Analisis-de-la-supresion-de-la-respuesta-inmune-antitumoral-mediada-por-celulas-estromales-mesenquimales-derivadas-de-tumores-malignos-de-cuello-uterino

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA 
CARRERA DE BIOLOGÍA 
 
 
 
 Unidad Multidisciplinaria de Investigación Experimental Zaragoza 
 Unidad de Investigación en Diferenciación Celular y Cáncer 
Laboratorio de Inmunobiología 
 
 
 
Análisis de la supresión de la respuesta inmune antitumoral 
mediada por Células Estromales Mesenquimales derivadas de 
tumores malignos de cuello uterino. 
 
 
 
Tesis 
 
Que para obtener el título de 
 
B I Ó L O G A 
 
PRESENTA: 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 
 
 
 
Director de Tesis: Dr. Alberto Monroy García 
 
Asesor Interno: Dra. María de Lourdes Mora García 
 
 
 
México, D.F. 2011 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros ii 
 
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES 
"ZARAGOZA" 
IM ~"""1lAlI N .. (~L 
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Mm' !, 
DIRECCiÓN 
JEFE DE LA UNIDAD DE ADMINISTRACiÓN ESCOLAR 
PRESENTE. 
ComuniCO a usted que la alumna CONTRERAS LANDEROS SELENE 
VAZMIN. con numero de cuenta 304329393, de la carrera de Biología se le ha 
fi jado el dia 1" del mes de diciembre de 2011 a las 14:00 hrs. para presentar 
examen profesional, el cual tendrá lugar en esta Facultad con el siguiente 
jurado. 
PRESIDENTE DR. BENNV WEISS STEIDER 
VOCAL DR. ALBERTO MONROV GARCIA' 
SECRETARtO ORA. MA. DE LOUROES MORA GARCIA 
SUPLENTE Q. F. B. JOSt OSeAR GONZÁlEZ MORENO 
SUPLENTE M en C. LUIS SÁNCHEZ SÁNCHEZ 
El titulo de la tesIs que presenta es. Análisis de la supresión de la respuesta 
inmune antitumoral mediada por Células Estromales Mesenquimales 
derivadas de tumores malignos de cuello uterino. 
OpCIón de titulación. tesIs. 
Agradeceré por anticipado su aceptación v haQo propia la ocasión para 
saludarle o DE E!'TUOto! .. 
IIEcleI 
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A T E N tA rf EI'N~i']E ~ 
"POR MI RAZA HABL.o\RA E~~S~ITU" 
México. D. F., a 3 ie~ d9"2011 , .... ,,- ,., 
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REc elO N 
UEL MENDOZA NÚÑEZ 
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OfICINA Of ~X.AMHIES 
P!«.JF~StONAlES y CE GRADO 
0Ft CARlOS ~nlLEJOS CRUZ 
JEFE CE CARRERA 
____________________________ S-iL 
Selene Yazmin Contreras Landeros iii 
 
 
 
 
 
 
 
La realización de este trabajo fue posible con el apoyo institucional del Laboratorio de 
Inmunobiología de la Unidad de Investigación en Diferenciación Celular y Cáncer, de la 
Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, UNAM, así como por el apoyo financiero de 
los proyectos DGAPA-PAPIIT No.IN223010 y FIS/IMSS/PROT/G09/762 y 800. Durante 
el desarrollo de este proyecto conté con el apoyo de la beca para tesis de licenciatura 
por parte de DGAPA-PAPIIT, así como la beca para titulación para exalumnos de alto 
rendimiento otorgada por la UNAM. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros iv 
AGRADECIMIENTOS 
Agradezco al laboratorio de Inmunobiología de la FES Zaragoza, UNAM, donde realicé 
mi trabajo de tesis y a todo el equipo que lo integra especialmente a la Dra, María de 
Lourdes Mora García y al Dr. Alberto Monroy García por permitirme formar parte de su 
equipo y proporcionarme las herramientas necesarias para llevar a cabo mi trabajo de 
investigación, también agradezco y reconozco de manera muy especial el apoyo 
incondicional que recibí del M. en C. Jorge Hernández Montes, por su tiempo que 
dedico a responder a las miles de preguntas que le hice, que si bien resolvieron muchas 
dudas, también crearon otras más, lo cual genero una de las mayores enseñanzas 
dentro de mis inicios en la investigación y la mejor comprensión de este estudio mil 
gracias. 
A todos mis compañeros y amigos de laboratorio: Francisco, Arturo, Gilberto, Esteban, 
Rocío, Edwin, Carlos y Brenda por hacer que el trabajo a su lado sea siempre tan 
agradable y porque cada uno de ustedes de alguna manera me apoyaron en el 
desarrollo de este trabajo. De manera particular a las Biólogas: Karina Pérez, Azucena 
Don, Vianey Serrano, Carmen Zaragoza e Ivonne Titla por transmitir su conocimientos 
sobre las técnicas que empleamos en el laboratorio y que formaron la base para la 
realización experimental de este trabajo. 
A la Unidad de Investigación en Enfermedades Oncológicas del Hospital Infantil 
“Federico Gómez”, especial agradecimiento a la Dra. Sara Huerta Yepez, por brindarme 
la oportunidad de realizar una parte importante del trabajo experimental de este estudio 
en su laboratorio, por los consejos y enseñanzas dadas. También agradezco la ayuda 
técnica para llevar a cabo los experimentos de manera satisfactoria a todos los 
integrantes de esta Unidad de Investigación particularmente a: Biol, Jesús Rangel, Dra. 
Guillermina Baay, Belén, Gaby y Dany. 
A mis sinodales y revisores del trabajo ya que sus consejos y observaciones realizadas 
de manera tan acertada, permitieron la culminación de este proyecto. 
Dr. Benny Weiss Steider, Dra. María de Lourdes Mora García, Dr. Alberto Monroy 
García, Q.F.B. José Oscar Gonzales Moreno y M. en C. Luis Sánchez Sánchez. 
Selene Yazmin Contreras Landeros v 
DEDICATORIA 
A Dios por darme la vida y todo lo que tengo, que es lo que necesito 
para seguir adelante cada instante. 
A mis padres porque me han dado siempre con amor todo el apoyo, 
las enseñanzas y consejos que me han permitido de manera 
importante desarrollar hasta este momento mi gran proyecto de 
vida y porque me motivan cada día a continuar. Los admiro y estoy 
muy orgullosa de ustedes por el esfuerzo que hacen porque 
cumplamos nuestras metas, es por eso que la alegría de este logro 
profesional que obtengo es para ustedes. 
A mis hermanos porque su llegada y presencia iluminan mi vida y 
los buenos momentos a su lado son mi mayor alegría. 
A mi mamita, por ser mi gran amiga y estar siempre a mi lado. 
A Francisco, por ser mi amor real que siempre soñé. 
A Padme, por la mayor enseñanza de vida que me dejaste. 
Con aprecio, a mis amigos y familia en general que es tan grande. 
Gracias por todo, 
Los amo mucho viven por siempre en mi mente y en mi corazón… 
 
Selene Yazmin 
Selene Yazmin Contreras Landeros vi 
ÍNDICE PÁGINA 
ABREVIATURAS DE USO FRECUENTE…………………………………………………....1 
RESUMEN……………………………………………………………………………………..…2 
INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………….............3 
MARCO TEÓRICO……………………………………………………………………………...5 
 VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO (VPH)…………………………………………....5 
 Estructura del VPH…………………………………………………………………..5 
 Clasificación del VPH…………………………………………………….………....6 
 Ciclo de vida e infección por VPH…………………………………………............6 
 
 RESPUESTA INMUNE CONTRA EL VPH………………………………………….12 
 
 SISTEMA INMUNE Y CANCER CERVICO UTERINO (CaCu)…………………...15 
 
 CÉLULAS ESTROMALES MESENQUIMALES (CEMs)…………………………..17 
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN............................................22 
HIPÓTESIS……………………………………………………………………………………..24 
OBJETIVOS……………………………………………………………………………............25 
MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………………….…...26 
 Ratones…………………………………………………………………………….…...26 
 Cultivos celulares……………………………………………………………………....26 
 Inmunización e inoculación de células para la inducción de tumores……………27 
 Medición de tumores………………………………………………………………..…28 
 Determinación de linfocitos T antígeno específicos………………………….…….28 Obtención de tumores………………………………………………………………....29 
 Inmunohistoquímicas……………………………………………………………..…...29 
 Cultivo y fijación de las CEMs infiltradas en tumores inducidos………………..…30 
 Análisis estadístico……………………………………………………………………..31 
 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros vii 
 
RESULTADOS................................................................................................................32 
 Participación de las CEMs en el crecimiento tumoral en ratones de la cepa 
C57BL/6 sin protección inmunológica……………………………………..…………32 
 Participación de las CEMs en el crecimiento tumoral en ratones de la cepa 
C57BL/6 con protección inmunológica…………………………………….………...34 
 Las CEMs revierten la población de linfocitos T antígeno específicos en ratones 
previamente inmunizados y tratados con TC-1……………………………………..35 
 Análisis de la infiltración de linfocitos T CD8+, CD4+, FoxP3 y CD25+ en los 
tumores inducidos en ratones que recibieron inmunización previa y sin 
inmunización, bajo presencia y ausencia de CEMs………………….…………….39 
 Migración de CEMs inoculadas vía sistémica al sitio del tumor…………………..49 
DISCUSIÓN DE RESULTADOS…………………………………………………….……….51 
CONCLUSIONES……………………………………………………………………….……..57 
PERSPECTIVAS………………………………………………………………………….…...58 
BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………….….....59 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 1 
ABREVIATURAS DE USO FRECUENTE 
CaCu ………………………..Cáncer Cérvico Uterino 
VPH ………………………….Virus del Papiloma Humano 
CEMs ………………………..Células Estromales Mesenquimales 
CEMs-MON ……………...…CEMs Humanas Derivadas de Médula Ósea Normal 
CEMs-CNOR ……………….CEMs Humanas Derivadas de Cérvix Normal 
CEMs-CaCu.………………..CEMs Humanas Derivadas de Cáncer Cérvico Uterino 
NIC …………………………..Neoplasia Intraepitelial Cervical 
CPH ………………………...Complejo Principal de Histocompatibilidad 
Tregs ………………………..Linfocitos T reguladores 
IL …………………………….Interleucina 
TNF-α ……………………….Factor de Necrosis Tumoral alfa 
IFN-γ .……………………….Interferón gamma 
HGF …………..…………….Factor de Crecimiento de Hepatocitos 
TGF ………………………....Factor de Crecimiento Transformante 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 2 
RESUMEN 
Antecedentes: Las Células Estromales Mesenquimales (CEMs) son un grupo 
heterogéneo de células encontradas en diversos tejidos, se caracterizan por tener una 
gran capacidad de autorenovación y diferenciación a varios tipos celulares; son células 
inmunoprivilegiadas, ya que escapan al reconocimiento inmune; además poseen amplia 
actividad inmunosupresora, ya que inhiben una variedad de células del sistema inmune, 
incluyendo: linfocitos B, células dendríticas, células asesinas naturales así como 
linfocitos T vírgenes o antígeno específicos. Además tienen la capacidad de inducir, 
reclutar y mantener la función reguladora de linfocitos T reguladores (Tregs). 
Recientemente se ha reportado que en modelos tumorales singénicos, heterólogos e 
incluso xenogénicos, las CEMs tienen la capacidad de migrar al sitio de desarrollo 
tumoral para favorecer el implante, crecimiento y metástasis de tumores malignos. 
Justificación: Conocer los mecanismos de acción de las CEMs en el desarrollo 
tumoral, permitirá establecer estrategias inmunoterapéuticas para su tratamiento. 
Objetivo: Analizar la capacidad inmunosupresora de CEMs humanas derivadas de 
Médula Ósea Normal (CEMs-MON), de Cérvix Normal (CEMs-CNOR) y de Cáncer 
Cérvico Uterino (CEMs-CaCu) sobre la respuesta antitumoral de linfocitos T antígeno 
específicos en un modelo in vivo. Hipótesis: Se espera que CEMs-CaCu tengan mayor 
efecto supresor de la respuesta inmune antitumoral. Métodos: Ratones de la cepa 
C57BL/6 (haplotipo H2-Db) normales o inmunizados previamente con el péptido 
antigénico RAHYNIVTF derivado de la proteína E7 del Virus de Papiloma Humano tipo 
16. (VPH-16), fueron inoculados dorsalmente con 105 células tumorales TC-1 (H2-Db, 
positivas a E6/E7 del VPH-16) además de la co-inoculación de las diferentes CEMs (105 
células) vía intravenosa, con la finalidad de analizar el crecimiento tumoral así como la 
respuesta de linfocitos T tumor específicos mediante moléculas pentaméricas H2-
Db/péptido, y la infiltración de células Tregs en el tumor por análisis 
inmunohistoquímico. Resultados: El crecimiento tumoral en los grupos de ratones 
tratados ya sea con células TC-1 solas ó TC-1 con las diferentes estirpes de CEMs fue 
similar, (1.2-2cm3). Sin embargo, en los ratones que recibieron inmunización previa, no 
se observó crecimiento del tumor en el grupo que recibió únicamente células TC-1; 
mientras que en los grupos de ratones co-inyectados con células TC-1 y CEMs se 
observó crecimiento tumoral, principalmente en aquellas que recibieron CEMs-CaCu. 
(3.6cm3). Este fenómeno fue asociado con una baja frecuencia en la población de 
linfocitos T CD8+, específicos al péptido RAHYNIVTF (0.19%) al día 10 y (0.13%) al día 
15 posterior a la inoculación de las CEMs, así como de una mayor infiltración de 
linfocitos Tregs CD4+CD25+ FOXP3+ en los tumores de los ratones que recibieron 
CEMs-CaCu (1.3X106 cel/cm2) Conclusiones: Las CEMs derivadas de tumores de 
CaCu mostraron una mayor actividad supresora de la respuesta inmune in vivo en 
ratones C57BL/6 bajo condiciones de protección inmunológica al inhibir las poblaciones 
de linfocitos T CD8+ antígeno específicos e inducir la infiltración de linfocitos T con los 
marcadores CD4+, CD25+ FoxP3+, propios de células T reguladoras así como la 
migración de las CEMs inoculadas en el sitio tumoral. Conocer los mecanismos 
precisos de la inmunosupresión de la respuesta antitumoral antígeno-específica 
mediados por las CEMs será de gran importancia para establecer protocolos de terapia 
antitumoral. 
 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 3 
INTRODUCCIÓN 
En la actualidad, el cáncer cérvico uterino (CaCu) es la segunda causa más común de 
muerte especialmente en mujeres jóvenes de alrededor del mundo. (Lowy et al, 2006). 
De acuerdo a estadísticas de la Organización Mundial de la Salud existen 
aproximadamente 500,000 nuevos casos cada año, de los cuales un tercio mueren a 
causa de esta enfermedad. (Yugawa et al, 2009). 
Es reconocido que el 99% de tumores invasivos de CaCu están asociados con la 
infección por el Virus del Papiloma Humano (VPH). Se han identificado cerca de 100 
diferentes tipos de VPH en base a su secuencia de ácidos desoxirribonucleicos (ADN), 
de los cuales, los tipos VPH-16 y -18, son conocidos como de alto riesgo oncogénico, 
ya que su ADN se encuentra en poco más del 70% de los tumores de CaCu. En 
contraste, tipos de VPH de bajo riesgo como 6 y 11 son encontrados primariamente en 
verrugas benignas (Walboomers et al, 1999; Bosch et al, 2002; de Villiers et al, 2004). 
La persistencia del VPH en el tracto genital se relaciona con la falla en la respuesta 
inmune mediada por linfocitos T auxiliares tipo Th1 y por linfocitos T citotóxicos; así 
como por la inducción de linfocitos T reguladores antígeno-específicos, su influjo en el 
tumor y nódulos linfáticos de pacientes con CaCu avanzado (Visser et al, 2007; Molling 
et al, 2007; Nakamura et al, 2007; Piersma, et al, 2007; Adurthi et al, 2008; Welters et 
al, 2008). Estas evidencias han sugerido que durante el desarrollo de la enfermedad se 
genera tolerancia inmunológica hacia el tumor con la concomitante aparición de 
linfocitos T reguladores (Tregs). Sin embargo, se desconoce como se originan estas 
poblaciones celulares, si antígenos virales favorecen su inducción y qué tipos celulares 
participan en este proceso. 
Recientemente se ha propuesto que las Células Estromales Mesenquimales (CEMs) 
participan en dicho reclutamiento debido a que éstas se caracterizan por tener per se 
actividad inmunosupresora de la respuesta inmune y porque se ha visto que tienen la 
capacidad de inducir, reclutar y mantener la función reguladora de linfocitos Tregs. 
(Pittenger et al, 1999; Dominici et al, 2006; Prevosto etal, 2007; Di Ianni et al, 2008). 
 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 4 
También se ha visto que cuando las CEMs son trasplantadas o inyectadas, tienen la 
capacidad de migrar a una variedad de órganos y tejidos, esta capacidad se ve 
incrementada en sitios de inflamación y ciertas patologías debido a su capacidad de 
reparación y remodelación de tejidos. (Chapel et al, 2003). En el caso de los tumores, 
se ha demostrado que existen mediadores inflamatorios en el microambiente tumoral 
que proveen las condiciones propicias para el arribo de las CEMs. A pesar de que 
existen avances en el tema, el papel de las CEMs en el microambiente tumoral aún es 
incierto. 
Es por eso que resulta importante conocer el papel de las CEMs en el desarrollo 
tumoral y evasión de la respuesta inmune en tumores. Con dicho fin en el presente 
estudio se analizó la capacidad de las CEMs humanas derivadas de Médula Ósea 
Normal (CEMs-MON), de Cérvix Normal (CEMs-CNOR) y de Cáncer Cérvico Uterino 
(CEMs-CaCu), para inducir crecimiento tumoral en ratones de la cepa C57BL/6 
(haplotipo H2-Db) bajo condiciones normales y con previa protección inmunológica (por 
inmunización con el péptido antigénico RAHYNIVTF derivado de la proteína E7 del 
VPH-16), utilizando células tumorales TC-1 (H2-Db y positivas a E6/E7 del VPH-16). 
Además se analizó la presencia de poblaciones de linfocitos T reclutados en el 
microambiente tumoral, la infiltración de CEMs en los tumores inducidos y la generación 
de linfocitos T antígeno específicos al péptido RAHYNIVTF en el bazo de los ratones 
inmunizados. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 5 
MARCO TEÓRICO 
 VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO (VPH) 
El VPH representa un grupo heterogéneo de agentes que infectan tejidos epiteliales 
que producen papilomas y tumores benignos. En algunos casos la infección viral puede 
llevar a una transformación maligna. La naturaleza infecciosa de los papilomas 
genitales y cutáneos y su relación con la actividad sexual ha sido reconocida desde la 
época de los romanos. (Crum et al, 1991). Sin embargo, no es sino hasta 1949 cuando 
por microscopia electrónica se identificaron partículas virales en verrugas humanas. Los 
VPH han sido aislados en al menos 24 especies de animales incluyendo aves, reptiles y 
mamíferos y en algunas de estas especies se ha asociado a cáncer invasivo. (Zur 
Hausen et al, 1994). 
La diversidad genética del VPH no refleja la adquisición rápida de mutaciones, sino una 
historia antigua de adaptaciones del virus a diferentes células del hospedero y a los 
mecanismos de control viral desarrollados por él mismo. Actualmente el mayor aliciente 
para el interés en el VPH se debe, no solo al aumento de la prevalencia de infección por 
este virus a nivel mundial en los últimos años, sino al descubrimiento de su relación 
causal con el cáncer de cuello uterino, cáncer ano-genital y posiblemente otros 
canceres humanos, entre ellos tumores de piel y mucosas. (Androphy et al, 1994). 
 Estructura del VPH 
El VPH pertenece a la familia Papilomaviridae, de estructura icosahédrica de 72 
capsómeros (60 hexámeros y 12 pentámeros) con un diámetro aproximado de 55nm. 
(Hebner et al, 2006). Los VPH son pequeños, no envueltos, con un genoma circular de 
doble cadena de aproximadamente 8kb. (Howley et al, 2006). Figura 1. 
 
 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 6 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. Virus del Papiloma Humano. Muestra ADN circular de doble cadena protegido por una cápside 
proteica. (Tomado de http://nobelprize.org/medicine/laureates/2008/illpres.html) 
El genoma viral puede ser dividido en tres regiones. Figura 2. 
Una región larga de control (RLC), responsable de regular la expresión viral después de 
la infección. Esta región contiene el origen viral de la replicación, cuatro sitios de unión 
para la proteína viral E2 y numerosos sitios de unión para los factores de trascripción 
celular. (Kurvinen et al, 2000). 
El resto del genoma comprende ocho marcos de lectura abierta (ORF) divididos entre la 
región temprana que codifica las proteínas E1, E2, E4, E5, E6 y E7 y la región tardía, 
que codifica las proteínas L1 y L2. (Spink et al, 2005). Tabla 1. 
Tabla 1. Proteínas de VPH y sus funciones (Tomado de Hamid et al, 2008) 
Proteína Función 
E1 Replicación de ADN 
E2 Regulación de la transcripción y auxiliar en la replicación de ADN. 
Requerido para mantener el genoma en infecciones persistentes. 
E4 Rompe filamentos de queratina 
E5 Transformación 
E6 Transformación. Se enlaza a E6AP y promueve la ubiquitinación y 
degradación de p53 
E7 Transformación. Se enlaza e inactiva a Prb 
L1 Proteína mayor de la cápside 
L2 Proteína menor de la cápside 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 7 
La Región Temprana (early region: E) contiene seis regiones codificantes (E1, E2, E4, 
E5, E6 y E7) de las cuales E6 y E7 generan proteínas con alto poder oncogénico que 
se traduce en poder transformante y de inmortalización celular. El resto de segmentos 
sintetizan proteínas propias de la estructura y función del virus. E1 codifica dos 
proteínas requeridas para la replicación extracromosómica del ADN viral y para 
completar su ciclo vital. En E2 se codifican dos proteínas que en cooperación con las de 
E1 son necesarias para la replicación extracromosómica. Del resto de los componentes 
de la región temprana se conocen menos detalles en la que la proteína E4 parece ser 
importante para la maduración y replicación viral; E5 se sabe que interacciona con 
receptores de membrana y de esta manera podría estimular la proliferación de las 
células infectadas por el VPH (García, 2007). 
La Región Tardía (late región: L) contiene dos regiones codificantes L1 y L2 las cuales 
generan proteínas que forman parte de la cápside viral. L1 codifica la más importante 
de las proteínas ya que constituye aproximadamente el 90% la cual es una forma muy 
extendida entre los distintos virus específicos de cada especie. Tienen la capacidad de 
generar anticuerpos que pueden ser detectados en pacientes infectadas. De la región 
L2 se codifican proteínas de menor tamaño y mayor variabilidad interespecies de la 
cápside viral. La transcripción de L1 y L2 está regulada por factores reguladores de 
transcripción que se producen únicamente en las células epiteliales más diferenciadas 
de la capa superficial del cérvix; esto explica el hecho de que la producción de viriones 
y el efecto citopático es más pronunciado en las lesiones histológicamente de más bajo 
grado. (Giroglou et al, 2001). 
 
 
 
 
 
Figura. 2 Representación lineal del genoma del VPH. La línea inferior, muestra una representación lineal 
del genoma circular de 7.9kb del VPH-16. (Hamid et al, 2008)) 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 8 
 Clasificación del VPH 
La familia de los VPH cuenta con más de 150 tipos virales que en función de su 
tropismo se clasifican en cutáneos y mucosales. Los cutáneos se detectan 
primordialmente en las verrugas cutáneas, en las lesiones cutáneas de enfermos con 
epidermodisplasia verruciforme y en algunos cánceres de piel no melanoma. En 
relación con su potencial oncogénico, los VPH mucosales se clasifican en tipos de alto, 
probable y de bajo riesgo oncogénico. (Castellsagué et al, 2007) 
Datos procedentes de 11 estudios de casos y controles que exploraron la asociación 
entre infección por VPH y cáncer de cérvix realizados en diferentes países han 
identificado 15 tipos virales como de alto riesgo oncogénico(16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 
51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 y 82); tres tipos se han clasificado como de probable alto 
riesgo (26, 53 y 66); y 12 tipos se han catalogado como tipos de bajo riesgo (6, 11, 40, 
42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 y CP6108) (Castellsagué et al, 2007) 
 Ciclo de vida e infección por VPH 
En trabajos que intentan explicar el modelo de infección por VPH utilizando partículas 
tipo virus, se ha evidenciado que durante laactividad sexual, ocurre una lesión o 
microtrauma del epitelio genital, en particular en la zona de transformación aquella que 
permanentemente sufre cambios en el epitelio escamoso, es el área más vulnerable a 
la infección del epitelio cervical, lo cual permite la exposición de las células basales en 
activa proliferación a los diferentes tipos de VPH permitiendo la unión entre el receptor 
de la célula basal con la proteína de la cápside viral L1, a nivel de su extremo carboxi 
terminal (Giroglou et al, 2001). Dicho receptor ha sido asociado estructuralmente con 
Heparán Sulfato para los tipos virales 16; 33 y con Alfa-6-Integrina para VPH-6 
(Evander et al, 1997; Bousarghin et al, 2003). 
Una vez unido el virus a la superficie celular, se produce su internalización al citoplasma 
de la célula huésped, proceso que ha sido identificado como endocitosis (Bousarghin et 
al, 2003). Dos sistemas han sido reconocidos; el primero involucra un complejo proteico 
llamado Clatrina (Kirchhausen, 2000), utilizado por los tipos 16 y 18; el segundo, utiliza 
un grupo de proteínas principalmente Caveolina, denominado endocitosis por caveolas, 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 9 
en el que participa el VPH 31. (Anderson, 1993). Posterior a la endocitosis, existe 
evidencia en modelos de infección por partículas virales tipo 11 y 16 que la cápside viral 
de 55 nm de diámetro experimenta degradación en el citoplasma celular, a través de un 
proceso de reducción química que daña los puentes disulfuro que estabilizan la 
cápside, originando capsómeros y monómeros los cuales son transportados al núcleo 
junto a pequeños fragmentos del ADN viral, logrando atravesar los poros nucleares de 
un diámetro aproximado a 39 nm, con ello el genoma viral y las proteínas de la cápside 
participan en los procesos de transcripción génica, replicación del ADN y maduración 
de viriones. (Merle et al, 1999; Nelson et al, 2002). 
Es posible definir una población viral no productiva, localizada en el estrato basal, en la 
cual se mantiene la replicación del ADN viral en un número de copias bajo (30-50 
copias por célula infectada), en forma extracromosómica, llamados episomas que se 
estructuran en base a histonas y material genético (Ruesch et al, 1998; Holmgren et al, 
2005), esto requiere la expresión de E1 y E2. Estas proteínas se unen al origen de 
replicación viral y enganchan a las ADN polimerasas celulares y otras proteínas 
necesarias para la replicación del ADN. Se postula que durante esta etapa se 
aseguraría que el ADN viral se distribuya difusamente por las células basales 
proliferantes y que al mantener un número reducido de copias se impediría la activación 
de la respuesta inmune (Peh et al, 2002) 
Sin embargo, este número de copias aumenta dramáticamente cuando se mueven las 
células infectadas a las capas superiores del epitelio (Nakahara et al, 2005; Wilson et 
al, 2005) Figura 3. 
Al iniciarse la diferenciación de la célula basal y su viaje a través del epitelio, comienza 
la replicación y transcripción del DNA viral. Durante esta fase de amplificación, los 
genomas son empaquetados en viriones infecciosos antes de su liberación. Las células 
infectadas son morfológicamente diferentes y se denominan coilocitos, con un núcleo 
ampliado y, a menudo múltiples núcleos por célula. La activación del promotor 
dependiente de diferenciación conduce a una mayor expresión de las proteínas E1, E4 
y E5. (Nakahara et al, 2005; Wilson et al, 2005). 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 10 
L1 y L2 se expresan también en la capa superior del epitelio. Los viriones de VPH son 
icosaédricos en estructura y se componen de 360 proteínas L1 reunidos en 72 
estructuras pentaméricas. (Belnap et al, 1996) L2 interacciona con L1 y facilitan el 
ensamblaje de viriones. (Buck et al, 2005). Las cápsides se someten a un proceso de 
maduración provocada por el procesamiento proteolítico de los componentes del virión 
antes de la liberación de la célula. El virus que se elimina puede infectar el epitelio basal 
o extenderse a nuevos hospederos. (Kirnbauer et al, 1992) Figura 3. 
 
 
Figura 3. Etapas del ciclo de vida del virus del papiloma humano y su localización en el epitelio 
escamoso. En el epitelio normal cervical escamoso y estratificado, las células hijas de la célula tallo del 
epitelio se dividen a lo largo de la membrana basal y maduran verticalmente a través del epitelio sin más 
división (lado derecho). Mientras que cuando ocurre la infección por VPH dentro de las células tallo, en la 
capa basal del epitelio, la expresión de proteínas virales de trascripción temprana ocurre. Bajo la 
regulación de las proteínas, la división celular de la población se expande verticalmente y la 
diferenciación de las células epiteliales es tardía y menos completa, con cambios en la arquitectura del 
epitelio (lado izquierdo). Los viriones maduros son producidos en las capas mas superficiales del epitelio 
y las células presentadoras de antígeno (CPA) intraepiteliales son eliminadas en el epitelio infectado por 
VPH. (Tomado de Frazer, 2004) 
Sin embargo, la producción de viriones es tan sutil que no alcanza a haber una lisis 
importante de las células, este estado puede permanecer casi inalterado durante varios 
años, produciendo algunas alteraciones celulares en forma de displasia (Tay et al, 
1987). 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 11 
Por otro lado puede ocurrir una afección directa del genoma celular; en este caso los 
VPH se consideran de alto riesgo tales como 16 y 18, después de alcanzar al núcleo 
celular, algunos genes virales son integrados dentro del genoma de la célula huésped, 
principalmente los segmentos E6-E7. La replicación de los virus en este caso entra en 
un lapso de espera hasta que la célula hospedera replica su propio ADN junto con el del 
ADN viral (Zur Hausen et al, 2000). Lo cual constituye la mayor determinante en la 
inducción y mantenimiento del fenotipo maligno, implicado en el proceso de 
oncogénesis (Concha, 2007) 
Los mecanismos de transformación son complejos y al parecer varían de un virus a 
otro. El principio general consiste en que dos o más proteínas tempranas cooperan para 
dar un fenotipo transformado. En la mayoría de los VPH la proteína E2 se une a la 
región del promotor temprano, disminuye y regula la expresión de E6/E7; la pérdida de 
E2 es por lo tanto el primer paso en la transformación y es lo que ocurre cuando sucede 
la integración viral, al romperse el punto de transcripción de los genes E1 y/o E2, lo que 
resulta en una sobre-expresión de los genes E6/E7. (Beutner, 1997; Stoler, 1997). 
Los genes E6 y E7 representan los principales genes transformadores del VPH. En 
algunas lesiones VPH-positivas la proteína E6 al perder su regulación se une a p53 
formando un complejo trimérico junto con la proteína-asociada-E6 y lo degrada por la 
vía de la ubiquitina. Al reducir la efectividad de p53 como regulador del ciclo celular, las 
células pueden pasar a la fase S del ciclo con daños cromosomales que pueden ser 
reproducidos en esta fase. Por otro lado, E7 se une a p107, a la ciclina A y a pRb, que 
regula la progresión del ciclo celular de la fase G1 a la fase S aboliendo su función 
normal, perdiendo así un factor regulador importante en la proliferación celular y 
estimulando la producción de la maquinaria replicativa de la célula en la ausencia de 
una progresión normal de G1 a S. (Bonn et al, 1998). Este fenómeno es diferente según 
el tipo de VPH que haya infectado la célula: en general los productos de E6/E7 de VPH 
de alto riesgo se unen a estas proteínas celulares de manera más eficiente que los VPH 
de bajo riesgo. (Shah, 1997). Muy interesante resulta el hallazgo de que en humanos la 
proteína E6 puede degradar preferencialmente a la proteína p53 que presente una 
arginina en la posición 72. Esto quiere decir que una persona homocigota para p53-Arg, 
con factores de riesgo iguales a alguienque no lo sea tiene un riesgo 7 veces mayor de 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 12 
desarrollar carcinomas de cérvix asociados a VPH. E5 es otro gen transformador del 
virus y actúa de manera diferente, estimulando la progresión de la célula y regulando 
positivamente los receptores de factores de crecimiento epidérmico, que son esenciales 
para que el queratinocito pase la fase G1 del ciclo. Al aumentar esta actividad la célula 
es hiperestimulada a pasar a la fase S del ciclo con el riesgo de llevar daños 
cromosomales no reparados (McCance, 1998). 
Todo lo anterior va a influenciar finalmente la evolución de la infección al inmortalizar 
las células epiteliales llevándolas a una inestabilidad genética que les permite adquirir 
una acumulación gradual de cambios celulares específicos, requeridos para la 
tumorigénesis y que van a reflejar el largo período de tiempo que se describe entre el 
inicio de la infección y la aparición de lesiones invasivas del cérvix (Kurman, 1992; Zur 
Hausen, 1998). Se ha encontrado también que E6 y E7 son activamente transcritos en 
el cáncer cervical, lo que sugiere que se requiere la expresión permanente y no 
regulada de estos genes para mantener el fenotipo transformado. (Kurman, 1994). 
La infección del tracto genital por VPH puede inicialmente resultar en una lesión de bajo 
grado o NIC 1 (Neoplasia Intraepitelial Cervical grado 1). Estas lesiones exhiben 
patrones de diferenciación medianamente alterados y muchas de ellas son “limpiadas” 
por el sistema inmune en menos de un año. El mecanismo por el cual la respuesta 
inmune celular elimina las infecciones causadas por VPH aún no es claramente 
entendido. Algunas de estas lesiones, sin embargo, no son eliminadas por el sistema 
inmune y pueden persistir por períodos tan largos como décadas. (Longworth et al, 
2004). 
 RESPUESTA INMUNE CONTRA EL VPH 
Desde el punto de vista de la evolución microbiológica, los virus del papiloma son muy 
exitosos agentes infecciosos. Para lograr este estilo de vida exitoso, el virus del 
papiloma humano o bien, debe evitar o negociar los poderosos sistemas de defensa 
inmunológico del hospedero. La defensa del individuo consiste en una asociación entre 
la inmunidad innata (fagocitos, proteínas solubles como citocinas, el complemento y 
barreras epiteliales) junto con la inmunidad adaptativa (anticuerpos y células efectoras 
citotóxicas). (Stanley, 2009), Figura 4. 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 13 
En términos simples, el sistema inmune innato detecta el patógeno y actúa como 
primera línea de defensa eliminando cerca del 90% de los ataques microbianos. La 
inmunidad innata no tiene memoria específica pero crucialmente activa una apropiada 
respuesta inmune adaptativa que genera una respuesta efectora de gran especificidad. 
De tal forma que la respuesta adaptativa humoral mediada por anticuerpos logra 
eliminar partículas virales libres de los fluidos del cuerpo y puede prevenir una 
reinfección por virus, por otro lado la respuesta adaptativa mediada por células es 
esencial para eliminar células infectadas por virus. (Stanley, 2009). Figura 4. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Inmunidad innata y adaptativa. Los mecanismos de la inmunidad innata constituyen la primera 
barrera defensiva contra la infección. Las respuestas inmunitarias adaptativas se desarrollan después y 
consisten en la activación de los linfocitos T y B. (Tomado de Abbas et al, 2008) 
La inmunidad innata es alertada por daño, estrés o muerte celular, fenómeno que activa 
los sensores de la inmunidad innata como receptores tipo Toll manifestados por la 
inflamación. En el proceso inflamatorio las células efectoras de la inmunidad innata son 
reclutadas y las células del parénquima y fagocitos son activados para secretar 
citocinas inflamatorias y otras moléculas de defensa que reclutan más efectores 
citotóxicos en el foco inflamatorio. Crucialmente las células dendríticas en la periferia 
son activadas para poner en marcha la respuesta inmune adaptativa por presentación 
del antígeno a células T vírgenes en los nódulos linfáticos. (Medzhitov et al, 1997). 
Figura 5. 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 14 
 
Figura 5. Activación de la respuesta inmune adaptativa. Las células detríticas son células presentadoras 
de antígeno que al activarse mediante el reconocimiento de un patógeno, son transportadas desde el 
tejido infectado a los ganglios linfáticos, junto con su antígeno para entrar en los tejidos linfoides 
secundarios, en los cuales inician la respuesta inmune adaptativa. (Tomado de 
http://epidemiologiamolecular.com/01/10/2010/inmunidad-adaptativa-frente-a-agentes-infecciosos) 
El exclusivo ciclo de vida intra-epitelial de los VPH es crucial para comprender la 
respuesta inmune del hospedero. Este ciclo de vida intra-epitelial tiene algunos 
aspectos clave que impactan sobre el reconocimiento y respuesta del sistema inmune 
de los individuos a los VPH. Primeramente la no inflamación acompañada de la 
infección viral que por lo tanto no genera ninguna señal de peligro para alertar a los 
sensores de la inmunidad innata. (Stanley, 2009) 
Los VPH son virus no líticos, su ciclo de vida es llevado a cabo en el queratinocito, una 
célula destinada a morir por causas naturales y un alto nivel de replicación y 
ensamblaje viral que ocurre en queratinocitos diferenciados, en segundo lugar, aunque 
los VPH parecen ser capaces de unirse y entrar a otras células, la expresión génica 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 15 
viral y la síntesis de proteínas son confinadas a los queratinocitos. Por lo tanto no hay 
síntesis de proteínas virales en células presentadoras de antígenos. Además como se 
ha mencionado el VPH infecta vía microabrasiones que dejan la lámina basal intacta y 
se eliminan en superficies mucosas o cutáneas, lejos de canales vasculares, de tal 
manera que es pobre el acceso a los nódulos linfáticos donde la respuesta inmune 
adaptativa es iniciada. (Stanley, 2009). 
En vista de estos impedimentos resulta difícil que exista una respuesta inmune contra el 
VPH, sin embargo grandes evidencias muestran que sí la hay. Estudios histológicos de 
regresión de verrugas genitales revela un largo infiltrado dentro del estroma y epitelio 
de la verruga de células T (CD4+ y CD8+) y macrófagos. (Coleman et al, 1994). La 
infiltración de linfocitos expresa la activación de marcadores en el medio dominados por 
citocinas proinflamatorias como IL-12, TNFα e IFNγ, (Stanley et al, 2006) lo cual 
ocasiona una sobre-regulación de moléculas de adhesión requeridas para el tráfico de 
los linfocitos en el endotelio de los capilares de las verrugas. Estos efectos son 
característicos de la respuesta inmune mediada por células Th1. (Coleman et al, 1994). 
La mayoría de las infecciones por VPH son eliminadas por el sistema inmune, sin 
embargo si la respuesta inmune falla al eliminar o controlar la infección a continuación 
una infección persistente promoverá altos niveles de ADN de VPH de alto riesgo lo cual 
permite que los individuos tengan mayor probabilidad de progresión hacia una 
neoplasia cervical de alto grado (NIC 2/3) y carcinoma invasivo. (Moscicki et al, 2006; 
Liaw et al, 2001). 
 SISTEMA INMUNE Y CÁNCER CÉRVICO UTERINO (CaCu) 
Las células tumorales han desarrollado durante su generación múltiples mecanismos 
inmunosupresores con el propósito de evadir el reconocimiento inmune o desactivar los 
mecanismos efectores de células T anti-tumorales. Dichos mecanismos incluyen 
alteraciones en la presentación antigénica, defectos en señales intracelulares de células 
T, incremento de la secreción de factores inmunosupresores, activación de vías de 
señalización inhibitorias en células del sistema inmune y reclutamiento selectivo de 
poblaciones reguladoras. En conjunto estos mecanismos se combinan en estados 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 16 
avanzados del cáncer, limitando la capacidad delsistema inmune de contrarrestar el 
crecimiento del tumor. (Rabinovich et al, 2007). 
Evidencias recientes han confirmado la hipótesis de que los tumores pueden alterar la 
inmunidad antitumoral promoviendo la expansión, el reclutamiento y la activación de 
distintas poblaciones de linfocitos T reguladores (Treg) (Sakaguchi, 2004; Zou, 2005). 
Los linfocitos T reguladores naturales (nTreg) expresan, desde su diferenciación en el 
timo, el patrón de expresión CD4+, CD25+ y FoxP3+. Esta población de linfocitos 
suprimen respuestas de linfocitos T efectores (CD4+ y CD8+) in vivo (Curiel et al, 2004, 
Horwitz et al, 2008). 
Se ha encontrado la presencia de Treg en el microambiente tumoral de pacientes con 
cáncer ovárico y de mama (Liyanage et al, 2002; Curiel et al, 2004) y se relaciona la 
acción inmunosupresora de estas células con la progresión tumoral y la resistencia a la 
quimioterapia (Okita et al, 2005; Leong et al, 2006) observándose una población 
agrandada de Treg en sangre periférica de pacientes con diferentes tipos de cáncer. 
(Woo et al, 2001; Ormandy et al, 2005, Hiraoka et al, 2006). 
Las células Treg pueden estar involucradas en el fracaso del sistema inmune para 
controlar el desarrollo de cáncer inducido por VPH. Se ha investigado la frecuencia, 
fenotipo y actividad de las células Treg en pacientes con NIC y con cáncer cervical y 
mostraron frecuencias celulares aumentadas de CD4+/CD25+ en sangre periférica, así 
como baja expresión de IFN-γ y alta expresión de CTLA-4 y FoxP3. Estas frecuencias 
aumentadas en las células Treg en las pacientes con cáncer cervical pueden suprimir la 
inmunidad específica a VPH. (Visser et al, 2007) 
Los antecedentes mencionados sugieren que la presencia de VPH en el desarrollo del 
cáncer cérvico uterino se relaciona con la falla en la respuesta inmune mediada por 
linfocitos T auxiliares tipo Th1, por linfocitos T citotóxicos y por la inducción de linfocitos 
T reguladores antígeno-específicos, su influjo en el tumor y nódulos linfáticos de 
pacientes con CaCu avanzado (Visser et al, 2007; Molling et al, 2007; Nakamura et al, 
2007; Piersma et al, 2007). 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 17 
Lo cual ha sugerido que durante el desarrollo de la enfermedad se genera tolerancia 
inmunológica hacia el tumor, con la concomitante aparición de células 
inmunosupresoras. Recientemente se ha estipulado que las Células Estromales 
Mesenquimales (CEMs), dispuestas en el nicho tumoral pueden ser uno de los 
candidatos importantes en generar directa e indirectamente supresión de la respuesta 
inmune, debido a que éstas se caracterizan por tener per se actividad inmunosupresora 
de la respuesta inmune y por su capacidad de inducir, reclutar y mantener la función 
reguladora de linfocitos Tregs (Pittenger et al, 1999; Dominici et al, 2006; Prevosto et al, 
2007; Di Ianni et al, 2008). 
 CÉLULAS ESTROMALES MESENQUIMALES (CEMs) 
Las CEMs representan una población heterogénea de células multipotentes de 
morfología fibroblastoide, que tienen la capacidad de diferenciarse en múltiples linajes, 
con propiedades benéficas en los procesos regenerativos e inmunomodulatorios. 
(Giordano et al, 2007). 
En el año 2006, la Sociedad Internacional de Terapia Celular o ISCT propuso tres 
criterios fundamentales para definir a las CEMs: primero, adherencia al plástico bajo 
condiciones de cultivo; segundo, expresión de los antígenos CD73, CD90 y CD105 en 
ausencia de antígenos hematopoyéticos como CD34, CD45, marcadores de monocitos, 
macrófagos y linfocitos B; y tercero, capacidad de diferenciación in vitro en osteocitos, 
adipocitos y condrocitos bajo condiciones estándar de cultivo (Páez et al, 2007) Figura 
6. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Diferenciación de las Células Estromales Mesenquimales hacia osteocitos, adipocitos y 
condrocitos. (Tomado de http://stemcells-research.net/2011/07/11/human-mesenchymal-stem-cells/). 
http://stemcells-research.net/2011/07/11/human-mesenchymal-stem-cells/
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 18 
Las CEMs expresan Complejo Principal de Histocompatibilidad clase 1 (CPH-I) pero no 
expresan moléculas CPH-II, B7-1, B7-2, CD40, o CD40L. Además, estas células 
secretan citocinas y moléculas reguladoras que juegan un papel importante en la 
proliferación y maduración de células madre hematopoyéticas (Aggarwal et al, 2005; 
Locatelli et al, 2007). 
Debido a las características que presentan las CEMs, como son: su plasticidad, la 
secreción de citocinas y su baja inmunogenicidad, las hacen candidatas para terapia 
celular e ingeniería celular (Cárcamo et al, 2008). 
Las propiedades inmunosupresoras de las CEMs han sido documentadas con muchos 
estudios que enfocan su utilidad en sus efectos en un trasplante (Le Blanc et al, 2005; 
Ringden et al, 2006; Brooke et al, 2007), debido a que las CEMs obtenidas de médula 
ósea de humanos, mandriles y ratones han demostrado disminuir la respuesta inmune 
de los linfocitos en ensayos in vitro e in vivo (Bartholomew et al, 2002; Djouad et al, 
2003). Se han encontrado varios mecanismos para explicar estos posibles efectos 
como son la secreción de factores anti-inflamatorios, citocinas, (Rasmusson, 2006), 
modulación del desarrollo celular (Aggarwal et al, 2005; Jiang et al, 2005), la supresión 
de linfocitos T efectores (Potian et al, 2003; Rasmusson et al, 2003) y el aumento de 
células T reguladoras. (Bernardo et al, 2007) 
Las CEMs suprimen la proliferación de células T in vitro, aún bajo condiciones de 
estímulo ya sea en presencia de mitógenos, aloantígenos o anticuerpos tales como 
anti-CD3 y anti-CD28 (Rasmusson et al, 2003; Prevosto et al, 2007; Di Ianni et al, 
2008), y se ha visto que la proliferación de linfocitos T citotóxicos puede ser suprimida 
de manera Complejo Principal de Histocompatibilidad (CPH) independiente, 
traspasando la barrera entre especies (Djouad et al, 2003). Las CEMs pueden inhibir la 
activación de linfocitos T citotóxicos, aloantígeno específicos estando presentes en un 
radio más grande que el de células efectoras, en un radio más bajo éstas pueden 
decrementar o incrementar la actividad aloantígeno específica mediada por linfocitos T 
citotóxicos (Locatelli et al, 2007). Durante la maduración de células dendríticas, las 
CEMs pueden inhibir la expresión de moléculas involucradas en la presentación de 
antígenos como CD1a, CD40, CD80, CD86 y HLA-DR, fenómeno mediado por la 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 19 
producción de citocinas, en particular Factor de Crecimiento de Hepatocitos (HGF) y 
Factor de Crecimiento Transformante (TGF-β1), pero no por la inducción de apoptosis 
(Arévalo et al, 2007). 
Por otro lado, evidencias han mostrado que las CEMs juegan un papel importante en la 
patogénesis y progresión del comportamiento tumoral afectado por el compartimiento 
del estroma como puede ser la matriz extracelular, vasos sanguíneos, tejido conectivo, 
células del sistema inmune que dinámicamente están interligadas con el parénquima 
del tumor. (Li et al, 2006; Valtieri et al, 2008) 
Estudios demuestran que las CEMs favorecen el crecimiento tumoral in vivo (Djouad et 
al, 2003; Zhu et al, 2006). También se ha reportado que CEMs o células parecidas a 
éstas, pueden ser aisladas de varios tumores, como linfomas, sarcomas de médula 
ósea (Cao et al, 2009) y CaCu (Montesinos et al, 2009). Con base en evidencias 
recientes, se ha encontrado que las CEMs pueden ser uno de los tipos celulares 
implicados, en la inducción de poblaciones de linfocitos T reguladores (Pittenger et al, 
1999; Dominici et al, 2006; Prevosto et al, 2007; Di Ianni et al, 2008), el implante, la 
metástasis y supresión de la respuesta inmune en tumores malignos. (Yen et al, 2008). 
En co-cultivos de células T y CEMs, la producción de FoxP3 aumenta mientras que la 
de CD127 disminuye, lo cual indica que las CEMs regulan el fenotipo (CD4+ CD25+ 
FoxP3+ CTLA-4+) y función de las células Tregs (DiIanni et al, 2008). 
Recientemente se ha logrado obtener y caracterizar CEMs de tejidos normales de 
cuello uterino y de tumores avanzados de Cáncer Cérvico Uterino. En estudios previos 
se ha encontrado que las CEMs obtenidas de tumores malignos de cuello uterino, al 
cultivarlas en contacto con linfocitos heterólogos de donadores normales, se favorece la 
inducción de poblaciones de linfocitos T regs CD4+ CD25+ FoxP3+ CTLA-4+ 
(Montesinos et al, 2009). 
Estudios muestran que durante el desarrollo de tumores se llegan a perder los 
contactos existentes entre células, lo cual puede contribuir a aumentar las capacidades 
migratorias y de metástasis de algunas células. Además de la expresión de citocinas 
como TGF-β pueden contribuir a la interacción de células estromales y células malignas 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 20 
en el microambiente tumoral (Turley et al, 2008). En algunos estudios se ha demostrado 
que las CEMs provenientes de médula ósea contribuyen en el microambiente tumoral 
influenciando el crecimiento y la progresión de tumor (Nakamura et al, 2004; Hung et al, 
2005; Nakamizo et al, 2005). Existe evidencia experimental de que las CEMs migran 
hacia sitios de formación del tumor y se incorporan dentro del microambiente tumoral, 
se ha propuesto que las propiedades inmunosupresoras de las CEMs permiten la 
proliferación de las células del tumor y la estimulación de la formación de vasos 
sanguíneos (Zhu et al, 2006) 
Lo anterior es complementado por varios autores inicialmente por Studeny et al, 2002 
que, en un modelo in vivo de ratones, al inyectar CEMs humanas marcadas con 
proteína verde fluorescente mostró su migración hacia tumores de melanoma 
implantados. Posteriormente Djouad et al, 2003 encontró que el co-trasplante de CEMs 
con células de melanoma en ratones favorece el establecimiento y rápido crecimiento 
del tumor, resultado que persiste aún cuando éstas son trasplantadas a un sitio distante 
del tumor, investigaciones del mismo equipo de trabajo, muestran que la presencia de 
CEMs facilita el crecimiento del tumor pero no tiene efecto en la metástasis, mientras 
que Karnoub et al, 2007 encontró que cuando se administran CEMs y células tumorales 
se incrementa el potencial metastásico. 
Los mecanismos precisos por los cuales las CEMs inmunosuprimen, aún no son claros. 
La supresión de la proliferación de las células T estimuladas por linfocitos alogénicos, 
células dendríticas y mitógenos, como concavalina A o fitohemaglutinina ha sido bien 
documentada (Barry et al, 2004). Tanto la vía contacto célula-célula (Beyth et al, 2005) 
como la actividad de factores solubles también mostraron estar involucrados en este 
proceso (Di Nicola et al, 2002; Tse et al, 2003). Por otra parte han sido reportados datos 
que sugieren que la actividad inmunosupresiva de las CEMs no está asociada con la 
secreción de HGF o TGF-β1 (Tse et al, 2003; Beyth et al, 2005) y que la supresión 
inmune al menos en parte, se debe a la generación de células Tregs CD8+. (Djouad et 
al, 2003). 
Otro mecanismo que también ha sido postulado es que el mecanismo inmunosupresivo 
de las CEMs está basado en la actividad de la Indoleamin 2,3-Dioxigenasa (IDO) la cual 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 21 
impide la síntesis de proteínas mediante la depleción de aminoácidos esenciales del 
triptófano (Meisel et al, 2004). Más recientemente, ha sido reportado que las CEMs 
inhiben la proliferación de células T a través del impedimento de la división celular 
(Glennie et al, 2005). En otro estudio se muestra que las CEMs alteran el perfil de 
secreción de varios componentes celulares de la respuesta inmune para inducir un 
fenotipo antiinflamatorio o tolerante, con un incremento en la secreción de Interleucina-
10 (IL-10) e IL-4 y un decremento en la producción del factor de necrosis tumoral-α 
(TNF-α) e Interferón-γ (IFN-γ) (Aggarwal et al, 2005). Finalmente ha sido postulado que 
las CEMs actúan suprimiendo la diferenciación de monocitos en células dendríticas 
maduras perjudicando la estimulación de células T (Beyth et al, 2005; Jiang et al, 2005). 
Diversos estudios han proveído datos que muestran efectos promotores y supresores 
de las CEMs en la progresión de tumores, datos que permanecen en pruebas debido a 
la gran complejidad de los procesos de crecimiento del tumor. Estas investigaciones 
son imprescindibles para describir eficientemente los efectos mediados por CEMs en el 
comportamiento del tumor con el fin de proveer un conocimiento más amplio para el 
empleo de CEMs en un contexto terapéutico. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 22 
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 
El Cáncer Cérvico Uterino (CaCu) es un problema importante de salud pública, ya que 
constituye una de las principales causas de mortalidad entre las mujeres mexicanas con 
cáncer. Cada año se diagnostican alrededor de 11,000 casos nuevos de CaCu invasor 
en nuestro país (INEGI, 2008). La mayoría de las pacientes ingresan con enfermedad 
avanzada, con un mal pronóstico y representan una enorme pérdida de recursos 
humanos y económicos. Esta enfermedad se encuentra fuertemente asociada (cercana 
al 100%) con la infección por el Virus de Papiloma Humano (VPH) de alto riesgo, en 
donde VPH-16 es el tipo de papiloma carcinogénico más comúnmente encontrado en 
los tumores de cuello uterino a nivel mundial (Walboomers et al, 1999). La presencia de 
VPH en este tipo de cáncer genital, también se relaciona con la falla en la respuesta 
inmune mediada por linfocitos T auxiliares tipo Th1 y por linfocitos T citotóxicos; así 
como por la inducción de linfocitos T reguladores antígeno-específicos y su influjo en el 
tumor y nódulos linfáticos de pacientes con CaCu avanzado (Visser et al, 2007; Molling 
et al, 2007; Nakamura et al, 2007; Piersma et al, 2007). Estas evidencias han sugerido 
que durante el desarrollo de la enfermedad se genera tolerancia inmunológica hacia el 
tumor, con la concomitante aparición de células inmunosupresoras. Se ha postulado 
que las Células Estromales Mesenquimales (CEMs) participan en la generación de 
linfocitos T reguladores en los tumores, debido a que éstas se caracterizan por tener 
per se actividad inmunosupresora de la respuesta inmune y por su capacidad de 
inducir, reclutar y mantener la función reguladora de linfocitos T reguladores (Pittenger 
et al, 1999; Dominici et al, 2006; Prevosto et al, 2007; Di Ianni et al, 2008). 
Recientemente nuestro grupo de investigación ha logrado obtener y caracterizar CEMs 
de tejidos normales de cuello uterino y de tumores avanzados de CaCu. En estudios 
previos in vitro, se ha encontrado que las CEMs obtenidas de tejidos tumorales 
cervicales, al ponerlas en contacto con linfocitos heterólogos de donadores normales, 
se favorece la inducción de poblaciones de linfocitos T reguladores CD4+ CD25+ 
Foxp3+ CTLA-4+, así como la inhibición de la proliferación de linfocitos T CD8+. 
Tomando en consideración la capacidad inmunosupresora de las CEMs, en este trabajo 
se planteó analizar el efecto de CEMs derivadas de tejidos cervicales tumorales (CEM-
CaCu) en la supresión in vivo de la respuesta inmune antitumoral en ratones de la cepa 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 23 
C57BL/6. Encontrándose una importante actividad inmunosupresora de la respuesta 
inmune antitumoral, así como la inducción de linfocitos T reguladores en el sitio tumoral. 
Los resultados de este estudio son de gran relevancia y postulan a las CEMs como 
blancos potenciales para inhibir su actividad supresora y establecer estrategias 
terapéuticas encaminadas a favorecer la respuesta inmune específica contra células 
tumorales. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 24 
 
HIPÓTESIS 
 
Las CEMs se caracterizan por tener capacidad inmunosupresora al inhibir una amplia 
variedad de células del sistema inmune, incluyendolinfocitos B, células dendríticas y 
células asesinas naturales, así como la activación y proliferación de linfocitos T 
vírgenes e incluso de memoria específica a un péptido antigénico (Di Nicola et al, 2002; 
Krampera et al, 2003; Plumas et al, 2005; Zappia et al, 2005; Rutella et al, 2006; 
Corcione et al, 2006; Sotiropoulou et al, 2006). Recientemente se ha reportado que las 
CEMs son capaces de favorecer el implante, crecimiento y metástasis de tumores 
malignos en sistemas singénicos, heterólogos e incluso xenogénicos, debido a que son 
toleradas por la baja expresión de moléculas del Complejo Principal de 
Histocompatibilidad en su membrana celular (Djouad et al, 2003; Karnoub et al, 2007). 
Además se sabe que participan en la inducción y reclutamiento de Tregs (Pittenger et 
al, 1999; Dominici et al, 2006; Prevosto et al, 2007, Di Ianni et al, 2008). Por tanto, en 
un modelo in vivo de ratones de la cepa C57BL/6, en condiciones de protección 
inmunológica previa con el péptido antigénico RAHYNIVTF de la proteína E7 de VPH-
16, al inocular células tumorales TC-1 (positivas a la expresión de las proteínas E6 y E7 
de VPH-16) junto con CEMs derivadas de tumores de cáncer cérvico-uterino, se 
espera que la actividad efectora de linfocitos T citotóxicos específicos sea suprimida y 
en consecuencia se favorezca el crecimiento tumoral, con la concomitante infiltración de 
CEMs y células T reguladoras en los tumores inducidos. 
 
 
 
 
 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 25 
OBJETIVOS 
Objetivo general 
Analizar la participación de Células Estromales Mesenquimales derivadas de tumores 
malignos de cuello uterino (CEMs-CaCu) en la supresión de la respuesta inmune 
antitumoral en ratones de la cepa C57BL/6. 
Objetivos específicos 
1) Analizar la participación de CEMs-CaCu en el crecimiento tumoral en ratones con 
y sin previa inmunización antígeno específica. 
2) Evaluar la generación de linfocitos T antígeno específicos en ratones con 
inmunización previa bajo presencia y ausencia de CEMs-CaCu. 
3) Analizar las poblaciones de linfocitos T infiltradas en los tumores inducidos 
4) Analizar la migración de CEMs-CaCu en los tumores inducidos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 26 
MATERIALES Y MÉTODOS. 
 Ratones 
Para la inducción de tumores se emplearon 10 grupos de 6 ratones hembra cada uno 
de la cepa C57BL/6 (Haplotipo H2-Db ) de 6-8 semanas de edad, se mantuvieron en 
condiciones estándar de bioterio, con alimento y agua, conforme a la Norma Oficial 
Mexicana NOM-062-ZOO-1999, Diario Oficial de la Federación, 22 de agosto de 2001. 
 Cultivos celulares. 
Para inducir tumores en los ratones C57BL/6, se utilizaron células tumorales TC-1 
derivadas de un carcinoma de pulmón de ratón las cuales expresan de manera 
permanente los genes E6 y E7 de VPH-16 junto con el gen Ras, además de ser 
histocompatibles a este modelo de ratón por presentar moléculas H-2D. Estas células 
fueron cultivadas con medio de cultivo RPMI 1640 (Sigma, USA) suplementado con 
suero fetal de bovino (SFB) GibcoBRL (Life Technologies, USA) al 10%. También se 
emplearon estirpes de CEMs (humanas), las cuales fueron previamente obtenidas de 
Médula Ósea Normal (CEMs-MON), Cérvix Normal (CEMs-CNOR) y con Cáncer 
Cérvico Uterino (CEMs-CaCu). Estas estirpes celulares fueron proporcionadas por el 
Laboratorio de Células Troncales Mesenquimales a cargo del Dr. Juan José Montesinos 
Montesinos, en la Unidad de Investigación Médica en Enfermedades Oncológicas, 
Hospital de Oncología, CMN SXXI. Todas las estirpes de CEMs utilizadas en este 
proyecto han sido caracterizadas bajo los criterios mínimos establecidos por la 
Sociedad Internacional de Terapia Celular, para definir a las CEMs (Dominici et al, 
2006) y que consisten en: ser adherentes en condiciones estándar de cultivo; expresan 
los marcadores CD105, CD73 y CD90 y carecen de los marcadores de superficie CD45, 
CD34, CD14/CD11b, CD79a/CD19 y HLA-DR en la membrana celular; y finalmente han 
sido caracterizadas por su capacidad de diferenciarse a osteoblastos, adipocitos y 
condrocitos. Las CEMs fueron cultivadas con medio de cultivo consistente en DMEM 
bajo en glucosa GibcoBRL (Life Technologies, USA) suplementado con suero fetal de 
bovino GibcoBRL (Life Technologies, USA) al 15%. Antes de ser inoculadas, todas las 
células fueron cultivadas en condiciones de esterilidad y mantenidas bajo condiciones 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 27 
reguladas en una incubadora (Forma Scientific ) a 37°C con 5% de CO2 y humedad 
saturante. 
Previo a la inoculación, las CEMs se marcaron con DAPI 50µg/ml de la siguiente 
manera: las células fueron incubadas con 50µg/ml DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole 
(Sigma, USA) por 1.5 horas a 37ºC en oscuridad. Posteriormente se realizaron dos 
lavados con PBS y fueron inoculadas a los ratones. 
 Inmunización e inoculación de células para la inducción de tumores 
Para inducir protección inmunológica en los ratones C57BL/6, se emplearon 5 grupos 
de 6 ratones cada uno y fueron inmunizados con tres dosis de péptido RAHYNIVTF 
(derivado de la proteína E7 de VPH16) (Invitrogen, CA, USA) de 100µg cada una, vía 
cavidad peritoneal. El péptido fue aplicado disuelto en PBS (Solución Salina de 
Fosfatos) y emulsionado con adyuvante completo de Freund (Sigma, USA) en 
proporción 1:1 para la primera dosis, en las dos dosis subsecuentes se utilizaron 100µg 
del péptido emulsionado con adyuvante incompleto de Freund (Sigma, USA) en 
proporción 1:1, el tiempo transcurrido entre cada inmunización fue de 10 días. El 
volumen total de antígeno y adyuvante fue de 100µL. 
Los cinco grupos de ratones sin protección inmunológica y los cinco grupos que 
recibieron previamente protección inmunológica con el péptido RAHYNIVTF, fueron 
tratados 10 días después, con las células tumorales TC-1 y CEMs marcadas con DAPI, 
de la siguiente manera. 
TRATAMIENTOS 
NO INMUNIZADOS 
INMUNIZADOS CON 
PÉPTIDO RAHYNIVTF 
TC-1:CEMs TC-1:CEMs 
 0:0 0:0 
(-) 100,000:0 100,000:0 
CEMs-MON 100,000:100,000 100,000:100,000 
CEMs-CNOR 100,000:100,000 100,000:100,000 
CEMs-CaCu 100,000:100,000 100,000:100,000 
Los ratones recibieron un refuerzo de 100,000 células tumorales TC-1 10 días después 
de iniciado el tratamiento. 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 28 
 Medición de tumores 
El tamaño de los tumores fue evaluado cada tercer día, durante 43 días posterior a la 
aplicación del refuerzo de células tumorales. El volumen del tumor fue calculado en 
cada momento tras medir el largo y ancho del tumor con ayuda de un vernier y 
aplicando la siguiente fórmula V= (R1*R22)/2, donde R1 y R2 son los valores obtenidos 
a partir de la medición perpendicular del tumor (Paz et al, 2009). 
 Determinación de linfocitos T antígeno específicos 
Con la finalidad de evaluar la inducción de linfocitos T citotóxicos específicos en los 
ratones inmunizados, así como la influencia de las CEMs sobre su actividad funcional, 
se analizó su presencia en el bazo en el momento en que se inicio el crecimiento 
tumoral en los ratones. Por tal motivo, se extrajo de cada uno de los tratamientos, el 
bazo de un ratón tratado al día 10 y 15 después de finalizados los tratamientos con 
células tumorales TC-1 y CEMs en ratones con inmunización previa. Los bazos fueron 
colocados en una caja petri de 50mm X 15mm (Corning, USA) con 3ml de PBS sobre 
una organza estéril, para obtener los linfocitos mediante presión con un émbolo. Las 
células obtenidas de los macerados fueron tratadas con 5 ml de buffer de lisis para 
eritrocitos y posteriormente se realizaron 2 lavados con PBS para obtener el botón 
celular. Se realizó conteo celular con azul de tripano para observar viabilidad celular. 
Posteriormente, en una placa de 96 pozos de fondo U (Corning, NY, USA) se colocaron 
1.5 millones de células de bazo en un volumen de 100µl con PBS+SFB-2% de cada 
muestra por pozo. Despuésde 1 lavado con PBS, las células fueron resuspendidas en 
50µl de PBS+SFB-2% y posteriormente se agregó 1µg de moléculas pentámericas 
marcadas con ficoeritrina (PE) (Proinmune, U.K), constituido por 5 moléculas H-2Db 
asociadas al péptido RAHYNIVTF. Después de resuspender, se dejó a temperatura 
ambiente 20min en oscuridad. A continuación se realizó un lavado con PBS+SFB 2% y 
se adicionó 1µg de anticuerpo contra CD8+ (Aloficocianina, (APC) (R&D Systems, MN) 
y CD19+ (FITC) (Invitrogen, USA) en 50µl de PBS+SFB 2%. Como controles, se 
utilizaron células de bazo de ratones sin inmunización previa. Finalmente las muestras 
fueron analizadas en el equipo FACS-ARIA (BD-USA). 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 29 
 Obtención de tumores 
Al finalizar 43 días del seguimiento en los diferentes grupos, los ratones fueron 
sacrificados y los tumores de los diferentes tratamientos fueron extraidos y 
fragmentados en dos porciones: una fue colocada en paraformaldehido al 4% con PBS 
para su posterior tratamiento para la realización de las tinciones inmunohistoquímicas; y 
la otra parte fue empleada para realizar cultivo celular y fijación de CEMs. 
 Inmunohistoquímicas 
Todas las muestras de los tumores fueron examinados por el método de avidina-
biotina-peroxidasa. Para su procesamiento, los tejidos fueron sometidos a cambios de 
diferentes porcentajes de alcohol (50-100%) para ser deshidratados y posteriormente 
en xilol para poder ser incluidos en parafina. Posteriormente, con ayuda de un 
micrótomo (Leica, USA) se realizaron cortes histológicos de 3µm de grosor y se 
colocaron en laminillas previamente tratadas con acetona y silano. 
Los tejidos dispuestos en las laminillas se desparafinaron y fueron tratados con 
diferentes concentraciones de alcoholes (100-70%) para ser rehidratados, 
posteriormente se realizó una recuperación antigénica por tratamiento con citrato de 
sodio (o.o1M, pH 6.0), por 20 min en baño maría a 90ºC. En seguida se eliminó la 
peroxidasa endógena con metanol y peróxido de hidrogeno (MetOH/H2O2) al 3% por 
10 minutos, esta operación se llevó a cabo 3 veces. Se bloqueó la unión no especifica 
de los anticuerpos, incubando las muestras con suero normal de cerdo al 0.2% por 
1hora en cámara húmeda, y se procedió a emplear el kit avidina-biotina (Vector 
Laboratories, Inc), por 15min en cámara húmeda, para amplificar la reacción. A 
continuación se procedió a incubar las muestras de manera independiente con 
anticuerpos cabra anti-ratón con especificidad hacía linfocitos CD8+, FoxP3 (Santa 
Cruz Biotechnology, CA, USA), CD25+, (R&D Systems, MN) y conejo anti ratón con 
especificidad hacía linfocitos CD4+ (Novus Biologicals, LLC) en una dilución 1:500, 
1:50, 1:200 y 1:50 respectivamente durante toda la noche. Posteriormente se realizaron 
5 lavados con PBS y se procedió a incubar por 30min con anticuerpo secundario 
conjugado a biotina conejo anti-cabra (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) y equino 
anti-conejo (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) según la fuente del anticuerpo 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 30 
primario correspondiente, en seguida se incubó con el complejo estreptavidina marcado 
con peroxidasa de rábano por 30min en cámara húmeda, (universal LSAB+ KIT/HRP, 
DAKO Cytomation) y finalmente el color se generó mediante la adición del substrato 
cromógeno denominado Diamino Benzidina (DAB), durante el tiempo requerido de cada 
marcador con respecto al control de isotipo. La reacción se detuvo con agua, y para 
finalizar el ensayo, los cortes de tejidos fueron contrateñidos con hematoxilina para 
diferenciar el núcleo y citoplasma celular. Las muestras fueron deshidratadas como se 
mencionó previamente. Las preparaciones fueron cubiertas con cubre objetos y resina 
para su preservación. Se emplearon controles negativos usando un isotipo control 
marcado con anticuerpo IgG normal de cabra o conejo de acuerdo al isotipo del 
anticuerpo primario (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). 
Los tejidos fueron digitalmente aumentados hasta 40x usando un sistema digital Aperio 
(Aperio Technologies, Inc., a Vista, Calif) Figura 7(A), el cual está complementado con 
un software Aperio ImageScope v11.0.2.716 el cual tiene la habilidad de identificar la 
tinción positiva mediante intensidad de pixeles en los tejidos y proporciona 
automáticamente un análisis numérico de las células teñidas por área total de los 
cortes. Figura 7(B) 
Cultivo y fijación de las CEMs infiltradas en tumores inducidos 
La segunda porción de tumor fue procesada en trozos muy pequeños y sembrados en 
una caja petri por explante y cultivadas con medio DMEM bajo en glucosa GibcoBRL 
(Life Technologies, USA) más el 15% de Suero Fetal Bovino (SFB) GibcoBRL (Life 
Technologies, USA) con cambios de medio de cultivo cada tercer día. Después de 
observar crecimiento celular en las cajas de cultivo, las células adheridas fueron 
lavadas con PBS y fijadas con paraformaldehido-PBS al 4%. A continuación se 
procedió a analizar la tinción específica de DAPI en las CEMs previamente marcadas, 
además de analizar la morfología correspondiente .a través de un microscopio de 
florescencia (Apotome , Zeiss, USA). 
 
 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 31 
 
 
 
 
 
Figura 7. Análisis de la tinción positiva en tejidos obtenida mediante inmunohistoquímica. (A) Equipo 
Aperio Technologies, Inc., a Vista, Calif, integrado con un scanner y un PC equipado con el software 
Aperio ImageScope v11.0.2.716, (B). Digitalización y análisis de la tinción de células CD8+ (La presencia 
de CD8+ es determinada por el uso de un anticuerpo policlonal anti CD8+) de un tejido tumoral de ratón, 
se observa tinción positiva específica color marrón y también se presenta un tejido control que no 
muestra esta tinción, se obtienen acercamientos de 40X. 
Análisis estadístico 
La prueba de Kruskal-Wallis fue empleada para hacer la comparación entre los datos 
de volumen tumoral de los diferentes grupos tratados La significancia fue determinada 
como P<0.05. 
 
 
 
 
(A) Análisis 
software 
(B) 
Scanner 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 32 
RESULTADOS 
 Participación de las CEMs en el crecimiento tumoral en ratones de la cepa 
C57BL/6 sin protección inmunológica. 
El crecimiento de las células tumorales es afectado por varios elementos que 
conforman el estroma tumoral, dentro de los cuales se encuentran: la matriz 
extracelular, los vasos sanguíneos, el tejido conectivo, las células de la respuesta 
inmune y las CEMs, que dinámicamente interaccionan con el parénquima del tumor 
(células tumorales) (Li et al, 2006; Valtieri et al, 2008; Hu et al, 2008, Joyce et al, 2009.). 
Las CEMs se comunican con las células tumorales a través de contacto directo y a 
través de mecanismos de señalización paracrina mediada por la secreción de factores 
solubles tales como citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento. Las interacciones 
entre las células tumorales y células que componen el estroma regulan el crecimiento, 
la invasión, la metástasis y la angiogénesis tumoral (Karnoub et al, 2007; Hwang et al, 
2008; Studebaker et al, 2008). Varios de estos estudios, basados en el uso de CEMs 
derivadas de médula ósea, han mostrado que las CEMs inoculadas en animales, 
juegan un papel importante en la patogénesis y progresión del tumor, así como en la 
supresión de la respuesta inmune para favorecer el implante y la progresión del mismo 
(Stagg, 2008). Sin embargo, resulta de gran relevancia el conocer si CEMs derivadas 
de tumores malignos también juegan un papel importante en la supresión de la 
respuesta inmune antitumoral. Por tal razón, en el presente estudio analizamos el papel 
de tres diferentes estirpes celulares de CEMs humanas: medula ósea normal (CEMs-
MON), tejido cervical normal (CEMs-CNOR) y tejido cervical tumoral (CEMs-CaCu) en 
el desarrollo tumoral inducido por células tumorales TC-1 en ratones de la cepa 
C57BL/6, tantoen condiciones normales como con previa protección inmunológica con 
el péptido antigénico RAHYNIVTF derivado de la proteína E7 de VPH-16. Cabe 
mencionar que las estirpes de CEMs fueron previamente caracterizadas con base en 
los criterios mínimos establecidos por la Sociedad Internacional de Terapia Celular, que 
consisten en ser adherentes, tener los marcadores CD105, CD73 y CD90 y carecer de 
los marcadores de superficie CD45, CD34, CD14/CD11b, CD79a/CD19 y HLA-DR en la 
membrana celular; asimismo, por su capacidad de diferenciarse a osteoblastos, 
adipocitos y condroblastos (Montesinos et al, 2009). Asimismo, la inducción del 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 33 
crecimiento tumoral, se realizó en ratones de la cepa C57BL/6 (haplotipo H2-Db), a los 
cuales se les inocularon células tumorales TC-1 (positivas a la expresión de las 
proteínas E6 y E7 de VPH-16), las cuales compartían el haplotipo H2-Db con la cepa de 
ratón. Para analizar el efecto de la co-inoculación de CEMs sobre el crecimiento 
tumoral, se establecieron 4 grupos de 6 ratones cada uno con los siguientes 
tratamientos: 1) TC-1+ CEMs-CaCu; 2) TC-1+CEMs-CNOR; 3) TC-1+CEMs-MON; y 4) 
Sólo células tumorales TC-1. Como se muestra en la Figura 8, después de la 
inoculación de las células TC-1 y CEMs en proporciones 1:1, las cinéticas de 
crecimiento tumoral en los grupos de ratones que recibieron CEMs junto con células 
tumorales TC-1, durante los 41 días de seguimiento no mostraron diferencias 
significativas respecto a la cinética de crecimiento tumoral en los ratones que recibieron 
únicamente células TC-1 (P>0.05). No obstante, al finalizar el tiempo de seguimiento, 
se observó que el tamaño promedio de los tumores en los animales que recibieron los 
tratamientos TC1+CEMs-CaCu y TC1+CEMs-CNOR (1.8-2.2cm3), tuvieron un tamaño 
promedio mayor al determinado en los ratones que fueron inoculados con CEMs-MON 
+ TC-1 ó únicamente con células tumorales TC-1 (1.2-1.5cm3). 
 
Figura 8. Cinéticas de crecimiento tumoral en ratones C57BL/6 inoculados con células tumorales TC-1 y 
co-inoculados con TC-1 + CEMs bajo condiciones normales (sin protección inmunológica). 10
5 
células 
TC-1 fueron inoculadas vía subdérmica en el dorso de un grupo de ratones en ausencia de CEMs (TC1), 
o en presencia de 10
5 
CEMs derivadas de Medula Ósea Normal (TC1+CEMs-MON); de Cérvix Normal 
(TC1+CEMs-CNOR) y de Cáncer de Cuello Uterino (TC1+CEMs-MCaCu). *Diferencia no significativa 
(P>0.05) 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 34 
 Participación de las CEMs en el crecimiento tumoral en ratones de la cepa 
C57BL/6 con protección inmunológica. 
Las CEMs son caracterizadas por tener efectos inmunosupresores sobre una variedad 
de células del sistema inmune, incluyendo linfocitos B, células dendríticas, células 
asesinas naturales y linfocitos T, inhibiendo su proliferación, activación e incluso la 
función efectora específica de linfocitos T, favoreciendo el crecimiento y la metástasis 
tumoral (Di Nicola et al, 2002; Krampera et al, 2003; Plumas et al, 2005; Zappia et al, 
2005; Rutella et al, 2006; Corcione et al, 2006; Sotiropoulou et al, 2006). 
Por otro lado, nuestro grupo de trabajo ha estandarizado un modelo de protección 
inmune ante el reto tumoral de células TC-1 en ratones C57BL/6 a través de la 
inmunización con el péptido antigénico RAHYNIVTF (derivado de la proteína E7 de 
VPH-16) el cual evita el crecimiento tumoral a través de la inducción de respuesta 
específica mediada por linfocitos T citotóxicos (Paz et al, 2009). Tomando como base 
esta metodología, se procedió a analizar si en ratones previamente inmunizados con el 
péptido RAHYNIVTF, al realizar el reto tumoral en presencia de CEMs, se revertía la 
protección inmune. Con este propósito, se inmunizaron 4 grupos de 6 ratones C57BL/6 
con el péptido RAHYNIVTF y después fueron retados con las células tumorales TC-1 
solas o co-inoculadas con las diferentes CEMs. 
Los resultados obtenidos muestran que la inmunización con el péptido RAHYNIVTF 
efectivamente protegió a los ratones ante el reto tumoral con células tumorales TC-1 
(Figura 9). Mientras que los ratones co-inyectados con células TC-1+CEMs presentaron 
crecimiento tumoral a partir del día 15 después de iniciado el tratamiento y mostraron 
un crecimiento significativo (P<0.001) después de los 40 días del tratamiento. Cabe 
hacer notar que los ratones que recibieron TC-1+CEMs-CaCu mostraron el mayor 
crecimiento tumoral promedio (3.5-4.0 cm3), mientras que los ratones que recibieron 
TC-1+CEMs-CNOR mostraron un crecimiento tumoral promedio de (1.7-2.3 cm3) y 
finalmente los ratones que recibieron TC-1+CEMs-MON mostraron un crecimiento 
tumoral promedio de (0.5-0.8 cm3) Figura 9. 
 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 35 
 
Figura 9. Cinéticas de crecimiento tumoral en ratones C57BL/6 inoculados con células tumorales TC-1 y 
co-inoculados con TC-1+CEMs bajo condiciones de protección inmunológica. Ratones C57BL/6 
previamente inmunizados con el péptido antigénico RAHYNIVTF (derivado de la proteína E7 de VPH-16), 
fueron inoculados con 10
5 
células en ausencia de CEMs (TC1); o en presencia de 10
5 
CEMs derivadas 
de Medula Ósea Normal (TC1+CEMs-MON), de Cérvix Normal (TC1+CEMs-CNOR) y de Cáncer de 
Cuello Uterino (TC1+CEMs-MCaCu). Diferencia significativa (***P<0.001, **P<0.01, *P<0.05). 
 Las CEMs revierten la población de linfocitos T antígeno específicos en 
ratones previamente inmunizados y tratados con TC-1. 
Estudios recientes han mostrado que las CEMs tienen la capacidad de inhibir la 
respuesta de células T vírgenes y T antígeno específicos (Krampera et al, 2003). Con 
base en este antecedente y por el hecho de que ratones C57BL/6 previamente 
inmunizados con el péptido antigénico RAHYNIVTF revirtieron su protección ante el reto 
tumoral cuando fueron tratados con células tumorales TC-1+CEMs, se procedió a 
analizar las poblaciones de linfocitos T citotóxicos específicos al péptido RAHYNIVTF al 
inicio del crecimiento tumoral. 
Con ayuda de moléculas pentaméricas H2-Db/RAHYNIVTF, que tienen la habilidad de 
reconocer el receptor de los linfocitos T específicos al péptido RAHYNIVTF, se 
analizaron las poblaciones de linfocitos T CD8+ específicos en células de bazo de los 
ratones tratados con TC-1 y con TC-1+CEMs. Como puede observarse en la Figura 
10A, los ratones que recibieron inmunización previa con el péptido RAHYNIVTF 
presentaron 0.56% de células positivas al pentámero a los 10 días después de ser 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 36 
inmunizados; los ratones que no recibieron inmunización mostraron 0.31% de células 
positivas, mientras que los ratones que fueron inoculados con células TC-1 presentaron 
un promedio de 0.53% de células positivas. De manera interesante, los ratones que 
además de ser inoculados con células tumorales TC-1 recibieron CEMs-CNOR 
disminuyeron el porcentaje de células positivas a 0.40 y aquellos que recibieron CEMs-
CaCu redujeron notablemente la población de células efectoras a 0.19%. Después de 
15 días de tratamiento, se encontró un incremento en la población de linfocitos T CD8 
positivos al pentámero (0.76%) en los ratones que fueron inoculados con TC-1+CEMs-
CNOR, mientras que en los ratones inoculados con TC-1+CEMs-CaCu la población 
disminuyó a 0.13% (Figura 10B). Estos datos concuerdan con lo observado en las 
cinéticas de crecimiento tumoral en los ratones inmunizados, donde el mayor 
crecimiento tumoral observado en los ratones que recibieron TC-1 + CEMs-CaCu 
correlacionó con una disminución importante en la población de linfocitos T CD8+ 
específicos al péptido RAHYNIVTF (Figura 10C). 
 
 
 
Selene Yazmin Contreras Landeros 37 
 
A) 
B) 
0.13 
0.31 0.56 0.53 
• • • 
Preinmune Pept RAHYNIVTF Pept+TC-l 
0.40 0.19 
iL 
Pent/PE 
Pept+ TC-l+CEMs-CNQR Pept+ TC-1+CEMs-CaCu 
0.52 0.39 
Preinmune Pept RAHYNIVTF Pept+TC-l 
0.51 0.76 
Pent/PE 
 
Selene