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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas Análisis de variaciones en residuos en la región N-terminal de la beta- neurotoxina CssII y su especificidad hacia subtipos de canales de sodio dependientes de voltaje TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: Maestro en Ciencias PRESENTA: QFB. RODRIGO IBARRA VEGA TUTOR PRINCIPAL DR. GERARDO A. CORZO BURGUETE Instituto de Biotecnología MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR DRA. ROSANA SÁNCHEZ LÓPEZ Instituto de Biotecnología DRA. GEORGINA ESTRADA TAPIA CICY, Mérida, Yucatán CUERNAVACA, MOR. DICIEMBRE 2015 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. ii Es un honor poder agradecer al Departamento de Medicina molecular y Bioprocesos del Instituto de Biotecnología y al posgrado en Ciencias Bioquímicas de la UNAM por permitirme la oportunidad de realizar el posgrado en esta gran institución. Al Dr. Gerardo Corzo por su asesoría y todo el apoyo que me brindó en este periodo. Al Dr. Lourival Domingos Possani por permitirme estar en su laboratorio durante el desarrollo del presente proyecto. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por la beca de maestría 3432736 otorgada en este periodo y por el apoyo del proyecto 240616. A la Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA) por el apoyo del proyecto IN204415 y al Programa de Apoyo a los Estudios de Posgrado (PAEP). Por último quiero agradecer ampliamente a la Dra. Juana María Jiménez Vargas y a la Dra. Georgina Estrada Tapia por su asesoría y sus consejos, a la Dra. Rita Restano Cassulini, al M.B. Timoteo Olamendi Portugal y al Dr. Fernando Zamudio por su asesoría y apoyo con los ensayos electrofisiológicos, determinación secuencias de ADN y determinación de masas moleculares. iii ¿Qué puedes hacer por los demás si no has conseguido hacer nada bueno de ti mismo? -Rabindranath Tagore iv Agradezco mucho a mis compañeros y amigos del laboratorio y del Instituto de Biotecnología por su valiosa amistad y todo su cariño. Este trabajo se lo dedico con todo mi cariño a mi familia por su gran apoyo a lo largo de este tiempo, en especial a mi papá José Ibarra García quien fue mi gran ejemplo de persona, siempre tuvo una maravillosa historia para compartir. - ¡Gracias por todo, te tengo siempre presente papá!. v INDICE ÍNDICE DE FIGURAS .................................................................................. viii ÍNDICE DE TABLAS ....................................................................................... x ABREVIATURAS .......................................................................................... xi UNIDADES ................................................................................................. xii NOMENCLATURA DE TOXINAS MUTANTES. ...............................................xiii GENOTIPOS DE LAS CÉLULAS UTILIZADAS .......................................... xiv RESUMEN .................................................................................................. xvi 1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................... 1 1.1. Canales de sodio dependientes de voltaje .......................................... 2 1.2. Toxinas que afectan canales de sodio ................................................. 3 1.2.1. Mecanismo de acción de las toxinas beta de alacrán: Atrapamiento del sensor de voltaje .......................................................... 5 2. ANTECEDENTES ..................................................................................... 8 3. HIPÓTESIS ............................................................................................ 13 4. OBJETIVOS ........................................................................................... 13 4.1. Objetivo general ............................................................................... 13 4.2. Objetivos particulares ....................................................................... 13 5. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................... 14 5.1. Cepas, Vectores y Oligonucleótidos: ................................................. 14 5.1.1. Cepas de E. coli (E. coli, genotypes, OpenWet Ware) ..................... 14 5.1.2. Vectores ........................................................................................ 15 5.1.3. Oligonucleótidos ........................................................................... 15 5.2. Medios de cultivo y soluciones ......................................................... 16 5.2.1. Medios de cultivo .......................................................................... 16 5.2.2. Soluciones para geles de agarosa (Sambrook et al., 1989) ............ 16 vi 5.2.3. Soluciones para geles de SDS-PAGE (Laemmli 1970) ..................... 17 5.2.4. Soluciones de ensayos electrofisiológicos ..................................... 17 5.3. Construcción de las variantes de la toxina CssII ................................ 18 5.3.1. Diseño de los oligonucleótidos mutagénicos .............................. 18 5.3.2. Mutaciones sitio dirigidas. .......................................................... 18 5.4. Clonación de los genes mutantes en el vector pGEM-T ..................... 20 5.5. Transformación de la cepa E. coli DH5α ............................................ 21 5.6. Análisis de secuencias ....................................................................... 21 5.7. Subclonación de los genes en el vector de expresión pQE30 ............ 22 5.8. Condiciones de expresión ................................................................. 23 5.9. Purificación de los péptidos de fusión ............................................... 24 5.10. Electroforesis de proteínas ............................................................ 26 5.11. Plegamiento “in vitro” .................................................................... 26 5.11.1. Plegamiento de péptidos de fusión reducidos ......................... 26 5.11.2. Plegamiento de péptidos de fusión oxidados. .......................... 27 5.12. Espectrometría de masas. .............................................................. 27 5.13. Ensayos de toxicidad en ratones CD1: Administración intracraneal 28 5.14. Digestiones de los péptidos de fusión. ........................................... 28 5.15. Ensayos electrofisiológicos............................................................. 28 6. RESULTADOS ....................................................................................... 30 6.1. Amplificación de los genes mutagénicos ........................................... 30 6.2. Clonación en el vector pGEM-T ......................................................... 31 6.3. Secuenciación de DNA ...................................................................... 31 6.4. Subclonación en el vector de expresión pQE30 .................................32 6.5. Prueba de expresión de los vectores candidatos a secuenciar .......... 33 vii 6.6. Pruebas de expresión de las variantes con la cepa BL21 ................... 34 6.7. Purificación de proteínas .................................................................. 35 6.8. Plegamiento “in vitro” del péptido de fusión reducido ..................... 37 6.9. Plegamiento “in vitro” directo con elusión de la columna de Níquel. 38 6.10. Ensayos de toxicidad en ratones CD1: Administración intracraneal 44 6.11. Digestión de los péptidos de fusión ............................................... 45 6.12. Ensayos electrofisiológicos............................................................. 49 7. ANÁLISIS DE RESULTADOS ........................................................... 56 8. CONCLUSIÓN .................................................................................. 59 9. PERSPECTIVAS. ................................................................................. 60 10. REFERENCIAS .................................................................................... 61 viii ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Estructura de canales de sodio dependientes de voltaje.. ....................................... 3 Figura 2: Sitio de interacción del canal Nav con las toxinas beta. ........................................ 7 Figura 3. Modelo del mecanismo del atrapamiento del sensor de voltaje ............................. 8 Figura 4. Corrientes iónicas de canales de sodio Nav1.6 en presencia de la toxina nativa nCssII, la toxina recombinante rCssII y mutantes de CssII.. ................................................ 10 Figura 5. Representación de la estructura primaria y terciaria de la toxina beta del alacrán CssII (PDB: 2LI7).. .............................................................................................................. 12 Figura 6. A, Mapa del Vector pGEM-T (Promega): puntos referentes de la secuencia y B. Vector pQE30 (Qiagen). Tomados de los manuales correspondientes. ............................... 15 Figura 7. Secuencias promotoras de T7, SP6 y el sitio múltiple de clonación del vector pGEM-T (Promega). ............................................................................................................. 19 Figura 8. Esquema de la generación de las variantes por medio de mutaciones sitio dirigidas. ............................................................................................................................... 20 Figura 9. Esquema de la construcción de las variantes de CssII en el vector de expresión pQE30 ................................................................................................................................... 23 Figura 10. Esquema de la purificación de los péptidos de fusión en columnas de afinidad a Níquel. .................................................................................................................................. 25 Figura 11. Ensayos electrofisiológicos en canales Nav: A) Esquema representativo de la técnica de Patch-clamp, configuración de célula completa (Whole-cell), B) Protocolo de activación utilizado para los canales de sodio Nav. ............................................................. 29 Figura 12. Electroforesis en agarosa al 1% de los amplificados: A. los Megaoligos o Megaprimers mutagénicos MPS7N/K8H, MPK8H y MPS7N. B. amplificación de las variantes de CssII usando los Megaoligos mutados de la primera reacción. ....................... 30 Figura 13. Electroforesis de agarosa al 1% de los productos de la PCR de las clonas resultantes de la ligación del inserto CssII_S7N en el vector pGEM-T.............................31 Figura 14. Secuencia nucleotídica codificante para la variante CssII_S7N/K8H.. ............. 32 Figura 15.Digestiones de las construcciones plasmídicas con las enzimas BamHI y PstI. 33 Figura 16. SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes, prueba de expresión de la construcción CssII_K8H en XL1Blue.. ................................................................................ 34 Figura 17. SDS-PAGE, prueba de expresión de las variantes en pQE30 con la cepa de E. coli BL21(DE3).. .................................................................................................................. 35 Figura 18. Perfiles de HPLC de fase reversa de la variante CssII_S7N/K8H.. ................... 36 Figura 19. SDS-PAGE al 15% de las variantes de CssII reducidas y purificadas por HPLC. .............................................................................................................................................. 36 Figura 20. Perfiles de HPLC de fase reversa de las variantes de CssII reducidas y del producto de la reacción de plegamiento. .............................................................................. 37 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 ix Figura 21. Cromatogramas de la variante CssII_S7N/K8H oxidada y después del plegamiento sin reducir ........................................................................................................ 39 Figura 22. Ensayo de plegamiento de la variante CssII_S7N/K8H oxidada. ...................... 40 Figura 23. Registro de HPLC de fase reversa del perfil de plegamiento de la variante CssII_S7N/T64R/N66R ........................................................................................................ 41 Figura 24. Registro de HPLC de fase reversa del perfil de plegamiento de la variante CssII_K8H/T64R/N66R. ...................................................................................................... 41 Figura 25. Registro de HPLC de fase reversa del perfil de plegamiento de la variante CssII_S7N/K8H/T64R/N66R. .............................................................................................. 42 Figura 26. Registro de HPLC de fase reversa del perfil de plegamiento de la variante CssII_S7N ............................................................................................................................. 42 Figura 27. Registro de HPLC de fase reversa del perfil de plegamiento de la variante CssII_K8H. ........................................................................................................................... 43 Figura 28. Registro de HPLC de fase reversa del perfil de plegamiento de la variante CssII_S7N/K8H. ................................................................................................................... 43 Figura 29. Registro de HPLC de fase reversa de la digestión con Factor Xa de la variante control CssII_T64R/N66R. ................................................................................................... 45 Figura 30. Registro de HPLC de fase reversa de la digestión con Factor Xa de la variante CssII_S7N_T64R/N66R. ...................................................................................................... 46 Figura 31. Registro de HPLC de fase reversa de la digestión con Factor Xa de la variante CssII_K8H/T64R/N66R ....................................................................................................... 46 Figura 32. Registro de HPLC de fase reversa de la digestión con Factor Xa de la variante CssII_S7N/K8H_T64R/N66R. ............................................................................................. 47 Figura 33. Registro de HPLC de la digestión con Factor Xa de la variante CssII_S7N. .... 47 Figura 34. Registro de HPLC de la digestión con Factor Xa de la variante CssII_K8H. ... 48 Figura 35. Registro de HPLC de la digestión con Factor Xa de la variante CssII_S7N/K8H. ..............................................................................................................................................48 Figura 36.Trazos de corrientes iónicas de hNav1.4 y hNav1.6. Control y después de la aplicación de las variantes de CssII (600 nM). ..................................................................... 51 Figura 37. Efecto promedio normalizado de las variantes de CssII sobre los canales hNav1.6 y hNav1.4.. ............................................................................................................. 52 Figura 38. Trazos de corrientes iónicas de hNav1.4 (arriba) y hNav1.6 (Abajo). El control (Trazos negros) y después de la aplicación de las variantes de CssII (Trazos rojos; 1.2 µM).. ..................................................................................................................................... 54 Figura 39. Efecto promedio normalizado de las variantes de CssII sobre los canales hNav1.6 y hNav1.4.. ............................................................................................................. 55 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 l%20 x ÍNDICE DE TABLAS Tabla Descripción Página 1 Sitios de unión de toxinas a canales de sodio Nav y el efecto que ocasionan 4 2 Ejemplos de toxinas más abundantes en algunos alacranes del género Centruroides y la especie Tityus serrulatus 9 3 Alineamiento de secuencias de toxinas de alacrán del género Centruroides y los subtipos de canales Nav a los cuales reconocen mayormente 11 4 Secuencia de los oligonucleótidos diseñados para generar cambios de los codones correspondientes a los aminoácidos de las posiciones 7 y 8 del amino terminal de la toxina CssII 18 5 Secuencia de los oligonucleótidos externos al sitio de clonación en el vector pGEM-T. 20 6 Secuencia de las variantes de la toxina CssII comparadas con la toxina CeII9 32 7 Masas moleculares de las variantes de la toxina CssII reducidas. 38 8 Masas experimentales de los péptidos de fusión plegados 44 9 Registro del ensayo de toxicidad en ratones CD1 45 10 Masas moleculares de las toxinas recombinantes 49 xi ABREVIATURAS Nav Canales de sodio dependientes de voltaje. Nav1.4 Nomenclatura asignada al subtipo 4 de los canales de sodio dependientes de voltaje. Se conocen nueve subtipos de estos canales (Nav1.1 a Nav1.9). Nav1.6 Nomenclatura asignada al subtipo 6 de los canales de sodio dependientes de voltaje. Se conocen nueve subtipos de estos canales (Nav1.1 a Nav1.9). CssII Toxina beta II del alacrán Centruroides suffusus suffusus. CssIV Toxina beta IV del alacrán Centruroides suffusus suffusus. CeII9 Toxina beta II9 del alacrán Centruroides elegans. Ts1 Toxina beta 1 del alacrán Tityus serrulatus. Cn2 Toxina beta 2 del alacrán Centruorides noxius. Cn8 Toxina beta 8 del alacrán Centruroides noxius. Cll2 Toxina beta 2 del alacrán Centruroides limpidus limpidus. ADN Ácido Desoxirribonucleico. BamHI Enzima que corta el ADN en las secuencias 5´GǀGATCC3´, la enzima es originaria de la bacteria Bacillus amyloliquefaciens. DL50 Dosis letal 50: es la cantidad de una sustancia que ocasiona la muerte del 50% de una población de individuos a los que se les administró dicha sustancia. dNTP´s Desoxinucleótidos trifosfatos. D.O. Densidad Óptica. DTT Ditiotreitol. EDTA Etilen Diamino Tetra Acético. EGTA Ácido Etilen Glicol Tetraacético. GSH Glutatión (Glutatión reducido). GSSG Glutatión Disulfuro (Glutatión oxidado). HEPES Ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperacinil-(1)] etanosulfónico. HisrCssII Péptido recombinante de CssII unido a un segmento peptídico que incluye 6 Histidinas. HPLC Cromatografia Líquida de Alta Resolución. IC Administración Intracraneal. IFM Motivo estructural de los canales de sodio dependientes de voltaje, participa en la inactivación de estos canales (Isoleucina-Fenilalanina-Metionina). IPTG Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido. Kit Conjunto de reactivos y materiales que permiten realizar una metodología experimental. xii Ni-NTA Complejo organometálico formado por Ácido Nitrilotriacético y Níquel. pb Pares de bases. PCR Reacción en cadena de la polimerasa (del inglés Polymerase chain reaction). PDB Proviene del inglés Protein Data Bank, Banco de datos de proteínas. Se hace mención como PDB a un tipo de archivos que contiene información sobre estructuras en tercera dimensión de proteínas. PSA Persulfato de amonio. PstI Enzima que corta el ADN en las secuencias 5´CTGCAǀG3´, la enzima es originaria de la bacteria Providencia stuarti. RP-HPLC Cromatografía Líquida de Alta Resolución en Fase Reversa. rpm Revoluciones por minuto. SDS Dodecil Sulfato de Sodio. SDS-PAGE Electroforesis en Geles de Poliacrilamida. TEMED N,N,N´,N´-tetrametiletilendiamina. TFA Ácido Trifloro Acético. Tm Temperatura de Fusión del ADN, a esta temperatura las hebras del ADN se separa en cadenas independientes. UNIDADES nm Nanómetros. MΩ Unidad de resistencia eléctrica Mega Ohms. mV Unidad de voltaje o potencial eléctrico Milivolts. ms Milisegundo. s Segundo. min Minutos. h Horas. L Litros. mL Mililitros. µL Microlitros. g Gramos. mg Miligramos. µg Microgramos. ng Nanogramos. pmol Picomoles. nM Concentración nanomolar [nanomoles/Litro]. mM Concentración milimolar [milimoles/Litro]. M Concentración molar [moles/Litro]. Da Daltones: son las unidades de masa molecular generalmente utilizadas para péptidos y proteínas, son equivalentes a las unidades de masa atómica. xiii NOMENCLATURA DE TOXINAS MUTANTES. En este trabajo se generaron 6 mutantes de CssII: En la siguiente tabla se describe las abreviaciones utilizadas en algunas partes del escrito, las mutaciones correspondientes y la descripción. Abreviación de la mutante Mutante Descripción de la mutante S7N_RCR CssII_S7N/T64R/N66R Sustitución de serina por asparagina en la posición 7. La mutante presenta argininas en las posiciones 64 y 66. K8H_RCR CssII_K8H/T64R/N66R Sustitución de lisina por histidina en la posición 8. La mutante presenta argininas en las posiciones 64 y 66. NHS_RCR CssII_S7N/K8H/ T64R/N66R Sustitución de serina por asparagina en la posición 7 y de lisina por histidina en la posición 8. La mutante presenta argininas en las posiciones 64 y 66. S7N CssII_S7N Sustitución de serina por asparagina en la posición 7. K8H CssII_K8H Sustitución de lisina por histidina en la posición 8. NHS CssII_S7N/K8H Sustitución de serina por asparagina en la posición 7 y de lisina por histidina en la posición 8. CONTROL RCR T64R/N66R La variante presenta sustitución de la treonina T64 y de la asparagina 66 por argininas en estas posiciones. (generada por Estrada et al., 2011). xiv GENOTIPOS DE LAS CÉLULAS UTILIZADAS BL21(DE3)F – ompT gal dcm lon hsdSB(rB - mB - ) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]). DH5α:F - endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK - mK + ), λ–. XL1-Blue: endA1 gyrA96(nal R ) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F'[ ::Tn10 proAB + lacI q Δ(lacZ)M15] hsdR17(rK - mK + ). F - : Esta cepa no tiene el plásmido F (Factor sexual o ADN plasmídico de la fertilidad) ompT: Mutación en la proteasa externa de membrana que permite mejorar los rendimientos de algunas proteínas recombinantes. gal: Mutación en el metabolismo de la galactosidasa. Bloquea la utilización de la galactosidasa. dcm: La metilasa dcm permite la metilación de la citosina en las secuencias CC(A/T)GG lo que protege al ADN por algunas enzimas de restricción. lon: Esta cepa es mutante en la serínoproteasa dependientede ATP (Lon protease media la degradación selectiva de proteínas anormales o mutantes). hsdSB(rB- mB-): Permite la clonación con ADN endógeno sin corte por endonucleasas. λ(DE3[…]): Tiene el gen de la RNA polimerasa T7 del profago λ y laclq lacI: Producción de la proteína represora lac. lacUV5-T7gene: La cepa BL21(DE3) contiene el gen de la ARN Polimerasa T7 que es controlado por el promotor lacUV5 (Un promotor fuerte) dentro del ADN cromosomal ind1: La mutante Ind1 resulta en una fuerte disminución en el crecimiento de profagos. sam7: La mutación Sam7 hace que las partículas infecciosas del fago se mantengan dentro de la célula. nin5: Reduce la frecuencia del ciclo de lisogenización (Integración de ADN de fagos al genoma de la bacteria) debido al incremento de la actividad del gen Q. glnV44: La cepa presenta supresión del codón de paro ámbar (requerido para el crecimiento de algunos fagos) por inserción de glutamina. thi-1: Esta cepa requiere tiamina ( No puede producir su propia tiamina). recA1: RecA es una proteína usada por E. coli para reparar y mantener el ADN. RecA1 es una forma inactiva del gen RecA, específicamente en la actividad de ATPasa. Las células de este genotipo son sensibles a la radiación. relA1: Escherichia coli (relA1) desarrolla una estructura lipídica que difiere de la nativa y es caracterizada por la acumulación de fosfolípidos neutros y ácidos grasos saturados. La membrana es más frágil a la sonicación y choque osmótico. gyrA96: La cepa tiene una mutación en la ADN girasa, la cual le confiere resistencia al ácido nalidíxico (La mutación gyrA96 da a E. coli resistencia a la proteína ccdB). xv deoR: El represor transcripcional deoR, para el "Regulador de Dioxirribosa" su presencia da lugar a la expresión constitutiva de los genes que producen la desoxirribosa, permite la captación de plásmidos grandes. nupG: Es uno de dos transportadores de nucleósidos de alta afinidad en E. coli. este gen regulador permite la expresión constitutiva de la desoxirribosa y permite la captación de plásmidos grandes. Φ80dlacZΔM15: Permite la detección clonas azules y blancas. Δ(lacZYA-argF)U169: Las cepas que tienen esta deleción en su genoma presentan altos niveles de resistencia al peróxido de hidrógeno. hsdR17 (rK- mK+): La mutación hsdR17 elimina la restricción o corte por parte de endonucleasas en los sistemas de restricción-modificados, EcoKI, por lo que el ADN carente de metilación no es digerido. λ–: Deleción lisogénica lambda (El fago λ no llevar a cabo el ciclo lisogénico). Lac: Presenta deleción de todo el operón lac. F’[…]: El hospedero contiene un plásmido episomal F` con las características mencionadas. Tn10 = Transposón, normalmente lleva resistencia a tetraciclina. proAB + : Los genes proA y proB codifican para las primeras dos enzimas de la biosíntesis de prolina en E. coli. lacI q : Sobreproducción de la proteína represora lac (la base -35 rio arriba en el promotor es mutada de GCGCAA a GTGCAA). Δ(lacZ)M15: La cepa tiene deleción en el gen lacZ la cual contiene el ω-péptido: una β-galactosidasa derivada de la cepa de E. coli M15 que tiene el N-terminal eliminado (residuos N-terminal 11-41), es incapaz de formar tetrámeros por lo cual es inactiva. La transformación de esta cepa con plásmidos que contengan la secuencia para lacZα, que codifica los primeros 59 residuos de la β-galactosidasa (el α-péptido), permite la función de la beta-galactosidasa. Permite la detección de colonias azules y blancas. Nota: Los genes nombrados indican la pérdida de función por una mutación, si el símbolo Δ precede al nombre del gen, es indicativo de que el gen ha sido eliminado. Si un gen no está en el genotipo de las cepas, no se sabe si está o se encuentra mutado. xvi RESUMEN Los venenos de los alacranes son una mezcla compleja de componentes dentro de los cuales resaltan las neurotoxinas, estas son péptidos que afectan a los canales iónicos de Na + , K + , Ca 2+ y Cl - . Las neurotoxinas más sobresalientes por su abundancia y toxicidad son las que tienen como blanco a los canales de sodio dependientes de voltaje Nav como es el caso de la toxina beta CssII que está presente en el veneno del alacrán Centruroides suffusus suffusus. La toxina CssII es un péptido que afecta preferentemente al subtipo Nav1.6, está formada por 66 aminoácidos, tiene 4 puentes disulfuro y se encuentra amidada en el carboxilo terminal, dicha amidación es importante para la actividad biológica de CssII. Por otra parte, la toxina beta CeII9 proviene del veneno del alacrán Centruroides elegans, está formada por 67 residuos y presenta el patrón de los 4 puentes disulfuro. CeII9 se reportó como una toxina específica para el subtipo Nav1.4. Al comparar las secuencias de las toxinas CssII y CeII9 se observó que tienen 10 aminoácidos diferentes, de los cuales, principalmente los residuos de 7 y 8 del N-terminal resaltan por sus cambios no conservados. La región N-terminal (residuos 7-9) es variable en las toxinas beta del género Centruroides y esta región podría estar asociada a la especificidad por los subtipos de Nav en mamíferos, por lo que en este proyecto se propuso evaluar la participación de los residuos 7 y 8 de CssII y CeII9 en su selectividad a los subtipos Nav1.6 y Nav1.4. Para determinar si existe participación de la región amino terminal (residuos 7 y 8) en la selectividad sobre los subtipos Nav se construyeron mutantes de la toxinas CssII cambiando los residuos S7 y K8 por los residuos correspondientes de la toxina CeII9. Las mutantes generadas fueron: CssII_S7N, CssII_K8H y CssII_S7N/K8H. Estas mutantes se obtuvieron por medio de expresión heteróloga en E. coli, sin embargo, ya que este sistema no permite modificaciones postraduccionales de amidación en el C-terminal, se generaron además, las mismas variantes pero sustituyendo los residuos 64 y 66 por argininas (T64R/N66R) en la CssII ya que se ha demostrado que estos residuos pueden compensar la actividad biológica de la toxina recombinante sobre canales Nav1.6 ante la falta de amidación. xvii Las variantes de CssII expresadas con el vector pQE30 se obtuvieron en cuerpos de inclusión, los cuales se separaron y disolvieron en un solvente caotrópico. Los péptidos se plegaron in vitro con una metodología optimizada, las isoformas predominantes en los plegamientos presentaron masas moleculares próximas a las teóricas y fueron tóxicas para ratones CD1. Estos resultados fueron evidencia de un arreglo de puentes disulfuro igual al de la toxina nativa CssII. La actividad de las mutantes sobre canales Nav se evaluó por medio de ensayos electrofisiológicos con la metodología de Patch-clamp en la modalidad de célula completa "Whole cell", se utilizaron células CHO (Células de ovario de hámster chino) y células HEK (Células embrionarias de riñón humano) que expresan de manera estable a los canales Nav1.4 y Nav1.6, respectivamente. En los registros electrofisiológicos de las mutantes CssII_S7N_T64R/N66R, CssII_K8H_T64R/N66R y CssII_S7N/K8H_T64R/N66R sobre los canales Nav1.6 y Nav1.4 se observó una disminución que desde 5 a 20% comparada con el efecto ocasionado por la mutante control CssII_T64R/N66R, dicha disminución nos indica que los residuos S7 y K8 de la toxina CssII en conjunto favorecen el reconocimiento de ambos subtipos Nav, sin embargo, ninguna de las mutantes fue capaz de ocasionar efecto sobre del Nav1.4 semejante al que logra la toxina control CeII9, así también, ninguna de las mutantes antes mencionadas redujo su actividad de manera considerable sobre los subtipos Nav1.6 (solo se observó disminución en actividad en menos del 15% de la población de los Nav). Con estos resultados se concluyó que los residuos 7 y 8 de la región N-terminal de la toxinas CssII no son determinantes para el reconocimientode los subtipos Nav1.6 y Nav1.4. 1 1. INTRODUCCIÓN Los alacranes son uno de los grupos de animales más antiguos, se estima que su aparición en la tierra fue hace más de 400 millones de años. Durante este tiempo han mantenido su morfología prácticamente sin alteraciones, actualmente se conocen más de 1,500 especies distintas (Lourenco, 1994). Su éxito evolutivo se debe en gran medida, entre otras características, a la producción de veneno con el que pueden defenderse de agresores y capturar a las presas de las que se alimentan. El veneno que producen, es una mezcla de componentes; péptidos neurotóxicos, enzimas, lípidos, mucoproteínas, nucleótidos, aminas, entre otros, que ocasionan trastornos fisiológicos cuando son inyectados en la presa o en el agresor (Possani et al., 1999; 2006). Los alacranes pertenecen a la clase Arachnida, orden Scorpionida. Las especies que representan peligro por envenenamiento al ser humano pertenecen a la familia Buthidae, que comprende aproximadamente 500 especies, algunos de los géneros representativos son: Androctonus, Leiurus, Buthus, Buthotus, Heterometrus, Parabuthus, Centruroides y Tityus (Possani et al., 1999). Se calcula una incidencia mundial anual de 1.5 millones de picaduras a humanos, relacionadas con 2,600 muertes (Chippaux et al., 2012). Los péptidos neurotóxicos (toxinas) son los componentes más importantes del veneno, ya que afectan a canales iónicos (Canales de: Na + , K + , Cl - y Ca 2+ ) y ocasionan múltiples trastornos fisiológicos cuando se inyecta el veneno. En particular, las toxinas de alacrán que afectan a los canales de sodio de mamíferos son de gran interés, ya que su interacción con el receptor puede ser la responsable de la muerte del individuo ante la picadura del alacrán (Possani et al., 1999; Stevens et al., 2011). 2 1.1. Canales de sodio dependientes de voltaje Los canales de sodio dependientes de voltaje (Nav) son proteínas transmembranales presentes en neuronas y otras células excitables como los miocitos y células endócrinas. Estos canales son los responsables de permitir la entrada rápida de sodio al interior de las células con lo que se generan los potenciales de acción y se propagan los impulsos nerviosos, permitiendo la comunicación entre tejidos del organismo (Catterall et al., 2007). Se han reportado nueve subtipos de canales de sodio dependientes de voltaje (Nav1.1- Nav1.9) en mamífero. Los canales Nav están formados por una subunidad principal α (220- 260 kDa), constituida por cuatro dominios homólogos, cada dominio está formado por 6 segmentos trasmembranales (alfa hélices). El segmento 4 (S4) de los cuatro dominios, tiene aminoácidos básicos cada tercera posición (argininas y lisinas), las cargas positivas de estos residuos permiten que el sensor responda a cambios en el potencial de la membrana con cambios conformacionales del canal, estos cambios se ven reflejados en la apertura y cierre de los Nav. El asa que une a los segmentos S5 y S6 de cada dominio está embebida en la membrana plasmática y forman en conjunto el estrecho filtro de selectividad del canal. El motivo estructural IFM (formado por los residuos Isoleucina-Fenilalanina-Metionina) se encuentra en el asa que une al dominio III con el dominio IV (en el lado intracelular), este motivo IFM interactúa con la boca del canal y puede bloquear el paso de los iones. Ante la presencia de un estímulo despolarizante los canales Nav se activan y permiten el paso de los iones sodio, después de unos milisegundos el asa que contiene al motivo IFM bloquea al canal y lo lleva a un estado de inactivación (Fig. 1) (Catterall et al., 2005; 2007; Yu and Catterall, 2003). La subunidad α puede estar asociada a subunidades auxiliares β (30-36 kDa) que modulan la función del canal y modifican la expresión de las subunidades α (Baroni et al., 2013). Se conocen 4 tipos de subunidades (β1-β4): β1 y β3 se une por medio de puentes disulfuro a la subunidad alfa, mientras que las subunidades β2 y β4 se unen de manera no covalente (England et al., 2009). A pesar de la existencia de las subunidades beta, se ha observado que la subunidad alfa por sí sola es suficiente para generar canales funcionales en sistemas heterólogos (Goldin 2001). 3 Figura 1. Estructura de canales de sodio dependientes de voltaje. (a). Representación de la estructura secundaria: La subunidad α es ilustrada junto a subunidades β1 and β2. Los números Romanos indican los dominios de la subunidad alfa; los segmentos 5 y 6 (en verde) son los segmentos que forman el poro del canal, el asa embebida en la membrana que une a los segmentos S5 y S6 forman el filtro de selectividad. Los segmentos S4 (En amarillo) son los sensores de voltaje. El motivo IFM, marcado como h dentro del círculo azul es el encargado de la inactivación del canal. Los sitios P, son sitios de fosforilación; los círculos rojos son sitios de fosforilación por proteíncinasas A; los diamantes rojos son sitios de fosforilación por proteíncinasa C; ψ, probables sitios de glicosilación (Tomado de Yu and Catterall, 2003). 1.2. Toxinas que afectan canales de sodio Las toxinas han tomado gran importancia en investigación porque son herramientas poderosas para el estudio de la relación estructura-función de los canales iónicos (Possani et al., 1999; Estrada et al., 2007). Las toxinas que afectan a los Nav pueden actuar en al menos ocho sitios diferentes de los canales, estas toxinas se distinguen por el sitio al que se unen y por el efecto que producen sobre el comportamiento del canal (Tabla 1, England et al., 2009; Stevens et al., 2011). La interacción de las toxinas con los canales Nav puede ocurrir de dos maneras distintas, algunas toxinas como la tetradotoxina pueden ocluir físicamente el poro del canal y evitar la conductancia del sodio, mientras que otras toxinas se unen a regiones distintas al poro y modifican la cinética del canal (Stevens et al., 2011). 4 Tabla 1. Sitios de unión de toxinas a canales de sodio Nav y el efecto que ocasionan (England et al., 2009; Stevens et al., 2011) Sitio Neurotoxinas Ejemplos Péptidos Principal área de unión Efecto 1 Toxinas Guanidino μ-Conotoxinas Tetradotoxina (TTX) Saxitoxina (STX) KIIIA, SIIIA, PIIIA No No Si DI-IV S5-S6 Boquea la conducción de Na+. 2 Toxinas liposolubles pequeñas Batracotoxina Veratridina Grayanotoxina Aconitina No No No No DI DIV S6 Promueve la activación persistente. 3 Toxinas alfa de alacrán Toxinas de anemona de mar AaH II, LqHaIT, BMK M1 ATX-II, AFTII Si Si DIV S3-S4 Desestabiliza el estado inactivado, incrementa la probabilidad del estado abierto. 4 Toxinas beta de alacrán Toxinas beta de araña μ O-conotoxinas Css4, Tsγ, AaHIT Magi5, HWTX-IV MrVIA Si Si Si DII S3-S4 Favorece la activación del canal en dirección de la hiperpolarización. 5 Compuestos de poliéter cíclicos Brevetoxinas Ciguatoxinas No No DI S6 Favorece la activación y bloquea la inactivación. 6 δ-Conotoxinas Si DIV S4 Retarda la inactivación del canal. 7 Piretroides DDT, Deltametrina No DII-DIII Inhibe la inactivación, cambia la dependencia de voltaje para la activación. LA Anestésicos locales Anticonvulsivos Antiarrítmicos Antidepresivos Lidocaina No DIV S6 Bloquea la conducción de Na+. En el veneno de alacrán existen dos grupos de toxinas que tienen como blanco a los canales de sodio: por un lado las toxinas alfa que son péptidos que se unen al sitio 3 y retardan o bloquean la inactivación del canal provocando un efecto despolarizante. Por otra parte, las toxinas beta se unen al sitio 4 y promueven la apertura del canal a potenciales más negativos,además, estas últimas disminuyen el pico máximo de corriente (Fig.2) (Jover et al., 1980; Wheeler et al., 1983; Rogers et al., 1996; Cestèle et al., 1998). 5 1.2.1. Mecanismo de acción de las toxinas beta de alacrán: Atrapamiento del sensor de voltaje Las toxinas tipo beta de alacrán se unen al sitio 4 de los canales Nav y presentan el mecanismo del “atrapamiento del sensor de voltaje” (“voltaje sensor trapping”), este mecanismo lo propuso Cestèle y colaboradores en 1998. En el trabajo caracterizaron a la beta toxina CssIV, este péptido presentó una alta afinidad hacia el canal Nav1.2 que se encuentra en el cerebro y una baja afinidad por el canal cardiaco Nav1.5. Debido a la homología de estos canales, se construyeron quimeras Nav1.2/Nav1.5 sustituyendo regiones de las “asas” externas de los canales. Sobre las quimeras se determinó la afinidad de la toxina CssIV, en el grupo de experimentos detectaron residuos importantes en la interacción toxina-canal Nav en las “asas” que unen a los segmentos S1-S2 y S3-S4 (Cestèle et al., 1998). En este trabajo también se demostró que la toxina beta no afecta el comportamiento normal de los canales Nav durante los protocolos de activación, a menos que se aplique un pulso despolarizante antes de iniciar dichos protocolos (Cahalan 1975; Wang et al., 1983). Con estos resultados se propuso que la toxina se une al sitio 4: asas S1- S2 y S2-S4 (En las proximidades del sensor de voltaje IIS4: Fig. 2), al aplicar un pulso despolarizante los sensores de voltajes se desplazan al exterior, en este momento la toxina beta atrapa al sensor de voltaje IIS4 y lo mantiene en el estado activo (Fig. 3). En el 2004 Karbat y colaboradores analizaron la participación de los residuos con carga de la toxina de insecto Bj-xtrIT (toxina beta del alacrán Bothotus judaicus) en la afinidad a canales de sodio de cucaracha (Periplaneta americana) y en la toxicidad sobre larvas de mosca (Sarcophaga faculata). En este proyecto se generaron mutantes de la toxina sustituyendo los residuos cargados por alanina, por residuos polares, hidrofóbicos o de carga opuesta, en sus experimentos detectaron que la mutante E15R tenía una afinidad 10 veces menor que la toxina nativa, y sorprendentemente, la toxicidad (DE50) de esta variante disminuyó más de 13,500 veces. De acuerdo a este resultado se propuso que la toxina se une al canal en estado de reposo, después de la despolarización de la membrana, el sensor DIIS4 se desplaza al exterior (para llevar al canal al estado abierto) y es atrapado por la toxina. Además, se propuso que en el atrapamiento del sensor de voltaje, el glutamato E15 de la toxina participa estableciendo interacciones iónicas con las argininas externas del 6 sensor (DIIS4), de esta manera el sensor no puede regresar al interior y se potencia la activación del canal (Karbat et al., 2004). Cohen y colaboradores en el 2005 comprobaron la participación del glutamato E15 de la toxina CssIV (toxina beta del alacrán Centruroides suffusus suffusus) en la modificación del comportamiento de los canales de sodio Nav, en su trabajo encontraron que la variante CssIV_E15R presentó una reducción en la afinidad al canal en aproximadamente 3 veces con respecto a la toxina nativa, además, mediante ensayos electrofisiológicos notaron ausencia de actividad de esta variante sobre canales Nav1.2 a una concentración de 10 μM, en cambio el efecto de la toxina nativa CssIV fue muy evidente a concentraciones de 2.5 μM. Los resultados que obtuvieron apoyan el mecanismo del atrapamiento del sensor de voltaje con la trascendente participación del glutamato E15 en el proceso, el cual establece un puente salino con las argininas externas del sensor de voltaje (DIIS4) (Cohen et al., 2005). En el 2009 Hernández-Salgado inmunizó conejos Nueva Zelanda con la variante CssII_E15R (variante de la toxina beta CssII del alacrán Centruroides suffusus suffusus) como propuesta para generar anticuerpos con antígenos de baja toxicidad, los anticuerpos que se obtuvieron fueron capaces de neutralizar a las toxinas nativas CssII y Cn2 (Toxina beta del alacrán Centruroides noxius). En la caracterización de la variante CssII_E15R se detectó que está no es tóxica a concentraciones de 30μg/20g de ratón en administración intraperitoneal (Hernández et al., 2009), esta dosis es elevada con respecto a la dosis letal 100 (DL100) de la toxina recombinante de CssII determinada de 6μg/20g ratón en administración intraperitoneal (Estrada et al., 2007). Por otra parte Campos y colaboradores en el 2007 realizaron una serie de experimentos para seguir el movimiento del sensor de voltaje DIIS4 del canal Nav1.4 mediante espectroscopía de fluorescencia. Para lo cual, se marcó el “asa” S3-S4 del dominio II con un fluoróforo. Los registro se hicieron en ausencia y presencia de la toxina Ts1 (toxina beta del alacrán Tityus serrulatus). Los resultados permitieron confirmar el atrapamiento del sensor DIIS4 ya que en presencia de la toxina no fue posible detectar movimiento del “asa” marcada (y por lo tanto del sensor DIIS4), lo que si ocurrió en ausencia de la toxina Ts1. En este trabajo también fue posible concluir que el atrapamiento del sensor de voltaje DIIS4 7 ocasiona un efecto de cooperatividad en los sensores S4 de los otros dominios (DI, DIII y DIV) favoreciendo la activación del canal a potenciales más negativos (Campos et al., 2007). Sorprendentemente, la toxina beta Ts1 de 61 aminoácidos comparte solamente cerca del 40% de identidad con toxinas beta del género Centruroides y no requiere de un prepulso despolarizante para producir la activación de los Nav a potenciales más negativos (Campos et al., 2007; Pinheiro et al.,2003). Figura 2: Sitio de interacción del canal Nav con las toxinas beta. Las flechas indican el sitio 4, el cual está formado por las asas S1-S2 y S3-S4 del dominio II, en verde se marca el sensor de voltaje S4 del mismo dominio (Tomado de Cestéle et al., 1998). 8 Figura 3. Modelo del mecanismo del atrapamiento del sensor de voltaje. La toxina beta se une al canal en estado de reposo. Cuando el canal recibe un estímulo despolarizante, el sensor de voltaje se desplazan al exterior, en ese momento la toxina atrapa al sensor S4(DII) y lo mantiene en estado activo (Tomada de Cestéle et al., 1998). 2. ANTECEDENTES En México, una de las especies de alacrán más conocidas por ocasionar intoxicaciones graves en humanos es Centruroides suffusus suffusus, conocido como el alacrán de Durango (Martin et al., 1987). El veneno de este alacrán está constituido por varias toxinas, predominando la toxina CssII por ser mayoritaria con más del 1.2% del veneno total (La fracción tóxica soluble representa el 1.78%) y por ser la más tóxica con una dosis letal media (DL50) de 0.7μg/20g de ratón por vía intraperitoneal (Martin et al., 1987). En la siguiente tabla se presentan ejemplos de las toxinas más abundantes en el veneno de alacranes del género Centruroides (presentes en México) y de la especie Tityus serrulatus (presente en Sudamérica) (Tabla 2) La toxina CssII presenta una estructura α/β estabilizada por puentes disulfuro (Fig. 4). Es un péptido de 66 aminoácidos, incluye 8 cisteínas que forman cuatro puentes disulfuro lo que le da un arreglo empacado y resistente a varios factores como la temperatura y degradación por algunas proteasas (Possani et al., 1999). La toxina CssII está amidada en el carboxilo terminal y se une con afinidad de 0.1 nM al sitio 4 de los Nav1.6. 9 Tabla 2, Ejemplos de toxinas más abundantes en algunos alacranes del género Centruroides y la especie Tityus serrulatus Toxina Especie LD50 (Intraperitoneal) LD50 (Intracraneal) % del veneno Referencia CssII Centruroides suffusus suffusus 0.7μg/20g ratón 5ng/20g ratón >1.2% Martin et al., 1987Cn2 Centruroides noxius 0.4μg/20g ratón 0.25μg/20g ratón -- -- -- -- Pintar et al., 1999 Riaño-Umbarila et al., 2013 Cll2 Centruroides limpidus limpidus -- 1.5% Riaño-Umbarila et al., 2013 Cll1 Centruroides limpidus limpidus 1.7μg/20g ratón -- 0.5% Riaño-Umbarila et al., 2013 Ts1 Tityus serrulatus 1.52μg/20g ratón -- -- Arantes et al., 1989 En el 2007, Estrada y colaboradores expresaron heterólogamente la toxina recombinante CssII, la cual presentó una constante de afinidad a los Nav1.6 de 1.5 nM, es decir, 15 veces menos afín que la toxina nativa. Este dato indicó que la amidación del carboxilo terminal en la toxina nativa CssII es muy importante en la interacción con este receptor Nav (Estrada et al., 2007). Posteriormente Estrada y colaboradores en el 2011 notaron que algunas toxinas alfa y beta de alacrán presentaban amidación y aminoácidos básicos en el carboxilo terminal. Por lo que de manera general estas toxinas presentan un C- terminal cargado positivamente, característica que no se presentaba en la toxina recombinante rCssII antes analizada, ya que la falta de amidación ocasiona una carga negativa en el carboxilo. En su trabajo se propuso que el aumento de residuos básicos en el carboxilo terminal de CssII aumentaría la carga positiva y podría compensar la falta de amidación del C-terminal. Con el fin de probar esta hipótesis construyeron mutantes, dentro de las cuales encontraron que la CssII[T64R/N66R] presentaba actividad sobre el Nav1.6 comparable con la toxina nativa CssII. El resultado permitió aseverar que el aumento de cargas positivas en el C-terminal de CssII puede mejorar la actividad sobre el canal Nav1.6 (Estrada et al., 2007; 2011, Fig. 4). 10 Figura 4. Corrientes iónicas de canales de sodio Nav1.6 en presencia de la toxina nativa nCssII, la toxina recombinante rCssII y mutantes de CssII. El control sin toxina (Círculos negros), después de la aplicación de 500nM de nCssII (Círculos blancos) y con estrellas la variante analizada de CssII T64R/N66R (Tomado de Estrada et al., 2011). En el 2010 Vandendriessche y col., caracterizaron la actividad de la toxina CeII9 del alacrán Centruroides elegans sobre subtipos de canales Nav, en el desarrollo de sus experimentos encontraron que esta toxina afecta de manera específica a los canales Nav1.4 (Vandendriessche et al., 2010). De igual manera, Schiavon y colaboradores en el 2011, caracterizaron mediante ensayos electrofisiológicos varias toxinas beta, entre ellas la toxina CssII, analizando sus resultados se pudo observar que esta toxina afecta preferentemente al canal de sodio Nav1.6. Este conjunto de datos resultaron interesantes por el hecho de que las toxinas (CssII y CeII9) presenta solamente 10 aminoácidos diferenciales en su secuencia de los 66 y 67 residuos correspondientes. Al analizar en un alineamiento las secuencias de estas y otras toxinas beta del género Centruroides, se observa que los residuos de las posiciones 7-9 son poco conservados y generaron la idea de que estas posiciones pueden estar asociadas a la especificidad hacia diferentes subtipos de canales Nav (Tabla 3). 11 Tabla 3. Alineamiento de secuencias de toxinas de alacrán del género Centruroides y los subtipos de canales Nav a los cuales reconocen mayormente (Schiavon et al., 2006; 2012; Vandendriessche et al., 2010). Toxina Secuencia primaria Subtipo Nav 1-------10 11------20 21------30 31------40 41------50 51------60 61---66 Css2 KEGYLVSKST GCKYECLKLG DNDYCLRECK QQYGKSSGGY CYAFACWCTH LYEQAVVWPL PNKTCN 1.6 CeII9 KEGYLVNHST GCKYECFKLG DNDYCLRECR QGYGKGAGGY CYAFGCWCTH LYEQAVVWPL PKKTCNA 1.4 Cn2 KEGYLVDKNT GCKYECLKLG DNDYCLRECK QQYGKGAGGY CYAFACWCTH LYEQAIVWPL PNKRCS 1.1, 1.2, 1.5, 1.6 Cn8 KEGYIVNYYT GCKFACAKLG DNDYCLRECK ARYGKGAGGY CYAFGCWCTH LYEQAVVWPL PKKKCRA 1.1, 1.4, 1.5 Cll2 KEGYLVNHST GCKYECFKLG DNDYCLRECK QQYGKGAGGY CYAFGCWCNH LYEQAVVWPL PKKTCN 1.1, 1.4, 1.3, 1.4, 1.5 Css4 KEGYLVNSYT GCKFECFKLG DNDYCLRECR QQYGKGSGGY CYAFGCWCTH LYEQAVVWPL PNKTCN 1.1, 1.2, 1.6 ****:*. * ***: * *** *********: ***.:*** ****.***.* *****:**** *:* * Al hacer un análisis estructural de la toxina CssII (PDB: 2LI7; Fig. 5), se observó que los residuos serina 7 y lisina 8 se encuentran próximos al extremo C-terminal, del cual se ha demostrado su importancia en la afinidad de la toxina CssII por el canal Nav1.6 (Estrada et al., 2011). De la misma manera, los residuos 7 y 8 se encuentran próximos al residuo Glutamato E15, que es un residuo determinante en la actividad de las toxinas beta (Fig. 5), como se mencionó anteriormente, el Glu15 participa en el atrapamiento del sensor de voltaje del dominio II (IIS4) de los canales Nav (Cohen et al., 2005; Hernández-Salgado et al., 2009; Karbat et al., 2004). 12 Figura 5. Representación de la estructura primaria y terciaria de la toxina beta del alacrán CssII (PDB: 2LI7). Los residuos Glutámico 15 (rojo), Treonina 64 y Asparagina 66 (Amarillo) participan en la interacción con el canal Nav 1.6. En verde y azul se representa a los aminoácidos Serina 7 y Lisina 8 posibles residuos que dictan la especificidad de la toxina hacia el canal Nav 1.6. De acuerdo a lo anterior, se propuso generar variantes de la toxina CssII, modificando la serina de la posición 7 y la lisina de la posición 8 por los residuos correspondientes a la toxina CeII9. Las variantes propuestas fueron: 1) CssII[S7N], 2)CssII[K8H], así como una variante doble 3) CssII[S7N/K8H]. Con estos cambios se pretendió responder a la pregunta: ¿Es posible cambiar la especificidad de una toxina hacia el canal Nav1.6 a una toxina con especificidad hacia el canal Nav1.4? (ver Tabla 3). Debido a que en el sistema heterólogo utilizado para la expresión de las variantes no produce modificación postraduccional de amidación en el carboxilo terminal, se propuso generar tres mutantes más que corresponden a los péptidos antes mencionados pero incluyendo los cambios en los residuos Treonina 64 y Asparagina 66 por Argininas en el carboxilo terminal, esperando que estas variantes mantengan la afinidad que presenta la toxina nativa nCssII como lo demostraron Estrada y col., en el 2011. Las variantes fueron:4) CssII[S7N/T64R/N66R], 5) CssII[K8H/T64R/N66R], así como la variante 6) CssII[S7N/K8H/T64R/N66R]. 13 3. HIPÓTESIS La región N-terminal [posiciones 7 y 8] de la beta-neurotoxina CssII del alacrán Centruroides suffusus suffusus está involucrada en el reconocimiento de los canales Nav1.4 y Nav1.6. 4. OBJETIVOS 4.1. Objetivo general Analizar el efecto de las variaciones en los residuos 7 y 8 en el extremo N-terminal de la toxina CssII en su actividad hacia los canales Nav1.4 y Nav1.6. 4.2. Objetivos particulares Diseñar y expresar las construcciones variantes de la toxina CssII. Plegar in vitro y digerir los péptidos de fusión de CssII Evaluarla actividad de las variantes de CssII sobre los canales Nav1.4 y Nav1.6. 14 5. MATERIALES Y MÉTODOS Los reactivos empleados en este proyecto se obtuvieron con las compañías Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany), IBI Scientific (IA, USA), J.T. Baker Chemical (Pennsylvania, USA), Fermont (Monterrey, México), Becton, Dickinson and company (New Jersey, USA), Avantor performance material (Pennsylvania, USA), Química SON´S, S.A. de C. V., Laboratorios (Puebla, Puebla, México), Merck KGaA (Darmstadt, Germany), Qiagen N.V. (Venlo, Limburg, Netherlands). Las enzimas de restricción, ADN ligasas, ADN polimerasas, dNTP´s, Marcadores de peso molecular, Proteasa Factor Xa, IPTG, Vectores de clonación y expresión, se adquirieron con las empresas New England BioLabs (Beberly,MA, USA), Promega (Fitchburg, Wisconsin, USA) y Thermo Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) y Qiagen (Venlo, Limburgo, Netherlands). 5.1. Cepas, Vectores y Oligonucleótidos: 5.1.1. Cepas de E. coli (E. coli, genotypes, OpenWet Ware) Durante el desarrollo experimental se utilizaron diferentes cepas de E. coli: BL21, DH5α y XL1-Blue, sus genotipos son: BL21(DE3)F – ompT gal dcm lon hsdSB(rB - mB - ) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) DH5α:F - endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK - mK + ), λ– XL1-Blue: (Estratagene): endA1 gyrA96(nal R ) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F'[ ::Tn10 proAB + lacI q Δ(lacZ)M15] hsdR17(rK - mK + ). 15 5.1.2. Vectores Se emplearon el vector de clonación pGEM T-easy (Promega) y el vector de expresión pQE30 (Qiagen), Fig.6. Figura 6.A, Mapa del Vector pGEM-T (Promega): puntos referentes de la secuencia y B. Vector pQE30 (Qiagen). Tomados de los manuales correspondientes. 5.1.3. Oligonucleótidos Los oligonucleótidos utilizados en el desarrollo experimental se sintetizaron en la Unidad de síntesis y secuenciación de ADN del Instituto de Biotecnología de la UNAM. 16 5.2. Medios de cultivo y soluciones 5.2.1. Medios de cultivo Medio LB (Por litro): 10 g NaCl, 10 g Bacto Triptona, 5 g Extracto de levadura, pH 7. Medio LB/Amplicilina*: Medio LB + 100 µg/mL Amplicilina. Agar LB (Por litro): 10 g NaCl, 10 g Bacto Triptona, 5 g Extracto de levadura, 15g Bacto Agar, pH 7.0, cajas de Petri preparadas con 25mL. Agar LB/Ampicilina*: Agar LB + 100 µg/mL ampicilina, cajas de Petri preparadas con 25mL. Medio YT2X (Por litro): 16 g Bacto triptona, 10g Extracto de levadura y 5 g NaCl pH 7. Medio YT2X/Ampicilina*: Medio YT2X + 100 µg/mL Ampicilina. Agar YT2X (por litro) 16 g Bacto triptona, 10g Extracto de levadura y 5 g NaCl, 15 g Bacto Agar, pH 7.0, cajas petri preparadas con 25mL. Agar YT2X/Ampicilina*: (por litro) Agar YT2X + 100 µg/mL ampicilina, cajas petri preparadas con 25mL. 5.2.2. Soluciones para geles de agarosa (Sambrook et al., 1989) Amortiguador de corrida (Running buffer) TBE 5X, para geles de agarosa 1 L: 54 g de Tris base, 27.5 g Ácido bórico y 20 mL 0.5 M EDTA (pH 8). Solución de carga (Loading buffer) 6X: 0.25% azul de bromofenol, 0.25% de xileno cianol FF y 30% glicerol en agua. Gel de agarosa: Se prepara con Amortiguador de corrida TBE 1X y agarosa al porcentaje que se requiera. 17 5.2.3. Soluciones para geles de SDS-PAGE (Laemmli 1970) Amortiguador para gel concentrador: Tris-HCl 0.5M, pH 6.8 Amortiguador para gel separador: Tris-HCl 1.5M, pH 8.8 Solución poliacrilamida 30%: Acrilamida 29.2%, Bis-acrilamida 0.8% Detergente: SDS 10% Catalizador de la polimerización: Persulfato de amonio 10% Iniciador de polimerización: N,N,N´,N´-tetrametiletilendiaminta, TEMED A partir de estas soluciones se prepararon los geles concentrador y separador para SDS-PAGE Gel separador: Tris-HCl 0.3755M pH 8.8, Acrilamida 15%, SDS 0.1%, PSA 0.05%, TEMED (0.0333% v/v). Gel concentrador: Tris-HCl 0.125M pH 6.8, Acrilamida 4%, SDS 0.1%, PSA 0.05%, TEMED (0.0333% v/v). Amortiguador de corrida (Running buffer) 1X: Tris O.025 M pH 8.3, Glicina 0.192 M, SDS 0.1%. Amortiguador de carga (Loading buffer) 2X: Tris 0.125 M pH 8, SDS 4%, Glicerol 20%, 2-mercaptoetanol 10%, 0.05% Azul de bromofenol. Solución para teñir: Ácido acético (10% v/v), Metanol (40% v/v) y Azul de Coomassie R250 (0.2% m/v). Solución para desteñir: Ácido acético (10% v/v) y metanol (50 % v/v). 5.2.4. Soluciones de ensayos electrofisiológicos La solución extracelular contenía (mM): NaCl 130, KCl 5, MgCl2 2, HEPES 10, D-glucosa 5, pH 7.4. La solución estándar de la pipeta contenía (mM): N-metil-D- glucosamina 195, NaCl 10, MgCl2 2, EGTA 5, HEPES 10, pH 7.3 (Estrada et al., 2011) 18 5.3. Construcción de las variantes de la toxina CssII Las construcciones de CssII y CssII_T64R/N66R ensambladas en el vector pGEM (Promega) generadas por Estrada y cols. (2007, 2011) se utilizaron como templados para generar las variantes de la toxina CssII propuestas en este proyecto. 5.3.1. Diseño de los oligonucleótidos mutagénicos Con base en la secuencia de la toxina CssII se diseñaron tres oligonucleótidos para modificar los codones correspondientes a los aminoácidos de las posiciones 7 y 8 del amino terminal, sus secuencias se muestran a continuación. Los cambios se hicieron de acuerdo con el uso preferencial de codones de la cepa bacteriana E. coli (Tabla 4). Tabla 4. Secuencia de los oligonucleótidos diseñados para generar cambios de los codones correspondientes a los aminoácidos de las posiciones 7 y 8 del amino terminal de la toxina CssII. Oligo Secuencia (5´-3´) (pb) % GC Tm S7N CTG TGC TCT TGT TTA CCA GAT AGC 24 45.8 55.6°C K8H GCC TGT GCT ATG GCT TAC CAG 21 57.1 58.1°C S7N/K8H CAG CCT GTG CTA TGG TTT ACC AGA TAG 27 48.1 58.8 °C 5.3.2. Mutaciones sitio dirigidas. Para generar las variantes se utilizó mutagénesis sitio dirigida, con la metodología del Megaoligo o "Megaprimer" (Ke et al., 1997), el proceso se dividió en dos etapas; en la primera se amplificó un segmento del gen de la toxina CssII con los oligonucleótidos mutagénico S7N, K8H y S7N/K8H (Tabla 4) y con el oligo T7 (Que se alinea con la secuencia del promotor T7 de pGEM: Fig.7, Tabla 5). En la segunda etapa, se utilizó el amplicón de la primera reacción de PCR como oligonucleótido (Megaoligo) en conjunto 19 con el oligo SP6 (Fig. 7, Tabla 5) para amplificar los genes mutantes completos. La metodología se hizo de acuerdo al esquema de la figura 8. Figura 7. Secuencias promotoras de T7, SP6 y el sitio múltiple de clonación del vector pGEM-T (Promega). Para las amplificaciones realizadas se utilizaron las siguientes condiciones: 200 μM dNTP´s, 250 nM de cada oligonucleótidos, 1U de enzimaVent ADN polimerasa/100 μL de reacción (New England) ó Pfu DNA polimerasa (Thermo Scientific), 1-2 ng de ADN plasmídico/100μL de reacción. Las reacciones se realizaron en un Termociclador AppliedBiosystems 2720 en tres ciclos: el primero es de desnaturalización a 95ºC por 5 min, seguido de 30 ciclos de 30 s a 95 ºC, 30 s a 54.5 ºC y 30 s a 72 ºC y finalmente un ciclo de extensión a 72 ºC por 10 min. Los tamaños esperados de los segmentos amplificados de la primera etapa fueron: 127 pb con el oligo S7N, 126 pb con el oligo K8H y 131 pb con el oligo S7N/K8H. Los productos de PCR se corrieron en geles de agarosa al 1%, se tiñeron con bromuro de etidio y se visualizaron en el transiluminador NEW ENDURO TM UV, los productos de PCR (megaoligos) se purificaron mediante el sistema de extracción de DNA (Qiagen) y se utilizaron para amplificar los genes completos, se emplearon 100-150 ng de cada megaoligo y 40 pmol del oligonucleótido SP6 por reacción de 100 μL bajo las condiciones antes mencionadas. 20 Figura 8. Esquema de la generación de las variantes por medio de mutaciones sitio dirigidas, con la metodología del Megaoligo o "Megaprimer" (Modificado de Keet al., 1997). Tabla 5. Secuencia de los oligonucleótidos externos al sitio de clonación en el vector pGEM-T. Oligo Secuencia (5´-3´) (pb) % GC Tm T7 TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 20 40 47.5 SP6 ATT TAG GTG ACA CTA TAGAA 20 30 42.3 5.4. Clonación de los genes mutantes en el vector pGEM-T Inmediatamente después de la reacción de PCR, los genes mutantes amplificados se sometieron a un ciclo de 10 min a 72°C con Taq polimerasa (New England Biolab) para que agregar una Adenina en los extremos 3´, con esto fue posible ensamblar las construcciones mutantes en el vector pGEM-T (Promega), la clonación se hizo de acuerdo a las recomendaciones del proveedor.21 5.5. Transformación de la cepa E. coli DH5α La cepa de E. coli DH5α se transformó por medio de choque térmico, se utilizaron tubos con 100 µL de células químico-competentes a las cuales se adicionó 30-40 ng de cada plásmido CssII-pGEM (Construcciones variantes de CssII) concentrado, las muestras se agitaron suavemente y se incubaron en hielo por 15 min, después se incubaron a 42ºC durante 2 min y por último se mantuvieron en hielo por 10 min, para continuar, se adicionó 1 mL de medio líquidoYT2X y se mantuvieron a 37 ºC con agitación de 120 rpm por 1 h. Las células se sembraron en medio sólido YT2X (200 µg/mL de ampicilina), los cultivos se incubaron a 37ºC de 12 a 16h. Se seleccionaron algunas clonas para confirmar la presencia de los genes en el vector pGEM amplificando con los oligos T7 y SP6 (Fig. 7, Tabla 5). El tamaño de los productos de la reacción se analizó en geles de agarosa al 1%, posteriormente se extrajo plásmido de los cultivos con el sistema de aislamiento de Roche. Los plásmidos se secuenciaron en la unidad de síntesis y secuenciación de ADN del Instituto de Biotecnología de la UNAM, la secuenciación se basó en el método de Sanger, en un proceso de amplificación se emplea una polimerasa termoestable que usa terminadores fluorescentes. 5.6. Análisis de secuencias El análisis de las secuencias obtenidas se hizo con el software BioEdit v7.2.3 (Ibis Biosciences, Carlsbad, CA). En el análisis se buscó la presencia de la secuencia de los genes mutantes, los codones que codifican para los aminoácidos reconocidos por la proteasa Factor Xa, los sitios de corte para las enzimas BamHI y PstI, así como los codones de paro. 22 5.7. Subclonación de los genes en el vector de expresión pQE30 El vector pGEM con las construcciones variantes de CssII y el vector pQE30 se digirieron con las enzimas de restricción BamHI y PstI (New England, Biolabs) de acuerdo a las recomendaciones del proveedor, los fragmentos liberados y el vector pQE30 digeridos se separaron en geles de agarosa al 1% y se purificaron con el kit de extracción QIAquick Gel Extraction (Qiagen). Los genes mutantes se ligaron al vector de expresión pQE30 utilizando la enzima T4 ligasa (ThermoScience). La transformación se hizo mediante choque térmico, se emplearon aproximadamente 10 ng de ADN plasmídico, se utilizaron células químico-competentes de la cepa XL1Blue de E. coli (100 μL de células), las transformantes se crecieron en medio sólido con antibiótico y se analizaron por PCR para confirmar el tamaño del inserto. Las clonas con el producto de PCR del tamaño esperado se crecieron en medio líquido LB con ampicilina (100 μg/mL), se analizaron los lisados completos y las fracciones insolubles de las células en SDS-PAGE. Por último, se extrajo plásmido de las clonas que presentaron mejor expresión para mandar secuenciar. Las construcciones en el vector de expresión pQE30 presentaron el arreglo indicado en la Figura 9. 23 Figura 9. Esquema de la construcción de las variantes de CssII en el vector de expresión pQE30. El promotor T5 es inducible por IPTG, su regulación se encuentra bajo el promotor trc, el cual es regulado por el gen que codifica para el represor Lac (lacIq). También contiene un gen que le confiere resistencia a ampicilina. Los genes que codifican para las variantes de la toxina CssII se expresaron fusionados al sitio IEGR que es el sitio de corte reconocido por la proteasa factor FXa, a un segmento de 6 Histidinas y a 4 aminoácidos del inicio del péptido. 5.8. Condiciones de expresión La cepa E. coli BL21 (DE3) se utilizó como huésped para la expresión de las variantes de la toxina CssII. Las células químico-competentes se transformaron con 100 ng de ADN plasmídico por medio de choque térmico. Con las transformantes obtenidas se prepararon cultivos pequeños en medio LB con ampicilina (100 µg/mL) para inocular matraces con 500 mL de medio LB (ampicilina 100 µg/mL) y se iniciaron los crecimientos con densidades celulares ópticas de 0.05 (Determinada a 600 nm). 24 Los cultivos inoculados se incubaron a 37 °C y 200 rpm, hasta alcanzar una D.O. cercana a 0.6 (Determinada a 600 nm), en ese momento se indujo la expresión con IPTG a una concentración final de 1 mM y se mantuvieron el crecimiento por 8 h más. A continuación, los cultivos se centrifugaron a 6,500 rpm durante 10 min a 4 °C en botes para centrífuga de 250 mL. El paquete celular se lavó con 200 mL de una solución de Tris 50 mM, pH 8 y se centrifugó nuevamente a 6,500 rpm por 10 min a 4°C. Las células se resuspendieron en 25 mL de Tris 50 mM, pH 8 adicionado con 0.1 mg lisozima/mL, se incubaron en hielo por 30 min, después del reposo las suspensiones se sometieron a una sonicación de 6 minutos efectivos: ciclos de 40 s de sonicación y 20 s de reposo. El proceso de sonicación se repitió tres veces con una separación de 10 min, las muestras se mantuvieron en hielo todo el proceso. El extracto resultante se centrifugó a 8,000 rpm por 20 min, se separó el sobrenadante. La pastilla se lavó con 20 mL de Tris 20 mM pH 8, se centrifugó nuevamente a 8,000 rpm por 20 min, se eliminó el sobrenadante y se realizó un lavado más. La pastilla resultante se trató con 15 mL de una solución caotrópica de Tris 50 mM, 6 M de cloruro de guanidinio pH 8 para extraer la proteína insoluble de los cuerpos de inclusión, la muestra se mantuvo en agitación suave por 4h a Temperatura ambiente. Finalmente se centrifugó a 8,000 rpm a 4°C durante 1h. El sobrenadante contenía la proteína de interés. 5.9. Purificación de los péptidos de fusión Los péptidos de fusión se purificaron en columnas de afinidad a Níquel (resina Ni-NTA agarosa: QIAGEN) en condiciones desnaturalizantes, siguiendo las recomendaciones del fabricante. En una columna de 10 mL se empacaron 2-4 mL de la resina Ni-NTA, la resina se equilibró pasando 10 volúmenes de Tris 50 mM pH 8, Cloruro de guanidinio 6 M. Una vez equilibrada la columna, se pasó el extracto proteico varias veces para favorecer la unión de los péptidos de fusión a la columna, a continuación, se hizo un lavado con 5 volúmenes de Tris 50 mM, Cloruro de guanidinio 6 M, Imidazol 30 mM pH 8. Por último, se hizo la elusión de los péptidos de fusión con Tris 50 mM pH 8, Cloruro de guanidinio 6 M e Imidazol 400 mM pH 8. La elusión se colectó en 4-5 alícuotas de 1.5 mL cada una (Fig. 10). Los péptidos de fusión se redujeron con 100 mM de DTT por 30 min a temperatura ambiente y se purificaron por HPLC de fase reversa, usando como solvente A) 0.12 % de 25 TFA en H2O y solvente B) 0.1% TFA en acetonitrilo. La separación se hizo con una columna C8 semipreparativa y una columna C18 analítica usando un gradiente de 20 a 60% de solvente B en un tiempo de 40 min con un flujo de 2 y 1 mL/min respectivamente, los registros de los cromatogramas se hicieron usando longitudes de onda de 230 y 280 nm. Para los péptidos obtenidos en los plegamientos in vitro se usaron las mismas condiciones de HPLC en fase reversa (Estrada et al., 2007). Figura 10.Esquema de la purificación de los péptidos de fusión en columnas de afinidad a Níquel. 26 5.10. Electroforesis de proteínas Las proteínas se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) de acuerdo al método de Laemmli (1970). Se utilizó una cámara de Amersham Biosciences (Hoefer SE 250), con geles de 1 mm de espesor. Un gel concentrador al 4% que precede al gel separador al 15%. Las muestras analizadas se incubaron durante 5 min a 95 °C en presencia de una solución desnaturalizante que contenía Tris-HCl 0.125 M pH 6.8, SDS al 4%, glicerol al 20%, β-mercaptoetanol 10% y azul de bromofenol 0.05% (m/v). La migración proteínica se efectuó en un voltaje de 80V. Después de la corrida,el gel se tiñó con una solución de: ácido acético (10% v/v), metanol (40% v/v) y azul de Coomassie R250 (0.2% m/v) y se incubó en agitación por 1h. Posteriormente, se realizó el desteñido en una solución de ácido acético (10% v/v) y metanol (50% v/v) para quitar el exceso de colorante. 5.11. Plegamiento “in vitro” 5.11.1. Plegamiento de péptidos de fusión reducidos Los péptidos de fusión reducidos con DTT y purificados por HPLC se secaron en una centrífuga de secado por vacío Savant y se sometieron a condiciones de plegamiento: Cloruro de guanidinio 2M, Tris 50mM pH 8, GSH:GSSG 1mM:0.1mM, 100µg de proteína/mL, la mezcla de reacción se mantuvo a 4°C durante 24 h antes de analizar nuevamente por HPLC de fase reversa de acuerdo a Estrada y cols. (2007). 27 5.11.2. Plegamiento de péptidos de fusión oxidados. Como estrategia alterna para mejorar la eficiencia del proceso, se propuso realizar los plegamientos directamente con las elusiones obtenidas de las columnas de Níquel (Elusión de columna de Níquel: 50 mM Tris pH 8, Imidazol 400 mM, 6M Cloruro de Guanidinio, 1-2 mg péptidos/mL). Para ello se colectaron las elusiones en un mismo recipiente, esta elusión total se diluyó con dos volúmenes de Tris 50 mM pH 8, así, la concentración de cloruro de Guanidinio se redujo a 2 M y la concentración del Imidazol a 133 mM. Por último, se agregó glutatión reducido GSH para alcanzar una concentración final 10 mM y Glutatión oxidado (GSSG) para una concentración final de 1mM. La mezcla de reacción se mezcló suavemente y se mantuvo a 0°C por 48h. Después se purificó la isoforma mayoritaria por medio de HPLC de fase reversa. Las especies GSH y GSSG se utilizaron en concentraciones 10 mM y 1 mM respectivamente, debido a que durante los ensayos se observó que favorecía considerablemente la reacción de plegamiento. 5.12. Espectrometría de masas. Las masas moleculares de los péptidos reducidos y plegados se determinaron en el equipo Electrospray/ESILCQ Fleet de Thermo Scientific con la ayuda del Dr. Fernando Zamudio. Algunos de las variantes se mandaron a analizar también por espectrometría de masas en el equipo de alta resolución LC-MS bomba de nanoflujo EASY-nLC II (Thermo- Ficher) acoplado a un espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap Velos (Termo-Ficher) con sistema de ionización tipo nano-electrospray (ESI) en la unidad de proteómica del Instituto de Biotecnología de la UNAM. 28 5.13. Ensayos de toxicidad en ratones CD1: Administración intracraneal Las pruebas de toxicidad se realizaron vía intracraneal (IC) en ratones de la cepa CD1 hembras y machos de aproximadamente 20 g de peso, los ratones se anestesiaron con éter etílico dentro de una cámara (para facilitar el procedimiento). Se administró por separado 2 µg de cada péptido de fusión (6His-Variante de CssII) disueltos en agua destilada estéril (1µg/µL) a cada ratón, para el ensayo se utilizó una microjeringa Hamilton de 10 µL que poseía un capilar de plástico sobre la aguja, de modo que solo quedaba expuesto 3 mm para penetrar el cráneo de los ratones. Los ratones se colocaron sobre una superficie plana y la aguja se introdujo en el centro de la cabeza, a la altura intermedia entre el ojo y la oreja, al ratón control se le administró 2 μL de agua destilada estéril. El desenlace de la intoxicación se registró durante los 30 minutos post-inyección. 5.14. Digestiones de los péptidos de fusión. Las digestiones de los péptidos de fusión se realizaron con la proteasa Factor Xa (New England BioLabs), se emplearon 1 y 2µg de Factor Xa por 50µg de péptido de fusión en volúmenes de 50µL de reacción, se utilizaron temperaturas de 23, 30 y 37ºC por 24 horas. 5.15. Ensayos electrofisiológicos Los ensayos electrofisiológicos se realizaron con células embrionarias de riñón humano HEK293 (Human embryionic kidney) que expresan de manera estable el canal de sodio dependiente de voltaje Nav1.6 y células de ovario de hamster chino CHO (Chinese hamster ovary) que expresan de manera estable el canal de sodio Nav1.4. de acuerdo a la metodología empleada por Estrada y cols. (2011). La solución extracelular contenía (mM): NaCl 130, KCl 5, MgCl2 2, HEPES 10, D-glucosa 5, pH7.4. La solución estándar de la pipeta contenía (mM): N-metil-D-glucosamina 195, NaCl 10, MgCl2 2, EGTA 5, HEPES 10, pH7.3. 29 En los experimentos se utilizó la técnica de Patch-clamp en la configuración de célula completa (Whole cell) usando un amplificador MultiClamp 700B y el softwarepClamp10 (Molecular Device, USA). Las pipetas tuvieron una resistencia 3-5 MΩ. Las corrientes se obtuvieron con protocolos despolarizantes que iniciaron con un pulso despolarizante de 50 mV seguidos de una serie de voltajes de -100 mV a +20 mV, se usó un potencial de mantenimiento de -120 mV durante cada registro y de -90 mV durante el reposo (Fig. 11). Con este protocolo se evaluó el efecto de las variantes de CssII_K8H, CssII_K8H_T64R/N66R, de los controles CssII_T64R/N66R y la toxina CeII9 del alacrán Centruroides elegans a concentraciones de 600nM. Así también, se probaron todas las variantes y el control CssII_T64R/N66R a 1.2µM. La adquisición y procesamiento de los datos se realizó utilizando los programas pClamp (Versión 10.0, Axon Instruments Co., USA) y Origin (versión 7.0 Microcal software, MA). Figura 11. Ensayos electrofisiológicos en canales Nav: A)Esquema representativo de la técnica de Patch-clamp, configuración de célula completa (Whole-cell), B) Protocolo de activación utilizado para los canales de sodio Nav. 30 6. RESULTADOS 6.1. Amplificación de los genes mutagénicos Los amplificados de la primera reacción de PCR presentaron una migración inferior a las 200 pb, próximo al tamaño teórico: MPS7N 127 pb, MPK8H 126 pb y MPS7N/K8H 131 pb (Fig. 12A). Después de la purificación de los megaoligos, se procedió a la amplificación de los genes completos, para ello, se emplearon 100-150 ng de cada megaoligo y 40 pmol del oligonucleótido SP6 por reacción de 100 μL. En el gel de agarosa se observaron productos con una migración inferior a 500 pb. Los productos amplificados tenían un tamaño teórico de 390 pb (Fig. 12B). Figura 12. Electroforesis en agarosa al 1% de los amplificados: A. los Megaoligos o Megaprimers mutagénicos MPS7N/K8H, MPK8H y MPS7N. B. amplificación de las variantes de CssII usando los Megaoligos mutados de la primera reacción. A B 31 6.2. Clonación en el vector pGEM-T El tamaño de las construcciones en el vector pGEM se confirmó mediante PCR. Los productos de la reacción fueron próximos a 400 y 500 pb (Fig. 13) como se esperaba (Tamaño teórico 390 y 482pb). En el proceso se seleccionaron plásmidos que presentaron productos de amplificación cercanos a 500 pb para secuenciar. Figura 13. Electroforesis de agarosa al 1% de los productos de la PCR de las clonas resultantes de la ligación del inserto CssII_S7N en el vector pGEM-T. 6.3. Secuenciación de DNA Los electroferogramas obtenidos en el proceso de secuenciación se analizaron con el programa BioEdit v7.2.3 (Ibis Biosciences, Carlsbad, CA), en las construcciones en pGEM se confirmaron: Secuencia del gen mutante, codones de paro, sitios de corte para la enzimas de restricción BamHI y PstI así como los codones codificantes para la secuencia de aminoácidos reconocida por la proteasa Factor Xa. En la Figura 14 se esquematiza el ejemplo de la secuencia obtenida para la construcción CssII_S7N/K8H en pGEM. En el proceso fue posible confirmar las construcciones para las seis variantes (Fig. 14; Tabla 6). 32 Figura 14. Secuencia nucleotídica codificante para la variante CssII_S7N/K8H. En verde se señalan los sitios reconocidos por las enzimas de restricción (BamHI GǀGATCC y PstI
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