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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas “Análisis del mecanismo de acción de toxinas de Bacillus thuringiensis activas contra Spodoptera frugiperda” TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: Doctor en Ciencias PRESENTA: M. en C. Diana Laura Martínez de Castro Jiménez TUTOR PRINCIPAL Mario Soberón Chávez (Instituto de Biotecnología-UNAM) MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR Ernesto Ortiz Suri (Instituto de Biotecnología-UNAM) Humberto Lanz (Instituto Nacional de Salud Pública) Ciudad de México. Agosto, 2019. UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. El presente proyecto de investigación se realizó en el Departamento de Microbiología Molecular, del Instituto de Biotecnología de la Universidad Autónoma de México, bajo la dirección del Dr. Mario Soberón Chávez con el financiamiento de beca CONACYT 444978. Dedicatoria A mi par de soles, Andrea y Diego, por ser el motor más grande del mundo, los amo con todo mi ser. A mi compañero de aventuras, gracias por caminar conmigo. A mis padres, por darme la fortaleza para cumplir mis metas. A mi hermano Alfonso, gracias por apoyarme siempre. Agradecimientos A los Dres. Mario Soberón y Alejandra Bravo por brindarme la oportunidad de cursar mis estudios de posgrado en su laboratorio. A mi comité tutoral los Dres. Humberto Lanz y Ernesto Ortiz, muchas gracias por cada una de sus observaciones, por todo el tiempo dedicado, aprendí mucho de ustedes. Al comité que revisó esta tesis, los Dres. Luis Cárdenas, Guadalupe Espín, Ricardo Oropeza, Enrique Salas y Alicia Gonzales, gracias por aceptar ser parte del comité y por su cuidadosa revisión. A todos mis compañeros del laboratorio por todo el tiempo compartido. Un especial agradecimiento a mis queridas amigas Iris, Leivi, Bivi, Pau y Liz, gracias por brindarme su amistad y apoyo a lo largo de los años, las quiero mucho. A todo Don Sergio, Chelita y Don Alex, elementos claves para el laboratorio, su trabajo es fundamental para nosotros. A la Unidad de Docencia por apoyarnos en todos los trámites y hacerlo más sencillo. Índice I. Índice de figuras………………………………………………………………………… 3 II. Índice de tablas………………………………………………………………………... 4 III. Abreviaturas……………………………………………………………………………. 5 IV. Resumen………………………………………………………………………………... 6 V. Abstract…………………………………………………………………………………. 8 1. Introducción…………………………………………………………………………… 10 1.1 Bacillus thuringiensis………………………………………………………………. 10 1.2 Toxinas Cry…………………………………………………………………………. 10 1.3 Mecanismo de acción………………………………………………………….. 12 1.3.1 Activación proteolítica……………………………………………………… 13 1.3.2 Unión a receptores ………………………………………………………….. 13 1.3.2.1 APN ………………………………………………………………………… 14 1.3.2.2 ALP………………………………………………………………………… 15 1.3.2.3 Caderina…………………………………………………………………. 15 1.3.2.4 Transportadores ABC…………………………………………………… 16 1.3.3 Formación de oligómero…………………………………………………… 17 1.4 Resistencia………………………………………………………………………….. 18 2. Antecedentes………………………………………………………………………… 20 2.1 Toxina Cry1AbMod………………………………………………………………… 20 2.1.1 Toxicidad de la toxina Cry1AbMod ……………………………………… 21 2.2 Toxina Vip3Aa……………………………………………………………………… 22 2.2.2 Mecanismo de acción de la toxina Vip3Aa……………………………… 23 3. Hipótesis………………………………………………………………………………… 24 4. Objetivos……………………………………………………………………………….. 24 4.1 Objetivo general…………………………………………………………………… 24 4.2 Metas………………………………………………………………………………… 24 5. Materiales y método………………………………………………………………… 25 5.1 Preparación y purificación de toxinas………………………………………… 25 5.1.1 Toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod………………………………………………. 25 5.1.2 Toxina Vip3Aa……………………………………………………………………. 25 5.1.2.1 Cultivo e inducción…………………………………………………………… 25 5.1.2.2 Lisis y purificación…………………………………………………………….. 26 5.1.2.3 Purificación por columna de níquel……………………………………… 26 5.2 Aislamiento de BBMV……………………………………………………………… 26 5.3 Bioensayos…………………………………………………………………………… 27 5.4 Biotinilación de toxinas……………………………………………………………. 27 5.5 Ligand blot…………………………………………………………………………… 27 5.6 Oligomerización……………………………………………………………………… 28 5.7 Pull-down…………………………………………………………………………….. 28 2 5.7.1 Unión de la protoxina Vip3Aa y las toxinas Cry1AbMod y Vip3Aa con las perlas de agarosa………………………………………………………… 28 5.7.2 Unión de la toxina/protoxina a las proteínas de las BBMV……………… 28 6. Resultados y discusión………………………………………………………………. 30 6.1 Mecanismo de toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod en Spodoptera frugiperda 30 6.1.1 Obtención y solubilización de las toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod…….. 31 6.1.2 Toxicidad de Cry1Ab y Cry1AbMod en S. frugiperda………………….. 31 6.1.3 Ensayos de activación proteolítica………………………………………… 31 6.1.4 Unión de las toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod en BBMV de S. frugiperda……………………………………………………………………… 32 6.1.5 Pull-down de la toxina activada Cry1AbMod………………………….. 34 6.1.5.1 Identificación de proteínas de membrana que interactúan con Cry1AbMod. ……………………………………………………………… 35 6.1.6 Oligomerización……………………………………………………………….. 37 6.2 Mecanismo de la toxina Vip3Aa en Spodoptera frugiperda…………….. 40 6.2.1 Producción y purificación de la toxina Vip3Aa…………………………... 40 6.2.2 Toxicidad de la proteína Vip3Aa…………………………………………….. 41 6.2.3 Análisis del procesamiento in vitro de la toxina Vip3Aa………………… 42 6.2.4 Análisis de proteínas de unión de BBMV con Vip3Aa por Ligand blot. 43 6.2.5.1 Análisis de proteínas de unión de BBMV con la protoxina Vip3Aa por pull-down………………………………………………………………… 44 6.2.5.1.1 Identificación de proteínas de membrana que interactúan con la protoxina Vip3Aa…………………………………………….. 44 6.2.5.2 Análisis de proteínas de unión de BBMV con la toxina activada Vip3Aa por pull-down………………………………………………………. 45 6.2.5.2.1 Identificación de proteínas de membrana que interactúan con la toxina activada Vip3Aa. 46 7. Conclusiones…………………………………………………………………………… 49 8. Perspectivas …………………………………………………………………………… 50 9. Apéndice ……………………………………………………………………………….. 51 10.Referencias ……………………………………………………………………………. 55 3 I. Índice de figuras Figura 1 Espectro de acción de las d-endotoxinas Bt (Cry y Cyt). Figura 2 Estructura tridimensional de la toxina Cry1Aa. Figura 3 Mecanismo de acción de toxinas Cry. Figura 4 Procesamiento de las toxinas Cry1A. Figura 5 Mecanismos de resistencia en insectos. Figura 6 Potencia de las toxinas Cry1AMod contra sus versiones nativas en diversos lepidópteros. Figura 7 Potencia de las toxinas Cry1AMod contra sus versiones nativas en S. frugiperda. Figura 8 Mecanismo de acción de la toxina Vip3Aa. Figura 9 Expresión y solubilización de toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod. Figura 10 Activación proteolítica delas protoxinas Cry1Ab y Cry1AbMod. Figura 11 Unión de las toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod a BBMV de S. frugiperda. Figura 12 Pull-down de la toxina Cry1AbMod y las proteínas de las BBMV de Sf. Figura 13 Localización celular de las proteínas identificadas del pull- down de la toxina Cry1AbMod. Figura 14 Ensayos de oligomerización de las toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod. Figura 15 Expresión de la toxina Vip3Aa. Figura 16 Purificación de la proteína Vip3Aa. Figura 17 Procesamiento de la protoxina Vip3Aa con tripsina, quimiotripsina y jugo gástrico. Figura 18 Ligand blot de la protoxina Vip3Aa y toxinas activadas con tripsina y jugo gástrico Figura 19 Ensayo de pull-down de la protoxina Vip3Aa. Figura 20 Localización celular de las proteínas identificadas para la protoxina Vip3Aa. Figura 21 Ensayo de pull-down de la toxina Vip3Aa. Figura 22 Localización celular de las proteínas identificadas para la toxina Vip3Aa. 4 II. Índice de tablas Tabla 1 Especies de insectos resistentes aislados en el campo. Tabla 2 Bioensayo de las protoxinas Cry1Ab y Cry1AbMod contra S. frugiperda (Población IBT-UNAM). Tabla 3 Resultado de la secuenciación LC-MS/MS del pull-down de la toxina Cry1AbMod y las proteínas de membrana de las BBMV de S. frugiperda. Tabla 4 Receptores de toxinas Bt en Spodoptera spp. Tabla 5 Bioensayo de las protoxinas Vip3Aa contra S. frugiperda (Población UAEM). Tabla 6 Resultado de la secuenciación LC-MS/MS del pull-down de la protoxina Vip3Aa y las proteínas de las BBMV de S. frugiperda. Tabla 7 Resultado de la secuenciación LC-MS/MS del pull-down de la toxina Vip3Aa y las proteínas de las BBMV de S. frugiperda. 5 III. Abreviaturas Bt Bacillus thuringiensis PFT Toxinas formadoras de poro APN Aminopeptidasa-N ALP Alcalino fosfatasa GPI Glicosilfosfatidilinositol Transportador ABC ATP-binding cassette transporter ABCC2 Transportador ABC subfamilia C2 LC50 Concentración letal media GalNac N-Acetilgalactosamina GPI Glicosilfosfatidilinositol Sf21 Línea celular 21 de Spodoptera frugiperda Sf9 Línea celular 9 de Spodoptera frugiperda CR Repetido de caderina Bt-R1 Receptor 1 de Bacillus thuringiensis S2 Línea celular de Drosophila melanogaster HI5 Línea celular de Trichoplusia ni COS-7 Línea celular de mono TMD Dominio transmembranal NBD Dominio de unión a nucleótidos BBMV Brush border membrane vesicle VIP Vegetative Insecticidal Protein IPTG Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido CnBr Bromuro de cianógeno 6 IV. Resumen Las toxinas Cry que produce Bacillus thuringiensis (Bt) son proteínas que utilizan alrededor del mundo en el control de insectos plaga en forma de aerosol o expresadas en plantas transgénicas. El desarrollo de resistencia en insectos amenaza su efectividad. El mecanismo de acción de la toxina Cry1Ab involucra una serie de pasos. El primero de ellos es la ingestión de los cristales por una larva susceptible, posteriormente se lleva a cabo la activación de la protoxina por proteasas endógenas del insecto, el fragmento tóxico o toxina activada se une a los receptores que se encuentran sobre la membrana apical del intestino medio, se han identificado la alcalino fosfatasa (ALP) y aminopeptidasa N (APN), caderina y recientemente el transportador ABCC2. Posterior de la unión, la toxina oligomeriza y es capaz de insertarse en la membrana, formando poros en la membrana celular, resultando en la muerte del insecto. Las toxinas Cry Modificadas (Cry1Ab y Cry1AbMod) tienen el potencial de contender con la resistencia, mostrando toxicidad en numerosas especies de lepidópteros susceptibles y resistentes. Sin embargo, el mecanismo de acción de las toxinas modificadas no se encuentra descrito en su totalidad. En el presente estudio, se comparó la toxicidad, activación, unión, oligomerización entre la toxina Cry1Ab y Cry1AbMod en Spodoptera frugiperda. La toxina Cry1AbMod mostró toxicidad en S. frugiperda (LC50 88 ng/cm2), la toxina Cry1Ab no fue tóxica (LC50 >2000 ng/cm2). Se comparó la proteólisis in vitro de las toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod con los tratamientos con tripsina, quimiotripsina y jugo gástrico, la toxina Cry1AbMod es más estable en los tratamientos de quimiotripsina y jugo gástrico en comparación con la toxina Cry1Ab. Los ensayos de unión mostraron que la toxina Cry1AbMod activada presentan una mayor unión comparado con la toxina Cry1Ab. La toxina Cry1AbMod se une a las aminopeptidasas N1, N3, N4 y N5. Finalmente, se identificó la formación de oligómero de la toxina Cry1AbMod activada con quimiotripsina y jugo gástrico, la toxina Cry1Ab activada no formó oligómero. La estabilidad, unión y formación de oligómero de la toxina Cry1AbMod se correlaciona con la toxicidad en Spodoptera frugiperda. Las proteínas Vip son producidas por Bt y son secretadas durante la fase de crecimiento vegetativo. La toxina Vip3Aa es la más estudiada y es tóxica contra un amplio rango de lepidópteros. Actualmente, se co-expresan toxinas Vip3Aa y Cry en cultivos transgénicos de maíz y algodón. 7 El mecanismo de acción de la toxina Vip3Aa no está del todo descrito. Se propone que posterior a su ingestión por un insecto susceptible, la protoxina de 88-90 kDa se procesa por proteasas y se produce la toxina activada de 66 kDa. La toxina se une de manera específica a receptores y es capaz de formar oligómeros que presentan actividad de formación de poro ocasionando la muerte de la larva. En el presente estudio se evaluaron diferentes pasos en el mecanismo de acción de la toxina Vip3Aa. La activación de la protoxina es más efectiva con tripsina y con el jugo gástrico de S. frugiperda que la quimiotripsina, sugiriendo que la activación in vivo es por tripsina. La toxina activada se une a un mayor número de proteínas en las microvellosidades que la protoxina y estas son diferentes entre sí. Se identificó como proteínas de unión para la protoxina al receptor lipoproteico de baja densidad, entre otras. La toxina activada se une al transportador ABCA1, entre otras proteínas. 8 V. Abstract Cry toxins produced by Bacillus thuringiensis (Bt) are proteins widely used in insect control as spray products or expressed in transgenic crops. The development of insect resistance threatens their effectiveness. The mode of action of Cry1Ab toxin involves a sequential step. The first is the crystal ingestion by susceptible larvae, following the protoxin activation by endogenous proteases, the fragment toxic or activated toxin binds to receptors in membrane apical midgut, it has been identified alkaline phosphatase (ALP) and aminopeptidase N (APN), cadherin and recently ABCC2 transporter. The toxin oligomerizes and inserts into the membrane, forming pores in the membrane cellular, resulting in the insect death. Cry modified toxins (Cry1AbMod and Cry1AbMod) have the potential to counter resistance, showed toxicity in several susceptible and resistant lepidopteran pests. However, the mode of action for the toxicity of modified toxins is not well understood. In this study, we compared the toxicity, activation, binding, and oligomerization between Cry1Ab and Cry1AbMod in Spodoptera frugiperda. The Cry1AbMod showed toxicity to Spodoptera frugiperda (LC50 88 ng/cm2), and Cry1Ab was not toxic (LC50 >2,000 ng/cm2). The in vitro proteolysis of Cry1Ab and Cry1AbMod by treatments with trypsin, chymotrypsin, and midgut juice was compared, the Cry1AbMod is more stable than Cry1Ab in chymotrypsin and midgut juice in the treatments. The protein stability, binding and oligomer formation of Cry1AbMod is correlated with toxicity to Spodoptera frugiperda.BBMV binding assays showed that the Cry1AbMod activated toxins displayed enhanced binding compared to the Cry1Ab activated toxins. Cry1AbMod toxin binds to aminopeptidases N1, N3, N4 y N5. Finally, we identified the oligomer formation by Cry1AbMod activated with chymotrypsin and midgut juice, and Cry1Ab activated toxins did not oligomerize. Vip proteins also are produced by Bt and are secreted during the vegetative growth. The Vip3Aa toxin is the most studied and is toxic against several lepidopteran species. The Vip3Aa toxin is co-expressed with Cry toxins in corn and cotton transgenic crops. The mode of action of Vip3Aa toxin it is not well understood. It has been proposed that before the ingestion by susceptible larvae, the protoxin (88-90 kDa) is processed by proteases and it produces the activated toxin (66 kDa). The toxin 9 binds to specific receptors and it is able to form oligomers that present pore formation activity leading the larvae death. In the present study, we evaluate different steps in the mode of action of the Vip3Aa toxin. The protoxin activation is more effective with trypsin and midgut juice of S. frugiperda than chymotrypsin, suggesting that the activation in vivo is by trypsin. The activated toxin binds to a major number of proteins into the microvilli than protoxin, and these proteins are different between. Low-density lipoprotein receptor was identified as a binding protein for the protoxin. The activated toxin binds to ABCA1 receptor, among other proteins. 10 1. Introducción El gusano cogollero, Spodoptera frugiperda Smith (Lepidoptera: Noctuidae) es una plaga que ocasiona pérdidas considerables en diversos tipos de cultivos; principalmente maíz, sorgo, arroz, algodón, alfalfa, entre otros1. En América, esta plaga se distribuye desde Argentina hasta Canadá2, recientemente se ha reportado su aparición en África3. Es considerada la plaga del maíz más importante en México, ocasionando pérdidas del 20-35% de las cosechas4. Con la finalidad de reducir los daños ocasionados por S. frugiperda, los agricultores aplican productos químicos como método de control, lo que ha llevado consigo a la afectación de organismos benéficos, además de generar contaminación, dejando residuos tóxicos en el aire, el suelo y el agua5. Asimismo, el uso constante de insecticidas químicos ha provocado resistencia de estos insectos6, estos insectos poseen una alta capacidad de desintoxicación mediante una batería de enzimas específicas (hidrolasas, oxidasas y citocromo P450)7,8. Una alternativa a los insecticidas químicos, es el control biológico. El insecticida con mayor éxito está basado en las proteínas que produce la bacteria Bacillus thuringiensis. Los insecticidas Bt se ha demostrado que son efectivos, altamente específicos y seguros para el medio ambiente9. 1.1 Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis (Bt), es una bacteria que se encuentra distribuida alrededor del mundo en una gran variedad de ambientes; desde el suelo, desierto, bosques, tundra, en polvo de productos agro-culturales almacenados, insectos muertos, plantas, etc.10,11,12. Esta bacteria fue aislada por primera vez en 1901 por el biólogo japonés Ishiwata Shigetane, el cual estudiaba las causas de la muerte del gusano de la seda (Bombix mori)13. En el año 1911, el científico alemán Ernst Berliner, aisló nuevamente la bacteria de muestras colectadas en Turingia, Alemania y dio el nombre a la bacteria Bt. En el año 1938, se comercializó en Francia por primera vez el biopesticida denominado “Sporine” basado en Bt. En el año 1996 se introdujeron plantas transgénicas que expresan toxinas Cry14. 1.2 Toxinas Cry Bt produce de manera natural toxinas formadoras de poro (PFT, del inglés pore forming toxins) o también denominadas -endotoxinas durante la etapa de esporulación del crecimiento de la bacteria, se clasifican en dos familias: Cry y Cyt15. Las toxinas Cry son tóxicas y específicas contra una gran variedad de insectos, como lepidópteros, coleópteros y dípteros (Figura 1). 11 Figura 1. Espectro de acción de las -endotoxinas Bt (Cry y Cyt). Las toxinas Cyt se marcan en rojo. Tomada de Palma, L. et al., 201416. Actualmente, la familia más grande de proteínas Cry, es la familia Cry de 3 dominios, son moléculas globulares que contienen tres dominios distintos. Se ha resuelto la estructura cristalográfica de nueve toxinas Cry, que incluye: Cry1Aa17, Cry1Ac18, Cry2Aa19, Cry3Aa17, Cry3Bb20, Cry4Aa21, Cry4Ba22, Cry7Ca123 y Cry8Ea24. Todas las toxinas anteriormente mencionadas, son activadas a estructuras de 65 kDa organizado en tres dominios estructurales y funcionales (Figura 2)25. El dominio I (en azul) se encuentra conformado por siete hélices alfa antiparalelas, organizadas en ramillete, la hélice alfa 5 se localiza al centro y está rodeada por hélices anfipáticas, este dominio está involucrado en la formación de poro e inserción en la membrana26. El dominio II (en amarillo) se compone de tres láminas beta antiparalelas en un arreglo de prisma, se sugiere que está involucrado en la unión con los receptores y la especificidad de las toxinas, este dominio es el más variable26. El dominio III (en rojo) también se compone de láminas beta formando un -sándwich, a este dominio se le atribuye la misma función que el dominio II26, para la toxina Cry1Ac, una asa extendida forma un sitio de unión a carbohidratos N-acetilgalactosamina (GalNac)implicado en la unión con receptores27. 12 Figura 2. Estructura tridimensional de la toxina Cry1Aa. Se muestra el dominio I en azul, Dominio II en amarillo y el Dominio III en rojo. Modificada de Palma, L. et al., 201416. 1.3 Mecanismo de acción de las toxinas Cry De manera general, se acepta que el mecanismo de acción de las toxinas Cry consiste en la ingestión de los cristales por insectos susceptibles, posteriormente hay una activación de proteolítica de la toxina. La toxina se une a receptores específicos resultando en la oligomerización e inserción en la membrana formando poros que conducen el proceso de lisis celular y finalmente la muerte del insecto (Figura 3)28. A continuación, se revisará cada paso del mecanismo de acción. Figura 3. Mecanismo de acción de toxinas Cry. Se muestran los pasos secuenciales. Los cristales proteicos se solubilizan, las protoxinas se liberan y son activadas por proteasas (café). Se da la unión del monómero (naranja) a receptores ALP (rojo) y APN (azul) favoreciendo el contacto con el receptor caderina (verde) o el transportador ABCC2 13 (rojo). La toxina oligomeriza y se une nuevamente a ALP, APN o al transportador ABCC2, el oligómero se inserta en la membrana y ocasiona la muerte de la larva. 1.3.1 Activación proteolítica Posterior a la ingestión de los cristales por los insectos susceptibles, estos se solubilizan debido a las condiciones reductoras y alcalinas presentes en los intestinos de los insectos, como consecuencia se liberan las protoxinas del cristal29. Las protoxinas son del rango de peso molecular entre 70-130 kDa y requiere que sean procesadas proteolíticamente por enzimas (principalmente tripsina y quimiotripsina) presentes en los fluidos digestivos a fragmentos de 55 a 65 kDa para tener actividad tóxica (Figura 4). La toxina activada atraviesa la membrana peritrófica y es capaz de unirse a los receptores en la superficie de las células del intestino medio. Figura 4. Procesamiento de las toxinas Cry1A. Se muestra la protoxina con los siete dominios que la conforman. Posterior a la activación con tripsinase obtiene la toxina activada. Modificada de Palma, L. et al., 201416. 1.3.2 Unión a receptores Posterior a la activación, la toxina se une a receptores anclados a la membrana. Se han descrito proteínas que interactúan secuencialmente con las toxinas Cry30. Los receptores putativos mejor caracterizados son la aminopeptidasa-N (APN), alcalino fosfatasa (ALP), caderina y recientemente, los trasportadores ABC. 14 1.3.2.1 APN Las enzimas aminopeptidasas-N (APN) son metaloproteasas de la familia M1 dependientes de zinc31. En insectos lepidópteros, se distribuyen en la membrana de las células epiteliales y se encuentran ancladas por un puente de glicosilfosfatidilinositol (GPI)32. Su principal función en los insectos es la digestión de proteínas, cortan aminoácidos neutrales del N-terminal de los polipéptidos33. Estas proteínas se han estudiado ampliamente debido a la relación en citotoxicidad que presentan con las toxinas Cry. Se ha corroborado la participación de APN en el mecanismo de acción de toxinas Cry mediante experimentos de silenciamiento, expresión del gen en organismos no susceptibles, así como la ausencia de expresión de APN en insectos resistentes a toxinas Cry. La expresión transgénica de APN en Drosophila melanogaster confirió sensibilidad a la toxina Cry1Ac, la cual de manera natural no es tóxica hacia ese organismo34. En Helicoverpa armígera se realizó el silenciamiento de APN y se observó una reducción de la mortalidad de las larvas cuando se retaron con la toxina Cry1Ac, asimismo, se transfectó la línea celular Sf21 con el gen APN y esta fue sensible a la toxina Cry1Ac, lo que confirmó que APN es receptor para la toxina Cry1Ac en ese insecto35. En Spodoptera litura se silenció APN y se observó una reducción de la toxicidad de la Cry1Ca36. Recientemente se encontró que APN1 es receptor funcional de la toxina Cry1Ca en Spodoptera frugiperda 37. Por otro lado, se ha observado que la resistencia de Trichoplusia ni hacia la toxina Cry1Ac se debe a alteraciones en el patrón de expresión de APN1 y APN638. La ausencia de la expresión de APN1 en Spodoptera exigua ocasiona resistencia a la toxina Cry1Ca39. La información anterior confirma la participación de APN en el mecanismo de acción de toxinas Cry. 1.3.2.2 ALP Las enzimas alcalino fosfatasas catalizan la hidrólisis del fosfato orgánico40. Se dividen en dos grupos de acuerdo a su localización: solubles (s-ALP) y 15 membranales (m-ALP) las cuales se encuentran en balsas lipídicas anclados por GPI40. Estas proteínas se expresan mayormente en los primeros estadios del desarrollo41. La interacción inicial de Cry1Ab con ALP es crítica para la toxicidad en M. sexta42. El silenciamiento de ALP en M. sexta es más importante que APN para la toxina Cry1Ab43. La unión de Cry1Ac con ALP de H. virescens y H. armigera involucra interacciones con GalNac44. Se ha reportado una correlación entre la disminución en la expresión de ALP y la resistencia a toxinas Cry en H. virescens, H. armígera y S. frugiperda 45. Mediante silenciamiento se confirmó que ALP2 es el receptor funcional para la toxina Cry2Aa en S. exigua 41 . 1.3.2.3 Caderina La caderina es una proteína de adhesión que depende de calcio, a diferencia de las caderinas encargadas de las uniones adherentes involucradas en la adhesión célula-célula, las caderinas que funcionan como receptores de toxinas Cry se localizan en la membrana apical de las células epiteliales columnares, tienen un peso molecular de 210 kDa y están compuestas por tres dominios: un dominio extracelular formado por 12 repetidos de caderina (CR), un dominio transmembranal y un dominio intracelular46. Se ha encontrado que es una proteína de unión en insectos lepidópteros47–50, coleópteros51 y dípteros52, las afinidades de caderina y toxinas Cry varían dependiendo el insecto. En el año 1995 se identificó la caderina como el primer receptor descrito para las toxinas Cry, se le llamó Bt-R1 (Bt receptor 1) para la toxina Cry1Ab en M. sexta53. Posteriormente, se reportó que la caderina es receptor funcional de toxinas Cry1A en Bombix mori47, Ostrinia nubilalis50 y H. virescens54. Se ha propuesto que la caderina es importante en la especificidad de las toxinas Cry1A ya que al transfectar las líneas celulares S2, COS-7 y H5 con BT-R1 estas líneas celulares se vuelven susceptibles a las toxinas Cry1A55,54. 16 Se han asociado mutaciones de caderina con la resistencia en algunas especies de lepidópteros, entre los cuales se encuentra Pectinophora gossypiella49, H. armigera48 y H. virescens56. El silenciamiento de caderina por RNA de interferencia ha demostrado que es un receptor funcional para la toxina Cry1Ab en M. sexta. También la caderina es receptor para la toxina Cry1Ca en S. exigua57 y Chilo suppressalis58. Lo anterior indica que la caderina juega un papel importante en el mecanismo de acción de las toxinas. 1.3.2.4 Transportadores ABC Los transportadores ABC (ATP binding cassette) son proteínas integrales de membrana que utilizan la energía de la hidrólisis del ATP para transportar sustratos a través de la membrana. Se compone de dos dominios transmembranales (TMD1 y TMD2) y dos dominios de unión a nucleótidos (NBD1 y NBD2). Mediante genómica comparativa de la familia de transportadores ABC en artrópodos sugiere que su función es trasportar iones y secreción de toxinas59. Se ha relacionado la resistencia de toxinas Cry a defectos en los transportadores ABC, el primer caso que se reportó corresponde a la resistencia a las toxinas Cry1Ab y Cry1Ac en H. virescens debido a una mutación en el transportador ABCC260. De manera similar, se encontró que el transportador ABCC2 es responsable de la resistencia a la toxina Cry1Ac en Plutella xylostella y T. ni61. En Japón, la resistencia de B. mori a la toxina Cry1Ab se debe a una inserción de tirosina en una asa en el transportador ABCC262. En una población resistente a la toxina Cry2Ab de H. armigera se debe a una mutación en el transportador ABCA263. La expresión heteróloga de los receptores ABCC2 y ABCB1 en la línea celular de Spodoptera frugiperda Sf9 confirió susceptibilidad a las toxinas Cry1A y Cry3, respectivamente, sugiriendo que son receptores para estas toxinas64. El silenciamiento del transportador ABCH1 en P. xylostella confirmó que es receptor para la toxina Cry1Ac65. En resumen, las toxinas Cry1A usan como receptores los transportadores ABCC2 y ABCC3, la toxina Cry8Ca usa el transportador ABCC2, ABCC3 y 17 ABCC4, la toxina Cry2A al transportador ABCA2 y finalmente la toxina Cry3Aa al transportador ABCB1. 1.3.3 Formación de oligómero La oligomerización y la formación de poro son pasos claves en la actividad de las toxinas Cry1A. Retomando el modelo de acción de toxinas Cry, se propone que la interacción del monómero de Cry1A con caderina promueve un procesamiento proteolítico en el cual se escinde la hélice -1 induciendo la oligomerización de la toxina de una masa molecular de 250 kDa aproximadamente y este oligómero presenta actividad de formación de poro28. Se ha descrito la oligomerización para toxinas activas contra distintos órdenes como lo son las toxinas Cry1, Cry3, Cry4Ba y Cry11A activas contra lepidópteros, coleópteros y dípteros66–69. Existen diversos trabajos que apoyan la formación de oligómero por medio de mutantes puntuales afectadas en la oligomerización, estructuras cristalográficas de toxinas Cry y análisis de western blot contra anticuerpos específicos para toxinas Cry1A, de los cuales se habla con mayor detalle a continuación. Se realizaron mutantes en la hélice -3, en particular la R99E en la toxina Cry1Ab, en donde se observó que esta toxina estaba afectada en la oligomerización por medio de análisisde western blot, así como la realización de bioensayos contra M. sexta en donde se observó que esta mutante no fue tóxica70. De manera similar, mutantes de la toxina Cry11Aa en la hélice -3 presentaron defectos en la formación de oligómero y toxicidad en larvas de Aedes aegypti71. Por otra parte, se han obtenido las estructuras cristalográficas de las toxinas Cry4Ba (PDB: 1W99) y Cry5Ba (PDB: 4D8M) en donde se observó una formación de un trímero en donde estaban ausentes las hélices -1 y -2 durante la proteólisis correspondiente al proceso de cristalización22,72. De manera similar, la toxina Cry4Ba mostró una organización trimérica observada por microscopia electrónica73. 18 1.4 Resistencia en insectos a toxinas Cry El uso convencional de insecticidas químicos y toxinas bacterianas para el control de insectos plaga en la agricultura global implica una presión de selección para el desarrollo de la evolución de resistencia a insecticidas74. Se tiene reporte que al menos 9 especies de insectos han desarrollado resistencia en el campo (Tabla 1). Tabla 1. Especies de insectos resistentes aislados en el campo. Especie Cultivo Toxina Ubicación Referencia <1% de individuos resistentes H. armigera Algodón Cry1Ac Australia 75 H. armigera Algodón Cry2Ab Australia 75 H. punctifera Algodón Cry2Ab Australia 76 1-6% de individuos resistentes Diatraea saccharalis Maíz Cry1Ab Estados Unidos 77 H. armigera Algodón Cry1Ac China 78 Ostrinia furnacalis Maíz Cry1Ab Filipinas 79 P. gossypiella Algodón Cry1Ac China 80 >50% de individuos resistentes H. zea Algodón Cry2Ab Estados Unidos 81 Busseola fusca Maíz Cry1Ab Sudáfrica 82 D. virgifera virgifera Maíz Cry3Bb Estados Unidos 83 H. zea Algodón Cry1Ac Estados Unidos 84 P. gossypiella Algodón Cry1Ac India 85 S. frugiperda Maíz Cry1Fa Puerto Rico 86 La resistencia a toxinas Cry se puede desarrollar por mutaciones que afecten cualquiera de los pasos del mecanismo de acción de las toxinas (Figura 5). La resistencia se puede generar por diferentes mecanismos, que van desde la alteración en la activación de las toxinas, secuestro por esterasas, respuesta inmune elevada y por la alteración en la unión de la 19 toxina de los receptores, siendo este el último mecanismo el que se asocia mayormente a resistencia a toxinas Cry87,88. Figura 5. Mecanismos de resistencia en insectos. Los principales mecanismos de resistencia están involucrados en defectos en la activación de las protoxinas, mutaciones en los receptores y cambios en el sistema inmune, entre otros. Modificado de Wu 201489. 20 2. Antecedentes 2.1 Toxina Cry1AbMod Las toxinas Cry modificadas (Cry1AbMod y Cry1AcMod) carecen de los primeros 56 aminoácidos hacia el extremo N-terminal, que corresponden a la hélice -1 y parte de la hélice -2a, estas toxinas tienen la característica que son capaces de formar oligómeros sin requerir de la interacción con caderina y son presentan toxicidad contra insectos resistentes con mutaciones ligadas a caderina u otros receptores90. Es importante mencionar que las toxinas Cry1AMod son seguras, no aumentaron su espectro de acción, ya que se requiere que el oligómero se una a los receptores anclados por GPI y se inserte en la membrana para matar a la larva91. La toxina Cry1AbMod insertada en membranas sintéticas adopta una organización trimérica observada por microscopia electrónica91. 2.1.1 Toxicidad de Cry1AbMod Como se mencionó anteriormente, las toxinas Cry1AbMod y Cry1AcMod son eficientes para contender con la resistencia en diferentes especies de lepidópteros. Sin embargo, se ha demostrado que ambas toxinas presentan una pérdida en la potencia en insectos susceptibles92 (Figura 6: barras color claro). Recientemente se encontró que la protoxina de Cry1AbMod induce eficientemente la oligomerización, no así la toxina activada Cry1AbMod, este hecho podría explicar la pérdida de potencia de las toxinas Cry1AbMod contra insectos susceptibles93. Se propuso que no sólo los insectos blanco podrían tener diferentes receptores, también podrían tener diferente contenido de proteasas que afectan directamente la proporción de protoxina/toxina activada y este efecto se vería reflejado directamente en la toxicidad93. 21 Figura 6. Potencia de las toxinas Cry1AMod contra sus versiones nativas en diversos lepidópteros. La potencia se obtuvo dividiendo la LC50 de la toxina nativa entre la LC50 de su correspondiente toxina modificada para la línea resistente (barras en color oscuro) o línea susceptible (barras en color claro). Se reportan las siguientes especies: Plutella xylostella (Px), Ostrinia nubilalis (On), Ditraea saccharalis (Ds), Helicoverpa armigera (Ha), Pectinophora gossypiella (Pg) y Trichoplusia ni (Tn). Modificado de Tabashnik et al., 2011. En Brasil, la especie S. frugiperda ha desarrollado resistencia al maíz-Bt que expresa la toxina Cry1Fa86. Datos recientes indican que las toxinas Cry1AbMod y Cry1AcMod resultaron ser altamente efectivas contra esta población, en contraste con sus contrapartes nativas (Figura 7), sin embargo, no se ha analizado el mecanismo de acción de las toxinas Cry1AMod en esta especie94. 22 Figura 7. Potencia de las toxinas Cry1AMod contra sus versiones nativas en S. frugiperda. La potencia se obtuvo dividiendo la LC50 de la toxina nativa entre la LC50 de su correspondiente toxina modificada para la línea resistente (barras en color oscuro) o línea susceptible (barras en color claro). Todos los valores son mayores a 1 indicando que la toxina modificada fue más potente que la toxina nativa. Modificado de Monnerat et al., 2015 94. Las toxinas Cry1AMod son eficaces contra las especies de lepidópteros resistentes P. gossypiella y P. xylostella, que presentan mutaciones en el receptor caderina y el transportador ABCC2, respectivamente. Recientemente, se determinó que la toxina Cry1AcMod se une con menor afinidad a las BBMV de las dos poblaciones de insectos mencionadas anteriormente, adicionalmente, ambas toxinas presentan defectos en la oligomerización. Lo anterior, sugiere que la pérdida de potencia de las toxinas Cry1AMod se debe a una oligomerización menos eficiente95. 2.2 Toxina Vip3Aa Las proteínas insecticidas vegetativas (Vip, del inglés vegetative insecticidal proteins) son producidas por Bt durante la fase vegetativa de la bacteria96. Existen hasta el momento 4 familias de toxinas Vip (Vip1, 2, 3 y 4)97. Las toxinas Vip no presentan homología en secuencia de aminoácidos con ninguna proteína Cry descrita al momento97. Esta característica, las posicionan como candidatas importantes para el control de plagas de lepidópteros y para combatir insectos resistentes. La toxina Vip3Aa es la más estudiada y es tóxica contra un amplio rango de lepidópteros, entre los cuales destacan; Agrotis ipsilon, Spodoptera frugiperda, Heliothis virescens, Helicoverpa zea99, las cuales son especies de importancia agronómica. Actualmente, se co-expresan toxinas Vip3Aa y Cry en cultivos transgénicos de maíz y algodón100. 23 2.2.1 Mecanismo de acción de Vip3Aa El mecanismo de acción de la toxina Vip3Aa no está del todo claro (Figura 8). Se propone que posterior a su ingestión por un insecto susceptible, la protoxina de 88-90 kDa (Figura 8-1) se procesa por proteasas y se produce la toxina activada de 66 kDa (Figura 8-2). La toxina se une de manera específica a receptores, los cuales hasta el momento no se han descrito con precisión (Figura 8-3). La toxina Vip3Aa es capaz de formar oligómeros y estos presentan actividad de formaciónde poro (Figura 8-4) ocasionando la muerte de la larva97. Es importante mencionar que la proteína Vip3Aa no comparte sitios de unión con las toxinas Cry101 y que son altamente activas contra especies en las cuales las toxinas Cry son poco susceptibles o en algunas que no presentan actividad102, por lo cual se propone que son mecanismos de acción diferentes. Figura 8. Mecanismo de acción de la toxina Vip3Aa. Modificada de Chakroun et al., 2016 97. Recientemente, se reportaron como receptores para la protoxina Vip3Aa el Scavenger receptor-C103 y Fibroblast Growth Factor Receptor104 en las líneas celulares Sf9 y Sf21, hasta el momento no se han reportado receptores en insectos. 24 3. Hipótesis Las toxinas Cry1AbMod y Vip3Aa no comparten receptores funcionales en la microvellosidad media apical en Spodoptera frugiperda. 4. Objetivos 4.1 Objetivo general: Entender la diferencia entre el mecanismo de acción de las toxinas Cry1Ab, Cry1AbMod y Vip3Aa en Spodoptera frugiperda. 4.2 Metas: - Determinar la toxicidad de Cry1Ab, Cry1AbMod y Vip3Aa en S. frugiperda. - Analizar la activación proteolítica de la protoxinas Cry1Ab, Cry1AbMod y Vip3Aa con tripsina, quimiotripsina y jugo gástrico de S. frugiperda. - Evaluar la oligomerización de las toxinas activadas Cry1Ab y Cry1AbMod en presencia de BBMV de S. frugiperda. - Identificar las proteínas de unión en las BBMV de las toxinas Cry1AbMod y Vip3Aa en S. frugiperda. 25 5. Materiales y métodos 5.1 Preparación y purificación de toxinas 5.1.1 Toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod La cepa Bt 407- que producen las toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod se crecieron en cajas HCT suplementadas con eritromicina (10 µg/ml) a 30°C hasta que se observó la completa esporulación (alrededor de 72 horas). Se realizaron diversos lavados de la mezcla de espora/cristal en el amortiguador 300 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1 mM PMSF. Las inclusiones cristalinas se solubilizaron en un amortiguador alcalino (100 mM Na2CO3, 0.1% -mercaptoetanol, pH 10.5) durante 1 hora a 37°C. Las toxinas activadas se obtuvieron diferentes tratamientos de las protoxinas solubles. Cry1Ab-T; Cry1Ab activada con tripsina (1:50), Cry1AbMod-T; Cry1AbMod activada con tripsina (1:50), Cry1Ab-Q; Cry1Ab activada con quimiotripsina (1:50), Cry1AbMod-Q; Cry1AbMod activada con quimiotripsina (1:50), Cry1Ab-JG; Cry1Ab activada con jugo gástrico (1%) y Cry1AbMod-JG; Cry1AbMod activada con jugo gástrico(1%) de S. frugiperda. La activación se llevó a cabo en un amortiguador de carbonatos 100 mM (pH 8.6) durante 1 hora a 37°C. Las toxinas activadas se purificaron mediante cromatografía de intercambio iónico Mono Q ion-exchange column (Pharmacia Biotech). La toxina se eluyó con un gradiente de 50-500 NaCl en un amortiguador de carbonatos 20 mM (pH 10.8). Se determinó la concentración de proteínas de las toxinas activadas utilizando el método Bradford utilizando BSA como estándar. Las toxinas purificadas se analizaron por SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie. 5.1.2 Toxina Vip3Aa En el laboratorio se encuentra disponible la cepa de E. coli BL21 con el plásmido integrado para la expresión heteróloga de la proteína Vip3A. El gen vip3A fue previamente clonado en el vector pET28a flanqueado por una marca de 6 histidinas en los extremos N-terminal que favorecen su posterior purificación. 5.1.2.1 Cultivo e inducción Se reactivó la cepa Vip3Aa-E. coli BL21 en medio sólido LB suplementado con kanamicina (50 µg/ml) a 37°C. Se realizó un pre-cultivo de 50 ml de LB líquido suplementado con kanamicina (50 µg/ml) toda la noche a 37°C. A la mañana siguiente se inoculó 500 ml de medio 2xTY líquido suplementado con kanamicina (50 µg/ml) con 5 ml del pre-cultivo en un matraz Fernbach estéril. El matraz se incubó a 30°C hasta que alcanzó una densidad óptica leída a 600 nm (OD600) de 26 0.9-1. Una vez que se confirmó la OD600 se dejó el matraz a temperatura ambiente 5 minutos y se indujo el cultivo con IPTG 0.5 mM y se incubó nuevamente a 30°C. Se recuperó el cultivo en frascos Nalgene 250 ml y se centrifugó a 4,000 rpm a 10°C durante 15 minutos. Se descartó el sobrenadante. Las pastillas se resuspendieron en 80 ml de agua estéril y se centrifugó a 10,000 rpm a 10°C. Se descartó el sobrenadante y se confirmó la correcta expresión de la toxina por SDS-PAGE. Se almacenaron las alícuotas a -70°C. 5.1.2.2 Lisis y purificación Se descongeló una alícuota añadiendo 9 ml de PBS 1X. Se transfirió el lisado en un vial de vidrio y se sonicó en hielo tres veces durante 50 segundos a 100% de amplitud. Se centrifugó a 10,000 rpm durante 15 minutos. Se recuperó el sobrenadante y se pasó el lisado por un filtro de 45 micras. 5.1.2.3 Purificación por columna de níquel Se utilizó una columna empacada con 1 ml de resina Ni-agarosa equilibrada con PBS 1X. Se pasó el lisado tres veces por la columna. Se lavó la columna con 50 ml de PBS/ imidazol 35 mM. Se eluyó con 5 ml de PBS/ imidazol 250 mM. Se recuperaron las fracciones. Se eluyó con 2 ml de PBS/imidazol 500 mM. Se terminó de lavar con 5 ml de PBS/imidazol 500 mM. Se equilibró nuevamente la columna con PBS 1X y la columna se almacenó con PBS/Etanol al 10%. Se confirmó la obtención de la toxina por SDS-PAGE. 5.2 Aislamiento y purificación de BBMV Se disectaron los intestinos (parte media) de larvas de tercer instar de Spodoptera frugiperda y se utilizaron para preparar las BBMV con el método de precipitación diferencial con MgCl2. Se tomaron 2.5 g de tejido y se descongeló em hielo. El tejido se colocó en un tubo de vidrio estéril que contenía 25 ml de solución I (Manitol 300 mM, EGTA 5 mM, EDTA 1 mM, HEPES 10 mM, TRIS-HCl 17 mM, DTT 2 mM, PMSF 1 mM, pH 7.4). El tejido se disgregó con un embolo estéril montado en un homogenizador Black & Decker U-114 tipo FV dando 9 golpes a 2,250 rpm. Se agregó un volumen de 25 ml de MgCl2 24 mM al tubo y se cubrió la boca de este con parafilm. Se mezcló suavemente mediante inversión y la muestra se incubó en hielo durante 15 minutos. Se centrifugó a 4,500 rpm por 15 minutos a 4°C en un rotor de ángulo fijo JA-20 (Beckman) utilizando una centrifuga J2-HS (Beckman). La pastilla fue descartada y el sobrenadante fue transferido a otro tubo estéril. Se centrifugó a 16,000 rpm durante 30 minutos a 4°C usando el equipo anteriormente descrito. El sobrenadante fue descartado y la pastilla resultante fue resuspendida en 10 ml de solución I más 10 ml de MgCl2 24 mM. Se repitieron los dos pasos de centrifugación anteriores para obtener una segunda pastilla al centrifugar a 27 16,000, la cual se resuspendió en solución I diluida en agua estéril 1:1 fría. Se dieron tres golpes adicionales a 2,250 rpm. La concentración de proteína se determinó por el método de Lowry, DC protein assay dye method (Bio-Rad) utilizando BSA como estándar. Se almacenaron a -70°C hasta su uso. 5.3 Bioensayos Se determinó la toxicidad de las protoxinas Cry1Ab, Cry1AbMod y Vip3Aa por el método de contaminación de superficie con larvas neonatas de S. frugiperda. Se incorporaron concentraciones de 1 a 2000 ng/cm2 en la superficie de la dieta contenida en placas de 24 pozos (Corning Glas Works), se utilizó agua como control negativo. Las placas se incubaron a 28°C con 65% ± 5% de humedad relativa y un fotoperiodo de luz-oscuridad de 16:8 h. Se realizaron por triplicado para calcular la concentración letal 50 (LC50) con el programa probit (Probit software). 5.4 Biotinilación de toxinas Las toxinas activadas de Cry1Ab (Cry1Ab-T, Cry1Ab-Q y Cry1Ab-JG) y Cry1AbMod (Cry1AbMod-T, Cry1AbMod-Q y Cry1AbMod-JG), así como la protoxina Vip3Aa y la toxina activada Vip3Aa se dializaron en un amortiguador boratos 100 mM, pH 8 yse utilizó el kit de marcaje con biotina (Roche Molecular Biochemicals). Se incubaron 0.6 mg de toxinas con 20 µl de biotina. Se dejó la reacción 1 hora a temperatura ambiente. Se empacó una columna de sephadex G25 y se equilibró la columna con 10 ml de PBS 1X. La biotina libre se removió por filtración en gel. Se recuperó la toxina marcada y se verificó el marcaje por western blot. 5.5 Ligand blot Se incubaron 10 µg de BBMV en un amortiguador de unión (PBS 1X, 0.1% BSA, 0.1% Tween 20) con 15 nM de toxinas Cry biotiniladas (Cry1Ab-T, Cry1Ab-Q, Cry1Ab-JG, Cry1AbMod-T, Cry1AbMod-Q and Cry1AbMod-JG) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugaron a 14,000 rpm durante 10 min para remover la toxina que no se unió. Se realizaron tres lavados con el amortiguador de unión. Finalmente, la pastilla se resuspendió en 10 µl de PBS con 3 µl de amortiguador de Laemmli. Las muestras se hirvieron y se separaron por SDS-PAGE y se electrotransfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF). Se revelaron las proteínas utilizando estreptavidina acoplada a peroxidasa (1:5000). La membrana se visualizó con el sustrato Super Super SignalTM chemiluminescence substrate (Pierce). 28 5.6 Oligomerización Se incubaron 2 y 4 µg de cada toxina activada con 10 µg de BBMV en un amortiguador carbonatos (pH 10.5). El volumen total fue 50 µl, la reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante una hora. Se utilizó una muestra que solo contenía BBMV como control negativo. Posteriormente se añadió 3 µl de amortiguador Laemmli y las muestras se calentaron a 50°C durante 3 minutos. Las muestras se separaron por SDS-PAGE al 8% y se electrotransfirieron una membrana de PVDF y se revelaron por western blot. La membrana de PVDF se bloqueó con leche descremada al 5% (peso/volumen) en un amortiguador de lavado (PBS 1X pH 7.4, Tween 20 al 0.1% durante una hora a temperatura ambiente. La membrana se lavo 3 veces con amortiguador de lavado. Las toxinas se detectaron con un anticuerpo policlonal anti-Cry1Ab (diluido 1:30,000; 1 hora). La visualizaron se llevó a cabo con un anticuerpo secundario contra conejo acoplado a peroxidasa (Santa Cruz Biotechnology) (1:25,000 dilution; 1h), seguido del sustrato Super SignalTM chemiluminescence substrate (Pierce). 5.7 Pull-down 5.7.1 Unión de la protoxina Vip3Aa y las toxinas Cry1AbMod y Vip3Aa con las perlas de agarosa Las toxinas Cry1AbMod y Vip3Aa, además de la protoxina Vip3Aa se incubaron con perlas de agarosa activadas con CNBr (General Electric) en un amortiguador de carbonatos (NaHCO3 100 mM, NaCl 500 mM, pH 8.3) toda la noche a 4°C en agitación. Se centrifugaron a 13,000 rpm durante 5 minutos a 4°C. Se evaluó la eficiencia de la unión cuantificando el sobrenadante por Bradford. Se bloquearon los sitios activos añadieron 150 µl de amortiguador de bloqueo (Tris-HCl 100 mM pH 8) y se incubó durante dos horas a temperatura ambiente con agitación. Posteriormente se hicieron tres ciclos de lavados: cada ciclo es un lavado con 150 µl de amortiguador 1 (100 mM de ácido acético/acetato de sodio pH 4, 500 mM de NaCl), se centrifugó a 13,000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Seguido de amortiguador de lavado 2 (100 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM de NaCl), se centrifugó a 13,000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Estos ciclos se repitieron tres veces. 5.7.2 Unión de la toxina/protoxina a las proteínas de las BBMV Se solubilizaron 1 mg de BBMV en el amortiguador de solubilización (Tritón-X100 1%, NaHPO4/NaH2PO4 50 mM, NaCl 50 mM, EGTA 5 mM, EDTA 5 mM, PMSF 1 mM, pH 7.5) a 950 rpm una hora a 4°C. Se ultracentrifugaron a 30,000 rpm durante 30 minutos a 4°C. Se recuperó el sobrenadante y se determinó la concentración de 29 proteína por el método de Bradford. Se incubaron 150 µl de toxina con 300 µl de proteínas solubles de las BBMV durante 1 hora a 4°C. Posteriormente las muestras se centrifugaron a 13,000 rpm durante 15 minutos a 4°C. Se recuperó la pastilla y se lavó dos veces con 500 µl de PBS, NaCl 1 mM. Posteriormente, se hicieron tres lavados con 500 µl de PBS. Las proteínas que continuaban unidas a las toxinas/protoxina se disociaron con temperatura, hirviendo las muestras 10 minutos en 30 µl de amortiguador de carga (Tris-HCl 100 mM, DTT 200 mM, SDS 4%, bromofenol blue 0.2%, glicerol 20%, pH 6.8). El sobrenadante se separó mediante SDS-PAGE al 15% y se cortó el carril para su procesamiento en la Unidad de Proteómica, IBT-UNAM para su posterior identificación MS/MS. 30 6. Resultados y discusión 6.1 Parte I: Mecanismo de toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod en Spodoptera frugiperda 6.1.1 Obtención y solubilización de las toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod. Las toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod se obtuvieron a partir de las cepas de Bt- Cry1Ab y Bt-Cry1AbMod, respectivamente. Se monitoreó su crecimiento durante un lapso de 72 horas hasta observar por microscopio óptico la esporulación y liberación de los cristales proteicos. Se analizó la expresión y solubilización de las proteínas obtenidas en amortiguador de carbonatos 100 mM, pH 10.5 mediante SDS-PAGE (Figura 9) en donde se observa la producción de las proteínas; en el carril 2 la banda de 135 kDa corresponde a la toxina Cry1Ab y en el carril 5 la banda de 130 kDa corresponde a la toxina Cry1AbMod. En los carriles 3 y 6 se aprecia que ambas toxinas son solubles en condiciones alcalinas, previamente descrito90,105. Figura 9. Expresión y solubilización de toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod. SDS-PAGE 10% teñido con azul de coomassie. La fecha indica la protoxina. Carriles: 1) Marcador de peso molecular, 2) Espora-cristal de Cry1Ab, 3) Fracción soluble de Cry1Ab, 4) Pastilla de Cry1Ab, 5) Espora-cristal de Cry1AbMod, 6) Fracción soluble de Cry1AbMod y 7) Pastilla de Cry1AbMod. 31 6.1.2 Toxicidad de Cry1Ab y Cry1AbMod en S. frugiperda. Se evaluó la actividad de las protoxinas Cry1Ab y Cry1AbMod mediante la realización de bioensayos (Tabla 2), por el método de contaminación de superficie, contra en larvas neonatas de S. frugiperda pertenecientes a la población de México (IBT-UNAM). Los bioensayos se realizaron por triplicado y los resultados se analizaron con el programa estadístico PROBIT. Se observó que la protoxina Cry1Ab no fue tóxica (LC50 >2000 ng/cm2), en contraste con la protoxina de Cry1AbMod encontrando una LC50 de 88 ng/cm2. Tabla 2. Bioensayo de las protoxinas Cry1Ab y Cry1AbMod contra S. frugiperda (Población IBT-UNAM). Protoxina LC50 (ng/cm2) Cry1Ab >2000 Cry1AbMod 88 [62-116] Límite de confianza del 95%. 6.1.3 Ensayos de activación proteolítica. Como se mencionó previamente, en el mecanismo de acción de las toxinas Cry, las protoxinas de 135 kDa se procesan a un fragmento tóxico de 65 kDa106. Se analizó la activación de las protoxinas Cry1Ab y Cry1AbMod con las proteasas tripsina, quimiotripsina y con jugo gástrico de S. frugiperda (Figura 10). En el carril 2 se observa el tratamiento de la protoxina Cry1Ab con tripsina dando como resultado una banda de 65 kDa, en el carril 3 el tratamiento con quimiotripsina y el carril 4 con jugo gástrico en donde se observa también la banda de 65 kDa, correspondiente al monómero de Cry1Ab. En el carril 5 está el tratamiento de la protoxina Cry1AbMod con tripsina obtenido un patrón de bandeo característico de esta toxina, previamente reportado90 y los carriles 6 y 7 corresponden al tratamiento con quimiotripsina y jugo gástrico, respectivamente. 32 Figura 10. Activación proteolítica de las protoxinas Cry1Ab y Cry1AbMod. SDS-PAGE 10% teñido con azul de coomassie. Carriles: 1) Marcador de pesomolecular, 2) Cry1Ab activada con tripsina (1:50), 3) Cry1Ab activada con quimiotripsina (1:50), 4) Cry1Ab activada con jugo gástrico de Sf (1%), 5) Cry1AbMod activada con tripsina (1:50), 6) Cry1Ab activada con quimiotripsina (1:50) y 7) Cry1Ab activada con jugo gástrico de Sf (1%). En el lumen de los intestinos de las larvas se encuentra una gran diversidad de enzimas digestivas107. Las serin proteasas son las principales enzimas que se encuentran ahí y se ha observado que juegan un papel importante en el procesamiento de las toxinas Cry108. En el año 2006, se reportó la composición de proteasas en el jugo gástrico de Spodoptera spp., el cual se encuentra compuesto por: quimiotripsina (85%), tripsina (7%), aminopeptidasa (5%), elastasa (1%) y carboxipeptidasa (1%)109, se puede apreciar que la toxina Cry1Ab es menos estable en los tratamientos con quimiotripsina y jugo gástrico (carriles 3 y 4, respectivamente) en comparación con tripsina (carril 2). Por otro lado, la toxina Cry1AbMod es estable en ambos tratamientos quimiotripsina y jugo gástrico (carriles 6 y 7), estos datos concuerdan con lo reportado por Srinivasan et al., 2006109, por lo cual se observa que la composición de proteasas en el jugo gástrico es similar al reportado, además que sugiere que la activación de la toxina está dada por una proteasa tipo quimiotripsina. 6.1.4 Unión de las toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod en BBMV de S. frugiperda. Por lo general, si una toxina es letal en algún insecto, esta se une de manera específica y saturable a las BBMV110. Este tipo de unión indica que las toxinas se unen a un número limitado de sitios definidos en las BBMV. Se evaluó la unión de las toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod activadas con los 33 diferentes tratamientos (tripsina, quimiotripsina y jugo gástrico de Sf) y marcadas con biotina a BBMV de S. frugiperda a una concentración fija de 15 nM. La Figura 11 muestra el resultado de la unión de las toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod. Se puede apreciar que ambas toxinas, de los diferentes tratamientos, se unen a las BBMV. Dado que se observa mayor intensidad en la unión de la toxina Cry1AbMod (carriles 6 y 7) se podría sugerir que esta toxina se une con mayor afinidad a las BBMV respecto a la toxina Cry1Ab (carriles 2-4). Figura 11. Unión de las toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod a BBMV de S. frugiperda. Western blot detectado con estreptavidina acoplada a peroxidasa, dilución 1:80,000. Carriles: 1) Marcador de peso molecular, 2) Toxina Cry1Ab activada con tripsina, 3) Toxina Cry1Ab activada con quimiotripsina, 4) Toxina Cry1Ab activada con jugo gástrico, 5) Toxina Cry1AbMod activada con tripsina, 6) Toxina Cry1AbMod activada con quimiotripsina, 7) Toxina Cry1AbMod activada con jugo gástrico y 8) Control negativo. La protoxina Cry1Ab no es tóxica para S. frugiperda, la toxina activada mostró una unión baja en comparación con la toxina Cry1AbMod. En reportes previos, se ha analizado la unión de la toxina Cry1Ab activada hacia las BBMV de S. frugiperda, la conclusión de estos estudios es que a pesar que no es tóxica es capaz de unirse e interactúa de manera no específica con la microvellosidad y que esta unión no se relaciona con toxicidad111,112,113. Por otro lado, la toxina Cry1AbMod activada con quimiotripsina y con jugo gástrico mostraron una unión mayor en contraste con la toxina Cry1Ab, esto pudiera deberse a que la deleción del amino- terminal induce cambios conformacionales que favorece la exposición de residuos que interactúan con las proteínas de la microvellosidad de S. frugiperda. Las diferencias en unión se correlacionan con la actividad de las toxinas. 34 6.1.5 Pull-down de la toxina Cry1AbMod e identificación de proteínas. El ensayo de pull-down es un método in vitro que se utiliza para determinar la interacción física entre dos o más proteínas114. Este ensayo permite obtener información de interacciones proteína-proteína desconocidas o corroborar las interacciones provenientes de otras técnicas (ej. Co- inmunopreciptación)114. Es parecido a la Inmunoprecipitación, la diferencia radica en que se utiliza una “proteína presa” en lugar de un anticuerpo115. Para determinar las proteínas de unión en las BBMV de S. frugiperda con la toxina Cry1AbMod, se realizó un ensayo de pull-down (Figura 12 ), en primer lugar, se activó la proteína Cry1AbMod con jugo gástrico de S. frugiperda y la toxina activada se acopló a perlas de agarosa funcionalizadas con CnBr. Posteriormente, la proteína inmovilizada se incubó con las proteínas solubles de las BBMV. Las proteínas pertenecientes a las BBMV que se unen a la toxina Cry1AbMod se separaron por medio de centrifugación. Finalmente, las proteínas que se unieron a la toxina Cry1AbMod se encuentran en la pastilla y se visualizaron por medio de SDS-PAGE (carril 3). Figura 12. Pull-down de la toxina Cry1AbMod y las proteínas de las BBMV de Sf. SDS-PAGE 12% teñido con azul de coomassie. Carriles: 1) Marcador de peso molecular, 2) Toxina Cry1AbMod acoplada a las perlas de agarosa, 3) Pull-down. 6.1.5.1 Identificación de proteínas de membrana que interactúan con Cry1AbMod. El carril 3 de la Figura 12 se cortó y se envió al Laboratorio de Proteómica del IBT-UNAM para la secuenciación de péptidos por espectrometría de 35 masas LC-MS/MS. Se identificaron 27 proteínas en total. Se analizó la distribución celular de cada una de ellas (Figura 13). El 72% de las proteínas identificadas corresponde a la categoría de proteínas de membrana, dado que son de principal interés como potenciales receptores para la toxina Cry1AbMod se enlistaron en la Tabla. Figura 13. Localización celular de las proteínas identificadas del pull-down de la toxina Cry1AbMod. Tabla 3. Resultado de la secuenciación LC-MS/MS del pull-down de la toxina Cry1AbMod y las proteínas de membrana de las BBMV de S. frugiperda. Fracción Identidad Número de acceso Descripción 1 100% A0A0U2WS26_SPOFR Aminopeptidasa N1[Spodoptera frugiperda] 100% A0A0U2WES6_SPOFR Aminopeptidasa N4 [Spodoptera frugiperda] 100% A0A0U2WB66_SPOFR Aminopeptidasa N3 [Spodoptera frugiperda] 100% A0A194Q3Q9_PAPXU Transportador de azúcar [Papilio xuthus] 99% A0A1A9FDK2_LELAM Canal iónico [Lelliottia amnigena] 98% A0A0L7L7N1_9NEOP Transportador de azúcar [Operophtera brumata] 100% A0A076VDI4_SPOEX Aminopeptidasa N5 [Spodoptera exigua] 100% Q4G6A5_SPOEX Aminopeptidasa N1[Spodoptera exigua] 2 100% A0A0U2WES6_SPOFR Aminopeptidasa N4 [Spodoptera frugiperda] 36 100% A0A076VDI4_SPOEX Aminopeptidasa N5 [Spodoptera exigua] 100% Q4G6A5_SPOEX Aminopeptidasa N1[Spodoptera exigua] 3 100% A0A0U2WS26_SPOFR Aminopeptidasa N1[Spodoptera frugiperda] 100% A0A0U2WES6_SPOFR Aminopeptidasa N4 [Spodoptera frugiperda] 4 99% I0E0A6_MANSE VMP46 [Manduca sexta] 100% A0A0U2WES6_SPOFR Aminopeptidasa N4 [Spodoptera frugiperda] Del análisis de LC-MS/MS destaca la identificación de las aminopeptidasas N1, N3, N4 y N5, como posibles receptores de Cry1AbMod en Sf (México, IBT-UNAM). Para corroborar si las aminopeptidasas anteriormente mencionadas son receptores funcionales de la toxina Cry1AbMod se tendrían que realizar ensayos de RNA de interferencia para evaluar la posible participación de cada proteína, esta estrategia no se continuó debido a la pérdida de esta población en el insectario del laboratorio y al reemplazo de otra población de S. frugiperda con diferente susceptibilidad a la toxina Cry1AbMod. Actualmente, se cuenta con poca información acerca de las moléculas que son receptores funcionales involucrados en la unión de las toxinas de Bt en Spodoptera spp., en comparación con otras especies de insectos. La identificación de los receptores funcionales se ha realizado principalmente medianteestudios de RNA de interferencia 116. La Tabla 4 resume los receptores que se han identificado para las toxinas de Bt en Spodoptera spp, el artículo de doctorado fue el primer reporte de candidatos a receptores de la toxina Cry1AbMod en S. frugiperda. 37 Tabla 4. Receptores de toxinas Bt en Spodoptera spp. Especie Receptor Toxina Referencia S. litura APN Cry1C 36 S. exigua APN1 Cry1Ca 39 S. exigua APN1, APN3 y APN6 Cry1Ca 117 S. exigua Caderina Cry1Ca Cry1Ac Cry2A 57 118 S. exigua Transportador ABCC2 y ABCC3 Cry1Ac Cry1Ca 119 S. frugiperda (línea celular SF21) Proteína ribosomal S2 Vip3A 120 S. litura Proteína ribosomal S2 Vip3A 120 S. frugiperda APN1 Cry1Ca 37 6.1.6 Oligomerización La oligomerización es paso determinante dentro del mecanismo de acción de las toxinas Cry 121,122. El oligómero se ha observado mediante el contacto de las toxinas activadas con las BBMV66,91,123. También se ha obtenido con liposomas: SUV, del inglés Small Unilamellar Vesicles 124,69,121,125 o LUV, del inglés Large unilamellar vesicles 68,73 y con un fragmento que mimetiza a caderina, denominado scFv3 126–128. Se llevó a cabo un ensayo de oligomerización de las toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod activadas con los diferentes tratamientos (tripsina, quimiotripsina y jugo gástrico) con dos concentraciones de toxina (2 y 4 µg) y las BBMV de S. frugiperda (Figura 14 Panel-A y B). En la Figura 14-A no se observó la formación de oligómero de la toxina Cry1Ab en ninguna concentración. En contraste, la Figura 14-B, se observa la formación un complejo de alto peso molecular alrededor de 200 kDa para la toxina Cry1AbMod activada con jugo gástrico de S. frugiperda y quimiotripsina (carriles 2, 3, y 6). 38 Panel A Panel B Figura 14. Ensayos de oligomerización de las toxinas Cry1Ab y Cry1AbMod. Western blot, la detección se realizó un anticuerpo primario anti-Cry1A, empleado a una dilución de 1: 15,000 y un anticuerpo secundario empleado en una dilución 1: 30,000. Panel A) Toxina Cry1Ab. Carriles: 1) Marcador de peso molecular, 2) Toxina Cry1Ab activada con jugo gástrico (2 µg) en presencia de BBMV, 3) Toxina Cry1Ab activada con jugo gástrico (4 µg) en presencia de BBMV, 4) Toxina Cry1Ab activada con jugo gástrico (4 µg), 5) Toxina Cry1Ab activada con quimiotripsina (2 µg) en presencia de BBMV, 6) Toxina Cry1Ab activada con quimiotripsina (4 µg) en presencia de BBMV, 7) Toxina Cry1Ab activada con quimiotripsina (4 µg), 8) Toxina Cry1Ab activada con tripsina (2 µg) en presencia de BBMV, 9) Toxina Cry1Ab activada con tripsina (4 µg) en presencia de BBMV, 10) Toxina Cry1Ab activada con tripsina (4 µg). Panel B) Toxina Cry1AbMod. Carriles: 1) Marcador de peso molecular, 2) Toxina Cry1AbMod activada con jugo gástrico (2 µg) en presencia de BBMV, 3) Toxina Cry1AbMod activada con jugo gástrico (4 µg) en presencia de BBMV, 4) Toxina Cry1AbMod activada con jugo gástrico (4 µg), 5) Toxina Cry1AbMod activada con quimiotripsina (2 µg) en presencia de BBMV, 6) Toxina Cry1AbMod activada con quimiotripsina (4 µg) en presencia de BBMV, 7) Toxina Cry1AbMod activada con quimiotripsina (4 µg), 8) Toxina Cry1AbMod activada con tripsina (2 µg) en presencia de BBMV, 9) Toxina Cry1AbMod activada con tripsina (4 µg) en presencia de BBMV, 10) Toxina Cry1AbMod activada con tripsina (4 µg). La flecha indica el oligómero. La toxina Cry1AbMod activada con jugo gástrico y quimiotripsina formaron oligómero, su peso molecular podría sugerir la formación de un trímero, que ya se ha observado previamente para las toxinas Cry4Ba y Cry1AbMod 129, 91. La toxina Cry1AbMod activada con tripsina no se detectó la formación de oligómero, la pérdida de la capacidad de oligomerización pudiera deberse a cambios estructurales relacionados con la proteólisis, ya que el patrón de activación es diferente entre los tratamientos de tripsina comparado con los tratamientos de quimiotripsina y jugo gástrico. Se sabe que una activación incorrecta deriva en la incapacidad de formar oligómeros121 como es el caso de la toxina Cry1Ab. 39 La incapacidad de la toxina Cry1Ab de formar oligómero se correlaciona con lo observado en los datos de toxicidad. 40 6.2 Parte II: Mecanismo de la toxina Vip3Aa en Spodoptera frugiperda 6.2.1 Producción y purificación de la toxina Vip3Aa En el laboratorio se tiene la cepa de E. coli BL21 con el plásmido integrado para la expresión heteróloga de la proteína Vip3A. El gen vip3a fue previamente clonado en el vector pET28a flanqueado por una marca de 6 histidinas en los extremos N-terminal que favorecen su posterior purificación. Se llevó a cabo la cinética de la producción de la proteína Vip3Aa mediante la inducción del cultivo con IPGT y se tomaron alícuotas de distintas horas (Figura 15-A). Posteriormente, se verificó la expresión de la proteína mediante western blot utilizando un anticuerpo anti-tag his6X que reconoce la marca de histidinas (Figura 15-B). El peso molecular esperado fue de 88.5 kDa, que corresponde a la protoxina Vip3Aa. Panel A Panel B Figura 15. Expresión de la toxina Vip3Aa. Panel A) SDS-PAGE al 10%. Cinética de inducción con 0.5 mM de IPTG. Panel B) Western blot de la cinética. La flecha indica la toxina Vip3Aa. Posteriormente, se purificó la proteína Vip3Aa por cromatografía de afinidad en columna de níquel. La proteína Vip3Aa eluye, mayoritariamente, en la fracción de 250 mM de imidazol (Figura 16). 41 Figura 16. Purificación de la proteína Vip3Aa. SDS-PAGE al 10%. La fecha indica la toxina Vip3Aa. 6.2.2 Toxicidad de la proteína Vip3Aa. De manera similar a las toxinas Cry, se realizaron bioensayos por triplicado para evaluar si la proteína Vip3Aa tenía actividad en larvas neonatas de S. frugiperda. Los resultados se analizaron con el programa estadístico PROBIT y se muestran en la Tabla 5. Previamente se reportó que la concentración letal media de la toxina Vip3Aa en S. frugiperda es de 55.9 ng/cm2 130. En la población de México, se encontró que la protoxina Vip3Aa es tóxica en un rango similar al reporte previamente mencionado. Tabla 5. Bioensayo de las protoxinas Vip3Aa contra S. frugiperda (Población UAEM). Protoxina LC50 (ng/cm2) Vip3Aa 30 (16-56) Límite de confianza del 95%. 6.2.3 Análisis del procesamiento in vitro de la toxina Vip3Aa. Se ha analizado la proteólisis in vitro de la proteína Vip3Aa, principalmente, con tripsina y jugo gástrico de insectos susceptibles y no susceptibles 131-132. Se realizó la activación proteolítica de la protoxina Vip3Aa con tripsina, quimiotripsina y jugo gástrico de S. frugiperda (Figura 17), se observó que la toxina se activa con los tratamientos de tripsina y jugo gástrico. En la activación con tripsina se encontraron 3 fragmentos mayoritarios (62, 20, 22 kDa) y con jugo gástrico 4 fragmentos principales (62, 45, 22, 20 kDa). La activación con quimiotripsina es menos eficiente que los tratamientos anteriores observando mayoritariamente la protoxina. 42 Figura 17. Procesamiento de la protoxina Vip3Aa con tripsina, quimiotripsina y jugo gástrico. SDS-PAGE al 15%. Las flechas indican la protoxina y toxina, respectivamente. Debido a la similitud de los resultados del procesamiento de la protoxina Vip3Aa entre tripsina y jugo gástrico, se sugiere que la proteólisis in vivo probablemente sea llevada a cabo por una proteasa tipo tripsina. Se ha reportado que la tripsina juega un papel importanteen la formación de la toxina activada Vip3Aa133. El patrón de activación de la toxina Vip3Aa varía dependiendo la proteasa que se emplee, por ejemplo, para el tratamiento con tripsina se encuentra una banda de 62-66 kDa y el fragmento de 22 kDa corresponde al N-terminal, con el jugo gástrico se han observado 4 productos mayoritariamente 62, 45, 33 y 22 kDa, se sugiere que el fragmento activo es el de 62-66 kDa 134,98. 6.2.4 Análisis de proteínas de unión de BBMV con Vip3Aa por Ligand blot. Se han realizado diversos ensayos de ligand blot de la toxina Vip3Aa con distintos insectos lepidópteros112,120. La toxina Vip3Aa se une a proteínas con una masa molecular de 65, 55, 80, 100, 110 kDa, dependiendo del insecto135–138. Cabe mencionar que no se han encontrado similitudes, en el peso molecular, en cuanto al reconocimiento de proteínas entre las toxinas Cry1Ab, Cry1Ac y las toxinas Vip3Aa. Para realizar el ensayo de ligand blot, se marcó con biotina a la protoxina Vip3Aa y la toxina activada con tripsina, se encontraron diferencias notorias entre las proteínas de unión de la protoxina y las toxinas activadas. Para la protoxina Vip3Aa se observaron pocas bandas con menor intensidad: 50, 25, 20, 12 y 10 kDa (Figura 18- Panel A). Entre la toxina activada con tripsina reconoce 9 bandas: 70, 60, 50, 45, 40, 30, 25, 20, 10 kDa (Figura 18-Panel B), sugiriendo que la toxina activada es capaza de unirse a un número mayor de proteínas en contraste con la protoxina. 43 Panel A Panel B Figura 18. Ligand blot de la protoxina Vip3Aa y toxinas activadas con tripsina y jugo gástrico. Western blot. Panel A) Protoxina Vip3Aa y Panel B) Toxina Vip3A activada con tripsina. Las flechas indican el peso molecular de las proteínas. 6.2.5.1Análisis de proteínas de unión de BBMV con la protoxina Vip3Aa por pull-down. Se realizó el ensayo de pull-down con proteínas solubles de las BBMV de S. frugiperda y la protoxina Vip3Aa (Figura 19). Se acopló la protoxina Vip3Aa a perlas de agarosa funcionalizadas con CnBr. Posteriormente, la proteína inmovilizada se incubó con las proteínas solubles de las BBMV. Las proteínas pertenecientes a las BBMV que se unieron a la protoxina Vip3Aa se separaron por medio de centrifugación. Finalmente, las proteínas que se unieron a la protoxina Vip3Aa se encontraron en la pastilla y se visualizaron por medio de SDS-PAGE (carril 3). Figura 19. Ensayo de pull-down de la protoxina Vip3Aa. SDS-PAGE al 12%. Carriles: 1) Marcador de peso molecular, 2) Protoxina Vip3Aa acoplada a las perlas, 3) Pull-down. P1 a P5 son los fragmentos que se cortaron para el análisis de secuenciación. 44 6.2.5.1.1 Identificación de proteínas de membrana que interactúan con la protoxina Vip3Aa. El carril 3 de la Figura 19 se cortó y se envió al Laboratorio de Proteómica del IBT-UNAM para la secuenciación de péptidos por espectrometría de masas LC-MS/MS. Se identificaron 14 proteínas en total. Se analizó la distribución celular de cada una de ellas (Figura 20). El 38% de las proteínas identificadas corresponde a la categoría de proteínas de membrana, dado que son de principal interés como potenciales receptores para la protoxina Vip3Aa se enlistó en la Tabla 6. Figura 20. Localización celular de las proteínas identificadas para la protoxina Vip3Aa. Tabla 6. Resultado de la secuenciación LC-MS/MS del pull-down de la protoxina Vip3Aa y las proteínas de las BBMV de S. frugiperda. Fracción Peso molecular (kDa) Número de acceso Descripción P2 513 A0A212F9W8_DANPL Low-density lipoprotein receptor [Danaus plexippus plexippus] P2 33 A0A2A4J5D8_HELVI- DECOY Uncharacterized protein [Heliothis virescens] 45 P2 33 A0A2A4J5D8_HELVI Uncharacterized protein [Heliothis virescen] P2 95 A0A0L7LL29_9NEOP Putative heparan- alpha- glucosaminide n- acetyltransferase [Operophtera brumata] 6.2.5.2 Análisis de proteínas de unión de BBMV con la toxina Vip3Aa activada por pull-down. Se realizó el ensayo de pull-down con proteínas solubles de las BBMV de S. frugiperda y la toxina Vip3Aa activada con tripsina (Figura 21). Se acopló la ptoxina Vip3Aa a perlas de agarosa funcionalizadas con CnBr. Posteriormente, la proteína inmovilizada se incubó con las proteínas solubles de las BBMV. Las proteínas pertenecientes a las BBMV que se unieron a la toxina Vip3Aa se separaron mediante centrifugación. Finalmente, las proteínas que se unieron a la toxina Vip3Aa se encontraron en la pastilla y se visualizaron por medio de SDS-PAGE (carril 3) Figura 21. Ensayo de pull-down de la toxina Vip3Aa. SDS-PAGE al 12%. Carriles: 1) Marcador de peso molecular, 2) Toxina Vip3Aa acoplada a las perlas, 3) Pull-down. T1 a T6 son los fragmentos que se cortaron para el análisis de secuenciación. 46 6.2.5.2.1 Identificación de proteínas de membrana que interactúan con la toxina activada Vip3Aa. El carril 3 de la Figura 21 se cortó y se envió al Laboratorio de Proteómica del IBT-UNAM para la secuenciación de péptidos por espectrometría de masas LC-MS/MS. Se identificaron 65 proteínas. Se analizó la distribución celular de cada una de ellas (Figura 22). El 12% de las proteínas identificadas corresponde a la categoría de proteínas de membrana, dado que son de principal interés como potenciales receptores para la toxina Vip3Aa se enlistaron en la Tabla. Figura 22. Localización celular de las proteínas identificadas para la toxina Vip3Aa. Tabla 7. Resultado de la secuenciación LC-MS/MS del pull-down de la toxina Vip3Aa y las proteínas de las BBMV de S. frugiperda. Fracción Peso molecular (kDa) Número de acceso Descripción T3 58 A0A2H1X1180 ATP-binding cassette sub-family A ABCA1 (Fragment) [Spodoptera frugiperda] T3 101 A0A2H1V171_SPOFR SFRICE_017317 OS [Spodoptera frugiperda] T7 213 A0A2H1VQE8_SPOFR SFRICE_011731 (Fragment) OS [Spodoptera 47 frugiperda] T7 356 A0A2H1W0A8_SPOFR SFRICE_001959 OS [Spodoptera frugiperda] T7 54 A0A2H1WF29_SPOFR SFRICE_029377 OS [Spodoptera frugiperda] T7 51 A0A2H1X327_SPOFR SFRICE_040191 OS [Spodoptera frugiperda] La proteína Vip3Aa se ha estudiado por más de 20 años desde el primer reporte de Estruch et al., 199696, además se ha utilizado comercialmente como bioinsecticida en aerosol y en plantas transgénicas, sin embargo, comparado con la información con las toxinas Cry, referente a su mecanismo de acción, y en particular a los receptores de esta toxina es escasa. Estruch et al., 1996 mencionó que la toxina Vip3Aa se une a proteína de 48 kDa en Agrotis ipsilon la cual presenta homología con tenascinas y sugiriere que pudiera actuar como receptor, sin embargo, no se han realizados estudios para aceptar o descartar esta proteína como receptor para Vip3Aa. Posteriormente, Singh et al.139, identificó a la proteína ribosomal S2 en la línea celular Sf21 como proteína de unión de la toxina Vip3Aa, sin embargo, en el contexto celular esta proteína es intracelular, por lo tanto, difícilmente podría ser el receptor de la toxina Vip3Aa. En el año pasado, se publicaron dos artículos en los cuales se identificaron a las proteínas Scavenger receptor-C103 y Fibroblast Growth Factor Receptor104 como receptores de la toxina Vip3Aa. La identificación de ambas proteínas deriva de un ensayo de pull-down, la principal diferencia entre estos ensayos y el que sea realizó en el presente trabajo, es el modelo de estudio en el cual ellos se basan en una línea celular denominada Sf9 y en este trabajo se utilizaron BBMV a partir de S. frugiperda, esto puede explicar la diferencia de las proteínas identificadas, siendo el presente trabajo el primero
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