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Aprendiendo Biologia

20.7.2022

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Biología

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Universidad Nacional Autónoma de México
Facultad de Estudios Superiores Iztacala

“Análisis de la respuesta inmune
antitumoral: Efecto de la administración
neonatal de Bisfenol A”

T E S I S

Que para obtener el título de:
BIÓLOGA

Presenta:
Cinthya Monserrat Camacho Arroyo

Director de Tesis:
Dr. Jorge Morales Montor

Los Reyes Iztacala, Tlalnepantla, Edo. de México, 2019.

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
Restricciones de uso

DERECHOS RESERVADOS ©
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL

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fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el
respectivo titular de los Derechos de Autor.

Este proyecto fue realizado en el laboratorio de “Interacciones Neuroinmuno-
endócrinas”, a cargo del Dr. Jorge Morales Montor, en el departamento de
Inmunología del Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM.

Índice

Resumen ………………………………………………………………………………7
Abreviaturas ………………………………………………………………………………9
1. Introducción …………………………………………………………….............11
1.1 Red Neuroinmunoendócrina ……………………………………..11
1.2 Sistema inmune y hormonas sexuales ……………………..……....11
1.3 Compuestos Disruptores Endócrinos ……………………………..12
1.3.1 BPA ……………………………………………………………..13
1.3.1.1 Fuentes y niveles de exposición ……………………..13
1.3.1.2 Etapas criticas del desarrollo ……………………..14
1.3.1.3 Efectos sobre el sistema inmunológico ……………..15
1.3.2 Efectos del BPA sobre células de la inmunidad innata ……..16
1.3.2.1 Macrófagos ……………………………………………..16
1.3.2.2 Células Dendríticas ……………………………………..17
1.3.2.3 Granulocitos ……………………………………………..17
1.3.3 Efectos del BPA sobre células de la inmunidad adaptativa …. 18
1.3.3.1 Linfocitos T ……………………………………………..18
1.3.3.2 Linfocitos B y células plasmáticas ……………………..20
1.4 Cáncer de mama………………………………………………………...21
1.5 Estadísticas ……………………………………………………………..21
1.6 Microambiente tumoral mamario: Inmunopatología ……………..22
1.6.1 Inmunovigilancia ……………………………………………..22
1.6.2 Inmunoedición ……………………………………………………..23
1.6.3 Inmuosubversión ……………………………………………..23
1.6.3.1 Linfocitos T CD8 ……………………………………..25
1.6.3.2 Linfocitos T CD4 ……………………………………..25
1.6.3.3 Linfocitos T regs ……………………………………..26
1.6.3.4 Células NK ……………………………………………..27
1.6.3.5 MAT´s ……………………………………………………..28

1.7 Modelo murino de tumores mamarios: línea 4T1 ……………..29
2. Antecedentes ……………………………………………………………..31
3. Planteamiento del problema ……………………………………………..31
4. Hipótesis ……………………………………………………………………..32
5. Objetivos ……………………………………………………………………..32
5.1 Objetivo general ……………………………………………………..32
5.2 Objetivos particulares ……………………………………………..32
6. Materiales y métodos ……………………………………………………..33
6.1 Modelo biológico ……………………………………………………..33
6.2 Disrupción Neonatal con BPA ……………………………………..33
6.2.1 Inoculación ……………………………………………………..33
6.2.2 Dosis ……………………………………………………………..34
6.3 Administración de línea 4T1 ……………………………………..34
6.3.1 Cultivo ……………………………………………………………..34
6.3.2 Inoculación ……………………………………………………..34
6.3.3 Parámetro endócrino: Ciclo estral ……………………………..35
6.4 Obtención de muestras ……………………………………………..35
6.4.1 Sangre ……………………………………………………………..36
6.4.2 Tumor ……………………………………………………………..36
6.4.3 Bazo y Nodulos linfáticos periféricos ……………………………..37
6.5 Citometría de flujo ……………………………………………………..37
7. Resultados ……………………………………………………………………..42
7.1 Ciclo estral ……………………………………………………………..42
7.2 Tumores mamarios ……………………………………………………..42
7.3 Poblaciones celulares ……………………………………………..43
7.3.1 Bazo ……………………………………………………………..43
7.3.2 Nódulos linfáticos periféricos ……………………………………..45
7.3.3 Tumor ……………………………………………………………..46
8. Discusión ……………………………………………………………………..48
9. Conclusiones ……………………………………………………………..52
10. Referencias ……………………………………………………………………..53

AGRADECIMIENTOS

A la Facultad de Estudios Superiores Iztacala de la Universidad Nacional
Autónoma de México, por formarme Bióloga, por abrirme las puertas al mundo y
darme las armas para triunfar en él.
A mi tutor, el Dr. Jorge Morales Montor, por incorporarme a su laboratorio,
depositar su confianza en mí y guiarme en la realización de este proyecto. Por
enseñarme a hacer ciencia, a pensar y actuar como una gran científica, y a definir
mí camino en la vida académica.
A los científicos y científicas que formaron parte de mi equipo de laboratorio, por
día con día estar dispuestos a ayudar cuando lo necesite, especialmente a
Marisa, mi maestra, quien con paciencia y vocación me enseño todo lo necesario.
Al Sistema Nacional de Investigadores por el apoyo con una beca de “Ayudante
de Investigador”, con un número de expediente 13926, que me fue otorgada
como apoyo para llevar acabo mi tesis de Licenciatura.
Al Proyecto IN209719 del Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e
Innovación Tecnológica (PAPIIT) de la Dirección General de Asuntos del Personal
Académico (DGAPA), UNAM, otorgado al Dr. Jorge Morales Montor.
Al Proyecto 2125 de Fronteras en la Ciencia, Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnología (CONACYT), otorgado al Dr. J. Morales-Montor.
A mi comité revisor, por su apoyo con sus comentarios, sugerencias y
enseñanzas.

Resumen
Los Compuestos Disruptores Endócrinos (CDEs) son moléculas que se
definen como agentes exógenos que interfieren, mimetizan o antagonizan la
acción de hormonas esteroides propias del organismo. En particular, el Bisfenol A
(BPA) es un CDE de carácter estrogénico. Por otra parte, debido a que el sistema
neuroendócrino e inmunológico tienen una interacción bidireccional, la exposición
a BPA en etapas críticas del desarrollo, puede provocar alteraciones no sólo en el
eje reproductivo de la descendencia, sino también en el sistema inmunológico,
afectando así una respuesta antitumoral en la vida adulta.
Por lo que, en este estudio, se decidió examinar si a los 14 días de
inducción tumoral en la mama, la exposición neonatal a BPA inducía un cambio en
el tamaño del tumor. Para esto, ratones hembra de la cepa singénica Balb/c se
expusieron a una dosis única de BPA de 250 μg / kg en la etapa del desarrollo
neonatal. Una vez alcanzada la madurez sexual (8 semanas de edad), les fue
inducido un tumor mamario, mediante la inyección de 10,000 células de la línea
4T1 de adenocarcinoma mamario espontáneo murino, lo que permite el uso de
individuos compatibles e inmunocompetentes. Transcurridos 14 días desde la
inducción, los ratones que fueron expuestos al BPA desarrollaron tumores de
menor tamaño.
Para evaluar la respuesta anti-tumoral a nivel local, por citometría de flujo
se realizó un análisis de infiltrado leucocitario de la masa tumoral, así como a nivel
regional (nódulos linfáticos periféricos) y sistémico (bazo). El análisis del infiltrado
leucocitario en tumor de los animales expuestos a BPA no muestra diferencias
significativas entre grupos, aunque sugiere una tendencia a la baja de linfocitos T
reguladores en este grupo. Así como se evaluó la respuesta adaptativa, también la
innata y se analizaron los porcentajes de células NK y macrófagos asociados a
tumor (TAMs), involucrados en la respuesta antitumoral temprana (14 días de
crecimiento tumoral). El análisis mostró un aumento en la población de células
NK y reguladoras en bazo, yde manera interesante, se encuentra
significativamente aumentada en tumor en el grupo expuesto a BPA. Lo cual

sugiere que en una respuesta antitumoral temprana, el BPA muestra un
comportamiento inmunomodulador y puede dejar una marca epigenética en estas
poblaciones involucradas en el crecimiento y desarrollo del tumor mamario.

Abreviaturas

AR Receptor de andrógenos
BPA Bisfenol A
BisGMA BPA-glicidil-metacrilato
CDE Compuesto disruptor endócrino
CPAs Células presentadoras de antígeno
DCs Células dendríticas
DES Dietilestilbestrol
DMSO Dimetilsulfóxido
DPN Día postnatal
ERα Receptor de estrógenos alfa
ERβ Receptor de estrógenos beta
FDA Food and Drug Administration
FoxP3 Forkhead Box P3
IFN-γ Interferón gama
LT Linfocitos T
LB Linfocitos B
LTCs Linfocitos T citotóxicos
LPS Lipopolisacárido
MATs Macrófagos asociados a tumor
Mφ Macrófagos

MHC Complejo principal de histocompatibilidad
NK Natural killer
PBMCs Células mononucleares de sangre periférica
ROS Especies reactivas de oxígeno
T helper Linfocitos T cooperadores
TGF-β Factor transformante del crecimiento beta
TNF-α Factor de necrosis tumoral alfa
TRAIL Ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF
Treg Linfocitos T reguladores

1. Introducción
1.1 La red Neuroinmunoendócrina
La red Neuroinmunoendocrina (NIM) se refiere a la interacción bidireccional
que existe entre dos entidades fisiológicas que se creían independientes: el
sistema inmune y el sistema neuroendócrino, que forman parte de una compleja
red fisiológica. Se tiene evidencia de que las citocinas, hormonas peptídicas,
hormonas esteroides, neurotransmisores y neuropéptidos regulan y modifican
tanto la respuesta inmune como diversos fenómenos neuroendocrinos y, en
conjunto, mantienen la homeostasis del organismo, dado que las células
involucradas en cada uno de estos tres sistemas, presentan receptores de
membrana para reconocer esta variedad de moléculas solubles secretadas por
otros sistemas 1.

1.2 Sistema inmune y hormonas sexuales
Desde la concepción de un mamífero, hasta el periodo previo a la etapa de
pubertad, el sexo de este organismo, va a determinar, tras su desarrollo fisiológico
y endócrino, múltiples diferencias que se basan en la producción, secreción y
circulación de estrógenos, progesterona y testosterona, así como en la función del
eje hipotálamo-pituitario-gonadal 1, 2.
En este sentido, es que se establece el dimorfismo sexual, que no solo se
observa en la diferenciación, desarrollo y funcionamiento de órganos
reproductivos, sino también se ha mostrado en la respuesta inmune: un mismo
estímulo antigénico, provoca diferentes respuestas en ambos sexos.
Existen distintas manifestaciones de estos fenómenos dimórficos. Uno de
ellos, es que las hembras de distintas especies producen niveles mayores de
inmunoglobulinas y por lo tanto, desarrollan una mayor respuesta humoral contra
infecciones, y también producen anticuerpos auto-reactivos, lo cual se refleja en la
mayor incidencia de enfermedades autoinmunes en mujeres 3, 4.

Las hormonas sexuales modulan una gran variedad de fenómenos en el
sistema inmunológico, incluyendo la maduración y selección de los timocitos, el
tránsito celular, la proliferación de linfocitos, la expresión de moléculas del MHC de
clase II y sus receptores, así como la producción de citosinas 5, 6, 7. Los esteroides
sexuales tienen efectos moduladores que están mediados por la expresión de
receptores para estas hormonas en las células del sistema inmunológico, siendo
los receptores clásicos a estrógenos (ERα y ERβ), el receptor a progesterona (PR)
y el receptor a andrógenos (AR) los más conocidos 8.

1.3 Compuestos Disruptores Endócrinos (CDEs)
La disrupción endocrina, es un campo de investigación actual, que tiene
que ver con la contaminación ambiental. Ha sido muy estudiado en los últimos 10
años, aunque los efectos de los disruptores endócrinos en vida silvestre, se han
estudiado desde la década de 1940. Se ha identificado una gran cantidad de
químicos como compuestos disruptores endócrinos (CDE) y los humanos
podemos estar expuestos a ellos por medio de la exposición dietética y ambiental
(agua, suelo y aire) 9. Lo anterior, ha dado pie al desarrollo de una nueva área de
estudio en la biología: la biomedicina ambiental, y que tiene que ver con todos los
efectos nocivos de compuestos producidos por la actividad humana industrial
sobre los diferentes organismos de la biosfera, y sus ecosistemas.
Así, los CDE han sido definidos como agentes exógenos que interfieren
con la síntesis, secreción, transporte, metabolismo, mecanismo de acción o
eliminación de las hormonas propias del organismo 10. Pueden ser agonistas o
antagonistas de las hormonas esteroides endógenas del organismo 11.
Algunos CDE pueden presentar actividad estrogénica, anti-estrogénica o
anti-androgénica. Estos compuestos, pueden tener origen natural (los
fitoestrógenos) o sintético (los anticonceptivos). Compuestos como el
Dietilstilbestrol (DES), la genisteína, los ftalatos, los hidrocarburos policíclicos
ambientales, los pesticidas organoclorados y los bisfenoles, pero en particular el

Bisfenol A (BPA) son algunos de los CDE ampliamente estudiados.En distintos
estudios epidemiológicos se han demostrado, alteraciones irreversibles en el eje
reproductivo de la descendencia a consecuencia de la exposición gestacional y
neonatal a este tipo de compuestos en diversas especies 12, 13.

1.3.1 El BPA
El Bisfenol A (BPA), es un CDE de carácter estrogénico, conocido por su
alta afinidad a los receptores nucleares de estrógenos ERα y Erβ 14, 15, 16. Por un
lado, se ha reportado que la afinidad del BPA por estos receptores es más baja
con respecto a un ligando natural, como el 17β-Estradiol 17, 18, por otro se ha
descrito la unión del BPA a otros receptores, como el de progesterona,
andrógenos y el de hormona tiroidea, a través de los cuales puede ejercer sus
efectos 19, 20, 21. Además, datos recientes sugieren que el BPA puede ser
considerado como un modulador selectivo del receptor de estrógenos (SERM, por
sus siglas en inglés), ya que este compuesto y el 17β-estradiol no siempre ejercen
los mismos efectos 22.
1.3.1.1 Fuentes y niveles de exposición
El BPA es ampliamente utilizado como monómero en la elaboración de
policarbonatos, resinas epóxicas y retardantes de flama 23 , compuestos usados
en la fabricación de envases de alimentos, botellas, recubrimientos de latas,
selladores dentales, en papel térmico, billetes, entre muchos otros, todos ellos
materiales de uso cotidiano. Este compuesto puede liberarse al ambiente al ser
sometido a altas temperaturas o a cambios extremos de pH, ya sean condiciones
ácidas o básicas. Esto gracias a una hidrólisis de los enlaces éster de los
polímeros que lo contienen 24, 25.
El BPA se ha detectado en diversos fluidos y tejidos en humanos, incluidos
la leche materna, la placenta, el cordón umbilical y el fluido seminal y con base en
el análisis de fluidos corporales humanos, se ha estimado un nivel sérico medio de

2 ng/ml. Lo que está determinado de manera más certera es que la principal
fuente de exposición a este CDE, es la vía oral 26, 27.
La Food and Drug Administration (FDA) de los Estados Unidos de América,
reportó que la dosis de exposición aproximada es de 2.4 a 0.16 µg/kg peso
corporal/día para niños de 0 a 12 meses y de 0.19 µg/kg peso corporal/día para
adultos, con base en datos de liberación de BPA en enlatados y contenedores de
alimentos 28.
La exposición a BPA es motivo de preocupación si es durante alguna etapa
del desarrollo de un mamífero, debidoa la capacidad que tiene este compuesto
para cruzar la barrera placentaria, permanecer en tejido adiposo y en leche
materna.

1.3.1.2 Etapas críticas del desarrollo
A lo largo de la vida de un mamífero existen períodos críticos de
multiplicación, proliferación y maduración celular, en los cuales existe un alto
grado de plasticidad (posibilidad de introducir cambios). Estos periodos se
denominan etapas críticas del desarrollo, y son de gran importancia para el
desarrollo de la vida adulta de un organismo. Estas etapas son la fetal o
gestacional, la neonatal y la prepuberal. En función de estas características un
individuo es capaz de producir cambios estructurales, funcionales y epigenéticos,
en respuesta a factores nocivos que alteran su crecimiento y desarrollo. La gran
variabilidad en el ritmo de crecimiento y de maduración de los diferentes tejidos,
órganos y sistema inmunoendócrino, sea en cualquiera de estas tres etapas,
determina la existencia de diferentes grados de afectación con las consiguientes
repercusiones a corto, medio y largo plazo (vida adulta) 29.
Uno de los principales mecanismos mediante los cuales los CDEs pueden
causar efectos a largo plazo modificando la expresión genética es la alteración de

los patrones epigenéticos. En este sentido, estudios recientes han confirmado que
el BPA puede ocasionar cambios epigenéticos 30.
Particularmente, se ha reportado que la exposición a BPA durante periodos
críticos del desarrollo puede modificar los patrones epigenéticos que controlan la
expresión de receptores de estrógeno en tejidos reproductivos, en el cerebro y en
el sistema inmunitario 31,32.

1.3.1.3 Efectos sobre el sistema inmunológico
Existe evidencia de que el BPA modifica la actividad de diversos tipos
celulares, sin embargo no se ha llegado a un acuerdo sobre los efectos que este
compuesto ejerce sobre el sistema inmunológico. La respuesta que se tiene a este
CDE es dependiente en gran medida de si los estudios son realizados in vitro o in
vivo, de la especie utilizada, el sexo de los sujetos experimentales, la etapa del
desarrollo en la que se administra, la dosis, la vía de administración y el esquema
de exposición, sin dejar de lado el contexto en el que se estudia, es decir, cuál
enfermedad. Sin embargo, se ha reportado que el BPA si afecta a diversos tipos
celulares del sistema inmune, modificando su funcionalidad 33.
Este compuesto tiene la capacidad de interferir en la diferenciación de
ciertos tipos celulares 34,35, disminuir o aumentar el porcentaje de células que
participan en la inmunidad innata y adaptativa, así como también la producción de
anticuerpos, la expresión de citosinas, receptores, y de algunas otras moléculas
de membrana 36.
Además, en los estudios in vivo muchas veces no se toma en cuenta que la
función de la respuesta inmunitaria debe ser estudiada bajo algún reto antigénico,
por lo que existe poca información acerca de los efectos que el BPA puede estar
ejerciendo sobre el sistema inmunitario durante un proceso infeccioso.

1.3.2 Efectos del BPA sobre las células de la inmunidad innata
1.3.2.1 Macrófagos
Los Mφ son una de las principales células fagocíticas que desempañan un
papel importante en el mantenimiento de la homeostasis en el organismo y se ha
demostrado que expresan las dos isoformas del receptor a estrógenos (ER-α y
ER-β) 37, con lo cual, el BPA podría ejercer sus efectos uniéndose a dichos
receptores.
En cuanto a los trabajos en los cuales se reportan efectos estimulatorios del
BPA sobre los Mφ, Hong y Cols, usando la línea celular de Mφ murinos RAW264,
indican que el BPA (43nM), potenció la producción de óxido nítrico inducida por
LPS, mientras que la producción de IFN-γ no se vio alterada 38, aunque también se
reporta que el BPA a 0.1µM, estimula la producción de las citocinas pro-
inflamatorias IL-1, IL-6 e IL-12 39. En otro estudio donde se evaluó el efecto de un
análogo del BPA [BPA-glicidil-metacrilato (BisGMA)], sobre la función de la línea
celular de Mφ RAW264.7, se reporta un aumento en la producción del TNF-α,
además de la expresión de moléculas de membrana como CD11, CD14, CD40,
CD45, CD54 y CD80 en esta misma línea celular 40.
En otro reporte, utilizando la línea celular de Mφ humanos THP1, se reporta
que el BPA (0.1µM) incrementa la producción de citocinas pro-inflamatorias TNF-α
e IL-6, y disminución de las citocinas reguladoras IL-10 y TGF-β. Además,
observan que el antagonista de los receptores nucleares a estrógenos, ICI
182,780, revierte la producción de estas citocinas (disminuye TNF-α e IL-6 e
incrementa IL-10 y TGF-β), lo cual indica que el BPA puede actuar por medio de
estos receptores 41. Se utilizaron derivados de células mononucleares de sangre
periférica (PBMCs, por sus siglas en inglés) humanas, y estimuladas o no con LPS
o IL-4 42, reportan efectos distintos del BPA en la producción de citocinas en Mφ
clásicamente activados (M1) o alternativamente activados (M2). Ellos reportan que
el BPA estimula la migración de M2, pero disminuye la producción de IL-6, IL-10 e
IL-1β en estas células. En el caso de los M1, reportan aumento en la producción
de IL-10 y disminución de IL-6.

Por otra parte, también se han reportado efectos inhibitorios de BPA sobre
la función de los Mφ. Se evaluó la capacidad de adherencia de Mφ peritoneales de
ratas expuestas a BPA, demostrando que el BPA (10nM), inhibe la adherencia de
los Mφ, pero no altera su viabilidad 43.

1.3.2.2 Células dendríticas
Las células dendríticas (DCs, por sus siglas en inglés) son las células
presentadoras de antígeno por excelencia y juegan un papel fundamental en la
regulación y polarización de las respuestas inmunológicas, además, se ha
reportado que estas células también expresan el ER-α y el ER-β 44.
Acerca de las acciones que puede tener el BPA sobre estas células, se
reporta que DCs derivadas de PBMCs en presencia de TNF-α incrementan la
expresión del ligando de la quimiocina 1 (CCL1), además de generar aumento en
la producción de IL-5, IL-10 e IL-13, así como en la expresión de GATA3 45. En
otra investigación se reporta aumento en la diferenciación de las DCs, así como
aumento en la expresión de MHCII y CD86 en estas células 46.

1.3.2.3 Granulocitos
Los granulocitos son las células de la inmunidad innata más abundantes en
el organismo. Se dividen en neutrófilos, que constituyen entre el 90 y el 95% de su
totalidad, los eosinófilos del 3 a 5% y los basófilos menos del 1%. En la literatura
existen muy pocos reportes acerca del efecto del BPA sobre estas células, un
ejemplo es en el que se demuestra que el BPA a dosis de 1mg/kg, aumenta el
reclutamiento de eosinófilos inducidos por ovoalbúmina en los alveolos y
submucosa de las vías aéreas 47 y se ha reportado que la exposición perinatal a
BPA aumenta la inflamación eosinofílica en las vías aéreas 48.

En el caso de los neutrófilos, en los trabajos se ha evaluado el efecto del
BPA sobre la diferenciación neutrofílica de las células HL-60 inducida por
dimetilsulfóxido (DMSO) y el factor estimulante de colonias de granulocitos. Estos
autores reportan que el BPA, a dosis bajas, genera aumento en la diferenciación
neutrofílica y adicionalmente, reportan que al agregar tamoxifen (inhibidor
competitivo de los ERs), no se suprime el efecto del BPA, lo cual sugiere que este
efecto potenciador en la diferenciación de los neutrófilos se da a través de una vía
independiente de los receptores nucleares de estrógenos 49.

1.3.3 Efecto del BPA sobre las células de la inmunidad adaptativa
1.3.3.1 Linfocitos T
Los LT son células de la inmunidad adaptativa que se pueden dividir en
linfocitos T citotóxicos (LTCs, por sus siglas en inglés) o en linfocitos T
cooperadores (T helper, por sus siglas en inglés), y estos a su vez en Th1,Th2,
Th9, Th17, Th33, con base en el patrón de citocinas que secretan. Estas células
han demostrado poseer receptores para esteroides sexuales 50. Los esteroides
sexuales a su vez, pueden estar modulando la diferenciación de los LT y con esto
regulando la respuesta inmunitaria 51, y al poseer receptores para dichas
hormonas, el BPA puede estar ejerciendo su efecto a través de dichos receptores
como se ha reportado en distintos estudios, en los cuales hay diferentes
resultados que difieren en cuanto a la polarización de la respuesta inmune por
parte de los LT.
Entre los reportes que indican polarización de la respuesta inmunitaria hacia
Th1, se cultivaron esplenocitos activados con concanavalina de ratones expuestos
al BPA por 4 semanas en el agua de beber, a dosis de 0.015, 1.5 y 30 mg/ml, y se
encontró que la exposición a BPA aumenta la expresión de IFN-γ y genera
reducción en la expresión de IL-4 52.
Del mismo modo, se ha evaluado el efecto del BPA en un modelo de
inmunización con lisozima de huevo de gallina (HEL), reportando que el BPA a

dosis de 30 y 300µg/kg aumentó significativamente la secreción de IFN-γ, mientras
que la producción de IL-4 aumentó a dosis de 300 y 3000µg/kg, con lo cual indican
que existe predominancia de la respuesta tipo Th1, además, usando un esquema
de exposición prenatal al BPA, donde las crías macho expuestas al BPA,
posteriormente fueron inmunizadas en la edad adulta con HEL, mostraron que el
BPA generó aumento tanto en los parámetros de respuesta Th1 (IFN- γ) como de
la respuesta Th2 (IL-4) pero, el aumento en la respuesta Th1 fue mayor que en la
Th2 53, 54.
Un estudio realizado en ratones, donde se analizó el efecto de la exposición
perinatal (día 9.5 de gestación y hasta el destete) a BPA con una dosis de
1mg/kg/día intraperitoneal 55, reporta que en las crías macho al llegar a la etapa
adulta, en los niveles séricos, existe incremento de G-CSF, GM-CSF, IL-12p70,
IL-1α, IL-1β y TNF-α en comparación con el grupo control e igualmente en
esplenocitos obtenidos de los mismos animales y estimulados con concanavalina,
hay aumento de G-CSF, GM-CSF, IL-12p70, IL-17, IL-4, IL-6 y TNF-α, además de
que en los sobrenadantes de los esplenocitos estimulados con LPS hay aumento
de GM-CSF, IFN-γ e IL-17, con lo cual concuerdan que existe aumento en las
citocinas Th1 con sesgo hacia una respuesta de tipo Th17.
En cuanto a los estudios donde se reporta que el BPA genera polarización
hacia una respuesta Th2, en un estudio in vitro, utilizando un cultivo primario de
linfocitos de ratón estimulado con BPA (50µM), reportan que los linfocitos
aumentan la expresión de GATA-3, IL-4 e IL-10 y disminuye la de Tbet, lo que
indica que se genera polarización hacia una respuesta Th2 56. En otro trabajo
indican que a la misma concentración de BPA aumenta la producción de IL-4 en
LT activados, provenientes de ganglios linfáticos de ratón 57. Adicionalmente, con
un esquema de exposición gestacional, se demostró que la exposición a BPA (40
y 400 µg/Kg/día) y donde posteriormente se evaluó la respuesta inmunitaria en
esplenocitos, genera que la expresión del ER-α se encuentre disminuida en
machos e incrementada en hembras, mientras que la expresión de citocinas Th1

(IL-2, IL-12, IFN-γ y TNF-α) se encuentra disminuida tanto en machos como en
hembras 58.
En cuanto a las células T reguladoras (Tregs), la administración perinatal de
BPA (1 ppm) administrada en la dieta durante la gestación y 3 dosis de
20mg/ratón a los 14, 16 y 18 días posnatal, genera disminución en el número de
éstas células en esplenocitos provenientes de ratones macho 59.

1.3.3.2 Linfocitos B y células plasmáticas
Los LB son células cuya importancia radica en la inmunidad humoral, ya
que son capaces de diferenciarse hacia células plasmáticas, encargadas de la
producción de anticuerpos como IgA, IgG, IgE, IgD e IgM. En distintos estudios se
ha observado que el BPA puede estar modificando de manera distinta la
producción de anticuerpos por parte de estas células, como se demostró en
ratones adultos DBA/1J machos y hembras, en los que el BPA genera aumento
en la proliferación de esplenocitos, además de aumento en la producción de
anticuerpos de forma dosis-dependiente: a 300µg/kg hay aumento de IgG2 anti-
HEL y a 3000µg/kg hay aumento de IgG1 anti-HEL 60. Del mismo modo, en otro
estudio se demuestra que la exposición gestacional (desde el día del
apareamiento (día 0), hasta el día 17 de gestación) el BPA (3000 µg/Kg) generó
aumento en la producción de anticuerpos IgG1 e IgG2a, con predominio de
anticuerpos IgG2a en las crías macho 61. De manera similar, existe aumento de
IgE en ratones BALB/c hembras expuestas al BPA durante la vida adulta a dosis
de 25mg/kg cada dos días por una semana 62.
La administrando BPA en el agua de bebida (10mg/L), por 2 semanas en
ratones machos y hembras con TCR transgénico, causa aumento en la producción
de IgG2a e IgA en los sobrenadantes de cultivos de esplenocitos provenientes de
estos ratones 63. De modo similar, en otro estudio con ratones de la cepa BALB/c,
utilizando un modelo de asma, la exposición perinatal (1 semana antes del

apareamiento y hasta el día 21 posnatal) a BPA (10µg/ml) en el agua de bebida,
aumenta los niveles séricos de IgG anti-OVA 64.

1.4 Cáncer de mama
Es un conjunto de enfermedades que se caracteriza por la presencia y
desarrollo de un grupo de células que crecen de manera desordenada e
independiente, pudiendo formar una masa o tumor maligno que se origina en las
células de la mama, tienden a invadir los tejidos que lo rodean, así como órganos
distantes, pudiendo evadir la respuesta inmunitaria.
Debido a la estructura de las mamas, este tipo de cáncer generalmente se
desarrolla en los conductos lactíferos (carcinoma ductal) o en los lobulillos
(carcinoma lobulillar), glándulas donde se produce la leche materna.
El cáncer de mama ocurre casi exclusivamente en las mujeres, en hombres
es una enfermedad infrecuente, ya que representa el 1 % de todos los cánceres y
es responsable del 0.1 % de las muertes por cáncer en hombres 65.

1.5 Estadísticas
El cáncer de mamá ocupa el primer lugar como causa de muerte por
neoplasia maligna más común entre las mujeres a nivel mundial 66, y representa el
16% del total de los casos de cáncer para esta población. En 2012, la OMS le
atribuyó 521 000 fallecimientos, los cuales ocurren principalmente en países en
desarrollo.
En México, en el año 2014, del total de casos de cáncer diagnosticados en
la población, el de mama es el de mayor presencia con casi 20%. En este mismo
año, la tasa de mortalidad por tumor maligno de mama tuvo un registro de 15
decesos por cada 100 000 mujeres 67.

De acuerdo con el último reporte de GLOBOCAN 68, en México, este
padecimiento ocupa el primer lugar tanto en incidencia como en mortalidad en
mujeres, seguido por el cáncer cérvico-uterino.

1.6 Microambiente tumoral mamario: Inmunopatología
La primera ola de protección con la que el sistema inmunológico interviene,
es por las células de la inmunidad innata, encargadas de detectar, marcar y
eliminar a las células transformadas. Las células que no mueren se convierten
posteriormente en el blanco de células de la inmunidad adaptativa, que
posteriormente se encargaran de atacar, contener el crecimiento de estas células
anormales y eliminarlas definitivamente. A este proceso inicial de detección de
células, se le denominó “inmunovigilancia” 69.

1.6.1 Inmunovigilancia
Aunque durante este proceso se detectan células transformadas y se
genera una respuesta inmunológica agresiva en contra, de manera particular,
existen células que logran evadir el reconocimiento y ataque del sistema
inmunológico. Estas células proliferan y, en respuesta, se generan nuevos
mecanismosdel sistema inmunológico 70. La respuesta humoral, por ejemplo,
logra una nueva presión de selección inmunológica sobre las células
transformadas. Sin embargo, este proceso es más complejo de lo que
originalmente se pensaba y comprende no sólo una serie eventos y procesos
simples, sino etapas alternativas, conocidas como la “Inmunoedición”, y la
“Inmunosubversión” 70.

1.6.2 Inmunoedición
Durante este proceso, se generan clonas de células transformadas con
menor inmunogenicidad, que son más resistentes a los mecanismos citotóxicos
que ejerce el sistema inmunológico. Por su parte, estas clonas tienen mayores
propiedades inmuno-moduladoras, tales como mayor habilidad para producir y
secretar factores solubles (citocinas) que modifican el microambiente tumoral, de
manera que afectan los mecanismos efectores de las células del sistema
inmunológico e inducen mayor tolerancia inmunológica y anergia en ciertos tipos
celulares 70.

1.6.3 Inmunosubversión
Durante este proceso, los linfocitos T reguladores (Treg), intervienen junto
con diversos elementos humorales en el microambiente tumoral, convirtiendo esta
etapa en la parte medial de la respuesta antitumoral, durante la cual las células
exitosamente modificadas escapan a la presión del sistema inmunológico 71.

A continuación se describe de manera breve, el papel que distintas
poblaciones celulares del sistema inmunológico juegan en estos procesos, que
pueden observarse de manera resumida en la Figura 1.

Figura 1. Inmunovigilancia e inmunosubversión. Los elementos de la inmunidad innata son
los primeros en intervenir; las células NK detectan células anormales o transformadas y las atacan
secretando perforinas y granzimas, produciendo apoptosis en las células tumorales. Los cuerpos
apoptóticos son fagocitados y procesados por las CPAs, ya sean macrófagos (Mφ) o células
dendríticas (DC), las cuales migran hacia los nódulos linfáticos periféricos (NLP) y presentan
antígenos a los linfocitos. Posteriormente, las clonas de linfocitos T helper (Th) y T citotóxicos
(LTCs) que fueron activados, proliferan y activan la inmunidad adaptativa antitumoral. Por su parte,
las células tumorales modifican el microambiente tumoral produciendo factores solubles,
denominados inmunomoduladores como el TGF-β, el cual disminuye la actividad de las células
citotóxicas y las CPAs (con lo que se favorece la generación de linfocitos T reguladores inducidos
(iTreg), otro factor como la IL-10 promueve la proliferación de los Treg ya existentes, también el
TGF-β modifica el perfil de activación de los MATs hacia un fenotipo protumoral, generando más
moléculas inmunomoduladoras (ROS, IL-12) y factores angiogénicos como el VEGF.

1.6.3.1 Lifocitos T citotóxicos
Los linfocitos T citotóxicos (LTCs), que se caracterizan por la expresión del
correceptor CD8+, son células que se activan por las células presentadoras de
antígenos (CPAs) en los nódulos linfáticos periféricos, seguido de su propia
expansión clonal y estas, ya que adquieren su fenotipo efector, migran hacia el
sitio en el que las CPAs detectaron el antígeno, ya sea de un agente exógeno o
uno propio transformado. Una vez que los LTCs encuentran alguna célula que
expresa el antígeno contra el cual están dirigidos, inducen la muerte de la misma
por contacto, mediante TRAIL o por la secreción de perforinas y granzimas.
Adicionalmente, los LTCs secretan IFN-γ y TNF-α 72.
En cuanto a la respuesta inmune antitumoral, los LTCs son capaces de
infiltrar y eliminar a las células transformadas durante etapas tempranas del
desarrollo tumoral, pero pierden su capacidad citotóxica ante una exposición
crónica al microambiente tumoral. Sin embargo, se sabe que estos linfocitos, en
este tipo de exposición, siguen siendo capaces de producir IL-2 e IFN-γ 73.

1.6.3.2 Linfocitos T cooperadores
Los linfocitos T cooperadores (T helper), caracterizados por la expresión del
correceptor CD4*, se encuentran tanto en circulación como residiendo en nódulos
linfáticos periféricos y mesentéricos, también en órganos linfoides. Cuando estos
linfocitos son activados por las CPAs, proliferan y adquieren su carácter efector,
dependiendo del microambiente en el que se encuentren. Una vez activados, los T
helper migran hacia el sitio donde se inició la respuesta inmune y ahí producen
citocinas y quimiocinas que modulan y orquestan esta respuesta antitumoral.
Existe una variedad de linfocitos T helper, dependiendo del perfil de
citocinas que producen. Entre los que encabezan la lista, se pueden mencionar a
los T helper (Th-) 1, Th2 y Th17. Los Th1 se caracterizan por secretar IFN-γ y

TNF-α. Los Th2 producen IL-4, IL-5 e IL-13. Los Th17 secretan IL-17A, IL-17F, IL-
6, IL-22 y TNF-α 74.
Con respecto a su mecanismo efector, se ha reportado que los Th1
favorecen la respuesta antitumoral al secretar citocinas proinflamatorias que
ejercen un efecto directo sobre las células tumorales y sobre otras poblaciones en
el microambiente tumoral. El IFN-y tiene propiedades antiproliferativas y
antiangiogénicas, a la vez que estimula a las células NK y a los LTCs, ya que
incrementan su capacidad citotóxica, mientras que activa a macrófagos y a células
dendríticas. Cabe mencionar que el TNF-α también posee propiedades
antiproliferativas e incrementa la expresión de moléculas del MHC clase I, tanto en
las células tumorales como en las CPAs, facilitando de esta manera, la
presentación de antígeno y la susceptibilidad de las células tumorales a los
mecanismos citotóxicos 75.

1.6.3.3 Linfocitos T reguladores
Los linfocitos T reguladores (Treg) representan entre el 5 y el 10% de los
linfocitos T CD4+ (T cooperadores) en la periferia y son capaces de modular la
respuesta inmune mediante la activación de mecanismos de supresión. Los Treg
se caracterizan por la expresión del factor de transcripción FoxP3 y una elevada
expresión del receptor de IL-2 CD25 76.
Los Treg, como principal característica, inhiben la actividad de las CPAs
mediante un mecanismo dependiente de contacto que involucra las interacciones
FasL/Fas y PD1/B7-H1, así como mecanismos independientes de contacto
mediados por IL-10, IL-35, IL-27 y TGF-β 77. Asimismo, dada la elevada expresión
de CD25, estos linfocitos consumen altas cantidades de IL-2, lo que conduce a
una privación de esta citocina, la cual deja de estar disponible para otras
poblaciones, como los LTCs y los T helper, reduciendo su potencial de activación
y acción.

De manera general, los Treg promueven el desarrollo del cáncer al suprimir
la respuesta inmune antitumoral. De manera interesante, la eliminación de estos
linfocitos por quimioterapia o mediante terapia de anticuerpos restaura la
respuesta inmune antitumoral en varios modelos animales, lo que resulta en la
eliminación o disminución de tumores 78.

1.6.3.4 Células NK
Las células NK (Natural killer) son células del sistema inmunológico innato
de carácter efector, que controlan varios tipos de células tumorales, virus y
patógenos microbianos exógenos, limitando su crecimiento, proliferación y
diseminación, principalmente mediante su actividad citolítica 79.
Estas células son uno de los principales linajes celulares que inician el
proceso de inmunovigilancia, pues se ha asociado su baja actividad con un mayor
riesgo de desarrollar cáncer 80.
Las células NK vigilan constantemente las células del organismo, censan y
determinan si sus moléculas de membrana son propias y se encuentran sanas.
Por este motivo, las células NK expresan múltiples receptores de inhibición que
tienen afinidad por las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad
(MHC) de clase I, las cuales presentan polimorfismos incluso entre individuos de la
misma especie y cuya expresión puede verse alterada ante fenómenos de estrés yalgunas patologías 81,82.
Por otra parte, estas células también expresan receptores de activación,
cuyos ligandos se expresan de manera esporádica en células normales, pero se
expresan en respuesta al estrés y a la trasformación celular.
Una vez que las células NK fueron activadas, utilizan dos principales
mecanismos efectores: la exocitosis de gránulos que contienen perforina y
granzimas A/B y la señalización por medio de ligandos receptores de muerte
celular, tales como FasL (Ligando de Fas), TRAIL (Ligando Inductor de Apoptosis

Relacionado con TNF) y segundo, las células NK activadas producen citocinas
que controlan y modifican el crecimiento tumoral, además de promover la
activación de otros tipos celulares y moléculas secretadas como el IFN-γ y el TNF-
α.
Sin embargo, las células tumorales utilizan diversos mecanismos para
resistir y evadir a las células NK, incluyendo su inhibición mediante interacciones
por contacto, la secreción de factores inhibitorios como el factor transformante del
crecimiento beta (TGF-β) y la modificación del microambiente tumoral,
favoreciendo el reclutamiento y diferenciación de linfocitos Tregs y favoreciendo el
crecimiento de las células transformadas, derivando en la aparición de una masa
tumoral 83.

1.6.3.5 Macrófagos asociados a tumor
Los MATs son células de carácter fagocítico y residen en la mayoría de los
tejidos del cuerpo. En respuesta a daño tisular e infección, los monocitos
circulantes son reclutados hacia el sitio del evento y se diferencian a macrófagos
tisulares propiamente. Este tipo celular, expresa una gran variedad de receptores
de membrana que les permiten reconocer moléculas características de células
propias estresadas, modificadas o necróticas, cuerpos apoptóticos, restos
celulares e indudablemente patógenos. Una vez que entran en contacto con estos
elementos, los macrófagos los fagocitan y los procesan para su destrucción.
Así como las células dendríticas, los macrófagos son considerados células
presentadoras de antígeno (CPAs) y representan el vínculo entre la inmunidad
innata y la inmunidad adaptativa. Después de que un patógeno o una célula
dañada es fagocitadas y procesada, el macrófago migra hacia el nódulo linfático
más próximo, sea periférico o mesentérico y en el transcurso madura, adquiriendo
la expresión de moléculas coestimuladoras de superficie (CD40, CD80, CD86), las
cuales le permiten activar a linfocitos T 84.

Se sabe que los macrófagos pueden presentar toda una gama de perfiles
de activación, de manera general se habla de dos clases de macrófagos:
clásicamente activados (M1) y alternativamente activados (M2) 85.
Los macrófagos M1 se generan de la estimulación con IFN-γ sólo o en
conjunto con moléculas bacterianas, tal como el lipopolisacárido (LPS). Por otra
parte, los macrófagos M2 son diferenciados por distintos estímulos, como las
citocinas interleucina (IL-) 4, IL-13, IL-10, TGF-β y glucocorticoides 86.
Los MATs presentan un fenotipo similar al M2 87, caracterizado por la
expresión de Arg-1, Fizz-1 y Ym-1, entre otros y una mínima expresión de iNOS.
En cáncer de mama, los MATs son antiinflamatorios y se correlacionan con un mal
pronóstico. Esto se debe a que los MATs no son CPAs competentes, ya que la
expresión de moléculas coestimuladoras se ve disminuida, a tal grado que, en vez
de activar a linfocitos T, ocasionan la anergia de estas células.
De manera importante, estos macrófagos producen IL-10, citocina
inmunomoduladora que disminuye la activación de linfocitos T cooperadores,
citotóxicos y células NK encargados de la destrucción dirigida de cuerpos
anormales. Además, la participación de los MATs no se limita a la
inmunomodulación en el microambiente tumoral, pues contribuyen de manera
directa a la vascularización del mismo, ya que producen factores angiogénicos
como el factor de crecimiento vascular-endotelial (VEGF), además de que
favorecen la invasión ya que al secretan metaloproteasas que degradan la matriz
extracelular 88.

1.7 Modelo murino de tumores mamarios: línea 4T1
La línea tumoral 4T1 es una subpoblación que fue obtenida a partir de un
tumor que creció espontáneamente en una hembra BALB/c (H-2d). Es un modelo
singénico en ratones hembras maduras y las células tumorales se caracterizan por
ser transplantables, pueden ser inoculadas vía ectópica u ortotópica, creciendo

anatómicamente en el sitio correcto. Tras su inoculación, se desarrolla un tumor
primario que se palpa a partir de la primera semana, invade y hace metástasis
espontánea agresiva vía hematógena (similar a la del estadio IV de cáncer de
mama en humanos) a pulmón, hígado, bazo, nódulos linfáticos, ocasionalmente
hueso y cerebro, siendo una de las pocas líneas que presentan esta característica
89, 90.
Dado que el crecimiento tumoral y la diseminación metastásica de células
4T1 imitan muy estrechamente el cáncer de mama humano, los tumores inducidos
por esta línea pueden usarse como modelo de esta enfermedad en animales de la
cepa BALB/c haploidéntica, ya que a diferencia de otros modelos, no es necesario
el uso de modelo animal parcial o en su totalidad inmunodeprimidos.

2. Antecedentes
Se tomó como antecedente directo, un trabajo doctoral de nuestro grupo de
investigación, en el que se realizó una disrupción endocrina a ratones hembra
neonatos al tercer día de vida con BPA, y alcanzada su madurez sexual, se les
administro la línea celular 4T1 (Adenocarcinoma mamario murino) 91. Como
resultado, después de 25 días de crecimiento tumoral, la susceptibilidad a
desarrollar tumores de mayor tamaño y peso, en ratones expuestos a BPA es
doblemente mayor.
Además, el incremento en la abundancia de Treg en el infiltrado tumoral en
este mismo grupo de ratones, es significativo y lo que sugiere es que una única
dosis de BPA como disrupción neonatal, es capaz de modificar y mantener
cambios en la respuesta antitumoral del organismo en la vida adulta.
Estos hallazgos, si bien nos muestran el efecto que tiene este disruptor
endocrino en la vida adulta del animal y en un estadio avanzado de tumor
mamario, surge la pregunta de cómo y en qué momento de este crecimiento
tumoral comienza este comportamiento celular y cómo se manifiesta la respuesta
inmunológica en etapas tempranas de desarrollo del tumor.

3. Planteamiento del problema
Si se toma en cuenta la red de interacciones inmuno-endócrinas y el efecto
de los disruptores endócrinos que no solo se limita a sistemas reproductivo,
endócrino y los tejidos involucrados, sino que podría extenderse y afectar al
sistema inmune, especialmente si la exposición ocurre durante las etapas críticas
del desarrollo, es de interés evaluar el efecto que el Bisfenol A pueda ejercer
sobre el sistema inmune, particularmente en su respuesta contra tumores
mamarios.

4. Hipótesis
La exposición neonatal a Bisfenol A favorecerá el crecimiento del tumor
mamario inducido por la inyección de la línea celular 4T1 durante la vida adulta.

5. Objetivos
5.1 Objetivo general
Estudiar la respuesta inmune sistémica e intratumoral en ratones hembra
con tumores inducidos con la línea celular 4T1 que hayan sido expuestos
neonatalmente a Bisfenol A.

5.2 Objetivos particulares
 Determinar las diferencias de peso seco entre las masas tumorales en los
animales de los grupos control, vehículo y expuestos a BPA.
 Cuantificar mediante citometría de flujo, los porcentajes de Linfocitos T
CD3+; CD4+, CD8+ y Treg en las masas tumorales de los grupos control,
vehículo y expuestos a BPA.
 Analizar mediante citometría de flujo, los porcentajes de Linfocitos T CD3+;
CD4+, CD8+ y Treg a nivel sistémico (Nódulos linfáticos periféricos (NLP) y
bazo) en los grupos; control, vehículo y expuestos a BPA.
 Identificar losporcentajes de células NK y Macrófagos, a partir de masa
tumoral de los grupos control, vehículo y expuestos a BPA.
 Observar mediante citometría de flujo los porcentajes de células NK y
Macrófagos en NLP en los grupos control, vehículo y expuestos a BPA.

6. Materiales y métodos
6.1 Modelo biológico
Los ratones macho y hembra de la cepa BALB/c AnN (H-2d) singénica,
fueron obtenidos de Harlan México. La colonia se mantuvo en constante
reproducción, alojados en un rack ventilado en una sala con inyección y extracción
de aire, en condiciones estables de temperatura (19-22°C) y ciclos de 12 horas de
luz y oscuridad, alimento 2017 Envigo (RMS S.A, Ciudad de México) ad libitum y
agua suministrada en hydropac®, en la Unidad de Modelos Biológicos (UMB) del
Instituto de Investigaciones Biomédicas (IIB). De cada camada se utilizaron
únicamente las hembras para el estudio.
Los experimentos con los animales se llevaron a cabo dentro de las
instalaciones del IIB, apegado a la NOM-062-ZOO-1999 y al Instituto Nacional de
Salud (NIH) de los Estados Unidos de América (Guide for the Care and Use of
Laboratory Animals). El CICOAL del IIBM avaló el presente proyecto.

6.2 Disrupción Neonatal con BPA
6.2.1 Inoculación
Se determinó que la disrupción neonatal seria hecha al tercer día de
nacimiento. Se contaron tres días, tomando como 0.5 día postnatal, el día de
hallazgo de camada. Mediante observación y medición urogenital, se determinó el
sexo de las crías, siendo necesario el uso de hembras para este estudio y se
designaron a cada uno de los grupos experimentales y se les administró el
tratamiento correspondiente.

6.2.2 Dosis
Tomando en cuenta tres grupos experimentales, las crías hembras del
grupo “BPA” recibieron una inyección subcutánea de BPA (Sigma-Aldrich, St.
Louis, MO, EUA) equivalente a 250 µg/kg de peso corporal, el grupo “Vehículo”
recibió una inyección subcutánea de 20 μL de aceite de maíz (Sigma-Aldrich). El
grupo “Intacto” no recibió ningún tratamiento neonatal.

6.3 Administración de línea 4T1
6.3.1 Cultivo
La línea celular 4T1 (ATCC® CRL-2539) fue cultivada en medio RPMI 1640
(Sigma-Aldrich) con 10% de Suero Fetal Bovino (By Productos, Guadalajara, Jal,
México). Tras 48 h en cultivo, se hizo un subcultivo. Se retiró el medio, se hicieron
dos lavados con PBS, se incubó con una solución de Tripsina-EDTA 0.25%
(Gibco, Grand Island, NY, EUA) durante 5 minutos para despegar las células de la
base del frasco de cultivo y añadirlas a medio nuevo.
Después del segundo “pase”, las células fueron cosechadas y suspendidas
en solución salina al 0.9% (PiSA, Guadalajara, Jal, México), se contaron y llevaron
a una concentración de 250,000 células/mL para ser inoculadas, siendo necesario
mantenerlas a baja temperatura para evitar muerte celular.

6.3.2 Inoculación
Los ratones se anestesiaron mediante la por inhalación de sevofluorano
(Abbot, Ciudad de México) al 5% durante unos segundos. Posteriormente, se
desinfectó el vientre, se localizó el 4° cojinete mamario inguinal y por debajo de él,
con una jeringa de 1 mL se inyectaron 40 μL de suspensión celular a cada animal,
equivalente a 10,000 células. Se monitoreó el desarrollo de la masa tumoral
durante 14 días.
https://www.atcc.org/Products/All/CRL-2539.aspx

6.3.3 Ciclo Estral
Se determinó previamente, que el BPA no altera este parámetro endócrino,
cuando se alcanza la madurez sexual y por ello, se planteó descartar el posible
efecto que la línea celular 4T1 pudiera tener sobre este.
La toma de muestra se realizó cada día por catorce días consecutivos de
crecimiento tumoral. Consistió en realizar un lavado vaginal, con pipeta pasteur y
50 μL de solución salina estéril al 0.9% (PiSA). Las muestras se colocaron sobre
portaobjetos, fueron fijadas y teñidas con Giemsa (Merck S.A., México),
posteriormente fueron observadas al microscopio óptico. Las muestras vaginales
fueron caracterizadas de acuerdo al tipo celular dominante en cada etapa del ciclo
estral. Se asignó la fase del ciclo estral correspondiente a cada frotis con base en
los siguientes criterios de interpretación:
 Proestro: predominancia de células epiteliales nucleadas ocasionalmente
acompañadas de células epiteliales cornificadas. Leucocitos escasos o
ausentes.
 Estro: abundantes células epiteliales cornificadas escamosas, en cúmulos.
 Metaestro: predominancia de leucocitos con presencia de células epiteliales
cornificadas escamosas y ocasional presencia de escasas epiteliales
nucleadas.
 Diestro: abundancia de leucocitos con ocasional presencia de escasas
células epiteliales nucleadas.

6.4 Obtención y procesamiento de muestras
Concluidos los 14 días de crecimiento tumoral, se realizó la eutanasia de
los animales para la obtención de tejidos u órganos involucrados en la respuesta
antitumoral y su debido procesamiento.

6.4.1 Sangre
Como primer paso, se anestesió al ratón con sevofluorano, en seguida, se
realizó la punción cardiaca con el uso de una jeringa de 1mL, ingresando en el
área torácica, por debajo de las costillas, hasta llegar al corazón. Se recolectaron
entre 700 y 900 μL de sangre por cada animal. Las muestras se colocaron en
tubos eppendorf de 1.5 mL, se esperó la coagulación y posteriormente se
centrifugaron a 3500 rpm durante 10 minutos a 4°C. El suero de cada muestra se
separó y almacenó a -20°C.

6.4.2 Tumor
Seguido de la punción cardiaca, se realizó la dislocación cervical del roedor.
Con la ayuda de pinzas y tijeras de punta redonda se hizo una disección roma
sobre la línea media ventral y dos más a partir del extremo caudal de la incisión
hacia las patas traseras del animal. Ya expuesta la cara interna de la piel, se
separó del peritoneo y se localizó el tumor y con ayuda del bisturí, se procedió a la
separación del mismo. El tumor fue pesado en una balanza analítica (Kern &
Sohn, GmBH) y se registró el peso.
Las masas tumorales se dividieron en dos partes iguales; la primera, se
almacenó en capsulas beem #3 (Cientifca Senna S.A., Ciudad de México) para
congelación en Tissue-Tek (Sakura Finetek Inc., Torrance, CA) y la segunda fue
picada finamente e incubada durante 20 minutos en medio de digestión (RPMI
1640 (Sigma-Aldrich), 10 U/mL DNasa I (Roche, Mannheim, GER), 0.5 mg/mL
Colagenasa IV (Sigma-Aldrich) la digestión se detuvo añadiendo 50 μL de SFB y
se procedió a la disgregación con malla de nylon. Las células de todas las
muestras se lavaron y suspendieron en buffer de FACS (solución amortiguadora
de fosfatos (PBS), suplementada con SFB 2%, NaN3 0.02%).

6.4.3 Bazo y ganglios linfáticos
Posterior a la extracción completa del tumor, se procedió a la búsqueda y
extracción de los ganglios linfáticos periféricos inguinales y bazo, éste último
localizado por disección del peritoneo para exponer las vísceras del animal.
Ambos órganos linfoides se almacenaron en PBS frio hasta ser procesados.
En el caso de las muestras de bazo, se dividieron en dos partes iguales;
una se congeló, en tubo eppendorf con 500 μL de reactivo TRIzol (Ambion,
Carlsbad, CA, EUA) y almacenó a -70°C. La parte restante de bazo, así como los
ganglios linfáticos, se mantuvieron en PBS frio hasta ser disgregados entre dos
mallas de nylon. Los eritrocitos del bazo se lisaron e incubaron 10 minutos en
buffer de lisis de eritrocitos (NH4Cl 0.15 M, KHCO3 1 M, Na2EDTA 0.1 mM, pH
7.3).
Las células de bazo y ganglios linfáticos se lavaron y suspendieron en
buffer de FACS al igual que las muestras de tumor. Las muestras de los tres
tejidos se tiñeron para citometría de flujo.

6.5 Citometría de flujo
Se utilizaron placas con fondo U de 96 pozos para la tinción y en cada uno
de ellos se colocaron 20 μL de muestra, equivalente a 1 x 106 células.Como primer paso, para evitar una tinción no especifica, se bloquearon los
receptores FC de la superficie celular con anticuerpo anti-CD16/CD32 (TruStain®,
BioLegend, San Diego, CA, EUA). Transcurridos 20 minutos de incubación a 4°C,
se les realizó un lavado con buffer de tinción.
Posteriormente, se incubaron durante el mismo tiempo y condiciones, con
los anticuerpos para tinción de superficie respectiva (ver Tabla 1) y una vez teñida
la superficie celular, las células se fijaron y permeabilizaron con el kit para FOXP3
(Tonbo biosciences, San Diego, CA, EUA) para poder ser teñidas con el

anticuerpo para tinción intracelular (ver Tabla 1), protegidas de la luz durante 30
minutos a 4°C.
Finalmente, las células se lavaron con buffer de permeabilización y se
suspendieron en 200 μL de buffer de tinción. Las células teñidas se contaron
utilizando el citómetro Attune NXT (Life Technologies) y se analizaron con los
programas FlowJo® (Tree Star Inc.) y Prism 7 (GraphPad Software, Inc.).

Tabla 1. Anticuerpos utilizados en tinciones de citometría.
Anticuerpo Clona Fluoróforo Marca
Anti-CD3 145-2C11 APC Cy7 Biolegend,
Anti-CD4 GK1.5 PE Biolegend,
Anti-CD8 53-6.7 PerCP Biolegend,
Anti-Foxp3 150D AlexaFluor®647 Biolegend,
Anti-F4/80 BM8 AlexaFluor®647 Biolegend,
Anti-NKp46 29A1.4 PE Biolegend,

La regionalización e identificación de las poblaciones y subpoblaciones
celulares se llevó a cabo tomando en cuenta sus características de tamaño y
complejidad o granularidad, vinculadas a los parámetros FSC-A y SSC-A del
programa.
El área correspondiente a linfocitos totales se muestra en la figura 2a. A
partir de esta región, se reemplazó el parámetro FSC-A por el canal de
fluorescencia al que corresponde el fluoróforo APC Cy7 que identifica a la
molécula CD3, característica de los linfocitos T (figura 2b) y se seleccionó a la
población positiva para este marcador. Dentro de esta región, con los parámetros
PE en las abscisas y PerCP en las ordenadas, se determinaron y seleccionaron
las poblaciones positivas a los marcadores CD4, de linfocitos T cooperadores y
CD8, de linfocitos T citotóxicos (figura 2c).

Finalmente dentro de la población CD4+, tomando como parámetro “y” a
SSC-A y como parámetro “x” al canal del fluoróforo Alexa Fluor®647, que identifica
al marcador Foxp3 intracelular, se determinó a la población positiva de linfocitos T
reguladores (figura 2d)
Figura 2. Método de identificación de linfocitos T y subpoblaciones. Dot Plots
representativos. Datos analizados con FlowJo
®
.

Para la identificación de células NK, se utilizó una región parecida a la
señalada de linfocitos totales, pero esta vez abarcando eventos más grandes y
granulares que es donde se posiciona este linaje celular (figura 3a). A partir de
esta población se seleccionó a la población positiva para Nkp46, marcada con el
fluoróforo PE (figura 3b).
Figura 3. Método de identificación para células NK. Dot Plots representativos. Datos
analizados con FlowJo
®
.

Finalmente, para la identificación de macrófagos, se excluyeron células
linfoides de menor tamaño y complejidad, dando paso a la selección de aquellas
células grandes y complejas que es donde se ubica a este tipo celular (figura 4a)
Dentro de esta región, con el canal correspondiente al fluoróforo Alexa Fluor®647
en las abscisas y el parámetro SSC-A en las ordenadas, se determinó y
seleccionó la poblaciones negativas como control sin teñir (figura 4b) y a las
positivas al marcador F4/80 (figura 4c).

F
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7. Resultados

7.1 Ciclo estral
Tomando en cuenta que la estrategia experimental requiere el desarrollo de
un tumor, era de gran importancia determinar si la línea celular 4T1, afecta por sí
misma la respuesta hormonal. Así, para evaluar este parámetro, se monitoreó
durante 14 días de crecimiento tumoral el estadio de ciclo estral en el que se
encontraba el animal y no se encontraron alteraciones en ninguno de los grupos
experimentales. Cada uno de los animales cicló en tiempo y forma adecuada.

7.2 Tumores mamarios
Al término de 14 días post inoculación de la línea celular 4T1, se realizó la
extirpación de las masas tumorales. El grupo expuesto a BPA presentaba tumores
de menor tamaño (figura 5a). Para corroborar este hecho, se determinó el peso
de los mismos y se normalizo juntando los resultados de dos experimentos
independientes. Como se muestra en la figura 5b, los tumores de los animales del
grupo BPA tienen un peso 50% menor respecto a su control.

Figura 5. Crecimiento tumoral. a. Imágenes representativas de los tumores en los tres
grupos experimentales. b. Evaluación del peso de los tumores (peso final). Con una media de 1
(I.C. = 0.91 – 1.04) para el grupo Intacto (n=6), 0.83 (I.C. = 0.65 – 1.009) para el grupo Vehículo
(n=6) y 0.41 (I.C. = 0.17– 0.68) para el grupo BPA (n=6). **, **** p=0.0001.

7.3 Poblaciones celulares
Se analizaron diversas subpoblaciones celulares a nivel local y sistémico
mediante tinciones de citometría de los órganos linfoides, nódulos linfáticos
periféricos y bazo, además del infiltrado leucocitario tumoral, estos pertenecientes
a los animales experimentales.
7.3.1 Bazo
Como primera respuesta, hay menor infiltrado de linfocitos T totales en los
animales expuestos a BPA sin tumor (figura 6a). Al evaluar el patrón celular por
linajes, si se observaron efectos como consecuencia del desarrollo tumoral. El
porcentaje de células T reguladoras es mayor en los animales con tumor inducido
(figura 6d). El mismo fenómeno lo presentan las células NK que se encuentran
aumentadas en los animales portadores de tumor (figura 6e). No se observaron
diferencias significativas por efecto del tratamiento neonatal en los grupos sanos ni
en aquéllos con desarrollo de tumor.

Grupos experimentales
Figura 6. Subpoblaciones celulares en bazo. a. Linfocitos T totales identificados con el
marcador CD3. b. Linfocitos T cooperadores identificados con el marcador CD4 dentro de
población CD3+. c. Linfocitos T citotóxicos identificados como CD8+ dentro de población
CD3+. d. Linfocitos T reguladores identificados con el marcador FOXP3, dentro de la población
CD4+. e. Células NK marcadas como NKp46+. f. Macrófagos identificados como F480+. Datos de
2 experimentos independientes expresados como media ± DE; n = 6. En a, **** p = 0.001 BPA vs
Intacto y Vehículo.
a b
c d

f e

7.3.2 Nódulos linfáticos periféricos
Para evaluar una respuesta inmunológica regional, se procede al análisis
de este tejido. Se puede apreciar en la figura 7, que el desarrollo tumoral modifica
las subpoblaciones estudiadas, ya que promueve la proliferación de linfocitos T
reguladores a consecuencia del desarrollo tumoral casi doble (figura 7d), mientras
que disminuye la proporción de linfocitos T cooperadores y mantiene sin cambios
la población de T citotóxicos entre animales 4T1 y controles sin mostrar
diferencias significativas por efecto del BPA.

a b

Grupos experimentales
Figura 7. Subpoblaciones celulares en nódulos linfáticos periféricos. a. Linfocitos T
totales identificados con el marcador CD3. b. Linfocitos T cooperadores identificados con el
marcador CD4 dentro de población CD3+. c. Linfocitos T citotóxicos identificados como CD8+
dentro de población CD3+. d. Linfocitos T reguladores identificadoscon el marcador FOXP3,
dentro de la población CD4. Datos de 2 experimentos independientes expresados como media ±
DE; n = 6.
c d

7.3.3 Tumor

a b

Grupos experimentales
Figura 8. Subpoblaciones celulares en tumor. a. Linfocitos T totales identificados con el
marcador CD3. b. Linfocitos T cooperadores identificados con el marcador CD4 dentro de
población CD3+. c. Linfocitos T citotóxicos identificados como CD8+ dentro de población
CD3+. d. Linfocitos T reguladores identificados con el marcador FOXP3, dentro de la población
CD4+. e. Células NK marcadas como NKp46+. f. Macrófagos identificados como F480+. Datos
de 2 experimentos independientes expresados como media ± DE; n = 6. En a, *** p= 0.0008 vs
Vehículo, p= 0.0002 vs BPA, en c, * p= 0483, en e, * p= 0.494, en f, ** p= 0.0060.
c d

f e

Como se puede apreciar, la composición celular a partir del infiltrado linfoide
total, es homogénea entre los grupos (figura 9a-d), sin embargo cabe resaltar que
el porcentaje de células NK infiltradas en tumor es 50% mayor en el grupo
expuesto a BPA (figura 9e). De manera resaltable, la población de MATs se
encuentra disminuida en el grupo BPA y de la misma forma, el infiltrado de células
Treg se encuentra ligeramente disminuido en el grupo de animales expuestos a
BPA, sin mostrar diferencias significativas.

8. Discusión
El objetivo principal de este trabajo fue evaluar efectos y repercusiones que
se manifiesten en la respuesta inmune temprana, contra tumores de mama
inducidos de animales que hayan sido expuestos durante el periodo neonatal a
Bisfenol A.
En los individuos tratados, la etapa crítica de desarrollo del sistema
inmunológico comprende tanto la gestación como el periodo neonatal, pero más
allá de la formación de los órganos linfoides y la hematopoyesis, la maduración del
sistema inmunológico tiene lugar entre el nacimiento y el día 30 postnatal 92.
Se ha demostrado que los días 2 a 4 de vida postnatal, son críticos para el
desarrollo y establecimiento de los componentes de la inmunidad adaptativa
mediada por linfocitos T y el desarrollo de linfocitos T reguladores, dado que se
tienen estudios en donde se ha demostrado que la remoción quirúrgica del timo o
el uso de medicamentos justo en esta ventana, resulta en fenómenos de
autoinmunidad multiorgánica 93.
Con base en este dato, se decidió utilizar una única dosis de BPA al tercer
día postnatal a razón de 250 µg/kg de peso corporal, ocasionando así una
disrupción endócrina durante un periodo crítico en el desarrollo del sistema
inmunológico.
A pesar de que la exposición fue única, el modelo experimental que se
utilizó, involucró el desarrollo de un adenocarcinoma mamario, lo que resulta en
un sistema susceptible a hormonas. Esto supondría un sistema en el que todo
cambio observado por el crecimiento tumoral, podría deberse tanto a factores
endócrinos como a factores inmunológicos.
Originalmente, se planteó el uso de la línea 4T1 como una estrategia
experimental que permitiría excluir el aprovechamiento del estradiol como factor
de crecimiento, dado que existen reportes que señalan que esta línea celular es
un modelo de cáncer de mama triple negativo 94, lo que significa que no expresa

receptores de estrógenos, de progesterona o el receptor HER2 95 y por este
motivo, su desarrollo sería independiente de los niveles hormonales de los
individuos. Sin embargo, en un trabajo del laboratorio se detectó que esta línea
celular sí expresa el receptor ER-α. Esto planteó la posibilidad de que los cambios
observados en cuanto al desarrollo tumoral pudieran ser atribuidos tanto a factores
endócrinos como a factores inmunológicos o la interacción de los mismos.
Por lo anterior, se decidió evaluar el grado de alteración endócrina que
pudiese ocurrir ante el esquema de inoculación de la línea celular 4T1, es decir,
evaluar durante 14 días post inoculación de la línea a razón de 10,000 células, si
afectaba algún parámetro endócrino. Como se reportó en la sección de resultados,
no se observaron alteraciones en la regularidad del ciclo estral, lo que nos permite
sugerir que los efectos observados en cuanto al desarrollo tumoral son debidos
principalmente a factores inmunológicos y no a alteraciones endócrinas
significativas.
Por otro lado, se encuentra bien documentado que la administración de
BPA, produce una variedad de efectos sobre el sistema endócrino en roedores, en
el eje reproductivo, tales como inicio temprano de la pubertad, alteraciones del
ciclo estral e incluso en el desarrollo de la glándula mamaria 96, 97, 98, 99, la mayoría
de estos efectos se observan tras exposiciones crónicas en el periodo perinatal o
prepuberal y a dosis mayores 100.
Sin embargo, Palacios Arreola 91, reportó la ausencia de alteraciones en
cuanto a la edad de inicio de la pubertad, la regularidad del ciclo estral o los
niveles basales de estradiol sérico, lo que nos permite sugerir que los efectos
observados tanto por la administración de BPA como por el uso de la línea 4T1
como modelo experimental para el desarrollo tumoral, son debidos principalmente
a factores inmunológicos y no a alteraciones endócrinas de mayor significancia.
De manera sobresaliente, como consecuencia de una única exposición al
BPA, se promovió el crecimiento tumoral.

Estudios anteriores asocian el riesgo de desarrollar cáncer de mama con la
exposición a BPA, pero principalmente asocian a este compuesto con
alteraciones en el desarrollo de la glándula mamaria y una mayor susceptibilidad a
la carcinogénesis 101, 102. Sin embargo, nuestros resultados muestran un nuevo
aspecto mediante el cual el BPA puede inhibir el desarrollo y la progresión del
tumor mamario en etapas tempranas del crecimiento de este, contrario a lo
esperado y reportado por Palacios 91, donde se encontró que este mismo
compuesto contribuye al aumento en el tamaño de masas tumorales, pero a mayor
tiempo de desarrollo tumoral.
Puesto que en el modelo utilizado, la glándula mamaria del ratón no fue el
objeto de dicha transformación celular, sino el tejido en el que se introdujeron
células tumorales, el desarrollo en mayor o menor medida del tumor, va a
depender de la respuesta inmunológica generada.
Al analizar el infiltrado leucocitario de los tumores, se observó que los
tumores del grupo expuesto a BPA no presentaban una mayor proporción de Treg,
lo cual corresponde con los tumores de menor tamaño para este grupo. Se sabe
que los Treg expresan las citocinas inmunomoduladoras IL-10 y TGF-β, a la vez
que limitan la producción de citocinas proinflamatorias que secretan otros tipos
celulares 103, 104. Por lo que es importante analizar la producción de estos factores
solubles para entender de mejor manera los mecanismos de regulación de los
Treg en estas condiciones en las que el tumor comienza a crecer.
Aunque los elementos de la inmunidad adaptativa revelan información
importante, el microambiente tumoral no se define únicamente por las células de la
inmunidad adaptativa. Los MATs constituyen una población muy importante en
este microambiente. Se sabe que los MATs adquieren un fenotipo muy particular
al encontrarse en el microambiente tumoral, el fenotipo es de activación alternativa
105, 106.

Los MATs encontrados en las muestras de tumor de animales que fueron
expuestos a BPA mostraron una baja comparado con su control y se espera que
este grupo celular tenga un perfil de activación alternativa y sería de gran
importancia evaluar la expresión de Arginasa y Fizz-1.
Algo muy interesante es lo que ocurre con las células NK: estas células si
fueron identificadasen el microambiente tumoral y en los bazos de los animales
que desarrollaron tumor, contrario a lo reportado por Palacios y colaboradores 91.
El hecho de que haya sido posible analizar esta población celular en los individuos
que desarrollaron tumores se debe a que esta población si interviene en etapas
más tempranas del desarrollo tumoral.

9. Conclusiones

1. La exposición a una única administración de la línea celular 4T1 a razón
de 10,000 células por individuo, no produce alteraciones evidentes en el
eje reproductivo.
2. Este trabajo muestra que la disrupción endócrina por BPA ocurrida
durante un periodo crítico del desarrollo, particularmente en lo que se
refiere a la comparación de la respuesta a diferentes tiempos de la
maduración tumoral y del sistema inmunológico, si muestra cambios en
las poblaciones de la inmunidad innata y adaptativa.
3. Primeramente y contrario a lo que se esperaba en etapas tempranas de
crecimiento tumoral, hubo una disminución en el tamaño de los tumores
pertenecientes a animales expuestos a BPA.
4. La disparidad existente entre un tumor con mayor tiempo de crecimiento
y uno con la mitad de tiempo, se caracteriza por una mayor proporción
de células NK y reguladoras en bazo, y de manera interesante, el
infiltrado de reguladoras en tumor no es mayor en el grupo expuesto a
BPA en comparación con animales no expuestos, sin embargo la
población de NKs se encuentra significativamente aumentada en tumor.
Lo cual no sugiere como se pensaba, que el BPA dejara una marca
epigenética en estas poblaciones involucradas.

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