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Analisis-del-mecanismo-de-accion-de-toxinas-de-Bacillus-thuringiensis-activas-contra-Spodoptera-frugiperda

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas 
 
 
 
“Análisis del mecanismo de acción de toxinas de Bacillus thuringiensis 
activas contra Spodoptera frugiperda” 
 
 
TESIS 
 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
 
Doctor en Ciencias 
 
 
 
PRESENTA: 
M. en C. Diana Laura Martínez de Castro Jiménez 
 
 
TUTOR PRINCIPAL 
Mario Soberón Chávez (Instituto de Biotecnología-UNAM) 
 
MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR 
Ernesto Ortiz Suri (Instituto de Biotecnología-UNAM) 
Humberto Lanz (Instituto Nacional de Salud Pública) 
 
 
Ciudad de México. Agosto, 2019. 
 
 
 
 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
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del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
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objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El presente proyecto de investigación se realizó en el Departamento de 
Microbiología Molecular, del Instituto de Biotecnología de la Universidad 
Autónoma de México, bajo la dirección del Dr. Mario Soberón Chávez con 
el financiamiento de beca CONACYT 444978. 
 
 
Dedicatoria 
 
 
 
 
 
A mi par de soles, Andrea y Diego, por ser el motor más grande del mundo, 
los amo con todo mi ser. 
 
 
A mi compañero de aventuras, gracias por caminar conmigo. 
 
 
A mis padres, por darme la fortaleza para cumplir mis metas. 
 
 
A mi hermano Alfonso, gracias por apoyarme siempre. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Agradecimientos 
 
 
A los Dres. Mario Soberón y Alejandra Bravo por brindarme la oportunidad 
de cursar mis estudios de posgrado en su laboratorio. 
A mi comité tutoral los Dres. Humberto Lanz y Ernesto Ortiz, muchas gracias 
por cada una de sus observaciones, por todo el tiempo dedicado, aprendí 
mucho de ustedes. 
Al comité que revisó esta tesis, los Dres. Luis Cárdenas, Guadalupe Espín, 
Ricardo Oropeza, Enrique Salas y Alicia Gonzales, gracias por aceptar ser 
parte del comité y por su cuidadosa revisión. 
A todos mis compañeros del laboratorio por todo el tiempo compartido. Un 
especial agradecimiento a mis queridas amigas Iris, Leivi, Bivi, Pau y Liz, 
gracias por brindarme su amistad y apoyo a lo largo de los años, las quiero 
mucho. 
A todo Don Sergio, Chelita y Don Alex, elementos claves para el 
laboratorio, su trabajo es fundamental para nosotros. 
A la Unidad de Docencia por apoyarnos en todos los trámites y hacerlo 
más sencillo. 
 
Índice 
 
I. Índice de figuras………………………………………………………………………… 3 
II. Índice de tablas………………………………………………………………………... 4 
III. Abreviaturas……………………………………………………………………………. 5 
IV. Resumen………………………………………………………………………………... 6 
V. Abstract…………………………………………………………………………………. 8 
 1. Introducción…………………………………………………………………………… 10 
 1.1 Bacillus thuringiensis………………………………………………………………. 10 
 1.2 Toxinas Cry…………………………………………………………………………. 10 
 1.3 Mecanismo de acción………………………………………………………….. 12 
 1.3.1 Activación proteolítica……………………………………………………… 13 
 1.3.2 Unión a receptores ………………………………………………………….. 13 
 1.3.2.1 APN ………………………………………………………………………… 14 
 1.3.2.2 ALP………………………………………………………………………… 15 
 1.3.2.3 Caderina…………………………………………………………………. 15 
 1.3.2.4 Transportadores ABC…………………………………………………… 16 
 1.3.3 Formación de oligómero…………………………………………………… 17 
 1.4 Resistencia………………………………………………………………………….. 18 
 2. Antecedentes………………………………………………………………………… 20 
 2.1 Toxina Cry1AbMod………………………………………………………………… 20 
 2.1.1 Toxicidad de la toxina Cry1AbMod ……………………………………… 21 
 2.2 Toxina Vip3Aa……………………………………………………………………… 22 
 2.2.2 Mecanismo de acción de la toxina Vip3Aa……………………………… 23 
 3. Hipótesis………………………………………………………………………………… 24 
 4. Objetivos……………………………………………………………………………….. 24 
 4.1 Objetivo general…………………………………………………………………… 24 
 4.2 Metas………………………………………………………………………………… 24 
 5. Materiales y método………………………………………………………………… 25 
 5.1 Preparación y purificación de toxinas………………………………………… 25 
 5.1.1 Toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod………………………………………………. 25 
 5.1.2 Toxina Vip3Aa……………………………………………………………………. 25 
 5.1.2.1 Cultivo e inducción…………………………………………………………… 25 
 5.1.2.2 Lisis y purificación…………………………………………………………….. 26 
 5.1.2.3 Purificación por columna de níquel……………………………………… 26 
 5.2 Aislamiento de BBMV……………………………………………………………… 26 
 5.3 Bioensayos…………………………………………………………………………… 27 
 5.4 Biotinilación de toxinas……………………………………………………………. 27 
 5.5 Ligand blot…………………………………………………………………………… 27 
 5.6 Oligomerización……………………………………………………………………… 28 
 5.7 Pull-down…………………………………………………………………………….. 28 
2 
 
 5.7.1 Unión de la protoxina Vip3Aa y las toxinas Cry1AbMod y Vip3Aa con 
 las perlas de agarosa………………………………………………………… 
 28 
 5.7.2 Unión de la toxina/protoxina a las proteínas de las BBMV……………… 28 
6. Resultados y discusión………………………………………………………………. 30 
 6.1 Mecanismo de toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod en Spodoptera frugiperda 30 
 6.1.1 Obtención y solubilización de las toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod…….. 31 
 6.1.2 Toxicidad de Cry1Ab y Cry1AbMod en S. frugiperda………………….. 31 
 6.1.3 Ensayos de activación proteolítica………………………………………… 31 
 6.1.4 Unión de las toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod en BBMV de S. 
 frugiperda……………………………………………………………………… 
 32 
 6.1.5 Pull-down de la toxina activada Cry1AbMod………………………….. 34 
 6.1.5.1 Identificación de proteínas de membrana que interactúan con 
 Cry1AbMod. ……………………………………………………………… 
 35 
 6.1.6 Oligomerización……………………………………………………………….. 37 
 6.2 Mecanismo de la toxina Vip3Aa en Spodoptera frugiperda…………….. 40 
 6.2.1 Producción y purificación de la toxina Vip3Aa…………………………... 40 
 6.2.2 Toxicidad de la proteína Vip3Aa…………………………………………….. 41 
 6.2.3 Análisis del procesamiento in vitro de la toxina Vip3Aa………………… 42 
 6.2.4 Análisis de proteínas de unión de BBMV con Vip3Aa por Ligand blot. 43 
 6.2.5.1 Análisis de proteínas de unión de BBMV con la protoxina Vip3Aa 
 por pull-down………………………………………………………………… 
44 
 6.2.5.1.1 Identificación de proteínas de membrana que interactúan 
 con la protoxina Vip3Aa…………………………………………….. 
44 
 6.2.5.2 Análisis de proteínas de unión de BBMV con la toxina activada 
 Vip3Aa por pull-down………………………………………………………. 
45 
 6.2.5.2.1 Identificación de proteínas de membrana que interactúan 
 con la toxina activada Vip3Aa. 
46 
7. Conclusiones…………………………………………………………………………… 49 
8. Perspectivas …………………………………………………………………………… 50 
9. Apéndice ……………………………………………………………………………….. 51 
10.Referencias ……………………………………………………………………………. 55 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 
 
I. Índice de figuras 
 
 
Figura 1 Espectro de acción de las d-endotoxinas Bt (Cry y Cyt). 
Figura 2 Estructura tridimensional de la toxina Cry1Aa. 
Figura 3 Mecanismo de acción de toxinas Cry. 
Figura 4 Procesamiento de las toxinas Cry1A. 
Figura 5 Mecanismos de resistencia en insectos. 
Figura 6 Potencia de las toxinas Cry1AMod contra sus versiones 
nativas en diversos lepidópteros. 
Figura 7 Potencia de las toxinas Cry1AMod contra sus versiones 
nativas en S. frugiperda. 
Figura 8 Mecanismo de acción de la toxina Vip3Aa. 
Figura 9 Expresión y solubilización de toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod. 
Figura 10 Activación proteolítica delas protoxinas Cry1Ab y 
Cry1AbMod. 
Figura 11 Unión de las toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod a BBMV de S. 
frugiperda. 
Figura 12 Pull-down de la toxina Cry1AbMod y las proteínas de las 
BBMV de Sf. 
Figura 13 Localización celular de las proteínas identificadas del pull-
down de la toxina Cry1AbMod. 
Figura 14 Ensayos de oligomerización de las toxinas Cry1Ab y 
Cry1AbMod. 
Figura 15 Expresión de la toxina Vip3Aa. 
Figura 16 Purificación de la proteína Vip3Aa. 
Figura 17 Procesamiento de la protoxina Vip3Aa con tripsina, 
quimiotripsina y jugo gástrico. 
Figura 18 Ligand blot de la protoxina Vip3Aa y toxinas activadas con 
tripsina y jugo gástrico 
Figura 19 Ensayo de pull-down de la protoxina Vip3Aa. 
Figura 20 Localización celular de las proteínas identificadas para la 
protoxina Vip3Aa. 
Figura 21 Ensayo de pull-down de la toxina Vip3Aa. 
Figura 22 Localización celular de las proteínas identificadas para la 
toxina Vip3Aa. 
 
 
 
4 
 
II. Índice de tablas 
 
 
Tabla 1 Especies de insectos resistentes aislados en el campo. 
Tabla 2 Bioensayo de las protoxinas Cry1Ab y Cry1AbMod contra S. 
frugiperda (Población IBT-UNAM). 
Tabla 3 Resultado de la secuenciación LC-MS/MS del pull-down de la 
toxina Cry1AbMod y las proteínas de membrana de las BBMV 
de S. frugiperda. 
Tabla 4 Receptores de toxinas Bt en Spodoptera spp. 
Tabla 5 Bioensayo de las protoxinas Vip3Aa contra S. frugiperda 
(Población UAEM). 
Tabla 6 Resultado de la secuenciación LC-MS/MS del pull-down de la 
protoxina Vip3Aa y las proteínas de las BBMV de S. frugiperda. 
Tabla 7 Resultado de la secuenciación LC-MS/MS del pull-down de la 
toxina Vip3Aa y las proteínas de las BBMV de S. frugiperda. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
5 
 
III. Abreviaturas 
 
 
Bt Bacillus thuringiensis 
PFT Toxinas formadoras de poro 
APN Aminopeptidasa-N 
ALP Alcalino fosfatasa 
GPI Glicosilfosfatidilinositol 
Transportador ABC ATP-binding cassette transporter 
ABCC2 Transportador ABC subfamilia C2 
LC50 Concentración letal media 
GalNac N-Acetilgalactosamina 
GPI Glicosilfosfatidilinositol 
Sf21 Línea celular 21 de Spodoptera frugiperda 
Sf9 Línea celular 9 de Spodoptera frugiperda 
CR Repetido de caderina 
Bt-R1 Receptor 1 de Bacillus thuringiensis 
S2 Línea celular de Drosophila melanogaster 
HI5 Línea celular de Trichoplusia ni 
COS-7 Línea celular de mono 
TMD Dominio transmembranal 
NBD Dominio de unión a nucleótidos 
BBMV Brush border membrane vesicle 
VIP Vegetative Insecticidal Protein 
IPTG Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido 
CnBr Bromuro de cianógeno 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6 
 
IV. Resumen 
 
Las toxinas Cry que produce Bacillus thuringiensis (Bt) son proteínas que utilizan 
alrededor del mundo en el control de insectos plaga en forma de aerosol o 
expresadas en plantas transgénicas. El desarrollo de resistencia en insectos 
amenaza su efectividad. 
 
El mecanismo de acción de la toxina Cry1Ab involucra una serie de pasos. El 
primero de ellos es la ingestión de los cristales por una larva susceptible, 
posteriormente se lleva a cabo la activación de la protoxina por proteasas 
endógenas del insecto, el fragmento tóxico o toxina activada se une a los 
receptores que se encuentran sobre la membrana apical del intestino medio, se 
han identificado la alcalino fosfatasa (ALP) y aminopeptidasa N (APN), caderina y 
recientemente el transportador ABCC2. Posterior de la unión, la toxina oligomeriza 
y es capaz de insertarse en la membrana, formando poros en la membrana 
celular, resultando en la muerte del insecto. 
 
Las toxinas Cry Modificadas (Cry1Ab y Cry1AbMod) tienen el potencial de 
contender con la resistencia, mostrando toxicidad en numerosas especies de 
lepidópteros susceptibles y resistentes. Sin embargo, el mecanismo de acción de 
las toxinas modificadas no se encuentra descrito en su totalidad. 
 
En el presente estudio, se comparó la toxicidad, activación, unión, 
oligomerización entre la toxina Cry1Ab y Cry1AbMod en Spodoptera frugiperda. 
La toxina Cry1AbMod mostró toxicidad en S. frugiperda (LC50 88 ng/cm2), la toxina 
Cry1Ab no fue tóxica (LC50 >2000 ng/cm2). Se comparó la proteólisis in vitro de las 
toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod con los tratamientos con tripsina, quimiotripsina y 
jugo gástrico, la toxina Cry1AbMod es más estable en los tratamientos de 
quimiotripsina y jugo gástrico en comparación con la toxina Cry1Ab. Los ensayos 
de unión mostraron que la toxina Cry1AbMod activada presentan una mayor 
unión comparado con la toxina Cry1Ab. La toxina Cry1AbMod se une a las 
aminopeptidasas N1, N3, N4 y N5. Finalmente, se identificó la formación de 
oligómero de la toxina Cry1AbMod activada con quimiotripsina y jugo gástrico, la 
toxina Cry1Ab activada no formó oligómero. La estabilidad, unión y formación de 
oligómero de la toxina Cry1AbMod se correlaciona con la toxicidad en 
Spodoptera frugiperda. 
 
Las proteínas Vip son producidas por Bt y son secretadas durante la fase de 
crecimiento vegetativo. La toxina Vip3Aa es la más estudiada y es tóxica contra 
un amplio rango de lepidópteros. Actualmente, se co-expresan toxinas Vip3Aa y 
Cry en cultivos transgénicos de maíz y algodón. 
 
7 
 
El mecanismo de acción de la toxina Vip3Aa no está del todo descrito. Se 
propone que posterior a su ingestión por un insecto susceptible, la protoxina de 
88-90 kDa se procesa por proteasas y se produce la toxina activada de 66 kDa. La 
toxina se une de manera específica a receptores y es capaz de formar 
oligómeros que presentan actividad de formación de poro ocasionando la 
muerte de la larva. 
 
En el presente estudio se evaluaron diferentes pasos en el mecanismo de acción 
de la toxina Vip3Aa. La activación de la protoxina es más efectiva con tripsina y 
con el jugo gástrico de S. frugiperda que la quimiotripsina, sugiriendo que la 
activación in vivo es por tripsina. La toxina activada se une a un mayor número de 
proteínas en las microvellosidades que la protoxina y estas son diferentes entre sí. 
Se identificó como proteínas de unión para la protoxina al receptor lipoproteico 
de baja densidad, entre otras. La toxina activada se une al transportador ABCA1, 
entre otras proteínas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
8 
 
V. Abstract 
 
Cry toxins produced by Bacillus thuringiensis (Bt) are proteins widely used in insect 
control as spray products or expressed in transgenic crops. The development of 
insect resistance threatens their effectiveness. 
 
The mode of action of Cry1Ab toxin involves a sequential step. The first is the crystal 
ingestion by susceptible larvae, following the protoxin activation by endogenous 
proteases, the fragment toxic or activated toxin binds to receptors in membrane 
apical midgut, it has been identified alkaline phosphatase (ALP) and 
aminopeptidase N (APN), cadherin and recently ABCC2 transporter. The toxin 
oligomerizes and inserts into the membrane, forming pores in the membrane 
cellular, resulting in the insect death. 
 
Cry modified toxins (Cry1AbMod and Cry1AbMod) have the potential to counter 
resistance, showed toxicity in several susceptible and resistant lepidopteran pests. 
However, the mode of action for the toxicity of modified toxins is not well 
understood. 
 
In this study, we compared the toxicity, activation, binding, and oligomerization 
between Cry1Ab and Cry1AbMod in Spodoptera frugiperda. The Cry1AbMod 
showed toxicity to Spodoptera frugiperda (LC50 88 ng/cm2), and Cry1Ab was not 
toxic (LC50 >2,000 ng/cm2). The in vitro proteolysis of Cry1Ab and Cry1AbMod by 
treatments with trypsin, chymotrypsin, and midgut juice was compared, the 
Cry1AbMod is more stable than Cry1Ab in chymotrypsin and midgut juice in the 
treatments. The protein stability, binding and oligomer formation of Cry1AbMod is 
correlated with toxicity to Spodoptera frugiperda.BBMV binding assays showed 
that the Cry1AbMod activated toxins displayed enhanced binding compared to 
the Cry1Ab activated toxins. Cry1AbMod toxin binds to aminopeptidases N1, N3, 
N4 y N5. Finally, we identified the oligomer formation by Cry1AbMod activated 
with chymotrypsin and midgut juice, and Cry1Ab activated toxins did not 
oligomerize. 
 
Vip proteins also are produced by Bt and are secreted during the vegetative 
growth. The Vip3Aa toxin is the most studied and is toxic against several 
lepidopteran species. The Vip3Aa toxin is co-expressed with Cry toxins in corn and 
cotton transgenic crops. 
 
The mode of action of Vip3Aa toxin it is not well understood. It has been proposed 
that before the ingestion by susceptible larvae, the protoxin (88-90 kDa) is 
processed by proteases and it produces the activated toxin (66 kDa). The toxin 
9 
 
binds to specific receptors and it is able to form oligomers that present pore 
formation activity leading the larvae death. 
 
In the present study, we evaluate different steps in the mode of action of the 
Vip3Aa toxin. The protoxin activation is more effective with trypsin and midgut 
juice of S. frugiperda than chymotrypsin, suggesting that the activation in vivo is by 
trypsin. The activated toxin binds to a major number of proteins into the microvilli 
than protoxin, and these proteins are different between. Low-density lipoprotein 
receptor was identified as a binding protein for the protoxin. The activated toxin 
binds to ABCA1 receptor, among other proteins. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
10 
 
1. Introducción 
 
El gusano cogollero, Spodoptera frugiperda Smith (Lepidoptera: Noctuidae) es 
una plaga que ocasiona pérdidas considerables en diversos tipos de cultivos; 
principalmente maíz, sorgo, arroz, algodón, alfalfa, entre otros1. En América, esta 
plaga se distribuye desde Argentina hasta Canadá2, recientemente se ha 
reportado su aparición en África3. Es considerada la plaga del maíz más 
importante en México, ocasionando pérdidas del 20-35% de las cosechas4. 
 
Con la finalidad de reducir los daños ocasionados por S. frugiperda, los 
agricultores aplican productos químicos como método de control, lo que ha 
llevado consigo a la afectación de organismos benéficos, además de generar 
contaminación, dejando residuos tóxicos en el aire, el suelo y el agua5. Asimismo, 
el uso constante de insecticidas químicos ha provocado resistencia de estos 
insectos6, estos insectos poseen una alta capacidad de desintoxicación mediante 
una batería de enzimas específicas (hidrolasas, oxidasas y citocromo P450)7,8. 
 
Una alternativa a los insecticidas químicos, es el control biológico. El insecticida 
con mayor éxito está basado en las proteínas que produce la bacteria Bacillus 
thuringiensis. Los insecticidas Bt se ha demostrado que son efectivos, altamente 
específicos y seguros para el medio ambiente9. 
 
1.1 Bacillus thuringiensis 
 
Bacillus thuringiensis (Bt), es una bacteria que se encuentra distribuida alrededor 
del mundo en una gran variedad de ambientes; desde el suelo, desierto, bosques, 
tundra, en polvo de productos agro-culturales almacenados, insectos muertos, 
plantas, etc.10,11,12. Esta bacteria fue aislada por primera vez en 1901 por el biólogo 
japonés Ishiwata Shigetane, el cual estudiaba las causas de la muerte del gusano 
de la seda (Bombix mori)13. En el año 1911, el científico alemán Ernst Berliner, aisló 
nuevamente la bacteria de muestras colectadas en Turingia, Alemania y dio el 
nombre a la bacteria Bt. En el año 1938, se comercializó en Francia por primera 
vez el biopesticida denominado “Sporine” basado en Bt. En el año 1996 se 
introdujeron plantas transgénicas que expresan toxinas Cry14. 
 
1.2 Toxinas Cry 
 
Bt produce de manera natural toxinas formadoras de poro (PFT, del inglés pore 
forming toxins) o también denominadas -endotoxinas durante la etapa de 
esporulación del crecimiento de la bacteria, se clasifican en dos familias: Cry y 
Cyt15. Las toxinas Cry son tóxicas y específicas contra una gran variedad de 
insectos, como lepidópteros, coleópteros y dípteros (Figura 1). 
11 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. Espectro de acción de las -endotoxinas Bt (Cry y Cyt). Las toxinas Cyt se marcan 
en rojo. Tomada de Palma, L. et al., 201416. 
 
Actualmente, la familia más grande de proteínas Cry, es la familia Cry de 3 
dominios, son moléculas globulares que contienen tres dominios distintos. Se ha 
resuelto la estructura cristalográfica de nueve toxinas Cry, que incluye: Cry1Aa17, 
Cry1Ac18, Cry2Aa19, Cry3Aa17, Cry3Bb20, Cry4Aa21, Cry4Ba22, Cry7Ca123 y Cry8Ea24. 
Todas las toxinas anteriormente mencionadas, son activadas a estructuras de 65 
kDa organizado en tres dominios estructurales y funcionales (Figura 2)25. El dominio 
I (en azul) se encuentra conformado por siete hélices alfa antiparalelas, 
organizadas en ramillete, la hélice alfa 5 se localiza al centro y está rodeada por 
hélices anfipáticas, este dominio está involucrado en la formación de poro e 
inserción en la membrana26. El dominio II (en amarillo) se compone de tres láminas 
beta antiparalelas en un arreglo de prisma, se sugiere que está involucrado en la 
unión con los receptores y la especificidad de las toxinas, este dominio es el más 
variable26. El dominio III (en rojo) también se compone de láminas beta formando 
un -sándwich, a este dominio se le atribuye la misma función que el dominio II26, 
para la toxina Cry1Ac, una asa extendida forma un sitio de unión a carbohidratos 
N-acetilgalactosamina (GalNac)implicado en la unión con receptores27. 
 
 
 
 
 
12 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Estructura tridimensional de la toxina Cry1Aa. Se muestra el dominio I en azul, 
Dominio II en amarillo y el Dominio III en rojo. Modificada de Palma, L. et al., 201416. 
 
1.3 Mecanismo de acción de las toxinas Cry 
 
De manera general, se acepta que el mecanismo de acción de las toxinas Cry 
consiste en la ingestión de los cristales por insectos susceptibles, posteriormente 
hay una activación de proteolítica de la toxina. La toxina se une a receptores 
específicos resultando en la oligomerización e inserción en la membrana 
formando poros que conducen el proceso de lisis celular y finalmente la muerte 
del insecto (Figura 3)28. A continuación, se revisará cada paso del mecanismo de 
acción. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Mecanismo de acción de toxinas Cry. Se muestran los pasos secuenciales. Los 
cristales proteicos se solubilizan, las protoxinas se liberan y son activadas por proteasas 
(café). Se da la unión del monómero (naranja) a receptores ALP (rojo) y APN (azul) 
favoreciendo el contacto con el receptor caderina (verde) o el transportador ABCC2 
13 
 
(rojo). La toxina oligomeriza y se une nuevamente a ALP, APN o al transportador ABCC2, el 
oligómero se inserta en la membrana y ocasiona la muerte de la larva. 
 
1.3.1 Activación proteolítica 
 
Posterior a la ingestión de los cristales por los insectos susceptibles, estos se 
solubilizan debido a las condiciones reductoras y alcalinas presentes en los 
intestinos de los insectos, como consecuencia se liberan las protoxinas del 
cristal29. Las protoxinas son del rango de peso molecular entre 70-130 kDa y 
requiere que sean procesadas proteolíticamente por enzimas 
(principalmente tripsina y quimiotripsina) presentes en los fluidos digestivos 
a fragmentos de 55 a 65 kDa para tener actividad tóxica (Figura 4). La 
toxina activada atraviesa la membrana peritrófica y es capaz de unirse a 
los receptores en la superficie de las células del intestino medio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Procesamiento de las toxinas Cry1A. Se muestra la protoxina con los siete 
dominios que la conforman. Posterior a la activación con tripsinase obtiene la toxina 
activada. Modificada de Palma, L. et al., 201416. 
 
1.3.2 Unión a receptores 
 
Posterior a la activación, la toxina se une a receptores anclados a la 
membrana. Se han descrito proteínas que interactúan secuencialmente 
con las toxinas Cry30. Los receptores putativos mejor caracterizados son la 
aminopeptidasa-N (APN), alcalino fosfatasa (ALP), caderina y 
recientemente, los trasportadores ABC. 
14 
 
1.3.2.1 APN 
 
Las enzimas aminopeptidasas-N (APN) son metaloproteasas de la familia 
M1 dependientes de zinc31. En insectos lepidópteros, se distribuyen en la 
membrana de las células epiteliales y se encuentran ancladas por un 
puente de glicosilfosfatidilinositol (GPI)32. Su principal función en los insectos 
es la digestión de proteínas, cortan aminoácidos neutrales del N-terminal 
de los polipéptidos33. Estas proteínas se han estudiado ampliamente 
debido a la relación en citotoxicidad que presentan con las toxinas Cry. 
 
Se ha corroborado la participación de APN en el mecanismo de acción de 
toxinas Cry mediante experimentos de silenciamiento, expresión del gen en 
organismos no susceptibles, así como la ausencia de expresión de APN en 
insectos resistentes a toxinas Cry. 
 
La expresión transgénica de APN en Drosophila melanogaster confirió 
sensibilidad a la toxina Cry1Ac, la cual de manera natural no es tóxica 
hacia ese organismo34. 
 
En Helicoverpa armígera se realizó el silenciamiento de APN y se observó 
una reducción de la mortalidad de las larvas cuando se retaron con la 
toxina Cry1Ac, asimismo, se transfectó la línea celular Sf21 con el gen APN y 
esta fue sensible a la toxina Cry1Ac, lo que confirmó que APN es receptor 
para la toxina Cry1Ac en ese insecto35. En Spodoptera litura se silenció APN 
y se observó una reducción de la toxicidad de la Cry1Ca36. Recientemente 
se encontró que APN1 es receptor funcional de la toxina Cry1Ca en 
Spodoptera frugiperda 37. 
 
Por otro lado, se ha observado que la resistencia de Trichoplusia ni hacia la 
toxina Cry1Ac se debe a alteraciones en el patrón de expresión de APN1 y 
APN638. La ausencia de la expresión de APN1 en Spodoptera exigua 
ocasiona resistencia a la toxina Cry1Ca39. La información anterior confirma 
la participación de APN en el mecanismo de acción de toxinas Cry. 
 
1.3.2.2 ALP 
 
Las enzimas alcalino fosfatasas catalizan la hidrólisis del fosfato orgánico40. 
Se dividen en dos grupos de acuerdo a su localización: solubles (s-ALP) y 
15 
 
membranales (m-ALP) las cuales se encuentran en balsas lipídicas 
anclados por GPI40. Estas proteínas se expresan mayormente en los 
primeros estadios del desarrollo41. 
 
La interacción inicial de Cry1Ab con ALP es crítica para la toxicidad en M. 
sexta42. El silenciamiento de ALP en M. sexta es más importante que APN 
para la toxina Cry1Ab43. La unión de Cry1Ac con ALP de H. virescens y H. 
armigera involucra interacciones con GalNac44. 
 
Se ha reportado una correlación entre la disminución en la expresión de 
ALP y la resistencia a toxinas Cry en H. virescens, H. armígera y S. frugiperda 
45. Mediante silenciamiento se confirmó que ALP2 es el receptor funcional 
para la toxina Cry2Aa en S. exigua 41 . 
 
1.3.2.3 Caderina 
 
La caderina es una proteína de adhesión que depende de calcio, a 
diferencia de las caderinas encargadas de las uniones adherentes 
involucradas en la adhesión célula-célula, las caderinas que funcionan 
como receptores de toxinas Cry se localizan en la membrana apical de las 
células epiteliales columnares, tienen un peso molecular de 210 kDa y 
están compuestas por tres dominios: un dominio extracelular formado por 
12 repetidos de caderina (CR), un dominio transmembranal y un dominio 
intracelular46. Se ha encontrado que es una proteína de unión en insectos 
lepidópteros47–50, coleópteros51 y dípteros52, las afinidades de caderina y 
toxinas Cry varían dependiendo el insecto. 
 
En el año 1995 se identificó la caderina como el primer receptor descrito 
para las toxinas Cry, se le llamó Bt-R1 (Bt receptor 1) para la toxina Cry1Ab 
en M. sexta53. Posteriormente, se reportó que la caderina es receptor 
funcional de toxinas Cry1A en Bombix mori47, Ostrinia nubilalis50 y H. 
virescens54. 
 
Se ha propuesto que la caderina es importante en la especificidad de las 
toxinas Cry1A ya que al transfectar las líneas celulares S2, COS-7 y H5 con 
BT-R1 estas líneas celulares se vuelven susceptibles a las toxinas Cry1A55,54. 
 
16 
 
Se han asociado mutaciones de caderina con la resistencia en algunas 
especies de lepidópteros, entre los cuales se encuentra Pectinophora 
gossypiella49, H. armigera48 y H. virescens56. 
El silenciamiento de caderina por RNA de interferencia ha demostrado que 
es un receptor funcional para la toxina Cry1Ab en M. sexta. También la 
caderina es receptor para la toxina Cry1Ca en S. exigua57 y Chilo 
suppressalis58. Lo anterior indica que la caderina juega un papel 
importante en el mecanismo de acción de las toxinas. 
 
1.3.2.4 Transportadores ABC 
 
Los transportadores ABC (ATP binding cassette) son proteínas integrales de 
membrana que utilizan la energía de la hidrólisis del ATP para transportar 
sustratos a través de la membrana. Se compone de dos dominios 
transmembranales (TMD1 y TMD2) y dos dominios de unión a nucleótidos 
(NBD1 y NBD2). Mediante genómica comparativa de la familia de 
transportadores ABC en artrópodos sugiere que su función es trasportar 
iones y secreción de toxinas59. 
 
Se ha relacionado la resistencia de toxinas Cry a defectos en los 
transportadores ABC, el primer caso que se reportó corresponde a la 
resistencia a las toxinas Cry1Ab y Cry1Ac en H. virescens debido a una 
mutación en el transportador ABCC260. De manera similar, se encontró que 
el transportador ABCC2 es responsable de la resistencia a la toxina Cry1Ac 
en Plutella xylostella y T. ni61. En Japón, la resistencia de B. mori a la toxina 
Cry1Ab se debe a una inserción de tirosina en una asa en el transportador 
ABCC262. En una población resistente a la toxina Cry2Ab de H. armigera se 
debe a una mutación en el transportador ABCA263. 
 
La expresión heteróloga de los receptores ABCC2 y ABCB1 en la línea 
celular de Spodoptera frugiperda Sf9 confirió susceptibilidad a las toxinas 
Cry1A y Cry3, respectivamente, sugiriendo que son receptores para estas 
toxinas64. El silenciamiento del transportador ABCH1 en P. xylostella 
confirmó que es receptor para la toxina Cry1Ac65. 
 
En resumen, las toxinas Cry1A usan como receptores los transportadores 
ABCC2 y ABCC3, la toxina Cry8Ca usa el transportador ABCC2, ABCC3 y 
17 
 
ABCC4, la toxina Cry2A al transportador ABCA2 y finalmente la toxina 
Cry3Aa al transportador ABCB1. 
 
 
1.3.3 Formación de oligómero 
 
La oligomerización y la formación de poro son pasos claves en la actividad 
de las toxinas Cry1A. Retomando el modelo de acción de toxinas Cry, se 
propone que la interacción del monómero de Cry1A con caderina 
promueve un procesamiento proteolítico en el cual se escinde la hélice -1 
induciendo la oligomerización de la toxina de una masa molecular de 250 
kDa aproximadamente y este oligómero presenta actividad de formación 
de poro28. Se ha descrito la oligomerización para toxinas activas contra 
distintos órdenes como lo son las toxinas Cry1, Cry3, Cry4Ba y Cry11A 
activas contra lepidópteros, coleópteros y dípteros66–69. 
 
Existen diversos trabajos que apoyan la formación de oligómero por medio 
de mutantes puntuales afectadas en la oligomerización, estructuras 
cristalográficas de toxinas Cry y análisis de western blot contra anticuerpos 
específicos para toxinas Cry1A, de los cuales se habla con mayor detalle a 
continuación. 
 
Se realizaron mutantes en la hélice -3, en particular la R99E en la toxina 
Cry1Ab, en donde se observó que esta toxina estaba afectada en la 
oligomerización por medio de análisisde western blot, así como la 
realización de bioensayos contra M. sexta en donde se observó que esta 
mutante no fue tóxica70. De manera similar, mutantes de la toxina Cry11Aa 
en la hélice -3 presentaron defectos en la formación de oligómero y 
toxicidad en larvas de Aedes aegypti71. 
 
Por otra parte, se han obtenido las estructuras cristalográficas de las toxinas 
Cry4Ba (PDB: 1W99) y Cry5Ba (PDB: 4D8M) en donde se observó una 
formación de un trímero en donde estaban ausentes las hélices -1 y -2 
durante la proteólisis correspondiente al proceso de cristalización22,72. De 
manera similar, la toxina Cry4Ba mostró una organización trimérica 
observada por microscopia electrónica73. 
 
 
18 
 
1.4 Resistencia en insectos a toxinas Cry 
 
El uso convencional de insecticidas químicos y toxinas bacterianas para el 
control de insectos plaga en la agricultura global implica una presión de 
selección para el desarrollo de la evolución de resistencia a insecticidas74. 
Se tiene reporte que al menos 9 especies de insectos han desarrollado 
resistencia en el campo (Tabla 1). 
 
Tabla 1. Especies de insectos resistentes aislados en el campo. 
 
Especie Cultivo Toxina Ubicación Referencia 
<1% de 
individuos 
resistentes 
 
H. armigera Algodón Cry1Ac Australia 75 
H. armigera Algodón Cry2Ab Australia 75 
H. punctifera Algodón Cry2Ab Australia 76 
1-6% de 
individuos 
resistentes 
 
Diatraea 
saccharalis 
Maíz Cry1Ab Estados Unidos 77 
H. armigera Algodón Cry1Ac China 78 
Ostrinia 
furnacalis 
Maíz Cry1Ab Filipinas 79 
P. gossypiella Algodón Cry1Ac China 80 
>50% de 
individuos 
resistentes 
 
H. zea Algodón Cry2Ab Estados Unidos 81 
Busseola fusca Maíz Cry1Ab Sudáfrica 82 
D. virgifera 
virgifera 
Maíz Cry3Bb Estados Unidos 83 
H. zea Algodón Cry1Ac Estados Unidos 84 
P. gossypiella Algodón Cry1Ac India 85 
S. frugiperda Maíz Cry1Fa Puerto Rico 86 
 
La resistencia a toxinas Cry se puede desarrollar por mutaciones que 
afecten cualquiera de los pasos del mecanismo de acción de las toxinas 
(Figura 5). La resistencia se puede generar por diferentes mecanismos, que 
van desde la alteración en la activación de las toxinas, secuestro por 
esterasas, respuesta inmune elevada y por la alteración en la unión de la 
19 
 
toxina de los receptores, siendo este el último mecanismo el que se asocia 
mayormente a resistencia a toxinas Cry87,88. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Mecanismos de resistencia en insectos. Los principales mecanismos de resistencia 
están involucrados en defectos en la activación de las protoxinas, mutaciones en los 
receptores y cambios en el sistema inmune, entre otros. Modificado de Wu 201489. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
20 
 
2. Antecedentes 
 
2.1 Toxina Cry1AbMod 
 
Las toxinas Cry modificadas (Cry1AbMod y Cry1AcMod) carecen de los 
primeros 56 aminoácidos hacia el extremo N-terminal, que corresponden a 
la hélice -1 y parte de la hélice -2a, estas toxinas tienen la característica 
que son capaces de formar oligómeros sin requerir de la interacción con 
caderina y son presentan toxicidad contra insectos resistentes con 
mutaciones ligadas a caderina u otros receptores90. Es importante 
mencionar que las toxinas Cry1AMod son seguras, no aumentaron su 
espectro de acción, ya que se requiere que el oligómero se una a los 
receptores anclados por GPI y se inserte en la membrana para matar a la 
larva91. La toxina Cry1AbMod insertada en membranas sintéticas adopta 
una organización trimérica observada por microscopia electrónica91. 
2.1.1 Toxicidad de Cry1AbMod 
Como se mencionó anteriormente, las toxinas Cry1AbMod y Cry1AcMod 
son eficientes para contender con la resistencia en diferentes especies de 
lepidópteros. Sin embargo, se ha demostrado que ambas toxinas 
presentan una pérdida en la potencia en insectos susceptibles92 (Figura 6: 
barras color claro). Recientemente se encontró que la protoxina de 
Cry1AbMod induce eficientemente la oligomerización, no así la toxina 
activada Cry1AbMod, este hecho podría explicar la pérdida de potencia 
de las toxinas Cry1AbMod contra insectos susceptibles93. Se propuso que 
no sólo los insectos blanco podrían tener diferentes receptores, también 
podrían tener diferente contenido de proteasas que afectan directamente 
la proporción de protoxina/toxina activada y este efecto se vería reflejado 
directamente en la toxicidad93. 
 
 
 
 
 
 
21 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Potencia de las toxinas Cry1AMod contra sus versiones nativas en diversos 
lepidópteros. La potencia se obtuvo dividiendo la LC50 de la toxina nativa entre la LC50 de 
su correspondiente toxina modificada para la línea resistente (barras en color oscuro) o 
línea susceptible (barras en color claro). Se reportan las siguientes especies: Plutella 
xylostella (Px), Ostrinia nubilalis (On), Ditraea saccharalis (Ds), Helicoverpa armigera (Ha), 
Pectinophora gossypiella (Pg) y Trichoplusia ni (Tn). Modificado de Tabashnik et al., 2011. 
 
En Brasil, la especie S. frugiperda ha desarrollado resistencia al maíz-Bt que 
expresa la toxina Cry1Fa86. Datos recientes indican que las toxinas 
Cry1AbMod y Cry1AcMod resultaron ser altamente efectivas contra esta 
población, en contraste con sus contrapartes nativas (Figura 7), sin 
embargo, no se ha analizado el mecanismo de acción de las toxinas 
Cry1AMod en esta especie94. 
 
 
 
 
 
 
 
22 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7. Potencia de las toxinas Cry1AMod contra sus versiones nativas en S. frugiperda. 
La potencia se obtuvo dividiendo la LC50 de la toxina nativa entre la LC50 de su 
correspondiente toxina modificada para la línea resistente (barras en color oscuro) o línea 
susceptible (barras en color claro). Todos los valores son mayores a 1 indicando que la 
toxina modificada fue más potente que la toxina nativa. Modificado de Monnerat et al., 
2015 94. 
Las toxinas Cry1AMod son eficaces contra las especies de lepidópteros 
resistentes P. gossypiella y P. xylostella, que presentan mutaciones en el 
receptor caderina y el transportador ABCC2, respectivamente. 
Recientemente, se determinó que la toxina Cry1AcMod se une con menor 
afinidad a las BBMV de las dos poblaciones de insectos mencionadas 
anteriormente, adicionalmente, ambas toxinas presentan defectos en la 
oligomerización. Lo anterior, sugiere que la pérdida de potencia de las 
toxinas Cry1AMod se debe a una oligomerización menos eficiente95. 
2.2 Toxina Vip3Aa 
Las proteínas insecticidas vegetativas (Vip, del inglés vegetative 
insecticidal proteins) son producidas por Bt durante la fase vegetativa de la 
bacteria96. Existen hasta el momento 4 familias de toxinas Vip (Vip1, 2, 3 y 
4)97. Las toxinas Vip no presentan homología en secuencia de aminoácidos 
con ninguna proteína Cry descrita al momento97. Esta característica, las 
posicionan como candidatas importantes para el control de plagas de 
lepidópteros y para combatir insectos resistentes. La toxina Vip3Aa es la 
más estudiada y es tóxica contra un amplio rango de lepidópteros, entre 
los cuales destacan; Agrotis ipsilon, Spodoptera frugiperda, Heliothis 
virescens, Helicoverpa zea99, las cuales son especies de importancia 
agronómica. Actualmente, se co-expresan toxinas Vip3Aa y Cry en cultivos 
transgénicos de maíz y algodón100. 
23 
 
2.2.1 Mecanismo de acción de Vip3Aa 
El mecanismo de acción de la toxina Vip3Aa no está del todo claro (Figura 
8). Se propone que posterior a su ingestión por un insecto susceptible, la 
protoxina de 88-90 kDa (Figura 8-1) se procesa por proteasas y se produce 
la toxina activada de 66 kDa (Figura 8-2). La toxina se une de manera 
específica a receptores, los cuales hasta el momento no se han descrito 
con precisión (Figura 8-3). La toxina Vip3Aa es capaz de formar oligómeros 
y estos presentan actividad de formaciónde poro (Figura 8-4) 
ocasionando la muerte de la larva97. Es importante mencionar que la 
proteína Vip3Aa no comparte sitios de unión con las toxinas Cry101 y que 
son altamente activas contra especies en las cuales las toxinas Cry son 
poco susceptibles o en algunas que no presentan actividad102, por lo cual 
se propone que son mecanismos de acción diferentes. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 8. Mecanismo de acción de la toxina Vip3Aa. Modificada de Chakroun et al., 2016 
97. 
Recientemente, se reportaron como receptores para la protoxina Vip3Aa 
el Scavenger receptor-C103 y Fibroblast Growth Factor Receptor104 en las 
líneas celulares Sf9 y Sf21, hasta el momento no se han reportado 
receptores en insectos. 
 
 
 
 
24 
 
3. Hipótesis 
 
Las toxinas Cry1AbMod y Vip3Aa no comparten receptores funcionales en la 
microvellosidad media apical en Spodoptera frugiperda. 
 
 
 
4. Objetivos 
 
4.1 Objetivo general: 
 
Entender la diferencia entre el mecanismo de acción de las toxinas Cry1Ab, 
Cry1AbMod y Vip3Aa en Spodoptera frugiperda. 
 
4.2 Metas: 
 
- Determinar la toxicidad de Cry1Ab, Cry1AbMod y Vip3Aa en S. frugiperda. 
- Analizar la activación proteolítica de la protoxinas Cry1Ab, Cry1AbMod y 
Vip3Aa con tripsina, quimiotripsina y jugo gástrico de S. frugiperda. 
- Evaluar la oligomerización de las toxinas activadas Cry1Ab y Cry1AbMod 
en presencia de BBMV de S. frugiperda. 
- Identificar las proteínas de unión en las BBMV de las toxinas Cry1AbMod y 
Vip3Aa en S. frugiperda. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
25 
 
 
5. Materiales y métodos 
 
5.1 Preparación y purificación de toxinas 
 
5.1.1 Toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod 
 
La cepa Bt 407- que producen las toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod se crecieron en 
cajas HCT suplementadas con eritromicina (10 µg/ml) a 30°C hasta que se 
observó la completa esporulación (alrededor de 72 horas). Se realizaron diversos 
lavados de la mezcla de espora/cristal en el amortiguador 300 mM NaCl, 10 mM 
EDTA, 1 mM PMSF. Las inclusiones cristalinas se solubilizaron en un amortiguador 
alcalino (100 mM Na2CO3, 0.1% -mercaptoetanol, pH 10.5) durante 1 hora a 37°C. 
Las toxinas activadas se obtuvieron diferentes tratamientos de las protoxinas 
solubles. Cry1Ab-T; Cry1Ab activada con tripsina (1:50), Cry1AbMod-T; Cry1AbMod 
activada con tripsina (1:50), Cry1Ab-Q; Cry1Ab activada con quimiotripsina (1:50), 
Cry1AbMod-Q; Cry1AbMod activada con quimiotripsina (1:50), Cry1Ab-JG; 
Cry1Ab activada con jugo gástrico (1%) y Cry1AbMod-JG; Cry1AbMod activada 
con jugo gástrico(1%) de S. frugiperda. La activación se llevó a cabo en un 
amortiguador de carbonatos 100 mM (pH 8.6) durante 1 hora a 37°C. Las toxinas 
activadas se purificaron mediante cromatografía de intercambio iónico Mono Q 
ion-exchange column (Pharmacia Biotech). La toxina se eluyó con un gradiente 
de 50-500 NaCl en un amortiguador de carbonatos 20 mM (pH 10.8). Se determinó 
la concentración de proteínas de las toxinas activadas utilizando el método 
Bradford utilizando BSA como estándar. Las toxinas purificadas se analizaron por 
SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie. 
 
5.1.2 Toxina Vip3Aa 
 
En el laboratorio se encuentra disponible la cepa de E. coli BL21 con el plásmido 
integrado para la expresión heteróloga de la proteína Vip3A. El gen vip3A fue 
previamente clonado en el vector pET28a flanqueado por una marca de 6 
histidinas en los extremos N-terminal que favorecen su posterior purificación. 
5.1.2.1 Cultivo e inducción 
Se reactivó la cepa Vip3Aa-E. coli BL21 en medio sólido LB suplementado con 
kanamicina (50 µg/ml) a 37°C. Se realizó un pre-cultivo de 50 ml de LB líquido 
suplementado con kanamicina (50 µg/ml) toda la noche a 37°C. A la mañana 
siguiente se inoculó 500 ml de medio 2xTY líquido suplementado con kanamicina 
(50 µg/ml) con 5 ml del pre-cultivo en un matraz Fernbach estéril. El matraz se 
incubó a 30°C hasta que alcanzó una densidad óptica leída a 600 nm (OD600) de 
26 
 
0.9-1. Una vez que se confirmó la OD600 se dejó el matraz a temperatura ambiente 
5 minutos y se indujo el cultivo con IPTG 0.5 mM y se incubó nuevamente a 30°C. 
Se recuperó el cultivo en frascos Nalgene 250 ml y se centrifugó a 4,000 rpm a 
10°C durante 15 minutos. Se descartó el sobrenadante. Las pastillas se 
resuspendieron en 80 ml de agua estéril y se centrifugó a 10,000 rpm a 10°C. Se 
descartó el sobrenadante y se confirmó la correcta expresión de la toxina por 
SDS-PAGE. Se almacenaron las alícuotas a -70°C. 
5.1.2.2 Lisis y purificación 
Se descongeló una alícuota añadiendo 9 ml de PBS 1X. Se transfirió el lisado en un 
vial de vidrio y se sonicó en hielo tres veces durante 50 segundos a 100% de 
amplitud. Se centrifugó a 10,000 rpm durante 15 minutos. Se recuperó el 
sobrenadante y se pasó el lisado por un filtro de 45 micras. 
5.1.2.3 Purificación por columna de níquel 
Se utilizó una columna empacada con 1 ml de resina Ni-agarosa equilibrada con 
PBS 1X. Se pasó el lisado tres veces por la columna. Se lavó la columna con 50 ml 
de PBS/ imidazol 35 mM. Se eluyó con 5 ml de PBS/ imidazol 250 mM. Se 
recuperaron las fracciones. Se eluyó con 2 ml de PBS/imidazol 500 mM. Se terminó 
de lavar con 5 ml de PBS/imidazol 500 mM. Se equilibró nuevamente la columna 
con PBS 1X y la columna se almacenó con PBS/Etanol al 10%. Se confirmó la 
obtención de la toxina por SDS-PAGE. 
5.2 Aislamiento y purificación de BBMV 
 
Se disectaron los intestinos (parte media) de larvas de tercer instar de Spodoptera 
frugiperda y se utilizaron para preparar las BBMV con el método de precipitación 
diferencial con MgCl2. Se tomaron 2.5 g de tejido y se descongeló em hielo. El 
tejido se colocó en un tubo de vidrio estéril que contenía 25 ml de solución I 
(Manitol 300 mM, EGTA 5 mM, EDTA 1 mM, HEPES 10 mM, TRIS-HCl 17 mM, DTT 2 
mM, PMSF 1 mM, pH 7.4). El tejido se disgregó con un embolo estéril montado en 
un homogenizador Black & Decker U-114 tipo FV dando 9 golpes a 2,250 rpm. Se 
agregó un volumen de 25 ml de MgCl2 24 mM al tubo y se cubrió la boca de este 
con parafilm. Se mezcló suavemente mediante inversión y la muestra se incubó 
en hielo durante 15 minutos. Se centrifugó a 4,500 rpm por 15 minutos a 4°C en un 
rotor de ángulo fijo JA-20 (Beckman) utilizando una centrifuga J2-HS (Beckman). 
La pastilla fue descartada y el sobrenadante fue transferido a otro tubo estéril. Se 
centrifugó a 16,000 rpm durante 30 minutos a 4°C usando el equipo anteriormente 
descrito. El sobrenadante fue descartado y la pastilla resultante fue resuspendida 
en 10 ml de solución I más 10 ml de MgCl2 24 mM. Se repitieron los dos pasos de 
centrifugación anteriores para obtener una segunda pastilla al centrifugar a 
27 
 
16,000, la cual se resuspendió en solución I diluida en agua estéril 1:1 fría. Se dieron 
tres golpes adicionales a 2,250 rpm. La concentración de proteína se determinó 
por el método de Lowry, DC protein assay dye method (Bio-Rad) utilizando BSA 
como estándar. Se almacenaron a -70°C hasta su uso. 
 
5.3 Bioensayos 
 
Se determinó la toxicidad de las protoxinas Cry1Ab, Cry1AbMod y Vip3Aa por el 
método de contaminación de superficie con larvas neonatas de S. frugiperda. Se 
incorporaron concentraciones de 1 a 2000 ng/cm2 en la superficie de la dieta 
contenida en placas de 24 pozos (Corning Glas Works), se utilizó agua como 
control negativo. Las placas se incubaron a 28°C con 65% ± 5% de humedad 
relativa y un fotoperiodo de luz-oscuridad de 16:8 h. Se realizaron por triplicado 
para calcular la concentración letal 50 (LC50) con el programa probit (Probit 
software). 
 
5.4 Biotinilación de toxinas 
 
Las toxinas activadas de Cry1Ab (Cry1Ab-T, Cry1Ab-Q y Cry1Ab-JG) y Cry1AbMod 
(Cry1AbMod-T, Cry1AbMod-Q y Cry1AbMod-JG), así como la protoxina Vip3Aa y 
la toxina activada Vip3Aa se dializaron en un amortiguador boratos 100 mM, pH 8 
yse utilizó el kit de marcaje con biotina (Roche Molecular Biochemicals). Se 
incubaron 0.6 mg de toxinas con 20 µl de biotina. Se dejó la reacción 1 hora a 
temperatura ambiente. Se empacó una columna de sephadex G25 y se equilibró 
la columna con 10 ml de PBS 1X. La biotina libre se removió por filtración en gel. Se 
recuperó la toxina marcada y se verificó el marcaje por western blot. 
 
5.5 Ligand blot 
 
Se incubaron 10 µg de BBMV en un amortiguador de unión (PBS 1X, 0.1% BSA, 0.1% 
Tween 20) con 15 nM de toxinas Cry biotiniladas (Cry1Ab-T, Cry1Ab-Q, Cry1Ab-JG, 
Cry1AbMod-T, Cry1AbMod-Q and Cry1AbMod-JG) durante 1 hora a temperatura 
ambiente. Las muestras se centrifugaron a 14,000 rpm durante 10 min para 
remover la toxina que no se unió. Se realizaron tres lavados con el amortiguador 
de unión. Finalmente, la pastilla se resuspendió en 10 µl de PBS con 3 µl de 
amortiguador de Laemmli. Las muestras se hirvieron y se separaron por SDS-PAGE 
y se electrotransfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF). Se 
revelaron las proteínas utilizando estreptavidina acoplada a peroxidasa (1:5000). 
La membrana se visualizó con el sustrato Super Super SignalTM chemiluminescence 
substrate (Pierce). 
 
28 
 
5.6 Oligomerización 
 
Se incubaron 2 y 4 µg de cada toxina activada con 10 µg de BBMV en un 
amortiguador carbonatos (pH 10.5). El volumen total fue 50 µl, la reacción se llevó 
a cabo a temperatura ambiente durante una hora. Se utilizó una muestra que 
solo contenía BBMV como control negativo. Posteriormente se añadió 3 µl de 
amortiguador Laemmli y las muestras se calentaron a 50°C durante 3 minutos. Las 
muestras se separaron por SDS-PAGE al 8% y se electrotransfirieron una membrana 
de PVDF y se revelaron por western blot. La membrana de PVDF se bloqueó con 
leche descremada al 5% (peso/volumen) en un amortiguador de lavado (PBS 1X 
pH 7.4, Tween 20 al 0.1% durante una hora a temperatura ambiente. La 
membrana se lavo 3 veces con amortiguador de lavado. Las toxinas se 
detectaron con un anticuerpo policlonal anti-Cry1Ab (diluido 1:30,000; 1 hora). La 
visualizaron se llevó a cabo con un anticuerpo secundario contra conejo 
acoplado a peroxidasa (Santa Cruz Biotechnology) (1:25,000 dilution; 1h), seguido 
del sustrato Super SignalTM chemiluminescence substrate (Pierce). 
5.7 Pull-down 
 
5.7.1 Unión de la protoxina Vip3Aa y las toxinas Cry1AbMod y 
Vip3Aa con las perlas de agarosa 
 
Las toxinas Cry1AbMod y Vip3Aa, además de la protoxina Vip3Aa se incubaron 
con perlas de agarosa activadas con CNBr (General Electric) en un amortiguador 
de carbonatos (NaHCO3 100 mM, NaCl 500 mM, pH 8.3) toda la noche a 4°C en 
agitación. Se centrifugaron a 13,000 rpm durante 5 minutos a 4°C. Se evaluó la 
eficiencia de la unión cuantificando el sobrenadante por Bradford. Se bloquearon 
los sitios activos añadieron 150 µl de amortiguador de bloqueo (Tris-HCl 100 mM pH 
8) y se incubó durante dos horas a temperatura ambiente con agitación. 
Posteriormente se hicieron tres ciclos de lavados: cada ciclo es un lavado con 150 
µl de amortiguador 1 (100 mM de ácido acético/acetato de sodio pH 4, 500 mM 
de NaCl), se centrifugó a 13,000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. 
Seguido de amortiguador de lavado 2 (100 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM de NaCl), se 
centrifugó a 13,000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Estos ciclos se 
repitieron tres veces. 
 
 5.7.2 Unión de la toxina/protoxina a las proteínas de las BBMV 
 
Se solubilizaron 1 mg de BBMV en el amortiguador de solubilización (Tritón-X100 
1%, NaHPO4/NaH2PO4 50 mM, NaCl 50 mM, EGTA 5 mM, EDTA 5 mM, PMSF 1 mM, 
pH 7.5) a 950 rpm una hora a 4°C. Se ultracentrifugaron a 30,000 rpm durante 30 
minutos a 4°C. Se recuperó el sobrenadante y se determinó la concentración de 
29 
 
proteína por el método de Bradford. Se incubaron 150 µl de toxina con 300 µl de 
proteínas solubles de las BBMV durante 1 hora a 4°C. Posteriormente las muestras 
se centrifugaron a 13,000 rpm durante 15 minutos a 4°C. Se recuperó la pastilla y 
se lavó dos veces con 500 µl de PBS, NaCl 1 mM. Posteriormente, se hicieron tres 
lavados con 500 µl de PBS. Las proteínas que continuaban unidas a las 
toxinas/protoxina se disociaron con temperatura, hirviendo las muestras 10 
minutos en 30 µl de amortiguador de carga (Tris-HCl 100 mM, DTT 200 mM, SDS 4%, 
bromofenol blue 0.2%, glicerol 20%, pH 6.8). El sobrenadante se separó mediante 
SDS-PAGE al 15% y se cortó el carril para su procesamiento en la Unidad de 
Proteómica, IBT-UNAM para su posterior identificación MS/MS. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
30 
 
6. Resultados y discusión 
 
6.1 Parte I: Mecanismo de toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod en Spodoptera 
frugiperda 
 
6.1.1 Obtención y solubilización de las toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod. 
Las toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod se obtuvieron a partir de las cepas de Bt-
Cry1Ab y Bt-Cry1AbMod, respectivamente. Se monitoreó su crecimiento 
durante un lapso de 72 horas hasta observar por microscopio óptico la 
esporulación y liberación de los cristales proteicos. Se analizó la expresión y 
solubilización de las proteínas obtenidas en amortiguador de carbonatos 
100 mM, pH 10.5 mediante SDS-PAGE (Figura 9) en donde se observa la 
producción de las proteínas; en el carril 2 la banda de 135 kDa 
corresponde a la toxina Cry1Ab y en el carril 5 la banda de 130 kDa 
corresponde a la toxina Cry1AbMod. En los carriles 3 y 6 se aprecia que 
ambas toxinas son solubles en condiciones alcalinas, previamente 
descrito90,105. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 9. Expresión y solubilización de toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod. SDS-PAGE 10% teñido 
con azul de coomassie. La fecha indica la protoxina. Carriles: 1) Marcador de peso 
molecular, 2) Espora-cristal de Cry1Ab, 3) Fracción soluble de Cry1Ab, 4) Pastilla de 
Cry1Ab, 5) Espora-cristal de Cry1AbMod, 6) Fracción soluble de Cry1AbMod y 7) Pastilla de 
Cry1AbMod. 
 
 
31 
 
6.1.2 Toxicidad de Cry1Ab y Cry1AbMod en S. frugiperda. 
Se evaluó la actividad de las protoxinas Cry1Ab y Cry1AbMod mediante la 
realización de bioensayos (Tabla 2), por el método de contaminación de 
superficie, contra en larvas neonatas de S. frugiperda pertenecientes a la 
población de México (IBT-UNAM). Los bioensayos se realizaron por 
triplicado y los resultados se analizaron con el programa estadístico PROBIT. 
Se observó que la protoxina Cry1Ab no fue tóxica (LC50 >2000 ng/cm2), en 
contraste con la protoxina de Cry1AbMod encontrando una LC50 de 88 
ng/cm2. 
Tabla 2. Bioensayo de las protoxinas Cry1Ab y Cry1AbMod contra S. 
frugiperda (Población IBT-UNAM). 
Protoxina LC50 (ng/cm2) 
Cry1Ab >2000 
Cry1AbMod 88 [62-116] 
 Límite de confianza del 95%. 
6.1.3 Ensayos de activación proteolítica. 
Como se mencionó previamente, en el mecanismo de acción de las 
toxinas Cry, las protoxinas de 135 kDa se procesan a un fragmento tóxico 
de 65 kDa106. Se analizó la activación de las protoxinas Cry1Ab y 
Cry1AbMod con las proteasas tripsina, quimiotripsina y con jugo gástrico de 
S. frugiperda (Figura 10). En el carril 2 se observa el tratamiento de la 
protoxina Cry1Ab con tripsina dando como resultado una banda de 65 
kDa, en el carril 3 el tratamiento con quimiotripsina y el carril 4 con jugo 
gástrico en donde se observa también la banda de 65 kDa, 
correspondiente al monómero de Cry1Ab. En el carril 5 está el tratamiento 
de la protoxina Cry1AbMod con tripsina obtenido un patrón de bandeo 
característico de esta toxina, previamente reportado90 y los carriles 6 y 7 
corresponden al tratamiento con quimiotripsina y jugo gástrico, 
respectivamente. 
 
 
 
32 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 10. Activación proteolítica de las protoxinas Cry1Ab y Cry1AbMod. SDS-PAGE 10% 
teñido con azul de coomassie. Carriles: 1) Marcador de pesomolecular, 2) Cry1Ab 
activada con tripsina (1:50), 3) Cry1Ab activada con quimiotripsina (1:50), 4) Cry1Ab 
activada con jugo gástrico de Sf (1%), 5) Cry1AbMod activada con tripsina (1:50), 6) 
Cry1Ab activada con quimiotripsina (1:50) y 7) Cry1Ab activada con jugo gástrico de Sf 
(1%). 
En el lumen de los intestinos de las larvas se encuentra una gran diversidad 
de enzimas digestivas107. Las serin proteasas son las principales enzimas que 
se encuentran ahí y se ha observado que juegan un papel importante en 
el procesamiento de las toxinas Cry108. En el año 2006, se reportó la 
composición de proteasas en el jugo gástrico de Spodoptera spp., el cual 
se encuentra compuesto por: quimiotripsina (85%), tripsina (7%), 
aminopeptidasa (5%), elastasa (1%) y carboxipeptidasa (1%)109, se puede 
apreciar que la toxina Cry1Ab es menos estable en los tratamientos con 
quimiotripsina y jugo gástrico (carriles 3 y 4, respectivamente) en 
comparación con tripsina (carril 2). Por otro lado, la toxina Cry1AbMod es 
estable en ambos tratamientos quimiotripsina y jugo gástrico (carriles 6 y 
7), estos datos concuerdan con lo reportado por Srinivasan et al., 2006109, 
por lo cual se observa que la composición de proteasas en el jugo gástrico 
es similar al reportado, además que sugiere que la activación de la toxina 
está dada por una proteasa tipo quimiotripsina. 
6.1.4 Unión de las toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod en BBMV de S. 
frugiperda. 
Por lo general, si una toxina es letal en algún insecto, esta se une de 
manera específica y saturable a las BBMV110. Este tipo de unión indica que 
las toxinas se unen a un número limitado de sitios definidos en las BBMV. Se 
evaluó la unión de las toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod activadas con los 
33 
 
diferentes tratamientos (tripsina, quimiotripsina y jugo gástrico de Sf) y 
marcadas con biotina a BBMV de S. frugiperda a una concentración fija 
de 15 nM. La Figura 11 muestra el resultado de la unión de las toxinas 
Cry1Ab y Cry1AbMod. Se puede apreciar que ambas toxinas, de los 
diferentes tratamientos, se unen a las BBMV. Dado que se observa mayor 
intensidad en la unión de la toxina Cry1AbMod (carriles 6 y 7) se podría 
sugerir que esta toxina se une con mayor afinidad a las BBMV respecto a la 
toxina Cry1Ab (carriles 2-4). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 11. Unión de las toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod a BBMV de S. frugiperda. Western blot 
detectado con estreptavidina acoplada a peroxidasa, dilución 1:80,000. Carriles: 1) 
Marcador de peso molecular, 2) Toxina Cry1Ab activada con tripsina, 3) Toxina Cry1Ab 
activada con quimiotripsina, 4) Toxina Cry1Ab activada con jugo gástrico, 5) Toxina 
Cry1AbMod activada con tripsina, 6) Toxina Cry1AbMod activada con quimiotripsina, 7) 
Toxina Cry1AbMod activada con jugo gástrico y 8) Control negativo. 
La protoxina Cry1Ab no es tóxica para S. frugiperda, la toxina activada 
mostró una unión baja en comparación con la toxina Cry1AbMod. En 
reportes previos, se ha analizado la unión de la toxina Cry1Ab activada 
hacia las BBMV de S. frugiperda, la conclusión de estos estudios es que a 
pesar que no es tóxica es capaz de unirse e interactúa de manera no 
específica con la microvellosidad y que esta unión no se relaciona con 
toxicidad111,112,113. Por otro lado, la toxina Cry1AbMod activada con 
quimiotripsina y con jugo gástrico mostraron una unión mayor en contraste 
con la toxina Cry1Ab, esto pudiera deberse a que la deleción del amino-
terminal induce cambios conformacionales que favorece la exposición de 
residuos que interactúan con las proteínas de la microvellosidad de S. 
frugiperda. Las diferencias en unión se correlacionan con la actividad de 
las toxinas. 
34 
 
 
6.1.5 Pull-down de la toxina Cry1AbMod e identificación de 
proteínas. 
El ensayo de pull-down es un método in vitro que se utiliza para determinar 
la interacción física entre dos o más proteínas114. Este ensayo permite 
obtener información de interacciones proteína-proteína desconocidas o 
corroborar las interacciones provenientes de otras técnicas (ej. Co-
inmunopreciptación)114. Es parecido a la Inmunoprecipitación, la 
diferencia radica en que se utiliza una “proteína presa” en lugar de un 
anticuerpo115. Para determinar las proteínas de unión en las BBMV de S. 
frugiperda con la toxina Cry1AbMod, se realizó un ensayo de pull-down 
(Figura 12 ), en primer lugar, se activó la proteína Cry1AbMod con jugo 
gástrico de S. frugiperda y la toxina activada se acopló a perlas de 
agarosa funcionalizadas con CnBr. Posteriormente, la proteína inmovilizada 
se incubó con las proteínas solubles de las BBMV. Las proteínas 
pertenecientes a las BBMV que se unen a la toxina Cry1AbMod se 
separaron por medio de centrifugación. Finalmente, las proteínas que se 
unieron a la toxina Cry1AbMod se encuentran en la pastilla y se visualizaron 
por medio de SDS-PAGE (carril 3). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 12. Pull-down de la toxina Cry1AbMod y las proteínas de las BBMV de Sf. SDS-PAGE 
12% teñido con azul de coomassie. Carriles: 1) Marcador de peso molecular, 2) Toxina 
Cry1AbMod acoplada a las perlas de agarosa, 3) Pull-down. 
6.1.5.1 Identificación de proteínas de membrana que interactúan con 
Cry1AbMod. 
 
El carril 3 de la Figura 12 se cortó y se envió al Laboratorio de Proteómica 
del IBT-UNAM para la secuenciación de péptidos por espectrometría de 
35 
 
masas LC-MS/MS. Se identificaron 27 proteínas en total. Se analizó la 
distribución celular de cada una de ellas (Figura 13). El 72% de las proteínas 
identificadas corresponde a la categoría de proteínas de membrana, 
dado que son de principal interés como potenciales receptores para la 
toxina Cry1AbMod se enlistaron en la Tabla. 
 
 
 
 
 
 
Figura 13. Localización celular de las proteínas identificadas del pull-down de la toxina 
Cry1AbMod. 
Tabla 3. Resultado de la secuenciación LC-MS/MS del pull-down de la toxina Cry1AbMod 
y las proteínas de membrana de las BBMV de S. frugiperda. 
Fracción Identidad Número de acceso Descripción 
1 100% A0A0U2WS26_SPOFR Aminopeptidasa 
N1[Spodoptera frugiperda] 
 100% A0A0U2WES6_SPOFR Aminopeptidasa N4 
[Spodoptera frugiperda] 
 100% A0A0U2WB66_SPOFR Aminopeptidasa N3 
[Spodoptera frugiperda] 
 100% A0A194Q3Q9_PAPXU Transportador de azúcar 
[Papilio xuthus] 
 99% A0A1A9FDK2_LELAM Canal iónico [Lelliottia 
amnigena] 
 98% A0A0L7L7N1_9NEOP Transportador de azúcar 
[Operophtera brumata] 
 100% A0A076VDI4_SPOEX Aminopeptidasa N5 
[Spodoptera exigua] 
 100% Q4G6A5_SPOEX Aminopeptidasa 
N1[Spodoptera exigua] 
2 100% A0A0U2WES6_SPOFR Aminopeptidasa N4 
[Spodoptera frugiperda] 
36 
 
 100% A0A076VDI4_SPOEX Aminopeptidasa N5 
[Spodoptera exigua] 
 100% Q4G6A5_SPOEX Aminopeptidasa 
N1[Spodoptera exigua] 
3 100% A0A0U2WS26_SPOFR Aminopeptidasa 
N1[Spodoptera frugiperda] 
 100% A0A0U2WES6_SPOFR Aminopeptidasa N4 
[Spodoptera frugiperda] 
4 99% I0E0A6_MANSE VMP46 [Manduca sexta] 
 100% A0A0U2WES6_SPOFR Aminopeptidasa N4 
[Spodoptera frugiperda] 
 
Del análisis de LC-MS/MS destaca la identificación de las aminopeptidasas 
N1, N3, N4 y N5, como posibles receptores de Cry1AbMod en Sf (México, 
IBT-UNAM). Para corroborar si las aminopeptidasas anteriormente 
mencionadas son receptores funcionales de la toxina Cry1AbMod se 
tendrían que realizar ensayos de RNA de interferencia para evaluar la 
posible participación de cada proteína, esta estrategia no se continuó 
debido a la pérdida de esta población en el insectario del laboratorio y al 
reemplazo de otra población de S. frugiperda con diferente susceptibilidad 
a la toxina Cry1AbMod. 
Actualmente, se cuenta con poca información acerca de las moléculas 
que son receptores funcionales involucrados en la unión de las toxinas de 
Bt en Spodoptera spp., en comparación con otras especies de insectos. La 
identificación de los receptores funcionales se ha realizado principalmente 
medianteestudios de RNA de interferencia 116. La Tabla 4 resume los 
receptores que se han identificado para las toxinas de Bt en Spodoptera 
spp, el artículo de doctorado fue el primer reporte de candidatos a 
receptores de la toxina Cry1AbMod en S. frugiperda. 
 
 
 
 
 
37 
 
Tabla 4. Receptores de toxinas Bt en Spodoptera spp. 
Especie Receptor Toxina Referencia 
S. litura APN Cry1C 36 
S. exigua APN1 Cry1Ca 39 
S. exigua APN1, APN3 y APN6 Cry1Ca 117 
 
S. exigua Caderina Cry1Ca 
Cry1Ac 
Cry2A 
57 
118 
S. exigua Transportador ABCC2 y 
ABCC3 
Cry1Ac 
Cry1Ca 
119 
S. frugiperda (línea 
celular SF21) 
Proteína ribosomal S2 Vip3A 120 
 
S. litura Proteína ribosomal S2 Vip3A 120 
S. frugiperda APN1 Cry1Ca 37 
 
6.1.6 Oligomerización 
 
La oligomerización es paso determinante dentro del mecanismo de acción 
de las toxinas Cry 121,122. El oligómero se ha observado mediante el 
contacto de las toxinas activadas con las BBMV66,91,123. También se ha 
obtenido con liposomas: SUV, del inglés Small Unilamellar Vesicles 124,69,121,125 
o LUV, del inglés Large unilamellar vesicles 68,73 y con un fragmento que 
mimetiza a caderina, denominado scFv3 126–128. 
Se llevó a cabo un ensayo de oligomerización de las toxinas Cry1Ab y 
Cry1AbMod activadas con los diferentes tratamientos (tripsina, 
quimiotripsina y jugo gástrico) con dos concentraciones de toxina (2 y 4 µg) 
y las BBMV de S. frugiperda (Figura 14 Panel-A y B). En la Figura 14-A no se 
observó la formación de oligómero de la toxina Cry1Ab en ninguna 
concentración. En contraste, la Figura 14-B, se observa la formación un 
complejo de alto peso molecular alrededor de 200 kDa para la toxina 
Cry1AbMod activada con jugo gástrico de S. frugiperda y quimiotripsina 
(carriles 2, 3, y 6). 
 
 
 
 
 
38 
 
Panel A Panel B 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 14. Ensayos de oligomerización de las toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod. Western blot, 
la detección se realizó un anticuerpo primario anti-Cry1A, empleado a una dilución de 1: 
15,000 y un anticuerpo secundario empleado en una dilución 1: 30,000. Panel A) Toxina 
Cry1Ab. Carriles: 1) Marcador de peso molecular, 2) Toxina Cry1Ab activada con jugo 
gástrico (2 µg) en presencia de BBMV, 3) Toxina Cry1Ab activada con jugo gástrico (4 µg) 
en presencia de BBMV, 4) Toxina Cry1Ab activada con jugo gástrico (4 µg), 5) Toxina 
Cry1Ab activada con quimiotripsina (2 µg) en presencia de BBMV, 6) Toxina Cry1Ab 
activada con quimiotripsina (4 µg) en presencia de BBMV, 7) Toxina Cry1Ab activada con 
quimiotripsina (4 µg), 8) Toxina Cry1Ab activada con tripsina (2 µg) en presencia de BBMV, 
9) Toxina Cry1Ab activada con tripsina (4 µg) en presencia de BBMV, 10) Toxina Cry1Ab 
activada con tripsina (4 µg). Panel B) Toxina Cry1AbMod. Carriles: 1) Marcador de peso 
molecular, 2) Toxina Cry1AbMod activada con jugo gástrico (2 µg) en presencia de BBMV, 
3) Toxina Cry1AbMod activada con jugo gástrico (4 µg) en presencia de BBMV, 4) Toxina 
Cry1AbMod activada con jugo gástrico (4 µg), 5) Toxina Cry1AbMod activada con 
quimiotripsina (2 µg) en presencia de BBMV, 6) Toxina Cry1AbMod activada con 
quimiotripsina (4 µg) en presencia de BBMV, 7) Toxina Cry1AbMod activada con 
quimiotripsina (4 µg), 8) Toxina Cry1AbMod activada con tripsina (2 µg) en presencia de 
BBMV, 9) Toxina Cry1AbMod activada con tripsina (4 µg) en presencia de BBMV, 10) Toxina 
Cry1AbMod activada con tripsina (4 µg). La flecha indica el oligómero. 
La toxina Cry1AbMod activada con jugo gástrico y quimiotripsina formaron 
oligómero, su peso molecular podría sugerir la formación de un trímero, 
que ya se ha observado previamente para las toxinas Cry4Ba y 
Cry1AbMod 129, 91. La toxina Cry1AbMod activada con tripsina no se 
detectó la formación de oligómero, la pérdida de la capacidad de 
oligomerización pudiera deberse a cambios estructurales relacionados con 
la proteólisis, ya que el patrón de activación es diferente entre los 
tratamientos de tripsina comparado con los tratamientos de quimiotripsina 
y jugo gástrico. Se sabe que una activación incorrecta deriva en la 
incapacidad de formar oligómeros121 como es el caso de la toxina Cry1Ab. 
39 
 
La incapacidad de la toxina Cry1Ab de formar oligómero se correlaciona 
con lo observado en los datos de toxicidad. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
40 
 
6.2 Parte II: Mecanismo de la toxina Vip3Aa en Spodoptera frugiperda 
6.2.1 Producción y purificación de la toxina Vip3Aa 
En el laboratorio se tiene la cepa de E. coli BL21 con el plásmido integrado 
para la expresión heteróloga de la proteína Vip3A. El gen vip3a fue 
previamente clonado en el vector pET28a flanqueado por una marca de 6 
histidinas en los extremos N-terminal que favorecen su posterior 
purificación. 
Se llevó a cabo la cinética de la producción de la proteína Vip3Aa 
mediante la inducción del cultivo con IPGT y se tomaron alícuotas de 
distintas horas (Figura 15-A). Posteriormente, se verificó la expresión de la 
proteína mediante western blot utilizando un anticuerpo anti-tag his6X que 
reconoce la marca de histidinas (Figura 15-B). El peso molecular esperado 
fue de 88.5 kDa, que corresponde a la protoxina Vip3Aa. 
Panel A Panel B 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 15. Expresión de la toxina Vip3Aa. Panel A) SDS-PAGE al 10%. Cinética de inducción 
con 0.5 mM de IPTG. Panel B) Western blot de la cinética. La flecha indica la toxina 
Vip3Aa. 
 
Posteriormente, se purificó la proteína Vip3Aa por cromatografía de 
afinidad en columna de níquel. La proteína Vip3Aa eluye, 
mayoritariamente, en la fracción de 250 mM de imidazol (Figura 16). 
 
 
41 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 16. Purificación de la proteína Vip3Aa. SDS-PAGE al 10%. La fecha indica la toxina 
Vip3Aa. 
6.2.2 Toxicidad de la proteína Vip3Aa. 
De manera similar a las toxinas Cry, se realizaron bioensayos por triplicado 
para evaluar si la proteína Vip3Aa tenía actividad en larvas neonatas de S. 
frugiperda. Los resultados se analizaron con el programa estadístico PROBIT 
y se muestran en la Tabla 5. Previamente se reportó que la concentración 
letal media de la toxina Vip3Aa en S. frugiperda es de 55.9 ng/cm2 130. En la 
población de México, se encontró que la protoxina Vip3Aa es tóxica en un 
rango similar al reporte previamente mencionado. 
Tabla 5. Bioensayo de las protoxinas Vip3Aa contra S. frugiperda 
(Población UAEM). 
Protoxina LC50 (ng/cm2) 
Vip3Aa 30 (16-56) 
 Límite de confianza del 95%. 
6.2.3 Análisis del procesamiento in vitro de la toxina Vip3Aa. 
Se ha analizado la proteólisis in vitro de la proteína Vip3Aa, principalmente, 
con tripsina y jugo gástrico de insectos susceptibles y no susceptibles 131-132. 
Se realizó la activación proteolítica de la protoxina Vip3Aa con tripsina, 
quimiotripsina y jugo gástrico de S. frugiperda (Figura 17), se observó que la 
toxina se activa con los tratamientos de tripsina y jugo gástrico. En la 
activación con tripsina se encontraron 3 fragmentos mayoritarios (62, 20, 22 
kDa) y con jugo gástrico 4 fragmentos principales (62, 45, 22, 20 kDa). La 
activación con quimiotripsina es menos eficiente que los tratamientos 
anteriores observando mayoritariamente la protoxina. 
42 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 17. Procesamiento de la protoxina Vip3Aa con tripsina, quimiotripsina y jugo 
gástrico. SDS-PAGE al 15%. Las flechas indican la protoxina y toxina, respectivamente. 
Debido a la similitud de los resultados del procesamiento de la protoxina 
Vip3Aa entre tripsina y jugo gástrico, se sugiere que la proteólisis in vivo 
probablemente sea llevada a cabo por una proteasa tipo tripsina. Se ha 
reportado que la tripsina juega un papel importanteen la formación de la 
toxina activada Vip3Aa133. El patrón de activación de la toxina Vip3Aa 
varía dependiendo la proteasa que se emplee, por ejemplo, para el 
tratamiento con tripsina se encuentra una banda de 62-66 kDa y el 
fragmento de 22 kDa corresponde al N-terminal, con el jugo gástrico se 
han observado 4 productos mayoritariamente 62, 45, 33 y 22 kDa, se 
sugiere que el fragmento activo es el de 62-66 kDa 134,98. 
6.2.4 Análisis de proteínas de unión de BBMV con Vip3Aa por Ligand blot. 
Se han realizado diversos ensayos de ligand blot de la toxina Vip3Aa con 
distintos insectos lepidópteros112,120. La toxina Vip3Aa se une a proteínas 
con una masa molecular de 65, 55, 80, 100, 110 kDa, dependiendo del 
insecto135–138. Cabe mencionar que no se han encontrado similitudes, en el 
peso molecular, en cuanto al reconocimiento de proteínas entre las toxinas 
Cry1Ab, Cry1Ac y las toxinas Vip3Aa. Para realizar el ensayo de ligand blot, 
se marcó con biotina a la protoxina Vip3Aa y la toxina activada con 
tripsina, se encontraron diferencias notorias entre las proteínas de unión de 
la protoxina y las toxinas activadas. Para la protoxina Vip3Aa se observaron 
pocas bandas con menor intensidad: 50, 25, 20, 12 y 10 kDa (Figura 18-
Panel A). Entre la toxina activada con tripsina reconoce 9 bandas: 70, 60, 
50, 45, 40, 30, 25, 20, 10 kDa (Figura 18-Panel B), sugiriendo que la toxina 
activada es capaza de unirse a un número mayor de proteínas en 
contraste con la protoxina. 
43 
 
 
Panel A Panel B 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 18. Ligand blot de la protoxina Vip3Aa y toxinas activadas con tripsina y jugo 
gástrico. Western blot. Panel A) Protoxina Vip3Aa y Panel B) Toxina Vip3A activada con 
tripsina. Las flechas indican el peso molecular de las proteínas. 
6.2.5.1Análisis de proteínas de unión de BBMV con la protoxina Vip3Aa por 
pull-down. 
Se realizó el ensayo de pull-down con proteínas solubles de las BBMV de S. 
frugiperda y la protoxina Vip3Aa (Figura 19). Se acopló la protoxina 
Vip3Aa a perlas de agarosa funcionalizadas con CnBr. Posteriormente, la 
proteína inmovilizada se incubó con las proteínas solubles de las BBMV. Las 
proteínas pertenecientes a las BBMV que se unieron a la protoxina Vip3Aa 
se separaron por medio de centrifugación. Finalmente, las proteínas que se 
unieron a la protoxina Vip3Aa se encontraron en la pastilla y se visualizaron 
por medio de SDS-PAGE (carril 3). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 19. Ensayo de pull-down de la protoxina Vip3Aa. SDS-PAGE al 12%. Carriles: 1) 
Marcador de peso molecular, 2) Protoxina Vip3Aa acoplada a las perlas, 3) Pull-down. P1 
a P5 son los fragmentos que se cortaron para el análisis de secuenciación. 
44 
 
6.2.5.1.1 Identificación de proteínas de membrana que interactúan con la 
protoxina Vip3Aa. 
 
El carril 3 de la Figura 19 se cortó y se envió al Laboratorio de Proteómica 
del IBT-UNAM para la secuenciación de péptidos por espectrometría de 
masas LC-MS/MS. Se identificaron 14 proteínas en total. Se analizó la 
distribución celular de cada una de ellas (Figura 20). El 38% de las proteínas 
identificadas corresponde a la categoría de proteínas de membrana, 
dado que son de principal interés como potenciales receptores para la 
protoxina Vip3Aa se enlistó en la Tabla 6. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 20. Localización celular de las proteínas identificadas para la 
protoxina Vip3Aa. 
 
Tabla 6. Resultado de la secuenciación LC-MS/MS del pull-down de la 
protoxina Vip3Aa y las proteínas de las BBMV de S. frugiperda. 
Fracción Peso 
molecular 
(kDa) 
Número de acceso Descripción 
P2 513 A0A212F9W8_DANPL Low-density 
lipoprotein 
receptor [Danaus 
plexippus 
plexippus] 
P2 33 A0A2A4J5D8_HELVI-
DECOY 
Uncharacterized 
protein [Heliothis 
virescens] 
45 
 
P2 33 
A0A2A4J5D8_HELVI 
 
Uncharacterized 
protein [Heliothis 
virescen] 
P2 95 A0A0L7LL29_9NEOP Putative heparan-
alpha-
glucosaminide n-
acetyltransferase 
[Operophtera 
brumata] 
 
6.2.5.2 Análisis de proteínas de unión de BBMV con la toxina Vip3Aa 
activada por pull-down. 
Se realizó el ensayo de pull-down con proteínas solubles de las BBMV de S. 
frugiperda y la toxina Vip3Aa activada con tripsina (Figura 21). Se acopló 
la ptoxina Vip3Aa a perlas de agarosa funcionalizadas con CnBr. 
Posteriormente, la proteína inmovilizada se incubó con las proteínas 
solubles de las BBMV. Las proteínas pertenecientes a las BBMV que se 
unieron a la toxina Vip3Aa se separaron mediante centrifugación. 
Finalmente, las proteínas que se unieron a la toxina Vip3Aa se encontraron 
en la pastilla y se visualizaron por medio de SDS-PAGE (carril 3) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 21. Ensayo de pull-down de la toxina Vip3Aa. SDS-PAGE al 12%. Carriles: 1) 
Marcador de peso molecular, 2) Toxina Vip3Aa acoplada a las perlas, 3) Pull-down. T1 a T6 
son los fragmentos que se cortaron para el análisis de secuenciación. 
 
 
46 
 
6.2.5.2.1 Identificación de proteínas de membrana que interactúan 
con la toxina activada Vip3Aa. 
 
El carril 3 de la Figura 21 se cortó y se envió al Laboratorio de Proteómica 
del IBT-UNAM para la secuenciación de péptidos por espectrometría de 
masas LC-MS/MS. Se identificaron 65 proteínas. Se analizó la distribución 
celular de cada una de ellas (Figura 22). El 12% de las proteínas 
identificadas corresponde a la categoría de proteínas de membrana, 
dado que son de principal interés como potenciales receptores para la 
toxina Vip3Aa se enlistaron en la Tabla. 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 22. Localización celular de las proteínas identificadas para la toxina 
Vip3Aa. 
 
Tabla 7. Resultado de la secuenciación LC-MS/MS del pull-down de la 
toxina Vip3Aa y las proteínas de las BBMV de S. frugiperda. 
Fracción Peso 
molecular 
(kDa) 
Número de acceso Descripción 
T3 58 A0A2H1X1180 ATP-binding 
cassette sub-family 
A ABCA1 
(Fragment) 
[Spodoptera 
frugiperda] 
T3 101 A0A2H1V171_SPOFR SFRICE_017317 OS 
[Spodoptera 
frugiperda] 
T7 213 A0A2H1VQE8_SPOFR SFRICE_011731 
(Fragment) OS 
[Spodoptera 
47 
 
frugiperda] 
T7 356 A0A2H1W0A8_SPOFR SFRICE_001959 OS 
[Spodoptera 
frugiperda] 
T7 54 A0A2H1WF29_SPOFR SFRICE_029377 OS 
[Spodoptera 
frugiperda] 
T7 51 A0A2H1X327_SPOFR SFRICE_040191 OS 
[Spodoptera 
frugiperda] 
 
La proteína Vip3Aa se ha estudiado por más de 20 años desde el primer 
reporte de Estruch et al., 199696, además se ha utilizado comercialmente 
como bioinsecticida en aerosol y en plantas transgénicas, sin embargo, 
comparado con la información con las toxinas Cry, referente a su 
mecanismo de acción, y en particular a los receptores de esta toxina es 
escasa. 
Estruch et al., 1996 mencionó que la toxina Vip3Aa se une a proteína de 48 
kDa en Agrotis ipsilon la cual presenta homología con tenascinas y sugiriere 
que pudiera actuar como receptor, sin embargo, no se han realizados 
estudios para aceptar o descartar esta proteína como receptor para 
Vip3Aa. Posteriormente, Singh et al.139, identificó a la proteína ribosomal S2 
en la línea celular Sf21 como proteína de unión de la toxina Vip3Aa, sin 
embargo, en el contexto celular esta proteína es intracelular, por lo tanto, 
difícilmente podría ser el receptor de la toxina Vip3Aa. 
En el año pasado, se publicaron dos artículos en los cuales se identificaron 
a las proteínas Scavenger receptor-C103 y Fibroblast Growth Factor 
Receptor104 como receptores de la toxina Vip3Aa. La identificación de 
ambas proteínas deriva de un ensayo de pull-down, la principal diferencia 
entre estos ensayos y el que sea realizó en el presente trabajo, es el modelo 
de estudio en el cual ellos se basan en una línea celular denominada Sf9 y 
en este trabajo se utilizaron BBMV a partir de S. frugiperda, esto puede 
explicar la diferencia de las proteínas identificadas, siendo el presente 
trabajo el primero

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