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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE CIENCIAS ANÁLISIS DE LOS NIVELES DE LINFOCITOS NK DE RATONES C57BL-6 TRATADOS CON GK-1 Y CÉLULAS DENDRÍTICAS CARGADAS CON MAGE-AX Y POSTERIORMENTE INOCULADOS CON MELANOMA T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: (B I Ó L O G A) P R E S E N T A : MEDINA SOLARES ILIANA ANAHÍ DIRECTOR DE TESIS: DR. GABRIELA PIÑÓN ZÁRATE CIUDAD UNIVERSITARIA, CD. MX. (2018) UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. ~Pág. 1~ HOJA DE DATOS DEL JURADO 1. DATOS DEL ALUMNO Medina Solares Iliana Anahí 5562025981 Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Ciencias Biología 309136736 5. DATOS DEL SINODAL 3 M. en C. Bucio López Laura 2. DATOS DEL ASESOR Dra. Piñón Zárate Gabriela 6.DATOS DEL SINODAL 4 Dr. Castell Rodríguez Andrés Elliú 3. DATOS DEL SINODAL 1 Dra. Ustarroz Cano Martha Luz 7. DATOS DE LA TESIS Análisis de los niveles de linfocitos NK de ratones C57BL-6 tratados con GK-1 y células dendríticas cargadas con MAGE-AX y posteriormente inoculados con melanoma. 96 pp. 2018 4. DATOS DEL SINODAL 2 M. en C. Herrera Enríquez Miguel Ángel ~Pág. 2~ ÍNDICE CONTENIDO PÁGINA 1. AGRADECIMIENTOS ACADÉMICOS…………………………… 5 2. DEDICATORIA……………………………………………………… 6 3. ABREVIATURAS…………………………………………………… 9 4. INDICE DE FIGURAS………………………………………………. 11 5. RESUMEN…………………………………………………………… 12 6. ABSTRACT………………………………………………………….. 13 7. INTRODUCCIÓN……………………………………………………. 14 I. MELANOMA MALIGNO……………………………………….. 14 1.1. Generalidades, incidencia y etiopatogenia…………… 14 1.2. Tipos de melanoma……………………………………... 15 1.3. Detección de melanoma……………………..…………. 16 II. SISTEMA INMUNITARIO Y RESPUESTA INMUNE……….. 17 2.1. Respuesta inmune innata………………………………. 18 2.2. Respuesta inmune adaptativa…………………………. 20 III. CÉLULAS DENDRÍTICAS…………………………………….. 22 3.1. Origen y diferenciación de células dendríticas………. 22 3.2. Tipos de células dendríticas…………………………… 24 3.3. Maduración y migración de células dendríticas……… 27 3.4. Captura de antígenos…………………………………… 28 3.5. Presentación de antígeno y activación de linfocitos T. 29 IV. LINFOCITOS T………………………………………………….. 31 ~Pág. 3~ 4.1. Generación de subpoblaciones de linfocitos T………. 31 4.1.1. Linfocitos T CD8………………………………… 31 4.1.2. Linfocitos T CD4………………………………… 32 V. CÉLULAS LINFOIDES INNATAS……………………………. 33 5.1. Generalidades…………………………………………… 33 5.2. Tipos de ILC……………………………………………... 34 5.2.1. Células linfoides innatas no citotóxicas………. 34 5.2.2. Células linfoides innatas citotóxicas. CÉLULAS NK……………………………………. 36 VI. INTERACCIONES ENTRE CÉLULAS DENDRÍTICAS Y CÉLULAS NK…………………………………………………… 39 VII. ANTÍGENOS TUMORALES…………………………………… 43 VIII. RESPUESTA INMUNOLÓGICA CONTRA EL CÁNCER….. 44 IX. INMUNOTERAPIA ANTITUMORAL………………………….. 45 8. ANTECEDENTES…………………………………………………... 49 8.1. Los antígenos MAGE…………………………………………… 49 8.2. El péptido MAGE-AX……………………………………………. 50 8.3. El péptido GK-1………………………………………………….. 50 8.4. Inmunoterapia adoptiva con células dendríticas…………….. 52 9. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA…………………………… 53 10. HIPÓTESIS………………………………………………………….. 54 11. OBJETIVO GENERAL…………………………………………….. 54 12. OBJETIVOS PARTICULARES…………………………………… 54 13. MATERIAL Y MÉTODO……………………………………………. 54 ▪ Obtención de GM-CSF a partir de células X-63…………. 55 ▪ Diferenciación de células dendríticas……………………... 56 ~Pág. 4~ ▪ Evaluación del fenotipo de las células dendríticas………. 57 ▪ Esquema de vacunación…………………………………… 58 ▪ Inducción de melanoma……………………………………. 58 ▪ Evaluación de efecto post-inoculación……………………. 58 ▪ Tinción de linfocitos y citometría de flujo…………………. 59 ▪ Análisis estadísticos………………………………………… 60 14. RESULTADOS……………………………………………………… 61 ▪ Fenotipo de las células dendríticas……………………………………. 61 ▪ Población de linfocitos T, macrófagos y células dendríticas……… 63 En Bazo………………………………………………………………. 63 En Ganglio Poplíteo………………………………………………… 66 ▪ Población de linfocitos NK en bazo……………………………. 69 En Bazo………………………………………………………………. 69 En Ganglio Poplíteo………………………………………………… 72 15. ESQUEMA DE MODELO EXPERIMENTAL…………………….. 76 16. DISCUSIÓN………………………………………………………….. 77 ▪ MOCDs cargadas con MAGE- AX.………………………………………. 77 ▪ Niveles de linfocitos T, B, MO y CDs residentes de órganos linfoides en bazo y ganglio…………………………………………………………... . 79 ▪ Análisis de los niveles celulares de linfocitos NK en bazo y ganglio…. 82 17. CONCLUSIONES…………………………………………………… 86 18. REFERENCIAS……………………………………………………... 87 ~Pág. 5~ AGRADECIMIENTOS ACADÉMICOS Agradezco infinitamente a la Doctora Gabriela Piñón Zárate por su dedicación, dirección y coordinación del presente trabajo. También quiero agradecer al Dr. Andrés Elliú Castell Rodríguez y al M. en C. Miguel Ángel Herrera Enríquez por sus amables asesorías y sugerencias teóricas y prácticas. Agradezco también a los miembros de mi jurado por su dedicación y valioso tiempo invertido en la revisión de esta tesis: • Dra. Martha Luz Ustarroz Cano. • M. en C. Miguel Ángel Herrera Enríquez. • M. en C. Laura Bucio López. • Dr. Andrés Elliú Castell Rodríguez. • Dra. Gabriela Piñón Zárate. Esta tesis fue realizada gracias al apoyo del proyecto DGPA PAPIIT IA207917. ~Pág. 6~ DEDICATORIA Para Itzel. Pocas personas tienen la dicha y privilegio de compartir tantas vivencias, emociones y palabras como yo lo he hecho contigo. Gracias por tu compañía, por tus consejos, por tu fortaleza, por las cantadas en el coche y por cada palabra de inspiración para que terminara este trabajo. Eres una mujer extraordinariamente fuerte, inspiradora y amorosa. Eres éxito puro. ¡Gracias, hermana! Para mi mamá. Cada letra de esta tesis es para ti. Gracias infinitas por todas las palabras de ánimo y por las incontables veces que me has apoyado para levantarme. Gracias por las risas, por cada abrazo y cada palabra. Eres la mejor bióloga que conozco, y mi primera inspiración para serlo. La mejor maestra que le he podido pedir a la vida. Me siento muy orgullosa de la mujer que eres, y doy gracias al cielo por tenerte en los buenos, en los malos y en los mejores momentos de mi vida. No sé qué haría sin ti. ¡Gracias, mami! Para mi papá. Aquí está el fruto de los sacrificios que tú y mi mamá han hecho cada día por mí. Eres el hombre más divertido, inspirador, creativo e inteligente que conozco. Gracias por tus chistes, por tus palabras de aliento y por los incesantes impulsos para que terminara este trabajo. Gracias por recordarme diariamente el significado de esfuerzo y dedicación. No concibo mejor padre que tú. Sin ti jamás lo habría logrado, eres mi orgullo. ¡Gracias, papá! A mis tíos Leonides y Lourdes. Me siento infinitamente afortunada por tenerlos a mi lado y en mi vida. Gracias por cada muestra de apoyo, comprensión y por sus palabras de aliento. A Dano, “Yeye”, Isaac,Alán, Mónica y Regi. Y a la Familia Medina del “Mundo Mundial” y, por supuesto, a todos mis primos. La perfecta definición de diversión, locura, apoyo y familia son ustedes, gracias por todas las maravillosas vivencias. Son un gran pilar en mi vida y un gran ejemplo de fortaleza, hermandad y humildad. A mi mejor amiga, confidente y hermana por elección: Brenda Rodríguez. Por todas las locuras, consejos, pláticas y experiencias. Por cada momento extraordinario a tu lado. Me siento muy feliz de saber que envejeceremos juntas. Te amo demasiado. Gracias a mis eternos amigos Jesús Alvarado, Rebeca Medina, Esleidy Rodríguez y Daniela Irais (Azul). Aún a la distancia, mi vida es hermosa y especial con ustedes en ella. ¡Gracias, amigos! Gracias Irving, por la locura de amistad que tenemos (también por las pláticas en inglés, la pizza, el karaoke y los ánimos para que terminara esta tesis). Eres mi mejor amigo en el mundo. Gracias Homero, por tu apoyo incondicional, inspiración y sabios consejos. Te admiro mucho, amigo. ¡Eres grande, Hércules! ~Pág. 7~ Gracias Marto, por tu apoyo y amistad sinceras. Eres la perfecta definición de lealtad y confianza. Te llevo en el corazón, amigo. Gracias Diego, por tu nobleza, diversión y amistad pura. Jamás te detengas. Y gracias también al resto de “La pandilla”: Chabe, Coralito, Jorge, Diego Rosas, Lalo, Chato, Beta, Aza y Azu. Gracias por tantas carcajadas, son mis personas favoritas en el mundo y las más locas que tengo el privilegio y fortuna de conocer. “Somos como somos”. Gracias a mis mejores amigos de la facultad; Montserrat Saldívar (Mo), Javier Ancona Torres, Diego Miranda, Allan López y José Sobrino. La carrera jamás hubiera sido lo mismo sin ustedes. Gracias por su amistad. Los llevo en mi corazón. Gracias a mi familia golera, GOL 44. Especialmente a Eric Viveros, Eduardo Soto, Lili Nahid, Sergio Sierra, Xóchitl, Andrea, Harumi, Aline, Rebeca, Irma, Israel, Roberto, Claudia, Luis, Ismael, Cece, Rafa, Rose, Tovar, Orqui, Pablo, Josué, Yatzel, Antonio, Jesús, Monse, Chelis, Rubí, Manuel, Sergio Sánchez (el mejor staff), Diana Vázquez y Elizabeth Sánchez. Gracias por tanto aprendizaje y su siempre incondicional amor y apoyo. Los llevo en mi corazón. Vivir el entrenamiento a su lado fue de las mejores experiencias que pudieron pasarme en la vida. A mi otra familia golera, GOL 48. Gracias por su amor comprometido y por permitirme ser parte de ustedes. Los amo. Gracias también a los integrantes del Laboratorio de Inmunoterapia. Gaby, Miguel, mi Doc., Katy, Lau, Jenny, Bety, Rose y Erick. Hacer ciencia con ustedes fue lo más divertido y bonito que he experimentado. Gracias infinitas a mis profesores. Por su esfuerzo y dedicación. Sus enseñanzas hicieron eco en mi vida y esta tesis se realizó gracias a ustedes. Gracias a: Gregorio Topalián, Julio Prieto, Jorge Rojas, Marisol Montellano, Rosa María Zúñiga, Vladimir Cachón, Ernesto Soto, Rodrigo González, Fernando Camacho y Gloria Irene Lozano. ¡Son los mejores! Finalmente, gracias a la estrella más brillante del cielo; mi abue; “Memes”. Tu legado persiste con tus hijos que son diariamente mi ejemplo a seguir. Gracias por haber sido la mujer más fuerte y dadora del mundo. No hay día que no te extrañemos. Vives en el corazón de tu familia. Sé que donde quiera que estés, estarás orgullosa por mi esfuerzo. Te amo. ~Pág. 8~ Lo que caracteriza al hombre de ciencia no es la posesión del conocimiento o de verdades irrefutables, sino la búsqueda desinteresada e incesante de la verdad. Karl Popper ~Pág. 9~ ABREVIATURAS NOMBRE ABREVIATURA Anticuerpo Ac Antígeno Ag Célula dendrítica inmadura CDi Células dendríticas CDs Células dendríticas convencionales CDcs Células dendríticas derivadas de médula ósea MOCDs Células dendríticas derivadas de monocitos CDms Células dendríticas plasmacitoides CDps Células dendríticas residentes de órganos linfoides CDr Células linfoides innatas ILC Células Natural Killer NKs Células NK convencionales cNKs Células presentadoras de antígenos APC Clúster de diferenciación CD Complejo de histocompatibilidad I MHCI Complejo de histocompatibilidad II MHCII Factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos GM-CSF Inmunoglobulinas Igs Interferones IFN Interleucina IL Linfocito T citotóxico CTL Macrófagos MO Medio Ham F-12 de crecimiento (SBF 10%, 1% antibiótico) F-12c Medio Ham F-12 de producción (Sin SBF ni antibiótico) F-12p Medio Ham F-12 de selección (SBF 10%, 1mg/ml geneticina) F-12s ~Pág. 10~ Patrones moleculares asociados a daño celular DAMP Patrones moleculares asociados a patógenos PAMP Pre- células dendríticas plasmacitoides Pre-pCDs Pre-células dendríticas convencionales Pre-cCDs Progenitor linfoide común CLP Célula Natural killer T NKT Progenitores de CDs y MO MDPs Progenitores de CDs, granulocitos y MO GMDPs Progenitores de células mieloides CMPs Receptor de célula T TCR Receptor tipo Toll TLR Receptores de citotoxicidad natural NCRs Solución salina balanceada de Hank´s (NaCl, KCl, MgSO4, CaCl2, Na2HPO4, KH2PO4, Glucosa, NaHCO3) HBSS Suero bovino fetal SBF ~Pág. 11~ ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS NO. DE FIG. DESCRIPCIÓN PÁGINA INTRODUCCIÓN Fig. 1. Tipos de melanoma 16 Fig. 2. Inmunidad innata y adaptativa 21 Fig. 3. Origen y diferenciación de las células dendríticas 23 Fig. 4 Tipos de células dendríticas y su localización 27 Fig. 5 Presentación de antígenos y activación de células T 31 Fig. 6 La familia de células linfoides innatas (ILCs) 35 Fig. 7 Desarrollo de células NK en humano y ratón 37 Fig. 8 Interacciones entre células dendríticas y células NK 42 Fig. 9 Tipos de Inmunoterapia 48 MÉTODO Fig. 10 Gráficas de puntos del fenotipo de células dendríticas 57 Fig. 11 Gráficas de puntos del fenotipo de linfocitos en bazo y ganglio 60 Tabla 1 Grupos experimentales y esquemas de vacunación 55 RESULTADOS Fig. 12 Fenotipo de las células dendríticas derivadas de médula ósea 61 Fig. 13 Poblaciones celulares presentes en bazo 63 Fig. 14 Gráficas de poblaciones celulares en bazo 65 Fig. 15 Poblaciones celulares presentes en ganglio 66 Fig. 16 Gráficas de poblaciones celulares en ganglio poplíteo 68 Fig. 17 Poblaciones de células NK presentes en bazo 69 Fig. 18 Población de linfocitos NK1.1- CD49b+ en bazo 71 Fig. 19 Población de linfocitos DP en bazo 71 Fig. 20 Población de linfocitos NK1.1+ CD49b- en bazo 72 Fig. 21 Poblaciones de células NK presentes en ganglio 72 Fig. 22 Población de linfocitos NK1.1- CD49b+ en ganglio 74 Fig. 23 Población de linfocitos DP en ganglio 74 Fig. 24 Población de linfocitos NK1.1+ CD49b- en ganglio 75 Fig. 25 Modelo experimental 76 ~Pág. 12~ Resumen El melanoma maligno es una neoplasia cutánea que se desarrolla a partir de la transformación maligna de melanocitos y presenta un alto potencial metastásico. Su incidencia en México ha aumentado hasta un 500% en la última década. Generalmente, el melanoma con metástasis es resistente a la radioterapia y a la quimioterapia, además, la mayoría de los pacientes que se someten a dichos tratamientos tienen una alta probabilidad de reincidencia, razón por la cual es urgente la búsqueda de alternativas terapéuticas que prevengan la reaparición de un tumor. Algunas de estas estrategias incluyen el uso del péptido GK-1. Por ejemplo, se ha observado que GK-1, utilizado como adyuvante, aumenta la producción de INF-γ en cultivos de esplenocitos, induce protección contra la cisticercosis murina y, en conjunto con la vacuna de la influenza produce una respuesta inmune específica. Dado lo anterior, nuestro grupo ha investigado estrategias que implican el uso de CDs cargadas con el antígeno MAGE-AX y GK-1, demostrandoque la terapia puede inducir una respuesta inmunológica tipo Th1, caracterizada por la activación de linfocitos T CD4+ y T CD8+, la producción de IL-12, INF-γ, que conlleva al 100% de sobrevida y ausencia de desarrollo tumoral en ratones retados con melanoma. Además de los linfocitos T, en el modelo experimental de melanoma utilizado por nuestro equipo, las células NK también pueden están involucradas en la producción de INF-γ, en la inmunovigilancia tumoral y ser activados por citocinas (como IL-12). Por ello, en el presente trabajo se evaluaron los niveles de linfocitos NK tras la terapia preventiva con CDs derivadas de médula ósea y cargadas con el antígeno MAGE-AX en ratones inoculados con el péptido GK-1. Para analizar lo anterior, se trataron ratones C57BL-6 con GK-1 y con CDs cargadas con el antígeno MAGE-AX. Un mes después de dicho tratamiento, los ratones se retaron con 6 x 104 células de la línea celular de melanoma B16-F10. Después de 20 días del reto con melanoma, se extrajeron bazo y ganglios poplíteos para analizar por citometría de flujo los niveles de distintas poblaciones celulares. El tratamiento con GK-1 y CDs cargadas con MAGE-AX indujo 100% de sobrevida y ausencia tumoral. Asimismo, se observó un aumento significativo (en bazo y ganglio) de los niveles de CDs residentes de órganos linfoides y de las células NK1.1+ CD49b-, NK1.1+ CD49b+ y NK1.1- CD49b+. Los resultados indican que la terapia con CDs cargadas con MAGE-AX en conjunto con el inmunomodulador GK-1, produce una potente respuesta inmune Th1 local y específica, además del incremento en poblaciones de linfocitos relacionados con la respuesta inmune innata como los linfocitos NK1.1+ CD49b-, NK1.1+ CD49b+ y NK1.1- CD49b+. Por lo que este tipo de terapias no sólo pueden inducir la activación de linfocitos T antígeno específicos, sino que también puede inducir la proliferación de células de la respuesta inmune innata relacionadas con la inmunovigilancia antitumoral. ~Pág. 13~ ABSTRACT Malignant melanoma is the greatest cutaneous metastasic neoplasia derived from the malignant transformation of melanocytes. In Mexico the incidence of malignant melanoma has increased up to 500% in the last decade. It is well known that metastasic melanoma is resistant to chemotherapy and radiation. However, most of the patients who undergo some of these treatments have a high probability of reincidence. Accordingly, it is necessary to develop more effective therapeutic therapies that prevent tumor recurrence. Some studies with GK-1 peptide used as an adjuvant, demonstrated an increased production of INF-γ by splenocytes, immune protection against murine cysticercosis and, in conjunction with influenza vaccine, enhances a specific immune response. Therefore, our group have demonstrated that the use of dendritic cells (DCs) loaded with MAGE-AX antigen and GK-1 peptide could lead a Th1 immune response characterized for the activation of T CD4+ and T CD8+ lymphocytes, an increase of IL-12 and INF-γ production, 100% of survivor in melanoma challenged mice, and tumor absence in all individuals. In addition to T lymphocytes, NK cells are involved in the INF-γ production and immune surveillance of tumors. Hence, in this work we evaluated NK cells levels after vaccination with bone marrow derived dendritic cells (BMDCs) loaded with MAGE-AX antigen in GK-1 inoculated mice. For that purpose, C57BL/6 mice were inoculated with MAGE-AX loaded BMDCs and GK-1. One month after this treatment, mice were treated with 6 x104 B16-F10 melanoma cells, which can induce a tumor. Then, after 20 days of melanoma induction, spleen and lymph nodes were extracted and the cell populations were analyzed by flow cytometry. The treatment with GK-1 peptide and MAGE-AX antigen loaded BMDCs induced 100% of survivor and tumor absence in melanoma challenged mice. Besides, we observed a significant increase of lymphoid- resident dendritic cells (LRDCs) and NK1.1+ CD49b+, NK1.1+ CD49b- and NK1.1- CD49b+ cells in spleen and lymph nodes. These results indicate that MAGE-AX antigen loaded DCs and GK-1 peptide therapy produces a potent and local specific immune response and immune protection against melanoma. ~Pág. 14~ INTRODUCCIÓN I. MELANOMA MALIGNO 1.1. GENERALIDADES, INCIDENCIA Y ETIOPATOGENIA El melanoma maligno es una neoplasia cutánea que se desarrolla a partir de la transformación maligna de melanocitos (células de origen neuroectodérmico productoras de melanina) y presenta un alto potencial metastásico (Vidrio G., 2007). Su pronóstico depende de la extensión de la enfermedad, con una supervivencia de 90% en los tumores localizados, la cual se reduce a menos de 15% en los melanomas con metástasis (Cárdenas M.L, 2010). Es el tercer cáncer de piel más frecuente después del carcinoma basocelular y del epidermoide, y su incidencia en México ha aumentado hasta en un 500% en la última década. A pesar de que los casos de melanoma representan el 5% del total de todas las neoplasias de piel, es responsable del 95% de todas las muertes por cáncer de piel (Pitcovski J. et al, 2017; Vidrio G., 2007) En México, representa el 7.9% de los tumores de la piel y es diagnosticado frecuentemente entre los 30-50 años. Se presenta usualmente en la piel del tórax en hombres y, en miembros inferiores en mujeres (a) Vidrio G., 2003; b) Vidrio G., 2007; Cárdenas, 2010) En cuanto a etiopatogenia se sabe que algunos factores como la susceptibilidad genética al melanoma, una prologada y frecuente exposición a rayos ultravioleta, aumentan la predisposición de padecer esta enfermedad (Mordoh, 2009; Vidrio, 2003). Existen características propias del individuo que predisponen a un riesgo mayor para desarrollar melanoma que se pueden resumir como: la aparición de un melanoma previo, piel blanca, pelo rubio o pelirrojo, ojos claros, 3) aumento en el número de lunares (nevos atípicos), historia familiar positiva, presencia de nevos congénitos, inmunosupresión, entre otros (Acosta E. et al, 2009; Vidrio G., 2003). ~Pág. 15~ 1.2. TIPOS DE MELANOMA Existen cuatro tipos básicos de melanoma que cuentan con características clínicas diferentes entre sí (Fig. 1). 1. Melanoma lentigo maligno. Se observa más frecuentemente en áreas expuestas en forma crónica al sol, como la cara, cuello y antebrazos y, es común en personas de edad avanzada. Se muestra como una lesión hiperpigmentada, irregular, de larga evolución. Es menos agresivo, puede permanecer “in situ” por varios años y cuando hay induración (endurecimiento del tejido cutáneo y subcutáneo), indica progresión hacia un melanoma invasor. Este tipo de melanoma se origina a partir de células madre localizadas en los folículos pilosos (Acosta et al, 2009). 2. Melanoma de extensión superficial. Es la forma más común en personas de raza blanca. Al inicio es una lesión plana, con diferentes tonos de pigmentación, y conforme avanza puede mostrar una zona elevada. Es el tipo más frecuente de melanoma de crecimiento radial (Acosta, 2009; Vidrio, 2003) 3. Melanoma nodular. Caracterizado por la ausencia de compromiso epidérmico (al menos en fases iniciales) y de extensión radial. Presenta una forma con relieve cuya superficie puede ser lisa y de varias tonalidades que van desde negro/ azuloso hasta no presentar pigmento alguno, aunque siempre presenta una coloración uniforme. Esta variedad casi desde el inicio tiene crecimiento vertical y es invasor, con tendencia a diseminarse (Acosta, 2009). 4. Melanoma acral lentiginoso. Empieza como una lesión macular, con pigmentación irregular de diversos tonos, se extiende en forma periférica o radial, para después convertirse en lesiones con relieve. Se localiza en la región palmar o plantar. Esta forma, y el melanoma nodular, son las variedades más frecuentes en nuestro país (Vidrio G., 2003). ~Pág. 16~Fig. 1. Tipos de melanoma. Tomado y modificado de Acosta A. et al, 2009. Una de las principales características del melanoma en etapas avanzadas (con metástasis) es la resistencia a la radioterapia y a la quimioterapia, razón por la cual se hace urgente la búsqueda de alternativas terapéuticas menos invasivas (Cárdenas, 2010; Bhuvanesh S. K. et al, 2017). 1.3. DETECCIÓN DE MELANOMA La detección de melanoma se basa en distintas estrategias. La más común es la exploración médica y detección visual donde el médico plantea preguntas al paciente, especialmente en relación con los posibles factores de riesgo y sobre la evolución del lunar o lunares sospechosos, luego, se lleva a cabo la extirpación de la lesión. Tras la extirpación del tumor es obligatoria una exploración histopatológica que se considera como el gold standard para el diagnóstico de la enfermedad. El análisis consiste en una evaluación histológica con H-E y un posterior análisis inmunohistoquímico para evidenciar la presencia de antígenos tumorales como HMGB45, S-100, tirosinasa, Melan A, entre otros, que se encuentran expresados en melanoma. Esto confirmará el diagnóstico de certeza de melanoma (Acosta, 2009; Pitcovsky J., 2017). También se realiza una exploración del resto de la piel. Un lunar sospechoso presenta las características “ABCDE” (no todos los melanomas presentan las cuatro características): A) asimetría de la forma, B) bordes irregulares o poco definidos, C) color cambiante que varía dependiendo de las zonas, D) diámetro mayor a 6 mm y E) evolución. Otra estrategia es la dermatoscopia, la cual consiste en utilizar un pequeño dispositivo denominado dermatoscopio que ilumina y amplía los puntos de la piel para una exploración más precisa. Aunque no siempre sea necesaria la ~Pág. 17~ exploración con dermoscopio, mejora la exactitud el diagnóstico cuando la realiza un médico con experiencia en el uso de esta técnica (Acosta, 2009) II. SISTEMA INMUNITARIO Y RESPUESTA INMUNE El sistema inmunitario evolucionó para proteger a los organismos multicelulares contra agentes patógenos. Sus principales funciones son la defensa contra microorganismos y la inmunovigilancia contra la emergencia de tumores y de enfermedades autoinmunes y alérgicas (Toche P., 2012). Es altamente adaptable y usa varios mecanismos efectores potentes que tienen la habilidad de destruir una gran cantidad de agentes microbianos y moléculas alergénicas y tóxicas (Chaplin, 2010). Esta diversidad de agentes patógenos potenciales requiere una gama de mecanismos de reconocimiento y destrucción para estar a la par con la variedad de invasores (Owen, 2014). Por esta razón, el sistema inmunitario completo comprende tanto órganos, células y moléculas que se encuentran íntimamente interconectados (Rojas, 2012). Por otro lado, la respuesta inmune se define como la acción conjunta de células y moléculas que nos defienden de las agresiones externas (por agentes patógenos o alérgenos externos) e internas (como infecciones virales y células transformadas o malignas) (Rojas, 2012). La respuesta que se inicia al contacto con un patógeno se conoce como respuesta inmune innata y corresponde a la primera línea de defensa del huésped. Posee mecanismos pre-existentes que se activan de manera inmediata y que preceden a la inmunidad adaptativa, la cual se centra en el desarrollo de linfocitos T y B específicos, y se caracteriza por aumentar la capacidad defensiva del huésped frente a exposiciones sucesivas de Ags (figura 2) (Rojas, 2012; Owen, 2014; Toche P., 2012). ~Pág. 18~ 2.1. RESPUESTA INMUNE INNATA La defensa contra los organismos patógenos está mediada por las respuestas mediadas por la inmunidad innata y adaptativa. La inmunidad innata es el conjunto de mecanismos que constitutivamente actúan contra todos los microorganismos patógenos desde el primer contacto con ellos y constituye la primera línea de defensa. Es inmediata, no específica y consta de mecanismos de defensa celulares y moleculares que existen antes de la infección y que pueden responder eficaz y rápidamente a ella. Sin embargo, este tipo de respuesta es incapaz de generar memoria inmunológica en el huésped. Si no logra controlar al antígeno o patógeno, inicia una serie de procesos que llevan al desarrollo de una respuesta inmune adaptativa o adquirida (Fig. 2) (Abbas, 2012; Owen, 2014). CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNE De acuerdo con Rojas M. y colaboradores (2012), existen diversos tipos de células que participan de manera inmediata ante el primer encuentro con un agente extraño o con una célula anormal. Estas son: 1. Células epiteliales. Constituyen la interfaz medio ambiente, medio interno y forman barreras que evitan el ingreso de agentes externos. Secretan péptidos anti-microbianos, producen citocinas y quimiocinas que atraen a otras células para la defensa contra patógenos (Rojas, 2012). 2. Células endoteliales. Cubren el interior de vasos sanguíneos y regulan el paso normal de las células que censan los tejidos en busca de antígenos. También facilitan el paso de células indispensables para la defensa del huésped (Rojas, 2012). 3. Células fagocíticas. Incluyen a monocitos, neutrófilos y células dendríticas. Atrapan, procesan y desintegran patógenos. Producen moléculas mediadoras de la inflamación (Rojas, 2012). 4. Células presentadoras de antígenos (APC). Capturan, procesan antígenos y migran a órganos linfoides secundarios donde los presentan a linfocitos T para dar inicio a una respuesta inmune adaptativa (Rojas, 2012). ~Pág. 19~ 5. Mastocitos y basófilos. Liberan sus gránulos para iniciar la defensa contra patógenos, liberando moléculas vasodilatadoras y que incrementan la permeabilidad vascular para facilitar el paso a los tejidos de células, factores del complemento y anticuerpos (Rojas, 2012). 6. Eosinófilos. Ayudan a la defensa contra parásitos, sobre los que liberan proteínas tóxicas que destruyen sus membranas. Participan en procesos alérgicos (Rojas, 2012). 7. Células linfoides. Se activan de manera inmediata al reconocer carbohidratos y lípidos de patógenos, se clasifican en: 7.1. Células linfoides innatas (ILC): Estas células expresan varios de los receptores normalmente encontrados en las células progenitoras linfoides, pero no las marcas moleculares propias de los linfocitos maduros. Se ubican estratégicamente a lo largo de mucosas, tienen la capacidad de producir varias citocinas y generan distintas subpoblaciones. Se comentarán más adelante. A este grupo pertenecen las células NK. 7.2. Linfocitos γδ: Pueden capturar antígenos sin la ayuda de células presentadoras, no requieren la expresión de moléculas co-estimulatorias para actuar y no generan memoria. 7.3. Linfocitos B-1: Se caracterizan por expresar en su membrana la molécula CD5. Su principal función es la de neutralizar rápidamente algunos virus y bacterias aún sin tener contacto directo con ellos. 7.4. Linfocitos T asesinos naturales (NKT): Son células con morfología similar a las células NK que expresan TCR y NK1.1 de linaje linfoide, y comparten características con células T. Son citotóxicas para células que expresen Ag lipoproteicos. 7.5. Células iNKT: Son células de morfología linfoide y se caracterizan por poseer un receptor de Ag invariable, así como por su capacidad de producir rápidamente citocinas que polarizan una respuesta Th1, Th2 o Th17, después de ser activadas (Rojas, 2012). ~Pág. 20~ 2.2. RESPUESTA INMUNE ADAPTATIVA CÉLULAS PRESENTADORAS DE ANTÍGENOS Cualquier interacción entre una respuesta inmune innata y adaptativa requiere de la traducción precisa y constante de señales de la respuesta contra daño o infección. En el centro de esta interacción se encuentran las APC, un grupo heterogéneo de células que funcionan como centinelas, y las cuales contantemente se encuentran vigilando elmicroambiente celular en busca de antígenos. Pertenecen a este grupo las CDs, los macrófagos y los linfocitos B. Tras captar y procesar antígenos, las APC regulan el alza de expresión de moléculas del Complejo Principal de Histocompatibilidad de tipo I y II, y otras moléculas implicadas en la estimulación y activación de linfocitos T (como CD80, CD86, CD40, etc.) que facilitan la sinapsis inmunológica entre una APC y un linfocito T virgen (Fig. 2) (Owen, 2014; Piñón- Zárate et al, 2014). ~Pág. 21~ Fig. 2. Inmunidad innata y adaptativa. Los elementos de la respuesta inmune innata son las barreras físicas y las barreras químicas, que previenen la infección. Cuando un agente extraño atraviesa esta primera línea de defensa, es detectado por células inmunitarias como; células NK, MO y CDs entre otras, que a través de receptores y la liberación de citocinas, permiten el reclutamiento de más células al sitio de daño. También, la liberación constitutiva de citocinas permite la activación de una respuesta inmune adaptativa, mediada por células T y caracterizada por la producción de anticuerpos y citocinas pro-inflamatorias (Imagen original). ~Pág. 22~ III. CÉLULAS DENDRÍTICAS 3.1. ORIGEN Y CARACTERÍSTICAS DE LAS CÉLULAS DENDRÍTICAS Las CDs fueron descubiertas por Ralph Steinman y Zanvil Cohn a finales de la década de los 70 (Merad, 2013). Representan una fracción heterogénea y pequeña del sistema hematopoyético especializada en la captura, procesamiento y presentación de antígenos (Kushwah, 2011). Son capaces de reconocer patógenos, señales de daño tisular y antígenos tumorales. Existe una gran variedad de CDs con distintos fenotipos y localizaciones, formando un sistema distribuido ampliamente por todo el cuerpo (Castell et al, 2017). Se originan a partir de células precursoras CD34+ en médula ósea y se reporta su presencia en todos los tipos de tejidos (Banchereau & Palucka, 2005; Rojas, 2012). Se pensaba que las CDs podrían tener un origen linfoide o mieloide, sin embargo, tras varios experimentos en el 2007, se descubrió que las CDs se originan a partir de un progenitor mieloide común (CMP) y de un progenitor linfoide común (CLP), y que la diferenciación hacia CDs implica la acción de distintos factores de crecimiento como Flt3L receptor de Flt3 (Fms-like tyrosine kinase 3; por sus siglas en inglés), el factor de estimulación de colonia de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) y M-CSF (Castell et al, 2017). Entre los distintos factores de crecimiento, el más importante es Flt3L y está implicado en el desarrollo de distintos tipos de CDs. También se ha sugerido su papel en el mantenimiento y desarrollo de CDs en órganos linfoides y mucosas. Por su parte, el factor GM-CSF está relacionado con la diferenciación in vitro e in vivo de progenitores de CDs y se sugiere su papel en la migración y activación de las CDs en órganos linfoides. El factor M-CSF por otro lado, está implicado con la diferenciación de monocitos. En humano, se conocen tres precursores de CDs; GMDPs (progenitores de CDs, granulocitos y macrófagos), MDPs (progenitores de CDs y macrófagos) y, CDPs (progenitores de CDs comunes). Conforme se diferencian, adquieren otro fenotipo expresando distintos ~Pág. 23~ marcadores de superficie como CD34, Lin, M-CSFR, Flt3, c-Kit, Siglec-H, CD123, entre otros. Bajo la influencia de Flt3-L, las CDs convencionales y las CDs plasmacitoides, se originan a partir de CDPs. En ratón también se conocen varios precursores; CMPs (progenitores de células mieloides), MDPs y CDPs. Estos se diferencian en pre-cCDs (pre- células dendríticas convencionales) y pre-pCDs (pre- células dendríticas plasmacitoides). Las primeras darán origen a las CDs convencionales, y las segundas a CDs plasmacitoides, respectivamente (Castell et al, 2017) (Fig. 3). Fig.3. Origen y diferenciación de las CDs en humano y ratón. Se requieren de factores de crecimiento como GM-CSF y Flt3-L para la correcta diferenciación de las CDs. Éstas, van adquiriendo un fenotipo diferente en cada etapa, expresando distintos marcadores de superficie como CD34, Lin, M-CSFR, Flt3, c-Kit, Siglec-H, CD123, entre otros. GMDPs (progenitores de CDs, granulocitos y macrófagos), MDPs (progenitores de CDs y macrófagos), CDPs (progenitores de CDs comunes), CMPs (progenitores de células mieloides), pre-cCDs (pre- células dendríticas convencionales) y pre-pCDs (pre- células dendríticas plasmacitoides) (Modificado de: Castell R. et al, 2017). ~Pág. 24~ Las CDs presentan una morfología propia, caracterizada por la presencia de numerosos procesos membranosos que pueden tomar la forma de dendritas o pseudópodos. Contienen altas concentraciones de estructuras intracelulares relacionadas con el procesamiento de antígenos como endosomas, lisosomas, etc. Están presentes en tejidos y órganos linfoides y no linfoides, así como circulando en linfa aferente y sangre periférica. Se caracterizan por la elevada expresión de moléculas MHC-I y II, y la ausencia de marcadores como CD14, CD3, CD19, CD20 y CD24. Además, presentan moléculas de adhesión (como CD11a, CD11c, CD50, CD54, CD58 y CD102) y moléculas co-estimulatorias (CD40, CD80, CD86, CD273). Su fenotipo varía a lo largo de los diferentes estados de maduración y activación (Banchereau & Palucka, 2005; Begoña et al, 2012; Palucka & Banchereau, 2012) (Fig. 3). 3.2. TIPOS DE CÉLULAS DENDRÍTICAS Las CDs son un grupo heterogéneo que ha sido dividido en distintas categorías. Esta clasificación se basó inicialmente en la expresión diferencial de moléculas de superficie, sin embargo, actualmente se conocen cuatro grandes categorías de CDs que son: CDs convencionales, células de Langerhans, CDs plasmacitoides y CDs derivadas de monocitos (Castell et al, 2017; Belz & Nutt, 2012; Palucka & Banchereau, 2012; Palucka & Banchereau, 2013) (Fig.4). CDS CONVENCIONALES (cCDs) Las cCDs están especializadas en la presentación y procesamiento de antígenos, y se dividen a su vez, en cCD1s y cCD2s. Las cCD1s se caracterizan por la expresión de CD8+ CD103+ en ratón y BDCA3+ (CD141+) en humano. Tienen como función la presentación de antígenos endógenos (son especialmente sensibles al reconocimiento de restos celulares causados por apoptosis/ necrosis), ~Pág. 25~ la polarización de células T helper a una respuesta Th1 y la secreción de INF en respuesta a una estimulación vía TLR3 (Toll like-receptor 3). El fenotipo de las cCD2s, en cambio, es CD11b+ CD4+ CD8− en ratón, y BDCA1+ (CD1c+) en humano, y se especializan en la presentación de antígenos a células T CD4+. Además, son capaces de inducir respuestas Th2 o Th17, lo cual enfatiza su importancia en la respuesta contra patógenos extracelulares (Fig. 4) (Castell et al, 2017; Belz & Nutt, 2012; Kushwah, 2011; Pakalniskyte, 2017; Schlitzer & Ginhoux, 2014; Schlitzer, 2015; Schlitzer, 2015). Las cCDs también pueden clasificarse y dividirse en: CDs migratorias y CDs residentes de órganos linfoides. Las CDs migratorias se desarrollan a partir de progenitores presentes en tejidos periféricos y actúan como centinelas en busca de antígenos. A partir de los tejidos periféricos, las CDs migran a órganos linfoides secundarios donde interactúan con células T inmaduras. Es importante recalcar que las CDs migratorias no se encuentran en bazo, únicamente en ganglios linfáticos, donde su proporción es dependiente del tejido del que provienen. Las CDs migratorias se dividen en CDs CD11b+ (también conocidas como CDs dermales o CDs intersticiales) y las CDs CD11b- que también expresan CD103 (o integrina αE) (Belz & Nutt, 2012; Kushwah, 2011; Palucka & Banchereau, 2013). La segunda categoría de CDs convencionales se conoce como CDs residentes de órganos linfoides (CDrs), las cuales colonizan el bazo, ganglios linfáticos y el timo. Este tipo de CDs puede clasificarse de acuerdo a la expresión de CD4 y CD8α en:1) CDs CD4+, 2) CDs CD8α+ y 3) CDs CD4-CD8α- (o doble- negativas). Las CDs CD8α+ se caracterizan por su gran capacidad para presentar antígenos y por inducir una respuesta citotóxica dependiente de linfocitos T CD8+. Los otros dos subgrupos de CDs son más eficientes para presentar antígenos vía MHC-II a células T CD4+, no son capaces de migrar a otros órganos y se desarrollan a partir de precursores presentes en tejidos linfoides. En ausencia de un estímulo de infección permanecen en estado inmaduro, es decir, presentan alta capacidad endocítica y baja expresión de MHC-II comparada con las CDs maduras. Su presencia en tejido linfoides las hace ideales para reconocer antígenos y patógenos presentes en sangre (Belz & ~Pág. 26~ Nutt, 2012; Kushwah, 2011; Hu & Wan, 2011; Palucka & Banchereau, 2012; Palucka & Banchereau, 2013). CÉLULAS DE LANGERHANS (CL) Las células de Langerhans (CL) residen en la piel y al igual que las CDs migratorias, se desplazan a órganos linfoides secundarios para presentar antígenos. Sin embargo, a diferencia de las CDs convencionales que se derivan de precursores de medula ósea. (Belz & Nutt, 2012; Palucka & Banchereau, 2013). CDS PLASMACITOIDES (CDps) Son células quiescentes distribuidas por todo el organismo y se caracterizan por la rápida producción de interferones de tipo 1 (INF tipo I) en respuesta a infecciones virales. Se sabe que las CDps juegan un papel importante en la diferenciación de células B vírgenes a células plasmáticas a través de la secreción de INF e interleucina-6 (IL-6). Pueden madurar y presentar antígenos virales endógenos (vía MHC-II) (Belz & Nutt, 2012; Kushwah, 2011; Hu & Wan, 2011) CDs DERIVADAS DE MONOCITOS (CDms) Bajo condiciones inflamatorias, los monocitos en sangre pueden ser rápidamente movilizados y diferenciados a CDs. También se les encuentra en tejidos periféricos (menos cerebro) y pueden presentar antígenos y migrar subsecuentemente a nódulos linfáticos (Belz & Nutt, 2012; Kushwah, 2011; Hu & Wan, 2011). ~Pág. 27~ Fig. 4. Tipos de células dendríticas convencionales y su localización en los distintos órganos. Las células dendríticas convencionales pueden subdividirse en cCD1 y cCD2, ambas expresan distintos marcadores y se encuentran ampliamente distribuidas en la piel, pulmones, bazo, las placas de Peyer en el intestino, sangre y ganglios linfáticos. Modificado de: Castell et al, 2017. 3.3. MADURACIÓN Y MIGRACIÓN DE CÉLULAS DENDRÍTICAS Como ya se mencionó, el fenotipo de las CDs cambia según el nivel de maduración. Las células dendríticas inmaduras (CDi) expresan CCR1 y CCR3, cuyos ligandos se expresan en los endotelios activados y en células inflamatorias, promoviendo su residencia en la piel, bazo, hígado, pulmón, corazón, riñón y mucosas, constituyendo una red de CDs intersticiales en todos los órganos exceptuando al sistema nervioso central y testículo (Begoña et al, 2012). ~Pág. 28~ La función principal de las CDi es la captura de antígenos. El fenotipo de las CDi se caracteriza por la expresión de grandes cantidades de receptores de quimiocinas inflamatorias, que les permiten extravasarse en los tejidos, y por una baja expresión de moléculas co-estimulatorias, de adhesión, de MHC y marcadores específicos de CDs. Sólo cuando la CDi es expuesta a estímulos exógenos o endógenos derivados de bacterias, virus, células necróticas, cuerpos apoptóticos, proteínas de choque térmico e inmunocomplejos, se incrementa la expresión de MHC-II y de moléculas co-estimulatorias como CD80, CD86 y CD40. Los Ag son capturados ya sea por macropinocitosis, endocitosis mediada por receptor o fagocitosis, gracias a los receptores de superficie en las CDs como receptores de Fc, integrinas, lectinas tipo C, y receptores scavenger, como LOX-1 y CD91 (Banchereau & Palucka, 2005; Begoña et al, 2012; Cárdenas, 2010; Palucka & Banchereau, 2013). 3.4. CAPTURA Y PROCESAMIENTO DE ANTÍGENOS En el interior de las CDs, los antígenos son procesados, degradados a péptidos y luego son cargados en MHC para ser presentados a células T CD8+. En general éstos péptidos se derivan de proteínas intracelulares endógenas que se procesan en el citosol y se degradan por vía endógena de procesamiento. Las proteínas intracelulares son ubiquitinadas y degradadas en péptidos por el proteasoma y posteriormente, son transportadas al retículo endoplásmico rugoso (RER) donde son cargados en un MHC-I. Los complejos MHC-péptido son llevados desde el RER a la membrana celular a través de la red Trans-Golgi para la presentación de Ag a los linfocitos T CD8+ (Begoña et al, 2012; Cárdenas, 2010; Owen, 2014). En cambio, las moléculas MHC clase II presentan Ag a células T CD4+, éstos péptidos se derivan de proteínas exógenas (ya sea propias o extrañas) que se degradan por la vía exógena de procesamiento. Esto quiere decir que los antígenos exógenos son procesados en endosomas que se fusionan con lisosomas portadores de proteasas responsables de la degradación de las proteínas en péptidos que se unirán a moléculas MHC-II. Los complejos MHC-péptido son transportados a la superficie celular, donde presentaran antígeno a linfocitos T ~Pág. 29~ CD4+. Estas proteínas exógenas pueden ser presentadas a células T CD8+ en el contexto de MHC-I, fenómeno conocido como “presentación cruzada”; esto permite la activación de una respuesta inmune tanto de linfocitos T CD4+ como de linfocitos T CD8+ (Begoña et al, 2012; Owen, 2014). 3.5. PRESENTACIÓN DE ANTÍGENOS Y ACTIVACIÓN DE LINFOCITOS T El fenómeno central en la generación de reacciones inmunitarias humorales y celulares es la activación y expansión clonal de células T. Cuando las CDs aumentan la expresión de moléculas co-estimulatorias MHCI y II, se les conoce como CDs maduras y son capaces de migrar hacia los órganos linfoides secundarios para la presentación de antígenos y la activación de linfocitos T. El reconocimiento del antígeno por linfocitos T CD4+ o T CD8+ depende del complejo del TCR (Receptor de células T), que no distingue entre antígenos intracelulares o extracelulares, por lo que su especificidad depende de su unión al MHC correspondiente. La activación de las células T, por tanto, es iniciada por la interacción entre el complejo TCR-CD3 localizado en los linfocitos T y un complejo péptido-MHC expresado sobre la superficie de una CD (Abbas, 2012; Owen, 2014). No obstante, para que el proceso de activación de los linfocitos T vírgenes sea exitoso y logren su diferenciación en células efectoras, es necesario la participación de tres señales durante la presentación de antígenos entre el linfocito T y las CDs: interacción TCR-antígeno-MHC, señalización a través de moléculas co- estimulatorias y producción de citocinas, como se describe a continuación (Owen, 2014). ~Pág. 30~ PRIMERA SEÑAL DE ACTIVACIÓN: RECONOCIMIENTO DEL ANTÍGENO El reconocimiento de antígenos por el TCR induce el acercamiento de varios complejos del TCR que se acompaña de la reorganización y acercamiento de moléculas de membrana y proteínas de señalización hacia la zona de contacto con la CD. Esta zona de contacto entre las membranas del linfocito T y la CD, se conoce como sinapsis inmunológica. Tras el reconocimiento del antígeno, y de la formación de la sinapsis inmunológica, se inicia un proceso de señalización en el citoplasma que induce la activación de factores de transcripción implicados en la activación del linfocito T (Rojas, 2012). SEGUNDA SEÑAL DE ACTIVACIÓN: CO-ESTIMULACIÓN Una molécula co-estimulatoria es aquella molécula de membrana que por sí misma no es capaz de activar a un linfocito T, pero que puede amplificar o reducir de manera significativa la señalización inducida por el complejo del TCR. Las moléculas co-estimulatorias clásicas en las CDs son CD80, CD86 y CD40, las cuales pueden interactuar con CD28y CD40L expresadas por el linfocito T. Las señales co-estimulatorias positivas se conocen como la segunda señal de activación y son indispensables para potenciar la producción de interleucina-12 (IL- 12) por las CDs, debido a que proporcionan un estímulo sostenido del factor de transcripción nuclear NF-κB. La interacción entre estas moléculas inicia además señales anti-apoptóticas que prolongan la vida de los linfocitos T, inician la expresión de moléculas de adherencia, inducen la producción de factores de crecimiento y de citocinas que promueven la diferenciación y proliferación de los linfocitos T (Abbas, 2012; Owen, 2014; Rojas, 2012). TERCERA SEÑAL DE ACTIVACIÓN: CITOCINAS Las consecuencias y la magnitud de la activación de las células T también están conformadas por la actividad de citocinas solubles producidas tanto por las CDs, como por células T. Las citocinas se unen a receptores de superficie, lo cual estimula una cascada de señales intracelulares que pueden aumentar la proliferación y/o supervivencia. ~Pág. 31~ En respuesta a estas señales de activación, el linfocito T inicia la síntesis de la IL-2 y expresa de manera transitoria el receptor para el mismo. Mientras que la IL-12 producida por las CDs, permite la expansión clonal que da origen a un gran número de linfocitos T con un receptor idéntico al del linfocito T, con el cual se inició la expansión clonal capaz de reconocer únicamente el antígeno que indujo su activación. La fase de activación y expansión clonal de los linfocitos T es seguida por una fase de muerte durante la cual un 90% de las células efectoras es eliminado por apoptosis. Los mecanismos que inducen esta fase de muerte incluyen interacciones Fas- FasL, CD40- CD40L, etc. (Abbas, 2012; Rojas, 2012) Fig. 5. Presentación de antígenos y activación de linfocitos T. Las CDs reconocen antígenos, los captan a través de PRRs y los presentan a linfocitos T en conjunto con varias señales de activación como moléculas co-estimulatorias como CD80, CD86 y CD40. Esto, a su vez, activa señal para polarizar una respuesta tipo Th1 o Th2. (Kapsenberg, 2003). IV. LINFOCITOS T 4.1. Subpoblaciones de linfocitos T 4.1.1. Linfocitos T CD8+ Cuando un linfocito TCD8+ desarrolla sus funciones efectoras se convierte en un linfocito T citotóxico (CTL) capaz de atacar directamente y destruir células malignas ~Pág. 32~ o aquellas infectadas por un virus. Para ejercer su función, el linfocito T citotóxico induce apoptosis en las células blanco mediante la liberación de gránulos con perforinas y grandzimas, o por medio de la expresión de ligandos para receptores de muerte como Fas- ligando de Fas (Fas-L o CD95) (Abbas, 2012). 4.1.2. Linfocitos T CD4 La diferenciación de un linfocito T CD4+ en distintas subpoblaciones o fenotipos es crucial para una apropiada respuesta inmune que proteja al huésped y una inmunoregulación normal. Esas subpoblaciones se clasifican de acuerdo al perfil de citocinas que secretan y por factores de transcripción, también llamados “reguladores maestros” (Nakayamada, 2012): A. Linfocitos TH1 Las citocinas clave que inducen la diferenciación de células T vírgenes hacia células TH1 son IL-12, IL-18 e INF-γ, y son liberadas por MO y CDs después de ser activadas por patógenos intracelulares. Estos linfocitos T producen INF-γ, INF-α, INF-β, e IL-2 (Nakayamada, 2012; Owen, 2014). B. Linfocitos TH2 La respuesta tipo TH2 es inducida por patógenos intracelulares y alérgenos. Se genera por efecto de las IL-4, IL-25, IL-33 a IL-11, secretadas por mastocitos, eosinófilos y células NKT (Rojas, 2012; Nakayamada, 2012). C. Linfocitos TH17 Se generan por la acción conjunta de la IL-6, IL-21, IL-23 y TGF-β. La IL-17, en sinergismo con el TNF, para promover la liberación de quimiocinas y de mediadores de la inflamación como IL-8 y GM-CSF (Nakayamada, 2012; Rojas, 2012). D. Linfocitos TREG Las células TREG presentan el fenotipo CD4+CD25+ y representan el 5% al 10% de los linfocitos T CD4+ en sangre periférica. La presencia de este tipo de células es ~Pág. 33~ esencial para prevenir el desarrollo de enfermedades autoinmunes y evitar alergias (Abbas, 2012). E. Linfocitos TFH Se caracterizan por la producción constitutiva de CXCR5 lo que permite su retención en los órganos linfoides y su interacción con linfocitos B, donde inducen la diferenciación de éstos a células plasmáticas, la producción de anticuerpos con diferentes isotipos y la producción de linfocitos B de memoria (Nakayamada, 2012; Rojas, 2012). V. CÉLULAS LINFOIDES INNATAS 5.1. GENERALIDADES DE LAS ILCs En los últimos años se han encontrado evidencias de que el sistema inmune innato es capaz de montar una estrategia similar a una respuesta efectora Th para asegurar la primera línea de defensa contra patógenos a través de células linfoides innatas (CLI o ILC, en inglés) (Cella et al, 2014). Estas células pueden interactuar y comunicarse directamente con una gran variedad de células hematopoyéticas y no hematopoyéticas para establecer una respuesta inflamatoria, inmunitaria y homeostática en múltiples tejidos del organismo (Artis & Spits, 2015). Las ILC juegan un papel importante en las respuestas inmunes innatas en diferentes sitios y en la organización de los tejidos linfoides, especialmente en la vida fetal. Las células linfoides innatas, al igual que las células Th, son un grupo heterogéneo y pueden dividirse en dos grupos: ILCs citotóxicas (células NK) e ILCs no citotóxicas, estas últimas pueden subdividirse a su vez en tres grandes grupos: ILC1, ILC2 e ILC3. Frecuentemente se encuentran en la lámina propia de mucosas donde constantemente censan los cambios en el microambiente respondiendo a través de la liberación de citocinas específicas que limitan el daño provocado por la entrada de determinado patógeno al organismo. La incorporación de ILC en los tejidos de ~Pág. 34~ barrera ocurre durante el desarrollo embrionario y la migración tardía de las ILCs también ocurre durante la inflamación. También, se encuentran presentes en tejidos adultos (Artis & Spits, 2015; Montaldo & Vacca, 2014). En relación a su origen, está bien establecido que todos los linfocitos se originan a partir de un progenitor linfoide común (CLP) que se diferencia en precursores comprometidos a linajes celulares específicos. Mientras que los precursores de células T y B están bien caracterizados, los precursores de ILCs han sido recientemente identificados. La población de precursores que origina células pertenecientes a todos los grupos de ILCs es muy similar a los CLPs, pero se caracterizan por expresar la integrina α4β7, y se definen como células precursoras α linfoides (αLP). Las células αLP expresan, además, el receptor de quimiocinas CXCR6 y pueden diferenciarse en NKs convencionales (cNKs) e ILC del grupo 3. Por otro lado, existen precursores que expresan el represor transcripcional Id2 y pueden originar ILC1s, ILC2s, ILC3s y NKs (Artis & Spits, 2015; Cella et al, 2014) (Fig. 6). Como se mencionó con anterioridad, las ILC pueden dividirse en ILCs citotóxicas e ILC no citotóxicas, a continuación, se describe cada población. 5.2. TIPOS DE ILC NO CITOTÓXICAS GRUPO ILC1 Lo conforman células no-citotóxicas (Lin-) que secretan grandes cantidades de INF- γ y TNF (citocinas tipo 1), y están implicadas en la inmunidad contra bacterias intracelulares y parásitos (Artis & Spits, 2015; Cella et al, 2014). Song et al (2014) y Montaldo et al (2014) incluyen a las células NK convencionales dentro de este grupo, sin embargo, el grupo de Artis et al (2015), señala que de acuerdo a sus vías de desarrollo las células NK son un grupo excluido de las ILC no citotóxicas (Artis & Spits, 2015). ~Pág. 35~ GRUPO ILC2 Las células ILC2 producen citocinas de una respuesta tipo Th2 como. IL-5 e IL-13. Producen tambiénanfiregulina e IL-9, además del receptor para IL-9, del cual depende su supervivencia. Se encuentran colonizando varios tejidos como intestino, pulmones, piel y algunas estructuras linfoides. Promueven la expulsión de parásitos y mantienen la homeostasis pulmonar a través de hiper-reactividad durante infecciones virales como influenza (Cella et al, 2014). GRUPO ILC3 Las células del grupo ILC3 producen citocinas propias de una respuesta Th17 como IL-17 y/o IL-22. Se encuentran en mucosas como el del intestino grueso y delgado, las placas de Peyer y tejidos linfoides asociados al intestino, y son críticas en la respuesta inmune contra la diseminación de bacterias comensales en huéspedes inmunodeficientes (Dunn et al, 2004; Cella et al, 2014). Fig. 6. La familia de células linfoides innatas (ILCs). Cada uno de los grupos está definido por la expresión diferencial de marcadores de superficie y patrones de expresión de citocinas. Las ILCs pueden ser activadas por una gran diversidad de estímulos que incluyen hormonas, neuropéptidos, citocinas, etc., y pueden contribuir en la inmunidad, inflamación y el ~Pág. 36~ mantenimiento de la homeostasis celular. [GM-CSF, Factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos; IFN-γ, Interferón γ; IL, interleucina; ITL, Inductora de tejidos linfoides; NCR, Receptor de citotoxicidad natural; CCR6, Receptor de quimiocina 6; T-bet, factor de transcripción de células Th1]. Tomado y modificado de: Artis D., Spits H., 2015. ILC CITOTÓXICAS: CÉLULAS NK ORIGEN, DESARROLLO Y FENOTIPO DE LAS CÉLULAS NK Descubiertas en 1975 por Kiessling, han llamado la atención en la actualidad por su potencial en la Inmunoterapia (Morvan & Lanier, 2015). Son la tercera población de linfocitos que, distintos a las células T y B, no requieren ser previamente “sensibilizados”, carecen del sistema de recombinación somático mediada por RAG, y son capaces de eliminar rápidamente células transformadas y/o alogénicas tanto in vivo como in vitro (Cella et al, 2014; Morvan & Lanier, 2015; Pampena & Levy, 2015). Las células NK exhiben algunas características normalmente asociadas con una respuesta inmune adaptativa. Estas incluyen la expansión de células patógeno- específicas, la generación de memoria a largo plazo que persiste después del encuentro con el patógeno y, la habilidad de montar una respuesta inmune secundaria (Hayakawa, 2006; Sungur & Murphy, 2013). Las células NK se desarrollan en la medula ósea, a partir de un progenitor común linfoide (CLP) que expresa c-KIT, FLT3 e IL-7R. En humanos el CLP se diferencia luego en un progenitor de células NK (pNK) que se caracteriza por la expresión de IL-2Rβ (CD122). La pérdida de algunos marcadores linaje-específico (por ejemplo; CD3, CD19, CD4, Gr-1, etc.) por parte de los pNKs es uno de los primeros pasos de la diferenciación de las células NK (Cella et al, 2014; Zamora, 2015). Conforme van madurando y expandiéndose, las células NK inmaduras (iNKs) comienzan a sobre-expresar CD2 (humano y ratón), CD161 (humano), CD56 (humano), KIR (humano), NK1.1 (ratón C57BL-6), DX5 o CD49b (ratón), Ly49 (ratón), mientras comienzan a desregular la expresión de CD27 y la subunidad integrina-α (ratón) (Cooper, 2001) (Fig. 7). Durante la última etapa de maduración, las células NK ~Pág. 37~ murinas migran a la periferia y expresan CD11b y CD43, y finalmente adquieren por completo su función efectora (Hayakawa, 2006; Sungur & Murphy, 2013; Zamora, 2015). Fig. 7. Desarrollo de células NK en humano y ratón. Los estadios tempranos de desarrollo de las células NK son similares entre humano y ratón. Cada etapa de maduración se caracteriza por la expresión de distintas moléculas como c-KIT, CD2 (humano y ratón), CD161(humano), NK 1.1 (ratón), CD56 (humano), Ly49 (ratón) y KIR (humano). Imagen modificada de: Sungur y Murphy, 2013. En humanos, las células NK incluyen los subgrupos CD56brightCD16- y CD56dimCD16+ presentes en sangre periférica. Las células NK CD56bright están especializadas en la secreción de INF-γ en respuesta a citocinas como IL-12 e IL- 18. Las células NK CD56dimCD16+, por su parte, están especializadas en producir una potente respuesta citotóxica gracias a la liberación de gránulos que contienen granzimas y perforinas (Cella et al, 2014; Cooper, 2001; Lion, 2012) En ratón se reconocen dos grupos de células NK de acuerdo a la expresión de CD11b. En la vida fetal y en ratones neonatos, las células NK CD11blow componen la mayor parte de esta población celular, mientras que, en etapa adulta, estas células sólo se encuentran en médula ósea, nódulos linfáticos e hígado, donde presentan una alta tasa de proliferación. Las células NK CD11bhigh, en cambio, están presentes en bazo, sangre periférica y pulmón. Éstas últimas llegan a expresar altos niveles de receptores Ly49 y adquieren potentes capacidades efectoras a comparación de la población CD11blow. El grupo CD11bhigh puede a su ~Pág. 38~ vez subdividirse en dos subpoblaciones basado en la expresión de CD27: CD11bhighCD27high y CD11bhighCD27low. Las primeras son potentes células efectoras y responden mejor a ligandos de CXCR3 o CXCR4 in vitro, mientras que la segunda población expresa mayormente receptores Ly49 y receptores para quimiocinas como CX3CR1 y S1P5. Se ha especulado que, en sus distintos estados de maduración, las células NK murinas siguen la siguiente vía de acuerdo a la expresión de dichos receptores: DN (Dobles negativas) CD11blow CD11bhigh CD27high CD27low (Chiossine & Walzer, 2009; Sague, 2004; Sun & Lanier, 2011) (Fig. 7 ). En dicho trabajo se emplearon otros marcadores de células NK como: a) NK 1.1 (CD161b), un antígeno de superficie codificado por el gen NKR-P1B/NKR- P1C cuya expresión está vinculada con lisis tumoral in vitro. Además, dicho marcador está implicado en la activación de células NK, en la producción de INF-γ y en la liberación de gránulos citotóxicos y b) CD49b (α2 integrina o cadena α VLA- 2) es una glicoproteína de 150 kD expresada en células NK, linfocitos T CD4+ de bazo, células epiteliales y plaquetas. Al asociarse con CD29 (subunidad de integrina β1) forma el complejo VLA-2, que juega un papel crítico en la adhesión y activación linfocítica. También es común el uso de CD44 (también conocido como Hermes o H-CAM) en el estudio de las NK, pues se trata de una glicoproteína de 80-95 kD cuya sobreexpresión en células NK potencia la actividad citotóxica de éstas y está implicada con la producción de INF-γ (Morvan & Lanier, 2015; Sague, 2004; Sun & Lanier, 2011). RECEPTORES DE CÉLULAS NK Las funciones de las células NK están finamente reguladas por un balance entre receptores de activación e inhibición, muchos de los cuales se expresan en un diverso patrón que resulta en varios subgrupos de células NK funcionalmente distintos entre sí (Orr & Lanier, 2010; Moretta, 2002). A través de estos receptores, las células NK son capaces de reconocer y matar eficazmente a las células infectadas por virus y tumorales. Los receptores de células NK parecidos a inmunoglobulinas (KIRs) en humano y los receptores Ly49 (también conocidos como KLRA) en ratón, se unen específicamente a moléculas del complejo de ~Pág. 39~ histocompatibilidad I (MHCI). Ambos tipos de receptores se encuentran codificados en familias polimórficas de genes que generan tanto receptores inhibitorios como activadores. Otra familia de receptores conservada en humano y en ratón es el sistema CD94-NKG2. En este sistema, CD94 forma un heterodímero con el receptor inhibitorio NKG2A o con el receptor de activación NKG2C. Los receptores KIR, Ly49 y CD94-NKG2 reconocen MHCI propios en células sanas, ligandos codificados por patógenos y alteraciones en el patrón de expresión de MHCI sobre la superficie celular, lo que conlleva a la activación de las células NKs (Fig. 7) (Colucci et al, 2002; Degli-Esposti & Smyth,2005; Moretta, 2002) VI. INTERACCIÓN ENTRE CÉLULAS DENDRÍTICAS Y LINFOCITOS NK Las CDs y las células NK juegan un papel crítico como primeras defensas contra el cáncer e infecciones. Ambos tipos celulares son elementos que tienen distintos sistemas de reconocimiento para identificar señales de peligro, por lo cual, la comprehensión de las interacciones entre estos dos tipos de células no deja de ser imprescindible (Lion, 2012). Se sabe de distintos mecanismos por los cuales las CDs y las NK interactúan, una de ellas, son las citocinas que las CDs secretan para potenciar la función citotóxica de las NK. De forma recíproca, las células NK secretan INF-γ, que permite la maduración y activación de respuestas dependientes de células T. Queda claro que las células NK tienen potencial para modular las funciones de las CDs y están implicadas en las respuestas inmunes específicas (Fig. 8) (Degli-Esposti & Smyth, 2005; Moretta, 2002; Morandi, 2012; Walzer, 2005). 6.1. Activación de células NK por CDs Los primeros estudios que demostraron la capacidad de las CDs para activar a las NKs se llevaron a cabo por Fernández et al (1999), que trataron con Flt3L (factor de crecimiento que favorece la proliferación de CDs y NKs) a ratones atímicos ~Pág. 40~ desnudos, observando la inducción de un efecto antitumoral dependiente de NKs. Este efecto se reducía significativamente cuando se eliminaban in vivo las CDs CD8α+; lo cual sugirió la capacidad de las mismas para potenciar la función de las NKs in vivo. Se demostró, además, que la inoculación de CDs en tumores de mesotelioma AK7 condujo a la activación de NKs y posterior erradicación tumoral (Morandi, 2012; Walzer, 2005). A. CITOCINAS DERIVADAS DE CDs El reconocimiento de patógenos mediado por TLR por CDs estimula la producción de diversas citocinas, que pueden potenciar las funciones de las células NK, por ejemplo, la IL-12. Esta citocina es secretada por distintos subtipos de CDs tanto en humano como en ratón, y es esencial en la inducción in vitro de las células NK para la producción de INF-γ. También, la IL-12 actúa de forma sinérgica con la IL-18 para aumentar la secreción de INF-γ por parte de distintos tipos celulares, incluidas las NKs. En ratón, se sabe que la IL-2 y la IL-15 producidas por CDs derivadas de médula ósea, potencia la citotoxicidad de las NK y, además, promueven la producción de INF-γ. Por otro lado, la IL-18 secretada por las CDs puede inducir la expresión del receptor de IL-12 en células NK. Adicionalmente, se ha demostrado que las pCDs secretan grandes cantidades de interferón tipo I (INF-α/β) que induce citotoxicidad en las NK (Degli-Esposti & Smyth, 2005; Walzer, 2005; Thomas & Yang, 2016; Zwirner & Domaica, 2010). B. CONTACTO CÉLULA- CÉLULA Fernández et al (1999) fueron los pioneros en demostrar que para la activación de las células NK por parte de las CDs se requiere del contacto directo célula- célula. Por otro lado, Jinushi et al (2003), demostraron que la expresión de MIC-A y MIC-B en CDs estimuladas con INF-α es indispensable para que las CDs puedan interactuar con las células NK. Borg et al (2004) señalaron que la sinapsis entre CDs y NKs requiere de cambios estructurales en la membrana y citoesqueleto de las CDs y que este contacto permite, a su vez, la secreción de IL-12 por parte de las CDs y la activación y maduración de las NKs (a. Walzer, 2005, b. Walzer, 2005). ~Pág. 41~ 6.2. Maduración de CDs por NKs Estudios pioneros in vitro han demostrado que, en determinadas proporciones celulares CD/NK, las células NK inducen la activación y maduración de las CDs. Se requieren de factores solubles (como TNF-α/INF-γ) y del contacto célula- célula, para la activación de las CDs dependiente de NKs (a. Walzer, 2005, b. Walzer, 2005) Terme et al (1999), demostraron que las NK-IL-2+ pueden activar a las CDs derivadas de médula ósea promoviendo la expresión de CD80. Por otro lado, en humanos, las NK- IL-2+ son capaces de inducir maduración de pCDs en sangre y CDs mieloides, y puede, además, promover la producción de INF-α y TNF por parte de las CD plasmacitoides. Este efecto es dependiente de contacto célula- célula, sin embargo, los receptores/ ligandos específicos involucrados en este proceso aún se desconocen (a. Walzer, 2005, b. Walzer, 2005). 6.3. Eliminación de CDs por NKs Uno de los aspectos más intrigantes de las interacciones CDs-NK, es la capacidad de las células NK para eliminar CDs inmaduras. Se ha demostrado in vitro que las señales dependientes de NKp30 juegan un rol critico en la lisis de células dendríticas inmaduras, y que la sobreexpresión de moléculas MHC-I en CDs maduras, impide la lisis por parte de las NKs (a. Walzer, 2005, b. Walzer, 2005). Carbone et al (2000) sugirieron la participación de CD40 y CD1 en la eliminación de CDs inmaduras. Además, las células NK poseen la capacidad de eliminar las CDs inmaduras autólogas y alogénicas a través de una triple señal entre los marcadores NKp30, DNAM-1 y una baja expresión de MHC-I (Van Elssen, 2014). 6.4. Interacción entre células NK y CD en la respuesta antitumoral En la década de 1980, la función de las células NK como defensa contra el cáncer se comenzaba a señalar en múltiples estudios que señalaron una fuerte asociación entre distintos tipos de cáncer y la desregulación de las funciones de las NKs. Se demostró que anormalidades en los niveles o funciones de la población de NKs ~Pág. 42~ estaban asociados con respuestas antitumorales fallidas (Lion, 2012). Es bien sabido que las células tumorales evitan la eliminación por parte del sistema inmune debido a la pérdida in vivo de señales de peligro que activan a las CDs. La activación de las células NK por células tumorales (debido a la pérdida total o baja expresión de MHC-I, la sobre expresión de ligandos de NKG2D y, la expresión de CD27 o pg96) promueve una respuesta inmune antitumoral dependiente de células T. Se ha observado que el INF-γ secretado por las células NK durante la eliminación del tumor es esencial para activar células T citotóxicas (CTL), particularmente en tumores que expresan CD70, CD80 y, CD86. Sin embargo, la eliminación de células tumorales por CTLs y el reconocimiento de ligandos de NKG2D no es dependiente de INF-γ, aunque si requiere del apoyo de células T CD4+ (Fig. 8). Esto indica que las CDs y las células NK están equipadas con sets complementarios de receptores que permiten el reconocimiento de distintos agentes patógenos y tumorales. La activación de las CDs se puede llevar a cabo directamente mediante la captación y reconocimiento agentes patógenos, o indirectamente por células NK, como se mencionó anteriormente (a. Walzer, 2005, b. Walzer, 2005). ~Pág. 43~ Fig. 8. Interacciones entre células dendríticas y células NK. A. Activación de CDs por NKs a partir de la liberación de TNFα e INF-γ, lo que a su vez induce la liberación de otras citocinas por las CDs. B. Lisis de CD inmaduras (CDi) por células NKs. Las NK pueden eliminar CDs inmaduras a través de la desregulación de MHCI y la sobreexpresión de ligando de NKp30. C. Activación de células NK por CDs. Gracias a la liberación de diversas citocinas (IL-12, 15,18 e INF tipo I) las CDs activan a las células NK para que éstas ejerzan citotoxicidad sobre las células tumorales (vía grandzimas/ perforinas o por ligandos de muerte). D. Maduración y proliferación de NKs. Al liberar IL-12, 15 y 18, las CDs permiten que las células NK maduren y comiencen a proliferar. E. Secreción de citocinas. Una vez activas, las células NK pueden presentar una potente actividad citotóxica o secretar grandes cantidades de citocinas como TNF-α e INF-γ, que iniciarán una respuesta inmune dependiente de células T (presentación de antígeno) y la activación de más células dendríticas (captación de Ag tumorales). Imagen original. VII. ANTÍGENOS TUMORALESEn múltiples tumores pueden encontrarse antígenos únicos o expresados de manera inapropiada que suelen ser detectados por el sistema inmune. Los antígenos tumorales pueden dividirse en: 1) Antígenos Específicos para Tumor (AET o TSA, por sus siglas en inglés), que se producen por mutaciones en células tumorales (Owen J. et al, 2014), y 2) los Antígenos Asociados con Tumor (AAT o TAA, por sus siglas en inglés), los cuales se encuentran expresados en la superficie de las células tumorales, pueden ser cargados en MHC y reconocidos por linfocitos T. Con respecto a su patrón de expresión en tejidos neoplásicos y normales, los AAT han sido clasificados en: 1) antígenos de diferenciación, 2) antígenos específicos compartidos entre tumores, 3) antígenos individuales, resultado de mutaciones o 4) proteínas sobre-expresadas, y 5) antígenos virales. En el presente estudio utilizamos el antígeno MAGE-AX (de tipo AAT) que será discutido más adelante (Eggert, 2004). ~Pág. 44~ VIII. RESPUESTA INMUNOLÓGICA CONTRA EL CÁNCER Una de las funciones del sistema inmune es reconocer y controlar el crecimiento tumoral. Las evidencias recopiladas durante la última década, desde modelos murinos hasta humano, demuestran que el sistema inmune reconoce a las células tumorales y se encarga de la erradicación de las mismas (Dunn et al, 2004; Owen, 2014; Teng, 2015). Por otro lado, el sistema inmune también puede promover la progresión tumoral a través del mantenimiento de señales crónicas de inflamación y suprimiendo la inmunidad antitumoral (Teng, 2015). Esta dualidad del sistema inmune para suprimir y promover el crecimiento tumoral es denominada Inmunoedición del cáncer, y hasta la fecha, existen tres mecanismos propuestos mediante los cuales este proceso opera; eliminación, equilibrio y escape (Dunn, Old, & Schreiber, 2004; Teng, 2015). A. Fase de eliminación También denominada inmunovigilancia al cáncer. En esta fase, la inmunidad innata y adaptativa están involucradas en la detección y eliminación del tumor antes de que sea clínicamente aparente (Teng, 2015). Entre las señales que induce la respuesta inmunológica se encuentran las de daño, como INF-γ y DAMPs (como el ácido hialurónico). Otro de los mecanismos involucra la expresión en la superficie de las células tumorales de ligandos inducidos por estrés. Estas moléculas son ligandos que se unen a los receptores NKG2D en las células NK y en los linfocitos Tγδ, inducen una actividad antitumoral y, además, liberan citocinas proinflamatorias e inmunomodulatorias que facilitan el desarrollo de la respuesta inmunológica adaptativa (Teng, 2015; Vesely & Schreiber, 2013). B. Fase de equilibrio Durante esta fase la respuesta inmunológica adaptativa previene el crecimiento de variantes raras de células tumorales que sobreviven a la fase de eliminación (Vesely & Schreiber, 2013). En esta fase, el sistema inmunológico mantiene las células tumorales residuales en estado de latencia y eventualmente pueden crecer e inducir ~Pág. 45~ tumores primarios o metástasis. El equilibrio puede ser resultado de la inhibición del crecimiento y las acciones citotóxicas sobre las células tumorales mediadas por la respuesta inmunológica; sin embargo, estas mismas funciones pueden provocar presión selectiva y crecimiento tumoral de las células que hayan adquirido las mutaciones más inmunoevasivas (Teng, 2015). Se trata de la fase más larga y puede prolongarse por años en humanos. De hecho, para algunos tumores sólidos en humanos se ha estimado un intervalo de aprox. 20 años entre la primera exposición a carcinógenos y la detección clínica del tumor. Durante este periodo, la heterogeneidad y la inestabilidad genética de las células que sobrevivieron a la etapa de eliminación son los factores que permiten que las células cancerosas resistan la eliminación por parte del sistema inmune (Dunn et al, 2004; Teng, 2015; Vesely & Schreiber, 2013). C. Fase de escape En esta fase, las células tumorales, que adquirieron la habilidad de evadir el reconocimiento inmunológico y evitar la eliminación gracias a cambios genéticos y epigenéticos, crecen y se convierten en tumores clínicamente visibles (Dunn et al, 2004). Esta puede ocurrir debido a los cambios en las células tumorales en respuesta a las funciones de edición del sistema inmunológico y/o a causa de los cambios en el huésped en respuesta a la inmunosupresión o al deterioro de la respuesta inmunológica (Teng, 2015; Vesely & Schreiber, 2013). IX. INMUNOTERAPIA ANTITUMORAL A pesar de los grandes avances para prevenir y tratar el cáncer, éste continúa siendo la mayor causa de muerte a nivel mundial. Muchos de los enfoques no quirúrgicos que permiten la erradicación de las células tumorales, como la quimioterapia y radioterapia, no sólo afectan a las células normales, también derivan en efectos secundarios que limitan el tratamiento. Es por ello que la enorme ~Pág. 46~ especificidad del sistema inmune para erradicar a las células tumorales sin comprometer a las células sanas ha permitido que se abran nuevas líneas de investigación para combatir y erradicar el cáncer. Los constantes hallazgos sobre la activación y regulación de linfocitos T CD8+ constituyeron un parteaguas para que se iniciaran distintas líneas de investigación en inmunología tumoral, donde la mayoría de las estrategias de vacunación se enfocan en la inducción de una respuesta por parte de las CTLs (Linfocitos T Citotóxicos). Sin embargo, a pesar de su papel, la inducción de los linfocitos T CD4+ es importante no sólo para potenciar la respuesta de los linfocitos T CD8+, también para mediar funciones efectoras antitumorales a partir de la activación de eosinófilos y macrófagos (Berzofsky, 2004; Lesterhuis et al, 2011; Yang, 2015). Algunos de los mayores retos en el diseño de vacunas contra el cáncer son; la identificación de antígenos tumorales que no estén presentes en células normales, el desarrollo de estrategias que permitan la inducción de una respuesta inmune lo suficientemente potente para erradicar a las células tumorales y evitar la tolerancia a los antígenos tumorales (Berzofsky, 2004). ESTRATEGIAS DE VACUNACIÓN CONTRA EL CÁNCER A. Vacunas modificadas a partir de células tumorales La más grande fuente de antígenos es el tumor mismo. Sin embargo, el uso de vacunas con células tumorales autólogas no es rentable debido que se necesitan producir vacunas a gran escala y las muestras son, con frecuencia, difíciles de obtener, por lo que los enfoques que utilizan líneas celulares tumorales son más apropiados (Berzofsky, 2004; Lesterhuis et al, 2011). B. Vacunas de péptidos El conocimiento de los complejos MHC-péptido y de las secuencias de aminoácidos de los epítopos tumorales sugiere el uso de péptidos como agentes terapéuticos en el tratamiento contra el cáncer. Las estrategias que se han desarrollado hasta el ~Pág. 47~ momento con péptidos buscan mejorar la inmunogenicidad y dirigir el sistema inmune para obtener respuestas deseadas, por ejemplo: el mejoramiento de epítopos y/o el uso de citocinas, quimiocinas y otras moléculas inmunomoduladoras como adyuvantes, que amplifiquen la respuesta inmune (Lesterhuis et al, 2011; Teng, 2015). C. Vectores de recombinantes virales Existen muchos ensayos experimentales que en la actualidad utilizan vectores virales que expresan antígenos tumorales como CEA (antígeno carcino- embriónico). Los vectores que son más usados en este tipo de terapia son: adenovirus, vaccinia y avipoxvirus. La alta prevalencia de anticuerpos antivirales que neutralizan estos virus limita el uso de los mismos, especialmente si son administrados en múltiples dosis. Es importante recalcar que la respuesta inmune contra este tipo de virus es más fuerte que la que se desencadena por antígenos tumorales (Berzofsky, 2004; Lesterhuis et al.,
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