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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN “Análisis del efecto del sobrenadante de las células mesenquimales obtenidas de membrana amniótica humana sobre la quimiotaxis de los neutrófilos” T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: LICENCIADA EN BIOQUÍMICA DIAGNÓSTICA PRESENTA: MARIANA YOLOTZIN GARCÍA BERMÚDEZ DIRECTORES: DR. YONATHAN OMAR GARFIAS BECERRA MÉD. CIR. GIBRÁN ALEJANDRO ESTÚA ACOSTA DRA. BEATRIZ BUENTELLO VOLANTE CUAUTITLÁN IZCALLI, ESTADO DE MÉXICO. OCTUBRE 2016. UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. DEDICATORIA A mis papás María de los Ángeles y Daniel que siempre han estado ahí para apoyarme, levantarme y darme palabras de aliento cuando lo necesito. Por desvelarse conmigo en esas noches de estudio. A mi hermana Itzel por ser mi mejor amiga y la sonrisa que me quita cualquier enojo o tristeza. Gracias a ustedes he logrado llegar hasta aquí, gracias por todas las lecciones que me han dado e impulsarme siempre con su cariño y ejemplo. Los amo. A mi abuela María de Jesús por esa fuerza que tienes, por los platos de comida cuando ya era muy tarde y todas las historias, gracias por cuidar de nosotros. A mis tíos y primos, gracias por estar siempre juntos, por las carcajadas, los bailes y los hombros prestados para dormir. Ustedes son mi apoyo incondicional. A Diego que desde el inicio ha estado ahí, gracias por todo. Por el ánimo para ser mejor día a día. Por impulsarme a crecer, por los abrazos y sonrisas cuando lo necesitaba. Por ser mi confidente, amigo y compañero estos años. A Montserrat, Andrea, Ximena, Luis, Jaime y Miguel por ser mi segunda familia en la universidad. Por las risas, bailes, tareas, exposiciones, los malos momentos que se convirtieron en anécdotas, las desveladas estudiando, las comidas a las 4 de la mañana, las carreras diarias… mil gracias a ustedes por el tiempo que vivimos juntos. A Gabriela y Natalia porque aunque pasan los años seguimos juntas. Gracias por su amistad, las pláticas, los regaños, por ser mis confidentes, porque con ustedes cualquier momento es bueno para reír a carcajadas y disfrutar la vida. AGRADECIMIENTOS Al doctor Yonathan Garfias por apoyarme y confiar en mí. Por explicarme las veces que fuera necesario. Lo admiro por ser un excelente profesor y ser humano. A Gibrán por las explicaciones, todos los experimentos y sobre todo, el tiempo dedicado a los ensayos conmigo, te agradezco por ser paciente y ayudarme. A Beatriz por estar ahí e impulsarme, por tu tiempo para revisar. A Sofía por apoyarme y hacer correcciones. A Mariana, Alfredo, Joaquín, Graciela, América, César, Beatriz y Óscar por toda la ayuda que me brindaron, las ideas y ánimos para terminar este trabajo, también por los momentos fuera del laboratorio y las buenas anécdotas. A Verónica y Olga por ser un gran apoyo en todo, por contagiarme su alegría y ser mis confidentes. Son un maravilloso equipo de trabajo y amigos increíbles. A la Unidad de Investigación del Conde Valenciana, por enseñarme el trabajo en equipo, por sus enseñanzas y todo el aprendizaje que he tenido tanto profesional, académica y personalmente a lo largo de la realización de este trabajo. A la UNAM, mi alma mater, por las oportunidades que me ha brindado y mantener las puertas abiertas para seguir creciendo profesional y personalmente. A la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán por permitirme entrar en sus aulas para estudiar. A mis profesores, por su pasión a enseñar y transmitirme sus conocimientos y el gusto por aprender todos días. Esta tesis se llevó a cabo bajo la dirección de los Dres. Beatriz Buentello Volante, Yonathan Omar Garfias Becerra y del Méd. Cir. Gibrán Alejandro Estúa Acosta. En el Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina y la Unidad de Investigación del Instituto de Oftalmología “Fundación de Asistencia Privada Conde de Valenciana I.A.P.” Esta tesis fue apoyada por los fondos sectoriales CONACYT-SALUD-160286, 273349; CONACYT-CIENCIA BÁSICA-167438 y DGAPA-PAPIIT-UNAM IA203514. ÍNDICE GENERAL Abreviaturas ............................................................................................................. I Índice de figuras ..................................................................................................... III Índice de tablas ...................................................................................................... III Resumen ................................................................................................................ IV I. Introducción ............................................................................................... 1 1. Sistema Inmune .......................................................................................... 1 2. Neutrófilos ................................................................................................... 1 2.1 Migración ................................................................................................ 2 3. Células troncales mesenquimales ............................................................... 8 3.1 Células mesenquimales de membrana amniótica (hAMSC) ................... 9 3.2 Trasplante de poblaciones de células madre ........................................ 10 II. Antecedentes .......................................................................................... 11 III. Planteamiento del problema .................................................................... 12 IV. Pregunta de investigación ....................................................................... 12 V. Hipótesis .................................................................................................. 12 VI. Objetivos ................................................................................................. 13 VII. Materiales y métodos .............................................................................. 14 VIII. Resultados .............................................................................................. 20 IX. Discusión ................................................................................................. 27 X. Conclusiones ........................................................................................... 30 XI. Referencias ............................................................................................. 31 I Abreviaturas AM Membrana amniótica ANCAs Anticuerpos citoplasmáticos anti-neutrófilos ATP Adenosintrifosfato BM-MSC Células troncales mesenquimales obtenidas de médula ósea, del inglés bone marrow derived mesenchymal stem cells. CAF Control de autoflorescencia CCL Ligando de quimiocinas CC CD Del inglés, cluster of differentiation CXCR Receptor de la familia de quimiocinas CXC CXCL Ligando de la familia de quimiocinas CXC CLA Antígeno cutáneo de linfocitos CO2 Dióxido de carbono CR Receptores para proteínas de complemento C3b Proteína del complemento, opsonina. C3bi Receptor del complemento tipo 3 C4bComponente del complemento 4b, opsonina C5a Componente del complemento 5a DAMP Patrones moleculares asociados a daño DAPI 2-(4-amidinofenil)-1H-indol-6-carboxamidina DMEMF-12 Medio Dulbecco modificado de Eagle: mezcla de nutrientes F-12 DNA Ácido desoxirribonucleico DPBS Del inglés Dulbecco’s phosphate-buffered saline EDTA Ácido etilendiaminotetraacético E-selectina Molécula de adhesión celular (MAC), CD62E FasL Fas ligando FITC Isotiocianato de fluoresceína fMLP N-formil-L-metionil-L-leucil-L-fenilalanina (C21H31N3O5S) G-CSF Factor estimulante de colonias de granulocitos GM-CSF Factor estimulante de colonias de macrófagos GlyCAM-1 Molécula de adhesión celular dependiente de glicosilación tipo I H2O2 Peróxido de hidrógeno hAEC Células epiteliales de amnios humano hAMSC Células mesenquimales obtenidas de membrana amniótica humana. HBSS Solución salina balanceada de Hank HClO Ácido hipocloroso HEPES Ácido 4-(2-hidroxietil) piperazina-1-etanesulfónico, N-(2-hidroxietil) piperazina-N′-(2-ácido etanesulfónico) HLA Antígeno leucocitario humano HGF Factor de crecimiento de hepatocitos, del inglés hepatocyte growth factor ICAM-1 Molécula de adhesión intercelular 1 ó CD54 ICAM-2 Molécula de adhesión intercelular 2 ó CD102 IDO Indolamina 2,3-dioxigenasa IFN Interferon IL Interleucina ISCT Sociedad Internacional de Terapia Celular, del inglés International Society for Cellular Therapy LES Lupus eritematoso sistémico II LFA-1 Antígeno asociado a función linfocítica 1 (CD11a) L-selectina Molécula de adhesión celular (MAC), CD62L LPS Lipopolisacárido MAdCAM-1 Molécula de adhesión celular1-adresina, del inglés mucosal vascular addressin cell adhesion molecule 1 MAC-1 Molécula de adhesión celular (CD11b/CD18) MHC-II Complejo mayor de histocompatibilidad tipo II MIF Factor inhibitorio de migración de macrófagos MPO Enzima mieloperoxidasa MSC Células troncales mesenquimales MSC-CM Medio condicionado de células troncales mesenquimales NADPH Nicotinamida adenina dinucleotido fosfato NET Trampas extracelulares de neutrófilos NK Del inglés, Natural Killer O2- Oxígeno PAMP Patrones moleculares asociados a patógenos PBS Buffer de fosfatos salina PCNA Antígeno nuclear de células de proliferación PE Ficoeritrina PE-Cy7 Ficoeritrina cianuro 7 PEDF Factor derivado del epitelio pigmentario PerCP Del inglés, peridinin-chlorophyllproteins PFA Paraformaldehído PGE2 Prostaglandina E2 Pmmp Polymorphprep PMN Polimorfonucleares PRR Receptor de reconocimiento de patrones PR3 Proteinasa 3 P-selectina Molécula de adhesión celular (MAC), CD62P PSGL-1 Glicoproteína P-selectina ligando 1 RNS Especies reactivas de nitrógeno ROS Especies reactivas de oxígeno SEM Error estándar de la media SFB Suero fetal bovino TGF-β Factor transformante de crecimiento β Th Linfocitos T cooperadores TLR Receptor tipo Toll TNF Factor de necrosis tumoral TRAIL Ligando inductor de apoptosis de ligando TNF Treg Linfocitos T reguladores VCAM-1 Proteína de adhesión celular vascular 1 VE-cadherina Cadherina vascular endotelial o CD144 VEGF Factor de crecimiento endotelial vascular III Índice de figuras Figura 1. Frotis de sangre periférica………………………………………………...… 2 Figura 2. Cascada de reclutamiento de neutrófilos……………………………….….4 Figura 3. Trampas extracelulares de neutrófilos (NET)……………………….……..7 Figura 4. Microfotografía de células hAMSC…………………………………..….…20 Figura 5. Caracterización fenotípica de hAMSC por citometría de flujo…..…….21 Figura 6. Gráfica de puntos por citometría de flujo para definir las poblaciones celulares……………………………………………………………………………….….22 Figura 7. Quimiotaxis de neutrófilos estimulados con diferentes concentraciones de fMLP en el sistema Transwell……………………………………………………....23 Figura 8. Efecto de las hAMSC en la quimiotaxis de neutrófilos…………….……25 Figura 9. Microfotografías representativas de quimiotaxis de neutrófilos…..….26 Índice de tablas Tabla 1. Identificación de condiciones para evaluar la quimiotaxis de neutrófilos en presencia de hAMSC…………………………………………..………………………..18 Tabla 2. Esquema representativo de las relaciones hAMSC-PMN para la evaluación de la quimiotaxis…………………………………………………………19 IV Resumen Durante un proceso inflamatorio ocurre la migración de células del sistema inmune, las primeras células en participar en este proceso son los neutrófilos, los cuales resultan de gran importancia ya que realizan tres funciones principales: liberación de sus gránulos, fagocitosis y producción de trampas extracelulares de neutrófilos (NET) entre otras funciones, todo esto con la finalidad de mediar el proceso inflamatorio. En diversas patologías, la existencia de una regulación deficiente de células inflamatorias se ha asociado a una quimiotaxis excesiva de neutrófilos, lo cual puede ocasionar daño grave en el sitio de lesión. Actualmente las células troncales, principalmente las derivadas de médula ósea, son utilizadas en terapias para regeneración de tejido, úlceras de pie diabético, úlceras corneales, entre otras. Se ha descrito que las células mesenquimales obtenidas de membrana amniótica humana (hAMSC) poseen propiedades inmunomoduladoras y antiinflamatorias, así como una capacidad de diferenciación y proliferación celular mayor a la presentada por las células troncales obtenidas de otros tejidos, además de tener baja inmunogenicidad. El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto del sobrenadante de las células mesenquimales derivadas de membrana amniótica sobre la migración celular de los neutrófilos. Las hAMSC se obtuvieron a partir de membrana amniótica que se cultivó en medio DMEMF-12, estas células presentaron una morfología fibroblastoide y fueron inmunofenotipificadas por citometría de flujo utilizando marcadores anti- CD90, CD105, CD45, CD73, CD44 y CD29. Se realizó la extracción de PMN a partir de sangre total, utilizando como método de separación la densidadde gradientes,obteniendo células con una viabilidad superior al 95%; el conteo celular se realizó con la técnicade exclusión V por azul tripano y la se inmunofenotipificación por citometría de flujoutilizando anti- CD11b y CD45. Para determinar la quimiotaxis de neutrófilos, se utilizó un sistema Transwell con presencia y ausencia de hAMSC y fMLP como quimioatrayente. Los resultados indican que las hAMSC son capaces de inhibir o presentar una disminución estadísticamente significativa ala quimiotaxis de los neutrófilos incluso con quimioatrayente en el sistema Transwell. 1 I. INTRODUCCIÓN 1. Sistema Inmune. La inmunidad es el conjunto de mecanismos por el cual el organismo es capaz de mantener la homeostasis a través del reconocimiento de lo propio y lo no propio. Para su estudio, la respuesta inmune se divide en dos: inmunidad innata y adaptativa; ambas trabajan en conjunto para mantener protegido al organismo, en general esta protección a su vez consta de reconocimiento y respuesta. La inmunidad innata posee mecanismos moleculares y celulares que son activados antes de que ocurra una infección y su finalidad es eliminar a cualquier agente extraño que logre traspasar las primeras barreras del organismo. Este tipo de inmunidad se caracteriza por su especificidad limitada, las células que participan en este proceso tienen una gran variedad de funciones ya sea efectoras, iniciadoras o de amplificación (Kindt et al., 2007; Patiño, 2009). Esta primera línea de defensa está formada por barreras mecánicas (piel, mucosas), físicas (tos, estornudos), químicas (acidez gástrica, secreciones sebáceas) y biológicas (microorganismos comensales). Si esta primera línea de defensa no es suficiente, se activan células como los neutrófilos, células cebadas, eosinófilos, células asesinas (NaturalKiller, NK) y elementos solubles como el sistema de complemento (Abbas et al., 2015; Kindt et al., 2007). 2. Neutrófilos. Los neutrófilos son células fagocíticas polimorfonucleares (PMN). Se encuentran en sangre periférica y representan entre el 50 y 70% del total de las células de la serie blanca. Son consideradas la primera línea de defensa contra infecciones bacterianas y fúngicas (Yam-Puc, et al., 2012). Estas células son producidas por medio de la hematopoyesisen la médula ósea a partir de progenitores de la serie mieloide; se requieren alrededor de 2 semanas para que los metamielocitos (estadio intermedio, cuyo núcleo posee forma de riñón) se diferencien desde una forma inmadura o en banda (núcleo alargado en forma de U), a un estadio segmentado o maduro donde presenta un núcleo con cromatina compacta (Figura 1). 2 Ya en circulación, los neutrófilos poseen una vida media aproximada de 8 horas, una vez activados por un proceso inflamatorio, la vida media de los neutrófilos aumenta asegurando la presencia de éstos en el sitio de inflamación (Kolaczkowsk et al., 2013). Dentro de todas las células del sistema inmune, los neutrófilos son las primeras células en migrar hacia un sitio inflamatorio, seguidas por los macrófagos y linfocitos (Barbieri, et al., 2005; Kindt et al., 2007). 2.1 Migración. El proceso de migración del neutrófilo es controlado por la acción de citocinas inflamatorias y quimiocinas en la superficie del endotelio vascular en sitios inflamatorios. Las citocinas son proteínas pequeñas (~25 kDa) que funcionan como “moléculas mensajeras” del sistema inmune. Pueden funcionar de manera autocrina, paracrina y endocrina. Por su parte, las quimiocinas son un subgrupo de citocinas de bajo peso molecular y patrones estructurales particulares que inducen la migración de los leucocitos hacia un gradiente de concentración químico de estas moléculas, proceso que se conoce como quimiotaxis (Doan et al., 2013; Harvey, 2013). Figura 1. Frotis de sangre periférica mostrando neutrófilo en estadio segmentado (100X). 3 Los receptores de quimiocinas expresados en neutrófilos son CXCR1 y CXCR2, entre otros, que se unen a las quimiocinas incluyendo CXCL8 (IL-8), la quimiocina más importante en la migración de neutrófilos a los tejidos (Abbas et al., 2015). Para iniciar el reclutamiento de neutrófilos hacia un tejido se requiere la acción de mediadores vasoactivos como TNF-α e IL-1 que inducen la expresión de moléculas de adhesión (ligandos de integrina y selectina) en las células endoteliales (Janeway et al., 2003) y la producción local de quimiocinas que promueven el movimiento de los leucocitos al endotelio del vaso sanguíneo y citocinas que induzcan las moléculas de adhesión necesarias (Abbas et al., 2015). Los neutrófilos y monocitos expresan distintos grupos de moléculas de adhesión y receptores de quimiocinas, lo que ocasiona la migración a diferentes sitios de inflamación o al mismo sitio de inflamación a diferentes tiempos. Los neutrófilos expresan las integrinas LFA-1 y MAC-1, las cuales al activarse, se unen a ICAM-1 endotelial (Abbas et al., 2015). Los agentes quimiotácticos que atraen a los neutrófilos al sitio de infección incluyen: 1. Factores endógenos: Fragmentos de proteína liberados cuando el complemento está activado (C5a) Factores derivados de los sistemas fibrinolíticos Productos de otros leucocitos y plaquetas Citocinas como IL-8, TNF-α, entre otros 2. Factores exógenos Productos microbianos como LPS, fMLP, otros Lípidos Dentro del proceso inflamatorio, el reclutamiento gradual de leucocitos depende por una parte de las quimiocinas presentes en el microambiente y por la expresión de moléculas de adhesión en el endotelio. Éstas incluyen las moléculas de adhesión celular (MAC) de la súper familia de inmunoglobulinas, que interactúan con las integrinas de leucocitos, mientras que las selectinas interactúan con los ligandos de carbohidratos (Kindt et al., 2007). En la mayoría de los tejidos, el proceso de inflamación involucra los siguientes pasos: reclutamiento, unión, rodamiento, adhesión, pavimentación y transmigración endotelial (Figura 2) (Kolaczkowska, 2013). El reclutamiento de neutrófilos es iniciado por cambios en la superficie del endotelio que resulta de la estimulación por mediadores inflamatorios (histamina, leucotrienos y citocinas), estos son liberados por las células cebadas y células dendríticas residentes de tejido cuando entran en contacto con sus receptores activados (Kindt et al., 2007). 4 Figura 2.Cascada de reclutamiento de neutrófilos. Existen dos métodos de transmigración: a) paracelular (entre células endoteliales) b) transcelulares (a través de las células endoteliales) Paso de un neutrófilo a través de la pared de un capilar sanguíneo (diapédesis). El proceso de migración incluye el rodamiento lento que es dependiente de la selectina; mientras que la adhesión, arrastre y migración transendotelial son dependientes de las interacciones con integrinas. Imagen obtenida y modificada de KOLACZKOWSKA, ELZBIETA (2013). Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. b a 5 El contacto de los neutrófilos con el endotelio es mediado por las selectinas. Estas glicoproteínas se encuentran en los neutrófilos (L-selectina o CD62L) y en el endotelio (E-selectina o CD62E y P-selectina o CD62P). Las selectinas de los neutrófilos se unen a los oligosacáridos presentes en las glicoproteínas de superficie de las células endoteliales, como CD34, MAdCAM-1(Molécula de adhesión celular 1-adresina), GlyCAM-1 (molécula de adhesión celular dependiente de glicosilación tipo I), Sialil Lewis X, Sialil Lewis A, CLA (antígeno cutáneo de linfocitos) y PSGL-1 (glicoproteína P-selectina ligando 1) (Muller, 2011; Muller, 2013). Durante este primer contacto la unión resulta débil; sin embargo, durante al estado inflamatorio se liberan estímulos quimiotácticos que aumentan el contacto entre células, como consecuencia los neutrófilos se unen firmemente al endotelio por las integrinas (LFA-1ó CD11a y MAC-1ó CD11b/CD18) y las moléculas de adhesión endoteliales (ICAM1 o CD54 e ICAM2 o CD102) (Kindt et al., 2007). Posteriormente, los neutrófilos atraviesan el endotelio, lo cual se conoce como diapédesis,esto es a través de las células endoteliales (paracelular) o de su citoplasma (transcelular) (Barcat, 2011; Kolaczkowska, 2013). Los receptores de reconocimiento depatrones (PRR, por sus siglas en inglés), permiten a las células de la inmunidad innata realizar el reconocimiento de microorganismos por medio de los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP, por sus siglas en inglés)o por señales de daño tisular generados por el proceso infeccioso o por patrones moleculares asociados a daño(DAMP) ocasionado por toxinas o daño mecánico sin agentes patógenos (Fainboim et al., 2013; Doan, 2013; Rojo et al., 2012). Los PRR se dividen en receptores tipo Toll (TLR), receptores “Scavenger” y opsoninas, entre otros (Doan, 2013). Los PAMP son componentes microbianos que permiten a las células de la inmunidad innata realizar un reconocimiento, dando paso al inicio de los procesos de liberación de sustancias microbicidas, citocinas y quimiocinas; están relacionados con la patogenicidad de los microorganismos (Fainboim et al., 2013). Una vez en el sitio de lesión los neutrófilos son capaces de realizar diversas funciones efectoras a través del reconocimiento por PRR. Los neutrófilos expresan PRR como el receptor tipo Toll 2 (TLR2) que permite detectar peptidoglicanos presentes de las bacterias gram positivas; TLR4 reconoce lipopolisacárido (LPS) presente en las paredes celulares de bacterias gram negativas (Kindt et al., 2007; Rabinovich, 2004). Como resultado, los microorganismos son ingeridos y degradados por las células fagocíticas (Doan,2013). Los receptores para proteínas del complemento reconocen moléculas depositadas sobre el microorganismo como consecuencia de su interacción con el sistema inmune del hospedero denominadas opsoninas. Así mismo, los neutrófilos expresan receptores para proteínas de complemento como CR1 (CD35) que reconoce a las proteínas C3b y C4b, el CR3 (CD11b/CD18) y CR4 (CD11c/CD18) 6 que reconocen fundamentalmente a C3bi. En particular las proteínas C3b se adhieren a la pared de microorganismos funcionando como opsoninas, favoreciendo la fagocitosis (Rabinovich, 2004). Una vez reconocido el microorganismo opsonizado, el neutrófilo se activa realizando la fagocitosis. La cual inicia con endocitosis de microorganismos opsonizados; posteriormente, se promueve la fusión de gránulos ricos en proteasas formando un fagolisosoma, este hecho expone el material fagocitado a dos sistemas microbicidas; uno dependiente de la producción de intermediarios de especies reactivas de oxígeno (ROS) y especies reactivas de nitrógeno (RNS) y el otro sistema que es independiente de éstas (Rabinovich, 2004). El estallido respiratorio se inicia con la activación de la enzima NADPH oxidasa responsable de la producción del anión superóxido (O2-), compuesto que constituye el sustrato para la generación de las ROS entre ellos el peróxido de hidrógeno (H2O2) y ácido hipocloroso (HClO) (Kindt, 2008). Los neutrófilos son capaces de mediar funciones para controlar una infección a travésde la generación de trampas extracelulares (NET), las cuales están formadas por fibras extracelulares compuestas de material nuclear (cromatina) y proteínas de los gránulos de los neutrófilos como elastasa, catepsina G, MPO (mieloperoxidasa), lactoferrina, gelatinasa y lisozima; además de fibras de DNA e histonas (Patiño, 2009; Falcão et al., 2015). Estas trampas son liberadas en respuesta a diversos agentes biológicos como bacterias, hongos y parásitos; actúan como una red de contención de la infección atrapando a los microorganismos al mismo tiempo que median su destrucción gracias a su capacidad de mantener una concentración local alta de sustancias antimicrobianas (Figura 3). La liberación de NET está asociada a una forma de muerte celular distinta de la apoptosis y la necrosis, a la cual se denomina NETosis. Esta es una forma activa de muerte celular, ya que existe liberación de cromatina descondensada al espacio extracelular (Amulic et al., 2012). El núcleo pierde su forma multilobulada, la eucromatina y la heterocromatina se homogenizan, la envoltura nuclear y las membranas granulares se desintegran y el material nuclear entra en contacto directo con los componentes de los gránulos. Finalmente, la membrana celular se rompe y las NET son liberadas. En esta red, las proteasas granulares asociadas y las propias histonas ejecutan funciones microbicidas en un radio de acción limitado por la cromatina liberada, que reduciría el daño a los tejidos circundantes.En la formación de NET como respuesta a estímulos químicos y biológicos se requiere NADPH oxidasa y MPO que generan especies reactivas de oxígeno (Gabelloni et al., 2013) 7 Las NET resultan benéficas para el organismo, ya que su liberación permite actuar como barrera física para evitar una diseminación de microorganismos patógenos, así como una concentración de sustancias antimicrobianas lo que facilita su eliminación. Se sabe que la endonucleasa sérica DNAsa 1 se encarga del degradación de las NET para evitar el daño o destrucción tisular que podría ocasionar la acumulación de los componentes de los gránulos de los neutrófilos, además de la función de limpieza que realizan los macrófagos (Yam-Puc et al., 2012). Recientemente, la liberación de NET se ha relacionado a la etiopatogenia de diversas enfermedades autoinmunológicas como: lupus eritematoso sistémico (LES), vasculitis-ANCA positivas, ateroesclerosis, artritis reumatoide, psoriasis, trombosis y gota. Por loque se ha demostrado que las NET están involucradas en el desarrollo de procesos inflamatorios crónicos (Munir et al., 2015). Para que se produzca una adecuada reparación tisular es necesaria la inflamación, ya que ésta es una consecuencia de cualquier lesión tisular (Kelley, 1993). En la inflamación aguda, el número de neutrófilos en untejido puede encontrarse alto debido a su llegada desde el torrente sanguíneo. Por lo tanto, la Figura 3.Trampas extracelulares de neutrófilos (NET). Fotografía de inmunofluorescencia que muestra NET en un modelo in vitro con tinción para DNA (DAPI-azul) y anti-elastasa (verde). Cortesía de Magaña Guerrero, Fátima Sofía, 2013. 8 capacidad de daño tisular por liberación de radicales de oxígeno y enzimas proteolíticas producidos por PMN será muy alta. Estos radicales (superóxido, peróxido de hidrógeno y ácido hipocloroso) al acumularse en exceso en un mismo sitio provocan daño en moléculas como proteínas, lípidos, carbohidratos y ácidos nucleicos (Barbieri et al., 2005). Una vez que el neutrófilo ha cumplido su función, muere por apoptosis (muerte celular programada) y es eliminado por macrófagos para evitar la posible liberación de su contenido citotóxico al medio extracelular, hecho que podría ocurrir en caso de muerte por necrosis. La apoptosis es un mecanismo de regulación que mantiene el número apropiado de células en el organismo (Barbieri et al., 2005). Existen diversas moléculas inflamatorias que retrasan la apoptosis de neutrófilos (Kelley, 1993),estudios han demostrado la influencia de LPS, C5a, fMLP, ATP, LTB4, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-15, IFN-γ en el retraso de la apoptosis del neutrófilo (Barbieri et al., 2005); esto provoca un aumento de PMN presentes en el sitio inflamatorio y la probabilidad de destrucción de estas células aumenta y con ello, la liberación de sus productos tóxicos al espacio extracelular lo que origina daño tisular (Kelley, 1993). Una desregulación del mecanismo de apoptosis está asociado a la aparición de diferentes enfermedades inflamatorias, tanto agudas como crónicas y parece estar mediado por el aumento en la producción de factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) (Barbieri et al., 2005). Condiciones autoinmunes y vasculitis, se encuentran asociados a la producción de anticuerpos citoplasmáticos anti-neutrófilos (ANCAs), los cuales están dirigidos contra algunos componentes de las NET, por ejemplo, MPO, PR3 y la elastasa de neutrófilos. Algunos tipos de cáncer (leucemia mieloide crónica y carcinomas mamarios tipo sólido) predisponen a los neutrófilos a liberar NET que contribuyen a la trombosis, por lo tanto, los neutrófilos actúan contra el propio organismo (Niknejad et al., 2013). 3. Células troncales mesenquimales. Las células mesenquimales son células indiferenciadas con un potencial proliferativo elevado, morfología fibroblastoide y poseen dos características fundamentales: autorrenovación y la generación de uno o más tipos celulares capaces de desempeñar funciones especializadas en un organismo. A su vez, poseen propiedades inmunomoduladoras y antiinflamatorias, regulando las respuestas innata y adaptativa (Macías et al., 2010; Macías et al., 2011). 9 La Sociedad Internacional de Terapia Celular o ISCT (International Society for Cellular Therapy) propuso tres criterios para definir las células troncales mesenquimales (MSC); primero que éstas células tengan la capacidad de adherirse al plástico en cultivo; segundo que expresen marcadores como CD73, CD90 y CD105 y la ausencia de marcadores hematopoyéticos como CD34, CD45, marcadores de monocitos, macrófagos y linfocitos B; y tercero, las MSC deben ser capaces de diferenciarse in vitro en osteoblastos, adipocitos y condrocitos bajo condiciones estándar de cultivo (Macías, 2014). En los últimos años el interés por el uso deMSC ha ido en aumento a raíz de su identificación, caracterización y aislamiento; así como el estudio de su posible uso como terapia alternativa de innumerables enfermedades (neurodegenerativas, cardíacas, endocrinológicas, oftalmológicas, etc) debido a su capacidad de diferenciación celular (Prosperet al., 2006). Se ha demostrado en un sistema in vitro que las MSC son capaces de migrar hacia proteínas de complemento, factores de crecimiento, citocinas y quimiocinas, IL-1β, TNF-α y quimiocina derivada de macrófagos. Se ha propuesto que la migración de las MSC a los sitios de inflamación puede determinar su función, ya sea en la eliminación de patógenos o la supresión de la inflamación (English, 2013). Las MSC poseen una importante capacidad inmunomoduladora, se ha demostrado que no permiten el reconocimiento de antígenos ya que interfieren con la función de las células dendríticas y linfocitos T al secretar citocinas, esta actividad se aumenta cuando se encuentran en un medio inflamatorio con altos niveles de interferón gamma (IFNγ). Inducen inmunosupresión de linfocitos T circulantes a través de la acción de TGF-beta (Garfias, 2012) y no expresan antígenos del sistema principal de histocompatibilidad de clase II (MHC II), ni moléculas co-estimuladoras CD40, CD40L, CD80, CD86 con esto reducen o inhiben las reacciones inmunes inducidas o en la tolerancia a injertos. Además, inducen el desarrollo de células T reguladoras (Treg) y disminuyen la actividad lítica de las células citotóxicas naturales (NK) y linfocitos citotóxicos (Socarrás et al., 2013). 3.1 Células mesenquimales de membrana amniótica (hAMSC). Las células mesenquimales de membrana amniótica son células que se obtienen a partir de la digestión enzimática de membrana amniótica (AM). Estas células no presentan las moléculas clásicas (A, B y C) y presentan las moléculas no clásicas (E, F y G) de clase I de HLA lo que les confiere no inmunogenicidad, posee propiedades inmunosupresoras (supresión directa de linfocitos T y B), inmunomoduladoras, antiinflamatorias y antifibróticas; las células derivadas del amnios inhiben el crecimiento tumoral e invasión por tres vías: inducción de 10 apoptosis, detención de ciclo celular e inhibición de angiogénesis (Niknejad et al., 2015). Las hAMSC inducen la apoptosis de linfocitos B y T a través de la secreción de factores solubles incluyendo factor de necrosis tumoral ∝ (TNF-∝), Fas ligando (FasL), ligando inductor de apoptosis de ligando TNF (TRAIL), factor transformante de crecimiento β (TGF-β) y factor inhibitorio de migración de macrófagos (MIF) (Niknejad et al, 2013). Algunos estudios demuestran que las hAMSC inhiben los reguladores positivos del ciclo celular incluyendo las ciclinas, cinasas dependientes de ciclinas, antígeno nuclear de células de proliferación (PCNA), proteínas de mantenimiento del minicromosoma. Las hAMSC secretan trombospondina, IL-10, IL-1, colágeno XVIII, endostatina, factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) lo cual les confiere propiedades antiangiogénicas (Niknejad et al, 2013). 3.2 Trasplante de poblaciones de células troncales. Las propiedades de las MSC favorecen el trasplante de poblaciones autólogas, es decir, el receptor es también el donador; singénicas, el donador es idéntico desde el punto de vista genético; o alogénicas, en donde el donador y el receptor no son idénticos a nivel genético, pero son de la misma especie. Las propiedades parácrinas de las MSC permiten la regulación del microambiente con la finalidad de proteger, promover la sobrevivencia y activar los mecanismos endógenos de reparación celular secretando factores neurotrópicos y factores promotores de crecimiento y de sobrevivencia (Kin et al., 2014). A su vez las MSC poseen características inmunosupresivas e inhibitorias de citocinas proinflamatorias; por lo cual los trasplantes de MSC autólogos, singénicos y alogénicos son idóneos ya que no requieren inmunosupresión farmacológica o alguna modificación genética. De acuerdo a da Silva et al., los efectos tróficos de las MSC se pueden dividir en anti-apoptóticos, de apoyo (estimulación de mitosis, proliferación y diferenciación) y angiogénicos (da Silva et al., 2009). En particular, las hAMSC resultan de gran interés científico debido a las propiedades antes descritas y las características que le confieren al medio en el que se encuentran resultando útiles en diversos tratamientos. En diversas enfermedades se han visto mejorías al ser tratadas con hAMSC. 11 II. Antecedentes En la actualidad el trasplante de hAMSC es utilizado en diversas enfermedades como quemaduras, úlceras corneales, úlceras en pie diabético y regeneración de tejidos debido a las propiedades antiangiogénicas, inmunomoduladoras y antiinflamatorias que poseen, aunado a que no expresan moléculas clásicas del HLA, por lo tanto presentan una baja inmunogenicidad convirtiéndolas en una terapia alterna para estos padecimientos. Murphy y colaboradores demostraron en un modelo murino que al administrar células epiteliales de amnios humano (hAEC) en lesiones de fibrosis pulmonar existe una reducción de factores como TNF-α, TNF-β, INF-γ e IL-6, por lo tanto se disminuye la fibrosis pulmonar y a su vez el infiltrado de células inflamatorias siendo consideradas como una posible terapia en enfermedades con un componente de fibrosis (Murphy et al., 2011). En el estudio planteado por Ke y colaboradores utilizan una inyección subconjuntival de MSC en conjunto con hidrogel de polisacárido en quemaduras por alcali en córnea de ratas,se observó una recuperación del epitelio corneal, reducción de inflamación y de neovascularización, demostrando que las MSC son un tratamiento efectivo en este tipo de quemaduras (Ke et al., 2015). En la Unidad de Investigación del Instituto de Oftalmología Conde de Valenciana ha sido posible aislar a partir de células mesenquimales de membrana amniótica (hAMSC). Se sabe que presentan las características descritas para las MSC, sin embargo se desconocen ciertos mecanismos que permiten su función inmunosupresora. Por ello, en nuestro grupo de trabajo, se ha demostrado que la inyección de hAMSC en la cámara anterior en un modelo de quemadura corneal murino, disminuye el infiltrado inflamatorio en el sitio de lesión. Por otra parte, en humano y en ratón se ha observado que el sobrenadante de las células mesenquimales obtenidas de la membrana amniótica humana provoca una disminución de la liberación de NET (manuscrito en preparación). Además, se ha observado que el sobrenadante de estas células disminuye la proliferación de queratocitos influyendo en el proceso de reparación corneal, inhibiendo el proceso de fibrosis en la córnea (manuscrito en preparación). De acuerdo a lo descrito por Chávez y colaboradores en México, de 2007 a 2014 los trasplantes de membrana amniótica fueron utilizados principalmente en enfermedades como pterigion, úlcera corneal y reparación de superficie conjuntival sin evidencia de rechazo al trasplante (Chávez et al., 2015). Estos antecedentes nos permiten sugerir que las células mesenquimales derivadas de membrana amniótica pueden tener un mecanismo sobre la quimiotaxis de los neutrófilos en el sitio de lesión debido a sus propiedades. 12 III. Planteamiento del problema Las MSC son células que se han utilizado en los últimos años para terapias regenerativas debido a sus propiedades inmunomoduladoras, antiinflamatorias y su baja inmunogenicidad. Existen estudios donde se demuestra que son capaces de disminuir el infiltrado de células inflamatorias, la neovascularización, la regeneración de tejido dañado, la disminución de la liberación de NET y la proliferación de células mononuclares. Sin embargo, se desconoce el funcionamiento de las hAMSC sobre la quimiotaxis de los neutrófilos al sitio de lesión. IV. Pregunta de investigación ¿El sobrenadantede células mesenquimales derivadas de membrana amniótica humana tiene algún efecto en la quimiotaxis de los neutrófilos? V. Hipótesis El sobrenadante de las células mesenquimales obtenidas de membrana amniótica inhibe la quimiotaxis de neutrófilos. 13 VI. Objetivo General Determinar el efecto del sobrenadante de las células mesenquimales derivadas de membrana amniótica sobre la migración celular de los neutrófilos por método de Transwell. Objetivos específicos 1. Obtener, cultivar y caracterizar células mesenquimales de membrana amniótica por citometría de flujo. 2. Obtener y caracterizar neutrófilos humanos por citometría de flujo. 3. Evaluar la migración de neutrófilos con quimioatrayente y con el sobrenadante de hAMSC por método de Transwell. 14 VII. MATERIALES Y MÉTODOS Obtención de hAMSCs. La membrana amniótica (MA) o amnios se obtuvo de mujeres donantes sanas, que firmaron un consentimiento informado, cuyo embarazo transcurrió sin complicaciones y sin trabajo de parto para evitar la activación de metaloproteasas. La membrana amniótica seseparó del corión de manera mecánica y se cortó en fragmentos de 3x3 cm, se añadieron 7 mL de tripsina/PBS/EDTA al 0.05%y se agitó por 30 segundos, seguidamente los fragmentos de MA se transfirieron con ayuda de pinzas a dos tubos nuevos de 50 mLy a cada tubo se le añadió 7 mL de tripsina/PBS/EDTA al 0.05%, se agitó por 30 segundos y se incubó a 37°C por 10 minutos en baño con agitación para eliminar restos de sangre o células contaminantes. Después de esta incubación, la tripsina se eliminó y los fragmentos se transfirieron a tubos nuevos de 50 mL y a cada tubo se le añadieron 12 mL de la solución de tripsina/PBS/EDTA al 0.05% y se incubó por 40 minutos a 37°C en baño María con agitación. El producto de digestión de la tripsina se desechó y se repitió el paso dos veces más. Posterior al tratamiento con tripsina, los fragmentos de MA se observaron al microscopio para evaluar la ausencia de células epiteliales. El aislamiento de células troncales mesenquimales derivadas de membrana amniótica (hAMSCs) se realizó a partir de estos fragmentos. Los fragmentos de MA tratados con tripsina se cortaron en segmentos más pequeños y se le realizó otra digestión con 12 mL de colagenasa II. Los fragmentos se homogeneizaronpor pipeteo evitando la formación de burbujas y se incubaron a 37°C por 90 minutos, cada 10 minutos se agitaron en vortex a mínima potencia. Después de la incubación, se neutralizó la colagenasa II con medio de cultivo DMEMF-12 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 10%, 1% Penicilina-Estreptomicina y 1% L-Glutamina. La mezcla se filtró a través de una malla para retirar los fragmentos sobrantes de tejido yse centrifugó a 500 x g por 5 minutos a 4°C. El sobrenadante se recuperó y fue nuevamente centrifugado, los botones celulares obtenidos en cada centrifugación fueron homogeneizados en 1 mL de medio de cultivo. Las células se sembraron en cajas de cultivo de 75 cm2en medio DMEMF- 12 suplementado y se mantuvieron en incubación a 37°C y 5% de CO2.Cada dos días aproximadamente se renovó el medio de las células adheridas y cuando el cultivo celular alcanzó una confluencia de 85-90% se despegaron y se cambiaron de caja para la realización de sub-cultivos (pases). 15 Caracterización de hAMSC. La fenotipificación de los cultivos celulares se realizó por citometría de flujo, basada en la expresión de marcadores específicos de MSC: CD29, CD44, CD73, CD105, CD90 y CD45. Se cultivaron las células del pase 3 al 6 hasta alcanzar el 90% de confluencia, se observaron en microscopio invertido y una vez alcanzada la confluencia se desechó el medio y se lavó con 3 mL de PBS dos veces y se añadieron 3 mL Tripsina/PBS/EDTA al 0.25% estéril y se retiró. Se añadieron 5 mL de Tripsina/PBS/EDTA al 0.25% estéril a la caja de cultivo de las hAMSC, e incubaron a 37°C por 5 minutos. Las células se observaron al microscopio para verificar que ya no se encontraran adheridas a la caja de cultivo y si era así, la reacción se detuvocon 5 mL de medio DMEMF-12 y todo el volumen se colocó en tubo de 15 mL. Se agregaron 2-3 mL más de medio DMEMF-12 a la caja de cultivo y este medio se recolectó en el mismo tubo. Una vez colectadas las células en el tubo, se centrifugó a 183 x g por 5 minutos a 4°C con rampa y se desechó el sobrenadante. El botón celular se resuspendió en 1000 µL de PBS y se contaron las hAMSC utilizando la técnica de exclusión de azul de tripano en cámara de Neubauer. Se colocaron 1x104 células por tubo para la caracterización por citometría (3 tubos). A cada tubo se le añadió 200 µL de PFA (paraformaldehído) al 4% para fijar estas células y se incubó por 10 minutos. Después de la incubación se añadieron 2 mL de PBS y se centrifugó a 183 x g por 5 minutos a 4°C con rampa. El sobrenadante se desecha y a los botones celulares se añaden los anticuerpos para la caracterización, según las siguientes especificaciones. Tubo 1: 5 µL CD90-FITC 5 µL CD105-PE 5 µL CD45-PECy7 Tubo 2: 5 µL CD73-PE 5 µLCD44-PerCP 5 µL CD29-FITC Tubo 3: 200 µL PBS, sin anticuerpos y este es el control de autoflorescencia (CAF) de hAMSC. Se incubó durante 30 minutos en oscuridad a temperatura ambiente, posteriormente se añaden 500 µL de PBS y se centrifugó a 183 x g por 5 minutos a 4°C con rampa, el sobrenadante se desecha y se repitió una vez más para un total de dos lavados. Una vez realizados los lavados se añadieron 200 µL de PBS 16 para resuspender las células. El número de células marcadas con los anticuerpos específicos se cuantificaron por citometría de flujo en un citómetro FACS Verse® y adquiriendo 10,000 eventos. Los datos fueron analizados con el programa FlowJo. Extracción de neutrófilos. Los neutrófilos fueron obtenidos de sangre periférica de donantes sanos, mediante gradiente de densidad. Se obtuvo sangre periférica en un tubo de 4 mL con EDTA. La sangre completa se colocó en un tubo de 15 mL sobre Pmmp (Polymorphprep) en relación 1:1 cuidando de no hacer turbulencias. Se centrifugó a 500 xg por 35 min a 20°C sin rampa y sin freno, para mantener el gradiente. Se tomó la fracción de células PMN colocándola en un tubo nuevo de 15 mL y se añadió un volumen igual de PBS, se resuspendieron las células y se centrifugó a 400 x g por 10 minutos a 4°C con rampa, se eliminó el sobrenadante. Para eliminar los eritrocitos del botón celular se adicionó 3 mL de buffer de lisis (155 mM NH4Cl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM NaHCO3) por 5 minutos, se agregó 1 mL de PBS para lavar y se realizó una centrifugación a 400 x g por 10 minutos a 4°C con rampa. El sobrenadante se desecha y el botón celular se trata según la técnica a seguir. Conteo celular. La cuantificación tanto de las hAMSC como de los neutrófilos se realizó con la técnica de exclusión de azul tripano. Las células fueron resuspendidas en 1 mL de PBS, y de estas se tomaron 10 µL y se agregaron 90 µL de azul de tripano en un tubo de 0.2 mL. Se colocaron 20 µL de la mezcla anterior en la cámara de Neubauer y se contó el número de células en un microscopio con un objetivo de 10X. Se utilizó la siguiente fórmula para obtener el total de células obtenidas en 1000 µL de medio o PBS. (Total de cél. obtenidas)4 × 10 × 10,000 = Número total de células por mL. Determinación de pureza de neutrófilos. Los neutrófilos extraídos (500 µL) se fijaron con 2 mL de PFA al 4% por 5 minutos a 4°C, seguidamentese agregó 2 mL de PBS para lavar y se centrifugaron a 400 xg por 10 minutos a 4°C con rampa. 17 Se desechó el sobrenadante y el botón se resuspendió en PBS/FACSFlow para la cuantificación en el citómetro de flujo (FACSVerse®). Se verificó que en la población obtenida de células se encontraban los PMN alcomparar con una población de sangre total. Se determinó la pureza de la población obtenida con ayuda del programa FlowJo. Caracterización de neutrófilos. Se colocaron 100x103 neutrófilos en un tubo para citometría. Se centrifugaron a 400 x g por 5 minutos a 4°C con rampa y se desechó el sobrenadante. Al botón celular se añadió 1 µL CD11b-PE + 5 µL CD45-PerCP y se incubó durante 30 minutos en oscuridad a temperatura ambiente, trascurrido este tiempo se agregó 500 μL de PBS y se centrifugó a 400 x g por 5 minutos a 4°C con rampa, el sobrenadante se desecha y al botón se le agregó 200 µL PBS. Se analizó la población de neutrófilos en un citómetro FACS Verse® y adquiriendo 10,000 eventos. Migración de neutrófilos en Transwell. Se realizó la extracción de neutrófilos con Pmmp a partir de sangre total y se verificó la viabilidad y se cuantificaron por medio de la técnica de exclusión de azul tripano en una cámara de Neubauer. Se añadieron 5 x 104 neutrófilosresuspendidos en 80 μL de Buffer A (SFB (2%), HEPES (10 mM), HBSS+/+) a la cámara superior del Transwell y en la cámara inferior se colocaron 200 μL de Buffer A con fMLP 12.5 nM, se incubaron a 37°C por 3 horas. Una vez transcurrido el tiempo, se retiró el sobrenadante de ambas cámaras. Se limpió la parte interna de la cámara superior con un isopo estéril y los neutrófilos se fijaroncon PFA al 4% por 5 minutos,colocando 80 µL en la cámara superior y 200 μL en la cámara inferior; al terminar el tiempo sedesechó el PFA y se agregó 80 µL y 200 μL de PBS en la cámara superior e inferior para eliminar los restos de PFA y este procedimiento se realizó una vez más. Se retiraron las membranas con ayuda de una pinza pequeña; se limpió la pinza entre cada extracción de membranas con alcohol. Se colocaron las membranas en portaobjetos, y se agregaron 10 µL de DAPI/PBS 1:3 y 10 µL de PBS 1X por membrana. Después se colocaron los cubreobjetos cuidando de no dejar burbujas y sellando con esmalte de uñas el contorno del cubreobjetos. 18 Quimiotaxis de neutrófilos en contacto con hAMSC en Transwell. Teniendo una confluencia celular del 90% de hAMSC de un cultivo de pase 3 a 6, las células adheridas a la caja de cultivo se trataron con tripsina para recolectarlas y se realizó un conteo celular. Se colocaron 5000, 1000 o 500 hAMSC en pozos diferentes de una caja de cultivo de 96 pozos para obtener las relaciones hAMSC-neutrófilos 1:10, 1:50 y 1:100 respectivamente. Las células se dejaron adherir al pozo de la caja de cultivo por 16 hrs en medio DMEMF-12 con SFB al 10% a 37°C y 5% de CO2. Después de las 16 hrs se retiró el medio de las células y se añadió 200 μL del tratamiento correspondiente (tabla 1 y tabla 2). Posteriormente se colocaron en la cámara superior del Transwell 5 x 104 neutrófilos resuspendidos en 80 μL DMEMF-12 sin SFB. Este sistema se incubó por 3 hrs a 37°C y 5% de CO2. Tratamiento A hAMSC hAMSC en DMEMF-12 sin SFB B hAMSC/fMLP hAMSC + fMLP 12.5 μM en DMEMF-12 sin SFB C Control + fMLP 12.5 μM en DMEMF-12 sin SFB D Control - DMEMF-12 sin SFB Tabla 1. Identificación de condiciones para evaluar la quimiotaxis de neutrófilos en presencia de hAMSC. Una vez trascurrido el tiempo de incubación, se retiró el sobrenadante de ambas cámaras y la parte interna de la cámara superior se limpió con un isopo estéril y los neutrófilos se fijaron con PFA al 4% por 5 minutos, colocando 80 μL en la cámara superior y 200 μL en la cámara inferior; al terminar el tiempo se desechó el PFA y se agregaron 80 μL y 200 μL de PBS en la cámara superior e inferior para eliminar los restos de PFA y etse procedimiento se realizó una vez más. Se colocó 5 μL de yoduro de propidio (0.25 mg/mL) sobre la membrana del Transwell por 3 minutos. Se lavó con 5 μL de PBS dos veces. Con ayuda de pinzas limpias se retiró la membrana del Transwell. Se colocó la membrana en un portaobjetos y se añadió glicerina/PBS (1:1), se colocó un cubreobjetos y con esmalte se fijaron las orillas para evitar que se secaran las membranas. Se observaron con microscopio Apotome® de fluorescencia. 19 Tabla 2. Esquema representativo de las relaciones hAMSC-PMN para la evaluación de la quimiotaxis. Análisis por microscopia de fluorescencia. Las membranas una vez teñidas con yoduro de propidio se observaron en microscopio de fluorescencia con un objetivo de 10X. La migración de los neutrófilos fue determinada como el área total de fluorescencia, considerando sólo aquellas mayores de 12 μm. Se calculó la media y SEM (error estándar de la media). Se usó el programa Graph Prism® para analizar los datos obtenidos para la comparación entre dos grupos independientes con la prueba de t de Student considerando una p<0.05 como estadísticamente significativa. hAMSC + PMN 1:10 hAMSC + PMN 1:50 hAMSC + PMN 1:100 Controles Sin hAMSC PMN fMLP sin fMLP fMLP sin fMLP fMLP sin fMLP fMLP sin fMLP 20 VIII. RESULTADOS Las hAMSC aisladas de membrana amniótica humana presentaron una morfología fibroblastoide, fueron adherentes al plástico de cultivo (Figura 4). La caracterización molecular por citometría de flujo indicó la expresión de los marcadores CD29, CD73, CD90, CD44, CD105 y la ausencia del marcador CD45 al comparar con los controles de autofluorescencia (Figura 5). Para todas las determinaciones (caracterización, conteo celular y ensayo de migración) se tomaron células con una confluencia del 90%. Figura 4.Microfotografía de células hAMSC. Morfología fibroblastoide de hAMSC al día 5 de cultivo y confluencia de 90%. La cantidad de las células en las diferentes poblaciones celulares fue determinada por citometría de flujo. Las poblaciones fueron separadas de acuerdo al tamaño y la complejidad interna. En sangre total el porcentaje de PMN fue de 67.4% y cuando fueron separadas las poblaciones por gradiente de densidad se observó un 95.0% de PMN en la muestra purificada (Figura 6, A). Se realizó la determinación de los marcadores celulares CD11b y CD45; en la muestra de sangre total el resultado fue positivo 69.1% para ambos marcadores, en la muestra de PMN aislados resultó positiva para los marcadores con un 98.2% obteniendo un mayor porcentaje de positividad con respecto al control de autofluorescencia (CAF) (Figura 6, B). 21 Figura 5.Caracterización fenotípica de hAMSC por citometría de flujo. Histogramas de expresión positiva o negativa de marcadores CD29, CD90, CD105, CD73, CD45 y CD44 (blanco) y control de autofluorescencia de hAMSC (gris). Control de autofluorescencia Fluorescencia de marcadores + + + + + ‐ 22 Figura 6.Gráficas de puntos por citometría de flujo para definir las poblaciones celulares. A) Identificación de las poblaciones celulares por tamaño y complejidad en sangre total (a) y aisladas por gradiente de densidad para determinar la población de PMN (b). B) Gráfica de puntos por citometría de flujo de la expresión positiva de los marcadores CD11b y CD45 en el control de autofluorescencia (CAF) (a) en sangre total (b) y neutrófilos aislados (c). ST PMN PMNSTCAF A) B) a) b) c) b) a) 23 El análisis del efecto del quimioatrayente (fMLP) sobre la migración de los neutrófilos se realizó utilizando 50,000 células por pozo en el sistema Transwell y con 3 hrs de estímulo. Los resultados indicaron que al utilizar una concentración de 12.5 μM de fMLP, el área de fluorescencia es 135.62 veces mayor que sin estímulo; al disminuir la concentración (6.25 µM) de fMLP esta área disminuye no significativamente, lo mismo ocurre al aumentar la concentración de fMLP (25 y 50 µM) ya que el área de fluorescencia aumenta significativamente (*=p<0.05) pero resulta menor que la fluorescencia observadaen la concentración de 12.5 µM. En concentración 100 µM aumenta no significativamente la fluorescencia observada en comparación con el control sin estímulo. Estos resultados indicaron de manera indirecta que a la concentración de 12.5 μM de fMLP la mayoría de los neutrófilos son estimulados para migrar hacia el quimioatrayente (Figura 7). Figura 7. Quimiotaxis de neutrófilos estimulados con diferentes concentraciones de fMLP en el sistema Transwell. Medición del área de fluorescencia de los neutrófilos teñidos con yoduro de propidio y observado en microscopio de fluorescencia (objetivo 63X). n=3 *=p<0.05. SE 6. 25 12 .5 25 50 10 0 0 100000 200000 300000 400000 500000 * * * Concentración de fMLP (M) F lu o re sc en ci a p o r ca m p o 24 El efecto del sobrenadante de las células mesenquimales de membrana amniótica sobre la quimiotaxis de neutrófilos se evaluó colocando las hAMSC en la cámara inferior del sistema Transwell y los neutrófilos en la parte superior sin estar en contacto con las células y usando como control positivo el estímulo de fMLP, también se analizó el efecto del sobrenadante de las hAMSC en presencia de fMLP. Las relaciones neutrófilos-hAMSC utilizadas fueron 1:10, 1:50 y 1:100. Al estar las hAMSC en relación 1:10 con los neutrófilos, se observó que la sola presencia de las células no disminuye significativamente (*=p<0.05) el área de fluorescencia con respecto al control negativo, sin embargo cuando se adiciona fMLP al sistema se observa una disminución significativa, es decir que en la relación 1:10 el sobrenadante de las células mesenquimales inhibe la migración de los neutrófilos. En la relación 1:50 de hAMSC-neutrófilos no hay disminución significativa de la quimiotaxis de neutrófilos por efecto de las hAMSC aún y cuando se agregó fMLP al sistema. Lo que nos indica que a esta concentración el sobrenadante de las hAMSC no es capaz de inhibir la quimiotaxis de neutrófilos. Cuando las hAMSC se encuentran en relación 1:100 al no tener presencia de quimioatrayente en el medio hay una disminución significativa del área de fluorescencia al igual que al encontrarse en contacto con el fMLP (*=p<0.05). Es visible la inhibición de la quimiotaxis de neutrófilos al estar en contacto con el fMLP, ya que disminuye 5.44 veces, y al no estar en contacto con el quimioatrayente el área de fluorescencia visible disminuye 0.04 veces. Por lo tanto, en la relación 1:100 si existe la inhibición de la quimiotaxis de neutrófilos mediada por el sobrenadante de hAMSC cuando no existe presencia de fMLP en el sistema. Al disminuir el número de células por neutrófilos (1:100) el sobrenadante de éstas no disminuye significativamente la migración de neutrófilos, pero disminuye 5.44 veces la quimiotaxis. Al estimular los neutrófilos con fMLP se observa migración de los mismos y cuando se agregan hAMSC, hay una disminución de la quimiotaxis estadísticamente significativa (*p=<0.05) (Figura 8). Las microfotografías representativas de las membranas de los sistemas Transwell nos permiten realizar la comparación entre las diferentes concentraciones de hAMSC sin fMLP y nuestros controles sin hAMSC (con presencia y ausencia de fMLP); lo que indica que si existe la inhibición de la migración de neutrófilos y estose comprueba en la concentración 1:100 hAMSC- neutrófilos al no presentar fluorescencia (Figura 9). 25 0 10000 20000 30000 40000 fMLP hAMSC + - ++ - - - + * 1:10 Á re a d e fl u o re sc en ci a p o r ca m p o 0 10000 20000 30000 40000 fMLP hAMSC + - + ++ - - - 1:50 Á re a d e fl u o re sc en ci a p o r ca m p o 0 10000 20000 30000 40000 * fMLP hAMSC + - - + ++ - - 1:100 Á re a d e fl u o re sc en ci a p o r ca m p o 0 10000 20000 30000 40000 1:100 1:50 1:10 hAMSC fMLP ++ +- ++ ++ + + + - - - -- - - - - * * Á re a d e fl u o re sc en ci a p o r ca m p o 0 5000 10000 15000 -- - - - - - + - - -- - - + - - + - -1:100 1:50 1:10 hAMSC fMLP Á re a d e fl u o re sc en ci a p o r ca m p o Figura 8.Efecto de las hAMSC en la quimiotaxis de neutrófilos. Utilizando diferentes relaciones de hAMSC-neutrófilos: a) 1:10, b) 1:50, c) 1:100, comparación de las concentraciones de hAMSC, con (e) y sin (d) fMLP (12.5 µM) en un sistema Transwell. Medición del área de fluorescencia de los neutrófilos teñidos con yoduro de propidio y observado en microscopio de fluorescencia (objetivo 63X). n=3 *=p<0.05. n=3 *=p<0.05 a) e) d) c) b) 26 Figura 9.Microfotografías representativas de quimiotaxis de neutrófilos. Efecto de las hAMSC en la migración de los neutrófilos en un sistema Transwell. Estímulo con fMLP (12.5 µM) por 3 horas en presencia de hAMSC. Controles positivo (C+) y negativo(C-) sin hAMSC. n=3 C- sin fMLP sin hAMSC C+ fMLP sin hAMSC 1:10 fMLP hAMSC 1:50 fMLP hAMSC 1:100 fMLP hAMSC 27 IX. DISCUSIÓN El presente estudio demostró que las hAMSC son capaces de inhibir la quimiotaxis de neutrófilos incluso en presencia de un quimioatrayente como fMLP. Con base en nuestros resultados podemos inferir que las hAMSC podrían secretan algunos factores solubles que poseen un efecto inmunomodulador hacia células de inmunidad innata como los neutrófilos. Las células que se aislaron de la membrana amniótica fueron positivas a la expresión de los marcadores CD29, CD73, CD90, CD105 y CD44, los cuales participan en procesos de adhesión celular y son compatibles con lo descrito acerca de células troncales y la ausencia de expresión del marcador CD45, lo cual nos permite demostrar que no se encuentran diferenciadas a un linaje hematopoyético. Con base en lo analizado por Insausti y colaboradores nosotros corroboramos que los resultados obtenidos presentan similitudes en cuanto a los marcadores fenotípicos que se analizaron de las células mesenquimales obtenidas de membrana amniótica. Así mismo, demostramos que las hAMSC obtenidas en los cultivos poseen los criterios de definición propuestos por la Sociedad Internacional de Terapia Celular, es decir, las hAMSC se adherían al plástico en las cajas de cultivo y presentaban la morfología característica fibroblastoide (Insausti, et al. 2014; Yen et al., 2005). En trabajos previos se demostró que utilizar células obtenidas de membrana amniótica posee una ventaja sobre lo descrito de las MSC obtenidas de otros tejidos, ya que no presenta contaminación con células no fibroblastoides. Además, comparadas con células derivadas de tejidos adultos poseen mayor proliferación y capacidad de diferenciación (Bieback et al., 2004; Erices et al., 2000; Yen et al., 2005). En un estudio realizado en 2014 por nuestro grupo de trabajo, se analizaron estos datos confirmando lo citado por los autores y por esta razón decidimos utilizar hAMSC en nuestros ensayos. Los neutrófilos son células capaces de migrar y realizar diapédesis hacia los sitios de lesión o inflamación a través de una señalización adecuada. En diversas enfermedades oftalmológicas, autoinmunes e inflamatorias se ha reportado que la presencia de neutrófilos con una deficiente depuración resultaen daño al tejido, lo que provoca una respuesta inflamatoria persistente. Chen y colaboradores describen que fMLP y LPS actúan de manera sinérgica activando a los leucocitos (Chen 2009). A su vez, existen diversos estudios en los que se demuestra que el LPS y fMLP incrementan la liberación de citocinas, dando paso a la migración de neutrófilos hacia los sitios de inflamación (Guirra et al., 2015). Por lo que se demostró en este estudio que el fMLP (12.5 µM) promueve la quimiotaxis de los neutrófilos obtenidos de sangre totalcon 3 horas de estímulo. 28 Contrario a nuestros resultados, Raffaguello et al. utilizando fMLP cultivaron neutrófilos con y sin BM-MSC (células troncalesmesenquimales obtenidas de médula ósea, del inglés bone marrow derived mesenchymal stem cells), sin encontrar ningún efecto significativo en la migración en respuesta al estímulo (Raffaguello et al., 2008), esto puede deberse a que utilizan MSC de estirpe celular diferente a la nuestra. De acuerdo a lo descrito por Garfias y colaboradores la membrana amniótica inhibe la inflamación, la angiogénesis y promueve la epitelización. Esto se demostró al colocar células mononucleares en contacto con células de membrana amniótica la proliferación de las mononucleares se ve disminuida (Garfias et al., 2011). Al poner en contacto los neutrófilos con el sobrenadante de hAMSC en un sistema Transwell se evidenció que estas células secretan algún componente al medio que es capaz de inhibir la quimiotaxis de los neutrófilos.Secomprobó a través de los ensayos de Transwell que las hAMSC son también capaces de inhibir la quimiotaxis de neutrófilos. Las hAMSC son capaces de modular a las células T y secretar factores solubles como IL-10, TGF-β1, HGF y PGE2, expresan en muy baja concentración moléculas de histocompatibilidad clásicas HLA-IA y tienen la capacidad de inhibir la maduración y expresión de moléculas coestimuladoras en las células presentadoras de antígeno. Aunado a esto, son capaces de bloquear la producción de las citocinas inflamatorias TNF-α, CXCL10, CXCL9 y CCL5. Todas estas características les confieren propiedades inmunomoduladoras, inmunorreguladoras, inmunosupresoras y tolerogénicas (Tabera et al., 2008; Insausti et al., 2013). Diversos estudios clínicos indican que la utilización de células troncales mesenquimales provoca la disminución del proceso inflamatorio revirtiendo la angiogénesis y acelerando la recuperación del paciente (Insausti et al., 2014). Con base en los antecedentes planteados, se sugiere que las hAMSC al encontrarse en un microambiente pro-inflamatorio activan ciertas vías de señalización secretando diversos factores solubles que contrarrestan este ambiente ejerciendo su efecto inmunomodulador. Se ha reportado por da Silva et al. que la degradación de triptófano como consecuencia de la expresión de IDO por las MSC detiene la proliferación de las células T, siendo los catabolitos de triptófano los que inhiben la activación de células T CD4+ y CD8+. Además las hAMSC son capaces de inhibir o aumentar la proliferación de las células B, así como regular la secreción de citocinas por las células dendríticas y macrófagos (da Silva et al., 2009). En un ensayo de daño hepático en ratones el medio condicionado (SFB al 0.05%) de MSC (MSC-CM) fue capaz de disminuir el infiltrado leucocitario (Parekkadan et al.,2007). De acuerdo a Khakoo la propagación del Sarcoma de 29 Kaposi depende de citocinas proinflamatorias, factores angiogénicos y expresión de moléculas de adhesión; ellos encontraron que las BM-MSC (células troncales mesenquimales de médula ósea) administradas por vía intravenosa provocan un efecto antitumoral (Khakoo et al., 2006). Según lo descrito por Follin et al. el fenotipo antiinflamatorio de macrófagos secreta IL-10, que actúa como inmunosupresor de células como los linfocitos. In vivo, este efecto es el resultado de la terapia con MSC, con macrófagos locales antiinflamatorios residiendo en el tejido, probablemente mediando el potencial regenerativo de las MSC. Además, las MSC son capaces de incrementar la diferenciación de las células T en células T reguladoras por la secreción de IL-10, PGE2 y TGF-β1 o por macrófagos antiinflamatorios (Follin et al., 2016). Las MSC son activadas por señales inflamatorias como TNF-α, IL-1α, IL-1β e INF-γ, provocando un ambiente inmunosupresor, por lo cual se empiezan a secretar IDO, PGE2, IL-10, TGF-β y HGF (factor de crecimiento de hepatocitos) ocasionando un ambiente inmunomodulador (Kramperaet al., 2013). En un estudio realizado por Fontaine y colaboradores se colocaron MSC con células T en un sistema Transwell, observaron que la proliferación de las células T disminuyó sin necesidad del contacto celular entre ellas, comprobando que los factores secretados por las MSC son las encargadas de esta regulación (Fontaine et al., 2016). Las MSC al ser células indiferenciadas con capacidad para diferenciarse en células maduras y altamente proliferativas permitiendo obtener una extensa cantidad de éstas células, se han convertido en alternativas ante diversas enfermedades. (Kin et al., 2014). Por esto, es fundamental entender la función inmunosupresora y antiinflamatoria que son capaces de efectuar la células mesenquimales, en especial las hAMSC; así como conocer los mecanismos inmunosupresores que emplean para regular el microambiente inflamatorio y/o células inflamatorias con el fin de optimizar su uso como potencial terapia celular en diversos procesos inflamatorios. Hasta el momento no se han descrito todas las moléculas que son secretadas por las hAMSC las cuales se cree son las encargadas de realizar la inmunomodulación de las células inmunitarias de tipo innata, por lo tanto queda un extenso campo de investigación sobre este tema. 30 X. CONCLUSIONES Las hAMSC obtenidas del cultivo celular cumplen con todos los criterios propuestos por la Sociedad Internacional de Terapia Celular que las definen como células mesenquimales. Los neutrófilos obtenidos resultaron viables para los ensayos con una morfología adecuada, con marcadores positivos para estas células. Las hAMSC son capaces de inhibir la quimiotaxis de neutrófilos incluso cuando éstos se encuentran en contacto con quimioatrayente (fMLP) in vitro. 31 XI. REFERENCIAS Abbas A. K, LichtmanA. H. H, Pillai S.(2015) Inmunología celular y molecular. Elsevier. pp. 530. Amulic B, Cazalet C, Hayes Garret L.; Metzler K. D.; Zychlinsky A. (2012) Neutrophil Function: From Mechanisms to Disease. Ann. RevImmunol. 30:459-89. Arias M, Felmer R. (2009) Biología de las células madre embrionarias (ES cells) en distintas especies: potenciales aplicaciones en biomedicina. ArchMedVet. 41(3):185-195. Barbieri P. G, Flores G. J, Vignoletti, F.(2005) El neutrófilo y su importancia en la enfermedad periodontal. Av Periodon Implantol. 17(1):11-16. Barcat J. A. (2011) Diapédesis ¿Entre o a través de las células endoteliales? Medicina Buenos Aires. 71(6). Bello G. J, López De C. S. A. (2001). Fundamentos de Ciencia Toxicológica. Ediciones Díaz de Santos. Madrid, España. pp.9-12. Bieback K, Kern S, Klüter H, EichlerH. (2004) Critical parameters for the isolation of mesenchymal stem cells from umbilical cord blood. Stem Cells. Alpha Med Press. 22(4):625-34. Chávez C, Jiménez A, Graue E, Zaga V, García M, Jiménez M, Garfias Y. (2015) Ophtalmic indications of amniotic membrane transplantation in Mexico: an eight years Amniotic Membrane Bank experience. Cell Tissue Bank.17(2):261-8. Chen L. Y, Pan Z. K. (2009) Synergistic activation of leucocytes by bacterial chemoattractants: potential drug targets. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. 9(4):361-70. Chen W, Huang Y, Han J, Yu L, Li Y, Lu Z, Li H, Li Z, Shi C, Duan F, Xiao Y. (2016) Immunomodulatory effects of mesenchymal stromal cells-derived exosome. Immunol Res. 64(4):831-40. Da Silva M L, María F. A, Tadeu C. D, I. Caplan A. (2009) Mechanisms involved in the therapeutic properties of mesenchymal stem cells. Cytokine Growth Factor Rev.20(5- 6):419-27. Doan T, Melvold R, Viselli S, Waltenbaugh C. (2013) Inmunología. Wolters Kluwer Health. España. pp.375. Erices A, Minguell J. J, Conget P. (2000) Biology and clinical utilization of mesenchymal progenitor cells. Braz J MedBiol Res. 33: 881-887 32 Fainboim L, Geffner J. (2013) Introducción a la inmunología humana. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires. pp.584. Falcão S. A, Weinkopff T, Hurrell B. P, Celes F. S, Curvelo R. P, Prates D. B, Barral A, Borges V. M, Tacchini-Cottier. F,de Oliveira C. I. (2015) Exposure to Leishmania braziliensis triggers neutrophil activation and apoptosis. PLoS Negl Trop Dis 9(3): e0003601. Flores F. E, Montesinos J. J,Mayani, H (2006) Células troncales mesenquimales: historia, biología y aplicación clínica. Rev Invest Clín. 58(5):498-511. Follin B, Juhl M, Cohen S, PerdersenA. E, Kastrup J, Ekblond A. (2016) Increased Paracrine Immunomodulatory Potential of Mesenchymal Stromal Cells in Three- Dimensional Culture. Tissue Eng Part B Rev. 22:4. Fontaine M. J, Shih H, Schäfer R, Pittenger M. F. (2016) Unraveling the Mesenchymal Stromal Cells' Paracrine Immunomodulatory Effects. Transfus Med Rev. 30(1):37-43. Gabelloni M. L, Sabbione F, Iula L, Keitelman I, Jancic C, Giordano M,Geffner J,Trevani A. (2013) Trampas extracelulares de neutrófilos: una novedosa estrategia antiinfecciosa empleando moléculas antimicrobianas largamente conocidas. Rev Quím Viva, 1(12). Garfias Y, Nieves H. J, García M. M, Estrada R. C, Jiménez M. MC. (2012) Stem cells isolated from the human stromal limbus possess immunosuppressant properties. Mol Vis.18: 2087–95. Garfias Y, Zaga V, Vadillo F, Osorio M, Jiménez M. (2011) Amniotic membrane is an immunosuppressor of peripheral blood mononuclear cells. Immunol Invest. 40:183-96. Ghannam S, Bouffi C, Djouad F, Jorgensen C, Noël D. (2010) Immunossupression by mesenchymal stem cells: mechanisms and clinical applications. Stem Cell Res Ther. 1(1):2. Guirra S, Ríos F, Olaitan S, de Oliveira D. (2015) Vitexin reduces neutrophil migration to inflammatory focus by down-regulating pro-inflammatory mediators via inhibition of p38, ERK1/2 and JNK pathway. Phytomedicine.15;23(1):9-17 Hernández R. P.(2009) Medicina regenerativa y células madre. Mecanismos de acción de las células madre adultas. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter. 25(1). Ingraham J. L, Ingraham C. A. (1998). Introducción a la microbiología. Editorial Reverté. Barcelona, España. pp. 386. Insausti C. L, Rodríguez M, Castellanos G, Moraleda J. M. (2013) Propiedades inmunomoduladoras de las células madre de la membrana amniótica. Nuevas perspectivas. Rev Hematol Mex. 15:11-20. 33 Janeway C. A, Travers P, Walport, M, Shlomchik M. J. (2003) Inmunobiología, el sistema inmunitario en condiciones de salud y enfermedad. Masson. Barcelona, España. pp.70-73. Jung C. C, Luh Y. M, Chang C. Y, Cheng C. C, I. Huang H, Huey B. C, Linju Y. B. (2006) Placenta-derived multipotent cells exhibit immunosuppressive properties that are enhanced in the presence of Interferon-γ. Stem Cells. 24(11):2466-77. Kaplan M.J, Radic M. (2013) NETosis, at the intersection of cell biology, microbiology and immunology. Front in Immunol. Ke Y, Wu Y, Cui X, Liu X, Yu M, Yang C, Li X. (2015) Polysaccharide hydrogel combined with mesenchymal stem cells promotes the healing of corneal alkali burn in rats. PLoSOne.10(3):e0119725. Kelley W. N. (1993) Medicina Interna. Médica Panamericana. Madrid, España. pp. 996- 998. Khakoo A. Y, Pati S, Anderson S. A, Reid W, Elshal M. F, Rovira I.I, Nguyen A. T, Malide D, Combs C.A, Hall G, Zhang J, Raffeld M, Rogers T. B, Stetler-Stevenson W, Frank J. A, Reitz M, Finkel T. (2006) Human mesenchymal stem cells exert potent antitumorigenic effects in a model of Kaposi’s sarcoma. J Exp Med. 15;203(5):1235-47. Kim SH, Bang SH, Kang SY, Park KD, Eom JH, Oh IU, Yoo SH, Kim CW, Baek SY (2014) Human amniotic membrane-derived stromal cells (hAMSC) interact depending on breast cancer cell type through secreted molecules. Tissue Cell. 47(1):10-6. Kin N. T, Fortino V. R, Pelaez D, Cheung H. S .(2014) Progress of mesenchymal stem cell therapy for neural and retinal diseases. World J Stem Cells. 6(2):111-9. Kindt T. J, Goldsby Richard A. Y Osborne B. A. (2007) Inmunología de Kuby. McGraw Hill. sexta edición. México. pp. 690. Kolaczkowska E, Kubes P. (2013) Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13(3):159-75. Krampera M, Galipeau J, Shi Y , Tarte K, Sensebe L, on behalf of the MSC committee of the International Society for Cellular Therapy (ISCT) (2013) Immunological characterization of multipotent mesenchymal stromal cells—The International Society for Cellular Therapy (ISCT) working proposal. Cytotherapy. 15(9):1054-61. Lizarbe I. M. A. (2007) El suicidio y la muerte celular. Rev R Acad Cienc Exact Fís Nat.101(2):2007. Macías A. C, del Valle P. L, Baganet C. A, Dorticós B. E, Jaime F. J, Lam D. R, Socarrás F. B, Sánchez S. M, Marsán S. V, Palma S. L, Hernández R. P, Ballester S. J. (2011) Caracterización fenotípica de las células madre de médula ósea utilizadas en la terapia celular regenerativa. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter. 27(2):233-43. 34 Macías A. C, del Valle L, Galván J, Cuétara K, Socarrás B, Hernández P, Ballester J. (2014) Caracterización fenotípica de células madre mesenquimales humanas de médula ósea y tejido adiposo. Resultados preliminares. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter. 30(2). MacíasA. C, del Valle L, Hernández R. P, Ballester S. J.(2010) Características fenotípicas y funcionales de las células madre mesenquimales y endoteliales. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter. 26(4):256-75. Muller W. A. (2011) Mechanisms of leukocyte transendothelial migration.Annu Rev Pathol. 6:323-44 Muller W. A. (2013) Getting leukocytes to the site of inflammation.Vet Pathol. 50(1):7-22. Munir H, Rainger G. E, Nash G. B, MacGettrick H. (2015) Analyzing the effect of stromal cells on the recruitment of leukocytes from flow. J Vis Exp.(95):e52480. Murphy S, Lim R, Dickinson H, Acharya R, Rosli S, Jenkin G, Wallace E. (2011) Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20(6):909-23 Niknejad H, PaeiniV. G, Tehrani F. A, Khayat K. M, Peirovi H. (2013) Side dependent effects of the human amnion on angiogenesis. Placenta. 34(4):340–5. Niknejad H, Yazdanpanah G, Ahmadiani A. (2015) Induction of apoptosis, stimulation of cell-cycle arrest and inhibition of angiogenesis make human amnion-derived cells promising sources for cell therapy of cancer. Cell Tissue Res. 363(3):599-608. Parekkadan B, van Poll D, Suganuma K, Carter E.A, Berthiaume F, Tilles A.W, Yarmush M. L. (2007) Mesenchymal stem cell-derived molecules reverse fulminant hepatic failure. PLoSOne.2(9):e941. Patiño G. P. J. (2009) Inmunología; una ciencia activa. Universidad de Antioquia. Colombia. pp. 108-115. Pinegin B, Vorobjeva N, Pinegin V. (2015) Neutrophil extracellular traps and their role in the development of chronic inflammation and autoimmunity. Autoimmun Rev. 14(7):633- 40. Prosper F, Gavira J. J, Herreros J, Rábago G, Luquin R, Moreno J, Robles J. E, Redondo P. (2006) Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre. Anales Sis San Navarra. 29(2):219-34. Rabinovich, G. A. (2004). Inmunopatología molecular: nuevas fronteras de la medicina; un nexo entre la investigación biomédica y la práctica clínica. Médica Panamericana. Madrid, España. pp. 614. 35 Raffaghello L, Bianchi G, Bertolotto M, Montecucco F, Busca A, Dallegri F, Ottonelo L, Pistoia V. (2008) Human mesenchymal stem cells inhibit neutrophil apoptosis: a model for neutrophil preservation in the bone marrow niche. Stem Cells. 26(1):151-62. Rojo V, Aguilar D, Prado H, Reyes Á, Sullivan J. (2012) Participación de los patrones moleculares asociados al daño en el tratamiento convencional del cáncer. Rev Invest Clin. 64(3):284-93. Socarrás F. B, del Valle P. L, de la Cuétara B. K, Marsán S. V, Sánchez S.M, Macías A. C.(2013)Células madre mesenquimales: aspectos relevantes y aplicación clínica en la medicina regenerativa. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter. 29(1):16-23. Tabera S, Pérez J, Díez M, Sánchez L, Blanco B, López A, Benito A, Ocio E, Sánchez F, Cañizo C, San Miguel J. (2008) The effect of mesenchymal stem cells on the viability, proliferation
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