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Analisis-del-efecto-del-sobrenadante-de-las-celulas-mesenquimales-obtenidas-de-membrana-amniotica-humana-sobre-la-quimiotaxis-de-los-neutrofilos

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
 
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN 
 
 
 
“Análisis del efecto del sobrenadante de las células 
mesenquimales obtenidas de membrana amniótica humana sobre 
la quimiotaxis de los neutrófilos” 
 
 
T E S I S 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
LICENCIADA EN BIOQUÍMICA DIAGNÓSTICA 
 
 
PRESENTA: 
MARIANA YOLOTZIN GARCÍA BERMÚDEZ 
 
 
DIRECTORES: 
DR. YONATHAN OMAR GARFIAS BECERRA 
MÉD. CIR. GIBRÁN ALEJANDRO ESTÚA ACOSTA 
DRA. BEATRIZ BUENTELLO VOLANTE 
 
CUAUTITLÁN IZCALLI, ESTADO DE MÉXICO. OCTUBRE 2016. 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
DEDICATORIA 
 
A mis papás María de los Ángeles y Daniel que siempre han estado ahí 
para apoyarme, levantarme y darme palabras de aliento cuando lo necesito. Por 
desvelarse conmigo en esas noches de estudio. A mi hermana Itzel por ser mi 
mejor amiga y la sonrisa que me quita cualquier enojo o tristeza. Gracias a 
ustedes he logrado llegar hasta aquí, gracias por todas las lecciones que me han 
dado e impulsarme siempre con su cariño y ejemplo. Los amo. 
 
A mi abuela María de Jesús por esa fuerza que tienes, por los platos de 
comida cuando ya era muy tarde y todas las historias, gracias por cuidar de 
nosotros. A mis tíos y primos, gracias por estar siempre juntos, por las carcajadas, 
los bailes y los hombros prestados para dormir. Ustedes son mi apoyo 
incondicional. 
 
A Diego que desde el inicio ha estado ahí, gracias por todo. Por el ánimo 
para ser mejor día a día. Por impulsarme a crecer, por los abrazos y sonrisas 
cuando lo necesitaba. Por ser mi confidente, amigo y compañero estos años. 
 
A Montserrat, Andrea, Ximena, Luis, Jaime y Miguel por ser mi segunda 
familia en la universidad. Por las risas, bailes, tareas, exposiciones, los malos 
momentos que se convirtieron en anécdotas, las desveladas estudiando, las 
comidas a las 4 de la mañana, las carreras diarias… mil gracias a ustedes por el 
tiempo que vivimos juntos. 
 
A Gabriela y Natalia porque aunque pasan los años seguimos juntas. 
Gracias por su amistad, las pláticas, los regaños, por ser mis confidentes, porque 
con ustedes cualquier momento es bueno para reír a carcajadas y disfrutar la vida. 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
Al doctor Yonathan Garfias por apoyarme y confiar en mí. Por explicarme 
las veces que fuera necesario. Lo admiro por ser un excelente profesor y ser 
humano. 
 
A Gibrán por las explicaciones, todos los experimentos y sobre todo, el 
tiempo dedicado a los ensayos conmigo, te agradezco por ser paciente y 
ayudarme. A Beatriz por estar ahí e impulsarme, por tu tiempo para revisar. A 
Sofía por apoyarme y hacer correcciones. A Mariana, Alfredo, Joaquín, Graciela, 
América, César, Beatriz y Óscar por toda la ayuda que me brindaron, las ideas y 
ánimos para terminar este trabajo, también por los momentos fuera del laboratorio 
y las buenas anécdotas. A Verónica y Olga por ser un gran apoyo en todo, por 
contagiarme su alegría y ser mis confidentes. 
Son un maravilloso equipo de trabajo y amigos increíbles. 
 
A la Unidad de Investigación del Conde Valenciana, por enseñarme el 
trabajo en equipo, por sus enseñanzas y todo el aprendizaje que he tenido tanto 
profesional, académica y personalmente a lo largo de la realización de este 
trabajo. 
 
A la UNAM, mi alma mater, por las oportunidades que me ha brindado y 
mantener las puertas abiertas para seguir creciendo profesional y personalmente. 
 
A la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán por permitirme entrar en 
sus aulas para estudiar. A mis profesores, por su pasión a enseñar y transmitirme 
sus conocimientos y el gusto por aprender todos días. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Esta tesis se llevó a cabo bajo la dirección de los Dres. Beatriz Buentello 
Volante, Yonathan Omar Garfias Becerra y del Méd. Cir. Gibrán Alejandro Estúa 
Acosta. En el Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina y la Unidad 
de Investigación del Instituto de Oftalmología “Fundación de Asistencia Privada 
Conde de Valenciana I.A.P.” Esta tesis fue apoyada por los fondos sectoriales 
CONACYT-SALUD-160286, 273349; CONACYT-CIENCIA BÁSICA-167438 y 
DGAPA-PAPIIT-UNAM IA203514. 
 
 
 
ÍNDICE GENERAL 
 
Abreviaturas ............................................................................................................. I 
Índice de figuras ..................................................................................................... III 
Índice de tablas ...................................................................................................... III 
Resumen ................................................................................................................ IV 
 
I. Introducción ............................................................................................... 1 
1. Sistema Inmune .......................................................................................... 1 
2. Neutrófilos ................................................................................................... 1 
2.1 Migración ................................................................................................ 2 
3. Células troncales mesenquimales ............................................................... 8 
3.1 Células mesenquimales de membrana amniótica (hAMSC) ................... 9 
3.2 Trasplante de poblaciones de células madre ........................................ 10 
II. Antecedentes .......................................................................................... 11 
III. Planteamiento del problema .................................................................... 12 
IV. Pregunta de investigación ....................................................................... 12 
V. Hipótesis .................................................................................................. 12 
VI. Objetivos ................................................................................................. 13 
VII. Materiales y métodos .............................................................................. 14 
VIII. Resultados .............................................................................................. 20 
IX. Discusión ................................................................................................. 27 
X. Conclusiones ........................................................................................... 30 
XI. Referencias ............................................................................................. 31 
 
 
I 
 
Abreviaturas 
AM Membrana amniótica 
ANCAs Anticuerpos citoplasmáticos anti-neutrófilos 
ATP Adenosintrifosfato 
BM-MSC Células troncales mesenquimales obtenidas de médula ósea, del 
inglés bone marrow derived mesenchymal stem cells. 
CAF Control de autoflorescencia 
CCL Ligando de quimiocinas CC 
CD Del inglés, cluster of differentiation 
CXCR Receptor de la familia de quimiocinas CXC 
CXCL Ligando de la familia de quimiocinas CXC 
CLA Antígeno cutáneo de linfocitos 
CO2 Dióxido de carbono 
CR Receptores para proteínas de complemento 
C3b Proteína del complemento, opsonina. 
C3bi Receptor del complemento tipo 3 
C4bComponente del complemento 4b, opsonina 
C5a Componente del complemento 5a 
DAMP Patrones moleculares asociados a daño 
DAPI 2-(4-amidinofenil)-1H-indol-6-carboxamidina 
DMEMF-12 Medio Dulbecco modificado de Eagle: mezcla de nutrientes F-12 
DNA Ácido desoxirribonucleico 
DPBS Del inglés Dulbecco’s phosphate-buffered saline 
EDTA Ácido etilendiaminotetraacético 
E-selectina Molécula de adhesión celular (MAC), CD62E 
FasL Fas ligando 
FITC Isotiocianato de fluoresceína 
fMLP N-formil-L-metionil-L-leucil-L-fenilalanina (C21H31N3O5S) 
G-CSF Factor estimulante de colonias de granulocitos 
GM-CSF Factor estimulante de colonias de macrófagos 
GlyCAM-1 Molécula de adhesión celular dependiente de glicosilación tipo I 
H2O2 Peróxido de hidrógeno 
hAEC Células epiteliales de amnios humano 
hAMSC Células mesenquimales obtenidas de membrana amniótica humana. 
HBSS Solución salina balanceada de Hank 
HClO Ácido hipocloroso 
HEPES Ácido 4-(2-hidroxietil) piperazina-1-etanesulfónico, N-(2-hidroxietil) 
piperazina-N′-(2-ácido etanesulfónico) 
HLA Antígeno leucocitario humano 
HGF Factor de crecimiento de hepatocitos, del inglés hepatocyte growth 
factor 
ICAM-1 Molécula de adhesión intercelular 1 ó CD54 
ICAM-2 Molécula de adhesión intercelular 2 ó CD102 
IDO Indolamina 2,3-dioxigenasa 
IFN Interferon 
IL Interleucina 
ISCT Sociedad Internacional de Terapia Celular, del inglés International 
Society for Cellular Therapy 
LES Lupus eritematoso sistémico 
II 
 
LFA-1 Antígeno asociado a función linfocítica 1 (CD11a) 
L-selectina Molécula de adhesión celular (MAC), CD62L 
LPS Lipopolisacárido 
MAdCAM-1 Molécula de adhesión celular1-adresina, del inglés mucosal vascular 
addressin cell adhesion molecule 1 
MAC-1 Molécula de adhesión celular (CD11b/CD18) 
MHC-II Complejo mayor de histocompatibilidad tipo II 
MIF Factor inhibitorio de migración de macrófagos 
MPO Enzima mieloperoxidasa 
MSC Células troncales mesenquimales 
MSC-CM Medio condicionado de células troncales mesenquimales 
NADPH Nicotinamida adenina dinucleotido fosfato 
NET Trampas extracelulares de neutrófilos 
NK Del inglés, Natural Killer 
O2- Oxígeno 
PAMP Patrones moleculares asociados a patógenos 
PBS Buffer de fosfatos salina 
PCNA Antígeno nuclear de células de proliferación 
PE Ficoeritrina 
PE-Cy7 Ficoeritrina cianuro 7 
PEDF Factor derivado del epitelio pigmentario 
PerCP Del inglés, peridinin-chlorophyllproteins 
PFA Paraformaldehído 
PGE2 Prostaglandina E2 
Pmmp Polymorphprep 
PMN Polimorfonucleares 
PRR Receptor de reconocimiento de patrones 
PR3 Proteinasa 3 
P-selectina Molécula de adhesión celular (MAC), CD62P 
PSGL-1 Glicoproteína P-selectina ligando 1 
RNS Especies reactivas de nitrógeno 
ROS Especies reactivas de oxígeno 
SEM Error estándar de la media 
SFB Suero fetal bovino 
TGF-β Factor transformante de crecimiento β 
Th Linfocitos T cooperadores 
TLR Receptor tipo Toll 
TNF Factor de necrosis tumoral 
TRAIL Ligando inductor de apoptosis de ligando TNF 
Treg Linfocitos T reguladores 
VCAM-1 Proteína de adhesión celular vascular 1 
VE-cadherina Cadherina vascular endotelial o CD144 
VEGF Factor de crecimiento endotelial vascular 
 
III 
 
Índice de figuras 
 
Figura 1. Frotis de sangre periférica………………………………………………...… 2 
Figura 2. Cascada de reclutamiento de neutrófilos……………………………….….4 
Figura 3. Trampas extracelulares de neutrófilos (NET)……………………….……..7 
Figura 4. Microfotografía de células hAMSC…………………………………..….…20 
Figura 5. Caracterización fenotípica de hAMSC por citometría de flujo…..…….21 
Figura 6. Gráfica de puntos por citometría de flujo para definir las poblaciones 
celulares……………………………………………………………………………….….22 
Figura 7. Quimiotaxis de neutrófilos estimulados con diferentes concentraciones 
de fMLP en el sistema Transwell……………………………………………………....23 
Figura 8. Efecto de las hAMSC en la quimiotaxis de neutrófilos…………….……25 
Figura 9. Microfotografías representativas de quimiotaxis de neutrófilos…..….26 
 
 
 
 Índice de tablas 
 
Tabla 1. Identificación de condiciones para evaluar la quimiotaxis de neutrófilos en 
presencia de hAMSC…………………………………………..………………………..18 
Tabla 2. Esquema representativo de las relaciones hAMSC-PMN para la 
evaluación de la quimiotaxis…………………………………………………………19
IV 
 
Resumen 
 
Durante un proceso inflamatorio ocurre la migración de células del sistema 
inmune, las primeras células en participar en este proceso son los neutrófilos, los 
cuales resultan de gran importancia ya que realizan tres funciones principales: 
liberación de sus gránulos, fagocitosis y producción de trampas extracelulares de 
neutrófilos (NET) entre otras funciones, todo esto con la finalidad de mediar el 
proceso inflamatorio. 
 En diversas patologías, la existencia de una regulación deficiente de células 
inflamatorias se ha asociado a una quimiotaxis excesiva de neutrófilos, lo cual 
puede ocasionar daño grave en el sitio de lesión. 
 Actualmente las células troncales, principalmente las derivadas de médula 
ósea, son utilizadas en terapias para regeneración de tejido, úlceras de pie 
diabético, úlceras corneales, entre otras. Se ha descrito que las células 
mesenquimales obtenidas de membrana amniótica humana (hAMSC) poseen 
propiedades inmunomoduladoras y antiinflamatorias, así como una capacidad de 
diferenciación y proliferación celular mayor a la presentada por las células 
troncales obtenidas de otros tejidos, además de tener baja inmunogenicidad. 
 El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto del sobrenadante de las 
células mesenquimales derivadas de membrana amniótica sobre la migración 
celular de los neutrófilos. 
 Las hAMSC se obtuvieron a partir de membrana amniótica que se cultivó en 
medio DMEMF-12, estas células presentaron una morfología fibroblastoide y 
fueron inmunofenotipificadas por citometría de flujo utilizando marcadores anti-
CD90, CD105, CD45, CD73, CD44 y CD29. 
 Se realizó la extracción de PMN a partir de sangre total, utilizando como 
método de separación la densidadde gradientes,obteniendo células con una 
viabilidad superior al 95%; el conteo celular se realizó con la técnicade exclusión 
V 
 
por azul tripano y la se inmunofenotipificación por citometría de flujoutilizando anti-
CD11b y CD45. 
 Para determinar la quimiotaxis de neutrófilos, se utilizó un sistema 
Transwell con presencia y ausencia de hAMSC y fMLP como quimioatrayente. 
 Los resultados indican que las hAMSC son capaces de inhibir o presentar 
una disminución estadísticamente significativa ala quimiotaxis de los neutrófilos 
incluso con quimioatrayente en el sistema Transwell. 
 
 
1 
 
I. INTRODUCCIÓN 
 
1. Sistema Inmune. 
La inmunidad es el conjunto de mecanismos por el cual el organismo es 
capaz de mantener la homeostasis a través del reconocimiento de lo propio y lo no 
propio. Para su estudio, la respuesta inmune se divide en dos: inmunidad innata y 
adaptativa; ambas trabajan en conjunto para mantener protegido al organismo, en 
general esta protección a su vez consta de reconocimiento y respuesta. 
La inmunidad innata posee mecanismos moleculares y celulares que son 
activados antes de que ocurra una infección y su finalidad es eliminar a cualquier 
agente extraño que logre traspasar las primeras barreras del organismo. Este tipo 
de inmunidad se caracteriza por su especificidad limitada, las células que 
participan en este proceso tienen una gran variedad de funciones ya sea 
efectoras, iniciadoras o de amplificación (Kindt et al., 2007; Patiño, 2009). 
Esta primera línea de defensa está formada por barreras mecánicas (piel, 
mucosas), físicas (tos, estornudos), químicas (acidez gástrica, secreciones 
sebáceas) y biológicas (microorganismos comensales). Si esta primera línea de 
defensa no es suficiente, se activan células como los neutrófilos, células cebadas, 
eosinófilos, células asesinas (NaturalKiller, NK) y elementos solubles como el 
sistema de complemento (Abbas et al., 2015; Kindt et al., 2007). 
 
2. Neutrófilos. 
 Los neutrófilos son células fagocíticas polimorfonucleares (PMN). Se 
encuentran en sangre periférica y representan entre el 50 y 70% del total de las 
células de la serie blanca. Son consideradas la primera línea de defensa contra 
infecciones bacterianas y fúngicas (Yam-Puc, et al., 2012). 
 Estas células son producidas por medio de la hematopoyesisen la médula 
ósea a partir de progenitores de la serie mieloide; se requieren alrededor de 2 
semanas para que los metamielocitos (estadio intermedio, cuyo núcleo posee 
forma de riñón) se diferencien desde una forma inmadura o en banda (núcleo 
alargado en forma de U), a un estadio segmentado o maduro donde presenta un 
núcleo con cromatina compacta (Figura 1). 
 
 
 
2 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Ya en circulación, los neutrófilos poseen una vida media aproximada de 8 
horas, una vez activados por un proceso inflamatorio, la vida media de los 
neutrófilos aumenta asegurando la presencia de éstos en el sitio de inflamación 
(Kolaczkowsk et al., 2013). Dentro de todas las células del sistema inmune, los 
neutrófilos son las primeras células en migrar hacia un sitio inflamatorio, seguidas 
por los macrófagos y linfocitos (Barbieri, et al., 2005; Kindt et al., 2007). 
 
2.1 Migración. 
El proceso de migración del neutrófilo es controlado por la acción de 
citocinas inflamatorias y quimiocinas en la superficie del endotelio vascular en 
sitios inflamatorios. 
Las citocinas son proteínas pequeñas (~25 kDa) que funcionan como 
“moléculas mensajeras” del sistema inmune. Pueden funcionar de manera 
autocrina, paracrina y endocrina. Por su parte, las quimiocinas son un subgrupo de 
citocinas de bajo peso molecular y patrones estructurales particulares que inducen 
la migración de los leucocitos hacia un gradiente de concentración químico de 
estas moléculas, proceso que se conoce como quimiotaxis (Doan et al., 2013; 
Harvey, 2013). 
Figura 1. Frotis de sangre periférica mostrando 
neutrófilo en estadio segmentado (100X). 
3 
 
Los receptores de quimiocinas expresados en neutrófilos son CXCR1 y 
CXCR2, entre otros, que se unen a las quimiocinas incluyendo CXCL8 (IL-8), la 
quimiocina más importante en la migración de neutrófilos a los tejidos (Abbas et 
al., 2015). 
Para iniciar el reclutamiento de neutrófilos hacia un tejido se requiere la 
acción de mediadores vasoactivos como TNF-α e IL-1 que inducen la expresión de 
moléculas de adhesión (ligandos de integrina y selectina) en las células 
endoteliales (Janeway et al., 2003) y la producción local de quimiocinas que 
promueven el movimiento de los leucocitos al endotelio del vaso sanguíneo y 
citocinas que induzcan las moléculas de adhesión necesarias (Abbas et al., 2015). 
Los neutrófilos y monocitos expresan distintos grupos de moléculas de 
adhesión y receptores de quimiocinas, lo que ocasiona la migración a diferentes 
sitios de inflamación o al mismo sitio de inflamación a diferentes tiempos. Los 
neutrófilos expresan las integrinas LFA-1 y MAC-1, las cuales al activarse, se unen 
a ICAM-1 endotelial (Abbas et al., 2015). 
Los agentes quimiotácticos que atraen a los neutrófilos al sitio de infección 
incluyen: 
1. Factores endógenos: 
 Fragmentos de proteína liberados cuando el complemento está 
activado (C5a) 
 Factores derivados de los sistemas fibrinolíticos 
 Productos de otros leucocitos y plaquetas 
 Citocinas como IL-8, TNF-α, entre otros 
2. Factores exógenos 
 Productos microbianos como LPS, fMLP, otros 
 Lípidos 
Dentro del proceso inflamatorio, el reclutamiento gradual de leucocitos 
depende por una parte de las quimiocinas presentes en el microambiente y por la 
expresión de moléculas de adhesión en el endotelio. Éstas incluyen las moléculas 
de adhesión celular (MAC) de la súper familia de inmunoglobulinas, que 
interactúan con las integrinas de leucocitos, mientras que las selectinas 
interactúan con los ligandos de carbohidratos (Kindt et al., 2007). En la mayoría de 
los tejidos, el proceso de inflamación involucra los siguientes pasos: reclutamiento, 
unión, rodamiento, adhesión, pavimentación y transmigración endotelial (Figura 2) 
(Kolaczkowska, 2013). 
El reclutamiento de neutrófilos es iniciado por cambios en la superficie del 
endotelio que resulta de la estimulación por mediadores inflamatorios (histamina, 
leucotrienos y citocinas), estos son liberados por las células cebadas y células 
dendríticas residentes de tejido cuando entran en contacto con sus receptores 
activados (Kindt et al., 2007). 
4 
 
 
Figura 2.Cascada de reclutamiento de neutrófilos. Existen dos métodos de transmigración: a) 
paracelular (entre células endoteliales) b) transcelulares (a través de las células endoteliales) 
Paso de un neutrófilo a través de la pared de un capilar sanguíneo (diapédesis). El proceso de 
migración incluye el rodamiento lento que es dependiente de la selectina; mientras que la 
adhesión, arrastre y migración transendotelial son dependientes de las interacciones con 
integrinas. 
Imagen obtenida y modificada de KOLACZKOWSKA, ELZBIETA (2013). Neutrophil recruitment 
and function in health and inflammation. 
b 
a 
5 
 
El contacto de los neutrófilos con el endotelio es mediado por las selectinas. 
Estas glicoproteínas se encuentran en los neutrófilos (L-selectina o CD62L) y en el 
endotelio (E-selectina o CD62E y P-selectina o CD62P). Las selectinas de los 
neutrófilos se unen a los oligosacáridos presentes en las glicoproteínas de 
superficie de las células endoteliales, como CD34, MAdCAM-1(Molécula de 
adhesión celular 1-adresina), GlyCAM-1 (molécula de adhesión celular 
dependiente de glicosilación tipo I), Sialil Lewis X, Sialil Lewis A, CLA (antígeno 
cutáneo de linfocitos) y PSGL-1 (glicoproteína P-selectina ligando 1) (Muller, 2011; 
Muller, 2013). 
Durante este primer contacto la unión resulta débil; sin embargo, durante al 
estado inflamatorio se liberan estímulos quimiotácticos que aumentan el contacto 
entre células, como consecuencia los neutrófilos se unen firmemente al endotelio 
por las integrinas (LFA-1ó CD11a y MAC-1ó CD11b/CD18) y las moléculas de 
adhesión endoteliales (ICAM1 o CD54 e ICAM2 o CD102) (Kindt et al., 2007). 
Posteriormente, los neutrófilos atraviesan el endotelio, lo cual se conoce como 
diapédesis,esto es a través de las células endoteliales (paracelular) o de su 
citoplasma (transcelular) (Barcat, 2011; Kolaczkowska, 2013). 
 Los receptores de reconocimiento depatrones (PRR, por sus siglas en 
inglés), permiten a las células de la inmunidad innata realizar el reconocimiento de 
microorganismos por medio de los patrones moleculares asociados a patógenos 
(PAMP, por sus siglas en inglés)o por señales de daño tisular generados por el 
proceso infeccioso o por patrones moleculares asociados a daño(DAMP) 
ocasionado por toxinas o daño mecánico sin agentes patógenos (Fainboim et al., 
2013; Doan, 2013; Rojo et al., 2012). Los PRR se dividen en receptores tipo Toll 
(TLR), receptores “Scavenger” y opsoninas, entre otros (Doan, 2013). 
 Los PAMP son componentes microbianos que permiten a las células de la 
inmunidad innata realizar un reconocimiento, dando paso al inicio de los procesos 
de liberación de sustancias microbicidas, citocinas y quimiocinas; están 
relacionados con la patogenicidad de los microorganismos (Fainboim et al., 2013). 
 Una vez en el sitio de lesión los neutrófilos son capaces de realizar diversas 
funciones efectoras a través del reconocimiento por PRR. Los neutrófilos expresan 
PRR como el receptor tipo Toll 2 (TLR2) que permite detectar peptidoglicanos 
presentes de las bacterias gram positivas; TLR4 reconoce lipopolisacárido (LPS) 
presente en las paredes celulares de bacterias gram negativas (Kindt et al., 2007; 
Rabinovich, 2004). Como resultado, los microorganismos son ingeridos y 
degradados por las células fagocíticas (Doan,2013). 
 Los receptores para proteínas del complemento reconocen moléculas 
depositadas sobre el microorganismo como consecuencia de su interacción con el 
sistema inmune del hospedero denominadas opsoninas. Así mismo, los neutrófilos 
expresan receptores para proteínas de complemento como CR1 (CD35) que 
reconoce a las proteínas C3b y C4b, el CR3 (CD11b/CD18) y CR4 (CD11c/CD18) 
6 
 
que reconocen fundamentalmente a C3bi. En particular las proteínas C3b se 
adhieren a la pared de microorganismos funcionando como opsoninas, 
favoreciendo la fagocitosis (Rabinovich, 2004). 
 Una vez reconocido el microorganismo opsonizado, el neutrófilo se activa 
realizando la fagocitosis. La cual inicia con endocitosis de microorganismos 
opsonizados; posteriormente, se promueve la fusión de gránulos ricos en 
proteasas formando un fagolisosoma, este hecho expone el material fagocitado a 
dos sistemas microbicidas; uno dependiente de la producción de intermediarios de 
especies reactivas de oxígeno (ROS) y especies reactivas de nitrógeno (RNS) y el 
otro sistema que es independiente de éstas (Rabinovich, 2004). 
El estallido respiratorio se inicia con la activación de la enzima NADPH 
oxidasa responsable de la producción del anión superóxido (O2-), compuesto que 
constituye el sustrato para la generación de las ROS entre ellos el peróxido de 
hidrógeno (H2O2) y ácido hipocloroso (HClO) (Kindt, 2008). 
 Los neutrófilos son capaces de mediar funciones para controlar una 
infección a travésde la generación de trampas extracelulares (NET), las cuales 
están formadas por fibras extracelulares compuestas de material nuclear 
(cromatina) y proteínas de los gránulos de los neutrófilos como elastasa, catepsina 
G, MPO (mieloperoxidasa), lactoferrina, gelatinasa y lisozima; además de fibras de 
DNA e histonas (Patiño, 2009; Falcão et al., 2015). 
Estas trampas son liberadas en respuesta a diversos agentes biológicos 
como bacterias, hongos y parásitos; actúan como una red de contención de la 
infección atrapando a los microorganismos al mismo tiempo que median su 
destrucción gracias a su capacidad de mantener una concentración local alta de 
sustancias antimicrobianas (Figura 3). La liberación de NET está asociada a una 
forma de muerte celular distinta de la apoptosis y la necrosis, a la cual se 
denomina NETosis. Esta es una forma activa de muerte celular, ya que existe 
liberación de cromatina descondensada al espacio extracelular (Amulic et al., 
2012). 
El núcleo pierde su forma multilobulada, la eucromatina y la 
heterocromatina se homogenizan, la envoltura nuclear y las membranas 
granulares se desintegran y el material nuclear entra en contacto directo con los 
componentes de los gránulos. Finalmente, la membrana celular se rompe y las 
NET son liberadas. En esta red, las proteasas granulares asociadas y las propias 
histonas ejecutan funciones microbicidas en un radio de acción limitado por la 
cromatina liberada, que reduciría el daño a los tejidos circundantes.En la 
formación de NET como respuesta a estímulos químicos y biológicos se requiere 
NADPH oxidasa y MPO que generan especies reactivas de oxígeno (Gabelloni et 
al., 2013) 
7 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Las NET resultan benéficas para el organismo, ya que su liberación permite 
actuar como barrera física para evitar una diseminación de microorganismos 
patógenos, así como una concentración de sustancias antimicrobianas lo que 
facilita su eliminación. Se sabe que la endonucleasa sérica DNAsa 1 se encarga 
del degradación de las NET para evitar el daño o destrucción tisular que podría 
ocasionar la acumulación de los componentes de los gránulos de los neutrófilos, 
además de la función de limpieza que realizan los macrófagos (Yam-Puc et al., 
2012). 
Recientemente, la liberación de NET se ha relacionado a la etiopatogenia 
de diversas enfermedades autoinmunológicas como: lupus eritematoso sistémico 
(LES), vasculitis-ANCA positivas, ateroesclerosis, artritis reumatoide, psoriasis, 
trombosis y gota. Por loque se ha demostrado que las NET están involucradas en 
el desarrollo de procesos inflamatorios crónicos (Munir et al., 2015). 
Para que se produzca una adecuada reparación tisular es necesaria la 
inflamación, ya que ésta es una consecuencia de cualquier lesión tisular (Kelley, 
1993). En la inflamación aguda, el número de neutrófilos en untejido puede 
encontrarse alto debido a su llegada desde el torrente sanguíneo. Por lo tanto, la 
Figura 3.Trampas extracelulares de neutrófilos 
(NET). Fotografía de inmunofluorescencia que 
muestra NET en un modelo in vitro con tinción 
para DNA (DAPI-azul) y anti-elastasa (verde). 
Cortesía de Magaña Guerrero, Fátima Sofía, 
2013. 
8 
 
capacidad de daño tisular por liberación de radicales de oxígeno y enzimas 
proteolíticas producidos por PMN será muy alta. Estos radicales (superóxido, 
peróxido de hidrógeno y ácido hipocloroso) al acumularse en exceso en un mismo 
sitio provocan daño en moléculas como proteínas, lípidos, carbohidratos y ácidos 
nucleicos (Barbieri et al., 2005). 
Una vez que el neutrófilo ha cumplido su función, muere por apoptosis 
(muerte celular programada) y es eliminado por macrófagos para evitar la posible 
liberación de su contenido citotóxico al medio extracelular, hecho que podría 
ocurrir en caso de muerte por necrosis. La apoptosis es un mecanismo de 
regulación que mantiene el número apropiado de células en el organismo (Barbieri 
et al., 2005). 
Existen diversas moléculas inflamatorias que retrasan la apoptosis de 
neutrófilos (Kelley, 1993),estudios han demostrado la influencia de LPS, C5a, 
fMLP, ATP, LTB4, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-15, IFN-γ en el retraso de la apoptosis del 
neutrófilo (Barbieri et al., 2005); esto provoca un aumento de PMN presentes en el 
sitio inflamatorio y la probabilidad de destrucción de estas células aumenta y con 
ello, la liberación de sus productos tóxicos al espacio extracelular lo que origina 
daño tisular (Kelley, 1993). 
Una desregulación del mecanismo de apoptosis está asociado a la 
aparición de diferentes enfermedades inflamatorias, tanto agudas como crónicas y 
parece estar mediado por el aumento en la producción de factor estimulador de 
colonias de granulocitos (G-CSF) y factor estimulante de colonias de granulocitos 
y macrófagos (GM-CSF) (Barbieri et al., 2005). 
Condiciones autoinmunes y vasculitis, se encuentran asociados a la 
producción de anticuerpos citoplasmáticos anti-neutrófilos (ANCAs), los cuales 
están dirigidos contra algunos componentes de las NET, por ejemplo, MPO, PR3 y 
la elastasa de neutrófilos. Algunos tipos de cáncer (leucemia mieloide crónica y 
carcinomas mamarios tipo sólido) predisponen a los neutrófilos a liberar NET que 
contribuyen a la trombosis, por lo tanto, los neutrófilos actúan contra el propio 
organismo (Niknejad et al., 2013). 
 
3. Células troncales mesenquimales. 
 Las células mesenquimales son células indiferenciadas con un potencial 
proliferativo elevado, morfología fibroblastoide y poseen dos características 
fundamentales: autorrenovación y la generación de uno o más tipos celulares 
capaces de desempeñar funciones especializadas en un organismo. A su vez, 
poseen propiedades inmunomoduladoras y antiinflamatorias, regulando las 
respuestas innata y adaptativa (Macías et al., 2010; Macías et al., 2011). 
9 
 
 La Sociedad Internacional de Terapia Celular o ISCT (International Society 
for Cellular Therapy) propuso tres criterios para definir las células troncales 
mesenquimales (MSC); primero que éstas células tengan la capacidad de 
adherirse al plástico en cultivo; segundo que expresen marcadores como CD73, 
CD90 y CD105 y la ausencia de marcadores hematopoyéticos como CD34, CD45, 
marcadores de monocitos, macrófagos y linfocitos B; y tercero, las MSC deben ser 
capaces de diferenciarse in vitro en osteoblastos, adipocitos y condrocitos bajo 
condiciones estándar de cultivo (Macías, 2014). 
En los últimos años el interés por el uso deMSC ha ido en aumento a raíz 
de su identificación, caracterización y aislamiento; así como el estudio de su 
posible uso como terapia alternativa de innumerables enfermedades 
(neurodegenerativas, cardíacas, endocrinológicas, oftalmológicas, etc) debido a su 
capacidad de diferenciación celular (Prosperet al., 2006). 
Se ha demostrado en un sistema in vitro que las MSC son capaces de 
migrar hacia proteínas de complemento, factores de crecimiento, citocinas y 
quimiocinas, IL-1β, TNF-α y quimiocina derivada de macrófagos. Se ha propuesto 
que la migración de las MSC a los sitios de inflamación puede determinar su 
función, ya sea en la eliminación de patógenos o la supresión de la inflamación 
(English, 2013). 
Las MSC poseen una importante capacidad inmunomoduladora, se ha 
demostrado que no permiten el reconocimiento de antígenos ya que interfieren 
con la función de las células dendríticas y linfocitos T al secretar citocinas, esta 
actividad se aumenta cuando se encuentran en un medio inflamatorio con altos 
niveles de interferón gamma (IFNγ). Inducen inmunosupresión de linfocitos T 
circulantes a través de la acción de TGF-beta (Garfias, 2012) y no expresan 
antígenos del sistema principal de histocompatibilidad de clase II (MHC II), ni 
moléculas co-estimuladoras CD40, CD40L, CD80, CD86 con esto reducen o 
inhiben las reacciones inmunes inducidas o en la tolerancia a injertos. Además, 
inducen el desarrollo de células T reguladoras (Treg) y disminuyen la actividad 
lítica de las células citotóxicas naturales (NK) y linfocitos citotóxicos (Socarrás et 
al., 2013). 
 
3.1 Células mesenquimales de membrana amniótica (hAMSC). 
Las células mesenquimales de membrana amniótica son células que se 
obtienen a partir de la digestión enzimática de membrana amniótica (AM). Estas 
células no presentan las moléculas clásicas (A, B y C) y presentan las moléculas 
no clásicas (E, F y G) de clase I de HLA lo que les confiere no inmunogenicidad, 
posee propiedades inmunosupresoras (supresión directa de linfocitos T y B), 
inmunomoduladoras, antiinflamatorias y antifibróticas; las células derivadas del 
amnios inhiben el crecimiento tumoral e invasión por tres vías: inducción de 
10 
 
apoptosis, detención de ciclo celular e inhibición de angiogénesis (Niknejad et al., 
2015). 
Las hAMSC inducen la apoptosis de linfocitos B y T a través de la secreción 
de factores solubles incluyendo factor de necrosis tumoral ∝ (TNF-∝), Fas ligando 
(FasL), ligando inductor de apoptosis de ligando TNF (TRAIL), factor 
transformante de crecimiento β (TGF-β) y factor inhibitorio de migración de 
macrófagos (MIF) (Niknejad et al, 2013). 
Algunos estudios demuestran que las hAMSC inhiben los reguladores 
positivos del ciclo celular incluyendo las ciclinas, cinasas dependientes de ciclinas, 
antígeno nuclear de células de proliferación (PCNA), proteínas de mantenimiento 
del minicromosoma. Las hAMSC secretan trombospondina, IL-10, IL-1, colágeno 
XVIII, endostatina, factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) lo cual les 
confiere propiedades antiangiogénicas (Niknejad et al, 2013). 
 
3.2 Trasplante de poblaciones de células troncales. 
 Las propiedades de las MSC favorecen el trasplante de poblaciones 
autólogas, es decir, el receptor es también el donador; singénicas, el donador es 
idéntico desde el punto de vista genético; o alogénicas, en donde el donador y el 
receptor no son idénticos a nivel genético, pero son de la misma especie. 
Las propiedades parácrinas de las MSC permiten la regulación del 
microambiente con la finalidad de proteger, promover la sobrevivencia y activar los 
mecanismos endógenos de reparación celular secretando factores neurotrópicos y 
factores promotores de crecimiento y de sobrevivencia (Kin et al., 2014). A su vez 
las MSC poseen características inmunosupresivas e inhibitorias de citocinas 
proinflamatorias; por lo cual los trasplantes de MSC autólogos, singénicos y 
alogénicos son idóneos ya que no requieren inmunosupresión farmacológica o 
alguna modificación genética. De acuerdo a da Silva et al., los efectos tróficos de 
las MSC se pueden dividir en anti-apoptóticos, de apoyo (estimulación de mitosis, 
proliferación y diferenciación) y angiogénicos (da Silva et al., 2009). 
 En particular, las hAMSC resultan de gran interés científico debido a las 
propiedades antes descritas y las características que le confieren al medio en el 
que se encuentran resultando útiles en diversos tratamientos. En diversas 
enfermedades se han visto mejorías al ser tratadas con hAMSC. 
 
 
 
 
11 
 
II. Antecedentes 
 
 En la actualidad el trasplante de hAMSC es utilizado en diversas 
enfermedades como quemaduras, úlceras corneales, úlceras en pie diabético y 
regeneración de tejidos debido a las propiedades antiangiogénicas, 
inmunomoduladoras y antiinflamatorias que poseen, aunado a que no expresan 
moléculas clásicas del HLA, por lo tanto presentan una baja inmunogenicidad 
convirtiéndolas en una terapia alterna para estos padecimientos. 
 Murphy y colaboradores demostraron en un modelo murino que al 
administrar células epiteliales de amnios humano (hAEC) en lesiones de fibrosis 
pulmonar existe una reducción de factores como TNF-α, TNF-β, INF-γ e IL-6, por 
lo tanto se disminuye la fibrosis pulmonar y a su vez el infiltrado de células 
inflamatorias siendo consideradas como una posible terapia en enfermedades con 
un componente de fibrosis (Murphy et al., 2011). 
 En el estudio planteado por Ke y colaboradores utilizan una inyección 
subconjuntival de MSC en conjunto con hidrogel de polisacárido en quemaduras 
por alcali en córnea de ratas,se observó una recuperación del epitelio corneal, 
reducción de inflamación y de neovascularización, demostrando que las MSC son 
un tratamiento efectivo en este tipo de quemaduras (Ke et al., 2015). 
En la Unidad de Investigación del Instituto de Oftalmología Conde de 
Valenciana ha sido posible aislar a partir de células mesenquimales de membrana 
amniótica (hAMSC). Se sabe que presentan las características descritas para las 
MSC, sin embargo se desconocen ciertos mecanismos que permiten su función 
inmunosupresora. Por ello, en nuestro grupo de trabajo, se ha demostrado que la 
inyección de hAMSC en la cámara anterior en un modelo de quemadura corneal 
murino, disminuye el infiltrado inflamatorio en el sitio de lesión. Por otra parte, en 
humano y en ratón se ha observado que el sobrenadante de las células 
mesenquimales obtenidas de la membrana amniótica humana provoca una 
disminución de la liberación de NET (manuscrito en preparación). Además, se ha 
observado que el sobrenadante de estas células disminuye la proliferación de 
queratocitos influyendo en el proceso de reparación corneal, inhibiendo el proceso 
de fibrosis en la córnea (manuscrito en preparación). 
De acuerdo a lo descrito por Chávez y colaboradores en México, de 2007 a 
2014 los trasplantes de membrana amniótica fueron utilizados principalmente en 
enfermedades como pterigion, úlcera corneal y reparación de superficie conjuntival 
sin evidencia de rechazo al trasplante (Chávez et al., 2015). 
Estos antecedentes nos permiten sugerir que las células mesenquimales 
derivadas de membrana amniótica pueden tener un mecanismo sobre la 
quimiotaxis de los neutrófilos en el sitio de lesión debido a sus propiedades. 
12 
 
 
 
 
 
III. Planteamiento del problema 
 
 Las MSC son células que se han utilizado en los últimos años para terapias 
regenerativas debido a sus propiedades inmunomoduladoras, antiinflamatorias y 
su baja inmunogenicidad. Existen estudios donde se demuestra que son capaces 
de disminuir el infiltrado de células inflamatorias, la neovascularización, la 
regeneración de tejido dañado, la disminución de la liberación de NET y la 
proliferación de células mononuclares. Sin embargo, se desconoce el 
funcionamiento de las hAMSC sobre la quimiotaxis de los neutrófilos al sitio de 
lesión. 
 
 
 
IV. Pregunta de investigación 
 
 ¿El sobrenadantede células mesenquimales derivadas de membrana 
amniótica humana tiene algún efecto en la quimiotaxis de los neutrófilos? 
 
 
 
 
V. Hipótesis 
 
 El sobrenadante de las células mesenquimales obtenidas de membrana 
amniótica inhibe la quimiotaxis de neutrófilos. 
 
 
 
13 
 
 
 
 
 
VI. Objetivo General 
 
 Determinar el efecto del sobrenadante de las células mesenquimales 
derivadas de membrana amniótica sobre la migración celular de los neutrófilos 
por método de Transwell. 
 
 
 
 
 
Objetivos específicos 
 
 
 
1. Obtener, cultivar y caracterizar células mesenquimales de membrana 
amniótica por citometría de flujo. 
 
2. Obtener y caracterizar neutrófilos humanos por citometría de flujo. 
 
3. Evaluar la migración de neutrófilos con quimioatrayente y con el 
sobrenadante de hAMSC por método de Transwell. 
 
 
14 
 
VII. MATERIALES Y MÉTODOS 
 
Obtención de hAMSCs. 
 La membrana amniótica (MA) o amnios se obtuvo de mujeres donantes 
sanas, que firmaron un consentimiento informado, cuyo embarazo transcurrió sin 
complicaciones y sin trabajo de parto para evitar la activación de metaloproteasas. 
 La membrana amniótica seseparó del corión de manera mecánica y se 
cortó en fragmentos de 3x3 cm, se añadieron 7 mL de tripsina/PBS/EDTA al 
0.05%y se agitó por 30 segundos, seguidamente los fragmentos de MA se 
transfirieron con ayuda de pinzas a dos tubos nuevos de 50 mLy a cada tubo se le 
añadió 7 mL de tripsina/PBS/EDTA al 0.05%, se agitó por 30 segundos y se 
incubó a 37°C por 10 minutos en baño con agitación para eliminar restos de 
sangre o células contaminantes. Después de esta incubación, la tripsina se eliminó 
y los fragmentos se transfirieron a tubos nuevos de 50 mL y a cada tubo se le 
añadieron 12 mL de la solución de tripsina/PBS/EDTA al 0.05% y se incubó por 40 
minutos a 37°C en baño María con agitación. 
 El producto de digestión de la tripsina se desechó y se repitió el paso dos 
veces más. Posterior al tratamiento con tripsina, los fragmentos de MA se 
observaron al microscopio para evaluar la ausencia de células epiteliales. El 
aislamiento de células troncales mesenquimales derivadas de membrana 
amniótica (hAMSCs) se realizó a partir de estos fragmentos. 
 Los fragmentos de MA tratados con tripsina se cortaron en segmentos más 
pequeños y se le realizó otra digestión con 12 mL de colagenasa II. Los 
fragmentos se homogeneizaronpor pipeteo evitando la formación de burbujas y se 
incubaron a 37°C por 90 minutos, cada 10 minutos se agitaron en vortex a mínima 
potencia. 
 Después de la incubación, se neutralizó la colagenasa II con medio de 
cultivo DMEMF-12 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) 
suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 10%, 1% Penicilina-Estreptomicina 
y 1% L-Glutamina. La mezcla se filtró a través de una malla para retirar los 
fragmentos sobrantes de tejido yse centrifugó a 500 x g por 5 minutos a 4°C. El 
sobrenadante se recuperó y fue nuevamente centrifugado, los botones celulares 
obtenidos en cada centrifugación fueron homogeneizados en 1 mL de medio de 
cultivo. Las células se sembraron en cajas de cultivo de 75 cm2en medio DMEMF-
12 suplementado y se mantuvieron en incubación a 37°C y 5% de CO2.Cada dos 
días aproximadamente se renovó el medio de las células adheridas y cuando el 
cultivo celular alcanzó una confluencia de 85-90% se despegaron y se cambiaron 
de caja para la realización de sub-cultivos (pases). 
 
15 
 
Caracterización de hAMSC. 
 La fenotipificación de los cultivos celulares se realizó por citometría de flujo, 
basada en la expresión de marcadores específicos de MSC: CD29, CD44, CD73, 
CD105, CD90 y CD45. 
 Se cultivaron las células del pase 3 al 6 hasta alcanzar el 90% de 
confluencia, se observaron en microscopio invertido y una vez alcanzada la 
confluencia se desechó el medio y se lavó con 3 mL de PBS dos veces y se 
añadieron 3 mL Tripsina/PBS/EDTA al 0.25% estéril y se retiró. 
 Se añadieron 5 mL de Tripsina/PBS/EDTA al 0.25% estéril a la caja de 
cultivo de las hAMSC, e incubaron a 37°C por 5 minutos. Las células se 
observaron al microscopio para verificar que ya no se encontraran adheridas a la 
caja de cultivo y si era así, la reacción se detuvocon 5 mL de medio DMEMF-12 y 
todo el volumen se colocó en tubo de 15 mL. Se agregaron 2-3 mL más de medio 
DMEMF-12 a la caja de cultivo y este medio se recolectó en el mismo tubo. 
 Una vez colectadas las células en el tubo, se centrifugó a 183 x g por 5 
minutos a 4°C con rampa y se desechó el sobrenadante. El botón celular se 
resuspendió en 1000 µL de PBS y se contaron las hAMSC utilizando la técnica de 
exclusión de azul de tripano en cámara de Neubauer. 
Se colocaron 1x104 células por tubo para la caracterización por citometría 
(3 tubos). A cada tubo se le añadió 200 µL de PFA (paraformaldehído) al 4% para 
fijar estas células y se incubó por 10 minutos. Después de la incubación se 
añadieron 2 mL de PBS y se centrifugó a 183 x g por 5 minutos a 4°C con rampa. 
El sobrenadante se desecha y a los botones celulares se añaden los anticuerpos 
para la caracterización, según las siguientes especificaciones. 
 
Tubo 1: 5 µL CD90-FITC 
 5 µL CD105-PE 
 5 µL CD45-PECy7 
 
Tubo 2: 5 µL CD73-PE 
 5 µLCD44-PerCP 
 5 µL CD29-FITC 
 
Tubo 3: 200 µL PBS, sin anticuerpos y este es el control de 
autoflorescencia (CAF) de hAMSC. 
 
 Se incubó durante 30 minutos en oscuridad a temperatura ambiente, 
posteriormente se añaden 500 µL de PBS y se centrifugó a 183 x g por 5 minutos 
a 4°C con rampa, el sobrenadante se desecha y se repitió una vez más para un 
total de dos lavados. Una vez realizados los lavados se añadieron 200 µL de PBS 
16 
 
para resuspender las células. El número de células marcadas con los anticuerpos 
específicos se cuantificaron por citometría de flujo en un citómetro FACS Verse® y 
adquiriendo 10,000 eventos. Los datos fueron analizados con el programa FlowJo. 
 
Extracción de neutrófilos. 
 Los neutrófilos fueron obtenidos de sangre periférica de donantes sanos, 
mediante gradiente de densidad. 
 Se obtuvo sangre periférica en un tubo de 4 mL con EDTA. La sangre 
completa se colocó en un tubo de 15 mL sobre Pmmp (Polymorphprep) en 
relación 1:1 cuidando de no hacer turbulencias. Se centrifugó a 500 xg por 35 min 
a 20°C sin rampa y sin freno, para mantener el gradiente. Se tomó la fracción de 
células PMN colocándola en un tubo nuevo de 15 mL y se añadió un volumen 
igual de PBS, se resuspendieron las células y se centrifugó a 400 x g por 10 
minutos a 4°C con rampa, se eliminó el sobrenadante. Para eliminar los eritrocitos 
del botón celular se adicionó 3 mL de buffer de lisis (155 mM NH4Cl, 100 mM 
Na2EDTA, 10 mM NaHCO3) por 5 minutos, se agregó 1 mL de PBS para lavar y se 
realizó una centrifugación a 400 x g por 10 minutos a 4°C con rampa. El 
sobrenadante se desecha y el botón celular se trata según la técnica a seguir. 
 
Conteo celular. 
La cuantificación tanto de las hAMSC como de los neutrófilos se realizó con 
la técnica de exclusión de azul tripano. Las células fueron resuspendidas en 1 mL 
de PBS, y de estas se tomaron 10 µL y se agregaron 90 µL de azul de tripano en 
un tubo de 0.2 mL. Se colocaron 20 µL de la mezcla anterior en la cámara de 
Neubauer y se contó el número de células en un microscopio con un objetivo de 
10X. 
 Se utilizó la siguiente fórmula para obtener el total de células obtenidas en 
1000 µL de medio o PBS. (Total de cél. obtenidas)4 × 10 × 10,000 = Número total de células por mL. 
 
Determinación de pureza de neutrófilos. 
 Los neutrófilos extraídos (500 µL) se fijaron con 2 mL de PFA al 4% por 5 
minutos a 4°C, seguidamentese agregó 2 mL de PBS para lavar y se centrifugaron 
a 400 xg por 10 minutos a 4°C con rampa. 
17 
 
 Se desechó el sobrenadante y el botón se resuspendió en PBS/FACSFlow 
para la cuantificación en el citómetro de flujo (FACSVerse®). 
 Se verificó que en la población obtenida de células se encontraban los PMN 
alcomparar con una población de sangre total. Se determinó la pureza de la 
población obtenida con ayuda del programa FlowJo. 
 
 
Caracterización de neutrófilos. 
 Se colocaron 100x103 neutrófilos en un tubo para citometría. Se 
centrifugaron a 400 x g por 5 minutos a 4°C con rampa y se desechó el 
sobrenadante. Al botón celular se añadió 1 µL CD11b-PE + 5 µL CD45-PerCP y se 
incubó durante 30 minutos en oscuridad a temperatura ambiente, trascurrido este 
tiempo se agregó 500 μL de PBS y se centrifugó a 400 x g por 5 minutos a 4°C 
con rampa, el sobrenadante se desecha y al botón se le agregó 200 µL PBS. Se 
analizó la población de neutrófilos en un citómetro FACS Verse® y adquiriendo 
10,000 eventos. 
 
Migración de neutrófilos en Transwell. 
 Se realizó la extracción de neutrófilos con Pmmp a partir de sangre total y 
se verificó la viabilidad y se cuantificaron por medio de la técnica de exclusión de 
azul tripano en una cámara de Neubauer. 
 Se añadieron 5 x 104 neutrófilosresuspendidos en 80 μL de Buffer A (SFB 
(2%), HEPES (10 mM), HBSS+/+) a la cámara superior del Transwell y en la 
cámara inferior se colocaron 200 μL de Buffer A con fMLP 12.5 nM, se incubaron a 
37°C por 3 horas. Una vez transcurrido el tiempo, se retiró el sobrenadante de 
ambas cámaras. 
 Se limpió la parte interna de la cámara superior con un isopo estéril y los 
neutrófilos se fijaroncon PFA al 4% por 5 minutos,colocando 80 µL en la cámara 
superior y 200 μL en la cámara inferior; al terminar el tiempo sedesechó el PFA y 
se agregó 80 µL y 200 μL de PBS en la cámara superior e inferior para eliminar los 
restos de PFA y este procedimiento se realizó una vez más. 
 Se retiraron las membranas con ayuda de una pinza pequeña; se limpió la 
pinza entre cada extracción de membranas con alcohol. Se colocaron las 
membranas en portaobjetos, y se agregaron 10 µL de DAPI/PBS 1:3 y 10 µL de 
PBS 1X por membrana. Después se colocaron los cubreobjetos cuidando de no 
dejar burbujas y sellando con esmalte de uñas el contorno del cubreobjetos. 
18 
 
Quimiotaxis de neutrófilos en contacto con hAMSC en Transwell. 
Teniendo una confluencia celular del 90% de hAMSC de un cultivo de pase 
3 a 6, las células adheridas a la caja de cultivo se trataron con tripsina para 
recolectarlas y se realizó un conteo celular. 
 Se colocaron 5000, 1000 o 500 hAMSC en pozos diferentes de una caja de 
cultivo de 96 pozos para obtener las relaciones hAMSC-neutrófilos 1:10, 1:50 y 
1:100 respectivamente. Las células se dejaron adherir al pozo de la caja de cultivo 
por 16 hrs en medio DMEMF-12 con SFB al 10% a 37°C y 5% de CO2. Después 
de las 16 hrs se retiró el medio de las células y se añadió 200 μL del tratamiento 
correspondiente (tabla 1 y tabla 2). Posteriormente se colocaron en la cámara 
superior del Transwell 5 x 104 neutrófilos resuspendidos en 80 μL DMEMF-12 sin 
SFB. Este sistema se incubó por 3 hrs a 37°C y 5% de CO2. 
 
 Tratamiento 
A hAMSC hAMSC en DMEMF-12 sin SFB 
B hAMSC/fMLP hAMSC + fMLP 12.5 μM en DMEMF-12 sin SFB 
C Control + fMLP 12.5 μM en DMEMF-12 sin SFB 
D Control - DMEMF-12 sin SFB 
 
Tabla 1. Identificación de condiciones para evaluar la quimiotaxis de neutrófilos 
en presencia de hAMSC. 
 
 Una vez trascurrido el tiempo de incubación, se retiró el sobrenadante de 
ambas cámaras y la parte interna de la cámara superior se limpió con un isopo 
estéril y los neutrófilos se fijaron con PFA al 4% por 5 minutos, colocando 80 μL en 
la cámara superior y 200 μL en la cámara inferior; al terminar el tiempo se desechó 
el PFA y se agregaron 80 μL y 200 μL de PBS en la cámara superior e inferior 
para eliminar los restos de PFA y etse procedimiento se realizó una vez más. 
 Se colocó 5 μL de yoduro de propidio (0.25 mg/mL) sobre la membrana del 
Transwell por 3 minutos. Se lavó con 5 μL de PBS dos veces. Con ayuda de 
pinzas limpias se retiró la membrana del Transwell. 
 Se colocó la membrana en un portaobjetos y se añadió glicerina/PBS (1:1), 
se colocó un cubreobjetos y con esmalte se fijaron las orillas para evitar que se 
secaran las membranas. Se observaron con microscopio Apotome® de 
fluorescencia. 
 
19 
 
 
Tabla 2. Esquema representativo de las relaciones hAMSC-PMN para la 
evaluación de la quimiotaxis. 
 
Análisis por microscopia de fluorescencia. 
 Las membranas una vez teñidas con yoduro de propidio se observaron en 
microscopio de fluorescencia con un objetivo de 10X. La migración de los 
neutrófilos fue determinada como el área total de fluorescencia, considerando sólo 
aquellas mayores de 12 μm. Se calculó la media y SEM (error estándar de la 
media). Se usó el programa Graph Prism® para analizar los datos obtenidos para 
la comparación entre dos grupos independientes con la prueba de t de Student 
considerando una p<0.05 como estadísticamente significativa. 
hAMSC + PMN 
1:10 
 
hAMSC + PMN 
1:50 
 
 
hAMSC + PMN 
1:100 
 
Controles 
Sin hAMSC 
PMN 
fMLP sin fMLP fMLP sin fMLP fMLP sin fMLP fMLP 
sin 
fMLP 
 
 
 
20 
 
VIII. RESULTADOS 
 
Las hAMSC aisladas de membrana amniótica humana presentaron una 
morfología fibroblastoide, fueron adherentes al plástico de cultivo (Figura 4). La 
caracterización molecular por citometría de flujo indicó la expresión de los 
marcadores CD29, CD73, CD90, CD44, CD105 y la ausencia del marcador CD45 
al comparar con los controles de autofluorescencia (Figura 5). Para todas las 
determinaciones (caracterización, conteo celular y ensayo de migración) se 
tomaron células con una confluencia del 90%. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4.Microfotografía de células hAMSC. Morfología fibroblastoide de hAMSC al día 5 
de cultivo y confluencia de 90%. 
 
La cantidad de las células en las diferentes poblaciones celulares fue 
determinada por citometría de flujo. Las poblaciones fueron separadas de acuerdo 
al tamaño y la complejidad interna. En sangre total el porcentaje de PMN fue de 
67.4% y cuando fueron separadas las poblaciones por gradiente de densidad se 
observó un 95.0% de PMN en la muestra purificada (Figura 6, A). Se realizó la 
determinación de los marcadores celulares CD11b y CD45; en la muestra de 
sangre total el resultado fue positivo 69.1% para ambos marcadores, en la 
muestra de PMN aislados resultó positiva para los marcadores con un 98.2% 
obteniendo un mayor porcentaje de positividad con respecto al control de 
autofluorescencia (CAF) (Figura 6, B). 
 
 
21 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5.Caracterización fenotípica de hAMSC por citometría de flujo. Histogramas 
de expresión positiva o negativa de marcadores CD29, CD90, CD105, CD73, CD45 
y CD44 (blanco) y control de autofluorescencia de hAMSC (gris). 
Control de autofluorescencia 
Fluorescencia de marcadores 
+ 
+ 
+ + 
+ ‐ 
22 
 
 
 
 
 
Figura 6.Gráficas de puntos por citometría de flujo para definir las poblaciones celulares. A) 
Identificación de las poblaciones celulares por tamaño y complejidad en sangre total (a) y 
aisladas por gradiente de densidad para determinar la población de PMN (b). 
B) Gráfica de puntos por citometría de flujo de la expresión positiva de los marcadores 
CD11b y CD45 en el control de autofluorescencia (CAF) (a) en sangre total (b) y neutrófilos 
aislados (c). 
ST PMN
PMNSTCAF 
A) 
B) 
a) b) 
c) b) a) 
23 
 
El análisis del efecto del quimioatrayente (fMLP) sobre la migración de los 
neutrófilos se realizó utilizando 50,000 células por pozo en el sistema Transwell y 
con 3 hrs de estímulo. Los resultados indicaron que al utilizar una concentración 
de 12.5 μM de fMLP, el área de fluorescencia es 135.62 veces mayor que sin 
estímulo; al disminuir la concentración (6.25 µM) de fMLP esta área disminuye no 
significativamente, lo mismo ocurre al aumentar la concentración de fMLP (25 y 50 
µM) ya que el área de fluorescencia aumenta significativamente (*=p<0.05) pero 
resulta menor que la fluorescencia observadaen la concentración de 12.5 µM. En 
concentración 100 µM aumenta no significativamente la fluorescencia observada 
en comparación con el control sin estímulo. Estos resultados indicaron de manera 
indirecta que a la concentración de 12.5 μM de fMLP la mayoría de los neutrófilos 
son estimulados para migrar hacia el quimioatrayente (Figura 7). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7. Quimiotaxis de neutrófilos estimulados con diferentes concentraciones de 
fMLP en el sistema Transwell. Medición del área de fluorescencia de los neutrófilos 
teñidos con yoduro de propidio y observado en microscopio de fluorescencia 
(objetivo 63X). n=3 *=p<0.05. 
SE 6.
25
12
.5 25
 
50 10
0
0
100000
200000
300000
400000
500000 *
* *
Concentración de fMLP (M)
F
lu
o
re
sc
en
ci
a 
p
o
r 
ca
m
p
o
24 
 
El efecto del sobrenadante de las células mesenquimales de membrana 
amniótica sobre la quimiotaxis de neutrófilos se evaluó colocando las hAMSC en la 
cámara inferior del sistema Transwell y los neutrófilos en la parte superior sin estar 
en contacto con las células y usando como control positivo el estímulo de fMLP, 
también se analizó el efecto del sobrenadante de las hAMSC en presencia de 
fMLP. Las relaciones neutrófilos-hAMSC utilizadas fueron 1:10, 1:50 y 1:100. 
Al estar las hAMSC en relación 1:10 con los neutrófilos, se observó que la 
sola presencia de las células no disminuye significativamente (*=p<0.05) el área 
de fluorescencia con respecto al control negativo, sin embargo cuando se adiciona 
fMLP al sistema se observa una disminución significativa, es decir que en la 
relación 1:10 el sobrenadante de las células mesenquimales inhibe la migración 
de los neutrófilos. 
En la relación 1:50 de hAMSC-neutrófilos no hay disminución significativa 
de la quimiotaxis de neutrófilos por efecto de las hAMSC aún y cuando se agregó 
fMLP al sistema. Lo que nos indica que a esta concentración el sobrenadante de 
las hAMSC no es capaz de inhibir la quimiotaxis de neutrófilos. 
Cuando las hAMSC se encuentran en relación 1:100 al no tener presencia 
de quimioatrayente en el medio hay una disminución significativa del área de 
fluorescencia al igual que al encontrarse en contacto con el fMLP (*=p<0.05). Es 
visible la inhibición de la quimiotaxis de neutrófilos al estar en contacto con el 
fMLP, ya que disminuye 5.44 veces, y al no estar en contacto con el 
quimioatrayente el área de fluorescencia visible disminuye 0.04 veces. Por lo 
tanto, en la relación 1:100 si existe la inhibición de la quimiotaxis de neutrófilos 
mediada por el sobrenadante de hAMSC cuando no existe presencia de fMLP en 
el sistema. 
Al disminuir el número de células por neutrófilos (1:100) el sobrenadante de 
éstas no disminuye significativamente la migración de neutrófilos, pero disminuye 
5.44 veces la quimiotaxis. Al estimular los neutrófilos con fMLP se observa 
migración de los mismos y cuando se agregan hAMSC, hay una disminución de la 
quimiotaxis estadísticamente significativa (*p=<0.05) (Figura 8). 
Las microfotografías representativas de las membranas de los sistemas 
Transwell nos permiten realizar la comparación entre las diferentes 
concentraciones de hAMSC sin fMLP y nuestros controles sin hAMSC (con 
presencia y ausencia de fMLP); lo que indica que si existe la inhibición de la 
migración de neutrófilos y estose comprueba en la concentración 1:100 hAMSC-
neutrófilos al no presentar fluorescencia (Figura 9). 
 
25 
 
 
0
10000
20000
30000
40000
fMLP
 hAMSC
+
- ++
-
-
- +
*
1:10
Á
re
a 
d
e 
fl
u
o
re
sc
en
ci
a 
p
o
r 
ca
m
p
o
0
10000
20000
30000
40000
fMLP
 hAMSC
+
-
+
++
-
-
-
1:50
Á
re
a 
d
e 
fl
u
o
re
sc
en
ci
a 
p
o
r 
ca
m
p
o
0
10000
20000
30000
40000
*
fMLP
 hAMSC +
-
- +
++
-
-
1:100
Á
re
a 
d
e 
fl
u
o
re
sc
en
ci
a 
p
o
r 
ca
m
p
o
0
10000
20000
30000
40000
1:100
1:50
1:10
hAMSC
fMLP
++ +-
++ ++
+
+
+
-
-
- --
- -
- -
* *
Á
re
a 
d
e 
fl
u
o
re
sc
en
ci
a 
p
o
r 
ca
m
p
o
0
5000
10000
15000
--
-
-
-
-
-
+
-
-
--
-
-
+
-
-
+
-
-1:100
1:50
1:10
hAMSC
fMLP
Á
re
a 
d
e 
fl
u
o
re
sc
en
ci
a 
p
o
r 
ca
m
p
o
Figura 8.Efecto de las hAMSC en la quimiotaxis de neutrófilos. Utilizando 
diferentes relaciones de hAMSC-neutrófilos: a) 1:10, b) 1:50, c) 1:100, 
comparación de las concentraciones de hAMSC, con (e) y sin (d) fMLP (12.5 
µM) en un sistema Transwell. Medición del área de fluorescencia de los 
neutrófilos teñidos con yoduro de propidio y observado en microscopio de 
fluorescencia (objetivo 63X). n=3 *=p<0.05. 
n=3  
*=p<0.05 
a) 
e) d) 
c) 
b) 
26 
 
 
Figura 9.Microfotografías representativas de quimiotaxis de neutrófilos. Efecto de las
hAMSC en la migración de los neutrófilos en un sistema Transwell. Estímulo con fMLP (12.5
µM) por 3 horas en presencia de hAMSC. Controles positivo (C+) y negativo(C-) sin
hAMSC. n=3 
C- sin fMLP sin hAMSC C+ fMLP sin hAMSC 
1:10 fMLP hAMSC 1:50 fMLP hAMSC 
1:100 fMLP hAMSC 
27 
 
IX. DISCUSIÓN 
 
El presente estudio demostró que las hAMSC son capaces de inhibir la 
quimiotaxis de neutrófilos incluso en presencia de un quimioatrayente como fMLP. 
Con base en nuestros resultados podemos inferir que las hAMSC podrían 
secretan algunos factores solubles que poseen un efecto inmunomodulador hacia 
células de inmunidad innata como los neutrófilos. 
Las células que se aislaron de la membrana amniótica fueron positivas a la 
expresión de los marcadores CD29, CD73, CD90, CD105 y CD44, los cuales 
participan en procesos de adhesión celular y son compatibles con lo descrito 
acerca de células troncales y la ausencia de expresión del marcador CD45, lo cual 
nos permite demostrar que no se encuentran diferenciadas a un linaje 
hematopoyético. Con base en lo analizado por Insausti y colaboradores nosotros 
corroboramos que los resultados obtenidos presentan similitudes en cuanto a los 
marcadores fenotípicos que se analizaron de las células mesenquimales obtenidas 
de membrana amniótica. Así mismo, demostramos que las hAMSC obtenidas en 
los cultivos poseen los criterios de definición propuestos por la Sociedad 
Internacional de Terapia Celular, es decir, las hAMSC se adherían al plástico en 
las cajas de cultivo y presentaban la morfología característica fibroblastoide 
(Insausti, et al. 2014; Yen et al., 2005). 
En trabajos previos se demostró que utilizar células obtenidas de 
membrana amniótica posee una ventaja sobre lo descrito de las MSC obtenidas 
de otros tejidos, ya que no presenta contaminación con células no fibroblastoides. 
Además, comparadas con células derivadas de tejidos adultos poseen mayor 
proliferación y capacidad de diferenciación (Bieback et al., 2004; Erices et al., 
2000; Yen et al., 2005). En un estudio realizado en 2014 por nuestro grupo de 
trabajo, se analizaron estos datos confirmando lo citado por los autores y por esta 
razón decidimos utilizar hAMSC en nuestros ensayos. 
Los neutrófilos son células capaces de migrar y realizar diapédesis hacia 
los sitios de lesión o inflamación a través de una señalización adecuada. En 
diversas enfermedades oftalmológicas, autoinmunes e inflamatorias se ha 
reportado que la presencia de neutrófilos con una deficiente depuración resultaen 
daño al tejido, lo que provoca una respuesta inflamatoria persistente. 
Chen y colaboradores describen que fMLP y LPS actúan de manera 
sinérgica activando a los leucocitos (Chen 2009). A su vez, existen diversos 
estudios en los que se demuestra que el LPS y fMLP incrementan la liberación de 
citocinas, dando paso a la migración de neutrófilos hacia los sitios de inflamación 
(Guirra et al., 2015). Por lo que se demostró en este estudio que el fMLP (12.5 µM) 
promueve la quimiotaxis de los neutrófilos obtenidos de sangre totalcon 3 horas de 
estímulo. 
28 
 
Contrario a nuestros resultados, Raffaguello et al. utilizando fMLP cultivaron 
neutrófilos con y sin BM-MSC (células troncalesmesenquimales obtenidas de 
médula ósea, del inglés bone marrow derived mesenchymal stem cells), sin 
encontrar ningún efecto significativo en la migración en respuesta al estímulo 
(Raffaguello et al., 2008), esto puede deberse a que utilizan MSC de estirpe 
celular diferente a la nuestra. 
De acuerdo a lo descrito por Garfias y colaboradores la membrana 
amniótica inhibe la inflamación, la angiogénesis y promueve la epitelización. Esto 
se demostró al colocar células mononucleares en contacto con células de 
membrana amniótica la proliferación de las mononucleares se ve disminuida 
(Garfias et al., 2011). Al poner en contacto los neutrófilos con el sobrenadante de 
hAMSC en un sistema Transwell se evidenció que estas células secretan algún 
componente al medio que es capaz de inhibir la quimiotaxis de los 
neutrófilos.Secomprobó a través de los ensayos de Transwell que las hAMSC son 
también capaces de inhibir la quimiotaxis de neutrófilos. 
Las hAMSC son capaces de modular a las células T y secretar factores 
solubles como IL-10, TGF-β1, HGF y PGE2, expresan en muy baja concentración 
moléculas de histocompatibilidad clásicas HLA-IA y tienen la capacidad de inhibir 
la maduración y expresión de moléculas coestimuladoras en las células 
presentadoras de antígeno. Aunado a esto, son capaces de bloquear la 
producción de las citocinas inflamatorias TNF-α, CXCL10, CXCL9 y CCL5. Todas 
estas características les confieren propiedades inmunomoduladoras, 
inmunorreguladoras, inmunosupresoras y tolerogénicas (Tabera et al., 2008; 
Insausti et al., 2013). 
Diversos estudios clínicos indican que la utilización de células troncales 
mesenquimales provoca la disminución del proceso inflamatorio revirtiendo la 
angiogénesis y acelerando la recuperación del paciente (Insausti et al., 2014). 
Con base en los antecedentes planteados, se sugiere que las hAMSC al 
encontrarse en un microambiente pro-inflamatorio activan ciertas vías de 
señalización secretando diversos factores solubles que contrarrestan este 
ambiente ejerciendo su efecto inmunomodulador. 
Se ha reportado por da Silva et al. que la degradación de triptófano como 
consecuencia de la expresión de IDO por las MSC detiene la proliferación de las 
células T, siendo los catabolitos de triptófano los que inhiben la activación de 
células T CD4+ y CD8+. Además las hAMSC son capaces de inhibir o aumentar la 
proliferación de las células B, así como regular la secreción de citocinas por las 
células dendríticas y macrófagos (da Silva et al., 2009). 
En un ensayo de daño hepático en ratones el medio condicionado (SFB al 
0.05%) de MSC (MSC-CM) fue capaz de disminuir el infiltrado leucocitario 
(Parekkadan et al.,2007). De acuerdo a Khakoo la propagación del Sarcoma de 
29 
 
Kaposi depende de citocinas proinflamatorias, factores angiogénicos y expresión 
de moléculas de adhesión; ellos encontraron que las BM-MSC (células troncales 
mesenquimales de médula ósea) administradas por vía intravenosa provocan un 
efecto antitumoral (Khakoo et al., 2006). 
Según lo descrito por Follin et al. el fenotipo antiinflamatorio de macrófagos 
secreta IL-10, que actúa como inmunosupresor de células como los linfocitos. In 
vivo, este efecto es el resultado de la terapia con MSC, con macrófagos locales 
antiinflamatorios residiendo en el tejido, probablemente mediando el potencial 
regenerativo de las MSC. Además, las MSC son capaces de incrementar la 
diferenciación de las células T en células T reguladoras por la secreción de IL-10, 
PGE2 y TGF-β1 o por macrófagos antiinflamatorios (Follin et al., 2016). 
Las MSC son activadas por señales inflamatorias como TNF-α, IL-1α, IL-1β 
e INF-γ, provocando un ambiente inmunosupresor, por lo cual se empiezan a 
secretar IDO, PGE2, IL-10, TGF-β y HGF (factor de crecimiento de hepatocitos) 
ocasionando un ambiente inmunomodulador (Kramperaet al., 2013). En un estudio 
realizado por Fontaine y colaboradores se colocaron MSC con células T en un 
sistema Transwell, observaron que la proliferación de las células T disminuyó sin 
necesidad del contacto celular entre ellas, comprobando que los factores 
secretados por las MSC son las encargadas de esta regulación (Fontaine et al., 
2016). 
Las MSC al ser células indiferenciadas con capacidad para diferenciarse en 
células maduras y altamente proliferativas permitiendo obtener una extensa 
cantidad de éstas células, se han convertido en alternativas ante diversas 
enfermedades. (Kin et al., 2014). Por esto, es fundamental entender la función 
inmunosupresora y antiinflamatoria que son capaces de efectuar la células 
mesenquimales, en especial las hAMSC; así como conocer los mecanismos 
inmunosupresores que emplean para regular el microambiente inflamatorio y/o 
células inflamatorias con el fin de optimizar su uso como potencial terapia celular 
en diversos procesos inflamatorios. 
Hasta el momento no se han descrito todas las moléculas que son 
secretadas por las hAMSC las cuales se cree son las encargadas de realizar la 
inmunomodulación de las células inmunitarias de tipo innata, por lo tanto queda un 
extenso campo de investigación sobre este tema. 
 
 
 
 
 
30 
 
 
X. CONCLUSIONES 
 
 
Las hAMSC obtenidas del cultivo celular cumplen con todos los criterios 
propuestos por la Sociedad Internacional de Terapia Celular que las definen como 
células mesenquimales. 
 
Los neutrófilos obtenidos resultaron viables para los ensayos con una 
morfología adecuada, con marcadores positivos para estas células. 
 
Las hAMSC son capaces de inhibir la quimiotaxis de neutrófilos incluso 
cuando éstos se encuentran en contacto con quimioatrayente (fMLP) in vitro. 
 
 
 
 
31 
 
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