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Analisis-de-la-sobreexpresion-del-activador-transcripcional-mara-como-propuesta-para-la-produccion-recombinante-del-peptido-antimicrobiano-humano-ll-37-en-escherichia-coli

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Universidad Nacional Autónoma de México 
Facultad de Ciencias 
 
 
Análisis de la sobreexpresión del activador 
transcripcional MarA como propuesta para la 
producción recombinante del péptido antimicrobiano 
humano LL-37 en Escherichia coli. 
 
 TESIS 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
 
BIÓLOGO 
 
PRESENTA: 
ANDRÉS FERRIÑO IRIARTE 
 
DIRECTORA DE TESIS: 
QUÍM. VIVIANA ESCOBAR SÁNCHEZ 
 
MÉXICO D.F. ABRIL 2015 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
1. Datos del alumno 
Ferriño 
Iriarte 
Andrés 
54 15 13 23 
Universidad Nacional Autónoma de México 
Facultad de Ciencias 
Biología 
411002549 
2. Datos del asesor 
Quím. 
Viviana 
Escobar 
Sánchez 
3. Datos del sinodal 1 
Dr. 
Gabriel 
del Río 
Guerra 
4. Datos del sinodal 2 
Dra. 
Claudia Andrea 
Segal 
Kischinevzky 
5. Datos del sinodal 3 
Dr. 
Jorge Antonio 
García 
Álvarez 
6. Datos del sinodal 4 
M. en C. 
Alfonso José 
Vilchis 
Peluyera 
7. Datos del trabajo escrito 
Análisis de la sobreexpresión del activador transcripcional MarA como propuesta para la 
producción recombinante del péptido antimicrobiano humano LL-37 en Escherichia coli. 
83 páginas 
2015 
AGRADECIMIENTOS 
 
Agradezco a la Dra. Luisa Alba Lois y al Dr. Víctor Valdés López por aceptarme como parte de 
su equipo en el Laboratorio de Biología Molecular y Genómica. Asimismo agradezco al grupo del 
Dr. Agustino Martínez Antonio por permitirme realizar la primera fase de este proyecto en su 
laboratorio en el CINVESTAV, Irapuato. Agradezco a la Dra. María de los Angeles Cancino 
Rodezno por su apoyo técnico y por permitirme realizar parte de este proyecto en el Taller de 
Biología Molecular de la Célula I y II. 
Agradezco al Instituto de Investigaciones en Matemáticas Aplicadas y en Sistemas y a PAPIIT IN 
218611-3 por el apoyo económico necesario para llevar a cabo este proyecto. 
Agradezco a los miembros del jurado, la Dra. Claudia Segal Kischinevzky, el M. en C. Alfonso 
Vilchis Peluyera, el Dr. Jorge García Álvarez y el Dr. Gabriel del Río Guerra por tomarse el 
tiempo de revisar y corregir esta tesis. Especialmente agradezco a mi tutora, Viviana Escobar 
Sánchez, por todo su apoyo a lo largo de la realización de este proyecto. 
Expreso mi agradecimiento a los profesores del Taller de Biología Sintética, especialmente al Dr. 
Pablo Padilla Longoria quien me entusiasmó para llevar a cabo este proyecto y a Viviana Escobar 
Sánchez y a Claudia Segal Kischinevzky quienes lograron que este proyecto se concretara. 
Finalmente agradezco todos los miembros del equipo iGEM de la Facultad de Ciencias, quienes 
contribuyeron con la realización de este proyecto. 
 
 
 
RESUMEN 
 
LL-37 es un péptido antimicrobiano producido por el sistema inmune humano, el cual se ha 
estudiado recientemente como una alternativa a los antibióticos. A pesar de que la expresión 
recombinante en E. coli es uno de los medios más eficientes para la producción de proteínas, 
debido a la citotoxicidad en E. coli, la mayor parte de los sistemas de expresión para LL-37 
dependen de construcciones con proteínas de fusión solubles, lo que imposibilita su producción 
en su forma activa e incrementa el costo de producción. 
Recientemente se reportó la respuesta de cepas de E. coli que sobreexpresan MarA –un regulador 
transcripcional bacteriano que modula la expresión de genes cromosomales involucrados en 
resistencia a diversos antibióticos– retadas ante péptidos antimicrobianos, entre ellos LL-37, 
comparándolas con una cepa control. Se observó que la cepa que sobreexpresa MarA mostraba 
una susceptibilidad a LL-37 diez veces menor que la cepa control. 
Este proyecto corresponde a la primera fase experimental de un planteamiento teórico que 
propone una nueva aproximación para la producción de péptidos antimicrobianos. Utilizando 
herramientas de Biología Sintética, una disciplina que utiliza la combinación de diferentes 
secuencias genéticas para obtener organismos que realicen funciones nuevas, se desea producir 
un sistema en Escherichia coli en donde se obtenga una menor susceptibilidad al péptido 
antimicrobiano LL-37 gracias a la sobreexpresión simultánea del factor de transcripción MarA. 
Se realizaron las construcciones genéticas para expresar ambas secuencias proteicas, MarA y LL-
37, se analizó si están siendo debidamente expresadas y se observó si existen modificaciones 
fenotípicas en el organismo. Se logró una sobreexpresión adecuada del factor de transcripción 
MarA, observando el fenotipo de resistencia múltiple a antibióticos, sin embargo, la expresión de 
LL-37 en E.coli aun no ha sido lograda. 
 
 
ABREVIATURAS 
 
Å .......................................... Ångströms 
aa ......................................... Aminoácidos 
Acr ....................................... Resistencia a actiflavina 
ADB .................................... Agarose Dissolving Buffer, buffer para disolver agarosa 
DNA ................................... Ácido desoxirribonucleico 
iGEM .................................. International Genetically Engineered Machine 
IPTG .................................. Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido 
kDa ...................................... kiloDalton 
L ........................................... Loose 
mar ...................................... Resistencia múltiple a antibióticos 
MBP .................................... Proteína de unión a maltosa 
mRNA ................................ Ácido ribonucleico mensajero 
NK ...................................... Natural killer 
nm ....................................... Nanómetros 
nt .......................................... Nucleótido 
O .......................................... Open 
PBS ..................................... Phosphate buffered saline, buffer salino de fosfatos 
PCR ..................................... Polymerase chain reaction, reacción en cadena de la polimerasa 
PMSF .................................. Phenylmethylsulfonyl fluoride, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 
RBS ..................................... Ribosome binding site, Sitio de unión a ribosoma 
RFC ..................................... Request for comments 
RNAsa ................................ Ribonucleasa 
rpm ...................................... Revoluciones por minuto 
rRNA .................................. Ácido ribonucleico ribosómico 
S ........................................... Svedberg 
SDS ..................................... Dodecilsulfato sódico 
T .......................................... Tight 
TEMED ............................. N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina 
TLR ..................................... Toll-like receptors 
 
 
ÍNDICE 
1. Introducción .................................................................................. 1	
  
1.1. Expresión de proteínas recombinantes en E. coli ........................................................ 1	
  
1.1.1. Número de copias y mantenimiento del plásmido ............................................................. 1	
  
1.1.2. Promotores ........................................................................................................................... 2	
  
1.1.3. Traducción ...........................................................................................................................2	
  
1.1.4. Plegamiento ......................................................................................................................... 3	
  
1.1.5. Proteínas de fusión .............................................................................................................. 3	
  
1.2. Biología Sintética .......................................................................................................... 4	
  
1.2.1. Origen de la Biología Sintética ............................................................................................ 4	
  
1.2.2. Estandarización y dispositivos genéticos ........................................................................... 5	
  
1.2.3. BioBricks .............................................................................................................................. 5	
  
1.3. Péptidos antimicrobianos ............................................................................................. 7	
  
1.3.1. Catelicidinas ........................................................................................................................ 8	
  
1.3.2. Características del péptido antimicrobiano LL-37 .............................................................. 8	
  
1.3.3. Estructura de LL-37 .......................................................................................................... 10	
  
1.3.4. Mecanismo de acción ...................................................................................................... 11	
  
1.4. Resistencia múltiple a antibióticos en E. coli ............................................................. 12	
  
1.4.1. Activador transcripcional MarA ........................................................................................ 13	
  
1.4.2. Mecanismo de acción de MarA ....................................................................................... 13	
  
1.4.3. Estructura de MarA ........................................................................................................... 14	
  
1.5. Bomba de eflujo AcrAB-TolC ..................................................................................... 15	
  
1.5.1. Mecanismo de acción ...................................................................................................... 15	
  
2. Antecedentes .............................................................................. 17	
  
2.1. Relación con la resistencia al péptido antimicrobiano LL-37 .................................... 17	
  
2.2. Relación de AcrAB-TolC con LL-37 ........................................................................... 17	
  
2.3. LL-37 recombinante con actividad antimicrobiana al expresarse en P. pastoris ...... 18	
  
2.4. LL-37 recombinante con actividad lítica al expresarse en E. coli .............................. 19	
  
2.5. Bomba AcrAB-TolC para la expulsión de desechos intracelulares ........................... 19	
  
2.6. Aumento de la resistencia a la producción recombinante de geraniol mediante la 
sobreexpresión de MarA .................................................................................................... 20	
  
 
3. Justificación ................................................................................ 21	
  
4. Objetivos ...................................................................................... 22	
  
4.1. Objetivos ..................................................................................................................... 22	
  
5. Materiales y Métodos ................................................................. 23	
  
5.1. Plásmidos .................................................................................................................... 23	
  
5.1.1. Bioparte MarA ................................................................................................................... 23	
  
5.1.2. Bioparte LL-37 .................................................................................................................. 24	
  
5.1.3. Bioparte pLacI .................................................................................................................. 24	
  
5.1.4. Bioparte pBad-AraC ......................................................................................................... 25	
  
5.1.5. Bioparte RBS ..................................................................................................................... 25	
  
5.1.6. Bioparte GFP ..................................................................................................................... 26	
  
5.1.7. pGLO ................................................................................................................................. 26	
  
5.2. Oligonucleótidos ......................................................................................................... 26	
  
5.3. Medios de cultivo y cepas .......................................................................................... 27	
  
5.4. Preparación de células de Escherichia coli competentes con calcio ........................ 27	
  
5.5. Transformación de Escherichia coli por choque térmico ........................................... 28	
  
5.6. Minipreparación de plásmidos ................................................................................... 28	
  
5.7. Cuantificación de DNA en nanoespectrofotómetro ................................................... 32	
  
5.8. Digestiones de DNA con enzimas de restricción ....................................................... 29	
  
5.9. Electroforesis de DNA en geles de agarosa ............................................................... 30	
  
5.10. Extracción de fragmentos de DNA de geles de agarosa ......................................... 30	
  
5.11. Ligación de fragmentos de DNA .............................................................................. 31	
  
5.12. Verificación por PCR de los plásmidos ensamblados ............................................. 31	
  
5.13. Preparación de extractos proteicos de E. coli ......................................................... 32	
  
5.14. SDS-PAGE (método de Laemmli) ............................................................................. 33	
  
5.15. Antibiogramas por el método de difusión en agar ................................................... 34	
  
5.16. Curvas de crecimiento .............................................................................................. 34	
  
 
5.17. Secuenciación ........................................................................................................... 33	
  
5.18. Análisis estadísticos .................................................................................................. 35	
  
6. Resultados y discusión .............................................................. 36	
  
6.1. Diseño y construcción de biopartes ........................................................................... 36	
  
6.2. Caracterización de la construcción pLacI-RBS-MarA ............................................... 43	
  
6.2.1. Cambios en el perfil de expresión de proteínas .............................................................. 43	
  
6.2.2. Cambios en el nivel de resistencia a antibióticos ............................................................ 46	
  
6.3. Caracterización de la construcción pBAD-AraC-RBS-LL-37 .................................... 54	
  
6.3.1. Curvas de crecimiento ...................................................................................................... 54	
  
7. Conclusiones .............................................................................. 57	
  
8. Perspectivas ................................................................................ 58	
  
9. Referencias ................................................................................. 59	
  
10. Anexos .......................................................................................64	
  
 
 
ÍNDICE DE FIGURAS 
Figura 1.1. Sistema estándar RFC 10 de los Biobricks ............................................................ 6	
  
Figura 1.2. Representación del procesamiento típico de una catelicidina ................................. 9	
  
Figura 1.3. Naturaleza anfipática de LL-37 ............................................................................. 10	
  
Figura 1.4. Esquemas de las interacciones celulares asociadas a LL-37 ............................... 11	
  
Figura 1.5. Organización del locus mar en Escherichia coli .................................................... 12	
  
Figura 1.6. Diagrama de listón para el complejo RNA polimerasa-MarA-DNA ........................ 14	
  
Figura 1.7. Mecanismo de transporte rotacional de AcrB ...................................................... 16	
  
Figura 5.1. Ensamblaje estándar de los BioBricks .................................................................. 29	
  
Figura 6.1. Construcción pLacI-RBS-MarA ............................................................................ 37	
  
Figura 6.2. Construcción pBad-AraC-RBS-LL-37 .................................................................. 38	
  
Figura 6.3. Construcción pLacI-RBS-GFP ............................................................................. 39	
  
Figura 6.4. Construcción pBad-AraC-RBS-LL-37 .................................................................. 40	
  
Figura 6.5. Electroforesis mostrando los productos de PCR de las biopartes utilizadas ......... 41	
  
Figura 6.6. Gel de poliacrilamida con las fracciones solubles de MarA ................................... 43	
  
Figura 6.8. Gel de poliacrilamida con las fracciones insolubles de MarA ................................ 44	
  
Figura 6.8. Gel de poliacrilamida con luz ultravioleta con muestras de GFP ........................... 45	
  
Figura 6.9. Antibiograma de ampicilina .................................................................................. 47	
  
Figura 6.10. Antibiograma de kanamicina .............................................................................. 48	
  
Figura 6.11. Sensibilidad a diferentes cantidades de ampicilina ............................................. 50	
  
Figura 6.12. Sensibilidad a diferentes cantidades de kanamicina ........................................... 51	
  
Figura 6.13. Sensibilidad a ampicilina sin el antibiótico de selección ...................................... 52	
  
Figura 6.14. Sensibilidad a kanamicina sin el antibiótico de selección .................................... 53	
  
Figura 6.15. Monitoreo del crecimiento bacteriano con el plásmido LL-37. ........................... 54	
  
Figura 6.16. Estrías para probar la producción de GFP ......................................................... 55	
  
Figura 6.17. Diagrama que ilustra la secuenciación de las partes .......................................... 56	
  
Figura 6.18. Secuencias de pBad-AraC-RBS, de pGLO y del operón de arabinosa .............. 56	
  
 
 
ÍNDICE DE ANEXOS 
 
Anexo 1. Fragmento de la secuencia del plásmido que contiene marA .................................. 64	
  
Anexo 2. Mapa de restricción del plásmido que contiene a la bioparte MarA ......................... 65	
  
Anexo 3. Fragmento de la secuencia del plásmido que contiene la bioparte LL-37 ............... 66	
  
Anexo 4. Mapa de restricción del plásmido que contiene a la bioparte LL-37 ........................ 66	
  
Anexo 5. Fragmento de la secuencia del plásmido que contiene la bioparte pLacI ................ 67	
  
Anexo 6. Mapa de restricción del plásmido que contiene a la bioparte pLacI ......................... 67	
  
Anexo 7. Fragmento de la secuencia del plásmido que contiene la bioparte pBad-AraC ....... 69	
  
Anexo 8. Mapa de restricción del plásmido que contiene a la bioparte AraC+pBad ............... 70	
  
Anexo 9. Fragmento de la secuencia del plásmido que contiene la bioparte RBS .................. 71	
  
Anexo 10. Mapa de restricción del plásmido que contiene a la bioparte RBS ........................ 71	
  
Anexo 11. Fragmento de la secuencia del plásmido que contiene la bioparte GFP ................ 73	
  
Anexo 12. Mapa de restricción del plásmido que contiene a la bioparte GFP ........................ 73	
  
 
 
1	
  
1. INTRODUCCIÓN 
1.1. Expresión de proteínas recombinantes en E. coli 
Escherichia coli es uno de los sistemas más atractivos para la expresión heteróloga de proteínas 
gracias a su capacidad para crecer rápidamente y a densidades altas en sustratos convenientes. 
Aunque no se puede asegurar que el producto de un gen recombinante alcance niveles altos y sea 
biológicamente activo –debido a problemas de solubilidad o a modificaciones postraduccionales– 
se ha optimizado notoriamente su rendimiento y versatilidad, creando un organismo modelo para 
la producción de proteínas, del cual se ha documentado muy bien sus técnicas de transformación, 
fermentación y rendimiento de producción proteica, a diferencia de otros organismos. A 
continuación se revisan los aspectos más importantes que deben ser considerados para la 
expresión de proteínas en este organismo. 
1.1.1. Número de copias y mantenimiento del plásmido 
Para garantizar una buena expresión, generalmente se clona el DNA heterólogo dentro de 
plásmidos multicopia: entre 15 y 60 copias aquellos derivados de pMB1/ColE1 o de hasta 
algunos cientos de copias como los pUC derivados de pMB1. Cuando se producen proteínas 
tóxicas para el hospedero, con la consecuencia de reducir su tasa de crecimiento, o bien al cultivar 
las células a altas densidades o en procesos continuos, una de las mejores formas para evitar la 
pérdida de los plásmidos es incorporar en los plásmidos genes de resistencia a antibióticos y 
suplementar al medio de cultivo con antibióticos. 
Una alternativa a los plásmidos es la inserción directa del gen heterólogo dentro del cromosoma 
de E. coli. Sin embargo, experimentalmente no se ha explotado ampliamente esta estrategia ya que 
el número de copias en el hospedero es menor a la alcanzada por los plásmidos (Baneyx, 1999). 
 
 
2	
  
1.1.2. Promotores 
Para poder controlar el inicio de la transcripción se necesita de un promotor, el cual es una región 
de DNA adyacente a un gen la cual promueve la transcripción constitutivamente o bajo 
inducción. En el caso de E. coli, el operón lac ha servido como paradigma de la regulación génica 
en los procariontes, por lo que muchos promotores utilizados para la transcripción de genes 
heterólogos derivan de elementos regulatorios de este operón. A pesar de que el promotor lac es 
relativamente débil y no suele utilizarse para una expresión alta de polipéptidos, es muy utilizado 
para expresar proteínas con cierto nivel de toxicidad, debido a que se puede controlar la 
transcripción mediante la inducción por isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) (Baneyx, 
1999). No obstante, la fuga transcripcional del promotor lac representa un problema para la 
producción de proteínas de membrana u otras proteínas con alta toxicidad para el hospedero, por 
lo que el promotor de arabinosa, el cual presenta niveles de fuga transcripcionales menores al del 
promotor lac, constituye una alternativa para la producción de este tipo de proteínas. Este sistema 
utiliza L-arabinosa como inductor, la cual es un azúcar de bajo costo. 
Aunque se puede regular la expresión por araBAD al variar la concentración de L-arabinosa, 
existe una amplia heterogeneidad en la población celular, con algunas células completamente 
inducidas y otras que no se inducen en lo absoluto (Siegele, 1997). Esta variación poblacional 
depende de la expresión diferencial de los transportadores de arabinosa, por lo que se necesitaría 
crear una cepa capaz de sintetizar constitutivamente los transportadores de arabinosa o descubrir 
un inductor que no los utilice para poder controlar conexactitud los niveles de expresión de 
proteínas mediante el promotor araBAD (Hashemzadeh-Bonehi, 1998). 
1.1.3. Traducción 
Para iniciar la traducción en E. coli se requiere de una secuencia complementaria al extremo 3' de 
la subunidad 16S del rRNA (sitio de unión a ribosoma), seguida de un codón de inicio 
(usualmente AUG). Aunque el espacio óptimo entre estos dos elementos es de 8 nt, la traducción 
se ve severamente afectada por variaciones en esta distancia, ya que la estabilidad de las 
estructuras secundarias del mRNA que se encuentran entre el sitio de unión al ribosoma y el 
codón de inicio pueden reducir dramáticamente la expresión génica al interferir con el ribosoma 
(Ringquist, 1992). 
 
 
3	
  
Las diferencias en el uso de codones entre procariontes y eucariontes pueden también tener un 
gran impacto en la expresión de proteínas heterólogas. Por ejemplo, los codones de arginina, 
AGA y AGG se encuentran con poca frecuencia en E. coli, mientras que en eucariontes son muy 
comunes. La presencia de estos codones en genes heterólogos afectan los niveles de acumulación 
de proteínas, de mRNA y de estabilidad en el plásmido; incluso en ciertos casos, pueden inhibir la 
síntesis de proteínas y el crecimiento celular (Zahn, 1996). 
1.1.4. Plegamiento 
La sobreproducción de proteínas heterólogas en el citoplasma de E. coli suele acompañarse de un 
mal plegamiento y de la formación de agregados insolubles conocidos como cuerpos de 
inclusión. Aunque la formación de cuerpos de inclusión puede facilitar la purificación de 
proteínas, puede que no se obtenga un rendimiento alto de producto biológicamente activo. Un 
procedimiento usual para disminuir la formación de cuerpos de inclusión se logra al disminuir la 
temperatura de incubación, y las aproximaciones más recientes involucran el uso de proteínas 
asistentes como chaperonas o “foldasas” (disulfuroisomerasas) (Baneyx, 1999). 
1.1.5. Proteínas de fusión 
Históricamente las proteínas de fusión surgieron como respuesta a la necesidad de purificar y 
estabilizar a las proteínas, así como de acoplar las actividades de las enzimas a una determinada 
vía metabólica. Hoy en día también son utilizadas para mejorar la solubilidad de proteínas 
heterólogas que de otra forma se agregarían en cuerpos de inclusión. La razón por la cual las 
proteínas de fusión facilitan el plegamiento de proteínas heterólogas es porque éstas adquieren 
rápidamente su conformación nativa al salir del ribosoma y promueven el plegamiento correcto 
de las unidades subsecuentes mediante reacciones de isomerización que suceden simultáneamente 
con la traducción. Existen sistemas de fusión comercialmente disponibles como la MBP (Maltose 
Binding Protein o proteína de unión a maltosa) y la tiorredoxina que sirven para aumentar la 
solubilidad de la proteína además de poder ser utilizadas como etiqueta de afinidad y la glutatión 
S-transferasa que puede ser utilizada para purificar a la proteína mediante inmunoprecipitación 
(Prinz, Aslund, Holmgren, & Beckwith, 1997). 
 
 
4	
  
1.2. Biología Sintética 
El presente trabajo pretende plantear las bases para el diseño de un sistema biológico en el que se 
manipule una vía de resistencia múltiple a antibióticos en Escherichia coli y la producción 
recombinante de un péptido antimicrobiano humano en el mismo hospedero, por lo que resulta 
conveniente utilizar herramientas de la Biología Sintética. Esta disciplina se enfoca en el diseño y 
la construcción de nuevos componentes biológicos a partir de modelos, evaluándolos mediante 
herramientas de la biotecnología y la biología molecular, siendo este aspecto computacional la 
diferencia con la ingeniería genética en el enfoque científico moderno. 
La Biología Sintética tiene como objetivo extender o modificar la conducta de los organismos 
para que realicen nuevas funciones y se ha enfocado en la creación y perfeccionamiento de 
dispositivos genéticos y módulos, que favorezcan la investigación de fenómenos naturales dentro 
de la Biología y generen una gran variedad de aplicaciones (Andrianantoandro, Basu, Karig, & 
Weiss, 2006; Purnick & Weiss, 2009). 
1.2.1. Origen de la Biología Sintética 
El modelo del operón lac y el desarrollo de la tecnología del DNA recombinante dieron paso a los 
inicios de la Ingeniería Genética, iniciando una nueva etapa dentro de la biología experimental 
(Andrianantoandro et al., 2006). En 1978 Szybalksi y Skalka postularon que las nucleasas de 
restricción no sólo permitirían el análisis de genes individuales y una fácil construcción de DNA 
recombinante, sino que también permitirían el comienzo de la era de la Biología Sintética, en 
donde además de analizar y describir a los genes, se construirían y evaluarían nuevos arreglos 
genéticos (Endy, 2005). 
A finales del siglo XX surgieron varios intentos para estandarizar la forma en que se combinan 
diferentes fragmentos de DNA, resultando en el método de los BioBricks, un estándar en el que 
fragmentos de DNA son llamados biopartes, secuencias con una función definida que pueden ser 
combinadas de diferentes formas utilizando sitios de restricción estandarizados (Shetty, Endy, & 
Knight, 2008). Si la Biología Sintética es un campo totalmente nuevo o no es una cuestión 
debatible y se puede cuestionar si realmente es una disciplina apartada de la Ingeniería Genética y 
la Biotecnología o si sólo es una extensión de éstas. 
 
 
5	
  
1.2.2. Estandarización y dispositivos genéticos 
La estandarización es de gran importancia para establecer las reglas y especificaciones que 
requiere una disciplina, además de que permite unificar criterios y métodos para ser utilizados por 
diferentes grupos de investigación. 
La noción de dispositivo es una abstracción basada en procesos físicos que permiten la 
descomposición de sistemas en partes básicas funcionales. Los dispositivos biológicos procesan 
señales de entrada para producir señales de salida regulando el flujo de información, realizando 
funciones metabólicas y biosintéticas, e interaccionando con otros dispositivos y sus ambientes 
(Andrianantoandro et al., 2006). Los biólogos sintéticos diseñan sistemas complejos combinando 
biopartes, las unidades de diseño básicas que representan funciones biológicas, ya sean 
regulatorias (como un promotor de la expresión génica), traduccionales (como un sitio de unión a 
ribosoma), o post-traduccionales (un marco abierto de lectura que codifique para una proteína) 
(Helman, Lim, Pincus, & Sommovilla, 2007). La mayoría de las aplicaciones en la Biología 
Sintética requieren de diferentes dispositivos que trabajen a la par, utilizando estrategias de 
clonación simples para ensamblar las biopartes requeridas en un plásmido, antes de ser 
transformadas dentro de un organismo (Helman et al., 2007). 
Un módulo es un grupo de dispositivos con funciones interconectadas que realizan tareas 
complejas. La dificultad de construir módulos con diversos dispositivos naturales radica en que la 
evolución los ha optimizado para que actúen en sus contextos naturales, por lo que pueden no 
funcionar cuando se conectan con otros dispositivos en contextos artificiales (Andrianantoandro 
et al., 2006). 
1.2.3. BioBricks 
El estándar de los BioBricks se ha vuelto cada vez más común gracias a la facilidad que aportan sus 
mecanismos de clonación y porque sus partes y módulos se encuentran catalogados en el Registry 
of Standard Biological Parts, una base de datos auspiciada por el Instituto Tecnológico de 
Massachusetts (MIT) que provee acceso gratuito a un conjunto de secuencias genéticas con 
funciones biológicas básicas que pueden ser utilizadas para programar sistemas biológicos 
sintéticos. Cualquiera puede contribuir, diseñar o mejorar las partes almacenadas en el registro y 
se puede tener acceso al DNA al participar en el congreso iGEM (International Genetically 
 
 
6	
  
Engineered Machine), cuyo objetivo es fomentarel desarrollo del registro y de la Biología Sintética. 
Estos sistemas hacen uso de una combinación específica de enzimas de restricción que permiten 
unir genes de una forma iterativa y aprovechan la flexibilidad que da la síntesis de genes para 
eliminar y añadir sitios de restricción. Entre los sistemas estandarizados, el RFC10 (por la 
nomenclatura utilizada por la BioBrick Fundation, también conocido como “el estándar de 
Knight”), es por mucho el más utilizado en Biología Sintética para unir biopartes (Castro, 2011). 
Las partes en el RFC10 están flanqueadas por sitios de restricción que forman un prefijo y un 
sufijo. En el extremo 5' se encuentran los sitios de restricción para las enzimas EcoRI, NotI y 
XbaI, mientras que en el extremo 3' se encuentran los de SpeI, NotI y PstI (figura 1.1). El principio 
de este sistema es cortar los plásmidos de interés con enzimas de restricción para liberar una 
bioparte, preparar un vector, ligar esta bioparte con el vector, transformarlo en células 
competentes y corroborar que el proceso se haya realizado correctamente mediante el análisis por 
electroforesis de una reacción de PCR o de una reacción de digestión. De forma adicional se han 
añadido bases entre los sitios de restricción para inhibir la metilación accidental, que afectaría la 
actividad de las endonucleasas. El diseño del sistema de Knight permite unir una secuencia de 
DNA en frente o detrás de otra, de manera independiente del contenido de las partes, 
manteniendo asimismo los sitios de restricción. De esta forma, la construcción no es seriada y 
pueden realizarse varios ensamblajes simultáneamente (Castro, 2011). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1.1. Sistema estándar RFC 10 de los Biobricks. Se muestra la ubicación de los sitios de restricción de 
un prefijo y un sufijo en una bioparte en dos esquemas diferentes A y B (modificada de de la Fuente 
Colmenares, 2013). 
 
 
7	
  
1.3. Péptidos antimicrobianos 
Parte del sistema inmune de los eucariontes está compuesto por barreras físicas y moléculas 
capaces de inhibir microorganismos para evitar infecciones de patógenos, entre estas moléculas se 
encuentran los péptidos antimicrobianos. La mayor parte de estos péptidos son moléculas 
catiónicas con regiones cargadas y regiones hidrofóbicas separadas espacialmente, siendo estos 
rasgos estructurales los que determinan su mecanismo de acción (Bals, 2000; Vandamme, 
Landuyt, Luyten, & Schoofs, 2012). 
Los péptidos antimicrobianos pueden inhibir la biosíntesis de proteínas, de ácidos nucleicos y de 
la pared celular del microorganismo invasor; además son quimiotácticos para leucocitos, 
atrayéndolos al sitio de infección o inflamación. Adicionalmente se ha demostrado que los 
péptidos antimicrobianos son capaces de unirse a lipopolisacáridos para neutralizarlos y 
promover la angiogénesis y la cicatrización (Duplantier & van Hoek, 2013). 
Los péptidos antimicrobianos difieren en tamaño, secuencia de aminoácidos y motivos 
estructurales. Usualmente el producto traduccional primario de los péptidos antimicrobianos es 
un prepropéptido consistente de una secuencia señal en el extremo N-terminal con el retículo 
endoplasmático como destino, un prosegmento y un péptido catiónico en el extremo C-terminal 
con actividad antimicrobiana posterior al corte. El prosegmento usualmente es aniónico en carga 
y se le han propuesto varias funciones biológicas, entre ellas el correcto funcionamiento del 
extremo C-terminal, el tráfico intracelular y la inhibición de la actividad del péptido maduro. El 
propéptido es cortado durante etapas posteriores en el procesamiento intracelular o después de 
su secreción al espacio extracelular (figura 1.2) (Bals, 2000). 
A pesar de que los péptidos antimicrobianos han co-evolucionado con bacterias durante millones 
de años, hasta ahora no se ha descrito un mecanismo de resistencia generalizado hacia ellos; esto 
implica una ventaja potencial para el uso de los péptidos antimicrobianos como alternativa a otros 
antibióticos (Duplantier & van Hoek, 2013). 
 
8 
 
1.3.1. Catelicidinas 
Las catelicidinas (nombradas así por su habilidad para inhibir a la proteasa catepsina L) son un 
grupo extenso y diverso de péptidos antimicrobianos que contienen un dominio N-terminal 
denominado dominio catelina. La familia de las catelicidinas muestra una gran diversidad de 
secuencia, la cual reside en la separación del péptido activo de la secuencia conservada N-
terminal, ocasionando que las catelicidinas sean péptidos antimicrobianos estructuralmente 
conservados con α-hélices anfipáticas, pero sin secuencias conservadas (Duplantier & van Hoek, 
2013). Se han identificado 56 miembros de la familia de las catelicidinas en un amplio rango de 
organismos: peces, anfibios, reptiles y mamíferos. El hecho de que se encuentren tan conservadas 
evolutivamente sugiere una gran relevancia para el sistema inmune de estos organismos. Sin 
embargo, sólo recientemente en la evolución, las catelicidinas han adoptado un papel 
inmunoestimulatorio e inmunomodulatorio (Duplantier & van Hoek, 2013; Kościuczuk et al., 
2012; Vandamme et al., 2012). 
1.3.2. Características del péptido antimicrobiano LL-37 
LL-37 es el único péptido antimicrobiano humano de la familia de las catelicidinas y muestra 
actividad antimicrobiana hacia varias bacterias patógenas para el humano tanto Gram negativas 
(como Pseudomonas aeruginsa, Salmonella typhimurium y Escherichia coli) como Gram positivas (como 
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis y Listeria monocytogenes) en concentraciones 
submicromolares (MIC, <10µg/ml) (Turner, Cho, Dinh, Waring, & Lehrer, 1998), por lo que hay 
un gran interés en producir este péptido para aplicaciones farmacéuticas (Reddy KVR, Yedery 
RD, 2004). 
LL-37 es producido por diferentes tipos de células en el ser humano; es expresado 
constitutivamente en neutrófilos (Sørensen, Arnljots, Cowland, Bainton, & Borregaard, 1997), 
linfocitos NK (Natural Killer)(Büchau et al., 2010), mastocitos (Di Nardo, Vitiello, & Gallo, 2003) 
y es almacenado como su precursor en gránulos. Otras células del sistema inmune innato que 
expresan catelicidinas son las células dendríticas, los monocitos y los macrófagos (Vandamme et 
al., 2012). La expresión de LL-37 en los neutrófilos se retroalimenta positivamente, generando 
altas concentraciones de este péptido en el sitio de la inflamación. Esta descarga de LL-37 genera 
una fuerte respuesta inmune, capaz de terminar rápidamente con la infección. 
 
9 
 
La activación de los TLR(s) (Toll-like receptors) y/o una alteración en el estado de las citosinas, 
causado por una infección o daño celular, provoca la activación de la desgranulación de la célula, 
liberando el precursor inactivo hCAP18 (de 18 kDa y 170 aa) al medio extracelular, donde es 
procesado por la proteasa 3 en los neutrófilos o la calicreína en los queratinocitos para generar el 
péptido LL-37 (de 37 aa) en su forma activa. También se ha reportado que en la superficie de la 
piel, LL-37 es degradado por serín-proteasas en fragmentos más pequeños que pueden conservar 
su actividad antimicrobiana, pero que pierden sus efectos inmunomodulatorios e 
inmunoestimulantes (figura 1.2) (Sørensen et al., 1997; Wu, 2011). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1.2. Representación del procesamiento típico de una catelicidina (modificada de Vandamme et al., 
2012). 
 Señal 
 Preproteína 
–Calicreína 
–Proteasa 3 
 Dominio catelina Péptido 
 Dominio catelina Péptido 
Enzimas 
procesadoras: 
 Proproteína 
 Péptido activo 
 Dominio catelina Péptido 
Enzimas 
procesadoras: 
–Serín-proteasas endógenas 
–Proteasas microbianas 
 
Fragmentos activos 
 
10 
 
1.3.3. Estructura de LL-37 
El péptido LL-37contiene un 44% de residuos hidrofílicos, con once aminoácidos básicos y 
cinco aminoácidos ácidos, dándole una carga neta positiva de +6 a pH fisiológico. En solución 
acuosa LL-37 exhibe un espectro de dicroísmo circular que corresponde a una estructura 
desordenada, sin embargo, en membranas donde el ambiente es lipofílico o en soluciones con 
concentraciones salinas milimolares, muchos de los aminoácidos son capaces de formar puentes 
de hidrógeno intramoleculares en donde los grupos N-H del esqueleto donan un puente de 
hidrógeno a los grupos C=O del esqueleto, que están cuatro aminoácidos antes en la secuencia, 
generando una estructura de α-hélice, la cual es catiónica y anfipática (figura 1.3) (Dean, Bishop, 
& van Hoek, 2011; Porcelli, Verardi, Shi, Henzler-wildman, & Ramamoorthy, 2008). 
La naturaleza anfipática es un rasgo característico de la hélice α de LL-37, ilustrada en la figura 
1.3. Para obtener la estructura más aproximada a LL-37 en las membranas, Porcelli et al. 
elucidaron la estructura tridimensional utilizando Resonancia Magnética Nuclear de LL-37 en 
micelas de dodecilfosfocolina. En dilución, ni el extremo N ni el C terminal mostraban una 
estructura definida y estaban expuestos al solvente, mientras que en las micelas se formaban las 
dos hélices de LL-37, las cuales articulaban en el residuo K12 y eran soportadas por conjuntos 
hidrofóbicos formados por los residuos I13, F17 e I20, con un puente salino entre K12 y E16. La 
cara hidrofílica de LL-37 se mostró expuesta hacia la fase acuosa y la hidrofóbica se encontró 
acoplada en la región micelar. La superficie cóncava de LL-37 es hidrofóbica y se encuentra 
bordeada por residuos cargados positivamente, interaccionando con moléculas cargadas 
negativamente, como lipopolisacáridos, material genético y paredes celulares bacterianas. La 
superficie hidrofóbica de LL-37 está conformada por cuatro cadenas laterales de fenilalaninas que 
apuntan hacia la misma dirección (Li, Li, Han, Miller, & Wang, 2006; Porcelli et al., 2008). 
 Representación de rueda helicoidal de LL-37, ilustrando 
la naturaleza anfipática y catiónica de LL-37 (modificada 
de Duplantier & van Hoek, 2013) 
 
 
 
 
Figura 1.3. Naturaleza anfipática de LL-37; (A) Representación de rueda helicoidal de LL-37. (B) Proyección 
frontal de la hélice de LL-37 (modificada de Duplantier & van Hoek, 2013). 
 Hidrofóbico 
 F17 L28 V21 
G14 
 K25 
 
 
K12 
 
 R29 
 Q22 
 K18 
 I24 
 I13 
 I20 
 F27 
 E16 
 R23 
 R19 
 
 D26 K
15 
 LLGDFFKSKE 
 Hidrofílico 
A. B. 
 Hidrofóbico 
 Hidrofílico 
 
11 
 
1.3.4. Mecanismo de acción 
La actividad antimicrobiana de LL-37 en contra de bacterias Gram negativas como E. coli ha sido 
recientemente caracterizada en diferentes etapas utilizando microscopía de fluorescencia. En la 
primera fase, LL-37 se une en la membrana externa a los lipopolisacáridos y a los antígenos O, 
logrando saturar la membrana externa aproximadamente en un minuto. La translocación a través 
de la membrana externa hacia el espacio periplasmático suele suceder de cinco a veinticinco 
minutos después, inhibiendo el crecimiento, posiblemente a causa de una interferencia de LL-37 
con la biogénesis de la pared celular (Sochacki, Barns, Bucki, & Weisshaar, 2011). 
Se han propuesto tres modelos para explicar cómo los péptidos antimicrobianos inducen la 
muerte en las bacterias una vez que se asocian a la membrana, como se muestra en la figura 1.4. 
En el modelo de “barril-duela”, el péptido antimicrobiano se une, agrega e inserta dentro de la 
membrana lipídica interna con la cara hidrofóbica alineada con la región lipídica y la cara 
hidrofílica, formando la región interior del poro. En el modelo toroidal, el péptido 
antimicrobiano se agrega y dobla las monocapas lipídicas a través del poro para que el centro de 
la bicapa se alinee por los grupos polares tanto de los péptidos como de la monocapa lipídica. 
Por último, en el modelo de formación de micelas el péptido antimicrobiano desintegra a la 
membrana al orientarse paralelamente a la superficie de la bicapa lipídica, formando una capa 
extensa que obliga a los fosfolípidos a formar micelas. En los tres casos, la interacción resulta en 
poros dentro de la membrana interna, provocando la lisis bacteriana (Duplantier & van Hoek, 
2013). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1.4. Esquemas de las interacciones celulares asociadas a LL-37 (modificada de Duplantier & van Hoek, 
2013). 
Membrana 
citoplasmática 
Barril-duela Poro-toroidal Formación de micelas 
 
12 
 
1.4. Resistencia múltiple a antibióticos en E. coli 
Los métodos utilizados con mayor frecuencia para generar bacterias resistentes a antibióticos 
consisten en el uso de plásmidos o transposones que contengan genes de resistencia a 
antibióticos. Un mecanismo alternativo para la generación de mutantes de Escherichia coli 
resistentes a antibióticos consiste en la activación de alguno de los genes del locus mar. Los genes 
que se encuentran en este locus confieren resistencia a diferentes sustancias, mediante la 
alteración de la expresión de un gran número de genes en el cromosoma bacteriano, siendo el 
activador transcripcional MarA el que activa a los genes encargados de la resistencia a antibióticos 
(Alekshun, 1997). 
El locus mar de E. coli está compuesto por dos unidades transcripcionales divergentes: marC y 
marRAB, las cuales están separadas por el operador marO. El operador marO presenta dos sitios, 
los promotores PmarI y PmarII, los cuales son divergentes y se encuentran localizados en la 
región promotor-operador (figura 1.5). marC codifica para una proteína de membrana de función 
desconocida (Barbosa & Levy, 2000) y marRAB codifica al represor de mar (MarR), al activador 
(MarA) y a otra proteína de función desconocida (MarB) (Alekshun, 1997). 
 
 
 
 
Figura 1.5. Organización del locus mar en Escherichia coli (modificado de Alekshun, 1997). 
 
En condiciones no estresantes, MarR se une a los sitios I y II del operador de mar (marO) y 
bloquea la transcripción del operón marRAB (Robert G Martin & Rosner, 1995). Cuando se 
inactiva MarR, la expresión de marRAB es constitutiva, sin embargo, se ve afectada por un gran 
número de activadores transcripcionales, entre ellos MarA, Rob (un parálogo de MarA en E. coli 
que es expresado constitutivamente), Fis (una proteína multifuncional de unión a DNA) y SoxS 
(un parálogo de MarA en E. coli que controla la resistencia a estrés oxidativo), los cuales se unen a 
PmarII. Además de activar su propia transcripción, MarA también regula la expresión de muchos 
otros genes cromosomales, produciendo fenotipos diversos que le proporcionan a E. coli una 
respuesta rápida a diversos factores de estrés (Alekshun, 1997). 
 marC marR marA marB 
 PmarI PmarII 
 MarO 
 
13 
 
1.4.1. Activador transcripcional MarA 
MarA es un regulador transcripcional global que modula la expresión de al menos 40 genes 
cromosomales en Escherichia coli, confiriéndole varios niveles de resistencia a un gran número de 
diferentes agentes nocivos en el ambiente, como antibióticos, desinfectantes y agentes de estrés 
oxidativo (Barbosa & Levy, 2000; Wall, Markowitz, Rosner, & Martin, 2009). 
MarA es un miembro de la familia de activadores transcripcionales XylS/AraC. Las proteínas de 
esta familia suelen activar un gran número de genes, algunos de los cuales producen resistencia a 
antibióticos y a estrés oxidativo. Todas las proteínas de esta familia tienen un dominio hélice-giro-
hélice de unión a DNA de 21 residuos de aminoácidos (Alekshun, 1997). 
 
1.4.2. Mecanismo de acción de MarA 
MarA activa la transcripción al unirse como monómero a una secuencia de 20 pb de DNA (en un 
consenso de AYnGCACnnWn-nRYYAAAYn, donde R=A o G; Y=C o T; W=A o T y n=A, T, 
C o G), localizada en la región del promotor de los genes controlados. Se especula que la razónpor la cual MarA tiene tan poca especificidad se debe a que la segunda hélice de este dominio 
contiene un gran número de aminoácidos cargados positivamente, una característica poco común 
en los factores de transcripción (Alekshun, 1997; R G Martin, Gillette, Rhee, & Rosner, 1999). 
La relación entre la localización y orientación del sitio de unión de MarA, la caja mar y los 
hexámeros -10 y -35 es promotor específico. Los promotores de los miembros del regulón mar, 
entre ellos mar, fpr y acrAB, contienen una caja mar río arriba de la secuencia -35 con una 
orientación reversa relativa a los elementos de reconocimiento de la RNA polimerasa, lo que 
provoca una activación por establecimiento de contactos entre MarA y el dominio carboxilo 
terminal de la RNA polimerasa (figura 1.6) (Jair, Fawcett, Fujita, Ishihama, & Wolf, 1996; R G 
Martin et al., 1999). 
 
14 
 
1.4.3. Estructura de MarA 
MarA es una proteína de 127 residuos de aminoácidos y consiste en dos subdominios similares, 
cada uno de los cuales contiene un motivo hélice-giro-hélice de unión a DNA. Las dos hélices de 
reconocimiento se insertan en la misma cara del surco mayor del DNA, separándose 27 Å, 
doblando la hebra de DNA aproximadamente 35º (figura 1.6). La especificidad en el 
reconocimiento de la secuencia se da gracias a varias interacciones entre las hélices de 
reconocimiento y el surco mayor del DNA (Avies, 1998). 
 
 
 
Figura 1.6. Diagrama de listón para el complejo RNA polimerasa-MarA-DNA mostrando la inserción de las 
hélices de reconocimiento 3 y 6 de MarA en el surco mayor del DNA, provocando un doblamiento del DNA. El 
subdominio N se une a la secuencias río abajo del promotor mar y se posiciona cerca del sitio de inicio de 
transcripción, mientras que el subdominio C se une a la secuencia río arriba (modificado de Dangi, 
Gronenborn, Rosner, & Martin, 2004). 
Subunidad α de la 
RNA polimerasa 
 MarA 
C 
 N 
6 
3 
 
15 
 
1.5. Bomba de eflujo AcrAB-TolC 
Además de activar su propia transcripción y la de muchos genes más, MarA, al unirse a las 
regiones adyacentes de los promotores acrAB y tolC, regula positivamente la expresión de la 
bomba de eflujo AcrAB-TolC (Aono, Tsukagoshi, & Yamamoto, 1998). 
El complejo AcrAB-TolC abarca las membranas internas y externas de Escherichia coli y funciona 
como la mayor bomba de eflujo para resistencia a antimicrobianos. Impulsada por fuerza protón 
motriz, la bomba AcrAB-TolC efluye sales biliares, detergentes, solventes orgánicos y un gran 
número de antibióticos no relacionados estructuralmente (Eicher & Seeger, 2007). 
1.5.1. Mecanismo de acción 
AcrA y AcrB coexisten en la membrana interna formando un complejo que permanece asociado 
durante su acoplamiento a TolC. El acoplamiento de las horquillas α de AcrA a TolC promueve 
cambios conformacionales en el dominio proximal a la membrana de AcrA, los cuales se 
necesitan como estimulación para la actividad de transporte de AcrB. Los transportadores 
activados AcrAB generan la apertura de la punta periplasmática de TolC, permitiendo la difusión 
de los sustratos a través de la membrana externa. La conformación abierta del complejo es de 
vida corta y se relaja a un estado cerrado con o sin la disociación de las horquillas α de AcrA a 
TolC (Tikhonova, Yamada, & Zgurskaya, 2011). 
La estructura de AcrB está compuesta por tres monómeros que representan estados consecutivos 
en un ciclo de transporte. Uno de los monómeros no muestra interacción aparente con sus 
vecinos, por lo que su conformación es denominada L (Loose). Otro de ellos exhibe una apertura 
desde dentro del poro hacia el vórtice del trímero de AcrB, por lo que su conformación es 
denominada O (Open). En el monómero O, el subdominio PN1 (Pore Domain 1) está direccionado 
hacia los subdominios PN1 y PN2 de su vecino, interaccionando fuertemente con ellos. Esta 
interacción impone una constricción conformacional en su monómero vecino, denominado T 
(Tight). Un posible mecanismo de transporte es la rotación de cada una de las conformaciones, en 
donde L pasa a T, T pasa a O y O pasa de vuelta a L. Los subdominios PN1, incluyendo los 
poros de las hélices, podrían tomar el papel de los dientes de un trinquete que fuerzan los 
cambios conformacionales en este orden. El cambio conformacional de PN1 del monómero O al 
 
16 
 
L causa una pérdida de interacción con los subdominios PN1 y PN2 del monómero T y permite 
la conversión de los subdominios PN1/PC2 de la conformación T a la O. En consecuencia, el 
sustrato al que está unido el monómero T sale de la cavidad hidrofóbica localizada en la interfase 
de los subdominios PN2/PC1 durante la transición hacia la conformación monomérica O. Esta 
conversión del subdominio PN1 del monómero T hacia la conformación inclinada del 
monómero O restablece la interacción con el subdominio PN2 del monómero L e induce los 
cambios conformacionales que generan la cavidad de unión al sustrato en la interfase PN2/PC1 y 
el cambio conformacional de L a T. Esta secuencia de eventos forma una vía de eflujo para el 
sustrato a través de túneles con un mecanismo de transporte análogo a una bomba peristáltica. La 
figura 1.7 representa el mecanismo de expulsión de acridina. La difusión del sustrato dentro del 
túnel se ve limitada por el sitio de oclusión, cuya posición migra dentro del vórtice, guiando al 
sustrato hacia TolC. La naturaleza inespecífica de este tipo de transporte sustenta el amplio 
espectro de especificidad de sustrato observado en la bomba de eflujo AcrAB-TolC (Eicher & 
Seeger, 2007). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1.7. Mecanismo de transporte rotacional de AcrB. (A) Vista lateral de dos monómeros del trímero AcrB, 
de AcrA y de TolC. (B) Vista superior de los monómeros O, L y T (rojo, azul y amarillo respectivamente) 
indicando los sitios de unión al sustrato. Las diferentes formas geométricas reflejan diferentes afinidades por los 
sustratos transportados; triángulo para afinidad baja, rectángulo para afinidad alta y círculo para afinidad nula 
(modificada de Eicher & Seeger, 2007). 
 TolC 
AcrA 
 AcrB 
 
17 
 
2. ANTECEDENTES 
Se han realizado diversos esfuerzos para producir LL-37 recombinante, sin embargo el 
rendimiento no ha sido el suficiente para poderlo producir industrialmente. A continuación se 
describen algunos de los intentos más exitosos y se mencionan los trabajos sobre MarA que 
hicieron considerar su sobreexpresión como una propuesta alterna para mejorar el rendimiento 
de LL-37 en Escherichia coli. 
2.1. Relación con la resistencia al péptido antimicrobiano LL-37 
Warner y Levy en 2010 compararon la susceptibilidad de mutantes que sobreexpresan MarA ante 
péptidos antimicrobianos, entre ellos LL-37, en comparación a la cepa control AG100 de E. coli. 
Se observó que las cepas con sobreexpresión de MarA mostraban diez veces menor 
susceptibilidad a LL-37 y atribuyeron estos efectos a la activación de la bomba de eflujo AcrAB-
TolC por MarA, ya que mutantes en donde se perdía AcrAB o TolC anulaban el decremento en 
la susceptibilidad a LL-37 (Warner & Levy, 2010). 
2.2. Relación de AcrAB-TolC con LL-37 
Utilizando mutantes de E. coli con deleciones en AcrAB y en TolC, Warner y Levy realizaron 
experimentos en donde se examinaba la respuesta de distintas cepas cuando se agregaba LL-37 al 
medio. Demostraron que la cepa con mutaciones en acrAB era 20 veces más susceptible a LL-37 
que la cepa silvestre, que la cepa con deleciones en tolC era 200 veces más sensible a este péptido 
antimicrobiano y que una cepa con deleciones en acrR, el represor de acrAB, era 50 veces más 
resistente a LL-37, siendo consistente con estudios anteriores del mecanismo de resistencia a 
péptidos antimicrobianos basados en AcrAB (Warner & Levy, 2010). 
 
18 
 
Una posible explicación para la expulsión de LL-37 se observa al estudiar a las defensinas α y β, 
péptidos antimicrobianoshumanos que inhiben el crecimiento de E. coli pero que no son 
expulsados por la bomba de eflujo AcrAB-TolC. A pesar de que estos péptidos tienen tamaño 
similar a LL-37, difieren en que no presentan puentes disulfuro, lo que interfiere con la capacidad 
de estos péptidos para ser expulsados a través del complejo AcrAB-TolC, lo que sugiere que la 
presencia de puentes disulfuro en LL-37 es lo que le permite ser expulsado (Warner & Levy, 
2010). 
2.3. LL-37 recombinante con actividad antimicrobiana al expresarse 
en P. pastoris 
LL-37 fue expresado en una levadura metilotrófica, Pichia pastoris, utilizando el promotor de la 
gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, un fuerte promotor constitutivo. Para expresar el 
péptido antimicrobiano en su estado funcional, se tomó la secuencia del péptido activo y se le 
añadió la secuencia del codón inicial para permitir su traducción. Se purificó el péptido, 
mostrando actividad antimicrobiana en contra de Micrococcus luteus y se analizó la secuencia de 
aminoácidos de este LL-37 recombinante, mostrando que la secuencia seguía íntegra y que se 
logró expresar este péptido en su forma activa añadiendo una metionina a la región N-terminal, 
sin necesidad de utilizar precursores como proteínas de fusión (Hong, Lee, Kim, & Choi, 2007). 
A pesar de que Pichia pastoris permite expresar LL-37 en su forma activa, no se considera el 
organismo más adecuado para lograr un buen rendimiento en la producción de proteínas 
recombinantes. Escherichia coli tiene un rendimiento mucho mejor para la producción de DNA y 
proteínas recombinantes por varias razones. Las células competentes de E. coli pueden 
almacenarse congelándolas mientras que las células de Pichia pastoris deben ser transformadas 
inmediatamente después de hacerlas competentes. Los rendimientos de expresión en P. pastoris 
varían mucho entre diferentes clonas, y usualmente se necesita analizar un gran número de clonas 
para conocer cuál es la que mejor produce la proteína de interés. En P. pastoris se necesita de días 
para llegar a los niveles óptimos de expresión, mientras que E. coli llega al momento óptimo en 
algunas horas (Brondyk, 2009). 
 
19 
 
2.4. LL-37 recombinante con actividad lítica al expresarse en E. coli 
Liu et al. utilizaron un vector para la expresión inducible de LL-37, utilizando el promotor pBAD, 
que se induce por arabinosa, para observar su efecto en la cepa Top 10 de Escherichia coli bajo 
condiciones anaeróbicas y aeróbicas. La secuencia de LL-37 que utilizaron fue la misma que 
utilizó Hong para producirlo en Pichia pastoris (la secuencia del péptido activo con una metionina 
inicial añadida a la región N-terminal). La inducción de LL-37 provocó inhibición en el 
crecimiento y alteración en la morfología celular, generando un fenotipo filamentoso. Este 
estudio mostró que la expresión intracelular de LL-37 en E. coli inhibe el crecimiento tanto en 
condiciones anaeróbicas como aeróbicas y que la acumulación intracelular de LL-37 influye en el 
estatus iónico y de óxido-reducción de la célula en ambas condiciones (Liu et al., 2013). 
2.5. Bomba AcrAB-TolC como mecanismo para la expulsión de 
desechos intracelulares 
Estudios recientes han mostrado que las concentraciones intracelulares y extracelulares de varios 
metabolitos intracelulares se ven afectadas por la expresión de TolC. 
Tatsumi et al. (2008) reportaron que la producción excesiva de porfirinas y cisteína son tóxicas 
para la célula y tienen que ser expulsadas al medio. Cuando se añade exógenamente el ácido d-
amino levulínico, el precursor de la porfirina, éste estimula la biosíntesis de porfirina, tanto en la 
cepa silvestre de E. coli como en mutantes deficientes de TolC. Sin embargo, las mutantes en tolC 
acumulan grandes cantidades de porfirina y porfirinógenos intracelularmente, mientras que la 
cepa silvestre los excreta al medio. Los autores proponen que el ácido d-amino levulínico se 
metaboliza en la célula hacia porfirina y porfirinógeno, y que el exceso de éstos es expulsado de la 
célula por un sistema de eflujo dependiente de TolC (Tatsumi & Wachi, 2008). 
Asimismo, TolC en E. coli ha sido relacionado con el transporte de los sideróforos requeridos en 
la adquisición de hierro. Esta adquisición en respuesta a deficiencias de hierro dentro de la célula 
se ha atribuido a una enterobactina, la cual es secretada al medio para después ser convertida en 
una enterobactina férrica y ser transportada de vuelta a la célula. Deleciones en tolC resultan en 
una pérdida total en la exportación de enterobactina y en la adquisición de hierro (Zgurskaya, 
Krishnamoorthy, Ntreh, & Lu, 2011). 
 
20 
 
2.6. Aumento de la resistencia a la producción recombinante de 
geraniol mediante la sobreexpresión de MarA 
El geraniol es un alcohol con aplicaciones muy diversas en la industria y que se puede producir en 
E. coli mediante la sobreexpresión de la geranil difosfato sintasa y la expresión de la primera parte 
de una vía de mevalonato recombinante. Sin embargo, el geraniol es un producto tóxico para E. 
coli, por lo que su producción baja considerablemente (Zhou et al., 2014). 
La sobreexpresión de MarA promueve una tolerancia 104 veces mayor en E. coli hacia geraniol, en 
comparación con mutantes con deleciones en marA y tolC, por lo que Shah et al. –tomando en 
cuenta que el aumento en la concentración de la bomba de eflujo AcrAB-TolC generado 
solamente por la sobreexpresión del regulador transcripcional MarA es suficiente para 
incrementar la tolerancia al geraniol– proponen este mecanismo como una alternativa para 
generar geraniol recombinante y lograr que las células de E. coli bombeen geraniol al medio 
extracelular, confiriéndoles resistencia, y generando un mayor rendimiento en la producción de 
geraniol (Shah et al., 2013). 
 
21 
 
3. JUSTIFICACIÓN 
El presente trabajo pretende plantear las bases para el diseño de un sistema biológico en el que se 
pueda producir de manera recombinante un péptido antimicrobiano de forma eficiente en E. coli. 
Sabiendo que MarA disminuye la susceptibilidad de E. coli a LL-37 cuando éste se encuentra en el 
medio extracelular, que la sobreexpresión de MarA está relacionada con la expulsión de desechos 
intracelulares y que LL-37 se puede producir en su forma activa en Escherichia coli (resultando en la 
inhibición del crecimiento celular) es posible crear un sistema en el que al sobreexpresar MarA 
aumente la expresión recombinante de LL-37. Cualquiera de los tres escenarios posibles –que 
disminuya la inhibición del crecimiento celular, que aumente la inhibición o que no se muestren 
cambios– arrojaría más preguntas interesantes tanto sobre el mecanismo de acción mediante el 
cual la expresión de MarA disminuye la susceptibilidad a LL-37, como del mecanismo de acción 
mediante el cual LL-37 interfiere con las membranas de E. coli. 
Ya que el proyecto en general pretende crear un sistema en el que se manipule una vía de 
resistencia múltiple a antibióticos en E. coli mediante la sobreexpresión del activador 
transcripcional MarA y se produzca recombinantemente al péptido antimicrobiano humano LL-
37 en el mismo hospedero, se utilizará el método de las biopartes de la Biología Sintética, lo que 
permitirá caracterizar cada una de las partes y su funcionamiento, antes de unir los dos 
componentes del sistema (MarA y LL-37). 
 
22 
 
4. OBJETIVOS 
4.1. Objetivos 
1) Diseñar, construir y caracterizar un plásmido para que Escherichia coli sobreexprese el factor de 
transcripción bacteriano MarA. 
a) Construir el plásmido de sobreexpresión de MarA bajo el promotor plac a partir de 
BioBricks. 
b) Analizar por SDS-PAGE los cambios en el perfil de expresión de E. coli transformada con 
la construcción. 
c) Verificar el fenotipo de resistencia múltiple a antibióticos mediante antibiogramas de E. 
coli transformada con la construcción a diferentes concentraciones de antibióticos.2) Diseñar, construir y caracterizar un plásmido para que E. coli produzca el péptido 
antimicrobiano humano LL-37. 
a) Construir el plásmido de expresión de LL-37 bajo el promotor pBAD a partir de los 
BioBricks. 
b) Analizar la viabilidad de células transformadas con la construcción LL-37 al inducir con 
arabinosa. 
 
23 
 
5. MATERIALES Y MÉTODOS 
5.1. Plásmidos 
Todos los plásmidos utilizados en este trabajo cumplen con las especificaciones del RFC 10 de la 
BioBrick Fundation. Las biopartes pLacI, pBad-AraC, RBS y GFP se obtuvieron de las placas 2, 3 y 
5 del Registry Distribution del 2013 del iGEM (International Genetically Engineered Machine). Las 
biopartes MarA y LL-37 fueron sintetizadas por GenScript Corporation con los estándares del RFC 
10 de la BioBrick Fundation e incorporadas al Registry of Standard Biological Parts como parte de la 
presentación de este proyecto en la competencia iGEM del 2013. Los plásmidos construidos en 
este trabajo fueron diseñados in silico utilizando el programa SnapGene versión 2.5 (GSL Biotech 
LLC, Chicago, IL, U.S.A.). Todas las secuencias se muestran en los anexos. 
5.1.1. Bioparte MarA 
El gen que codifica para el factor de transcripción de resistencia múltiple a antibióticos (MarA) 
fue obtenido a partir de una síntesis artificial de la secuencia de marA de Escherichia coli cepa K-12 
subcepa MG1655, tomada de la Nucleotide Database del National Center of Biotechnology Information 
(NCBI) en http://www.ncbi.nlm.gov. La síntesis fue realizada por GenScript Corporation. 
La secuencia de marA (anexo 1) se encuentra flanqueada por los sitios de corte de las enzimas de 
restricción EcoRI, NotI y XbaI como prefijo de la secuencia y SpeI, NotI y PstI como sufijo. El gen 
que codifica para el factor de transcripción de resistencia múltiple a antibióticos se encuentra en el 
plásmido pUC57 de 2,710 pb, con resistencia a ampicilina y con sitio de origen de replicación 
pMB1, con 100-300 copias por célula. Este vector contiene la secuencia complementaria a los 
oligonucleótidos iGEM Fw y iGEM Rv, lo que simplifica la comprobación de una ligación 
exitosa mediante PCR (anexo 2). 
 
24 
 
5.1.2. Bioparte LL-37 
El gen que codifica para el péptido antimicrobiano fue obtenido a partir de una síntesis artificial 
de la secuencia del fragmento activo de ll-37 (los 37 aa con actividad antimicrobiana más el codón 
ATG para la metionina inicial) de Homo sapiens tomada de la Nucleotide Database del National Center 
of Biotechnology Information (NCBI) en http://www.ncbi.nlm.gov. La síntesis fue realizada por 
GenScript Corporation. La secuencia de ll-37 (anexo 3) se encuentra flanqueada por los sitios de 
corte de las enzimas de restricción EcoRI, NotI y XbaI como prefijo de la secuencia y SpeI, NotI y 
PstI como sufijo. El gen que codifica para el péptido antimicrobiano LL-37 se encuentra en el 
plásmido pUC57 de 2,710 pb, con resistencia a ampicilina y sitio de origen de replicación pMB1, 
con 100-300 copias por célula. Este vector contiene la secuencia complementaria a los 
oligonucleótidos iGEM Fw y iGEM Rv (anexo 4). 
5.1.3. Bioparte pLacI 
La secuencia del promotor lac fue obtenida del Registry Distribution del iGEM del 2013 (Placa 3, 
20J), que junto con un sitio de unión a ribosoma conforman la bioparte BBa_J04500. Este 
promotor fue utilizado para expresar a MarA y a GFP (utilizada como control). Esta bioparte 
consiste en un regulador sensible a LacI y a la proteína CAP (Proteína Activadora por 
Catabolitos). Contiene dos sitios de regulación, al primero se acopla la proteína CAP y al segundo 
se acopla la proteína LacI. Cuando LacI y CAP se acoplan a los sitios de regulación se inhibe la 
transcripción y cuando se separan la promueve. En presencia de lactosa o análogos a la lactosa 
como IPTG, LacI cambia de conformación y se separa de este regulador, activando la 
transcripción. Esta secuencia es el promotor natural del operón LacZYA, e incluye la secuencia 
terminal del gen lacI, pero no la región promotora para este gen parcial. El inserto de pLac fue 
obtenido mediante PCR de Escherichia coli cepa K-12 subcepa MG1655 (DeCelle, 2005). 
La secuencia de pLacI se muestra en el anexo 5 y se encuentra flanqueada por los sitios de corte 
de las enzimas de restricción EcoRI, NotI y XbaI como prefijo de la secuencia y SpeI, NotI y PstI 
como sufijo de la secuencia, y se encuentra flanqueada por la secuencia complementaria a los 
oligonucleótidos iGEM Fw y iGEM Rv. La secuencia del promotor regulado por LacI se 
encuentra en el plásmido circular pSB1C3 de 2,710 pb, con resistencia a cloranfenicol y sitio de 
origen de replicación pMB1, con 100-300 copias por célula (anexo 6). 
 
25 
 
5.1.4. Bioparte pBad-AraC 
La secuencia del promotor pBAD fue obtenida del Registry Distribution del iGEM del 2013 (Placa 
2, 7E), que junto con la secuencia codificante para el represor AraC que se transcribe en dirección 
opuesta (río arriba) conforman la bioparte BBa_K808000. Este promotor fue utilizado para 
expresar LL-37 y GFP (como control). Al unirse con L(+)-arabinosa, AraC cambia su 
conformación, induciendo la transcripción. La secuencia del promotor pBAD se encuentra 
flanqueada por los sitios de corte de las enzimas EcoRI, NotI y XbaI como prefijo de la secuencia, 
y SpeI, NotI y PstI como sufijo. 
La secuencia de pBad-AraC se muestra en el anexo 7 y se encuentra flanqueada por la secuencia 
complementaria a los oligonucleótidos iGEM Fw y iGEM Rv. La secuencia del promotor pBAD 
y la secuencia para la proteína reguladora AraC se encuentran en el plásmido circular pSB1C3 de 
2,710 pb, con resistencia a cloranfenicol y sitio de origen de replicación pMB1, con 100-300 
copias por célula (anexo 8). 
5.1.5. Bioparte RBS 
La secuencia del sitio de unión a ribosoma fue obtenida del Registry Distribution del iGEM del 2013 
(Placa 5, 2M), conformando la bioparte BBa_B0034. Este sitio de unión a ribosoma fue diseñado 
por el equipo de Mahajan et al. en 2003, basándose en el RBS utilizado en el represilador de 
Elowitz. La secuencia se encuentra flanqueada por los sitios de corte de las enzimas EcoRI, NotI y 
XbaI como prefijo de la secuencia, y SpeI, NotI y PstI como sufijo. 
La secuencia del RBS se muestra en el anexo 9 y se encuentra flanqueada por la secuencia 
complementaria a los oligonucleótidos iGEM Fw y iGEM Rv, lo cual simplifica la comprobación 
de una ligación exitosa mediante PCR. La secuencia del sitio de unión a ribosoma se encuentra en 
el plásmido circular pSB1A3 de 2,155 pb, con resistencia a ampicilina y sitio de origen de 
replicación pMB1, con 100-300 copias por célula (anexo 10). 
 
 
26 
 
5.1.6. Bioparte GFP 
El gen que codifica para la proteína verde fluorescente fue obtenido del Registry Distribution del 
iGEM del 2013 (Placa 5, 14K), conformando la bioparte BBa_E0040. Esta bioparte deriva del 
reportero utilizado en el represilador de Elowitz, quien obtuvo la secuencia de la publicación de 
Andersen y colaboradores (Andersen et al., 1998). Para mejorar su expresión en bacteria, 
Andersen construyó esta variante de GFP, GFPmut3, cambiando el aminoácido 2 de serina a 
arginina, el 65 de serina a glicina y el 72 de serina a alanina, mediante PCR de la GFP silvestre de 
Aequorea victoria. La secuencia se muestra en el anexo 11 y se encuentra flanqueada por los sitios 
de corte de las enzimas EcoRI, NotI y XbaI como prefijo de la secuencia, y SpeI, NotI y PstI como 
sufijo. 
La secuencia de GFP se encuentra flanqueada por la secuencia complementaria a los 
oligonucleótidos iGEM Fw y iGEM Rv, lo cual simplifica la comprobación de una ligación 
exitosa mediante PCR. La secuencia codificante para la proteína verde fluorescente se encuentra 
en el plásmido circular pSB1C3 de 2,710 pb, con resistencia a cloranfenicol y con sitio de origen 
de replicación pMB1, con 100-300 copias por célula (anexo 12). 
5.1.7. pGLO 
Como control se utilizó alplásmido pGLO (BIO-RAD, 2014) con resistencia a ampicilina, el cual 
incluye al gen de la proteína verde fluorescente de Aequorea victoria (la misma que la bioparte 
GFP), la cual es transcrita por el promotor pBAD, y reprimida en ausencia de arabinosa por la 
proteína AraC, que también está codificada en pGLO. 
5.2. Oligonucleótidos 
Todas las biopartes utilizadas en este trabajo se encuentran flanqueadas por las secuencias 
complementarias a los oligonucleótidos iGEM Fw (5’-tgccacctgacgtctaagaa-3’) y iGEM Rv (5’-
attaccgcctttgagtgagc-3’). Estos oligonucleótidos fueron sintetizados por la unidad de servicios 
genómicos del LANGEBIO del CINVESTAV, Irapuato. 
 
27 
 
5.3. Medios de cultivo y cepas 
Se utilizó medio LB (Lysogeny Broth) para crecer a Escherichia coli en condiciones nutritivas. 
Como medio de selección para las transformaciones se utilizaron medios de cultivo LB ampicilina 
(Pisa) a una concentración de 100 µg/mL y LB cloranfenicol (Kener) a una concentración de 25 
µg/mL. Para la inducción del promotor lac se utilizó IPTG a una concentración de 0.5 mM. Para 
la activación del regulador AraC se utilizó L (+) arabinosa al 1%. 
Se utilizaron las cepas de E. coli: 
DH5α (F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-
argF)U169, hsdR17(rK- mK+), λ–). 
HB101 (F- mcrB mrr hsdS20(rB- mB-) recA13 leuB6 ara-14 proA2 lacY1 galK2 xyl-5 mtl-1 
rpsL20(SmR) glnV44 λ). 
TOP10 (F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 nupG recA1 araD139 Δ(ara-
leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrR) endA1 λ). 
XL1-Blue (endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F'[ ::Tn10 proAB+ lacIq 
Δ(lacZ)M15] hsdR17(rK- mK+)). 
5.4. Preparación de células de E. coli competentes con calcio 
Se inocularon 3 mL de LB con una colonia y se incubaron toda la noche a 37ºC con agitación 
constante a 250 rpm. Se inocularon 250 µL de preinóculo en cada uno de los dos matraces con 
50 mL de LB fresco. Se incubó a 37ºC con agitación constante a 250 rpm hasta que las células 
llegaran a una densidad óptica a 600 nm de entre 0.4 y 0.6. Se centrifugó a 4ºC durante 10 
minutos a 4,000 rpm. Se colocaron las células en hielo, y se decantó el sobrenadante dejando un 
mililitro para resuspender las células suavemente. Se lavó con la mitad del volumen original, 25 
mL de CaCl2 0.1 M estéril a 4ºC. Se incubó en hielo durante 20 minutos y se procedió a 
centrifugar a 4ºC durante 10 minutos a 4000 rpm. Se decantó totalmente y se resuspendió en 0.5 
mL de CaCl2 0.1 M, glicerol 20% estéril. Se colocaron las células en hielo y se hicieron alícuotas 
de 50 µL en tubos de 0.5 mL estériles y se conservaron a -70ºC. Finalmente se determinó la 
eficiencia de las células (número de transformantes por µg de DNA) con un plásmido de 
concentración conocida. 
 
28 
 
5.5. Transformación de Escherichia coli por choque térmico 
Se agregó el DNA (200 ng de DNA superenrollado, o hasta 5 µL del producto de una ligación) a 
las células competentes. Se incubó en hielo 15 minutos y se procedió a dar un pulso a 42ºC 
durante minuto y medio sin agitar. Se incubó en hielo dos minutos y se resuspendió en un 
mililitro de LB, incubando por 40 minutos a 37ºC con agitación constante a 250 rpm. Se 
inocularon 100 µL del cultivo en una placa de LB con el antibiótico correspondiente al marcador 
de selección del plásmido transformado. 
5.6. Minipreparación de plásmidos 
Para las minipreparaciones de los plásmidos se utilizó el kit de purificación y minipreparación de 
MaestroGen: High-speed plasmid mini kit. Se crecieron cultivos toda la noche de las respectivas 
cepas de Escherichia coli con los plásmidos en 3 mL de LB con los antibióticos correspondientes. 
Se transfirieron 1.5 mL de los cultivos a tubos de microcentrífuga para centrifugar por un minuto 
a 16,000 x g descartando el sobrenadante, repitiendo este paso para los 1.5 mL restantes. Se 
resuspendió la pastilla con 200 µL de Buffer PD1 con RNAsa A con el vórtex o subiendo y 
bajando la muestra con micropipeta. Se lisaron las células con 200 µL de Buffer PD2, mezclando 
suavemente 10 veces por inversión. Se dejó reposar durante dos minutos para asegurar un lisado 
homogéneo. 
Se neutralizó con 300 µL de Buffer PD3 y se mezcló inmediatamente 10 veces por inversión. Se 
centrifugó por tres minutos a 16,000 x g. Se colocó la columna PD en el tubo colector y se añadió 
el sobrenadante a la columna, centrifugando a 16,000 x g por 30 segundos. Se descartó el eflujo y 
se volvió a colocar la columna PD en el tubo colector. Se lavó la columna con 400 µL de Buffer 
W1 con etanol y se centrifugó a 16,000 x g por 30 segundos. Se descartó el eflujo y se colocó la 
columna PD en el tubo colector. Se centrifugó de nuevo por 3 minutos para secar la columna y 
descartar cualquier residuo de etanol. Se colocó la columna en un tubo de microcentrífuga y se 
eluyó con 50 µL de agua, colocándolos en el centro de la matriz de la columna y dejando reposar 
durante dos minutos antes de centrifugar para eluir el DNA. 
 
29 
 
5.7. Digestiones de DNA con enzimas de restricción 
Para la digestión de los plásmidos se utilizaron cuatro enzimas diferentes: EcoRI, SpeI, PstI y XbaI. 
Dependiendo de si se quería la bioparte como sufijo o como prefijo, y de si se quería obtener un 
inserto o abrir el vector, se utilizaron diferentes combinaciones de dos de estas enzimas (Fig. 5.1). 
Si se deseaba tener una bioparte como prefijo y como inserto se digería con EcoRI y SpeI, en una 
relación molar 1:2 en buffer Cutsmart. Si se deseaba tener una bioparte como prefijo, abriendo el 
vector, se digería con SpeI y PstI en una relación molar 1:1 en buffer 2.1. Si se deseaba tener una 
bioparte como sufijo y como inserto se digería con XbaI y PstI en una relación molar 1:1.5 en 
buffer 2.1. Si se deseaba tener una bioparte como sufijo, abriendo el vector, se digería con EcoRI 
y XbaI en una relación molar 1:1 en buffer Cutsmart. Todas las enzimas de digestión y los buffers 
se obtuvieron del BioBrick Assembly Kit de New England Biolabs. 
Todas las reacciones de digestión se dejaron incubar durante toda la noche a 37ºC para realizar 
una extracción de DNA en gel de agarosa al día siguiente. 
 
 
 
Figura 5.1. Esquema en donde se muestra el ensamblaje estándar de los BioBricks (modificado de Johns 
Hopkings 2011 iGEM team, 2011). 
 
30 
 
5.8. Electroforesis de DNA en geles de agarosa 
El gel se preparó al 1% de agarosa con buffer TAE (Tris 40mM, ácido acético 20 mM y EDTA 1 
mM) 1x. Para preparar el gel se tomaron 50 mL de TAE 1x y 0.5 g de agarosa. Esta mezcla se 
calentó hasta fundir la agarosa y después de unos minutos de enfriamiento se colocó en la charola 
(medidas 10x15 cm) utilizando un peine para 15 pozos. Se cargaron las muestras con buffer de 
carga para DNA 6x (30% glicerol, 0.25% azul de bromofenol) con GelRed 6x (GenScript). Se 
corrió el gel a un voltaje de 100 V durante una hora. Se observó el resultado en un 
transiluminador UV en un cuarto oscuro y se realizó un registro fotográfico con una cámara 
Canon PowerShot A650. 
5.9. Extracción de fragmentos de DNA de geles de agarosa 
Se cortó con una navaja la zona del gel con los fragmentos de DNA deseados, procurando tomar 
la menor cantidad de agarosa posible. Se pesó el fragmento dentro de un microtubo de 1.5 mL 
previamente pesado y se procedió a purificar el DNA utilizando el Zymoclean Gel DNA Recovery 
Kit. 
Se agregaron 3 volúmenes de ADB (Agarose Dissolving Buffer) por cada volumen de agarosa 
cortada del gel. Se incubó a 37ºC por 10 minutos, hasta que el gel estuviera totalmente disuelto. 
Se transfirió la solución de agarosa derretida a una columna Zymo-Spin en un tubo colector. Se 
centrifugó durante 30 segundos a 16,000 x g y posteriormente se descartó el eflujo. Se añadieron 
200 µL de DNA Wash Buffer a la columna y se centrifugó a 16,000 x g durante 30 segundos, 
descartando el sobrenadante y volviendo a centrifugar, pero sin agregar

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