAL Dr. Rudolf M. Buijs Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR Dr. Jorge Morales Móntor Programa de Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas Dr. Eustacio Galileo Escobedo González Programa de Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas MÉXICO, D. F. Octubre, 2014 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 2 Formato: mgt._l VoBo Tutor, revisión de tesis de maestría A los miembros de Jurado de Examen México D. F. a 31 de Agosto de 2014 Por medio del presente manifiesto que he revi sado el trabaj o escrito del proyecto que lleva como título: "ANÁLISIS DE LA INTERACCIÓN ENTRE EL HÍGADO Y EL NÚCLEO SUPRAQUIASMÁTICO: VÍAS SENSORIALES AUTÓNOMAS" del alumno Fernando Cázarez Márquez y considero que t iene la calidad sufi ciente para ser presentado al jurado de examen. Atentamente Dr. Rudol f Marinus Buijs Tutor Académico ( 3 FERNANDO CÁZAREZ MÁRQUEZ Alumno (a) d~ la Ma~mía ~n Ci~ncias Bioquímicas Pr~s~nt~ PMDCB/N7 /2014 ... A Los miembros del Subcomité Académico en reunión ordinaria del día I&' de agosto del presente, conocieron su solicitud de ASIGNACiÓN de JURADO DE EXAMEN para optar por el grado de MAESTRO EN CIENCIAS (BIOQuíMICAS), con la réplica de la tesis "Análisis de la interaeeión entre el hígado y el núcleo supraquiasmático: vías sensoriales autónomas", dirigida por el Dr. Rudolf Marinus Buijs. De su análisis se acordó nombrar el siguiente jurado: PRESIDENTE VOCAL VOCAL VOCAL SECRETARIO Dra. Patricia l/eana Joseph Bravo Dr. Martín Gustavo Pedrala Alva Dr. Julio César Carrero Sánchel Dra. Gloria Benítel King Dra. Ana Brígida Clorinda Arias Álvarel Sin otro particular por el momento, aprovecho la ocasión para enviarle un cordial saludo. At~ntamente "POR MI RAZA HABtARÁ EL EspíRITU" Cd. Univ~rsitaria, D.F., a 22 d~ agosto d~12014. COORDINADORA DEL SUBCOMITÉ. ACADÉMICO CIUDAD DE MÉ.XICO DRA. BERTHA GONZÁLEZ PEDRAJO C.c.p. Archivo BGP*lgg contacto:mdcbq@posgrado.unam.mx tel. 56237006 4 If one has the hypothesis that all sparrows are grey, one can hold on the hypothesis so long as one sees only grey sparrows. However, the sight of the single white sparrow is enough to refute the hypothesis. Karl Popper 5 Agradecimientos. Este trabajo fue realizado bajo el apoyo de los proyectos DGAPA IG-200314 y CONACYT 220598. La realización de esta tesis fue gracias al Programa de Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas. Se agradece al “Programa de Apoyo a los Estudios del Posgrado” (PAEP) por el apoyo económico para la asistencia a dos congresos internacionales con datos obtenidos en esta tesis. Gracias a Leticia García Gutiérrez y Adelina González Pérez por toda la ayuda brindada. Agradezco a CONACYT por brindarme la beca de posgrado. Un especial agradecimiento al Dr. Rudolf M. Buijs por fungir como tutor de esta tesis y por permitirme realizar este proyecto en su laboratorio. Gracias al Dr. Eustacio Galileo Escobedo González y al Dr. Jorge Morales Móntor por ser parte del comité tutoral de mis estudios de maestría. A los Doctores que conformaron el jurado de examen, gracias a todos por su enorme disposición en la revisión de este trabajo. Al Instituto de Investigaciones biomédicas, UNAM por las instalaciones y todos los servicios. Gracias a la técnico del laboratorio Q.F.B. María del Carmen Basualdo Sigales por atender el suministro de reactivos, anticuerpos y animales usados en esta tesis. A todos mis compañeros y amigos del laboratorio. A mi familia, un enorme GRACIAS. 6 ABREVITURAS USADAS LPS. Lipopolisacárido NSQ. Núcleo Supraquiasmático CD. Cuerno Dorsal AP. Área Postrema NTS. Núcleo del tracto Solitario i.v. intravenoso Sx. Simpatectomía Psx. Parasimpatectomía TNF- α. Factor de Necrosis Tumoral α SNC. Sistema Nervioso Central NTS. Núcleo del Tracto Solitario AVP. Arginina-Vasopresina VIP. Péptido Intestinal Vasoactivo. PER. Proteina Period CRY. Proteína Criptocromo cAMP. Monofosfato de Adenosina Cíclico PVN. Núcleo Paraventricular del Hipotálamo IML. Columna Intermediolateral. DMV. Nucleo Dorsomotor del Vago LH. Hormona Luteinizante OVLT. Órgano Vasculoso de la Lámina Terminal LH. Hipotálamo Lateral DMH. Nucleo Dorsomedial del hipotálamo IGL. Hojuela intergeniculada lateral. CSF. Factores estimulantes de colonia. TLR-4. Receptor 4 tipo toll NF-κB. Factor nuclear κ de células B. IL. Interleucina EM. Eminencia Media. SFO. Órgano Subfornical CVO. Órgano Cirvunventricular. CKs. Células de Kupffer Sub P. Substancia P CGRP. Péptido relacionado a calcitonina DAB. Diaminobenzidina PBS. Buffer de fosfatos TH. Tirosina Hidroxilasa NPY. Neuropéptido Y CtB. Subunidad B de la toxina de Cólera E.S.M. Error sobre la media ANOVA. Análisis de Varianza 7 ÍNDICE Página Agradecimientos 5 Abreviaturas usadas 6 Índice 7 Índice de figuras 9 RESUMEN 10 1 INTRODUCCIÓN 11 1.1 RITMOS CIRCADIANOS EN LA FISIOLOGÍA. 1.2 EL NÚCLEO SUPRAQUIASMÁTICO COMO RESPONSABLE DE LOS RITMOS ENDÓGENOS. 1.3 CONTROL CIRCADIANO DE LAS FUNCIONES AUTÓNOMAS. 11 11 12 2 ANTECEDENTES 14 2.1 RESPUESTA INMUNE 2.2 RESPUESTA INMUNE INNATA 2.3 CITOCINAS 2.4 EL LIPOPOLISACÁRIDO (LPS) COMO ESTÍMULO PARA INVESTIGAR LA RESPUESTA INMUNE INNATA 2.5 CONTROL CIRCADIANO DE LA RESPUESTA INMUNE 2.6 ENTRADA DE INFORMACIÓN INMUNE AL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL 2.6.1 Órganos Circunventriculares. 2.6.2 Información sensorial visceral. 2.7 EL HÍGADO COMO ÓRGANO DE REPUESTA INMUNE 14 14 15 15 15 17 17 18 19 3 OBJETIVO 21 4 HIPÓTESIS 3.1 HIPOTESIS PARTICULARES 21 21 5 MATERIALES Y MÉTODOS 21 5.1 ANIMALES 5.2 EXPERIMENTO 1. ACTIVACIÓN NEURONAL POR EL LPS DE LOS CENTROS DE INTEGRACIÓN SENSORIAL NEURONAL Y HUMORAL. 5.3 EXPERIMENTO 2. DENERVACIONES DEL SISTEMA AUTÓNOMO HEPÁTICO 5.3.1 Diseño experimental de los experimentos 1 y 2. 5.4 EXPERIMENTO 3. INYECCIÓN DE TRAZADOR NEURONAL EN EL NÚCLEO SUPRAQUIASMÁTICO Y EN EL NÚCLEO DEL TRACTO SOLITARIO 21 22 22 23 25 8 5.5 IMAGENOLOGÍA Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO. 26 6 RESULTADOS 27 6.1 EXPERIMENTO 1. LAS VÍAS NEURALES Y HUMORALES TRANSMITEN INFORMACIÓN INMUNE AL CEREBRO Y AL NÚCLEO SUPRAQUIASMÁTICO 6.2 EXPERIMENTO 2. DENERVACIONES HEPÁTICAS SELECTIVAS 6.2.1 La rama simpática hepática inhibe la producción de TNF-α ante un reto con LPS. 6.2.2 La simpatectomía hepática interrumpe el paso de la información inmune sensorial espinal. 6.2.3 La falta de inervación simpática o parasimpática hepática no modificó la activación del Área Postrema (AP) después de una inyección con LPS. 6.2.4 Las ramas autónomas hepáticas participanen la transmisión de la información al NSQ después de un reto con LPS. 6.3 EXPERIMENTO 3. CONEXIONES RECIPROCAS ENTRE EL NÚCLEO SUPRAQUIASMÁTICO Y EL NÚCLEO DEL TRACTO SOLITARIO. 27 28 29 30 31 32 33 7 DISCUSIÓN 36 7.1 ACTIVACIÓN DE LAS ENTRADAS DE INFORMACIÓN SENSORIAL ESPINAL, VAGAL Y HUMORAL. 7.2 PAPEL DE LAS INNERVACIONES SIMPÁTICAS HEPÁTICAS ANTE UN RETO INMUNE 36 37 8 CONCLUSIONES 40 9 REFERENCIAS 41 10 ANEXOS 47 9 ÍNDICE DE FIGURAS Página Figura 1. Estructuras blanco de salida de información del NSQ en el cerebro de la rata. 13 Figura 2. Un reto inmune con LPS durante la noche induce la activación del Núcleo Supraquiasmático. 16 Figura 3.Vía humoral de entrada de información inmune al cerebro. 17 Figura 4. Sistema sensorial visceral autónomo. 19 Figura 5. Niveles de TNF-α en suero después de la inyección i.v. de LPS (1.6µg/kg) o Salina. 27 Figura 6. El LPS induce aumento de la actividad neuronal en centros de integración sensorial neuronal, humoral y en el NSQ. 28 Figura 7. Producción de TNF-α en suero después de un reto con LPS en animales con denervación selectiva hepática. 29 Figura 8. Actividad neuronal en el CD en animales denervados selectivos después del LPS. 30 Figura 9. La denervación selectiva hepática no interrumpe la transmisión de información de la respuesta inmune al NTS. 31 Figura 10. Actividad neuronal en el AP después de denervaciones hepáticas selectivas 32 Figura 11. c-FOS en el Núcleo Supraquiasmático después de una inyección con LPS en animales con denervación hepática selectiva. 33 Figura 12. El NSQ recibe aferencias del NTS 34 Figura 13.El cuerno dorsal y la médula espinal lateral en la médula espinal tienen proyecciones directas al NSQ. 34 Figura 14. El NTS envía proyecciones a la región ventrolateral del NSQ. 35 Figura 15. Papel inhibitorio de la rama simpática hepática en el control de la respuesta inmune al LPS. 40 10 RESUMEN. El núcleo supraquiasmático (NSQ) orquesta y sincroniza el ritmo circadiano de múltiples órganos en el cuerpo, incluyendo a los órganos del sistema inmune. Debido a la regulación circadiana, un reto con lipopolisacárido (LPS) induce respuestas diferentes del sistema inmune y del NSQ, dependiendo de la hora del día en la que se da administra el estímulo. El hígado, un órgano principalmente reconocido por su papel metabólico, también está involucrado en la respuesta inflamatoria, es capaz de detectar al LPS y está involucrado en la respuesta inflamatoria. En el presente trabajo se formuló la hipótesis de que el hígado podría ser capaz de señalizar la información de un reto inmune a través de vías sensoriales autónomas hacia el cerebro y al NSQ. La fisiología y la anatomía de las vías sensoriales entre el hígado y el cerebrono se han demostrado. Para investigar la comunicación neuronal sensorial entre la respuesta inmune y el cerebro se usó una inyección intravenosa de LPS i.v. (1.6µg/kg), como reto inmune, y se evaluó la actividad neuronal medida por inmunohistoquímica de c- FOS en los niveles torácicos del cuerno dorsal en la médula espinal (CD), en el área postrema (AP) y en el núcleo del tracto solitario (NTS). Con la finalidad de demostrar la posible participación del hígado en esta comunicación con el cerebro, se inyectó LPS en animales a los que se les realizó la denervación simpática (Sx) o parasimpática (Psx) del hígado. En los animales Sx se observó una disminución de la inmunoreactividad a c-FOS en los niveles torácicos del CD de la médula espinal en comparación con los animales controles de cirugía (Sham) y los animales denervados Psx. Los niveles de TNF-α en suero aumentaron significativamente en los animales Sx comparados con los Sham y los Psx. En el NSQ, los animales Psx mostraron activada la región ventrolateral mientras que en los animales Sx se encontró una tendencia a presentar una menor actividad después del reto con LPS. Los resultados del presente trabajo sugieren que el hígado podría comunicarse con el Sistema Nervioso Central a través de las vías espinales sensoriales y que esta comunicación tiene un papel importante en la inhibición de la respuesta inmune pro-inflamatoria. Con base en las conexiones anatómicas y en la activación de diferentes vías neurales después de un reto con LPS, se sugiere una relación entre los centros de integración sensorial como el NTS y el CD y el marcapasos circadiano, el NSQ. 11 1. INTRODUCCIÓN 1.1 RITMOS CIRCADIANOS EN LA FISIOLOGÍA Debido a los movimientos del planeta tierra, los seres vivos han estado expuestos a diferentes tipos de variaciones cíclicas en el ambiente. Una de estas variaciones es la transición día-noche, la cual es determinada por la rotación de la tierra sobre su eje. Esta transición de luz-oscuridad genera diversos cambios en el ambiente, así como en la presencia de depredadores o de alimento. La transición día-noche ha ejercido una fuerte presión de selección en todos los grupos de organismos, por lo que han propiciado el desarrollo de mecanismos celulares que son sensibles a la luz y que permiten la anticipación tanto a los cambios día y noche, como a otros cambios regulares en el ambiente (Whitmore et al., 1998). Esta capacidad de acoplamiento a los ciclos día-noche le ha permitido a los seres vivos preparar y anticipar las respuestas de diversos parámetros como la actividad, la conducta alimenticia, la temperatura corporal y un sinnúmero de parámetros fisiológicos (e.g. presión arterial, ritmo cardiaco, glucosa circulante) a los distintos momentos del día (Buijs, et al., 2013) (Figura 1A). 1.2. EL NÚCLEO SUPRAQUIASMÁTICO COMO RESPONSABLE DE LOS RITMOS ENDÓGENOS. En los mamíferos, los ritmos circadianos son generados y mantenidos por un reloj neural llamado núcleo supraquiasmático (NSQ), el cual es una estructura localizada en el hipotálamo ventral en cada hemisferio cerebral(Moore, 1992; Stephan y Zucker, 1972). El NSQ, está constituido por dos principales subdivisiones, el NSQ dorsomedial y el NSQ ventrolateral (Morin, 2007). Estas regiones fueron originalmente definidas por la expresión diferencial de neuropéptidos. La región dorsomedial se caracteriza por la alta expresión de arginina-vasopresina (AVP), mientras que la región ventrolateral tiene alta expresión de péptido intestinal vasoactivo (VIP) (Samson, 1979; Vandesande & Dierickx, 1975). El organismo se acopla diariamente al ciclo de luz y oscuridad por señales fóticas que provienen directamente de la retina, llegando hasta el NSQ vía el tracto retino- hipotalámico (Moore y Lenn, 1972) Los ritmos en el NSQ son generados por dos asas de regulación de la expresión génica. El heterodímero de las proteínas CLOCK/BMAL forman el asa positiva, a través de la regulación de la transcripción de los genes per y cry. Las proteínas traducidas, PER y CRY heterodimerizan y constituyen el asa negativa, inhibiendo la transcripción del 12 heterodímero CLOCK/BMAL. Esta regulación transcripcional/traduccional aplica al NSQ, y a casi cada tejido del cuerpo. La activación de PER por las señales fóticas de la retina que llegan al NSQ, no sólo forma parte del asa de retroalimentación de los genes reloj, sino además, es un gen de activación temprana que sincroniza al reloj circadiano en el NSQ (Bollinger y Schibler, 2014). Las neuronas dentro del NSQ se comunican entre sí por conexiones sinápticas, mecanismos parácrinos, o por uniones de tipo gap; lo que permite mantener la coherencia de sus oscilaciones circadianas (Bollinger y Schibler, 2014). La liberación de neurotransmisores inducida por las oscilaciones en la actividad de las neuronas del NSQ, controlan la secreción circadiana de hormonas y la actividad del sistema nervioso autónomo (Kalsbeek y Buijs, 2002). El control circadiano de laliberación de hormonas ocurre a través de la comunicación del NSQ con el Núcleo Paraventricular del Hipotálamo (PVN) (Kalsbeek et al., 1996). Este control es realizado por la sección neuroendócrina del PVN que regula a la pituitaria, y por la salida autónoma que regula la sensibilidad a las hormonas de la pituitaria en las glándulas endócrinas blanco (Buijs et al., 1999; Engeland y Arnhold, 2005). 1.3 CONTROL CIRCADIANO DE LAS FUNCIONES AUTÓNOMAS. El NSQ transmite de forma directa el tiempo circadiano hacia múltiples tejidos a través de neuronas preautonómicas en el hipotálamo. El PVN es un blanco directo del NSQ. El PVN envía información circadiana de salida hacia varios órganos a través del sistema nervioso autónomo; por la rama simpática, localizada en la columna intermediolateral (IML) y a través de la rama parasimpática, que se encuentra en el núcleo dorsomotor del vago (DMV) (Buijs et al., 2003) (Figura 1B). 13 IGL LH Temperatura Melatonina Corticosterona Alimentación NSQ IGL LH Temperatura Melatonina Corticosterona Alimentación A B Figura 1. Estructuras blanco de salida de información del NSQ en el cerebro de la rata. A) Ritmos circadianos de la hormona leutinizante (LH), de Temperatura, Melatonina, Corticosterona y el ritmo de alimentación en rata. B)Regulación circadiana del sistema nervioso autónomo. OVLT, Órgano Vasculoso de la Lamina Termina, DBB, Banda Diagonal de Broca; MPO, Núcleo Preóptico Medial; PVN, Núcleo Paraventricular del Hipotálamo; NSQ, Núcleo Supraquiamático; ARC, Núcleo Arqueado; LH, Hipotálamo Lateral; DMH, Núcleo Dorsomedial del hipotlálamo IGL, Hojuela intergeniculada lateral; DMV, Núcleo Dorsomotor del Vago, IML, Columna intermediolateral. . Modificado de Buijs y Kalsbeek, 2001 Por ejemplo, la comunicación entre el NSQ y el PVN puede señalizar a través de vías autónomas hacia el hígado para controlar la producción de glucosa (Kalsbeek et al., 2004). Además, el NSQ es capaz de regular la función cardiaca y la producción de corticosterona dependiente de la luz en la glándula adrenal (Scheer et al., 2001; Buijs et al., 2014; Buijs et al., 1999; Ishida et al., 2005). En cuanto al sistema inmune, existen conexiones anatómicas entre el bazo, el núcleo dorsomotor del vago (DMV) y la columna intermediolateral, los cuales presentan una comunicación con el NSQ (Buijs et al., 2008). Se demostró que la respuesta inmune adaptativa del bazo es regulada al menos por la salida autónoma parasimpática en el DMV y que esto podría estar influenciado por el NSQ. 14 2. ANTECEDENTES 2.1 RESPUESTA INMUNE Los mamíferos estamos rodeados de otros organismos, en el aire, en el suelo y en el agua. Existen microorganismos sobre la piel, las mucosas y en capas protectoras de las células epiteliales que recubren los tractos gastrointestinal, urogenital y respiratorio. Mientras la mayoría de los organismos son indefensos y otros hasta benéficos, también hay organismos patógenos. Para reproducirse, muchos de los organismos patógenos, deben penetrar en el cuerpo del hospedero (Mak et al., 2014). Los organismos multicelulares se protegen mediante complicadas redes de señalización y mecanismos celulares y moleculares, los cuales son conocidos como respuesta inmune (Murphy, 2012). El sistema inmune de los mamíferos puede montar dos tipos de respuesta: la innata y la adaptativa. La respuesta inmune innata es considerada una respuesta poco específica y rápida, mientras que la respuesta adaptativa es una respuesta específica contra un patógeno determinado. Estos dos tipos de respuesta son más similares, y están más interconectadas de lo que se consideraba anteriormente. De hecho, se cree que los vertebrados son capaces de tener una repuesta continua y conjuntan ambas para combatir las amenazas (Owen et al., 2013). En esta tesis abordamos la relación entre el sistema inmune innato y los ritmos circadianos. 2.2 RESPUESTA INMUNE INNATA La respuesta de la inmunidad innata es activada por la amenaza a la homeóstasis causada tanto por agentes infecciosos y no-infecciosos. En esta respuesta se involucran todos los niveles de la respuesta inmune (Owen et al., 2013). Esta respuesta le permite al organismo eliminar las entidades no deseadas y restablecer la homeostasis de la forma más rápida posible. La respuesta innata contribuye a la reparación del tejido lesionado por trauma y a remover las células muertas, dañadas o viejas (senescentes). Los elementos del sistema inmune innato son los primeros en confrontar a la amenaza y eliminarla del cuerpo. Este sistema está constituido por barreras anatómicas y fisiológicas que bloquean la entrada de patógenos. Además, puede inducir otras respuestas si el patógeno logró entrar en el hospedero. Si las respuestas innatas no son suficientes para controlar la situación y 15 restaurar la homeostasis, es probable que se cause una infección debido a una rápida replicación del patógeno, y entonces se monta la respuesta adaptativa (Mak, et al., 2014). 2.3 CITOCINAS. Tanto en la inmunidad innata como en la adaptativa, los leucocitos deben comunicarse entre ellos para generar una respuesta. Las citocinas son péptidos o glicoproteínas de bajo peso molecular de estructura y función diversa. Estos factores permiten la comunicación entre las distintas células que constituyen el sistema inmune. Son secretados principalmente por leucocitos, aunque también pueden ser secretados por otras células. Regulan la respuesta inmune, la hematopoyesis y otros procesos fisiológicos (Owen et al., 2013). Las citocinas son inducidas durante ambos tipos de respuesta inmune y frecuentemente estimulan la secreción de otras citocinas. Entre las citocinas más importantes están las interleucinas, los interferones, el factor de necrosis tumoral α (TNF-α), el factor de crecimiento transformante β (TGFβ), el factor estimulante de colonia (CSFs) y las quimiocinas (Owen et al., 2013). 2.4 EL LIPOPOLISACÁRIDO (LPS) COMO ESTÍMULO PARA INVESTIGAR LA RESPUESTA INMUNE INNATA La endotoxemia es utilizada como un modelo de respuesta inflamatoria sistémica. En este modelo, una dosis de lipopolisacárdido (LPS), es inyectado intravenosa o intraperitonealmente. El LPS es una molécula presente en la membrana externa de las bacterias Gram-negativas y es reconocido por el receptor tipo toll 4 (TLR4) y la proteína CD14 presentes en una gran variedad de células. Esta unión desencadena la activación de NF-κB. (Laflamme y Rivest, 2001) La endotoxemia induce cambios en el sistema inmune incrementando los niveles de citocinas proinflamatorias (TFN-α, IL-1β, e IL-6) y citocinas anti-inflamatorias (e.g. IL-10). Además, la endotoxemia genera radicales libres, como las especies reactivas de oxígeno, que causan daño celular y tisular (Revisado en Alamili et al., 2013). 2.5 CONTROL CIRCADIANO DE LA RESPUESTA INMUNE. Diversas funciones del sistema inmune presentan una regulación circadiana, por lo que oscilan de acuerdo a las fases de descanso-actividad. Por ejemplo, el número de leucocitos maduros en la circulación aumenta durante la fase de descanso, esta liberación 16 desde la médula ósea a la circulación depende del control local simpático (Haus y Smolensky, 1999). También los niveles de glucocorticoides (cortisol en humanos y corticosterona en roedores), adrenalina, noradrenalina y citocinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral (TNF) y de Interleucina 1β (IL-1β) son más altos durante el inicio de la fase de actividad comparados con la fase de descanso. Estas observaciones pueden tener implicaciones en la asociación entre ritmos circadianos y el inicio de enfermedades (Scheiermann et al., 2013). Resultados previos del laboratorio han mostrado que en la rata, la respuesta ante un reto inmune conLPS depende de la hora del día. La respuesta de la inmunidad innata es más alta en la noche que en el día. La producción de citocinas proinflamatorias después de un reto con LPS i.v es mayor en la noche que en el día tanto en dosis bajas (1.6 µg/kg), como en dosis altas (100 µg/kg) de LPS (Guerrero-Vargas et al., 2014). Además, la administración de LPS en la fase de actividad aumenta la actividad neuronal del NSQ, lo cual indica que hay una relación entre la respuesta inmune y el marcapasos maestro (Figura 2). Con base en lo anterior surge la pregunta: ¿Cuál es la vía por la cual el NSQ recibe información ante un reto inmune? Vehículo LPS Día Noche Día Noche Vehículo LPS C él u la s p o si ti va s a c- FO S A B Figura 2. Un reto inmune con LPS durante la noche induce la activación del Núcleo Supraquiasmático. A) Cortes coronales del NSQ con inmunohistoquímica de c-FOS (marcador de activación neuronal) después de la administración de LPS en el día o la noche. B) Cuantificación de la cantidad de células positivas a c-FOS para cada condición (Guerrero-Vargas et al.,2014) 17 2.6 ENTRADA DE INFORMACIÓN INMUNE AL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL 2.6.1 Órganos Circunventriculares. La información inmune de la circulación llega al cerebro a través de los órganos circunventriculares (CVOs). Los CVOs se encuentran en la línea media del cerebro rodeando los ventrículos y están desprovistos de una barrera hematoencefálica funcional debido a la presencia de capilares fenestrados (Dantzer et al., 2008) (Figura 3). El Área Postrema (AP), la eminencia media (EM) el órgano subfornical (SFO) y el órgano vasculoso de la lámina terminal (OVLT) expresan receptores para el LPS y para el TNF-α (Laflamme y Rivest, 2001; Nadeau y Rivest, 1999). Existen diferentes mecanismos por los que las citocinas pueden activar a los CVOs: 1) el transporte activo a través del endotelio de la barrera hematoencefálica, 2) la señalización inducida por terminales sensoriales periféricas a través del nervio vago y, 3) por el acceso directo de las citocinas circulantes o las endotoxinas a las neuronas y/o microglia sensoriales en los CVOs (Cottrell y Ferguson, 2004; Dantzer et al., 2008). Los CVOs se conectan con distintas estructuras hipotalámicas como el PVN y el NSQ (Shapiro y Miselis, 1985; Yi, et al.,, 2010). El NSQ recibe aferencias monosinápticas desde el SFO y polisinápticas desde el OVLT y el AP (Krout et al., 2002) lo que indica que la información de la periferia, en el caso de la respuesta inmune, puede llegar hasta el NSQ a través de la circulación. 4to ventrículo Macrófagos Citocinas LPS Figura 3. Vía humoral de entrada de información inmune al cerebro A la derecha se señala una célula capaz de detectar y responder ante el LPS en el CVO AP. SFO, Órgano Subfornical; OVLT, Órgano Vasculoso de la Lámina Terminal; ME, Eminencia Media; AP, Área Postrema; CP, Plexo Coroides; NTS, Núcleo del Tracto Solitario; LPS Lipopolisacárido; TLR, Receptor tipo toll (Dantzer et al., 2008). 18 2.6.2 Información sensorial visceral. El sistema nervioso autónomo está formado por dos divisiones principales, simpática y parasimpática, cada una con características anatómicas y funcionales particulares. Ambas ramas incluyen neuronas motoras que inervan y controlan la fisiología de los órganos viscerales, las glándulas sudoríparas y los vasos sanguíneos. Las fibras sensoriales de los órganos viscerales acompañan a los axones de las neuronas motoras autónomas de cada división (Watson, et al., 2010). Aferencias Vagales. El cerebro recibe información visceral a través de nervios sensoriales periféricos, siendo las aferentes vagales las más estudiadas (Watkins et al.,1995). Las células de la respuesta inmune liberan IL-1 ante diversos estímulos inmunes y activan directamente a las neuronas aferentes vagales (Niijima, 1996). Las neuronas bipolares sensoriales vagales se localizan en el ganglio nodoso. En este sitio se ha detectado la presencia de TLR4, sugiriendo que el LPS puede ser reconocido directamente a través de las aferentes vagales (Hosoi et al., 2005). Estas aferencias llegan al Núcleo del tracto Solitario (NTS) y al CVO-AP (Saper, 2005). El NTS está localizado en el tallo cerebral y se encarga de procesar información visceral y gustatoria. Esta estructura recibe la información sensorial primaria necesaria para la regulación de las funciones autónomas. Estas entradas sensoriales vienen de casi todos los órganos y tejidos inervados por vías autónomas (Card y Sved, 2011). El nervio vago inerva órganos viscerales como el hígado, pulmón, bazo, riñones e intestino. Se ha sugerido que el nervio vago tiene un papel en la respuesta inflamatoria (Tracey, 2002). Se ha propuesto que la estimulación eléctrica vagal disminuye la producción de TNF-α en el hígado, bazo y corazón durante la endotoxemia con LPS (Bernik et al., 2002; Borovikova et al., 2000). La vía colinérgica del nervio vago y su participación en la inhibición de la respuesta inmune, se conocen desde entonces como “el reflejo inflamatorio”. Recientemente, Cailotto et al., (2012) demostraron las conexiones neuroanatómicas del reflejo inflamatorio y su activación durante la inflamación de los intestinos en un modelo de trauma de ileum post-operatorio. Aferencias Espinales. Los nervios espinales que entran a la médula espinal se dividen en dos ramas o raíces principales: la raíz dorsal, que incluye a los axones de los cuerpos celulares del 19 ganglio de la raíz dorsal; y la raíz ventral por la que viajan los axones motores provenientes del cuerno ventral. Las raíces dorsales en la rata se agrupan en pares de 8 cervicales, 13 torácicas, 6 lumbares, 4 sacras y 3 caudales (Bear et al., 2007). Las aferentes sensoriales de la médula espinal que señalizan al cuerno dorsal (CD) han sido descritas por su capacidad de transmitir señales de dolor hacia la médula espinal (Schwenger et al., 2007). Se ha propuesto que los transmisores espinales asociados al dolor participan en la señalización de información desde el tracto gastrointestinal (Reinshagen et al., 1998; Van Nassauw et al., 2007) Las láminas 1 a 4 del CD reciben información visceral y a su vez envían información hacia el NTS o indirectamente a través del núcleo parabraquial (Craig, 2002). Además de la información vagal, el NTS recibe información de los órganos viscerales desde el cuerno dorsal (CD) de la médula espinal (Craig, 2002) (Figura 4). Aferentes espinales Aferentes vagales NTS Figura 4. Sistema sensorial visceral autónomo. Tanto la vía vagal como la vía espinal son capaces de enviar información sensorial al NTS. Modificado de Craig, (2002) 2.7 EL HÍGADO COMO ÓRGANO DE REPUESTA INMUNE Durante la digestión, los macronutrientes son absorbidos en el tracto gastrointestinal. Posteriormente, entran a la vía portal-hepática y llegan hasta el hígado. En el hígado hay macrófagos residentes conocidos como células de kupffer (CKs) los cuales hacen contacto con el material absorbido por el tracto gastrointestinal. Las CKs son uno de los principales depósitos de macrófagos en el cuerpo. Las CKs se encuentran 20 en el área periportal de los sinusoides hepáticos y participan en la eliminación de bacterias y endotoxinas derivadas de la vía gastrointestinal, a través de la vena porta (Owen et al., 2013). Algunas evidencias indican que el aumento de la actividad de las CKs podría estar implicado en varias enfermedades del hígado, como la hepatitis viral, cirrosis hepática y la activación o el rechazo del hígado durante un trasplante hepático (Kolios et al. , 2006). Las CKs poseen receptores a neurotransmisores autónomos clásicos como acetilcolina, noradrenalina y neurotransmisores sensoriales como substancia P (Sub P) (Tracey, 2002). En el hígado se han descrito otras fibras nerviosas como elpéptido intestinal vasoactivo (VIP) y el péptido relacionado al gen de la calcitonina (CGRP) (Tiegs et al., 1999). Las proyecciones primarias de CGRP llegan a láminas I y II del Cuerno Dorsal y colocalizan con la neuroquinina Sub P (Ju et al., 1987). En el hígado, el CGRP ha sido caracterizado por tener propiedades anti-inflamatorias disminuyendo la cantidad de citocinas proinflamatorias después de un reto con LPS (Kroeger et al., 2009). Nuestra pregunta de investigación se enfoca en saber cómo llega la información de una infección hasta el cerebro. Además, determinar si a través de las diferentes vías de entrada de información sensorial autónoma (vagal y espinal) y/o por la circulación, es que el LPS puede ser reconocido para que la información pueda ser transmitida desde la periferia al hipotálamo, hasta llegar al NSQ. 21 3. OBJETIVO. Investigar la transmisión de la información inmune de un reto con LPS desde el hígado hasta el sistema nervioso central a través de las fibras sensoriales autónomas, 4. HIPÓTESIS. Al administrar LPS, se transmitirá la información del reto inmune desde el hígado hasta el hipotálamo y al Núcleo Supraquiasmático. 4.1 HIPÓTESIS PARTICULARES. - Después de administrar el LPS, se activaran el Cuerno Dorsal (CD), el Núcleo del Tracto Solitario (NTS), el Área Postrema (AP) y el NSQ. - Después de una denervación simpática hepática, disminuirá la actividad del CD y del NTS. - Después de una denervación parasimpática hepática, disminuirá la actividad del NTS y del AP, pero la actividad del CD no se verá afectada. - El NSQ recibirá información desde el NTS y el CD los cuales reciben información por un reto inmune con LPS. 5. MATERIALES Y MÉTODOS 5.1 ANIMALES Se utilizaron ratas macho de la cepa Wistar de 8 semanas de edad y de 220-250 gramos de peso. Todos los experimentos y manipulación de los animales fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad Nacional Autónoma de México en estricto acorde con las Normas Mexicanas de uso y manipulación animal, Norma Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999. Los animales se mantuvieron en condiciones ad libitum de agua y alimento y en ciclos de luz oscuridad 12-12h con encendido a las 7 a.m. y 22 apagado a las 7 p.m. Los animales fueron provistos por el bioterio de la Facultad de Medicina, UNAM. De acuerdo a las hipótesis de este proyecto se realizaron tres experimentos independientes como se describe a continuación. 5.2 EXPERIMENTO 1. ACTIVACIÓN NEURONAL POR EL LPS DE LOS CENTROS DE INTEGRACIÓN SENSORIAL NEURONAL Y HUMORAL. Para determinar si existe activación neuronal en el NTS, el CD, el AP y el NSQ después de un reto con LPS, se realizó lo siguiente: Implantación de cánula intravenosa. Se inyectó a los animales una mezcla de Ketamina (Anestek, PiSA, Mexico, 50 mg/kg) y Xilacina (Procin, PiSA, Mexico; 8 mg/kg) intramuscular. Se implantó una cánula de polietileno (0.025 pulgadas de diámetro interno X 0.047 de diámetro externo, Silastic Laboraty tubing; Dow Corning Corp., Midland, MI, USA) en la vena yugular externa. La cánula se llenó con heparina (500µg/mL) como anti- coagulante. La cánula se exteriorizó y fijó en el cuello en medio de la cintura escapular. La cánula se cerró con un tapón de acero estéril. Las ratas estuvieron en un periodo de recuperación de 7 días después de la cirugía, hasta el día del experimento en las condiciones controladas ya descritas. En todos los experimentos se indujo la endotoxemia por una inyección intravenosa (i.v.) de LPS (Escherichia coli serotipo 0127:B8, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, Lote No. 051M4004) resuspendido en solución salina al 0.9% (Baxter, México). Se realizó una serie de diluciones del vial de LPS hasta llegar a alícuotas de 1mg/ml. A las ratas del grupo control se les inyectó vehículo (0.9% solución salina estéril libre de pirógenos; 1mL/kg) y a las tratadas con LPS se les administró una dosis de 1.6 µg/kg. 5.3 EXPERIMENTO 2. DENERVACIONES DEL SISTEMA AUTÓNOMO HEPÁTICO Para evaluar si las inervaciones hepáticas envían información hasta el Cuerno Dorsal y al NTS-AP se utilizaron animales de entre 220 y 250g a los que se les realizaron denervaciones selectivas de los nervios hepáticos, ya fueran simpáticas o parasimpáticas. 23 En animales anestesiados con xilacina y ketamina, se realizó una laparotomía en la línea media utilizando un microscopio estereoscópico y se les realizó alguno de los siguientes protocolos: Simpatectomía hepática (Sx) (n=7). Se removieron los nervios circundantes a la arteria hepática, así como cualquier tejido conectivo uniendo la arteria hepática, el ducto biliar y la vena portal, eliminando cualquier posible nervio entrecruzado. Parasimpatectomía (Psx) (n=7). Se visualizó al estómago y al esófago y se cortó el nervio entre el tronco ventral del vago y el hígado. Se cortó también la rama vagal hepática ventral proveniente desde del estómago. La parasimpatectomía hepática se realizó de esta forma con base en la validación de trabajo previo (Kalsbeek et al., 2004). Sham (Sh) (n=10). Se realizó el mismo procedimiento de laparotomía en otro grupo de ratas. Sin embargo, sólo se identificaron los nervios o las regiones dónde se encuentran los nervios, pero sin tocarlos. Se dejó recuperar 3 semanas después de la cirugía a todos los animales para evitar el perfil proinflamatorio debido a la laparotomía. Se realizó otra cirugía donde se implantó la cánula intravenosa en la yugular de la forma antes mencionada y se dejaron recuperar por 7 días. 5.3.1 Diseño experimental de los experimentos 1 y 2. Antes de inyectarse el LPS, las ratas fueron trasladadas desde el bioterio hasta una habitación independiente con luz y temperatura controladas con un mínimo de 6 horas de anticipación. Con base en la inducción de la actividad del NSQ por un reto con LPS (Guerrero-Vargas et al., 2014), los experimentos se realizaron en la fase de oscuridad utilizando luz roja. Dos horas después del comienzo de la fase de oscuridad, se tomó la primer muestra de sangre para cuantificar los niveles basales de TNF-α (tiempo 0). Inmediatamente después se inyectó el LPS o la solución vehículo a las dosis indicadas previamente. La siguiente muestra se tomó a los 20, minutos después de la administración de LPS o vehículo. Las muestras de sangre se centrifugaron a 7000 rpm durante 8 minutos. Se aisló el suero y se almacenó a – 20°C hasta su uso. Se determinó la cantidad de TNF-α en suero por ELISA de acuerdo a las recomendaciones del 24 fabricante (ThermoFisher Scientific, Rockford, USA, #ER3TNFA5). Se usaron curvas estándar para determinar las concentraciones de TNF-α y los resultados se expresaron en picogramos por mL. Se determinaron los niveles de TNF-α séricos de los 0 y 20 min después del estímulo con LPS, debido a que la expresión de c-FOS en el cerebro sólo aparece después de 60 min después de un estímulo. Por lo tanto, si se analizan los niveles de TNF-α de los 20 minutos, se verá su aporte a la expresión de c-FOS hasta los 80 minutos. Perfusión intracardiaca. 80 minutos después de la inyección con LPS o vehículo, los animales fueron sacrificados bajo anestesia con pentobarbital sódico (Pisabental, PiSa, Atalaquia, Hgo, México; 65mg/mL). Se perfundió a los animales con solución salina al 0.9% y paraformaldehido al 4%. El cerebro y la médula espinal permanecieron 24 horas más en paraformaldehido y por dos noches en sacarosa (30 %) para su crioprotección. Se realizaron cortes coronales de 40 µm para el análisis por inmunohistoquímica. Imunohistoquímica para c-FOS (Marcador de actividad neuronal). Se seleccionaron cortes del NSQ, NTS, del Área Postrema y del Cuerno Dorsal para realizar la inmunohistoquímica por libre flotación. Se seleccionaron 6 cortes que incluyeran cada región de interés.Se lavaron los cortes con buffer de fosfatos (PBS, pH: 7.6) y se incubaron con el anticuerpo primario policlonal de conejo dirigido contra c-FOS (Factor de dilución de 1:4000, Calbiochem, CA, U.S.A.) diluido en PBS adicionado con 0.5% de Tritón X-100 (Sigma-Aldrich) y 0.25% de albúmina sérica bovina (Roche). Los cortes se incubaron a temperatura ambiente por 1 hora y luego a 4°C durante toda la noche en agitación constante. Los cortes se lavaron con PBS y se incubaron con el anticuerpo secundario de burro anti-conejo conjugado con peroxidasa (Jackson Immunoresearch, West Grove, PO, USA; Factor de dilución de 1:500) durante una hora y media a temperatura ambiente. Posteriormente, los cortes fueron incubados con el complejo avidina-biotina (Vector, Burlingame, CA, USA, Factor de dilución 1:500) durante una hora y media. El revelado de la reacción se realizó incubando los cortes con una solución de Diaminobenzidina (DAB) al 0.025%, 0.0005% de NiNH4SO4, y 0.01% de peróxido de hidrógeno en PBS y trizma ® (TBS, 0.01M, pH, 7.6) durante 12 min. Los cortes se montaron sobre portaobjetos gelatinizados. Para cubrir los cortes, se sumergieron en un tren de concentraciones ascendentes de etanol (70, 96, 100%) y xilol. Finalmente se colocó el cubreobjetos usando Entellan como medio de montaje (Merck). 25 Inmunohistoquímica de hígado para Tirosina Hidroxilasa (TH) y Neuropéptido Y (NPY). Se realizaron cortes de 40 µm de grosor de la muestra de hígado perfundido de los animales Sx, Psx y Sh. Para disminuir la reactividad de las peroxidasas de hígado se incubaron los cortes con peróxido de hidrógeno al 3% en PBS durante 10 minutos en agitación suave a temperatura ambiente. Los cortes se lavaron con PBS y se bloquearon con una solución de PBS con 0.5 % de suero fetal bovino y 0.5 % de albúmina sérica bovina durante media hora a temperatura ambiente. De forma independiente, cortes distintos se incubaron con anticuerpos primarios de conejo contra TH (Millipore, Factor de dilución 1:300) o NPY (Buijs et al., 1989) diluidos en buffer de fosfatos y Trizma ® (TBS 0.25% gelatina, 0.5% tritón X-100, pH:7.6) en agitación durante 1 hora a temperatura ambiente y luego a 4°C durante toda la noche en agitación constante. La señal fue revelada de la misma forma que para la inmunohistoquímica de c-FOS, con excepción de que para la incubación del anticuerpo secundario y del complejo avidina-biotina se usó el buffer de fosfatos y Trizma ® mencionados en este apartado. Los cortes se montaron y cubrieron de la forma antes descrita. 5.4 EXPERIMENTO 3. INYECCIÓN DE TRAZADOR NEURONAL EN EL NÚCLEO SUPRAQUIASMÁTICO Y EN EL NÚCLEO DEL TRACTO SOLITARIO Para determinar la existencia de las conexiones anatómicas entre el NSQ y el NTS se realizó lo siguiente: Inyecciones en el NSQ. Se usaron ratas de 250 g de peso. Se realizaron inyecciones del trazador neuronal retrógrado CtB (subunidad B de la toxina de Cólera, 0.5%), con una microjeringa en un aparato estereotáxico al núcleo supraquiasmático de 40 ratas. El arco dentario se colocó a -2.5 mm y se colocó la jeringa en una inclinación de 10°. Las coordenadas usadas en el aparato estereotáxico, tomando a Bregma como referencia, fueron las siguientes: -0.2mm, + 8mm laterales a la línea media y 7.9mm de profundidad desde la superficie del cerebro. Inyecciones en el NTS. Se usaron ratas de 250 g de peso. Se inyectó CtB acoplado a Cy3 al 0.5%, usando el aparato estereotáxico. Se fijó la cabeza de la rata a 45°. Se expuso la superficie dorsal del tallo cerebral cortando la membrana dura y la aracnoides al nivel del área postrema. Para inyectar en el NTS, se usó la punta de una micropipeta alineada de 26 forma perpendicuar a la médula y colocada 0.4mm rostral, 0.5mm lateral del obex. 0.5 mm por debajo de la superficie del tallo cerebral. Después de 10 días de la inyección del trazador se sacrificó a los animales por perfusión intracardiaca y se obtuvieron cortes coronales del tallo cerebral del NSQ y del CD de 40 µm de grosor para su posterior análisis por inmunohistoquímica contra el trazador neuronal. Inmnohistoquímica para CtB. Para el análisis de las inyecciones en el NSQ y el NTS, se seleccionaron cortes del núcleo del tracto solitario (NTS) justo en los niveles donde los cortes corresponden al sobrelapamiento con el órgano circunventricular área postrema; cortes del NSQ (-13.68 hasta -14.40 con respecto a Bregma) y del CD, desde la Cervical 1, hasta Torácico 13. Los cortes se incubaron con anticuerpo primario de conejo contra CtB (Factor de dilución 1:10000). Desde este punto se continuó de la misma forma que para la inmunohistoquímica de c-FOS. Se montaron y cubrieron los cortes de la forma antes descrita. 5.5 IMAGENOLOGÍA Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO. Para la cuantificación de la inmunohistoquímica de c-FOS de los experimentos 1 y 2 se tomaron fotografías digitales de los cortes usando un microscopio Axioplan (Zeiss, Jena, Alemania) equipado con una cámara digital a color (Olympus DP25, Japón). Se tomaron 6 fotografías bilateralmente de cada región (CD, NTS, AP y NSQ) en cada cerebro. El número de células positivas a c-FOS se cuantificó usando el programa Image J (1.42q, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Se estableció una circularidad de 0.5 a 1.0 y de 20 a 200 pixeles para las marcas positivas. Los datos cuantitativos se expresaron como la media ± el error sobre la media (ESM). Se analizaron los resultados mediante una prueba de ANOVA de una vía y con una comparación múltiple de Tukey. Para el análisis de TNF-α en suero se realizó una prueba ANOVA de dos vías de medidas repetidas (Tiempo después del LPS: 0, 20 min; x Condición: Sham Salina, Sham LPS, Sx LPS y Psx LPS) seguido de una prueba de Bonferroni para comparaciones múltiples. Se consideraron estadísticamente significativos aquellas diferencias con valores de p<0.05. Las tablas con los datos estadísticos completos se muestran en el ANEXO 1. 27 6. RESULTADOS. 6.1 EXPERIMENTO 1. LAS VÍAS NEURALES Y HUMORALES TRANSMITEN INFORMACIÓN INMUNE AL CEREBRO Y AL NÚCLEO SUPRAQUIASMÁTICO. El estímulo con LPS indujo un aumento estadísticamente significativo de los niveles de TNF-α a los 20 minutos posteriores al estímulo (n=10), en comparación con los animales inyectados con solución salina (n=5) (ANOVA 2vías de medidas repetidas: TIEMPO: p <0.01; RETO: p <0.05; INTERACCIÓN: p <0.05; Figura 5) 0 20 0 50 100 Tiempo después del LPS (min) a,b LPS Salina TN F- e n su er o (p g/ m l) Figura 5. Niveles de TNF-α en suero después de la inyección i.v. de LPS (1.6µg/kg) o Salina. TNF-α en suero después de la administración de solución salina (barras blancas) o LPS (barras grises). Las barras corresponden al promedio ± e.s.m.a, p<0.05 vs 0 minutos, b p<0.01 vs Salina, por prueba pos hoc de Bonferroni. En cuanto a la activación neuronal, medida a través de la expresión del marcador c-FOS, el reto i.v. con 1.6µg/kg de LPS aumentó el número de células positivas a c-FOS en el cuerno dorsal (CD) de la médula espinal, evaluado en los niveles torácicos T5 a T7, p<0.001) (figura 6A y 6B), comparado con la administración de solución salina. Además, el reto con LPS también generó el incremento en el número de células positivas para c- FOS en el Núcleo del tracto solitario (NTS) (p<0.01) (Figura 6, D-F), en el órgano circunventricular área postrema (AP) (p<0.05; Figura 6H) y en el NSQ (p<0.05) (Figura 6, J-L). 28 0 20 40 60 80 100 b cé lu la s po si tiv as a c -F O S 0 5 10 15 20 c cé lu la s po si tiv as a c -F O S 0 5 10 15 20 a Sham Sal Sham LPS cé lu la s po si tiv as a c -F O S 3V LP S NSQ Bregma – 0.72mm J K Sa l A D G B E H C F I L N S Q AP A P N TS C D 0 50 100 150 c cé lu la s po si tiv as a c -F O S CD Figura6. El LPS induce aumento de la actividad neuronal en centros de integración sensorial neuronal, humoral y en el NSQ. Niveles de c-FOS en el A-C) Cuerno Dorsal, D-F) Núcleo del Tracto Solitario, G-I) Área Postrema y el J-L) Núcleo Supraquiasmático después de la administración de Salina (n=5) o LPS (n=10). Las barras corresponden al promedio ± e.s.m. a p<0.001, b p<0.01, c p<0.05 por t student vs Salina. 6.2 EXPERIMENTO 2. DENERVACIONES HEPÁTICAS SELECTIVAS Con la finalidad de corroborar que la denervación simpática del hígado se realizó correctamente, se analizó la presencia de tirosina hidroxilasa (TH), una de las enzimas involucradas en la síntesis de catecolaminas y del Neuropéptido Y en cortes hígado mediante inmunohistoquímica. De los 7 animales simpatectomizados, sólo 3 fueron 29 incluidos en el grupo de animales correctamente simpatectomizados, pues presentaron <10% de inmunoreactividad para TH y NPY en el hígado respecto a los animales control. La visualización de las neuronas con marcaje para TH fue complicada en la mayoría de los animales y de los cortes analizados. Al realizar una doble inmunofluorescencia contra TH y NPY, se encontró que ambas marcas colocalizan, por lo que a partir de la cantidad de NPY se pudo inferir la cantidad remanente de fibras de la rama simpática (Anexo 2 y 3). 6.2.1 La rama simpática hepática inhibe la producción de TNF-α ante un reto con LPS. El reto con LPS causó un incremento exacerbado en los niveles de TNF-α a los 20 minutos en los animales con denervación simpática (Sx) en comparación con todos los otros grupos (ANOVA 2vías medidas repetidas: TIEMPO: p <0.0001; GRUPO: p <0.0001; INTERACCIÓN: p <0.0001) (Sham Sal n=5, Sham LPS n=10, Sx LPS n=3, Psx LPS n=7). 0 20 0 50 100 150 200 800 1000 1200 Sham LPS Sx LPS Psx LPS Tiempo después del LPS (min) Sham Salina a,b TN F- e n su er o (p g/ m l) Figura 7. Producción de TNF-α en suero después de un reto con LPS en animales con denervación selectiva hepática. TNF-α en suero de animales Sham Sal (barras blancas), Sham LPS (barras grises), Simpatectomizados (Sx) LPS (barras negras) y de Parasimpatectomizados (Psx) LPS (barras rayadas). Las barras corresponden al promedio ± e.s.m. a p<0.001 vs Sham Salina, b p<0.001 vs Sham LPS, c p<0.001 vs Psx LPS por prueba pos hoc de Bonferroni (Sham Sal n=5, Sham LPS n=10, Sx LPS n=3, Psx LPS n=7) 30 6.2.2 La simpatectomía hepática interrumpe el paso de la información inmune sensorial espinal. En los animales con una denervación selectiva simpática, no se indujo la expresión de c- FOS por el LPS en el CD, específicamente en los niveles T5 a T7 de la médula espinal. En contraste, en los animales Sham y en los animales con denervación selectiva parasimpática tratados con LPS, la cantidad de células positivas para c-FOS, aumentó de manera significativa (p<0.01 y p<0.001 respectivamente) (Figura 8). A B C D E Cuerno Dorsal 0 5 10 15 20 a Sham LPS b Sham Sal Sx LPS Psx LPS cé lu la s po si tiv as a c -F O S Figura 8. Actividad neuronal en el CD en animales denervados selectivos después del LPS. A) Sham Salina, B) Sham LPS, C) Sx LPS, D) Psx LPS, E) Cuantificación de la actividad neuronal en el Cuerno Dorsal. Sham Sal (barras blancas), Sham LPS (barras grises), Sx LPS (barras negras) y de Psx LPS (barras rayadas). Las barras corresponden al promedio ± e.s.m Las líneas punteadas muestran el área cuantificada correspondiente a las láminas I-IV del CD. a p<0.01, b p<0.001 vs Salina por prueba pos hoc de Tukey. En la región del Núcleo del Tracto Solitario (NTS) incrementó la actividad neuronal, en respuesta al LPS, en forma similar en todos los grupos de animales al compararlos con el grupo de animales Sham con solución salina. (p<0.05 al comparar todos los grupos contra Sham-Sal). 31 A B C D E NTS 0 50 100 150 Sham Sal Sham LPS Sx LPS a a a Psx LPS cé lu la s po si tiv as a c -F O S Figura 9. La denervación selectiva hepática no interrumpe la transmisión de información de la respuesta inmune al NTS. A) Sham Salina, B) Sham LPS, C) Sx LPS, D) Psx LPS E) Cuantificación de la actividad neuronal en el Núcleo del tracto Solitario después de un reto con LPS. Sham Sal (barras blancas), Sham LPS (barras grises), Sx LPS (barras negras) y de Psx LPS (barras rayadas). Las barras corresponden al promedio ± e.s.m. La región dentro de la línea punteada corresponde al NTS. a p<0.01 vs Salina por prueba pos hoc de Tukey. 6.2.3 La falta de inervación simpática o parasimpática hepática no modificó la activación del Área Postrema (AP) después de una inyección con LPS. La administración de LPS no indujo cambios estadísticamente significativos en los niveles de células positivas para c-FOS en el AP en ningún grupo, al compararlos con los animales Sham Sal (Figura 10). Sin embargo se observó una tendencia en el aumento de la actividad neuronal en el AP en todos los grupos por la administración con LPS (p=0.0630) 32 A C D E B AP 0 10 20 30 40 50 Sham Sal Sham LPS Sx LPS Pxs LPS cé lu la s po si tiv as a c -F O S Figura 10. Actividad neuronal en el AP después de denervaciones hepáticas selectivas. A) Sham Salina, B) Sham LPS, C) Sx LPS, D) Psx LPS, E) Cuantificación de la actividad neuronal en el Área Postrema después de un reto con LPS. Sham Sal (barras blancas), Sham LPS (barras grises), Sx LPS (barras negras) y de Psx LPS (barras rayadas). Las barras corresponden al promedio ± e.s.m. La región dentro de la línea punteada corresponde al Área Postrema. 6.2.4 Las ramas autónomas hepáticas participan en la transmisión de la información al NSQ después de un reto con LPS. No se observó cambio en la actividad neuronal del NSQ después del reto con LPS entre los distintos grupos, respecto a los animales Sham Sal (p=0.0824). Sin embargo, se encontró una activación diferencial de las zonas dentro del NSQ por la administración del LPS. El grupo Sx mostró una tendencia a disminuir la actividad neuronal causada por el LPS, aunque, esta diferencia no alcanzó significancia estadística. En los Psx se activó la región ventrolateral a diferencia de la activación dorsomedial observada en los animales Sham (Figura 11). 33 E NSQ 0 50 100 150 Sham Sal Sham LPS Sx LPS Psx LpS cé lu la s po si tiv as a c -F O S 3V CO 3V 3V CO CO A B C D CO VL DM VL DM VL DM VL DM Figura 11. c-FOS en el Núcleo Supraquiasmático después de una inyección con LPS en animales con denervación hepática selectiva. A) Sham Salina, B) Sham LPS, C) Sx LPS, D) Psx LPS, E) Cuantificación de la actividad neuronal en el NSQ después de un reto con LPS. Sham Sal (barras blancas), Sham LPS (barras grises), Sx LPS (barras negras) y de Psx LPS (barras rayadas) Las barras corresponden al promedio ± e.s.m. La región punteada corresponde al NSQ. DM, Supraquiasmático Dorsomedial; VL, Supraquiasmático Ventrolateral, CO, Quiasma Óptico; 3V, Tercer Ventrículo 6.3 EXPERIMENTO 3. CONEXIONES RECIPROCAS ENTRE EL NÚCLEO SUPRAQUIASMÁTICO Y EL NÚCLEO DEL TRACTO SOLITARIO. La inyección de CtB en el núcleo supraquiasmático causó una distribución bilateral de neuronas marcadas preferentemente en el NTS ipsilateral a la inyección. Además, las inyecciones que alcanzaron la parte ventral del NSQ mostraron neuronas trazadas de forma retrógrada en la región más caudal del NTS (desde -13.68mm hasta -14.40mm con respecto a Bregma) (Figura 12). . 34 Sitio de la inyecciónA NTS DMV B Bregma -0.72mm Figura 12. El NSQ recibe aferencias del NTS. A) Corte de cerebro de rata que muestra el sitio de inyección del trazador neuronal en el NSQ a un nivel anteroposterior de -0.72mm con respecto a bregma. Publicado en Buijs et al., (2014). B) Neuronas positivas a CtB. La región punteada en A señala el NSQ. Las flechas señalan somasdentro del NTS. La médula espinal presentó somas en los niveles cervicales 1 y 2 en las láminas I y II, así como en el núcleo espinal lateral (LSP) de las cervicales 2 y 3 (Figura 13). Las inyecciones control no presentaron somas ni fibras en ninguna de las áreas mencionadas. B B C D DC A Figura 13. El cuerno dorsal y la médula espinal lateral en la médula espinal tienen proyecciones directas al NSQ. A) Diagrama de los niveles cervicales 1 y 2 Paxinos y Watson (2009) B,C)Los niveles Cervicales 1 y 2 de la médula espinal muestran células positivas a CtB en las láminas I y II. D) La médula espinal lateral muestra células positivas a CtB en los niveles cervicales 2 y 3. . 35 Por otra parte, la inyección de CtB en el NTS mostró un trazado anterógrado y retrógrado. Se localizaron fibras neuronales en el NSQ ventrolateral. Se encontraron también somas positivos en la parte dorsomedial del NSQ (Figura 14). La mayoría de las fibras neuronales se encontraron ipsilaterales aunque también hubo algunas proyecciones contralaterales al sitio de la inyección NTS CC CtB NSQ OC 3VA B Figura 14. El NTS envía proyecciones a la región ventrolateral del NSQ. A) Sitio de la inyección de trazador neuronal en el NTS. B) El NSQ recibe aferencias del NTS confirmado por la presencia de fibras en la parte ventrolateral (flecha blanca). CC, Canal central; OC, Quiasma óptico; 3V, tercer ventrículo. Publicado en Buijs et al. (2014) 36 7. DISCUSIÓN 7.1 ACTIVACIÓN DE LAS ENTRADAS DE INFORMACIÓN SENSORIAL ESPINAL, VAGAL Y HUMORAL. La administración de LPS como endotoxina ha sido una herramienta utilizada desde hace tiempo para demostrar que el cerebro ejerce un efecto sobre el control de la respuesta inmune periférica (Schedlowski et al., 2014). Se ha propuesto que el hipotálamo recibe señales internas y externas de retroalimentación que permiten al organismo realizar sus funciones y reajustar su fisiología (Buijs y Kalsbeek, 2001). La activación del CD, del NTS y del AP, observada en este trabajo, nos indica que el cerebro recibe información de un reto inmune provocado por la inyección i.v. de LPS. Activación del Cuerno Dorsal. Los datos de este trabajo demuestran por primera vez que el LPS induce la actividad neuronal de la región sensorial (CD) de la médula espinal. La información sensorial se integra en las láminas I a IV, las cuales son inervadas por las aferentes sensoriales (Craig, 2002; Paxinos y Watson, 2009). Esto sugiere que hay una participación de las vías sensoriales espinales en la transmisión y regulación de la respuesta inmune, inducida por el LPS, hacia el Sistema Nervioso Central. La administración de LPS incrementa la expresión de c-FOS en células de la columna intemediolateral (IML), señalando activación neuronal de la eferentes simpáticas (Tkacs y Strack, 1995). Además, se han descrito conexiones entre las neuronas sensoriales en el CD y la IML (Buijs, 2013; Marson y Gravitt, 2004). Esto indica que además del reflejo inmune vagal (Tracey, 2002), existe un reflejo inmune simpático, el cual participa en el control de la respuesta inmune ante patógenos. Activación del NTS. La activación neuronal del núcleo del tracto solitario por el LPS pudo deberse a la entrada de aferencias directas desde el Área Postrema (Shapiro y Miselis, 1985), pues esta región también se detectó activada. Otras posibles vías que podrían contribuir a esta activación del NTS son la activación de aferencias vagales después de la administración del LPS o de IL-1β, o por la integración sensorial de información proveniente de las láminas del cuerno dorsal en la médula espinal (Gaykema et al., 1998; Craig, 2002). 37 Activación del NSQ. La activación del NSQ inducida por el LPS, depende de la hora del día en que éste sea administrado (Guerrero-Vargas et al., 2014). En este trabajo se demostró que la administración de una dosis más baja de LPS (1.6 µg/kg), también tiene la capacidad de activar al NSQ dos horas después del inicio de la fase de oscuridad. La activación de los centros integradores primarios de información sensorial visceral, NTS CD y del AP, después de un estímulo con LPS, señalan que la información inmune puede ser recibida por diferentes vías. La información de tipo inmune puede recibirse no sólo por via vagal en el NTS. La activación del AP y del CD sugiere que la información inmune también podría transmitirse hacia el cerebro a través de vías humorales y espinales, respectivamente. Al relacionar las conexiones anatómicas directas que existen entre el NSQ y el NTS (este estudio), con la inducción de la actividad en el NSQ por el LPS, surge la hipótesis de que la activación del NSQ sea una consecuencia de la activación del NTS. Los niveles de la médula espinal donde se encontraron neuronas que proyectan al NSQ, no son los mismos que aquéllos en los que se observó la activación neuronal causada por el LPS. Los niveles cervicales proyectan directamente hacia el NSQ, mientras que los torácicos T5-T7 se activan en respuesta a la administración del LPS. A pesar de no haber evaluado la respuesta ante un reto inmune en los mismos niveles del cuerno dorsal, se mostraron las bases anatómicas que permiten sugerir la entrada de información sensorial de forma directa desde la médula espinal hasta el NSQ. 7.2 PAPEL DE LAS INNERVACIONES SIMPÁTICAS HEPÁTICAS ANTE UN RETO INMUNE La administración con LPS y las denervaciones selectivas nos permitieron analizar la posible influencia de la inervación autónoma simpática o parasimpática del hígado ante un reto inmune con LPS. Parasimpatectomía. La administración de LPS no tuvo un efecto en los niveles de TNF-α ni en la activación del NTS en las ratas con parasimpatectomía hepática. A pesar del fuerte peso que se la ha dado al nervio vago como inhibidor rápido de la respuesta inmune, a través de la isoforma α7 del receptor nicotínico para acetilcolina en el bazo y el 38 hígado (Borovikova et al., 2000; Tracey, 2002), los resultados de este trabajo sugieren que la respuesta inmune innata no es influenciada directamente a través de la rama parasimpática hepática. Otros trabajos han sugerido que la información inmune inducida por el LPS estimula al NTS a través del nervio vago (Gaykema et al., 1998; Goehler et al., 1998). Sin embargo, en estos trabajos, las denervaciones vagales aun cuando fueron subdiafragmáticas, no evitaron completamente la activación del NTS. En contraste, la activación del AP y del CD por la administración del LPS, encontrada en este estudio, sugiere que la información podría llegar desde estos sitios sensoriales. Simpatectomía. Los datos de este trabajo mostraron que la denervación simpática del hígado, está asociada a la disminución de la actividad neuronal en el CD. Esto sugiere que el hígado participa en la señalización al cerebro ante un reto inmune y que la respuesta inflamatoria del hígado es transmitida a través de aferentes sensoriales espinales. Un reporte previo, en el cual se extirpó el nervio esplácnico, sugiere que la rama simpática visceral es capaz de inhibir la respuesta proinflamatoria a la endotoxemia. Sin embargo, este trabajo no permitió discernir el aporte de los diferentes órganos viscerales (bazo, hígado, intestinos) al control de la respuesta inmune (Martelli et al., 2014)., El incremento de los niveles séricos de TNF-α y la disminución de la actividad del CD en los niveles de T5 a T7 después de la denervación selectiva del hígado, indican que la rama simpática hepática tiene un papel importante en la inhibición de la respuesta inmune innata de forma rápida, lo que da mayor peso al reflejo inmune espinal. Activación del NTS. Los datos mostraron que el NTS fue activado por el tratamiento con LPS en todos los grupos de animales. Se ha observado que el NTS recibeaferencias directas desde el AP (Shapiro y Miselis, 1985). Por lo tanto, la activación por el LPS pudo deberse a la inducción directa de la actividad del AP por el mismo LPS o el TNF-α en circulación. Sin embargo, debido al tiempo de análisis de la actividad neuronal posterior a la administración de LPS que fue usada en este trabajo, y a los elevados niveles de TNF- α encontrados en ese tiempo, no fue posible determinar el papel del LPS y/o del TNF-α sobre la entrada de información al NTS a través del nervio vago o del CD. Trabajos previos también han analizado la actividad neuronal a tiempos en dónde ya se detectan niveles circulantes de citocinas después del LPS o incluso se evalúa la actividad con la 39 inyección de citocinas directamente en la cavidad peritoneal (Gaykema et al., 1998; Goehler et al., 1998). Se podría evaluar la actividad neuronal a tiempos más cortos y utilizando menores dosis de LPS, con la finalidad de observar un menor efecto del TNF-α circulante. Activación del NSQ. A pesar de que no se observaron diferencias estadísticamente significativas, los animales con simpatectomía hepática presentaron una menor estimulación de la actividad neuronal en el NSQ después del LPS. Esta menor activación en el NSQ y la del CD, correlacionan con los niveles de TNF-α más altos en respuesta al LPS. Por lo tanto, las aferentes espinales hepáticas podrían tener un papel en la transmisión de información inmune hasta el NSQ. Se demostró recientemente que el NSQ y/o los ritmos circadianos son necesarios para la regulación de la respuesta inmune al LPS (Guerrero-Vargas et al., 2014). La denervación simpática generó una respuesta inflamatoria aumentada, de manera similar a lo que se ha observado cuando falta del NSQ. Esto podría ser debido a la regulación circadiana del sistema nervioso autónomo (Buijs et al., 2003), pues la ausencia de la rama simpática hepática evita la entrada de información sensorial, así como el control motor en el hígado. La parasimpatectomía hepática no alteró la actividad total del NSQ en respuesta a la administración de LPS. Se observó que, en los animales control, el LPS activó al NSQ en su zona dorsomedial. En los animales Psx, en cambio, se activó la región ventrolateral, la cual recibe la información fótica y del estado metabólico proveniente de la IGL y del NTS (Buijs et al., 2014; Saderi et al., 2013). Aunque el NTS no cambió su actividad después de las denervaciones selectivas, existe la posibilidad de que la integración de la información aferente espinal y vagal se realice en poblaciones neuronales diferentes del NTS. Esto podría explicar la menor activación neuronal en el NSQ en los animales sin la rama simpática hepática, mientras que en aquellos con la denervación de la rama parasimpática hepática, se activó la región ventrolateral del NSQ, la cual recibe aferencias directas del NTS. En conjunto, los resultados de este trabajo nos permiten sugerir un modelo que explica el papel de la inervación simpática en la disminución de la actividad neuronal en el CD y el NSQ y la sobreproducción de TNF-α en la periferia (Figura 16). 40 Hígado CD IML DMV AP NTS NSQ LPS-TLR-4 TNFα en suero Figura 16. Papel inhibitorio de la rama simpática hepática en el control de la respuesta inmune al LPS. La respuesta inmune al LPS reconocida por aferentes simpáticas hepáticas es transmitida a través del Cuerno Dorsal en la médula espinal. El NTS es capaz de recibir información inmune hepática desde el nervio vago y desde la médula espinal. Al denervar la rama simpática hepática se interrumpió la entrada de información al CD y al NSQ causando un descontrol en la producción de TNF-α inducido por el LPS. 8. CONCLUSIONES 1. Ante un reto con LPS, el hígado envía información al SNC a través de la ruta sensorial de la médula espinal. 2. El Núcleo del tracto solitario proyecta directamente hacia el NSQ. 3. La rama simpática hepática inhibe la respuesta inflamatoria ante un reto con LPS. 41 9. REFERENCIAS Alamili, M., Klein, M., Lykkesfeldt, J., Rosenberg, J., & Gögenur, I. (2013). Circadian variation in the response to experimental endotoxemia and modulatory effects of exogenous melatonin. Chronobiology International, 30(9), 1174–80. doi:10.3109/07420528.2013.808653 Bear, M. F., Connors, B. W., & Paradiso, M. A. (2007). NEUROSCIENCE Exploring the Brain (THIRD EDIT., p. 856). Baltimore USA: Lippincott Williams & Wilkins. Bernik, T. R., Friedman, S. G., Ochani, M., DiRaimo, R., Ulloa, L., Yang, H., … Tracey, K. J. (2002). Pharmacological stimulation of the cholinergic antiinflammatory pathway. The Journal of Experimental Medicine, 195(6), 781–8. Retrieved from http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2193742&tool=pmcentrez& rendertype=abstract Bollinger, T., & Schibler, U. (2014). 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