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Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Ciencias Análisis de la sobreexpresión del activador transcripcional MarA como propuesta para la producción recombinante del péptido antimicrobiano humano LL-37 en Escherichia coli. TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: BIÓLOGO PRESENTA: ANDRÉS FERRIÑO IRIARTE DIRECTORA DE TESIS: QUÍM. VIVIANA ESCOBAR SÁNCHEZ MÉXICO D.F. ABRIL 2015 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 1. Datos del alumno Ferriño Iriarte Andrés 54 15 13 23 Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Ciencias Biología 411002549 2. Datos del asesor Quím. Viviana Escobar Sánchez 3. Datos del sinodal 1 Dr. Gabriel del Río Guerra 4. Datos del sinodal 2 Dra. Claudia Andrea Segal Kischinevzky 5. Datos del sinodal 3 Dr. Jorge Antonio García Álvarez 6. Datos del sinodal 4 M. en C. Alfonso José Vilchis Peluyera 7. Datos del trabajo escrito Análisis de la sobreexpresión del activador transcripcional MarA como propuesta para la producción recombinante del péptido antimicrobiano humano LL-37 en Escherichia coli. 83 páginas 2015 AGRADECIMIENTOS Agradezco a la Dra. Luisa Alba Lois y al Dr. Víctor Valdés López por aceptarme como parte de su equipo en el Laboratorio de Biología Molecular y Genómica. Asimismo agradezco al grupo del Dr. Agustino Martínez Antonio por permitirme realizar la primera fase de este proyecto en su laboratorio en el CINVESTAV, Irapuato. Agradezco a la Dra. María de los Angeles Cancino Rodezno por su apoyo técnico y por permitirme realizar parte de este proyecto en el Taller de Biología Molecular de la Célula I y II. Agradezco al Instituto de Investigaciones en Matemáticas Aplicadas y en Sistemas y a PAPIIT IN 218611-3 por el apoyo económico necesario para llevar a cabo este proyecto. Agradezco a los miembros del jurado, la Dra. Claudia Segal Kischinevzky, el M. en C. Alfonso Vilchis Peluyera, el Dr. Jorge García Álvarez y el Dr. Gabriel del Río Guerra por tomarse el tiempo de revisar y corregir esta tesis. Especialmente agradezco a mi tutora, Viviana Escobar Sánchez, por todo su apoyo a lo largo de la realización de este proyecto. Expreso mi agradecimiento a los profesores del Taller de Biología Sintética, especialmente al Dr. Pablo Padilla Longoria quien me entusiasmó para llevar a cabo este proyecto y a Viviana Escobar Sánchez y a Claudia Segal Kischinevzky quienes lograron que este proyecto se concretara. Finalmente agradezco todos los miembros del equipo iGEM de la Facultad de Ciencias, quienes contribuyeron con la realización de este proyecto. RESUMEN LL-37 es un péptido antimicrobiano producido por el sistema inmune humano, el cual se ha estudiado recientemente como una alternativa a los antibióticos. A pesar de que la expresión recombinante en E. coli es uno de los medios más eficientes para la producción de proteínas, debido a la citotoxicidad en E. coli, la mayor parte de los sistemas de expresión para LL-37 dependen de construcciones con proteínas de fusión solubles, lo que imposibilita su producción en su forma activa e incrementa el costo de producción. Recientemente se reportó la respuesta de cepas de E. coli que sobreexpresan MarA –un regulador transcripcional bacteriano que modula la expresión de genes cromosomales involucrados en resistencia a diversos antibióticos– retadas ante péptidos antimicrobianos, entre ellos LL-37, comparándolas con una cepa control. Se observó que la cepa que sobreexpresa MarA mostraba una susceptibilidad a LL-37 diez veces menor que la cepa control. Este proyecto corresponde a la primera fase experimental de un planteamiento teórico que propone una nueva aproximación para la producción de péptidos antimicrobianos. Utilizando herramientas de Biología Sintética, una disciplina que utiliza la combinación de diferentes secuencias genéticas para obtener organismos que realicen funciones nuevas, se desea producir un sistema en Escherichia coli en donde se obtenga una menor susceptibilidad al péptido antimicrobiano LL-37 gracias a la sobreexpresión simultánea del factor de transcripción MarA. Se realizaron las construcciones genéticas para expresar ambas secuencias proteicas, MarA y LL- 37, se analizó si están siendo debidamente expresadas y se observó si existen modificaciones fenotípicas en el organismo. Se logró una sobreexpresión adecuada del factor de transcripción MarA, observando el fenotipo de resistencia múltiple a antibióticos, sin embargo, la expresión de LL-37 en E.coli aun no ha sido lograda. ABREVIATURAS Å .......................................... Ångströms aa ......................................... Aminoácidos Acr ....................................... Resistencia a actiflavina ADB .................................... Agarose Dissolving Buffer, buffer para disolver agarosa DNA ................................... Ácido desoxirribonucleico iGEM .................................. International Genetically Engineered Machine IPTG .................................. Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido kDa ...................................... kiloDalton L ........................................... Loose mar ...................................... Resistencia múltiple a antibióticos MBP .................................... Proteína de unión a maltosa mRNA ................................ Ácido ribonucleico mensajero NK ...................................... Natural killer nm ....................................... Nanómetros nt .......................................... Nucleótido O .......................................... Open PBS ..................................... Phosphate buffered saline, buffer salino de fosfatos PCR ..................................... Polymerase chain reaction, reacción en cadena de la polimerasa PMSF .................................. Phenylmethylsulfonyl fluoride, fluoruro de fenilmetilsulfonilo RBS ..................................... Ribosome binding site, Sitio de unión a ribosoma RFC ..................................... Request for comments RNAsa ................................ Ribonucleasa rpm ...................................... Revoluciones por minuto rRNA .................................. Ácido ribonucleico ribosómico S ........................................... Svedberg SDS ..................................... Dodecilsulfato sódico T .......................................... Tight TEMED ............................. N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina TLR ..................................... Toll-like receptors ÍNDICE 1. Introducción .................................................................................. 1 1.1. Expresión de proteínas recombinantes en E. coli ........................................................ 1 1.1.1. Número de copias y mantenimiento del plásmido ............................................................. 1 1.1.2. Promotores ........................................................................................................................... 2 1.1.3. Traducción ...........................................................................................................................2 1.1.4. Plegamiento ......................................................................................................................... 3 1.1.5. Proteínas de fusión .............................................................................................................. 3 1.2. Biología Sintética .......................................................................................................... 4 1.2.1. Origen de la Biología Sintética ............................................................................................ 4 1.2.2. Estandarización y dispositivos genéticos ........................................................................... 5 1.2.3. BioBricks .............................................................................................................................. 5 1.3. Péptidos antimicrobianos ............................................................................................. 7 1.3.1. Catelicidinas ........................................................................................................................ 8 1.3.2. Características del péptido antimicrobiano LL-37 .............................................................. 8 1.3.3. Estructura de LL-37 .......................................................................................................... 10 1.3.4. Mecanismo de acción ...................................................................................................... 11 1.4. Resistencia múltiple a antibióticos en E. coli ............................................................. 12 1.4.1. Activador transcripcional MarA ........................................................................................ 13 1.4.2. Mecanismo de acción de MarA ....................................................................................... 13 1.4.3. Estructura de MarA ........................................................................................................... 14 1.5. Bomba de eflujo AcrAB-TolC ..................................................................................... 15 1.5.1. Mecanismo de acción ...................................................................................................... 15 2. Antecedentes .............................................................................. 17 2.1. Relación con la resistencia al péptido antimicrobiano LL-37 .................................... 17 2.2. Relación de AcrAB-TolC con LL-37 ........................................................................... 17 2.3. LL-37 recombinante con actividad antimicrobiana al expresarse en P. pastoris ...... 18 2.4. LL-37 recombinante con actividad lítica al expresarse en E. coli .............................. 19 2.5. Bomba AcrAB-TolC para la expulsión de desechos intracelulares ........................... 19 2.6. Aumento de la resistencia a la producción recombinante de geraniol mediante la sobreexpresión de MarA .................................................................................................... 20 3. Justificación ................................................................................ 21 4. Objetivos ...................................................................................... 22 4.1. Objetivos ..................................................................................................................... 22 5. Materiales y Métodos ................................................................. 23 5.1. Plásmidos .................................................................................................................... 23 5.1.1. Bioparte MarA ................................................................................................................... 23 5.1.2. Bioparte LL-37 .................................................................................................................. 24 5.1.3. Bioparte pLacI .................................................................................................................. 24 5.1.4. Bioparte pBad-AraC ......................................................................................................... 25 5.1.5. Bioparte RBS ..................................................................................................................... 25 5.1.6. Bioparte GFP ..................................................................................................................... 26 5.1.7. pGLO ................................................................................................................................. 26 5.2. Oligonucleótidos ......................................................................................................... 26 5.3. Medios de cultivo y cepas .......................................................................................... 27 5.4. Preparación de células de Escherichia coli competentes con calcio ........................ 27 5.5. Transformación de Escherichia coli por choque térmico ........................................... 28 5.6. Minipreparación de plásmidos ................................................................................... 28 5.7. Cuantificación de DNA en nanoespectrofotómetro ................................................... 32 5.8. Digestiones de DNA con enzimas de restricción ....................................................... 29 5.9. Electroforesis de DNA en geles de agarosa ............................................................... 30 5.10. Extracción de fragmentos de DNA de geles de agarosa ......................................... 30 5.11. Ligación de fragmentos de DNA .............................................................................. 31 5.12. Verificación por PCR de los plásmidos ensamblados ............................................. 31 5.13. Preparación de extractos proteicos de E. coli ......................................................... 32 5.14. SDS-PAGE (método de Laemmli) ............................................................................. 33 5.15. Antibiogramas por el método de difusión en agar ................................................... 34 5.16. Curvas de crecimiento .............................................................................................. 34 5.17. Secuenciación ........................................................................................................... 33 5.18. Análisis estadísticos .................................................................................................. 35 6. Resultados y discusión .............................................................. 36 6.1. Diseño y construcción de biopartes ........................................................................... 36 6.2. Caracterización de la construcción pLacI-RBS-MarA ............................................... 43 6.2.1. Cambios en el perfil de expresión de proteínas .............................................................. 43 6.2.2. Cambios en el nivel de resistencia a antibióticos ............................................................ 46 6.3. Caracterización de la construcción pBAD-AraC-RBS-LL-37 .................................... 54 6.3.1. Curvas de crecimiento ...................................................................................................... 54 7. Conclusiones .............................................................................. 57 8. Perspectivas ................................................................................ 58 9. Referencias ................................................................................. 59 10. Anexos .......................................................................................64 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1.1. Sistema estándar RFC 10 de los Biobricks ............................................................ 6 Figura 1.2. Representación del procesamiento típico de una catelicidina ................................. 9 Figura 1.3. Naturaleza anfipática de LL-37 ............................................................................. 10 Figura 1.4. Esquemas de las interacciones celulares asociadas a LL-37 ............................... 11 Figura 1.5. Organización del locus mar en Escherichia coli .................................................... 12 Figura 1.6. Diagrama de listón para el complejo RNA polimerasa-MarA-DNA ........................ 14 Figura 1.7. Mecanismo de transporte rotacional de AcrB ...................................................... 16 Figura 5.1. Ensamblaje estándar de los BioBricks .................................................................. 29 Figura 6.1. Construcción pLacI-RBS-MarA ............................................................................ 37 Figura 6.2. Construcción pBad-AraC-RBS-LL-37 .................................................................. 38 Figura 6.3. Construcción pLacI-RBS-GFP ............................................................................. 39 Figura 6.4. Construcción pBad-AraC-RBS-LL-37 .................................................................. 40 Figura 6.5. Electroforesis mostrando los productos de PCR de las biopartes utilizadas ......... 41 Figura 6.6. Gel de poliacrilamida con las fracciones solubles de MarA ................................... 43 Figura 6.8. Gel de poliacrilamida con las fracciones insolubles de MarA ................................ 44 Figura 6.8. Gel de poliacrilamida con luz ultravioleta con muestras de GFP ........................... 45 Figura 6.9. Antibiograma de ampicilina .................................................................................. 47 Figura 6.10. Antibiograma de kanamicina .............................................................................. 48 Figura 6.11. Sensibilidad a diferentes cantidades de ampicilina ............................................. 50 Figura 6.12. Sensibilidad a diferentes cantidades de kanamicina ........................................... 51 Figura 6.13. Sensibilidad a ampicilina sin el antibiótico de selección ...................................... 52 Figura 6.14. Sensibilidad a kanamicina sin el antibiótico de selección .................................... 53 Figura 6.15. Monitoreo del crecimiento bacteriano con el plásmido LL-37. ........................... 54 Figura 6.16. Estrías para probar la producción de GFP ......................................................... 55 Figura 6.17. Diagrama que ilustra la secuenciación de las partes .......................................... 56 Figura 6.18. Secuencias de pBad-AraC-RBS, de pGLO y del operón de arabinosa .............. 56 ÍNDICE DE ANEXOS Anexo 1. Fragmento de la secuencia del plásmido que contiene marA .................................. 64 Anexo 2. Mapa de restricción del plásmido que contiene a la bioparte MarA ......................... 65 Anexo 3. Fragmento de la secuencia del plásmido que contiene la bioparte LL-37 ............... 66 Anexo 4. Mapa de restricción del plásmido que contiene a la bioparte LL-37 ........................ 66 Anexo 5. Fragmento de la secuencia del plásmido que contiene la bioparte pLacI ................ 67 Anexo 6. Mapa de restricción del plásmido que contiene a la bioparte pLacI ......................... 67 Anexo 7. Fragmento de la secuencia del plásmido que contiene la bioparte pBad-AraC ....... 69 Anexo 8. Mapa de restricción del plásmido que contiene a la bioparte AraC+pBad ............... 70 Anexo 9. Fragmento de la secuencia del plásmido que contiene la bioparte RBS .................. 71 Anexo 10. Mapa de restricción del plásmido que contiene a la bioparte RBS ........................ 71 Anexo 11. Fragmento de la secuencia del plásmido que contiene la bioparte GFP ................ 73 Anexo 12. Mapa de restricción del plásmido que contiene a la bioparte GFP ........................ 73 1 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Expresión de proteínas recombinantes en E. coli Escherichia coli es uno de los sistemas más atractivos para la expresión heteróloga de proteínas gracias a su capacidad para crecer rápidamente y a densidades altas en sustratos convenientes. Aunque no se puede asegurar que el producto de un gen recombinante alcance niveles altos y sea biológicamente activo –debido a problemas de solubilidad o a modificaciones postraduccionales– se ha optimizado notoriamente su rendimiento y versatilidad, creando un organismo modelo para la producción de proteínas, del cual se ha documentado muy bien sus técnicas de transformación, fermentación y rendimiento de producción proteica, a diferencia de otros organismos. A continuación se revisan los aspectos más importantes que deben ser considerados para la expresión de proteínas en este organismo. 1.1.1. Número de copias y mantenimiento del plásmido Para garantizar una buena expresión, generalmente se clona el DNA heterólogo dentro de plásmidos multicopia: entre 15 y 60 copias aquellos derivados de pMB1/ColE1 o de hasta algunos cientos de copias como los pUC derivados de pMB1. Cuando se producen proteínas tóxicas para el hospedero, con la consecuencia de reducir su tasa de crecimiento, o bien al cultivar las células a altas densidades o en procesos continuos, una de las mejores formas para evitar la pérdida de los plásmidos es incorporar en los plásmidos genes de resistencia a antibióticos y suplementar al medio de cultivo con antibióticos. Una alternativa a los plásmidos es la inserción directa del gen heterólogo dentro del cromosoma de E. coli. Sin embargo, experimentalmente no se ha explotado ampliamente esta estrategia ya que el número de copias en el hospedero es menor a la alcanzada por los plásmidos (Baneyx, 1999). 2 1.1.2. Promotores Para poder controlar el inicio de la transcripción se necesita de un promotor, el cual es una región de DNA adyacente a un gen la cual promueve la transcripción constitutivamente o bajo inducción. En el caso de E. coli, el operón lac ha servido como paradigma de la regulación génica en los procariontes, por lo que muchos promotores utilizados para la transcripción de genes heterólogos derivan de elementos regulatorios de este operón. A pesar de que el promotor lac es relativamente débil y no suele utilizarse para una expresión alta de polipéptidos, es muy utilizado para expresar proteínas con cierto nivel de toxicidad, debido a que se puede controlar la transcripción mediante la inducción por isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) (Baneyx, 1999). No obstante, la fuga transcripcional del promotor lac representa un problema para la producción de proteínas de membrana u otras proteínas con alta toxicidad para el hospedero, por lo que el promotor de arabinosa, el cual presenta niveles de fuga transcripcionales menores al del promotor lac, constituye una alternativa para la producción de este tipo de proteínas. Este sistema utiliza L-arabinosa como inductor, la cual es un azúcar de bajo costo. Aunque se puede regular la expresión por araBAD al variar la concentración de L-arabinosa, existe una amplia heterogeneidad en la población celular, con algunas células completamente inducidas y otras que no se inducen en lo absoluto (Siegele, 1997). Esta variación poblacional depende de la expresión diferencial de los transportadores de arabinosa, por lo que se necesitaría crear una cepa capaz de sintetizar constitutivamente los transportadores de arabinosa o descubrir un inductor que no los utilice para poder controlar conexactitud los niveles de expresión de proteínas mediante el promotor araBAD (Hashemzadeh-Bonehi, 1998). 1.1.3. Traducción Para iniciar la traducción en E. coli se requiere de una secuencia complementaria al extremo 3' de la subunidad 16S del rRNA (sitio de unión a ribosoma), seguida de un codón de inicio (usualmente AUG). Aunque el espacio óptimo entre estos dos elementos es de 8 nt, la traducción se ve severamente afectada por variaciones en esta distancia, ya que la estabilidad de las estructuras secundarias del mRNA que se encuentran entre el sitio de unión al ribosoma y el codón de inicio pueden reducir dramáticamente la expresión génica al interferir con el ribosoma (Ringquist, 1992). 3 Las diferencias en el uso de codones entre procariontes y eucariontes pueden también tener un gran impacto en la expresión de proteínas heterólogas. Por ejemplo, los codones de arginina, AGA y AGG se encuentran con poca frecuencia en E. coli, mientras que en eucariontes son muy comunes. La presencia de estos codones en genes heterólogos afectan los niveles de acumulación de proteínas, de mRNA y de estabilidad en el plásmido; incluso en ciertos casos, pueden inhibir la síntesis de proteínas y el crecimiento celular (Zahn, 1996). 1.1.4. Plegamiento La sobreproducción de proteínas heterólogas en el citoplasma de E. coli suele acompañarse de un mal plegamiento y de la formación de agregados insolubles conocidos como cuerpos de inclusión. Aunque la formación de cuerpos de inclusión puede facilitar la purificación de proteínas, puede que no se obtenga un rendimiento alto de producto biológicamente activo. Un procedimiento usual para disminuir la formación de cuerpos de inclusión se logra al disminuir la temperatura de incubación, y las aproximaciones más recientes involucran el uso de proteínas asistentes como chaperonas o “foldasas” (disulfuroisomerasas) (Baneyx, 1999). 1.1.5. Proteínas de fusión Históricamente las proteínas de fusión surgieron como respuesta a la necesidad de purificar y estabilizar a las proteínas, así como de acoplar las actividades de las enzimas a una determinada vía metabólica. Hoy en día también son utilizadas para mejorar la solubilidad de proteínas heterólogas que de otra forma se agregarían en cuerpos de inclusión. La razón por la cual las proteínas de fusión facilitan el plegamiento de proteínas heterólogas es porque éstas adquieren rápidamente su conformación nativa al salir del ribosoma y promueven el plegamiento correcto de las unidades subsecuentes mediante reacciones de isomerización que suceden simultáneamente con la traducción. Existen sistemas de fusión comercialmente disponibles como la MBP (Maltose Binding Protein o proteína de unión a maltosa) y la tiorredoxina que sirven para aumentar la solubilidad de la proteína además de poder ser utilizadas como etiqueta de afinidad y la glutatión S-transferasa que puede ser utilizada para purificar a la proteína mediante inmunoprecipitación (Prinz, Aslund, Holmgren, & Beckwith, 1997). 4 1.2. Biología Sintética El presente trabajo pretende plantear las bases para el diseño de un sistema biológico en el que se manipule una vía de resistencia múltiple a antibióticos en Escherichia coli y la producción recombinante de un péptido antimicrobiano humano en el mismo hospedero, por lo que resulta conveniente utilizar herramientas de la Biología Sintética. Esta disciplina se enfoca en el diseño y la construcción de nuevos componentes biológicos a partir de modelos, evaluándolos mediante herramientas de la biotecnología y la biología molecular, siendo este aspecto computacional la diferencia con la ingeniería genética en el enfoque científico moderno. La Biología Sintética tiene como objetivo extender o modificar la conducta de los organismos para que realicen nuevas funciones y se ha enfocado en la creación y perfeccionamiento de dispositivos genéticos y módulos, que favorezcan la investigación de fenómenos naturales dentro de la Biología y generen una gran variedad de aplicaciones (Andrianantoandro, Basu, Karig, & Weiss, 2006; Purnick & Weiss, 2009). 1.2.1. Origen de la Biología Sintética El modelo del operón lac y el desarrollo de la tecnología del DNA recombinante dieron paso a los inicios de la Ingeniería Genética, iniciando una nueva etapa dentro de la biología experimental (Andrianantoandro et al., 2006). En 1978 Szybalksi y Skalka postularon que las nucleasas de restricción no sólo permitirían el análisis de genes individuales y una fácil construcción de DNA recombinante, sino que también permitirían el comienzo de la era de la Biología Sintética, en donde además de analizar y describir a los genes, se construirían y evaluarían nuevos arreglos genéticos (Endy, 2005). A finales del siglo XX surgieron varios intentos para estandarizar la forma en que se combinan diferentes fragmentos de DNA, resultando en el método de los BioBricks, un estándar en el que fragmentos de DNA son llamados biopartes, secuencias con una función definida que pueden ser combinadas de diferentes formas utilizando sitios de restricción estandarizados (Shetty, Endy, & Knight, 2008). Si la Biología Sintética es un campo totalmente nuevo o no es una cuestión debatible y se puede cuestionar si realmente es una disciplina apartada de la Ingeniería Genética y la Biotecnología o si sólo es una extensión de éstas. 5 1.2.2. Estandarización y dispositivos genéticos La estandarización es de gran importancia para establecer las reglas y especificaciones que requiere una disciplina, además de que permite unificar criterios y métodos para ser utilizados por diferentes grupos de investigación. La noción de dispositivo es una abstracción basada en procesos físicos que permiten la descomposición de sistemas en partes básicas funcionales. Los dispositivos biológicos procesan señales de entrada para producir señales de salida regulando el flujo de información, realizando funciones metabólicas y biosintéticas, e interaccionando con otros dispositivos y sus ambientes (Andrianantoandro et al., 2006). Los biólogos sintéticos diseñan sistemas complejos combinando biopartes, las unidades de diseño básicas que representan funciones biológicas, ya sean regulatorias (como un promotor de la expresión génica), traduccionales (como un sitio de unión a ribosoma), o post-traduccionales (un marco abierto de lectura que codifique para una proteína) (Helman, Lim, Pincus, & Sommovilla, 2007). La mayoría de las aplicaciones en la Biología Sintética requieren de diferentes dispositivos que trabajen a la par, utilizando estrategias de clonación simples para ensamblar las biopartes requeridas en un plásmido, antes de ser transformadas dentro de un organismo (Helman et al., 2007). Un módulo es un grupo de dispositivos con funciones interconectadas que realizan tareas complejas. La dificultad de construir módulos con diversos dispositivos naturales radica en que la evolución los ha optimizado para que actúen en sus contextos naturales, por lo que pueden no funcionar cuando se conectan con otros dispositivos en contextos artificiales (Andrianantoandro et al., 2006). 1.2.3. BioBricks El estándar de los BioBricks se ha vuelto cada vez más común gracias a la facilidad que aportan sus mecanismos de clonación y porque sus partes y módulos se encuentran catalogados en el Registry of Standard Biological Parts, una base de datos auspiciada por el Instituto Tecnológico de Massachusetts (MIT) que provee acceso gratuito a un conjunto de secuencias genéticas con funciones biológicas básicas que pueden ser utilizadas para programar sistemas biológicos sintéticos. Cualquiera puede contribuir, diseñar o mejorar las partes almacenadas en el registro y se puede tener acceso al DNA al participar en el congreso iGEM (International Genetically 6 Engineered Machine), cuyo objetivo es fomentarel desarrollo del registro y de la Biología Sintética. Estos sistemas hacen uso de una combinación específica de enzimas de restricción que permiten unir genes de una forma iterativa y aprovechan la flexibilidad que da la síntesis de genes para eliminar y añadir sitios de restricción. Entre los sistemas estandarizados, el RFC10 (por la nomenclatura utilizada por la BioBrick Fundation, también conocido como “el estándar de Knight”), es por mucho el más utilizado en Biología Sintética para unir biopartes (Castro, 2011). Las partes en el RFC10 están flanqueadas por sitios de restricción que forman un prefijo y un sufijo. En el extremo 5' se encuentran los sitios de restricción para las enzimas EcoRI, NotI y XbaI, mientras que en el extremo 3' se encuentran los de SpeI, NotI y PstI (figura 1.1). El principio de este sistema es cortar los plásmidos de interés con enzimas de restricción para liberar una bioparte, preparar un vector, ligar esta bioparte con el vector, transformarlo en células competentes y corroborar que el proceso se haya realizado correctamente mediante el análisis por electroforesis de una reacción de PCR o de una reacción de digestión. De forma adicional se han añadido bases entre los sitios de restricción para inhibir la metilación accidental, que afectaría la actividad de las endonucleasas. El diseño del sistema de Knight permite unir una secuencia de DNA en frente o detrás de otra, de manera independiente del contenido de las partes, manteniendo asimismo los sitios de restricción. De esta forma, la construcción no es seriada y pueden realizarse varios ensamblajes simultáneamente (Castro, 2011). Figura 1.1. Sistema estándar RFC 10 de los Biobricks. Se muestra la ubicación de los sitios de restricción de un prefijo y un sufijo en una bioparte en dos esquemas diferentes A y B (modificada de de la Fuente Colmenares, 2013). 7 1.3. Péptidos antimicrobianos Parte del sistema inmune de los eucariontes está compuesto por barreras físicas y moléculas capaces de inhibir microorganismos para evitar infecciones de patógenos, entre estas moléculas se encuentran los péptidos antimicrobianos. La mayor parte de estos péptidos son moléculas catiónicas con regiones cargadas y regiones hidrofóbicas separadas espacialmente, siendo estos rasgos estructurales los que determinan su mecanismo de acción (Bals, 2000; Vandamme, Landuyt, Luyten, & Schoofs, 2012). Los péptidos antimicrobianos pueden inhibir la biosíntesis de proteínas, de ácidos nucleicos y de la pared celular del microorganismo invasor; además son quimiotácticos para leucocitos, atrayéndolos al sitio de infección o inflamación. Adicionalmente se ha demostrado que los péptidos antimicrobianos son capaces de unirse a lipopolisacáridos para neutralizarlos y promover la angiogénesis y la cicatrización (Duplantier & van Hoek, 2013). Los péptidos antimicrobianos difieren en tamaño, secuencia de aminoácidos y motivos estructurales. Usualmente el producto traduccional primario de los péptidos antimicrobianos es un prepropéptido consistente de una secuencia señal en el extremo N-terminal con el retículo endoplasmático como destino, un prosegmento y un péptido catiónico en el extremo C-terminal con actividad antimicrobiana posterior al corte. El prosegmento usualmente es aniónico en carga y se le han propuesto varias funciones biológicas, entre ellas el correcto funcionamiento del extremo C-terminal, el tráfico intracelular y la inhibición de la actividad del péptido maduro. El propéptido es cortado durante etapas posteriores en el procesamiento intracelular o después de su secreción al espacio extracelular (figura 1.2) (Bals, 2000). A pesar de que los péptidos antimicrobianos han co-evolucionado con bacterias durante millones de años, hasta ahora no se ha descrito un mecanismo de resistencia generalizado hacia ellos; esto implica una ventaja potencial para el uso de los péptidos antimicrobianos como alternativa a otros antibióticos (Duplantier & van Hoek, 2013). 8 1.3.1. Catelicidinas Las catelicidinas (nombradas así por su habilidad para inhibir a la proteasa catepsina L) son un grupo extenso y diverso de péptidos antimicrobianos que contienen un dominio N-terminal denominado dominio catelina. La familia de las catelicidinas muestra una gran diversidad de secuencia, la cual reside en la separación del péptido activo de la secuencia conservada N- terminal, ocasionando que las catelicidinas sean péptidos antimicrobianos estructuralmente conservados con α-hélices anfipáticas, pero sin secuencias conservadas (Duplantier & van Hoek, 2013). Se han identificado 56 miembros de la familia de las catelicidinas en un amplio rango de organismos: peces, anfibios, reptiles y mamíferos. El hecho de que se encuentren tan conservadas evolutivamente sugiere una gran relevancia para el sistema inmune de estos organismos. Sin embargo, sólo recientemente en la evolución, las catelicidinas han adoptado un papel inmunoestimulatorio e inmunomodulatorio (Duplantier & van Hoek, 2013; Kościuczuk et al., 2012; Vandamme et al., 2012). 1.3.2. Características del péptido antimicrobiano LL-37 LL-37 es el único péptido antimicrobiano humano de la familia de las catelicidinas y muestra actividad antimicrobiana hacia varias bacterias patógenas para el humano tanto Gram negativas (como Pseudomonas aeruginsa, Salmonella typhimurium y Escherichia coli) como Gram positivas (como Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis y Listeria monocytogenes) en concentraciones submicromolares (MIC, <10µg/ml) (Turner, Cho, Dinh, Waring, & Lehrer, 1998), por lo que hay un gran interés en producir este péptido para aplicaciones farmacéuticas (Reddy KVR, Yedery RD, 2004). LL-37 es producido por diferentes tipos de células en el ser humano; es expresado constitutivamente en neutrófilos (Sørensen, Arnljots, Cowland, Bainton, & Borregaard, 1997), linfocitos NK (Natural Killer)(Büchau et al., 2010), mastocitos (Di Nardo, Vitiello, & Gallo, 2003) y es almacenado como su precursor en gránulos. Otras células del sistema inmune innato que expresan catelicidinas son las células dendríticas, los monocitos y los macrófagos (Vandamme et al., 2012). La expresión de LL-37 en los neutrófilos se retroalimenta positivamente, generando altas concentraciones de este péptido en el sitio de la inflamación. Esta descarga de LL-37 genera una fuerte respuesta inmune, capaz de terminar rápidamente con la infección. 9 La activación de los TLR(s) (Toll-like receptors) y/o una alteración en el estado de las citosinas, causado por una infección o daño celular, provoca la activación de la desgranulación de la célula, liberando el precursor inactivo hCAP18 (de 18 kDa y 170 aa) al medio extracelular, donde es procesado por la proteasa 3 en los neutrófilos o la calicreína en los queratinocitos para generar el péptido LL-37 (de 37 aa) en su forma activa. También se ha reportado que en la superficie de la piel, LL-37 es degradado por serín-proteasas en fragmentos más pequeños que pueden conservar su actividad antimicrobiana, pero que pierden sus efectos inmunomodulatorios e inmunoestimulantes (figura 1.2) (Sørensen et al., 1997; Wu, 2011). Figura 1.2. Representación del procesamiento típico de una catelicidina (modificada de Vandamme et al., 2012). Señal Preproteína –Calicreína –Proteasa 3 Dominio catelina Péptido Dominio catelina Péptido Enzimas procesadoras: Proproteína Péptido activo Dominio catelina Péptido Enzimas procesadoras: –Serín-proteasas endógenas –Proteasas microbianas Fragmentos activos 10 1.3.3. Estructura de LL-37 El péptido LL-37contiene un 44% de residuos hidrofílicos, con once aminoácidos básicos y cinco aminoácidos ácidos, dándole una carga neta positiva de +6 a pH fisiológico. En solución acuosa LL-37 exhibe un espectro de dicroísmo circular que corresponde a una estructura desordenada, sin embargo, en membranas donde el ambiente es lipofílico o en soluciones con concentraciones salinas milimolares, muchos de los aminoácidos son capaces de formar puentes de hidrógeno intramoleculares en donde los grupos N-H del esqueleto donan un puente de hidrógeno a los grupos C=O del esqueleto, que están cuatro aminoácidos antes en la secuencia, generando una estructura de α-hélice, la cual es catiónica y anfipática (figura 1.3) (Dean, Bishop, & van Hoek, 2011; Porcelli, Verardi, Shi, Henzler-wildman, & Ramamoorthy, 2008). La naturaleza anfipática es un rasgo característico de la hélice α de LL-37, ilustrada en la figura 1.3. Para obtener la estructura más aproximada a LL-37 en las membranas, Porcelli et al. elucidaron la estructura tridimensional utilizando Resonancia Magnética Nuclear de LL-37 en micelas de dodecilfosfocolina. En dilución, ni el extremo N ni el C terminal mostraban una estructura definida y estaban expuestos al solvente, mientras que en las micelas se formaban las dos hélices de LL-37, las cuales articulaban en el residuo K12 y eran soportadas por conjuntos hidrofóbicos formados por los residuos I13, F17 e I20, con un puente salino entre K12 y E16. La cara hidrofílica de LL-37 se mostró expuesta hacia la fase acuosa y la hidrofóbica se encontró acoplada en la región micelar. La superficie cóncava de LL-37 es hidrofóbica y se encuentra bordeada por residuos cargados positivamente, interaccionando con moléculas cargadas negativamente, como lipopolisacáridos, material genético y paredes celulares bacterianas. La superficie hidrofóbica de LL-37 está conformada por cuatro cadenas laterales de fenilalaninas que apuntan hacia la misma dirección (Li, Li, Han, Miller, & Wang, 2006; Porcelli et al., 2008). Representación de rueda helicoidal de LL-37, ilustrando la naturaleza anfipática y catiónica de LL-37 (modificada de Duplantier & van Hoek, 2013) Figura 1.3. Naturaleza anfipática de LL-37; (A) Representación de rueda helicoidal de LL-37. (B) Proyección frontal de la hélice de LL-37 (modificada de Duplantier & van Hoek, 2013). Hidrofóbico F17 L28 V21 G14 K25 K12 R29 Q22 K18 I24 I13 I20 F27 E16 R23 R19 D26 K 15 LLGDFFKSKE Hidrofílico A. B. Hidrofóbico Hidrofílico 11 1.3.4. Mecanismo de acción La actividad antimicrobiana de LL-37 en contra de bacterias Gram negativas como E. coli ha sido recientemente caracterizada en diferentes etapas utilizando microscopía de fluorescencia. En la primera fase, LL-37 se une en la membrana externa a los lipopolisacáridos y a los antígenos O, logrando saturar la membrana externa aproximadamente en un minuto. La translocación a través de la membrana externa hacia el espacio periplasmático suele suceder de cinco a veinticinco minutos después, inhibiendo el crecimiento, posiblemente a causa de una interferencia de LL-37 con la biogénesis de la pared celular (Sochacki, Barns, Bucki, & Weisshaar, 2011). Se han propuesto tres modelos para explicar cómo los péptidos antimicrobianos inducen la muerte en las bacterias una vez que se asocian a la membrana, como se muestra en la figura 1.4. En el modelo de “barril-duela”, el péptido antimicrobiano se une, agrega e inserta dentro de la membrana lipídica interna con la cara hidrofóbica alineada con la región lipídica y la cara hidrofílica, formando la región interior del poro. En el modelo toroidal, el péptido antimicrobiano se agrega y dobla las monocapas lipídicas a través del poro para que el centro de la bicapa se alinee por los grupos polares tanto de los péptidos como de la monocapa lipídica. Por último, en el modelo de formación de micelas el péptido antimicrobiano desintegra a la membrana al orientarse paralelamente a la superficie de la bicapa lipídica, formando una capa extensa que obliga a los fosfolípidos a formar micelas. En los tres casos, la interacción resulta en poros dentro de la membrana interna, provocando la lisis bacteriana (Duplantier & van Hoek, 2013). Figura 1.4. Esquemas de las interacciones celulares asociadas a LL-37 (modificada de Duplantier & van Hoek, 2013). Membrana citoplasmática Barril-duela Poro-toroidal Formación de micelas 12 1.4. Resistencia múltiple a antibióticos en E. coli Los métodos utilizados con mayor frecuencia para generar bacterias resistentes a antibióticos consisten en el uso de plásmidos o transposones que contengan genes de resistencia a antibióticos. Un mecanismo alternativo para la generación de mutantes de Escherichia coli resistentes a antibióticos consiste en la activación de alguno de los genes del locus mar. Los genes que se encuentran en este locus confieren resistencia a diferentes sustancias, mediante la alteración de la expresión de un gran número de genes en el cromosoma bacteriano, siendo el activador transcripcional MarA el que activa a los genes encargados de la resistencia a antibióticos (Alekshun, 1997). El locus mar de E. coli está compuesto por dos unidades transcripcionales divergentes: marC y marRAB, las cuales están separadas por el operador marO. El operador marO presenta dos sitios, los promotores PmarI y PmarII, los cuales son divergentes y se encuentran localizados en la región promotor-operador (figura 1.5). marC codifica para una proteína de membrana de función desconocida (Barbosa & Levy, 2000) y marRAB codifica al represor de mar (MarR), al activador (MarA) y a otra proteína de función desconocida (MarB) (Alekshun, 1997). Figura 1.5. Organización del locus mar en Escherichia coli (modificado de Alekshun, 1997). En condiciones no estresantes, MarR se une a los sitios I y II del operador de mar (marO) y bloquea la transcripción del operón marRAB (Robert G Martin & Rosner, 1995). Cuando se inactiva MarR, la expresión de marRAB es constitutiva, sin embargo, se ve afectada por un gran número de activadores transcripcionales, entre ellos MarA, Rob (un parálogo de MarA en E. coli que es expresado constitutivamente), Fis (una proteína multifuncional de unión a DNA) y SoxS (un parálogo de MarA en E. coli que controla la resistencia a estrés oxidativo), los cuales se unen a PmarII. Además de activar su propia transcripción, MarA también regula la expresión de muchos otros genes cromosomales, produciendo fenotipos diversos que le proporcionan a E. coli una respuesta rápida a diversos factores de estrés (Alekshun, 1997). marC marR marA marB PmarI PmarII MarO 13 1.4.1. Activador transcripcional MarA MarA es un regulador transcripcional global que modula la expresión de al menos 40 genes cromosomales en Escherichia coli, confiriéndole varios niveles de resistencia a un gran número de diferentes agentes nocivos en el ambiente, como antibióticos, desinfectantes y agentes de estrés oxidativo (Barbosa & Levy, 2000; Wall, Markowitz, Rosner, & Martin, 2009). MarA es un miembro de la familia de activadores transcripcionales XylS/AraC. Las proteínas de esta familia suelen activar un gran número de genes, algunos de los cuales producen resistencia a antibióticos y a estrés oxidativo. Todas las proteínas de esta familia tienen un dominio hélice-giro- hélice de unión a DNA de 21 residuos de aminoácidos (Alekshun, 1997). 1.4.2. Mecanismo de acción de MarA MarA activa la transcripción al unirse como monómero a una secuencia de 20 pb de DNA (en un consenso de AYnGCACnnWn-nRYYAAAYn, donde R=A o G; Y=C o T; W=A o T y n=A, T, C o G), localizada en la región del promotor de los genes controlados. Se especula que la razónpor la cual MarA tiene tan poca especificidad se debe a que la segunda hélice de este dominio contiene un gran número de aminoácidos cargados positivamente, una característica poco común en los factores de transcripción (Alekshun, 1997; R G Martin, Gillette, Rhee, & Rosner, 1999). La relación entre la localización y orientación del sitio de unión de MarA, la caja mar y los hexámeros -10 y -35 es promotor específico. Los promotores de los miembros del regulón mar, entre ellos mar, fpr y acrAB, contienen una caja mar río arriba de la secuencia -35 con una orientación reversa relativa a los elementos de reconocimiento de la RNA polimerasa, lo que provoca una activación por establecimiento de contactos entre MarA y el dominio carboxilo terminal de la RNA polimerasa (figura 1.6) (Jair, Fawcett, Fujita, Ishihama, & Wolf, 1996; R G Martin et al., 1999). 14 1.4.3. Estructura de MarA MarA es una proteína de 127 residuos de aminoácidos y consiste en dos subdominios similares, cada uno de los cuales contiene un motivo hélice-giro-hélice de unión a DNA. Las dos hélices de reconocimiento se insertan en la misma cara del surco mayor del DNA, separándose 27 Å, doblando la hebra de DNA aproximadamente 35º (figura 1.6). La especificidad en el reconocimiento de la secuencia se da gracias a varias interacciones entre las hélices de reconocimiento y el surco mayor del DNA (Avies, 1998). Figura 1.6. Diagrama de listón para el complejo RNA polimerasa-MarA-DNA mostrando la inserción de las hélices de reconocimiento 3 y 6 de MarA en el surco mayor del DNA, provocando un doblamiento del DNA. El subdominio N se une a la secuencias río abajo del promotor mar y se posiciona cerca del sitio de inicio de transcripción, mientras que el subdominio C se une a la secuencia río arriba (modificado de Dangi, Gronenborn, Rosner, & Martin, 2004). Subunidad α de la RNA polimerasa MarA C N 6 3 15 1.5. Bomba de eflujo AcrAB-TolC Además de activar su propia transcripción y la de muchos genes más, MarA, al unirse a las regiones adyacentes de los promotores acrAB y tolC, regula positivamente la expresión de la bomba de eflujo AcrAB-TolC (Aono, Tsukagoshi, & Yamamoto, 1998). El complejo AcrAB-TolC abarca las membranas internas y externas de Escherichia coli y funciona como la mayor bomba de eflujo para resistencia a antimicrobianos. Impulsada por fuerza protón motriz, la bomba AcrAB-TolC efluye sales biliares, detergentes, solventes orgánicos y un gran número de antibióticos no relacionados estructuralmente (Eicher & Seeger, 2007). 1.5.1. Mecanismo de acción AcrA y AcrB coexisten en la membrana interna formando un complejo que permanece asociado durante su acoplamiento a TolC. El acoplamiento de las horquillas α de AcrA a TolC promueve cambios conformacionales en el dominio proximal a la membrana de AcrA, los cuales se necesitan como estimulación para la actividad de transporte de AcrB. Los transportadores activados AcrAB generan la apertura de la punta periplasmática de TolC, permitiendo la difusión de los sustratos a través de la membrana externa. La conformación abierta del complejo es de vida corta y se relaja a un estado cerrado con o sin la disociación de las horquillas α de AcrA a TolC (Tikhonova, Yamada, & Zgurskaya, 2011). La estructura de AcrB está compuesta por tres monómeros que representan estados consecutivos en un ciclo de transporte. Uno de los monómeros no muestra interacción aparente con sus vecinos, por lo que su conformación es denominada L (Loose). Otro de ellos exhibe una apertura desde dentro del poro hacia el vórtice del trímero de AcrB, por lo que su conformación es denominada O (Open). En el monómero O, el subdominio PN1 (Pore Domain 1) está direccionado hacia los subdominios PN1 y PN2 de su vecino, interaccionando fuertemente con ellos. Esta interacción impone una constricción conformacional en su monómero vecino, denominado T (Tight). Un posible mecanismo de transporte es la rotación de cada una de las conformaciones, en donde L pasa a T, T pasa a O y O pasa de vuelta a L. Los subdominios PN1, incluyendo los poros de las hélices, podrían tomar el papel de los dientes de un trinquete que fuerzan los cambios conformacionales en este orden. El cambio conformacional de PN1 del monómero O al 16 L causa una pérdida de interacción con los subdominios PN1 y PN2 del monómero T y permite la conversión de los subdominios PN1/PC2 de la conformación T a la O. En consecuencia, el sustrato al que está unido el monómero T sale de la cavidad hidrofóbica localizada en la interfase de los subdominios PN2/PC1 durante la transición hacia la conformación monomérica O. Esta conversión del subdominio PN1 del monómero T hacia la conformación inclinada del monómero O restablece la interacción con el subdominio PN2 del monómero L e induce los cambios conformacionales que generan la cavidad de unión al sustrato en la interfase PN2/PC1 y el cambio conformacional de L a T. Esta secuencia de eventos forma una vía de eflujo para el sustrato a través de túneles con un mecanismo de transporte análogo a una bomba peristáltica. La figura 1.7 representa el mecanismo de expulsión de acridina. La difusión del sustrato dentro del túnel se ve limitada por el sitio de oclusión, cuya posición migra dentro del vórtice, guiando al sustrato hacia TolC. La naturaleza inespecífica de este tipo de transporte sustenta el amplio espectro de especificidad de sustrato observado en la bomba de eflujo AcrAB-TolC (Eicher & Seeger, 2007). Figura 1.7. Mecanismo de transporte rotacional de AcrB. (A) Vista lateral de dos monómeros del trímero AcrB, de AcrA y de TolC. (B) Vista superior de los monómeros O, L y T (rojo, azul y amarillo respectivamente) indicando los sitios de unión al sustrato. Las diferentes formas geométricas reflejan diferentes afinidades por los sustratos transportados; triángulo para afinidad baja, rectángulo para afinidad alta y círculo para afinidad nula (modificada de Eicher & Seeger, 2007). TolC AcrA AcrB 17 2. ANTECEDENTES Se han realizado diversos esfuerzos para producir LL-37 recombinante, sin embargo el rendimiento no ha sido el suficiente para poderlo producir industrialmente. A continuación se describen algunos de los intentos más exitosos y se mencionan los trabajos sobre MarA que hicieron considerar su sobreexpresión como una propuesta alterna para mejorar el rendimiento de LL-37 en Escherichia coli. 2.1. Relación con la resistencia al péptido antimicrobiano LL-37 Warner y Levy en 2010 compararon la susceptibilidad de mutantes que sobreexpresan MarA ante péptidos antimicrobianos, entre ellos LL-37, en comparación a la cepa control AG100 de E. coli. Se observó que las cepas con sobreexpresión de MarA mostraban diez veces menor susceptibilidad a LL-37 y atribuyeron estos efectos a la activación de la bomba de eflujo AcrAB- TolC por MarA, ya que mutantes en donde se perdía AcrAB o TolC anulaban el decremento en la susceptibilidad a LL-37 (Warner & Levy, 2010). 2.2. Relación de AcrAB-TolC con LL-37 Utilizando mutantes de E. coli con deleciones en AcrAB y en TolC, Warner y Levy realizaron experimentos en donde se examinaba la respuesta de distintas cepas cuando se agregaba LL-37 al medio. Demostraron que la cepa con mutaciones en acrAB era 20 veces más susceptible a LL-37 que la cepa silvestre, que la cepa con deleciones en tolC era 200 veces más sensible a este péptido antimicrobiano y que una cepa con deleciones en acrR, el represor de acrAB, era 50 veces más resistente a LL-37, siendo consistente con estudios anteriores del mecanismo de resistencia a péptidos antimicrobianos basados en AcrAB (Warner & Levy, 2010). 18 Una posible explicación para la expulsión de LL-37 se observa al estudiar a las defensinas α y β, péptidos antimicrobianoshumanos que inhiben el crecimiento de E. coli pero que no son expulsados por la bomba de eflujo AcrAB-TolC. A pesar de que estos péptidos tienen tamaño similar a LL-37, difieren en que no presentan puentes disulfuro, lo que interfiere con la capacidad de estos péptidos para ser expulsados a través del complejo AcrAB-TolC, lo que sugiere que la presencia de puentes disulfuro en LL-37 es lo que le permite ser expulsado (Warner & Levy, 2010). 2.3. LL-37 recombinante con actividad antimicrobiana al expresarse en P. pastoris LL-37 fue expresado en una levadura metilotrófica, Pichia pastoris, utilizando el promotor de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, un fuerte promotor constitutivo. Para expresar el péptido antimicrobiano en su estado funcional, se tomó la secuencia del péptido activo y se le añadió la secuencia del codón inicial para permitir su traducción. Se purificó el péptido, mostrando actividad antimicrobiana en contra de Micrococcus luteus y se analizó la secuencia de aminoácidos de este LL-37 recombinante, mostrando que la secuencia seguía íntegra y que se logró expresar este péptido en su forma activa añadiendo una metionina a la región N-terminal, sin necesidad de utilizar precursores como proteínas de fusión (Hong, Lee, Kim, & Choi, 2007). A pesar de que Pichia pastoris permite expresar LL-37 en su forma activa, no se considera el organismo más adecuado para lograr un buen rendimiento en la producción de proteínas recombinantes. Escherichia coli tiene un rendimiento mucho mejor para la producción de DNA y proteínas recombinantes por varias razones. Las células competentes de E. coli pueden almacenarse congelándolas mientras que las células de Pichia pastoris deben ser transformadas inmediatamente después de hacerlas competentes. Los rendimientos de expresión en P. pastoris varían mucho entre diferentes clonas, y usualmente se necesita analizar un gran número de clonas para conocer cuál es la que mejor produce la proteína de interés. En P. pastoris se necesita de días para llegar a los niveles óptimos de expresión, mientras que E. coli llega al momento óptimo en algunas horas (Brondyk, 2009). 19 2.4. LL-37 recombinante con actividad lítica al expresarse en E. coli Liu et al. utilizaron un vector para la expresión inducible de LL-37, utilizando el promotor pBAD, que se induce por arabinosa, para observar su efecto en la cepa Top 10 de Escherichia coli bajo condiciones anaeróbicas y aeróbicas. La secuencia de LL-37 que utilizaron fue la misma que utilizó Hong para producirlo en Pichia pastoris (la secuencia del péptido activo con una metionina inicial añadida a la región N-terminal). La inducción de LL-37 provocó inhibición en el crecimiento y alteración en la morfología celular, generando un fenotipo filamentoso. Este estudio mostró que la expresión intracelular de LL-37 en E. coli inhibe el crecimiento tanto en condiciones anaeróbicas como aeróbicas y que la acumulación intracelular de LL-37 influye en el estatus iónico y de óxido-reducción de la célula en ambas condiciones (Liu et al., 2013). 2.5. Bomba AcrAB-TolC como mecanismo para la expulsión de desechos intracelulares Estudios recientes han mostrado que las concentraciones intracelulares y extracelulares de varios metabolitos intracelulares se ven afectadas por la expresión de TolC. Tatsumi et al. (2008) reportaron que la producción excesiva de porfirinas y cisteína son tóxicas para la célula y tienen que ser expulsadas al medio. Cuando se añade exógenamente el ácido d- amino levulínico, el precursor de la porfirina, éste estimula la biosíntesis de porfirina, tanto en la cepa silvestre de E. coli como en mutantes deficientes de TolC. Sin embargo, las mutantes en tolC acumulan grandes cantidades de porfirina y porfirinógenos intracelularmente, mientras que la cepa silvestre los excreta al medio. Los autores proponen que el ácido d-amino levulínico se metaboliza en la célula hacia porfirina y porfirinógeno, y que el exceso de éstos es expulsado de la célula por un sistema de eflujo dependiente de TolC (Tatsumi & Wachi, 2008). Asimismo, TolC en E. coli ha sido relacionado con el transporte de los sideróforos requeridos en la adquisición de hierro. Esta adquisición en respuesta a deficiencias de hierro dentro de la célula se ha atribuido a una enterobactina, la cual es secretada al medio para después ser convertida en una enterobactina férrica y ser transportada de vuelta a la célula. Deleciones en tolC resultan en una pérdida total en la exportación de enterobactina y en la adquisición de hierro (Zgurskaya, Krishnamoorthy, Ntreh, & Lu, 2011). 20 2.6. Aumento de la resistencia a la producción recombinante de geraniol mediante la sobreexpresión de MarA El geraniol es un alcohol con aplicaciones muy diversas en la industria y que se puede producir en E. coli mediante la sobreexpresión de la geranil difosfato sintasa y la expresión de la primera parte de una vía de mevalonato recombinante. Sin embargo, el geraniol es un producto tóxico para E. coli, por lo que su producción baja considerablemente (Zhou et al., 2014). La sobreexpresión de MarA promueve una tolerancia 104 veces mayor en E. coli hacia geraniol, en comparación con mutantes con deleciones en marA y tolC, por lo que Shah et al. –tomando en cuenta que el aumento en la concentración de la bomba de eflujo AcrAB-TolC generado solamente por la sobreexpresión del regulador transcripcional MarA es suficiente para incrementar la tolerancia al geraniol– proponen este mecanismo como una alternativa para generar geraniol recombinante y lograr que las células de E. coli bombeen geraniol al medio extracelular, confiriéndoles resistencia, y generando un mayor rendimiento en la producción de geraniol (Shah et al., 2013). 21 3. JUSTIFICACIÓN El presente trabajo pretende plantear las bases para el diseño de un sistema biológico en el que se pueda producir de manera recombinante un péptido antimicrobiano de forma eficiente en E. coli. Sabiendo que MarA disminuye la susceptibilidad de E. coli a LL-37 cuando éste se encuentra en el medio extracelular, que la sobreexpresión de MarA está relacionada con la expulsión de desechos intracelulares y que LL-37 se puede producir en su forma activa en Escherichia coli (resultando en la inhibición del crecimiento celular) es posible crear un sistema en el que al sobreexpresar MarA aumente la expresión recombinante de LL-37. Cualquiera de los tres escenarios posibles –que disminuya la inhibición del crecimiento celular, que aumente la inhibición o que no se muestren cambios– arrojaría más preguntas interesantes tanto sobre el mecanismo de acción mediante el cual la expresión de MarA disminuye la susceptibilidad a LL-37, como del mecanismo de acción mediante el cual LL-37 interfiere con las membranas de E. coli. Ya que el proyecto en general pretende crear un sistema en el que se manipule una vía de resistencia múltiple a antibióticos en E. coli mediante la sobreexpresión del activador transcripcional MarA y se produzca recombinantemente al péptido antimicrobiano humano LL- 37 en el mismo hospedero, se utilizará el método de las biopartes de la Biología Sintética, lo que permitirá caracterizar cada una de las partes y su funcionamiento, antes de unir los dos componentes del sistema (MarA y LL-37). 22 4. OBJETIVOS 4.1. Objetivos 1) Diseñar, construir y caracterizar un plásmido para que Escherichia coli sobreexprese el factor de transcripción bacteriano MarA. a) Construir el plásmido de sobreexpresión de MarA bajo el promotor plac a partir de BioBricks. b) Analizar por SDS-PAGE los cambios en el perfil de expresión de E. coli transformada con la construcción. c) Verificar el fenotipo de resistencia múltiple a antibióticos mediante antibiogramas de E. coli transformada con la construcción a diferentes concentraciones de antibióticos.2) Diseñar, construir y caracterizar un plásmido para que E. coli produzca el péptido antimicrobiano humano LL-37. a) Construir el plásmido de expresión de LL-37 bajo el promotor pBAD a partir de los BioBricks. b) Analizar la viabilidad de células transformadas con la construcción LL-37 al inducir con arabinosa. 23 5. MATERIALES Y MÉTODOS 5.1. Plásmidos Todos los plásmidos utilizados en este trabajo cumplen con las especificaciones del RFC 10 de la BioBrick Fundation. Las biopartes pLacI, pBad-AraC, RBS y GFP se obtuvieron de las placas 2, 3 y 5 del Registry Distribution del 2013 del iGEM (International Genetically Engineered Machine). Las biopartes MarA y LL-37 fueron sintetizadas por GenScript Corporation con los estándares del RFC 10 de la BioBrick Fundation e incorporadas al Registry of Standard Biological Parts como parte de la presentación de este proyecto en la competencia iGEM del 2013. Los plásmidos construidos en este trabajo fueron diseñados in silico utilizando el programa SnapGene versión 2.5 (GSL Biotech LLC, Chicago, IL, U.S.A.). Todas las secuencias se muestran en los anexos. 5.1.1. Bioparte MarA El gen que codifica para el factor de transcripción de resistencia múltiple a antibióticos (MarA) fue obtenido a partir de una síntesis artificial de la secuencia de marA de Escherichia coli cepa K-12 subcepa MG1655, tomada de la Nucleotide Database del National Center of Biotechnology Information (NCBI) en http://www.ncbi.nlm.gov. La síntesis fue realizada por GenScript Corporation. La secuencia de marA (anexo 1) se encuentra flanqueada por los sitios de corte de las enzimas de restricción EcoRI, NotI y XbaI como prefijo de la secuencia y SpeI, NotI y PstI como sufijo. El gen que codifica para el factor de transcripción de resistencia múltiple a antibióticos se encuentra en el plásmido pUC57 de 2,710 pb, con resistencia a ampicilina y con sitio de origen de replicación pMB1, con 100-300 copias por célula. Este vector contiene la secuencia complementaria a los oligonucleótidos iGEM Fw y iGEM Rv, lo que simplifica la comprobación de una ligación exitosa mediante PCR (anexo 2). 24 5.1.2. Bioparte LL-37 El gen que codifica para el péptido antimicrobiano fue obtenido a partir de una síntesis artificial de la secuencia del fragmento activo de ll-37 (los 37 aa con actividad antimicrobiana más el codón ATG para la metionina inicial) de Homo sapiens tomada de la Nucleotide Database del National Center of Biotechnology Information (NCBI) en http://www.ncbi.nlm.gov. La síntesis fue realizada por GenScript Corporation. La secuencia de ll-37 (anexo 3) se encuentra flanqueada por los sitios de corte de las enzimas de restricción EcoRI, NotI y XbaI como prefijo de la secuencia y SpeI, NotI y PstI como sufijo. El gen que codifica para el péptido antimicrobiano LL-37 se encuentra en el plásmido pUC57 de 2,710 pb, con resistencia a ampicilina y sitio de origen de replicación pMB1, con 100-300 copias por célula. Este vector contiene la secuencia complementaria a los oligonucleótidos iGEM Fw y iGEM Rv (anexo 4). 5.1.3. Bioparte pLacI La secuencia del promotor lac fue obtenida del Registry Distribution del iGEM del 2013 (Placa 3, 20J), que junto con un sitio de unión a ribosoma conforman la bioparte BBa_J04500. Este promotor fue utilizado para expresar a MarA y a GFP (utilizada como control). Esta bioparte consiste en un regulador sensible a LacI y a la proteína CAP (Proteína Activadora por Catabolitos). Contiene dos sitios de regulación, al primero se acopla la proteína CAP y al segundo se acopla la proteína LacI. Cuando LacI y CAP se acoplan a los sitios de regulación se inhibe la transcripción y cuando se separan la promueve. En presencia de lactosa o análogos a la lactosa como IPTG, LacI cambia de conformación y se separa de este regulador, activando la transcripción. Esta secuencia es el promotor natural del operón LacZYA, e incluye la secuencia terminal del gen lacI, pero no la región promotora para este gen parcial. El inserto de pLac fue obtenido mediante PCR de Escherichia coli cepa K-12 subcepa MG1655 (DeCelle, 2005). La secuencia de pLacI se muestra en el anexo 5 y se encuentra flanqueada por los sitios de corte de las enzimas de restricción EcoRI, NotI y XbaI como prefijo de la secuencia y SpeI, NotI y PstI como sufijo de la secuencia, y se encuentra flanqueada por la secuencia complementaria a los oligonucleótidos iGEM Fw y iGEM Rv. La secuencia del promotor regulado por LacI se encuentra en el plásmido circular pSB1C3 de 2,710 pb, con resistencia a cloranfenicol y sitio de origen de replicación pMB1, con 100-300 copias por célula (anexo 6). 25 5.1.4. Bioparte pBad-AraC La secuencia del promotor pBAD fue obtenida del Registry Distribution del iGEM del 2013 (Placa 2, 7E), que junto con la secuencia codificante para el represor AraC que se transcribe en dirección opuesta (río arriba) conforman la bioparte BBa_K808000. Este promotor fue utilizado para expresar LL-37 y GFP (como control). Al unirse con L(+)-arabinosa, AraC cambia su conformación, induciendo la transcripción. La secuencia del promotor pBAD se encuentra flanqueada por los sitios de corte de las enzimas EcoRI, NotI y XbaI como prefijo de la secuencia, y SpeI, NotI y PstI como sufijo. La secuencia de pBad-AraC se muestra en el anexo 7 y se encuentra flanqueada por la secuencia complementaria a los oligonucleótidos iGEM Fw y iGEM Rv. La secuencia del promotor pBAD y la secuencia para la proteína reguladora AraC se encuentran en el plásmido circular pSB1C3 de 2,710 pb, con resistencia a cloranfenicol y sitio de origen de replicación pMB1, con 100-300 copias por célula (anexo 8). 5.1.5. Bioparte RBS La secuencia del sitio de unión a ribosoma fue obtenida del Registry Distribution del iGEM del 2013 (Placa 5, 2M), conformando la bioparte BBa_B0034. Este sitio de unión a ribosoma fue diseñado por el equipo de Mahajan et al. en 2003, basándose en el RBS utilizado en el represilador de Elowitz. La secuencia se encuentra flanqueada por los sitios de corte de las enzimas EcoRI, NotI y XbaI como prefijo de la secuencia, y SpeI, NotI y PstI como sufijo. La secuencia del RBS se muestra en el anexo 9 y se encuentra flanqueada por la secuencia complementaria a los oligonucleótidos iGEM Fw y iGEM Rv, lo cual simplifica la comprobación de una ligación exitosa mediante PCR. La secuencia del sitio de unión a ribosoma se encuentra en el plásmido circular pSB1A3 de 2,155 pb, con resistencia a ampicilina y sitio de origen de replicación pMB1, con 100-300 copias por célula (anexo 10). 26 5.1.6. Bioparte GFP El gen que codifica para la proteína verde fluorescente fue obtenido del Registry Distribution del iGEM del 2013 (Placa 5, 14K), conformando la bioparte BBa_E0040. Esta bioparte deriva del reportero utilizado en el represilador de Elowitz, quien obtuvo la secuencia de la publicación de Andersen y colaboradores (Andersen et al., 1998). Para mejorar su expresión en bacteria, Andersen construyó esta variante de GFP, GFPmut3, cambiando el aminoácido 2 de serina a arginina, el 65 de serina a glicina y el 72 de serina a alanina, mediante PCR de la GFP silvestre de Aequorea victoria. La secuencia se muestra en el anexo 11 y se encuentra flanqueada por los sitios de corte de las enzimas EcoRI, NotI y XbaI como prefijo de la secuencia, y SpeI, NotI y PstI como sufijo. La secuencia de GFP se encuentra flanqueada por la secuencia complementaria a los oligonucleótidos iGEM Fw y iGEM Rv, lo cual simplifica la comprobación de una ligación exitosa mediante PCR. La secuencia codificante para la proteína verde fluorescente se encuentra en el plásmido circular pSB1C3 de 2,710 pb, con resistencia a cloranfenicol y con sitio de origen de replicación pMB1, con 100-300 copias por célula (anexo 12). 5.1.7. pGLO Como control se utilizó alplásmido pGLO (BIO-RAD, 2014) con resistencia a ampicilina, el cual incluye al gen de la proteína verde fluorescente de Aequorea victoria (la misma que la bioparte GFP), la cual es transcrita por el promotor pBAD, y reprimida en ausencia de arabinosa por la proteína AraC, que también está codificada en pGLO. 5.2. Oligonucleótidos Todas las biopartes utilizadas en este trabajo se encuentran flanqueadas por las secuencias complementarias a los oligonucleótidos iGEM Fw (5’-tgccacctgacgtctaagaa-3’) y iGEM Rv (5’- attaccgcctttgagtgagc-3’). Estos oligonucleótidos fueron sintetizados por la unidad de servicios genómicos del LANGEBIO del CINVESTAV, Irapuato. 27 5.3. Medios de cultivo y cepas Se utilizó medio LB (Lysogeny Broth) para crecer a Escherichia coli en condiciones nutritivas. Como medio de selección para las transformaciones se utilizaron medios de cultivo LB ampicilina (Pisa) a una concentración de 100 µg/mL y LB cloranfenicol (Kener) a una concentración de 25 µg/mL. Para la inducción del promotor lac se utilizó IPTG a una concentración de 0.5 mM. Para la activación del regulador AraC se utilizó L (+) arabinosa al 1%. Se utilizaron las cepas de E. coli: DH5α (F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA- argF)U169, hsdR17(rK- mK+), λ–). HB101 (F- mcrB mrr hsdS20(rB- mB-) recA13 leuB6 ara-14 proA2 lacY1 galK2 xyl-5 mtl-1 rpsL20(SmR) glnV44 λ). TOP10 (F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 nupG recA1 araD139 Δ(ara- leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrR) endA1 λ). XL1-Blue (endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F'[ ::Tn10 proAB+ lacIq Δ(lacZ)M15] hsdR17(rK- mK+)). 5.4. Preparación de células de E. coli competentes con calcio Se inocularon 3 mL de LB con una colonia y se incubaron toda la noche a 37ºC con agitación constante a 250 rpm. Se inocularon 250 µL de preinóculo en cada uno de los dos matraces con 50 mL de LB fresco. Se incubó a 37ºC con agitación constante a 250 rpm hasta que las células llegaran a una densidad óptica a 600 nm de entre 0.4 y 0.6. Se centrifugó a 4ºC durante 10 minutos a 4,000 rpm. Se colocaron las células en hielo, y se decantó el sobrenadante dejando un mililitro para resuspender las células suavemente. Se lavó con la mitad del volumen original, 25 mL de CaCl2 0.1 M estéril a 4ºC. Se incubó en hielo durante 20 minutos y se procedió a centrifugar a 4ºC durante 10 minutos a 4000 rpm. Se decantó totalmente y se resuspendió en 0.5 mL de CaCl2 0.1 M, glicerol 20% estéril. Se colocaron las células en hielo y se hicieron alícuotas de 50 µL en tubos de 0.5 mL estériles y se conservaron a -70ºC. Finalmente se determinó la eficiencia de las células (número de transformantes por µg de DNA) con un plásmido de concentración conocida. 28 5.5. Transformación de Escherichia coli por choque térmico Se agregó el DNA (200 ng de DNA superenrollado, o hasta 5 µL del producto de una ligación) a las células competentes. Se incubó en hielo 15 minutos y se procedió a dar un pulso a 42ºC durante minuto y medio sin agitar. Se incubó en hielo dos minutos y se resuspendió en un mililitro de LB, incubando por 40 minutos a 37ºC con agitación constante a 250 rpm. Se inocularon 100 µL del cultivo en una placa de LB con el antibiótico correspondiente al marcador de selección del plásmido transformado. 5.6. Minipreparación de plásmidos Para las minipreparaciones de los plásmidos se utilizó el kit de purificación y minipreparación de MaestroGen: High-speed plasmid mini kit. Se crecieron cultivos toda la noche de las respectivas cepas de Escherichia coli con los plásmidos en 3 mL de LB con los antibióticos correspondientes. Se transfirieron 1.5 mL de los cultivos a tubos de microcentrífuga para centrifugar por un minuto a 16,000 x g descartando el sobrenadante, repitiendo este paso para los 1.5 mL restantes. Se resuspendió la pastilla con 200 µL de Buffer PD1 con RNAsa A con el vórtex o subiendo y bajando la muestra con micropipeta. Se lisaron las células con 200 µL de Buffer PD2, mezclando suavemente 10 veces por inversión. Se dejó reposar durante dos minutos para asegurar un lisado homogéneo. Se neutralizó con 300 µL de Buffer PD3 y se mezcló inmediatamente 10 veces por inversión. Se centrifugó por tres minutos a 16,000 x g. Se colocó la columna PD en el tubo colector y se añadió el sobrenadante a la columna, centrifugando a 16,000 x g por 30 segundos. Se descartó el eflujo y se volvió a colocar la columna PD en el tubo colector. Se lavó la columna con 400 µL de Buffer W1 con etanol y se centrifugó a 16,000 x g por 30 segundos. Se descartó el eflujo y se colocó la columna PD en el tubo colector. Se centrifugó de nuevo por 3 minutos para secar la columna y descartar cualquier residuo de etanol. Se colocó la columna en un tubo de microcentrífuga y se eluyó con 50 µL de agua, colocándolos en el centro de la matriz de la columna y dejando reposar durante dos minutos antes de centrifugar para eluir el DNA. 29 5.7. Digestiones de DNA con enzimas de restricción Para la digestión de los plásmidos se utilizaron cuatro enzimas diferentes: EcoRI, SpeI, PstI y XbaI. Dependiendo de si se quería la bioparte como sufijo o como prefijo, y de si se quería obtener un inserto o abrir el vector, se utilizaron diferentes combinaciones de dos de estas enzimas (Fig. 5.1). Si se deseaba tener una bioparte como prefijo y como inserto se digería con EcoRI y SpeI, en una relación molar 1:2 en buffer Cutsmart. Si se deseaba tener una bioparte como prefijo, abriendo el vector, se digería con SpeI y PstI en una relación molar 1:1 en buffer 2.1. Si se deseaba tener una bioparte como sufijo y como inserto se digería con XbaI y PstI en una relación molar 1:1.5 en buffer 2.1. Si se deseaba tener una bioparte como sufijo, abriendo el vector, se digería con EcoRI y XbaI en una relación molar 1:1 en buffer Cutsmart. Todas las enzimas de digestión y los buffers se obtuvieron del BioBrick Assembly Kit de New England Biolabs. Todas las reacciones de digestión se dejaron incubar durante toda la noche a 37ºC para realizar una extracción de DNA en gel de agarosa al día siguiente. Figura 5.1. Esquema en donde se muestra el ensamblaje estándar de los BioBricks (modificado de Johns Hopkings 2011 iGEM team, 2011). 30 5.8. Electroforesis de DNA en geles de agarosa El gel se preparó al 1% de agarosa con buffer TAE (Tris 40mM, ácido acético 20 mM y EDTA 1 mM) 1x. Para preparar el gel se tomaron 50 mL de TAE 1x y 0.5 g de agarosa. Esta mezcla se calentó hasta fundir la agarosa y después de unos minutos de enfriamiento se colocó en la charola (medidas 10x15 cm) utilizando un peine para 15 pozos. Se cargaron las muestras con buffer de carga para DNA 6x (30% glicerol, 0.25% azul de bromofenol) con GelRed 6x (GenScript). Se corrió el gel a un voltaje de 100 V durante una hora. Se observó el resultado en un transiluminador UV en un cuarto oscuro y se realizó un registro fotográfico con una cámara Canon PowerShot A650. 5.9. Extracción de fragmentos de DNA de geles de agarosa Se cortó con una navaja la zona del gel con los fragmentos de DNA deseados, procurando tomar la menor cantidad de agarosa posible. Se pesó el fragmento dentro de un microtubo de 1.5 mL previamente pesado y se procedió a purificar el DNA utilizando el Zymoclean Gel DNA Recovery Kit. Se agregaron 3 volúmenes de ADB (Agarose Dissolving Buffer) por cada volumen de agarosa cortada del gel. Se incubó a 37ºC por 10 minutos, hasta que el gel estuviera totalmente disuelto. Se transfirió la solución de agarosa derretida a una columna Zymo-Spin en un tubo colector. Se centrifugó durante 30 segundos a 16,000 x g y posteriormente se descartó el eflujo. Se añadieron 200 µL de DNA Wash Buffer a la columna y se centrifugó a 16,000 x g durante 30 segundos, descartando el sobrenadante y volviendo a centrifugar, pero sin agregar
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