Analisis-de-una-librera-binaria-de-mutantes-de-NPR

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO EN CIENCIAS BIOQUíMICAS
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGíA
ANÁLISIS DE UNA LIBRERÍA BINARIA DE 
MUTANTES DE NPR
T E S I S
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:
MAESTRO EN CIENCIAS
P R E S E N T A
L.C.G. VITO ADRIÁN CANTÚ ALESSIO ROBLES
DIRECTOR DE TESIS:
Dr. FRANCISCO XAVIER SOBERON MAINERO
Instituto de Biotecnología, UNAM
INTEGRANTES DE COMITÉ TUTOR:
Dr. RUBEN PAUL GAYTAN COLIN
Instituto de Biotecnología, UNAM
Dr. GILLERMO GOSSET LAGARDA
Instituto de Biotecnología, UNAM
CUERNAVACA, MORELOS JUNIO 2013
 
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Integrantes de jurado de examen
Presidente
Dr. Lorenzo Segovia Forcella Instituto de Biotecnología, UNAM 
Secretario
Dr. Mrcela Ayala Aceves Instituto de Biotecnología, UNAM
Vocal
Dr. Nina Pastor Colón Facultad de ciencias, UAEM
Vocal 
Dr. Gabriel Del Rio Guerra Instituto de fisiología celular, UNAM
Vocal
Dr. Enrique Merino Perez Instituto de Biotecnología, UNAM
Este trabajo esta dedicado a:
Mis jefes (Padres)
Yina
Mi Hermano
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue realizado en el laboratorio del Dr. Xavier Soberon Mainero ubicado en el Instituto de 
Biotecnología, campus Morelos de la Universidad Nacional Autónoma de México con recursos 
aportados por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT).
Mi sincero agradecimiento al Dr. Xavier Soberon por asesorarme a lo largo de estos años y darme el 
espacio y la libertad de elegir mi camino.
Agradezco también Flores, Fily y Joel por formarme en las obscuras y misteriosas artes de la biología 
molecular. A Gloria Saab, por mantener al consorcio SOS (¡vaya nombre!) unido en las buenas y en las 
malas.
A los Doctores Paul Gaytan, Guillermo Gosset, Nina Pastor, Marcela Ayala, Enrique Merino, Gabriel 
Del Río y Lorenzo Segovia por su dedicación al leer y criticar mi trabajo. Sus opiniones y 
observaciones enriquecieron mucho este trabajo (y evitaron una serie de penosas faltas ortográficas)
A todos mis compañeros de laboratorio, especialmente a Tatiana por ser una muy decente compañera 
de mesa. A mis compañeros de generación de la maestría.
A Yina por escucharme y sacarme a pasear cuando la mi frustración aumentaba. 
A Patrick, Leo, Ana y Ronan por su amistad.
A los miembros de la unidad de docencia: Rudiño, Jalil, Toño y Gloria.
 
Índice de contenido
RESUMEN.................................................................................................................................................1
INTRODUCCIÓN.....................................................................................................................................3
Represión catabólica del carbono..........................................................................................................3
El sistema PTS.......................................................................................................................................4
Enzima 1...........................................................................................................................................5
HPr....................................................................................................................................................6
Complejos EII...................................................................................................................................6
Organización del PTS.......................................................................................................................7
Regulación del metabolismo del carbono...........................................................................................10
Regulación de la transcripción por Crp/cAMP ..............................................................................11
Regulación de cyaA y transcripción de crp....................................................................................12
El sistema PTS nitrógeno....................................................................................................................13
Conexión entre el metabolismo del carbono y el metabolismo del nitrógeno....................................15
ANTECEDENTES...................................................................................................................................17
HIPÓTESIS..............................................................................................................................................23
OBJETIVOS............................................................................................................................................23
DISEÑO EXPERIMENTAL....................................................................................................................23
Construcción de librería binaria..........................................................................................................25
Construcción de la librería..............................................................................................................25
Oligonucleótidos mutagénicos........................................................................................................26
Plásmido PZE12-TrpF-Luxp..........................................................................................................27
Probar construcción........................................................................................................................28
Transformación de la librería..............................................................................................................29
Selecciones y plásmidos......................................................................................................................30
Aclimatar cultivos...............................................................................................................................30
Secuenciación Sanger..........................................................................................................................31
Resumen de secuencias.......................................................................................................................32
DISEÑO MODELADO COMPUTACIONAL........................................................................................33
RESULTADOS........................................................................................................................................35
Comparación entre PJET y la hipótesis nula.......................................................................................35
Efecto del tamaño de muestra en la inferencia estadística..................................................................36
Comparación entre PJET y LB ...........................................................................................................37
Comparación entre LB y MTL............................................................................................................38
MODELO.................................................................................................................................................39
CONCLUSIONES...................................................................................................................................41PERSPECTIVAS......................................................................................................................................41
Metodología secuenciación masiva.....................................................................................................42
MÉTODOS..............................................................................................................................................45
Cepas...................................................................................................................................................45
Medios.................................................................................................................................................45
LB...................................................................................................................................................45
M9...................................................................................................................................................45
Sales m9(5X)..................................................................................................................................46
Medio mínimo M9..........................................................................................................................46
i
SOC................................................................................................................................................46
GYT................................................................................................................................................47
Otros....................................................................................................................................................47
Oligonucleótidos split resin.................................................................................................................47
Armado de la librería...........................................................................................................................48
Plásmido PZE12-TrpF-LoxP...............................................................................................................49
Purificar plásmido PZE12...................................................................................................................51
Digerir.................................................................................................................................................53
Ligar....................................................................................................................................................53
Verificar librería..................................................................................................................................54
Transformar.........................................................................................................................................54
Oligonucleótidos secuenciación masiva..............................................................................................55
Platear cajas en medio sólido..............................................................................................................56
Seleccionar y extraer plásmido de 96 cepas........................................................................................56
Secuenciar...........................................................................................................................................56
PCR de cultivo.....................................................................................................................................56
Estadística............................................................................................................................................57
Secuencias...........................................................................................................................................57
BIBLIOGRAFÍA.....................................................................................................................................58
Índice de tablas
Tabla 1: Constantes de equilibrio del PTSglc............................................................................................9
Tabla 2: Resumen de secuencias..............................................................................................................32
Tabla 3: Comparación entre secuencias en pJET y la hipótesis nula.......................................................35
Tabla 4: Comparación entre PJET y LB..................................................................................................38
Tabla 5: Comparación entre LB y MTL...................................................................................................39
Tabla 6: Modelo del aporte de cada mutación a la actividad HPr............................................................40
Tabla 7: Funciones binarias......................................................................................................................43
Tabla 8: Oligonucleótidos para armar la librería......................................................................................48
Tabla 9: Oligonucleótidos forward con tag..............................................................................................55
Tabla 10: Oligonucleótidos reverse con tag.............................................................................................56
Índice figuras
Figura 1: Organización de distintos sistemas PTS en E. coli (105)..........................................................5
Figura 2: Organización del operón rpoN en distintos organismos...........................................................14
Figura 3: Alineamiento múltiple entre HPr, CPr y NPr...........................................................................17
Figura 4: Perfiles de crecimiento.............................................................................................................18
Figura 5: Interfaz HPr:EIIMtl..................................................................................................................18
Figura 6: Reconstrucción de interacciones proteína-proteína por docking molecular.............................20
Figura 7: Comparación en la actividad de las permeasas de glucosa y manosa......................................21
Figura 8: Diagrama de flujo del diseño experimental..............................................................................24
Figura 9: Distribución de los ocho oligonucleótidos que usaron para ensamblar la librería binaria.......25
Figura 10: Gel del plásmido TrpF-LuxP..................................................................................................27
ii
Figura 11: El plásmido pJET....................................................................................................................28
Figura 12: Variantes del plásmido pJET..................................................................................................29
Figura 13: Secuencias de variantes crecidas en MM/manitol..................................................................30
Figura 14: Secuencias de variantes crecidas en LB.................................................................................31
Figura 15: Diseño modelado computacional............................................................................................33
Figura 16: Efecto del tamaño de muestra en la inferencia estadística.....................................................36
Figura 17: Regiones variables de la librería binaria.................................................................................43
Figura 18: Producto de PCR de los oligonucleótidos con etiquetas........................................................44
Figura 19: Digestión de PZE12-TrpF-LuxP.............................................................................................51
Figura 20: Purificaciónde las bandas B y M...........................................................................................51
iii
RESUMEN
NPr y HPr son proteínas parálogas que participan en los sistemas de transferencia de fosfato PTS y 
PTSNtr respectivamente. El sistema PTS cataliza simultáneamente la entrada a la célula y la 
transformación a fosfoéster de un amplio número de carbohidratos mientras que el sistema PTSNtr esta 
implicado en la regulación del metabolismo del nitrógeno. A pesar de la similitud entre los 
componentes de ambos sistemas se ha observado muy poca reacción cruzada entre ellos. En el articulo 
adjunto se describe cómo el cambiar catorce aminoácidos de la superficie de NPr por los 
correspondientes en HPr le proveé a esta NPr quimérica (llamada CPr) la habilidad de interaccionar y 
transferir fosfatos a diversas permeasas de carbohidratos (EIIAs) ; actividad normalmente llevada a 
cabo por HPr. Adicionalmente se produjeron otras dos variantes: CPr6 con las primeras seis mutaciones 
y CPr8 con las ultimas ocho. CPr6 fue capaz de fosforilar sólo algunas de las EIIA que fosforila CPr. 
Cpr8 no mostró actividad.
El trabajo presentado en esta tesis pretende elucidar el aporte de cada una de estas catorce mutaciones a 
la interacción con diversas EIIA caracterizando una librería que contenga todas las variantes con una de 
estas catorce mutaciones, todas las variantes con dos, todas las variantes con tres etc... Esta librería se 
sintetizo usando el método de separación de resina que es capaz de introducir variación en un gen a 
nivel de codón. Es decir, para cada una de estas catorce posiciones existen solo dos posibles codones: 
mutante (el de HPr) o silvestre (el de NPr). Esta librería, denominada binaria, tiene 214=16384 
variantes.
La librería binaria se clonó, trasformó y creció en LB (control), MM/Mnt (medio mínimo más manitol), 
MM/Man (MM más manosa) , MM/Dul(MM más dulcitol), MM/Sbt(MM más sorbitol) y 
1
MM/Glc(MM más glucosa). Se secuenciaron variantes de cada medio. Solo se contaron con suficientes 
secuencias MM/Mtl para realizar un análisis estadístico que propone la mutación L13N como 
perjudicial a la actividad y la mutación A51K como benéfica. La falta de la mutación A51K podría 
explicar porque CPr6 no crece en manitol como fuente de carbono. 
Ya que el reducido tamaño de muestra nos impide formular más conclusiones, se calculó in silico la 
energía de interacción de cada una de las 16384 variantes con cada una de las tres estructuras conocidas 
de EIIA (manosa, manitol y glucosa). El análisis de estas energías produce un modelo integral del 
aporte de cada de estas mutaciones a la actividad en estas tres fuentes de carbono. Este modelo es 
congruente con los resultados experimentales.
Finalmente, se propone y empieza a trabajar en un protocolo que usa oligonucleótidos marcados con 
secuencias especificas para poder secuenciar miles de variantes crecidas en diferentes condiciones en 
solo experimento de secuenciación masiva. Con esto se pretende, además de validar el modelo 
propuesto, observar el cambio en la frecuencia de las variantes de la librería a lo largo del tiempo en las 
distintas fuentes de carbono.
2
INTRODUCCIÓN
Represión catabólica del carbono
Dado un entorno extracelular particular, Escherichia coli sólo necesita un subconjunto de las enzimas 
codificadas en su genoma para crecer, indicando que la expresión génica está regulada de forma 
diferencial. Si un sustrato está ausente los genes responsables de metabolizarlo generalmente se 
reprimen para no malgastar energía en producir enzimas innecesarias en ese momento. El aumento en 
la concentración del sustrato relaja la represión de estos genes. El ejemplo clásico de este modo de 
regulación es el operón lac de E. coli(1).
Hace más de 100 años se observó que el crecimiento en glucosa reducía la actividad de ciertas enzimas 
en bacterias y levaduras, fenómeno al que se denominó “efecto glucosa”. Uno de los primeros ensayos 
cuantitativos de este efecto fue realizado en 1937 por Stephenson y Gale, quienes midieron la actividad 
galactosidasa (utilización de galactosa) en E. coli. Esta actividad se ve reducida siete veces en 
presencia de glucosa, mientras que el consumo de glucosa no se ve afectado por la presencia de 
galactosa(2).
A principios de la década de 1940s Monod observó que cuando se cultiva Bacilus subtilis en un medio 
con sacarosa y dextrano la bacteria primero consume la sacarosa, luego deja de crecer por un tiempo 
(fase lag), para finalmente empezar a consumir dextrano. Al extender sus estudios a más organismos y 
azúcares(3) se percató que este comportamiento bifásico era un mecanismo general y extendido; cada 
3
organismo parece tener su orden particular de consumo de fuentes de carbono, con glucosa 
comúnmente en primer lugar.
En los años siguientes se descubrió que azúcares comunes como glucosa, fructosa o sacarosa, en 
concentraciones suficientes, reducen la síntesis de enzimas requeridas para el transporte y utilización de 
fuentes de carbono menos favorables. Este fenómeno se conoce como “represión catabólica del 
carbono” (RCC)(4). Cuando la fuente primaria de carbono es consumida, la bacteria primero expresa 
los genes necesarios para consumir la fuente de carbono secundaria antes de poder continuar con el 
crecimiento.
Los mecanismos regulatorios de la RCC han sido estudiados extensamente, encontrándose que el uso 
preferencial de una fuente de carbono sobre otro implica modulación de la actividad enzimática y/o 
represión de la transcripción. En E. coli, el sistema de fosfotranferasa fosfoenolpiruvato:carbohidrato 
(PTS) desempeña un papel central en la represión catabólica del carbono.
El sistema PTS
El PTS de E. coli fue descrito por Kundig, Ghosh y Roseman como un sistema que utiliza 
fosfoenolpiruvato (PEP) para fosforilar ciertas hexosas incluyendo N-actilglucosamina, N-
acetilmanosamina, glucosa, manosa y manosamina(5). En seguida se reconoció como un mecanismo de 
transporte que cataliza simultáneamente la entrada a la célula y la transformación a fosfoéster de un 
amplio número de carbohidratos. La composición básica del PTS es similar en todas las especies 
estudiadas(6). Consta de dos componentes citoplásmicos generales, enzima 1 (EI) y HPr (Histidine 
4
Containing Protein) que son comunes para todos los carbohidratos del PTS y enzima 2 (EII) que es 
específica para cada carbohidrato. En general, una bacteria puede expresar un gran número de EIIs 
diferentes, en E. coli por lo menos 15(7). Cada EII consiste de uno o dos dominios hidrofóbicos 
integrales de membrana (C y D) y dos hidrofílicos (A y B). Estos dominios pueden o no encontrarse en 
el mismo polipéptido (ver figura 1). En el caso de fructosa, EIIAFru esta fusionada a FPr, otro parálogo 
de HPr. 
Enzima 1
EI esta significativamente conservada tanto en bacterias gram positivas como gram negativas(8), está 
compuesta por 570 residuos (63 Kda) y codificada por el gen ptsI. Se autofosforila en presencia de 
5
Figura 1: Organización de distintos sistemas PTS en E. coli (105)
Mg2+ en la posición N-3 del anillo de imidazol de la His-189 (9), localizado en el extremo N-terminal 
de la proteína. El extremo C-terminal contiene el sitio de unión a PEP y es necesario para la 
dimerización. La proteólisis leve de EI genera un péptido del extremo N-terminal. Los dominios N-
terminal (EI-N)(10) y C-terminal (EI-C)(11) han sido clonados y caracterizados; EI-N se fosforila tanto 
in vitro como in vivo en presencia de EI-C, PEP y Mg2+. La estructura de EI-N ha sido elucidada tanto 
en cristal(12) como en solución(13). La fosforilación no parece modificar dramáticamente la estructura 
deldominio. 
HPr
HPr tiene solo 90 residuos (9KDa) y es codificada por el gen ptsH. Ha sido purificada de varios 
organismos(6). La similitud es más pronunciada alrededor del sitio activo(14). HPr se fosforila en la 
posición N-1 del anillo imidazol de la His-15. 
Se conoce la estructura tridimensional de HPr de E. coli, B. subtilis y unas pocas especies más(15) 
(16). En el caso de E. coli también existen co-cristales de HPr con EIIAman (17) , EIIAglc (18) o EIIAmnt 
(19) así como con el dominio N-terminal de EI(20). En todos estos casos el esqueleto de HPr es 
idéntico, cuatro láminas beta antiparalelas cubiertas por un lado con 3 hélices alfa, lo que indica que 
HPr no requiere grandes cambios de conformación para lograr la interacción con EIIA o EI. Estudios 
con un gran número de mutantes de HPr sugieren que los residuos importantes para la interacción, 
tanto con EI como con todas las EIIA, se encuentran en las hélices 1 y 2 y sus asas cercanas (21). (ver 
figura 6)
Complejos EII
6
Los complejos EII tienen la una estructura modular(22) consistente hasta de 4 proteínas diferentes(6). 
Los dominios EIIA y EIIB se definen como aquellos que reciben el fosfato de HPr~P y EIIA~P 
respectivamente. Mientras que en EIIA el residuo fosforilable es siempre una histidina, en EIIB puede 
ser tanto una histidina (familia de manosa) como una cisteína (las demás familias)(23). El grupo fosfato 
de EIIB~P es transferido al carbohidrato tras la translocación (internado a la célula) por EIIC (y EIID 
en algunos casos)(ver figura 1).
 
Los complejos EII se clasifican en 4 superfamilias(24) según sus distintos orígenes evolutivos:
1. La superfamilia glucosa-fructosa-lactosa compuesta por la familia de glucosa (EIIAGlc/EIICBGlc de E. 
coli o EIICBAGlc de B. subtilis), la familia fructosa-mannitol (EIICBAMtl de E. coli), y la familia de 
lactosa(EIIALac/EIICBLac de L. casei).
2. La superfamilia ascorbato-galactitol, compuesta por la familia ascorbato (SgaA/SgaB/SgaT de E. 
coli) y la familia galactitol (EIIAGat/EIIBGat/EIICGat de E. coli ).
3. La familia de manosa (EIIABMan/EIICMan/EIIDMan de E. coli o EIIALev/EIIBLev/EIICLev/EIIDLev de B. 
subtilis).
4. La familia de dihidroxiacetona (EIIA-HPr-EIDha [DhaM] en E. coli).
Esta clasificación basada en secuencia está respaldada por análisis de cristalografía y RMN que 
muestran claramente que EIIA y EIIB pertenecientes a diferentes familias son estructuralmente 
distintos. La información estructural sobre los dominios integrales de membrana, EIIC y EIID, es 
limitada.
Organización del PTS
7
La transferencia de fosfato entre los componentes del PTS ocurre por una “asociación en línea” (25). 
Esta transferencia se facilita por la formación de complejos heterodiméricos, y dada la cinética del 
proceso, éstos deberían ser efímeros. Se ha descrito la estructura de varios complejos del PTS 
incluyendo EI/HPr (20), Hpr/EIIGlc (26) (27), Hpr/EIIMtl (28), Hpr/EIIMan (17), EIIAGlc/EIIBGlc (29) y 
EIIAChb~P/EIIBChb (29). La formación de los complejos heterodiméricos afecta las propiedades de 
control de flujo de los componentes de PTS (30).
Dado que tanto EI como HPr en E. coli están unidos a fragmentos de membrana(31), se ha propuesto 
que el PTS se asocia en un metabolón(32) (estructura multiprotéica formada por enzimas secuenciales 
de una misma vía metabólica) que mejoraría la función PTS. Sin embargo existen argumentos que 
ponen en duda esta afirmación ; por ejemplo, no es claro cómo se lleva a cabo la transferencia de 
fosfatos en un complejo completamente ensamblado. Además, no debería haber mejora funcional de un 
complejo EI-HPr-EII contra los componentes en solución, ya que la difusión no limita el flujo de 
glucosa(33).
La formación de complejos se observa con EI marcada con la proteína verde fluorescente (GFP por sus 
siglas en inglés), tanto en células crecidas en carbohidratos PTS como no-PTS, cuando llegan a fase 
estacionaria y altas densidades(34). En razón de que al agregar más carbohidratos los complejos 
desaparecen, parece que los azúcares propician su disociación.
Varias proteínas de PTS forman dímeros funcionales. La primera en ser descrita fue EI(35) y se cree 
que la transición monómero/dímero puede regular el flujo de entrada ya que PEP sólo fosforila a la 
forma dimérica y la asociación/disociación es muy lenta comparada con el flujo de carbohidratos(36). 
EI~P tiene una constante de dimerización 10 veces mayor que EI. Siendo esta promovida por Mg2+ y 
8
PEP e inhibida por piruvato (37).
Algunas EII tansmembranales como EIICBAMtl (38) y EIICBGlc (39) dimerizan. Análisis proteómicos 
han encontrado oligómeros de EIINag y EIITre (40), apoyando la visión generalizada que las permeasas 
del PTS funcionan como dímero u oligómeros. En general se acepta que HPr y EIIA no forman 
oligómeros sin embargo existe evidencia que sugiere lo contrario en el caso de EIIALac, EIIGlc y 
EIIABMan (41). También EIIANtr, componente del sistema PTSNtr y homólogo a EIIAFru, cristaliza como 
dímero (42) pero parece ser monómero en solución (43).
Se conocen las constantes de equilibro del PTS de E. coli (ver tabla 1). El Keq en este caso expresa la 
razón entre producto y sustrato. Es decir, en el equilibrio, existen 80 moléculas de HPr~P por cada 
molécula de EI~P. Esto significa que existe una proporción no despreciable de EI~P en el equilibrio. 
Tradicionalmente se considera que una reacción es irreversible si su Keq es mayor a 105.
Reacción Keq referencia
EI~P ↔ HPr~P 80 (36)
HPr~P ↔ EIIAGlc~P 1~1.5 (44)
EIIAGlc~P ↔ EIICBGlc~P 12 (36)
EIICBGlc~P ↔ Glc-6~P 3.2 x 106 (36)
Tabla 1: Constantes de equilibrio del PTSglc
Sólo la última reacción del PTSGlc es irreversible (Ver tabla 1 ). Se cree que las constantes de otros PTS 
son similares. La reversibilidad de las reacciones del PTS tiene implicaciones reguladoras discutidas 
más adelante.
9
Regulación del metabolismo del carbono
Cuando E. coli se enfrenta a un cambio en las fuentes de carbono disponibles puede adaptar su 
metabolismo mediante la expresión de operones específicos, generalmente inducidos por sustrato (45). 
Datos de transcriptómica muestran que cuando las células crecidas en fuentes ricas de carbono son 
posteriormente expuestas a fuentes de carbono que sólo permiten un crecimiento lento, el número de 
genes inducidos incrementa progresivamente (46). Células que crecen bajo limitación de carbono 
expresan y utilizan un gran número de transportadores, mientras que aquellas que crecen en glucosa 
sólo expresan unos pocos(47). Esta respuesta transcripcional está mediada por un número pequeño de 
reguladores(48): Crp, Mlc, FruR, CsrA y σ54. La actividad de algunos de estos reguladores está 
directamente afectada por el PTS.
La importancia del PTS en la regulación del carbono se volvió evidente cuando se encontró que 
mutantes con deleciones en HPr y/o EI no sólo eran incapaces de crecer en azúcares PTS sino en una 
gran gama de azúcares no PTS(6). Buscando mutaciones que restauraran el crecimiento en azúcares no 
PTS recurrentemente se encontró la mayoría un gen que se denominó crr (carbohydrate represion 
resistant)(49) que luego se demostró codifica para EIIAGlc. La triple mutante HPr, EI y EIIAGlc crece 
bien en azúcares no PTS, pero no crece en azúcares PTS. Esto muestra que EIIAGlc no sólo está 
implicada en el transporte de glucosa, sino también en la regulación del transporte y metabolismo de un 
gran número de fuentes de carbono no PTS.
EIIAGlc ~P es requerida para la activación de la adenilato ciclasa. Mutantes en este gen muestran una 
actividad marginal correspondiente a 5% de la enzima parental(50). EIIAGlc sin fosforilar puede unirse 
e inhibir múltiples proteínas no PTS incluyendo lapermeasa de lactosa (LacY) y melibiosa (MclB), el 
10
componente hidrolizador de ATP del sistema de transporte de maltosa malK y la glicerol cinasa. Al 
evitar la entrada de estos metabolitos se detiene la inducción de los genes involucrados en su 
transporte. A este proceso se le denominó “exclusión de inductor” (inducer exclusion). Estos 
mecanismos permiten a la célula usar fuentes de carbono alternativas sólo cuando EIIAGlc se encuentra 
mayoritariamente fosforilada (cuando no hay azúcares PTS).
Regulación de la transcripción por Crp/cAMP 
Crp es un regulador global que controla la expresión de diversos genes y operones (51). Crp se activa al 
unirse a cAMP sintetizado por adenilato ciclasa (cyaA). Diferentes genes y operones requieren distintas 
concentraciones de Crp/cAMP para activarse ya que este complejo puede tomar diferentes estados 
conformacionales activos y la afinidad por cada sitio en el ADN es diferente (52).
La concentración de Crp/cAMP está regulada por el PTS ; la adición de glucosa a células crecidas en 
lactosa baja la concentración de cAMP (53). Experimentos con células toluenizadas (54) (este 
tratamiento vuelve las membranas permeables a carbohidratos) muestran que la actividad de adenilato 
ciclasa se inhibe por glucosa (55). Otros carbohidratos PTS también inhiben la síntesis de cAMP (56) . 
Tanto las mutantes ptsHI y crr tienen baja actividad adenilato ciclasa (50). Basado en estos estudios se 
propuso un modelo en el cual EIIAGlc~P activa a adenilato ciclasa. Creciendo en una fuente rica de 
carbono, el flujo de fosfato hacia el carbohidrato externo genera una menor proporción EIIAGlc 
fosforilada inhibiendo la adenilato ciclasa. Sin embargo, en una fuente pobre de carbono, como lactato 
o succinato, toda la EIIAGlc se encuentra fosforilada, promoviendo la síntesis de cAMP. Este modelo no 
puede explicar por qué el crecimiento en algunas azúcares no PTS como glucosa-6~P o gluconato 
genera niveles similares de cAMP a los generados por glucosa (57). Más aún, el efecto inhibitorio de 
11
glucosa-6~P sólo ocurre en células intactas y no en toluenizadas (55).
Regulación de cyaA y transcripción de crp.
Nuestro entendimiento de la regulación mediada por Crp/cAMP proviene del estudio de mutantes 
cyaA, crp, ptsH, ptsI y/o crr (58). El efecto de diversas fuentes de carbono en el crecimiento, expresión 
génica, concentración de cAMP y crp ha sido monitoreado en estas mutantes. Agregar cAMP exógeno 
sirve para distinguir entre los efectos causados por cambios en la concentración de cAMP y aquellos 
causado por la actividad de Crp.
La inactivación de cyaA evita que E. coli crezca en muchos azúcares PTS, aunque la sobre expresión 
parece ser perjudicial (59). La inactivación de crp aumenta la concentración de cAMP en sesenta veces 
pero es dependiente de crr ; la doble mutante cyaA crr sólo presenta un aumento de cuatro veces (60). 
Esto se debe a que la expresión de cyaA está regulada negativamente por Crp/cAMP en E. Coli (61) y 
la de crp está regulada tanto negativamente (62) como positivamente (63) por Crp/cAMP, dando altos 
niveles de expresión a concentraciones muy bajas o muy altas del inductor. La expresión de crr es 
independiente de Crp/cAMP (64) pero la expresión de ptsG (EIICBGlc) esta casi completamente 
inhibida en mutanres en cyaA o crp (65).
No es claro como EIIAGlc~P ejerce su efecto regulatorio sobre cyaA. Se ha demostrado que tanto 
EIIAGlc~P como EIIAGlc se unen de manera similar a la adenilato ciclasa(66) pero sólo la forma 
forsforilada permite la unión de un factor extra aún no identificado. El extremo N-terminal de la 
adenilato ciclasa es la parte catalítica mientras el C-terminal es necesario para la regulación mediada 
por EIIAGlc~P(66), ya que mutantes en crp generan un aumento de cincuenta veces en la concentración 
12
de cAMP que se ve casi normalizado en mutantes sin los 48 aminoácidos C-ternimales de cyaA (67) . 
Mutantes en crr tienen de 5 a 20 % de la actividad adenilato ciclasa, que se recupera a niveles casi 
normales al expresar crr en un plásmido(68). Si EIIAGlc fuese el único factor que estimula la adenilato 
ciclasa la mutante en crr y la cyaA truncada deberían exhibir el mismo fenotipo, pero el efecto positivo 
de la concentración de cAMP al expresar crr en un plásmido (5x) es mucho menor al negativo causado 
por la deleción del domino C-terminal de CyaA (50x).
El sistema PTS nitrógeno
Existe un sistema homólogo a PTS denominado PTSNtr (PTS nitrógeno) compuesto por EINtr (PtsP), 
homólogo a EI ; NPr (PtsO), homólogo a HPr y EIIANtr (PtsN) homólogo a EIIFru (41). Ninguna de estas 
proteínas es capaz de complementar la ausencia de su parálogo (41). La función de este sistema aún no 
está bien entendida, pero se cree que regula el metabolismo del nitrógeno(69). También se ha propuesto 
un rol en la regulación de los niveles de K+(70). Tanto NPr como EIINtr se encuentran codificados en el 
mismo operón que el factor σ54, el operón rpoN. (Figura 2) En E. coli (69) y K. pneumoniae (71) la 
expresión del operón rpoN es constitutiva pero en B. japonicum (72) , P. putida (73) y R. etli (74) está 
auto-regulada negativamente por EINtr. Estos genes codifican para σ54 (rpoN),la proteína Y asociada a 
ribosoma (yhnH), EIIANtr (ptsN), una proteína de unión a ATP (yhbJ) y NPr (npr). (41)
13
EINtr, NPr y EIIANtr forman una cadena de transferencia de fosfato in vitro (69). PTSNtr fosforila glucosa 
1000 veces más lento que el PTS, sugiriendo que su función principal no es el transporte de 
carbohidratos (75). EINtr contiene un domino GAF que regula a algunos activadores dependientes del 
factor transcipcional σ54 (sigma54) lo que sugiere un papel regulatorio(76). Mutantes carentes de PtsN 
crecen mal en fuentes de orgánicas de nitrógeno cuando el carbono es limitante, pero crecen bien en 
glucosa (69). En E. coli aún no ha sido aislada una mutante en PtsP, pero su pérdida en otros 
organismos previene la expresión de genes importantes(77). HPr no parece estar involucrado en 
regulación (69). De estas observaciones no es obvio un modelo sobre cómo PTSNtr regula la expresión 
genética. 
Aunque está generalmente aceptado que la función del PTSNtr requiere de la cadena de transferencia de 
fosfato EINtr~P → Npr~P → EIIANtr~P para realizar su función, existe una gran diversidad en las 
proteínas del PTSNtr entre bacterias (ver figura 2)(de hecho R. etli parece no tener NPr pero sí copias 
funcionales de EINtr y EIIANtr (74)). Esto sugiere que existe reacción cruzada entre las proteínas del 
PTSNtr y del PTS(78). La estructura del complejo NPr:EIIANtr en solución(43) muestra una interfaz muy 
14
Figura 2: Organización del operón rpoN en 
distintos organismos
parecida a la de HPr:EIIA. 
HPr y NPr tienen una identidad de alrededor de 30% a lo largo de toda la proteína, lo que supone un 
plegamiento similar. También la estructura parcial de NPr (79) es idéntica a HPr. Aunque hay evidencia 
de reacción cruzada entre estos dos sistemas(78) nunca se ha observado transferencia de fosfatos de 
NPr a algún EII de PTS.
Conexión entre el metabolismo del carbono y el metabolismo del 
nitrógeno.
La regulación parece estar ligada tanto a las proteínas del PTSNtr como a las de PTS. Las enzimas clave 
para la utilización del nitrógeno se encuentran en el operón glnALG que codifica a la glutamato 
sintetasa (glnA) y el sistema de dos componentes NtrB (glnL) – NtrC (glnG). En condiciones limitantes 
de nitrógeno, NtrC~P bloquea la transcripción a partir del promotor principal σ54-dependiente glnAp1 
(80). Aunque el promotor alterno σ70-dependiente glnAp2 es estimulado por Crp/cAMP(que esta a su 
vez regulada por el PTS), la expresión de glnA es mucho mayor en células crecidas en glucosa que en 
fructosa oglicerol ya que, según se tiene entendido, Crp/cAMP también reprime al promotor glnAp1 y 
este efecto es más fuerte que el activador (80). La observación de que al aplicar cAMP a células 
crecidas en glucosa la actividad de glnA se reduce siete veces (81) apoya este modelo.
Mutantes en ptsN, crecidas en limitación de nitrógeno, tienen una reducción en la actividad del 
promotor glnAp2; en este caso aumentar cAMP no tiene efecto alguno (69). Estas mismas mutantes no 
pueden crecer en leucina o serina como fuente de nitrógeno y tienen crecimiento reducido en isoleucina 
(82). Suministrar ptsN en plásmido recupera el fenotipo, pero cuando el plásmido contiene ptsN 
15
His73Ala (no es fosforilable) crece aún mejor que la proteína silvestre. También se ha propuesto un 
papel de EIIANtr en la regulación de la síntesis de algunos aminoácidos (82). 
Por otro lado, células crecidas en limitación de nitrógeno acumulan α-cetoglutarato(83), inhibidor 
alosterico no competitivo de EI(84) (se cree que el PTSNtr inhibe a la α-cetoglutarato dehidrogenasa 
(85)) . Esta interacción ocasiona que, cuando el nitrógeno es limitante para el crecimiento, la actividad 
del PTS ,y por lo tanto el consumo de carbohidratos, se ve reducida considerablemente.
16
ANTECEDENTES
Los antecedentes experimentales relevantes, descritos en el artículo adjunto(86), corresponden a los 
grupos de investigación del Dr. Xavier Soberón y el Dr.Milton Saier. En este trabajo, que se realizó en 
gran medida durante mi maestría, se sustituyeron catorce residuos de la proteína NPr (K12P, L13N, 
A17T, M21A, F24V, E25K, Q28K, V49L, I50F, A51K, L53Q, M54T, D56G y A58T) en su superficie 
de interacción NPr-EIINtr por los correspondientes en HPr en esas posiciones (ver figura 3). Esta nueva 
proteína, denominada CPr14, fue capaz de complementar la actividad de HPr sobre un fondo genético 
BW25113(87):ΔptsH y ΔfruF (codificantes de HPr y FPr respectivamente), usando diversos azúcares 
PTS como fuente de carbono (figura 4)(glucosa, manitol, manosa, dulcitol y sorbitol). Los catorce 
residuos se eligieron examinando interfaz del complejo Hpr:EIImnt (ver figura 5). 
La figura 3 muestra, en el alineamiento superior los residuos que fueron mutados en NPr para generar 
CPr. El alineamiento inferior muestra la similitud entre secuencias: en verde los aminoácido 
conservados en las tres proteínas, en azul los conservado en dos y en rojo los solo presentes en una.
17
Figura 3: Alineamiento múltiple entre HPr, CPr y NPr
Figura 4.-(Arriba) Perfil de crecimiento de múltiples cepas 
en diversas fuentes de carbono. Es claro que las cepas NPr y 
Cpr8 carecen casi por completo de actividad PTS. Cpr14 y 
HPr presentan perfiles de consumo similares a la cepa 
parental excepto por el consumo de fructosa (debido a la 
deleción del gen fruF). CPr6 sin embargo es capaz sólo de 
transportar algunos carbohidratos; existe información 
parcialmente responsable del trasporte de manitol y glucito 
que se encuentra en las otras 8 mutaciones.
Figura 5.-(izquierda)Estructura del complejo HPr EIImnt 
(PDB 1J6T)(19) que fue usada como modelo para 
seleccionar las 14 mutaciones. HPr es la proteína verde, 
EIImnt la magenta. En rojo se muestran los 14 aminoácidos a 
ser sustituidos en NPr y en amarillo la histidina fosforilable.
18
Figura 4: Perfiles de crecimiento
Figura 5: Interfaz HPr:EIIMtl
Se construyeron diversos modelos de docking proteína-proteína para elucidar la naturaleza de este 
fenómeno. La figura 6 muestra los modelos obtenidos por HEX y MODELLER de los complejos de 
CPr y HPr con EIIA de manosa, manitol y glucosa. El número de modelos ser refiere a cuantas 
conformaciones superaron el umbral de energía para ser reportado o, en caso de no existir ninguno, la 
mejor conformación evaluada. 
La energía de unión mostrada corresponde a la función objetivo de HEX. Esta es teóricamente igual a 
ΔG en Kcal/Mol, pero los supuestos usados en el modelo de interacción hace que muchas veces este no 
se el caso. El RMSD (Root-mean-square deviation) es una medida promedio de la distancia de átomos 
sobrepuestos y, en este caso particular, de la distancia de los carbonos alfa del modelo tras el doking y 
el cristal (en el caso de HPr) o el modelo antes del docking (en los demás). El uso de MODELLER(88) 
y HEX(89) y específicamente la energía calculada y el RMSD han demostrado ser discriminantes para 
interacción y transferencia de fosfato a EII de NPr, HPr y CPr.
Ya que un modelo rígido fue capaz de reconocer variantes funcionales, se sugiere que la transferencia 
de fosfato entre HPr (o CPr o NPr) depende más bien de la fuerza de interacción entre las caras de las 
proteínas que de algún cambio de conformación.
19
Figura 6: Reconstrucción de interacciones proteína-proteína por docking molecular
Usando un sitio de restricción aseI, se construyeron las variantes CPr6 , con las primeras seis 
mutaciones, y Cpr8 , con las últimas ocho. Cpr8 fue incapaz de crecer en fuentes de carbono PTS. CPr6 
presentó un crecimiento normal en glucosa, manosa y dulcitol pero nulo en sorbitol y manitol. (figura 
4)
20
Los perfiles de crecimiento sugieren que Cpr14 transporta mejor manosa que HPr. Para comprobar esto 
se midió y comparo el transporte de 2-Desoxiglucosa (carbohidrato no metabolizable transportado 
específicamente por la permeasa de manosa) y glucosa marcadas radioactivamente (ver figura 7). Este 
experimento muestra claramente que HPr es mejor que CPr para fosforilar el transportador de glucosa. 
Sin embargo, en el caso del transportador de manosa CPr forsforila mejor que HPr. NPr, como era de 
esperarse, no fosforila a ninguno de estos transportadores.
Existen muchas presiones de selección que acotan las mutaciones posibles sobre la cara de interacción 
HPr : interaccionar con suficiente afinidad con cada una de las EIIA del sistema PTS, interaccionar con 
EI y no interaccionar de más con EINtr o EIINtr. Entre tantas funciones que tiene HPr, es difícil imaginar 
que esté optimizada para alguna en particular (claramente no es óptima para el transporte de manosa).
Modificar la cara de interacción de NPr nos podría permitir controlar el flujo de fosfato de PEP al 
carbohidrato de nuestra elección, permitiéndonos desarrollar cepas con interés biotecnológico. 
Claramente, mutar 14 residuos basados en un cristal es un experimento burdo de ingeniería genética; no 
sabemos cuales de estas mutaciones son realmente necesarias para el fenotipo o incluso si algunas son 
21
Figura 7: Comparación en la actividad de las permeasas de glucosa y manosa
deletéreas para el sistema PTS. Un estudio metódico y exhaustivo de estos catorce cambios es 
necesario.
22
HIPÓTESIS
Existe un subconjunto propio de los 14 residuos que debe ser clave en las interacciones proteína-
proteína realizadas por HPr, de tal forma que le permitan interaccionar con las diversas EII de manera 
diferencial. Dicho conjunto es discernible mediante la utilización de una biblioteca binaria de mutantes 
de la proteína homóloga Npr.
OBJETIVOS
1) Generar una librería binaria de las 14 mutaciones en NPr.
2) Caracterizar variantes de NPr según su patrón diferencial de consumo de cinco azúcares PTS: 
glucosa, manosa, manitol, sorbitol, dulcitol. 
3) Modelar, mediante herramientas bioinformáticas, la estructura y posibles interacciones con EII de las 
mutantes NPr.
4) Proponer un modelo sobre la especificidad de la interacción con EII que confieren estos 14 
aminoácidos.
DISEÑO EXPERIMENTAL
En este estudio se utilizó la cepa BW25113 de E. coli y una variante doble mutante (Δ ptsH, ΔfruF) de 
BW25113(87) (llamada 2Δ). La librería de 16384 variantes fue clonada en el plásmido pZE12(90) .
23
Se usó el método de separación de resina (“resin-splitting”) (91) parageneral la librería binaria ya que 
es capaz de generar solo la variación que nos importa explorar. Otras técnicas como mutación aleatoria 
o barajado de genes generan variación “inútil”. Se uso el plásmido PZE12 y la cepa 2Δ para que los 
resultados fueran directamente comparables con los del articulo adjunto. 
Ya que 2Δ carece de un sistema PTS activo, su crecimiento en LB es reducido. Esto causa que esta cepa 
produzca muy poco plásmido. Por esta razón se uso la cepa MC1061 (92) tanto para producir suficiente 
plásmido para las ligaciones así como para amplificar la librería binaria. 
24
Figura 8: Diagrama de flujo del diseño experimental
Construcción de librería binaria
Construcción de la librería
La librería binaria se ensambló con una variación del método usado para armar CPr (ver figura 9). 
Ocho oligonucleótidos que cubren el gen NPr (tres de ellos mutagénicos) se juntaron por pares por 
medio de reacciones de PCR (denominados P1, P2, P3 y P4). Solo P1 y P4 requieren NPr como 
templado. Los productos de PCR fueron purificados usando un gel nativo de acrilamida al 15%. Tras 
otra ronda de PCR, P1 y P2 generan H1, así como P3 y P4 generan H2. Se purificó de nuevo. Una 
última reacción de PCR de H1 con H2, amplificada con los oligonucleótidos “forward” y “reverse” 
generó el fragmento completo correspondiente a la librería armada.
Figura 9: Distribución de los ocho oligonucleótidos que usaron para ensamblar la librería binaria.
25
Oligonucleótidos mutagénicos
Tres oligonucleótidos mutagénicos (F2, R3 y R3) se ensamblaron por el método de separación de 
resina(91) : cada uno de los catorce codones por explorar se sustituyó con un tercio del codón 
correspondiente a HPr y dos tercios del correspondiente a NPr. Así, tomando en cuenta la composición 
esperada en cada codón, F2 está compuesto por 23 = 8 variantes, R3 por 24 = 16 variantes y R5 por 27 = 
128 variantes. Cuando se combinan con otros oligonucleótidos estándar para armar la librería binaria, 
se generan un total de 16384 (8*16*128) variantes. 
Los oligonucleótidos mutagénicos ensamblados por separación de resina se sintetizan de manera 
ordinaria, en fase sólida, adicionando nucleótido por nucleótido hasta llegar a la región variable. 
Entonces la columna se abre y una porción se transfiere a una segunda columna, mientras que el resto 
se mantiene en la primer columna. Para el caso particular de los oligonucleótidos ensamblados en este 
trabajo, un tercio de la resina se transfirió a la segunda columna, donde se ensambló el codón mutante 
nucleótido por nucleótido, mientras que en la primer columna se ensambló el codón silvestre de igual 
manera. Concluida la síntesis de ambos codones de manera independiente, las resinas se mezclaron en 
la primer columna y nuevamente se transfirió un tercio a la segunda columna para continuar con la 
síntesis del segundo codón mutante, mientras que en la primer columna se sintetizó el segundo codón 
silvestre. Este proceso de partición de resina, síntesis y mezclado se repitió para cada posición a 
explorar y las resinas se juntaron en una sola columna cada vez que los codones por sintetizar fueran 
los inmutables, es decir, aquellos que siempre deberían permanecer silvestres.
Esta técnica es muy versátil, porque en base a la proporción de resina separada se puede manipular el 
contenido de mutaciones en las variantes(93). No hay razón para limitarse a solo dos codones ni a 
26
regiones variantes del la misma longitud. Transferir un porcentaje pequeño de la resina generará 
variantes con pocos reemplazos, mientras que transferir un porcentaje alto generará variantes con alta 
proporción de mutaciones. 
Plásmido PZE12-TrpF-Luxp
Con la finalidad de poder diferenciar rápidamente por PCR de colonia aquellas clonas que contenían un 
inserto de la librería de aquellas que conservaban el fragmento silvestre, se clonó en el plásmido PZE12 
la fusión proteica TrpF-LuxP usando los mismos sitios de restricción (EcoRI y HindIII). El tamaño de 
este inserto (900 bp) es claramente distinguible del tamaño de la librería y de NPr (400bp).
Figura 10: Gel del plásmido TrpF-LuxP
Se probaron varias condiciones para la ligación (ver métodos), donde la mejor produjo 126 variantes 
por 10μl de células transformadas (de un total de 1000μl). Esta ligación debería alrededor de 63000 
27
variantes (126 * 100 del micro-litro de la transformación*5 de la mezcla de ligación restante). Con esta 
cantidad de variantes (sin corregir para las posibles mutantes y las que no tengan el inserto) cada una de 
las 16384 variantes tiene 98% de probabilidad de estar representada. Sin embargo, con estos números 
sólo hay una posibilidad muy baja (1.8 x10-100) de observar al menos una vez cada una de las variantes.
Finalmente, usando estas concentraciones, se generaron cinco nuevas ligaciones que, tras 
transformarse, dieron lugar a una diversidad combinada de 250,000 clonas individuales lo que da 
99.6% de posibilidad de observar todas las variantes por lo menos una vez. Estas trasformaciones 
fueron crecidas en LB y se extrajo plásmido super-enrollado. El DNA de las cinco librerías se mezcló 
en proporciones definidas para normalizar (ver métodos).
Probar construcción
Para explorar la diversidad de la librería sin expresar 
las variantes se uso el plásmido pJET 1.2 blunt(ver 
figura 11). En este vector el sitio de clonación 
interrumpe el gen de una enzima de restricción letal 
(eco47IR) de tal forma que el plásmido ligado sobre 
sí mismo no es viable.
Con este método se obtuvieron alrededor de 1000 colonias al platear 20 μl. De estas se secuenciaron 
quince (figura 12). Se muestran en naranja/azul los catorce residuos; en naranja los correspondientes a 
NPr (silvestre) y en azul los correspondientes a HPr (mutantes). En magenta se muestras las mutaciones 
no deliberadas que fueron probablemente introducidas por PCR durante el armado del gen. 
28
Figura 11: El plásmido pJET
Las secuencias de estas variantes muestran tres puntos importantes. Primero, todas las 14 mutaciones 
están presentes por lo menos en una de las variantes, lo que indica que los oligonucleótidos están bien 
sintetizados y el banco puede tener la diversidad suficiente. Segundo, la frecuencia de las mutaciones 
introducidas deliberadamente observada (35%) es muy parecida a la esperada (33%). Tercero la 
frecuencia de mutaciones no deliberadas es baja.
Transformación de la librería.
Una vez probada la construcción, se clonó en el plásmido PZE12 producido a partir de la digestión de 
PZE12-TrpF-Luxp. ya que la selección en manitol distingue mejor las células con un PTS activo, esta 
librería fue transformada en células 2Δ y crecida en MM + AMP + manitol (1 g/l) . Se seleccionaron 10 
colonias para extraer plásmido y se secuenciaron 7 de ellas(ver figura 13). De estos datos solo se puede 
proponer a la mutación A58T como importante para la actividad (ver pruebas estadísticas)
29
Figura 12: Variantes del plásmido pJET
Selecciones y plásmidos
En teoría las variantes obtenidas con el plásmido PJET no están sujetas a ninguna selección, ya que éste 
no es un vector de expresión y las células fueron crecidas en la cepa MC1061 que tiene un PTS 
intacto. Esto nos permite estudiar si hay desviación con respecto al diseño de la librería (1/3 de 
mutantes en las posiciones relevantes. También nos da una base contra la cual comparar las otras 
condiciones.
Las variantes obtenidas de LB están sujetas a una selección leve; aunque un PTS funcional no es 
estrictamente necesario para el crecimiento, puede ayudar. Además, el plásmido PZE12 es un vector de 
expresión y algunas de las proteínas de la librería podrían ser tóxicas para la célula. Por tóxica se 
entiende que se pliega mal y se agrega.
Las variantes obtenidas de MM/manitol estás sujetas a una selecciónfuerte. Un sistema PTS funcional 
es necesario para el crecimiento. Podrían crecer cepas que expresen variantes de la librería ligeramente 
tóxicas pero funcionales. 
Aclimatar cultivos
30
Figura 13: Secuencias de variantes crecidas en MM/manitol
Con el fin de evitar el lavado mecánico del medio, que en este caso ha mostrado reducir 
considerablemente el número de células viables, y de iniciar el programa genético que permitirá a las 
bacterias crecer en distintas fuentes de carbono, las células fueron sometidas a varios pases por 
cultivos líquidos.
Primero se tomó 2 µl de la transformación para crecer en LB/AMP y verificar que el número de 
Unidades Formadoras de Colonia (UFC) fuera suficiente. En paralelo, la transformación se usó para 
inocular 50 ml de LB/AMP líquido y se incubó a 30°C toda la noche. Tomando 1mL de este cultivo, se 
inocularon cinco matraces con 50 ml de medio mínimo, más uno de los carbohidratos (manosa, 
manitol, dulcitol, sorbitol o glucosa) como fuente de carbono. Tras crecer toda la noche, se usó 1 ml de 
cada uno de estos cultivos para inocular un matraz con el mismo medio y se creció una vez más. 
Secuenciación Sanger
Finalmente se plateó 100μL de estos cultivos en cajas con medio sólido con la fuente de carbono 
correspondiente. Se picaron 96 colonias, 14 de cada carbohidrato y 26 de LB para crecer en 5ml de LB. 
Se extrajo plásmido de estas 96 cepas usando un kit comercial de ROCHE. Los plásmidos se mandaron 
secuenciar a la unidad de secuenciación del IBT. Los resultados para LB se muestran a continuación.
31
Figura 14: Secuencias de variantes crecidas en LB
Estos datos corroboran que la librería clonada en el plásmido PZE12 está bien construida y están 
representadas las catorce mutaciones. Para el caso de las 70 secuencias en selección, todas, con la 
excepción de dos, fueron la misma variante ; aquella con las diez mutaciones esperadas K12P, L13N, 
A17T, M21A, F24V, Q28K, V49L, M54T, D56G Y A58T así con la mutación no esperada E33V(en 
verde en la figura 14).
Existen dos posibilidades para explicar este comportamiento. La primera es que la adecuación 
proporcionada por esta combinación de mutaciones es enorme, tanto que la variante es capaz de 
desplazar fácilmente a las demás variantes en todas las selecciones probadas. La otra posibilidad es que 
sea un fenómeno causado por el efecto fundador al hacer tantos pases por medio fresco. Cualquiera sea 
el caso, se ha encontrado una nueva mutación que parece ayudar a que NPr adquiera la actividad de 
HPr.
Resumen de secuencias
32
Tabla 2: Resumen de secuencias
N= 15 18 7
mutación/experimento PJET LB MTL
K12P 5 11 1
L13N 8 9 0
A17T 5 5 1
M21A 8 7 3
F24V 6 9 3
E25K 4 8 1
Q28K 3 9 4
V49L 11 11 4
I50F 4 7 5
A51K 1 3 4
L53Q 1 2 1
M54T 5 7 1
D56G 8 11 5
A58T 6 10 5
total 75 109 38
35.71% 43.25% 38.78%%mut
Esta tabla resume los resultados de las secuencias de diversas variantes en los medios de cultivo 
probados. Cada fila muestra una de las 14 mutaciones y el número de ocurrencias. Se secuenciaron 15 
variantes de PJET, 18 de LB y 7 de manitol.
DISEÑO MODELADO COMPUTACIONAL
La figura 15 muestra los pasos seguidos para obtener un modelo de la aportación de cada una de las 
catorce mutaciones a la actividad. Ya que la interacción Hpr:EII parece ser fundamentalmente 
electrostática la energía de interacción calculada por un método de docking rígido debería ser 
33
Figura 15: Diseño modelado computacional
proporcional a la ΔG real. Esto nos significa que la relación entre las energías de los modelos se 
conserva ; si el primero interacciona mejor que el segundo con EII Hex puede reconocer esto (aunque 
tal vez no reconozca del todo la magnitud de la diferencia).
Se usó Hex para calcular la energía de interacción de los modelos de cada una de las 16384 estructuras 
contra EIIMtl. Para calcular la aportación de la mutación K12P se separaron estas 16384 energías en dos 
poblaciones: la primera con las 8192 energías correspondientes a los modelos que tienen las mutación, 
y la segunda con las 8192 energías de los modelos que no la tiene. Esta partición no da dos poblaciones 
pareadas, cada energía en la primera corresponde a una en la segunda (la del modelos con secuencia 
idéntica excepto por la mutación K12P). Se realizo una prueba T de Student(94) sobre estos datos para 
obtener que el aporte de la mutación K12P a la interacción con EIIAMtl es de 3.58 (desviaciones 
estándar sobre la media). Se repitió este proceso para cada Mutación y para cada EIIA con estructura 
conocida (manitol, manosa y glucosa) para proponer un modelo (ver tabla 6 en resultados).
34
RESULTADOS
Comparación entre PJET y la hipótesis nula.
Los oligonucleótidos mutagénicos se construyeron de tal forma que cada codón tiene aproximadamente 
un 33% de probabilidad de estar mutado. Usando esta información como hipótesis nula, suponiendo 
que las secuencias en PJET no están sujetas a ninguna selección, con una distribución binomial se 
puede inferir si la síntesis de los oligonucleótidos y/o el armado de la librería introdujeron sesgo a la 
proporción de mutantes.
En este caso la mutación V49L (en verde) está sobre representada (p<0.02) y las mutaciones A51K y 
L53Q están subrepresentadas. 
35
Tabla 3: Comparación entre 
secuencias en pJET y la hipótesis nula
N= 15
mutación PJET binomial
K12P 5 0.6184
L13N 8 0.9692
A17T 5 0.6184
M21A 8 0.9692
F24V 6 0.7970
E25K 4 0.4041
Q28K 3 0.2092
V49L 11 0.9997
I50F 4 0.4041
A51K 1 0.0194
L53Q 1 0.0194
M54T 5 0.6184
D56G 8 0.9692
A58T 6 0.7970
Efecto del tamaño de muestra en la inferencia estadística
Las gráficas de la figura 16 describe el tamaño mínimo de muestra para obtener α=5% y β=20%. según 
la desviación observada respecto al modelo (33% de mutantes en todos los sitos). α es la probabilidad 
de que nuestra prueba concluya erróneamente que la proporción de mutantes en un posición está 
sesgada cuando en realidad es efecto del muestreo (falso positivo). β es la probabilidad de que la 
prueba concluya que no existe sesgo en una posición cuando en realidad sí lo hay (falso negativo). 
36
Effect size g
To
ta
l s
am
pl
e 
siz
e
Exact - Proportion: Difference from constant (binomial test, one sample case)
Tail(s) = Two, Constant proportion = 0.33,
α err prob = 0.05, Power (1-β err prob) = 0.8
0
50
100
150
200
250
-0.3 -0.25 -0.2 -0.15 -0.1
2 2 2
15 15 20 20
24 24 28 28
32 36
40
48
55 59
70
77
95
109
134
161
205
Figura 16: Efecto del tamaño de muestra en la inferencia estadística
Effect size g
To
ta
l s
am
pl
e 
siz
e
Exact - Proportion: Difference from constant (binomial test, one sample case)
Tail(s) = Two, Constant proportion = 0.33,
α err prob = 0.05, Power (1-β err prob) = 0.8
0
50
100
150
200
250
300
350
0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35
374
287
231
187
154
132
111
95 87
74 66 61 58
48 47 43 38 37 31 31 26 26 26 23 21 19 19 19 18 1616
Como se espera que el que exista sesgo sea un evento más bien raro, en general se acepta que β sea 
mayor que α. La primera gráfica explora tamaños de efecto g entre -0.32 y -0.8 (de 1% a 25% de 
frecuencia de sustitución observada). Así mismo la segunda gráfica explora tamaños de efecto g entre 
0.07 y 0.37 (de 40% a 70% de frecuencia de sustitución observada).
Con el actual tamaño de muestra N=15 en PJET solo sesgos muy evidentes como V49L (11/15 
observado contra 5/15 esperado) pueden alcanzar este nivel de certeza. La única forma de poder tener 
más certeza sobre nuestras predicciones, así como poder usar criterios más estrictos, es aumentar 
considerablemente el tamaño de muestra (N=200 sería un buen comienzo).
Comparación entre PJET y LB 
Al comparar la frecuencia de ocurrencia de cada mutación entre las variantes con la librería clonada en 
el plásmido pJET y aquellasdonde se clona en el plásmido PZE12, ambas crecidas crecidas en LB se 
busca elucidar su efecto en la toxicidad. Una mutación poco frecuente en PZE12 como a L53Q, se 
explica por el hecho de que también es poco frecuente en pJET, indicando que existe un sesgo en la 
librería. Una mutación con mayor proporción en PZE12 podría indicar actividad PTS, mientras que una 
con menor indicaría que es desventajosa para el (crecimiento probablemente es tóxica). 
37
La segunda columna muestra el P-valor obtenido a partir de una distribución binomial para cada 
mutación. Esta prueba infiere sobre que tan probable es que las diferencias en las proporciones de 
substitución observadas entre las dos condiciones se deban al azar. Se marcan con verde las mutaciones 
que ayudaron significativamente al crecimiento en LB (p<0.05). Al corregir para el tamaño pequeño de 
muestra con una prueba de Fisher(95) se pierde la significancia estadística (tercera columna). De este 
estudio se concluye que el efecto de estas mutaciones en el crecimiento de la cepa 2Δ en LB es 
pequeño. Un mayor número de muestras sin duda es necesario para aseverar esto con certeza.
Comparación entre LB y MTL
Comparar la frecuencia de ocurrencia de cada mutación entre las variantes con la librería clonada en el 
plásmido PZE12 aisladas de medio LB y aquellas aisladas en MTL nos dará una inferencia sobre la 
aportación, positiva o negativa, de esa mutación al crecimiento celular, y por ende a la actividad del 
sistema PTS. 
38
Tabla 4: Comparación entre PJET y 
LB
mutación
K12P 0,9961 0,1663
L13N 0,4791 1,0000
A17T 0,4122 1,0000
M21A 0,1606 0,4939
F24V 0,8653 0,7285
E25K 0,9708 0,4688
Q28K 0,9991 0,1451
V49L 0,1802 0,7120
I50F 0,9205 0,7120
A51K 0,9716 0,6074
L53Q 0,8857 1,0000
M54T 0,7767 1,0000
D56G 0,8147 0,7325
A58T 0,9424 0,4905
binomial p-fisher
La segunda columna muestra el P-valor obtenido a partir de una distribución binomial para cada 
mutación. Esta prueba infiere sobre que tan probable es que las diferencias en las proporciones de 
sustitución observadas entre las dos condiciones (LB y manitol) se deba al azar. Se marcan con verde 
las mutaciones que ayudaron significativamente al crecimiento en manitol y con rojo las que 
perjudicaron (p<0.1). Al corregir para el tamaño pequeño de muestra con una prueba de Fisher (tercera 
columna) solo se conserva significancia estadística en dos posiciones. En particular la mutación A51K 
también fue descrita por el método de docking molecular como importante para la actividad PTS en 
MM/MTL.
MODELO
39
Tabla 5: Comparación entre LB y MTL
mutación binomial P-fisher
K12P 0.0161 0.0730
L13N 0.0078 0.0267
A17T 0.3784 0.6372
M21A 0.7314 1.0000
F24V 0.5000 1.0000
E25K 0.1078 0.3548
Q28K 0.7734 1.0000
V49L 0.5557 1.0000
I50F 0.9839 0.2016
A51K 0.9980 0.0664
L53Q 0.8221 1.0000
M54T 0.1736 0.3623
D56G 0.8264 1.0000
A58T 0.8922 0.6592
Tras realizar los pasos descritos en el diseño del modelado computacional se propuso un valor para la 
aportación de cada uno de los 14 aminoácidos mutados a la interacción de HPr con las tres EIIA de las 
que existe estructura cristalina. El valor se obtiene con una prueba t de Student(94) (se evaluó también 
con una prueba t de Welch(96) para varianzas diferentes y el resultado fue idéntico). Se tomó +- 3 
como valor de corte (p=0.003) para definir significancia estadística. Los valores mayores a 3 (en verde) 
indican que en esa posición es ventajoso el codón mutante (el de HPr), los menores a -3 (en rojo) 
indican que el codón silvestre (el de NPr) es ventajoso para la interacción.
Este modelo es congruente con los resultados experimentales y confirma que la mutación A51K es 
relevante para la actividad. También el modelo propone que la cepa CPr6 no tiene actividad en manitol 
ya que le falta la mutación A51K y/o le sobra la M54T. Finalmente, estos perfiles de aportación 
energética sugieren que la interacción HPr:EIIMtl parece tener una orientación ligeramente distinta a 
HPr:EIIGlc o HPr:EIIMan .
40
Tabla 6: Modelo del aporte de cada mutación a la 
actividad HPr
MUT\prueba T glucosa manosa
K12P 3.58 -9.86 -6.27
L13N -0.21 0.44 0.84
A17T -2.83 3.34 -0.83
M21A 0.75 -2.27 0.05
F24V 5.36 -6.17 0.76
E25K 1.72 26.59 23.3
Q28K -1.4 13.71 12.43
V49L 0.21 0.78 -0.44
I50F -0.7 5.43 -1.49
A51K 6.22 12.26 8.8
L53Q 1.02 1.5 1.22
M54T -9.46 -1.79 -0.99
D56G 2.97 -2.71 4.92
A58T 0.58 2.9 1.67
Manitol
CONCLUSIONES
Construimos una librería binara de un gen completo usando oligonucleótidos sintetizados con la técnica 
de separación de resinas. Dicha librería presento una distribución de mutaciones cercana a la esperada y 
nos permitió, por lo menos en el caso de la interacción con EIIMtl, elucidar la importancia de algunos 
aminoácidos a la actividad HPr. Incluso con un tamaño de muestra pequeño fue posible identificar la 
mutación A51K como importante para la actividad PTS y la mutación L13N como detrimental . 
Los resultados de docking molecular son congruentes con los obtenidos experimentalmente, en 
particular la mutación A51K también fue identificada como importante para la actividad PTS en 
manosa, manitol y glucosa. Esto es congruente con el articulo adjunto ya que esta sustitución también 
está presente en la cepa CPr6 que crece bien en manosa y glucosa (pero no en manitol).
Ninguna de las 14 mutaciones es estrictamente necesaria para la actividad PTS en ninguno de los 
medios probados. Existen múltiples subconjuntos de estas catorce mutaciones que tienen actividad y 
algunas mutaciones parece sen más importantes en algunas selecciones que otras (E25K parce aportar 
mucho a la actividad en manosa y glucosa, pero poco en manitol).
PERSPECTIVAS
Ya que el tamaño de muestra afecta la confianza en la pruebas estadísticas, es indispensable 
incrementarlo. Sin embargo, el número de secuencias necesarias para inferir la contribución a la 
actividad PTS de algunas de las sustituciones es tan elevado que no es práctico obtenerlas por 
41
secuenciación de Sanger. Un método usando secuenciación masiva como el propuesto en este trabajo 
resolvería este problema al obtener millones de secuencias en cada medio de selección. Estos 
experimentos se están realizando actualmente.
La construcción de la mutante sencilla A51K o de cualquiera de las variantes propuestas por el docking 
nos dará un mejor entendimiento de la interacción HPr-EIIA.
El comprender plenamente la comunicación entre los sistemas PTS y PTSNtr así como entender las 
interacciones entre HPr y sus parálogos con las diversas EIIA nos permitirá regular el flujo de carbono 
y en especial respecto al orden y velocidad de consumo de los azúcares PTS.
Metodología secuenciación masiva
La librería binaria solo tiene dos regiones variantes (ver figura 17. las mutaciones están marcadas en 
naranja). Usando los oligonucleótidos marcados en azul para amplificar con PCR se genera un 
oligonucleótido de 218 bp que podría ser secuenciado por ilumina pair-end 2x75 (regiones en naranja) 
o por ion torrent (el producto completo). En nuestro caso se amplificaría por PCR la sección central del 
gen de un plásmido proveniente de selección en una fuente de carbono particular. El primer Forward 
contiene una etiqueta que permitirá saber de qué selección viene esta molécula en particular. El 
oligonucleótido reverse tiene una etiqueta que codifica para el tiempo en que se tomó la muestra. El 
producto de PCR de 218bp purificado se mezclará con los provenientes de otras selecciones y tiempos 
y serán secuenciados en una sola reacción.
42
Figura 17: Regiones variables de la librería binaria
Con el fin de poder contener fácilmente los errores de secuenciación se diseñaron estas etiquetas con 
información redundante. Cada etiqueta es de 7 pares de bases, las primeras tres identifican ya seael 
tiempo o la selección. Ninguna mutación sencilla puede transformar una en otra y darnos un falso 
positivo. Las siguientes cuatro se obtienen a partir de operaciones binarias con las tres primeras bases. 
De esta forma si una base está mutada hay forma de recuperar la información.
Las funciones binarias son:
Tabla 7: Funciones binarias
43
Función {+} ( X {+} Y = Z ) Función {sii} ( X {sii} Y = Z )
X Y Z X Y Z
A
A A
A
A C
C C C A
T G T T
G T G G
C
A C
C
A A
C A C C
T T T G
G G G T
T
A G
T
A T
C T C G
T A T C
G C G A
G
A T
G
A G
C G C T
T C T A
G A G C
Con estas funciones las 7 bases de la etiqueta se definieron 1,2,3, 1 {+} 2 , 2 {+} 3, 3 {sii} 1 y 1{ssi}2.
Para evaluar el cambio en la abundancia relativa de las variantes se planea extraer muestras del primer 
cultivo en cada medio de selección a diferentes densidades ópticas (0.2 ; 0.5 ; 1.0 y 1.0 + 3h). A esta 
muestra se le realizará PCR de cultivo con los oligonucleótidos correspondientes para el medio de 
selección y el tiempo. También se obtendrá un PCR del medio en LB (tiempo 0, sin selección) con la 
intención de normalizar y poder capturar los cambios en la población de secuencias.
Pruebas de PCR de cultivo usando en diferentes 
combinaciones de cultivo, oligonucleótido 
forward y oligonucleótido reverse. De izquierda a 
derecha las muestras son: marcador,1,2,3,4 y 5
muestra cultivo oligonucle
ótido 
forward
oligonucle
ótido 
reverse
1 CPr8 LB 0
2 CPr8 LB 12
3 CPr8 Glc 0
4 CPr8 Glc 12
5 CPr6 LB 0
Se puede observar que todas las bandas son 
congruentes con el tamaño esperado de 218pb
Se planea purificar estos 25 PCR ( 6 medios x 4 tiempos +tiempo 0), normalizarlos y secuenciarlos en 
una sola reacción del chip 316 de ion torrent.
44
Figura 18: Producto de PCR de los 
oligonucleótidos con etiquetas
MÉTODOS
Cepas
Se usaron las cepas descritas en el artículo (MC1061 (92) y 2delta(86) ).
Medios
LB
El medio LB se preparó según describe Bertani (97) . En caso de necesitar antibiótico se le agregó una 
solución stock de ampicilina para llegar a una concentración final de 200μg/ml. En caso de ser sólido 
se le agregó agar para llegar a una concentración de 1.5%.
A 900ml de H2O agregar:
20g Tryptona 
5g Extracto de levadura 
2ml 5M NaCl 
2.5ml 1M KCl
10ml 1M MgCl2 
10ml 1M MgSO4 
20ml 1M glucosa
Aforar a 1L con H2O ,esterilizar en la autoclave.
M9
El medio minino M9 se preparó según describe Adams (98). En caso de necesitar antibiótico se le 
agregó una solución stock de ampicilina para llegar a una concentración final de 200μg/ml. En caso de 
ser sólido se le agregó agar para llegar a una concentración de 1.5%. A menos que se indique de otra 
forma, se usó una concentración final de 1g/l para todas las fuentes de carbono.
45
Sales m9(5X)
A 800ml agregar:
64g Na2HPO4-7H2O 
15g KH2PO4 
2.5g NaCl 
5.0g NH4Cl 
Agitar hasta disolver. Aforar a 1000ml con H2O. Esterilizar en la autoclave. 
Medio mínimo M9
A 700ml de H2O (estéril) agregar:
200ml sales M9
2ml 1M MgSO4 (estéril) 
Aforar a 1000ml con H2O. Esterilizar en la autoclave.
SOC
El medio SOC se preparó según describe Hanahan (99) .
A 900ml de H2O se agregan:
20g tryptona
5g extracto de levadura
2ml 5M NaCl.
2.5ml 1M KCl.
10ml 1M MgCl2 
46
10ml 1M MgSO4 
20ml 1M glucosa 
Aforar a 1000ml con H2O. Esterilizar en la autoclave. 
GYT
El medio GYT se preparó según descrito por Tung(100) .
A 70 ml de H2O se agregan:
0.25g tryptona
0.125g extracto de levadura 
10ml glicerol 100% 
Aforar a 100ml con H2O. Esterilizar por filtro de 0.22μm.
Otros
BufferF
600 mM tris-HCl, 150 mM NH4PO3 , 20 mM MgCl2, pH 9
dNTP's
2.5mM ATP, 2.5mM CTP, 2.5mM TTP, 2.5mM GTP.
Oligonucleótidos split resin
Para armar la librería se usaron los siguientes oligonucleótidos:
47
Oligonucleótido secuencia
forward CGA GAA TTG TGA GCG GAT AAC
R1 CTT GAC GGT CAT GGT ACC TTT C
F2* G ACC GTC AAG CAA ACT GTT GAA ATC ACA AAC [AAG/CCG]
[CTG/AAC] GGC ATG CAT [GCC/ACC] CGG CCT GCA
R3* TAA GAG CAC TTC AGC GTC AAA ACC [CTG/CTT] CAT TAA [TTC/TTT] 
[AAA/TAC] CAG CTT [CAT/GGC] TGC AGG CCG
F4 AGT GCT CTT ACG TAA TGA CGA AGG CAC CGA GGC TGA AGC CAA C
R5* AAT CTG CCG TCC TTT [GGC/AGT] AGA [ATC/GCC] CAA [CAT/AGT] 
[CAG/CTG] CAG [CGC/TTT] [AAT/AAA] [AAC/CAG] GCT GTT GGC TTC A
F6 ACG GCA GAT TGA AGT TGA AGC GAC CGG TCC ACA GGA AGA GGA 
AGC ACT GGC CGC CGT T
reverse GAC AAA CAA CAG ATA AAA CGA AAG G
Tabla 8: Oligonucleótidos para armar la librería
Los oligonucleótidos marcados con * son aquellos sintetizados por el método de separación de resina.
Armado de la librería
La librería se armó a partir de las mitades del gen (H1 y H2) proporcionadas por Filiberto Sánchez en 
un PCR con los siguientes ingredientes:
H1 10μl
H2 10μl
oligonucleótido forward (10pm/μl) 4μl
oligonucleótido reverse (10pm/μl) 4μl
dNTP's 10μl
bufferF 10μl
taq(2U/μl) 5μl
H2O 47μl
Se usó una maquina “GeneAmp PCR System 9700” con el programa: 95°C x 5min ,(95°C x 1min ,
48
60°C x 1min, 72°C x 1min) *30, 72°C x 5 min.
Análisis del producto de PCR por gel de agarosa. El tamaño del fragmento 
observado concuerda con el esperado para la librería binaria de NPr (400bp)
Plásmido PZE12-TrpF-LoxP
El plásmido PZE12-NPr se digirió mezclando:
50μl plásmido 
5μl bufffer 2(new ingland biolab)
1μl HindIII
1μl EcoRI
Se dejó reposar a 37°C toda la noche. Se corrió la muestra en gel de agarosa al 2%, se tiñó con bromuro 
de etidio y se cortó la banda correspondiente al plásmido lineal sin inserto (+/- 3000bp). Esta banda se 
purificó con columna de fibra de vidrio (ROCHE) siguiendo las instrucciones del fabricante.
La secuencia TrpF-LoxP(101) (GAATTCATATGCATCATCATCATCATCACGGGGAG 
AATAAGGTATGTGGCCTGACGCGTGGGCAAGATGCTAAAGCAGCTTATGACGCGGGCGCGA
TTTACGGTGGGTTGATTTTTGTTGCGACATCACCGCGTTGCGTCAACGTTGAACAGGCGCA
GGAAGTGATGGCTGCGGCACCGTTGCAGTATGTTGGCGTGTTCCGCAATCACGATATTGCCG
ATGTGGTGGACAAAGCTAAGGTGTTATCGCTGGCGGCAGTGCAACTGCATGGTAATGAAGA
ACAGCTGTATATCGATACGCTGCGTGAAGCTCTGCCAGCAGGAGGGTCGACCATAACTTCGT
49
ATAATGTATACTATACGAAGTTATCCTCGAGCGGTGGCCATGTTGCCATCTGGAAAGCATTAA
GCGTCGGTGAAACCCTGCCCGCCCGCGAGTTTCAGCACGTTGATAAATATGTTTTAGACAA
CGGCCAGGGTGGAAGCGGGCAACGTTTTGACTGGTCACTATTAAATGGTCAATCGCTTGGC
AACGTTCTGCTGGCGGGGGGCTTAGGCGCAGATAACTGCGTGGAAGCGGCACAAACCGGC
TGCGCCGGACTTGATTTTAATTCTGCTGTAGAGTCGCAACCGGGCATCAAAGACGCACGTC
TTTTGGCCTCGGTTTTCCAGACGCTGCGCGCATATTAATGAGCTAGCGGCAAACCAATCCAA
GCTT) fue donada por Humberto Flores en forma ya digerida. 
La ligación se realizó en la siguiente mezcla:
PZE12 5μl 
TrpF-Loxp 2μl
bufferF 2μl
H2O 10μl
ligasa T4 1μl
Se reposó a 18°C durante 12 horas. 
La mezcla de ligación se trató con butanol para remover sales de acuerdo al protocolo siguiente:
1.-Agregar 700 μl de butanol a la mezcla.
2.-Centrifugar a 13000 rpm durante 10 minutos.
3.-Remover el sobrenadante con una micropipeta con cuidado de no desechar la pastilla.
4.-Secar la mezcla a 60°C al vacío y centrifugar hasta quedar completamente seco.
5.-Resuspender en 10 μl de H2O. 
50
Purificar plásmido PZE12
El plásmido PZE12-TrpF-LuxP se transformó en células MC1061 y se crecieron en cajas LB/AMP. Se 
inoculó una colonia en LB líquido y se creció en condiciones ordinarias, para finalmente extraer 
plásmido con una columna comercial (Roche).
PZE12-TrpF-LuxP tras digestión con las enzimas HindIII y EcoRI (). Nótese que tras liberar el inserto 
existen dos bandas del gen digerido
Figura 19: Digestión de 
PZE12-TrpF-LuxP
 
El plásmido PZE12-TrpF-luxP se digirió en las mismas condiciones de PZE12-NPr. Esta digestión no 
es completa y da dos bandas (figura 19). Para poder elucidar el origen de estas bandas, ambas se 
purificaron a la grande se le denominó M y a la chica B (figura 20). M fue cuantificada en 30ng/μl y B 
en 15ng/μl. Se hicieron ligaciones en diversas concentraciones.
Las mezclas de ligación fueron transformadas en la cepa MC1061 y se usaron dos controles adicionales 
C- que fueron células electroporadas sin DNA y C--