Analisis-del-proteoma-de-lneas-celulares-T98G-y-U87MG-de-glioblastoma

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES 
IZTACALA 
 
“Análisis del proteoma en líneas celulares T98G y U87MG 
de glioblastoma” 
 
T E S I S 
 
Q U E P A R A O B T E N E R E L T Í T U L O D E 
 
 
B I Ó L O G A 
 
P R E S E N T A 
 
M A L A G Ó N R E Y E S C L A U D I A M I R O S A V A 
 
A S E S O R 
 
DR. JUAN FERNANDO MINAURO SANMIGUEL 
 
Los Reyes Iztacala, 2016. 
usuario
Texto escrito a máquina
Estado de México
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Este trabajo se realizó en la Unidad de Investigación Médica 
en Genética Humana del hospital de pediatría “Dr. Silvestre 
Frenk Freund” del Centro Médico Nacional Siglo XXI, IMSS. 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS A TÍTULO 
 
A los miembros de la Comisión Dictaminadora: 
 Dr. Jorge Eduardo Campos Contreras 
 M. en C. María Teresa Ortiz Melo 
 Dr. Juan Fernando Minauro Sanmiguel 
 M. en C. Adriana Montserrat Espinosa Gonzáles 
 M. en C. Pilar Amellali Badillo Suárez 
Por la dedicación y el tiempo invertido en la revisión de este 
trabajo, por sus consejos, observaciones, sugerencias y por compartir 
sus conocimientos con la finalidad de enriquecer este trabajo, gracias. 
 
A la UNAM por abrirme las puertas de este recinto, por 
brindarme el orgullo de ser universitaria, por las oportunidades que me 
ha brindado y principalmente por ser una de las partes más 
importantes en mi vida. 
 
Al Hospital de Pediatría, Centro Médico Nacional Siglo XXI, del 
Instituto Mexicano del Seguro Social, por las facilidades concedidas 
para la realización de este proyecto. 
 
A la Unidad Médica de Genética Humana por abrirme las puertas 
y permitirme trabajar ahí. 
 
En primer lugar quiero agradecer al Dr. Juan Fernando Minauro 
Sanmiguel que me abrió las puertas de su laboratorio. A mis 
compañeros de laboratorio: Diana, Ariadna, Karina, Leopoldo y a la 
Dra. Ruth Ruiz-Esparza Garrido por la contribución que realizaron a mi 
trabajo. ¡Lo he logrado!, por esta razón quiero expresarles mi más 
sincero agradecimiento por ayudarme a hacer posible esto, por toda 
su paciencia, tiempo, dedicación, apoyo y consejos. 
Por otra parte también quiero agradecer a la FES Iztacala por 
formarme, por permitirme crecer tanto académica como 
personalmente, a los profesores que me acompañaron, durante este 
largo camino, en especial a la Mta. Amellali, al Dr. Salvador, al Dr. 
Ramón, gracias por sus enseñanzas. Y también quiero agradecer a 
Jesús por su paciencia y apoyo. 
Finalmente y no por eso menos importante quiero agradecer a mi 
Madre, a mi Abuelia, a Ricardo, a mi tía Lourdes, Julia, Claudia y a mis 
tíos Paulo y Sabel, todo esto es gracias y por ustedes. 
 
DEDICATORIAS 
A mi Mamá, por brindarme todo el apoyo y el amor que necesitaba, 
por renunciar a gran parte de tu etapa de madre para darme un 
pasado inolvidable, un presente maravilloso y la preparación necesaria 
para forjarme un futuro. 
A mi Abuelita, por darme tanto amor, tus consejos y tu protección, me 
haces mucha falta. ¡Te extraño! 
A Ricardo, porque me demostraste que aunque no lo parezca siempre 
estarás ahí, que no es necesario tener personas que no te quieren 
para no estar solo, que solo se necesita ser el mejor en esta vida y 
que solo tienes que ser fuerte para luchar por lo que quieres. Gracias, 
Te quiero un muchillón. 
A mi tía Lourdes, porque me has apoyado y escuchado en momentos 
de flaqueza y debilidad. Porque fuiste firme y segura en momentos en 
los que otros hubieran abandonado. 
A mi Julia, por tu cariño y tu ejemplo de fortaleza y superación. 
A mi tío Paulo, por siempre estar conmigo, por defenderme y 
protegerme. 
A Liliana, por todo el apoyo que me has brindado, el cariño, la 
honestidad, los consejos, por aceptarme como soy. 
A Pedro, gracias por escucharme. 
A Guy, por enseñarme a ser fuerte; a que no necesitas estar 
acompañado para superar tus miedos y adversidades: que quien te 
quiere no te abandona y sobre todo gracias por no estar aquí. 
 
 
 
 
 
 
 “Siempre intento tener control sobre mi vida. Creo que mi mayor 
miedo es ser débil. Y temo también ser un cordero aceptado 
completamente en la sociedad. Pienso que cada hombre y mujer es 
una estrella. Es sólo una cuestión de darse cuenta y convertirse en 
ello. Es una cuestión del poder de la voluntad. No tengo lugar en mi 
corazón para los estúpidos ni los débiles. Hay demasiada gente en 
este mundo y ellos deben hacer un lugar para quienes pueden 
contribuir con la sociedad” 
Marilyn Manson 
 
 
ÍNDICE DE CONTENIDO 
1 RESUMEN ................................................................................... 1 
1.1 ABSTRACT .......................................................................................... ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO. 
2 INTRODUCCIÓN ......................................................................... 3 
2.1 CÁNCER ............................................................................................................................................ 3 
2.2 GLIOBLASTOMA MULTIFORME .......................................................................................................... 4 
2.3 FACTORES BIOLÓGICOS ................................................................................................................... 5 
2.4 CAMBIO METABÓLICO ....................................................................................................................... 6 
2.5 MITOCONDRIAS FUNCIONALES ......................................................................................................... 8 
2.5.1 Alteración de fenotípico bioenergético mitocondrial ......................................................... 9 
2.6 PROTEÓMICA COMO HERRAMIENTA EN LA BÚSQUEDA DE BIOMARCADORES................................. 10 
2.6.1 IF1 .............................................................................................. ¡Error! Marcador no definido. 
3 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ........................................ 12 
4 JUSTIFICACIÓN ........................................................................ 13 
5 HIPÓTESIS ................................................................................ 14 
6 OBJETIVOS ............................................................................... 15 
6.1 GENERAL ........................................................................................................................................ 15 
6.2 PARTICULARES ............................................................................................................................... 15 
7 MATERIAL Y MÉTODOS ........................................................... 16 
7.1 METODOLOGÍA GENERAL ................................................................................................................ 16 
7.2 CULTIVO CELULAR .......................................................................................................................... 17 
7.3 EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS .......................................................................................................... 17 
7.4 CUANTIFICACIÓN .............................................................................................................................17 
7.5 ELECTROFORESIS DESNATURALIZANTE (SDS-PAGE) ................................................................. 18 
7.6 ISOELECTROENFOQUE (IEF) .......................................................................................................... 18 
7.7 ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL DESNATURALIZANTE ................................................................ 19 
7.8 WESTERN BLOT (WB) .................................................................................................................... 20 
7.9 ANÁLISIS DE IMAGEN PD-QUEST.................................................................................................... 21 
7.10 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ........................................................................................................................... 21 
8 RESULTADOS ........................................................................... 23 
8.1 MANTENIMIENTO DE LÍNEAS CELULARES ........................................................................................ 23 
8.2 RENDIMIENTO PROTEICO ................................................................................................................ 24 
8.3 INTEGRIDAD DE LAS PROTEÍNAS ..................................................................................................... 24 
8.4 CARACTERIZACIÓN POR WESTERN BLOT ...................................................................................... 25 
8.5 2D SDS-PAGE .............................................................................................................................. 27 
8.6 ANÁLISIS DE IMAGEN PD-QUEST.................................................................................................... 28 
8.7 ANÁLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES..................................................................................... 30 
9 DISCUSIÓN ............................................................................... 35 
10 CONCLUSIONES ...................................................................... 39 
11 PERSPECTIVAS........................................................................ 40 
12 REFERENCIAS ......................................................................... 41 
13 ANEXO ...................................................................................... 47 
 
 
 
ÍNDICE DE FIGURAS 
FIGURA 1. TRANSFORMACIÓN DE UNA CÉLULA NORMAL EN TUMORAL. .......................................................... 3 
FIGURA 2. FACTORES QUE CARACTERIZAN EL FENOTIPO DE UNA CÉLULA TUMORAL..................................... 3 
FIGURA 3. REPRESENTACIÓN DEL EFECTO WARBURG. ................................................................................... 3 
FIGURA 4.REMODELACIÓN DEL METABOLISMO ENERGÉTICO EN EL PROCESO DE CARCINOGÉNESIS. ........... 5 
FIGURA 5. METODOLOGÍA GENERAL. ................................................................................................................ 7 
FIGURA 6. 1D SEPARACIÓN POR PUNTO ISOELÉCTRICOFIGURA 5 . METODOLOGÍA GENERAL ....................... 7 
FIGURA 7. REPRESENTACIÓN GRÁFICA DEL MÉTODO DE SEPARACIÓN POR ELECTROFORESIS 
BIDIMENSIONAL DESNATURALIZANTE. ...................................................................................................... 7 
FIGURA 8. ESQUEMA DE ELECTROFORESIS Y TRANSFERENCIA. .................................................................... 19 
FIGURA 9. GEL MAESTRO GENERADO POR EL PROGRAMA PD-QUEST DE BIO RAD AL COMBINAR LOS SPOTS 
DE PROTEÍNA DE TODOS LOS GELES DE AMBAS LÍNEAS CELULARES. ................................................... 20 
FIGURA 10. IMÁGENES POR MICROSCOPIA INVERTIDA DEL CRECIMIENTO DE LAS LÍNEAS CELULARES T98G 
Y U87MG. ............................................................................................................................................... 34 
FIGURA 11. PERFIL ELECTROFORÉTICO OBTENIDO DE T98G Y U87MG EN SDS-PAGE 12%. ................. 24 
FIGURA 12. ANÁLISIS DE EXPRESIÓN EN LAS LÍNEAS CELULARES POR ENSAYO DE WESTERN BLOT. EN 
EXTRACTOS DE PROTEÍNA TOTAL. .......................................................................................................... 24 
FIGURA 13. GEL EN 2D SDS-PAGE REPRESENTATIVO DE T98G TEÑIDO CON AZUL DE COMASSIE 
COLOIDAL. ............................................................................................................................................... 27 
FIGURA 14. GEL EN 2D SDS-PAGE REPRESENTATIVO DE U87MG TEÑIDO CON AZUL DE COMASSIE 
COLOIDAL. ............................................................................................................................................... 27 
FIGURA 15. SELECCIÓN DE PROTEÍNAS UTILIZANDO EL PROGRAMA PD-QUEST. ........................................ 28 
FIGURA 16. GRÁFICA DEL CP1. ...................................................................................................................... 30 
FIGURA 17. PERFIL DE ESPRESIÓN DEL CP1. ................................................................................................ 32 
FIGURA 18. COMPARACIÓN GRÁFICA DEL PERFIL DE EXPRESIÓN DEL CP1 ENTRE T98G Y U87MG.FIGURA 
 
 
 
 
 
 
 
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file:///D:/FESI/Tesis/Imagenes/Fracciones/Tesis%20final.docx%23_Toc453692045
file:///D:/FESI/Tesis/Imagenes/Fracciones/Tesis%20final.docx%23_Toc453692045
file:///D:/FESI/Tesis/Imagenes/Fracciones/Tesis%20final.docx%23_Toc453692116
file:///D:/FESI/Tesis/Imagenes/Fracciones/Tesis%20final.docx%23_Toc453692116
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file:///D:/FESI/Tesis/Imagenes/Fracciones/Tesis%20final.docx%23_Toc453692050
file:///D:/FESI/Tesis/Imagenes/Fracciones/Tesis%20final.docx%23_Toc453692050
file:///D:/FESI/Tesis/Imagenes/Fracciones/Tesis%20final.docx%23_Toc453692054
file:///D:/FESI/Tesis/Imagenes/Fracciones/Tesis%20final.docx%23_Toc453692054
file:///D:/FESI/Tesis/Imagenes/Fracciones/Tesis%20final.docx%23_Toc453692056
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file:///D:/FESI/Tesis/Imagenes/Fracciones/Tesis%20final.docx%23_Toc453692073
 
ÍNDICE DE TABLAS 
TABLA 1. ANÁLISIS DENSITOMÉTRICO ...................................................................................................................277 
TABLA 2. ANÁLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES ...........................................................................................300 
TABLA 3. PROTEÍNAS QUE FORMAN A CP1 ............................................................... ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.2 
 
ÍNDICE DE ANEXOS 
TABLA 1. MATRIZ DE PESO DE FACTOR. .......................................................................................................... 47 
TABLA 2. PROTEÍNAS QUE COMPONEN F1.. .................................................................................................... 47 
TABLA 3. PROTEÍNAS QUE COMPONEN F2.. .................................................................................................... 47 
TABLA 4. PROTEÍNAS QUE COMPONEN F3. .....................................................................................................47 
TABLA 5. PROTEÍNAS QUE COMPONEN F4.. .................................................................................................... 49 
TABLA 6. PROTEÍNAS QUE COMPONEN F5. ..................................................................................................... 51 
TABLA 7. PROTEÍNAS QUE COMPONEN F6. ..................................................................................................... 52 
TABLA 8. PROTEÍNAS QUE COMPONEN F7.. .................................................................................................... 53 
 
 
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file:///D:/FESI/Tesis/Imagenes/Fracciones/Tesis%20final.docx%23_Toc451199691
file:///D:/FESI/Tesis/Imagenes/Fracciones/Tesis%20final.docx%23_Toc451199692
file:///D:/FESI/Tesis/Imagenes/Fracciones/Tesis%20final.docx%23_Toc451199720
file:///D:/FESI/Tesis/Imagenes/Fracciones/Tesis%20final.docx%23_Toc451199725
file:///D:/FESI/Tesis/Imagenes/Fracciones/Tesis%20final.docx%23_Toc451199726
file:///D:/FESI/Tesis/Imagenes/Fracciones/Tesis%20final.docx%23_Toc451199736
file:///D:/FESI/Tesis/Imagenes/Fracciones/Tesis%20final.docx%23_Toc451199764
file:///D:/FESI/Tesis/Imagenes/Fracciones/Tesis%20final.docx%23_Toc451199792
file:///D:/FESI/Tesis/Imagenes/Fracciones/Tesis%20final.docx%23_Toc451199820
file:///D:/FESI/Tesis/Imagenes/Fracciones/Tesis%20final.docx%23_Toc451199872
SIGLAS Y ABREVIATURAS 
1D 
 
Primera dimensión 
 
IF1 
 
Inhibidor del dominio F1 de la 
Adenosín trifosfato sintasa 
2D Segunda dimensión 
 
IgG Inmunoglobulina G 
 
ABTA 
 
Asociación Americana del 
Tumor Cerebral 
OXPHOS 
 
Fosforilación oxidativa 
 
 
ACP 
 
Análisis de Componentes 
Principales 
PAGE 
 
Electroforesis en geles de 
poliacrialmida 
 
ATP Adenosín trifosfato PBS Tampón de fosfato salino 
 
ATPasa 
 
Adenosíntrifosfato sintasa 
 
PBS-T 
 
Tampón de fosfato salino con 
Tween 
 
BEC Bioenergético celular Pf Peso de factor 
 
CAPS 
 
Ácido 3-(ciclohexilamino)-1-
propanosulfónico 
PI 
 
Punto isoeléctrico 
 
 
CHAPS 
 
 
(3-[(3-Colamidopropil)-
dimetilamonio]-propano 
sulfatano 
PM 
 
 
Peso molecular 
 
 
 
CP Componente principal PVDF Polifluoruro de vinildeno 
 
DMSO Dimetilsulfóxico SDS Dodecilsulfato sódico 
 
DOC Desoxicolato de sodio SFB Suero Fetal Bovino 
 
DTT Ditiotreitol SNC Sistema Nervioso Central 
EDTA Ácido etildiaminotetraacético 
 
TCA Ácido tricloroacético 
 
EMEM 
 
Medio mínimo esencial Eagle 
 
VDAC 
 
Canal de Aniones 
Dependientes de Voltaje 
 
GAPDH 
 
Gliceraldehído 3-fosfato 
deshidrogenasa 
WB 
 
Western Blot 
 
 
GBM 
 
Glioblastoma multiforme 
 
Βf1ATPasa 
 
Subunidad beta dominio F1 de 
la adenosín trifosfato sintasa 
 
IARC 
 
Agencia Internacional para la IEF Isoelectroenfoque 
 Investigación del Cáncer 
 
 
 
 
1 
1 RESUMEN 
 
El cáncer es uno de los principales problemas de salud pública a nivel mundial no 
solo por los estragos que causa, sino por el número de muertes que ocasiona. 
Esta es una enfermedad multifactorial que puede afectar cualquier parte del 
organismo por lo que esta involucra varios cambios en la fisiología celular.Los 
cambios que participan en el proceso de progresión tumoral se ven influidos por 
diversos factores, tanto externos como, siendo los internos los más importantes ya 
que le permiten a la célula mutada mantenerse viva y proliferar. 
La reprogramación del metabolismo energético, también conocido como efecto 
Warburg, es considerada una característica clave en la progresión tumoral. Esta 
representa una ventaja de sobrevivencia, debido a que se generan productos 
intermedios que alimentan diversas vías biosintéticas con las que se producen los 
elementos necesarios para la proliferación celular, etc. 
El uso de proteómica al estudiar la progresión tumoral ha permitido ampliar los 
conocimientos sobre este fenómeno. Sin embargo, aún no se ha logrado definir la 
participación que tiene la transformación metabólica, las diferentes rutas celulares 
y su relevancia, esto puede atribuirse principalmente a que su uso ha sido de 
forma aislada (observando el fenómeno únicamente en la mitocondria o sobre 
aspectos muy específicos) o sesgada (utilizando análisis estadísticos poco 
adecuados) 
De acuerdo con datos obtenidos en nuestro laboratorio, hay cambios importantes 
en el metabolismo energético (proteínas mitocondriales) que acompañan el 
progreso de la enfermedad lo que, se ajusta a la hipótesis de Warburg. Para 
evaluar la participación de estas proteínas, se buscará en extractos totales otras 
proteínas que sean relevantes en la transformación celular. 
Por tal razón, evaluamos los cambios en las vías mitocondriales con respecto al 
proteoma celular en un modelo de glioblastoma modificando el método de 
 
 
2 
selección de las proteínas e implementando el uso de análisis estadísticos como el 
Análisis de Componentes Principales el cual es una estrategia poco utilizada en el 
análisis de expresión de spots en geles 2D. 
El resultado del análisis definió siete componentes principales (CP). Cada uno de 
estos representa una parte del fenómeno. De esta forma el CP1 explica el 31%, el 
CP2 el 24.1%, CP 3 el 15.6%, etc. El CP1 agrupa entonces, el 31% de las 
proteínas lo cual lo define como el más importante por tener el mayor porcentaje 
de varianza expresada. Las proteínas ubicadas dentro de este CP al mostrar 
cambios en la expresión en los dos modelos, refleja un perfil proteico que 
distingue entre los estados del proceso con lo cual se puede establecer una firma 
proteica para el estado inicial y otro para el avanzado de la progresión tumoral. 
 
 
 
3 
2 INTRODUCCIÓN 
2.1 CÁNCER 
 
Dentro de las enfermedades no transmisibles, el cáncer es uno de los principales 
problemas de salud pública a nivel mundial no solo por los estragos que causa, 
sino por el número de muertes que ocasiona. Esta enfermedad es considerada 
una de las principales causas de morbilidad y mortalidad a nivel mundial. En 2012 
se reportaron 8.2 millones de muertes relacionadas y 14 millones de casos nuevos 
(IARC, 2014). Además, se prevé un incremento del 70% en el número de casos en 
los próximos 20 años (OMS, 2014). 
El cáncer es una enfermedad multifactorial que puede afectar cualquier parte del 
organismo por lo que esta involucra varios cambios en la fisiología celular. Este 
proceso se caracteriza por el crecimiento y diseminación celular descontrolada, los 
cuales tienen como consecuencia la formación de tumores (Figura 1) y su 
progresión. 
Figura 1. Transformación de una célula normal en tumoral. 
Modificado de (Silva, 2014). 
 
Figura 2. Factores que caracterizan el fenotipo de una célula 
tumoral.Figura 1. Transformación de una célula normal en 
tumoral. 
Modificado de (Silva, 2014). 
 
Figura 2. Factores que caracterizan el fenotipo de una célula tumoral. 
 
 
4 
El fenómeno de progresión tumoral define la malignidad y agresividad de un tumor 
con base en su capacidad de infiltración, su velocidad de crecimiento entre otras 
características (Díaz et al., 2004). 
Debido a que el cáncer es una enfermedad multifactorial la forma en la que se 
clasifica es variable y depende de los criterios que se utilicen, por ejemplo: el 
órgano de origen, la clase de célula implicada (epitelial, glandular, etc.), el grado 
de agresividad (benigno o maligno), si se encuentra en el sitio de origen (primario) 
o si migró (metastásicos). Actualmente, también se utilizan criterios moleculares, 
estos se basan en la expresión de algunos genes y proteínas, con los que se 
establece el estado de la enfermedad con base en su presencia. 
2.2 GLIOBLASTOMA MULTIFORME 
 
El glioblastoma multiforme (GBM) es un tumor primario que se originan en las 
células gliales denominadas astrocitos cuya morfología es similar a una estrella y 
conforma el tejido de apoyo del cerebro.Dentro de los tumores primarios quese 
forman en el Sistema Nervioso Central, el gioblastoma multiforme, es considerado 
la forma más agresiva y maligna de los gliomas (Rodríguez et al., 2012). Este tipo 
de tumor es muy peligroso debido a que las células se reproducen con mayor 
rapidez pues son alimentadas por una red amplia de vasos sanguíneos. Existen 
dos tipos: el primario o de novo es la forma más común y más agresiva; el 
secundario tiene un crecimiento más lento se encuentran principalmente en 
personas jóvenes (ABTA, 2015). 
Los procesos como el de carcinogénesis y la progresión tumoral se ven 
influidos por diversos factores, tanto internos como externos. Dentro de los 
factores externos se encuentran la radiación ionizante, bacterias, virus, etc. que 
tienen una clara participación dentro del fenómeno. Sin embargo, los factores 
biológicos como los cambios genéticos inducidos por mutaciones son los que 
tienen mayor importancia (Luque and Herráez, 2008), ya que, durante el proceso 
de transformación de células normales a células cancerosas, ocurren varias 
alteraciones genéticas. En este proceso se presenta la pérdida del control de los 
 
 
5 
mecanismos de replicación y reparación del ADN, así como de la segregación del 
material genético. Aunque las células normales tienen estrategias de defensa 
contra el desarrollo del cáncer, las células tumorales activan diferentes vías de 
escape que permiten la progresión de la neoplasia (Madrid-Marina et al., 1997). 
2.3 FACTORES BIOLÓGICOS 
 
Los factores biológicos son características adquiridas por la célula durante el 
proceso de carcinogénesis y progresión tumoral, estas le permiten a la célula 
mutada mantenerse viva y proliferar. En el año 2000 Hanahan and Weinberg 
definieron seis factores involucrados en la transformación de una célula normal a 
tumoral. Estos factores son; desregulación de señales de crecimiento, la 
insensibilidad a señales anti crecimiento, la evasión de la apoptosis, un potencial 
de replicación ilimitado, la vascularización sostenida y la metástasis. 
Posteriormente, la reprogramación del metabolismo energético, también conocido 
como efecto Warburg, fue incluida como característica clave en la progresión 
Figura 2. Factores que caracterizan el fenotipo de una célula tumoral. 
En el esquema se presentan las características adquiridas por una célula durante el 
desarrollo tumorogénico. Modificado de Hanahan and Weinberg, 2011 
 
 
Figura 3. Representación del efecto Warburg. 
La célula normal (azul) representa un modelo con metabolismo oxidativo, mientras 
 
 
6 
tumoral, al evidenciar el cambio entre una célula normal y una tumoral (Hanahan 
and Weinberg,2011) (Figura 2). 
 
2.4 CAMBIO METABÓLICO 
 
El efecto Warburg es una señal biológica clave entre células tumorales y células 
normales, refleja la alteración del metabolismo, donde se exacerba el consumo de 
glucosa, la célula se torna glicolítica y adquiere alteraciones genéticas y 
epigenéticas estables para mantener la proliferación, sobrevivir bajo 
microambientes desfavorables e invadir a los tejidos circundantes (Wolf et 
al.,2010). 
 
La reprogramación metabólica se refiere al cambio del fenotipo energético en la 
célula en presencia de oxigeno (normoxia), la cual utiliza la fosforilación oxidativa 
(OXPHOS) como principal fuente de Adenosín trifosfato (ATP) y cambia su 
metabolismo a un perfil glicolítico, aún en normoxia. Otto Warburg observó por 
primera vez este comportamiento en las células tumorales y acuñó el término de 
glicólisis aeróbica (Warburg, 1956b). Esta se caracteriza por una alta absorción de 
glucosa, bajo consumo de oxígeno y producción elevada de lactato (Figura 3). 
Warburg sugirió que dicho comportamiento se debía a la reducida actividad 
bioenergética mitocondrial (Warburg, 1965a). 
 
Este factor biológico es considerado una ventaja de sobrevivencia, debido a la 
generación de productos secundarios de la glicolísis que alimentan vías 
biosintéticas para la producción nucleótidos, aminoácidos, y las vías de síntesis de 
lípidos, así como la generación de NADPH para mantener el equilibrio redox 
(Schulze and Harris, 2012)y la formación de nuevas células. 
 
 
 
 
7 
 
 
 
 
El aumento en la glicólisis no se observa en cualquier tumor por lo cual la 
reprogramación metabólica varía de acuerdo al tipo de tumor y su tasa de 
crecimiento, es decir, las variaciones metabólicas se presentarán según el tamaño 
del tumor. Los tumores pequeños tienen un bajo consumo de glucosa y los de 
mayor tamaño un alto consumo de glucosa (Eigenbrodt et al., 1998). Esto provoca 
que aquellos tumores con una proliferación rápida presenten flexibilidad 
metabólica y la relación entre los estados metabólicos cambia de acuerdo al 
desarrollo de la enfermedad, es decir, los mecanismos de producción de energía 
se modifican con base en los requerimientos energéticos de la célula (Figura 4). 
Esto supone que las células de cáncer mantienen un número constante de 
Figura 3. Representación del efecto Warburg. 
La célula normal (azul) representa un modelo con metabolismo oxidativo, mientras que 
en la célula cancerosa (rojo) un metabolismo glicolitico en el que hay un consumo mayor 
de glucosa, una producción alta de lactato e incremento de los intermediarios para otras 
vías bioenergéticas. Modificado de Bierly and Mattiuz, 2013. 
 
Figura 4.Remodelación del metabolismo energético en el proceso de 
carcinogénesis. 
Se muestra los cambios en el mecanismo de producción de energía que tiene una 
célula tumoral (OXPHOS-Glicólisis-OXPHOS) en el proceso de transformación y 
formación del tumor. Modificado de Rossignol et al., 2011) Figura 3. Representación 
del efecto Warburg. 
La célula normal (azul) representa un modelo con metabolismo oxidativo, mientras que 
en la célula cancerosa (rojo) un metabolismo glicolitico en el que hay un consumo mayor 
de glucosa, una producción alta de lactato e incremento de los intermediarios para otras 
vías bioenergéticas. Modificado de Bierly and Mattiuz, 2013. 
 
Figura 4.Remodelación del metabolismo energético en el proceso de 
carcinogénesis. 
Se muestra los cambios en el mecanismo de producción de energía que tiene una 
célula tumoral (OXPHOS-Glicólisis-OXPHOS) en el proceso de transformación y 
formación del tumor. Modificado de Rossignol et al., 2011) 
 
Figura 5. Metodología general. 
 
boración de los mapas Validación del estado en líneas Análisis del proteoma 
 
 
 
 
8 
mitocondrias con las que puedan pasar de OXPHOS-Glicólisis durante la 
carcinogénesis. (Rossognol et al., 2011) 
 
 
 
2.5 MITOCONDRIAS FUNCIONALES 
 
Las mitocondrias son organelos dinámicos, pueden cambiar su forma, tamaño y 
distribución subcelular (Rojo et al., 1998), así como su actividad metabólica en 
respuesta a las condiciones fisiológicas y patológicas (Cuezva et al., 1997). Se ha 
observado en una gran variedad de células cancerosas en que las mitocondrias 
siguen produciendo ATP de manera regular (Rossignol et al., 2011) lo cual 
fundamenta la hipótesis de que las modificaciones del entorno desencadena 
adaptaciones metabólicas que promueven la progresión del tumor (Smolkova et 
Figura 4.Remodelación del metabolismo energético en el proceso de 
carcinogénesis. 
Se muestra los cambios en el mecanismo de producción de energía que tiene una 
célula tumoral (OXPHOS-Glicólisis-OXPHOS) en el proceso de transformación y 
formación del tumor. Modificado de Rossignol et al., 2011) 
 
Figura 5. Metodología general. 
 
boración de los mapas Validación del estado en líneas Análisis del proteoma 
 
Figura . Metodología general 
boración de los mapas Validación del estado en líneas Análisis del proteoma 
 
Figura . Metodología general 
Elaboración de los mapas Validación del estado en líneas Análisis del 
proteoma 
 
Figura . Metodología general 
Elaboración de los mapas Validación del estado en líneas Análisis del 
proteoma9 
al., 2010). Por lo tanto, las mitocondrias y los cambios que generan en el fenotipo 
celular constituyen un campo de estudio de gran interés, al demostrarse que 
tienen impactos en por lo menos dos factores que caracterizan el fenotipo tumoral: 
la proliferación y evasión a la muerte (Sánchez, 2014). 
2.5.1 Alteración de fenotípico bioenergético mitocondrial 
 
La alteración del metabolismo energético, la versatilidad y confluencia de las vías 
involucradas en el cáncer sugieren que en la mitocondria podrían encontrarse 
biomarcadores de prognosis y diagnóstico, debido a que en tumores humanos se 
presentan numerosos cambios a nivel de la OXPHOS y la biogénesis mitocondrial 
(Bellance, et al., 2009). Recientemente se propuso una firma bioenergética o 
índice bioenergético celular (índice BEC), el cual funciona como marcador de 
prognosis en cáncer y estima el potencial mitocondrial de la célula expresado 
como la razón βF1ATPasa/Hsp60/GAPDH, es decir, la relación entre el 
metabolismo oxidativo (cambios en la βF1ATPasa de la OXPHOS) y glicolítico 
(presencia de GAPDH) (Cuezva et al., 2002, 2004). 
En nuestro laboratorio se han observado cambios en la dinámica y expresión de 
proteínas de la OXPHOS. Fernández en 2014 comparó el proteoma mitocondrial 
de un modelo que emula el efecto Warburg con las líneas celulares T98G y 
U87MG, que tienen un metabolismo oxidativo y glicolítico respectivamente y 
representan un estado inicial y otro avanzado en el proceso de progresión tumoral. 
Demostró que a nivel mitocondrial existen diferencias en la expresión y arreglo de 
proteínas de la cadena respiratoria, evidenciando que el contenido de complejos 
respiratorios disminuye en U87MG y la formación de supercomplejos 
(aglomerados de los complejos I, II y IV) es mayor en T98G. Por otra parte en otro 
trabajo, se realizó una comparación del proteoma celular y se encontró que 24 
proteínas están diferencialmente expresadas, las cuales están involucradas en 
procesos como glicólisis, migración celular y estrés (Ramâo et al., 2012), lo cual 
demuestra que otras rutas celulares pueden estar participando en el proceso de 
progresión tumoral. 
 
 
10 
Por tal razón, estudiar la mitocondria y las modificaciones en su entorno en 
diferentes etapas metabólicas es relevante pues constituye un campo de estudio 
para definir nuevos blancos terapéuticos donde la proteómica sería una 
herramienta útil. 
 
2.5.1.1 Biomarcador 
 
Se conoce biomarcador a la característica o cambio fisiológico, bioquímico o 
morfológico medible y evaluable a nivel molecular, bioquímico o celular que actúa 
como indicador de un proceso biológico normal o patológico. Y estos se clasifican 
con base a la información que proporcionan en: De riesgo (informan sobre la 
predisposición de padecer una patología), diagnósticos, prognóstico, etc. 
Lo más frecuente y sencillo en el diagnóstico de enfermedades es que el marcador 
biológico sea un cambio medible en la concentración de una sustancia química o 
la simple presencia o ausencia de esa sustancia. 
Dentro de los marcadoes biológicos más complejos se encuentran los patrones 
moleculares de diferentes índole, en donde el estudio del proteoma es sumamente 
importante (Ortega-Ortiz, 2010) 
2.6 PROTEÓMICA COMO HERRAMIENTA EN LA BÚSQUEDA DE 
BIOMARCADORES 
 
El término proteoma define al complemento proteico del genoma y se refiere al 
conjunto completo de proteínas expresado por una célula durante un momento y 
condiciones determinadas (Rodríguez, 2014), de forma que brinda información 
acerca de la abundancia, localización e interacciones entre las proteínas en 
diferentes estados y se pueden identificar los cambios que presenta la célula 
(Petricoin et al., 2002) 
Aunque los estudios genómicos son útiles, los cambios en la expresión genética 
no siempre explican lo que se ve a nivel proteico. Las proteínas son reguladas por 
 
 
11 
otros procesos como: alteraciones en los niveles de traducción y modificaciones 
postraduccionales que son determinantes en la función biológica. Por esta razón 
en la búsqueda de biomarcadores, la proteómica es una herramienta útil que 
permite diferenciar etapas de un proceso, basándose en la identificación de las 
proteínas que han sido modificadas (Echeverri et al., 2010). 
La proteómica es una herramienta que permite analizar la dinámica y los cambios 
de expresión en proteínas asociadas a procesos biológicos como la 
carcinogénesis; de esta forma al caracterizar el proteoma, se pueden identificar 
proteínas con potencial de biomarcador (Rodríguez, 2014). 
Es interesante apuntar que en diversos estudios se han reportado varias proteínas 
mitocondriales, tales como: βF1ATPasa, HSp60, IF1 (Cuezva et al., 2002; 
Capuano et al.,1997), las cuales se encuentran expresadas diferencialmente en 
distintos tipos de cáncer. 
La proteína IF1 o Inhibitory Factor 1 fue descrita por primera vez en los años 60 
por Pullman y Monroy como un pequeño inhibidor peptídico termoestable y con 
capacidad de inhibir la actividad hidrolítica de la F1ATPasa solubilizada (Pullman 
and Monroy, 1963). Esta proteína tiene la capacidad de inhibir la actividad de la 
ATPasa debido a la apertura del espacio de la interfase α/β de la ATPasa que 
produce la unión de su región central y N-terminal, alterando los cambios 
conformacionales que se dan en la catálisis rotatoria del enzima y posiblemente 
bloqueando también la rotación del brazo central de la ATPasa (Minauro-
SanMiguel et al., 2002). De esta manera, la proteína IF1 es un regulador clave del 
metabolismo energético celular al inhibir la OXPHOS y regular la actividad de la 
glicólisis aeróbica (Cuezva et al., 2010; Sánchez, 2014; Cuezva et al., 2013). 
 
 
 
 
 
12 
3 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 
 
Dentro del proceso conocido como progresión tumoral se afectan varias rutas 
celulares, una de ellas es la modificación del metabolismo energético en la que 
hay cambios relevantes como la transición de un estado oxidativo a uno glicolítico. 
Los estudios realizados hasta el momento se han enfocado en buscar mutaciones 
en la mitocondria e identificar proteínas de forma aleatoria con relación a la 
transformación metabólica; sin embargo, no se ha logrado establecer la relación 
que tienen entre sí. En nuestro laboratorio buscamos los cambios provocados en 
el proteoma mitocondrial en dos estados metabólicos. Sin embargo, este proceso 
no es un evento aislado y compete a toda la célula, por lo cual es de suma 
importancia conocer todas las rutas celulares que se ven implicadas y determinar 
cual tiene mayor relevancia. 
El uso de proteómica al estudiar la progresión tumoral ha permitido ampliar los 
conocimientos sobre este fenómeno. Sin embargo, aún no se ha logrado definir la 
participación que tienen las diferentes rutas celulares y su relevancia, esto puede 
atribuirse principalmente a que su uso ha sido de forma aislada (observando el 
fenómeno únicamente en la mitocondria o sobre aspectos muy específicos) o 
sesgada (utilizando análisis estadísticos poco adecuados). 
Por tal razón, es de nuestro interés evaluar los cambios en las vías mitocondriales 
con respecto al proteoma celular en un modelo de glioblastoma modificando el 
método de selección de las proteínas e implementando el uso de análisis 
estadísticos que nos permitan tener una percepción más amplia del proceso. 
 
 
13 
4 JUSTIFICACIÓN 
 
Los métodos de análisis comúnmente usados para los proteomas 2D son las 
pruebas de t de Student y fold change, este tipo de pruebas es muy limitada para 
el análisis de datos Obtenidos por proteómica, con los que la información se ve 
sesgada. Por esta razón es de nuestro interés analizar y comparar los datos 
obtenidos, tanto a nivele mitocondrial como celular, con herramientas estadísticas 
alternativas como el análisis de Componentes Principales que, nos proporcionará 
la información para determinar gruposconcretos de proteínas que definen el 
proceso, la importancia que tienen estas proteínas dentro del fenómeno y cuáles 
podrían ser candidatos a biomarcador. 
 
 
 
 
14 
5 HIPÓTESIS 
 
Las líneas celulares T98G y U87MG de glioblastoma representan dos etapas en la 
progresión tumoral (inicial y avanzada), tienen un metabolismo oxidativo y 
glicolítico respectivamente, por lo tanto presentan un proteoma particular. Al 
comparar ambos proteomas, el análisis de componentes principales mostrará las 
proteínas que son relevantes en el proceso, permitiendo entender el papel de las 
vías celulares implicadas y del metabolismo mitocondrial. 
 
 
 
15 
6 OBJETIVOS 
 
6.1 GENERAL 
 
Encontrar el papel del cambio metabólico con respecto a las proteínas (vías 
celulares) relevantes en la progresión tumoral en las líneas celulares T98G y 
U87MG de glioblastoma. 
 
6.2 PARTICULARES 
 
 Caracterizar el estado de las líneas celulares con respecto a proteínas 
específicas implicadas en carcinogénesis. 
 Definir cuales spots/proteína son relevantes de acuerdo con herramientas 
de análisis estadístico multivariado (componentes principales). 
 
 
 
16 
7 MATERIAL Y MÉTODOS 
7.1 METODOLOGÍA GENERAL 
 
 Figura 5.. Metodología general. 
Elaboración de los mapas Validación del estado en líneas Análisis del proteoma 
 
 
Figura 6. 1D separación por punto isoeléctrico. 
a) Muestra el patrón de corrida de las proteínas, este depende de la carga que presenten, si es 
 
 
 
17 
7.2 CULTIVO CELULAR 
 
Se usaron las líneas celulares de glioblastoma humano T98G (ATCC® CRL-
1690™) y U87MG (ATCC®HTB-14™), ambas se crecieron en medio Eagle Medio 
Mínimo Esencial (EMEM) suplementado con Suero Fetal Bovino (SFB) [10%] y 
antibiótico-antimicótico (penicilina 10000 µg /mL, estreptomicina10000 µg/mL y 
anfotericina B 25 µg/mL) [1%] en cajas de cultivo estéril de 175 cm2 a 37°C, y CO2 
[5%] manteniendo una atmosfera húmeda, con cambios periódicos de medio hasta 
obtener una confluencia del 90% para realizar los experimentos propuestos 
7.3 EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS 
 
Las células fueron lavadas con Tampón de fosfato salino (PBS), posteriormente se 
rasparon con gendarme y 1mL de buffer RIPA (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, tritón X 
100 [1 %], Desoxicolato de sodio (DOC) [0.5 %], Dodecilsulfato sódico (SDS) [0.1 
%], Ácido etildiaminotetraacético (EDTA) 5 mM pH 7.5 con inhibidor de proteasas), 
el extracto obtenido se homogeneizó en un potter de teflón y se centrifugó a 12000 
rpm/10Min/4°C. Fue recuperado el sobrenadante. 
Para la electroforesis 2D, el extracto se precipitó con acetona [100%] 24 h/-70°C, 
se centrifugó a 12000 rpm/10 min y se desechó la acetona. El pellet se 
resuspendió en buffer de solubilización (Urea 7M, Tiourea 2M, 3-[(3-
Colamidopropil)-dimetilamonio]-propano sulfatano (CHAPS) [2%], Anfolitas [5%], 
Ditiotreitol (DTT) 60mM, Tris base 40 nM). 
7.4 CUANTIFICACIÓN 
 
La cantidad de proteína necesaria para cada ensayo se determinó por el método 
de Lowry (Lowry OH, 1951), utilizando albúmina en la construcción de la curva 
estándar con concentraciones desde 0.5 µg hasta 40µg/mL. Se registraron valores 
a una longitud de onda de 660 nm en un espetrofotómetro Ultrospec 2000 
UV/Visible Spectophotometer. 
 
 
18 
7.5 ELECTROFORESIS DESNATURALIZANTE (SDS-PAGE) 
 
El método que se utilizó fue el sistema discontinuo de Laemmli (Laemmli, 1970), 
se utilizó un gel separador al 12% y concentrador al 5%. Los geles se corrieron a 
100V/2h. 
7.6 ISOELECTROENFOQUE (IEF) 
 
Se usaron tiras de poliacrilamida de 7 cm (GE, USA) con un intervalo de pH de 3-
10, fueron hidratadas con el buffer de corrida (Urea 6M, Tiourea 2M, CHAPS 2%, 
2 µl de Azul de bromofenol, 1.25 µl de Anfolitas [1:100 µl]) con 310 µg de proteína 
en un volumen total de 125 µl durante 16 h. Transcurrido el tiempo de hidratación 
las tira se colocaron en la cámara de isoelectroenfoque Ettan IPGphor III 
Isoelectric Focusing System y se corrieron, en 4 pasos: 300V/30min, 
1000V/60min, 5000V/90min y 500V/36min. 
 
 
 
Figura 6. 1D separación por punto isoeléctrico. 
a) Muestra el patrón de corrida de las proteínas, este depende de la carga que presenten, si 
es positiva tiene un pH alto y migrará al lado negativo del gradiente, por otra parte si la carga 
es negativa tiene un pH bajo por lo que migrará a lado positivo del gradiente. 
b) Presenta la ubicación de las proteínas una vez separadas por su pinto isoeléctrico. 
Modificado de Nelson and Cox, 2007. 
 
Figura 7. Representación gráfica del método de separación por electroforesis 
bidimensional desnaturalizante. 
El extracto proteico es separado en una 1D por su punto isoeléctrico, posteriormente en la 
2D son separadas por su PM. El perfil obtenido determina la huella de un proteoma 
específico. Modificado de NPTEL, 2015. 
Figura 6. 1D separación por punto isoeléctrico. 
 
 
19 
7.7 ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL DESNATURALIZANTE 
 
Una vez que se realizó el IEF la tira pasó por un tren de equilibrio que consiste en 
tres lavados de 20 min con buffer de equilibrio (Urea 6M, Glicerol [30%], SDS 
0.05M, Tris HCl pH 8.8 y 2µl de azul de Bromofenol) con Ditiotreitol (DTT) 10 mM y 
dos lavados de 20 min con buffer de equilibro con iodoacetamida 0.02 M 
La tira tratada se colocó perpendicularmente en un gel de poliacrilamida [13%] y 
se recubrió con agarosa [0.01%] teñida con 2 µl de azul de Bromofenol. El gel se 
corrió a 120V/3 h. 
El gel se fijó con solución fijadora (Metanol [50%], Ac. Acético [10%] H2O 
destilada) durante 40min, se lavó y fue teñido con solución teñidora (Comassie 
Brillant Blue G250 [0.12%], Sulfato de amonio [10%] Ac. Fosfórico [10%] Metanol 
[20%]) 16 h. Finalmente se lavó con solución desteñidora (Sulfato de amonio [5%], 
Metanol [10%], H2O destilada) hasta eliminar el fondo. 
 
Figura 7. Representación gráfica del método de separación por electroforesis 
bidimensional desnaturalizante. 
El extracto proteico es separado en una 1D por su punto isoeléctrico, posteriormente 
en la 2D son separadas por su PM. El perfil obtenido determina la huella de un 
proteoma específico. Modificado de NPTEL, 2015. 
 
Figura 8. Esquema de electroforesis y transferencia. 
1) La muestra se coloca en el gel dentro de la cámara. 2. Las proteínas son 
separadas a lo largo del gel. 3) Una vez que la muestra fue separada en el gel este 
se transfiere a una membrana de PVDF. 4) Con la membrana se realiza los 
 
 
20 
7.8 WESTERN BLOT (WB) 
 
Las muestras separadas en los geles se transfirieron a una membrana de 
Polivinildifluoruro (PVDF), En la transferencia se utilizó un amortiguador de Towbin 
(tris base 0.3 % p/v, glicina 1.44 % p/v, metanol 10 % v/v) (Towbin, et al. 1979) al 
que se sustituyó tris base por Ácido 3-(ciclohexilamino)-1-propanosulfónico 
(CAPS) [10%] y se desarrolló a 100V/2 h. La membrana se bloqueó con leche libre 
de grasa al 5% en Tampón de fosfato salino con Tween (PBS-T) por 1h con 
agitación suave a temperatura ambiente para evitar el pegado inespecífico de 
anticuerpos. Después, se añadió el anticuerpo primario correspondiente Porina 
(abcam Porin [20B12AF2]) o Factor Inhibidor 1 (abcam Inhibitory Factor 1 
[5E2D7]) utilizando una disolución de 1:2000, se incubó 16 h en agitación 
constante a 4°C. 
Una vez que se unió el anticuerpo primario, se incubó con el secundario acoplado 
a Ig G de ratón en disolución 1:10000, para esto realizaron tres lavados de 15 min 
con PBS-T, se agregó el anticuerpo secundario y se dejó en agitación durante una 
hora a temperatura ambiente. Finalmente se realizaron tres lavados de 15 min con 
PBS-T para pasar a la etapa de detección por quimioluminiscencia. Se agregó la 
solución de quimioluminiscencia (kit millipore) en la superficie de la membrana 
durante 5 min. Transcurrido el tiempo se retiró la solución. La membrana fue 
escaneada en Cdigit li-cor utilizando el programa Image Studio Agent Ver. 3.1.21 
 
7.9 ANÁLISIS DE IMAGEN PD-QUEST 
 
Las imágenes se adquirieron en un densitómetro modelo GS-800 de Bio-rad. Las 
imágenes fueron cortadas y filtradas, posteriormente se analizaron con el 
programa PD-Quest Advanced V 8.0. Para el análisis se establecieron los 
siguientes parámetros: modelo Gaussiano, la detección del mismo número de 
puntos de proteína (spots) y filtro adaptativo que tiene como función reducir el 
ruido dentro de la imagen y cambia según los parámetros asignados. Los geles se 
“muestrearon” utilizando una red de 7x7, en cada cuadro se revisaron todos los 
spots encontrados automáticamente por el programa y se marcaron de forma 
aleatoria de acuerdo con la densidad, y bajo la condición de presentarse en ambas 
líneas o en la mayoría de los geles. Finalmente se obtuvo un gel maestro (Figura 
9) en el que se empalman todos los geles y se muestra un proteoma general con 
todos los spots. 
7.10 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 
 
En la base de datos obtenida con los spots se imputaron los datos faltantes con un 
análisis de regresión lineal múltiple. Posteriormente, se normalizaron y clasificaron 
en cinco grupos de expresión (5-1, siendo 5 muy expresado y 1 expresión muy 
baja). Posteriormente se realizó el análisis estadístico multivariado de 
componentes principales (ACP) para lo cual se utilizó un programa de licencia libre 
en R. Para el ACP de realizó una matriz de correlación, con él se evidenció las 
relaciones y la participación de todos los componentes dentro del fenómeno 
 
 
22 
 
 
Figura 9. Gel maestro generado por el programa PD-Quest de Bio rad al combinar 
los spots de proteína de todos los geles de ambas líneas celulares. 
Los puntos marcados con verde muestran los spots identificados por el programa, los 
recuadros morados son aquellos spots identificados por el programa que fueron 
marcados manualmente y los recuadros azules son los spots que no fueron detectados 
por el programa y que se añadieron manualmente. 
 
Figura 9. Gel maestro generado por el programa PD-Quest de Bio rad al combinar 
los spots de proteína de todos los geles de ambas líneas celulares. 
Los puntos marcados con verde muestran los spots identificados por el programa, los 
recuadros morados son aquellos spots identificados por el programa que fueron 
marcados manualmente y los recuadros azules son los spots que no fueron detectados 
por el programa y que se añadieron manualmente. 
 
 
23 
8 RESULTADOS 
8.1 MANTENIMIENTO DE LÍNEAS CELULARES 
 
Las líneas celulares T98G y U87MG (Figura 10) se crecieron hasta alcanzar una 
confluencia de aproximadamente el 90%, posteriormente se obtuvieron los 
extractos de proteína total para realizar diferentes los ensayos, estos se 
almacenaron a -70ᵒ C hasta su uso. 
 
 
 
 
Figura 10. Imágenes por microscopia invertida del crecimiento de las líneas celulares 
T98G y U87MG. 
La línea T98G crece formando una monocapa muy compacta, se muestran diferentes 
estados de confluencia, teniendo en a) el 20 % y b) el70 % de confluencia y alcanza el 90% 
de confluencia en 14 días. Por otra parte la línea U87MG al crecer forma cúmulos, se 
muestra algunos de sus estados de confluencia, siendo en a) el 20% y b) el 70%, esta línea 
alcanza el 90% de confluencia en 21 días. 
 
Figura 10. Imágenes por microscopia invertida del crecimiento de las líneas celulares 
T98G y U87MG. 
La línea T98G crece formando una monocapa muy compacta, se muestran diferentes 
estados de confluencia, teniendo en a) el 20 % y b) el70 % de confluencia y alcanza el 90% 
 
 
24 
8.2 RENDIMIENTO PROTEICO 
 
El extracto se obtuvo con aproximadamente 8x10 6 de células con la finalidad de 
contar con proteína suficiente para realizar los experimentos. Cabe destacar que 
todas las células que se usaron provenían del 2do pase, esto con la intención de 
que tuvieran las mismas características y evitar variaciones que podrían 
presentarse al ser de diferentes pases. El rendimiento de la extracción, no varió 
mucho aunque fue mayor a lo esperado en U87MG. Para la línea T98G se 
obtuvieron 11.2mg de proteína y en la línea U87MG 12.6mg. 
8.3 INTEGRIDAD DE LAS PROTEÍNAS 
 
Con el propósito de conocer el perfil electroforético y la integridad que 
presentaban los extractos celulares se realizó una electroforesis 
desnaturalizantecomo se describe en la metodología. En la Figura 11 se observa 
que en ambos casos los perfiles muestran bandas bien definidas y distribuidas a lo 
largo del gel, aunque se cargó con la misma cantidad de proteína existen 
diferencias de expresión entre los perfiles electroforéticos de cada línea, en 
U87MG hay proteínas que presentan una sobreexpresión muy marcada. Al no 
presentar barridos, el experimento reflejó que la integridad y la calidad de las 
muestras estaban en óptimas condiciones para realizar los experimentos 
propuestos. 
Figura 11. Perfil electroforético obtenido de T98G y U87MG en SDS-PAGE 12%. 
El gel fue cargado utilizando 5 µg de proteína para cada línea celular y fue teñido con 
azul de Comassie. De lado izquierdo se encuentra el marcador de peso molecular. 
 
Figura 12. Análisis de expresión en las líneas celulares por 
ensayo de Western Blot. En extractos de proteína total. 
 
 
25 
8.4 CARACTERIZACIÓN POR WESTERN BLOT 
 
Para las inmunodetecciones os extractos se cuantificaron y separaron en una 
electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE al 12% y se transfirieron a una 
membrana e PVDF. Para verificar que los cambios de proteínas se usó porina(49 
kDa) como control de carga mitocondrial debido a que la membrana externa es 
rica en esta proteína, tambien denominada voltage dependent anion channel 
(VDAC) (Gambero de Luna and Gambero, 2012). La densidad de estas bandas 
fue medida en la inmunodetección de ambas lienas. Aparentemente en estos 
análisis se ocuparon la misma cantidad de mitocondrias, respecto a la cual se 
midio la presencia de la proteina IF1 (11kDa) la cual es un regulador clave del 
metabolismo energético de la célula y puede funcionar como marcador en el 
proceso de progresión tumoral. 
La inmunodetección por WB se realizó con quimioluminiscencia en un Scanner C-
digit de Li Cor. La Figura 12a muestra que ambas líneas presentaron la misma 
cantidad de mitocondrias, debido a que la intensidad de reacción con porina es la 
misma, no obstante al evaluar IF1, se encontró una diferencia de expresión 
notable, siendo mayor en la línea T98G (Figura 12b) El analisis densitométrico se 
realizó con el programa Image1 usando las imágenes adquiridas con el 
fotodocumentador SYNGENE para corroborar el resultado. La Tabla 1 muestra 
que la cantidad de proteína expresada en pixeles/cm2 para porina es la misma en 
ambas lineas. Sin embargo, en el caso de IF1 se muestra que hay una diferencia 
visible siendo T98G la que tiene mayor cantidad de proteína. Es interesante notar 
que a persar de que se propone como un marcador, el cambio en el condenido es 
de menos del doble, por lo que en análisis típicos de proteómica no aparece. 
 
 
 
 
 
 
 
26 
 
 
 
 
 
27 
 
 
8.5 2D SDS-PAGE 
 
La 2D SDS-PAGE mostró que existen proteínas diferencialmente expresadas en 
ambas lineas celulares. La Imagen 13 se muestra el proteoma de T98G y la 
imagen 14 el de U87MG, donde las diferencias de expresión más evidentes están 
resaltadas en círculos rojos y con verde fueron marcadas algunas de las proteínas 
que se encuentran presentes en ambas líneas. 
 
Línea 
celular Pixeles/cm2 Promedio T98G/U87MG Índice 
 U87MG 66362.7 9900.1 6.7 1.4 
IF1 T98G 56328.8 
 12076.4 4.7 1.4 
 U87MG 25505.4 11891.1 2.1 
Porina T98G 55399.5 1.0 25836.8 2.1 
TABLA 1. ANÁLISIS DENSITOMÉTRICO 
 
Figura 13. Gel en 2D SDS-PAGE representativo de T98G teñido con azul de Comassie coloidal. 
Para realizar este gel se utilizaron 310 µg de proteína. La flecha superior indica el 
sentido de la 1D y la flecha lateral indica el sentidode la 2D la cual se realizó en un 
gel al 13%. Los círculos rojos muestran algunas de las diferencias visibles 
encontradas al comparar con U87MG y los círculos verdes son algunas proteínas 
que ambos geles presentan.TABLA 1. ANÁLISIS DENSITOMÉTRICO 
 
Figura 13. Gel en 2D SDS-PAGE representativo de T98G teñido con azul de Comassie coloidal. 
Para realizar este gel se utilizaron 310 µg de proteína. La flecha superior indica el sentido de la 1D y la 
flecha lateral indica el sentido de la 2D la cual se realizó en un gel al 13%. Los círculos rojos muestran 
algunas de las diferencias visibles encontradas al comparar con U87MG y los círculos verdes son algunas 
proteínas que ambos geles presentan. 
 
Figura 14. Gel en 2D SDS-PAGE representativo de U87MG teñido con azul de Comassie coloidal. 
Para realizar este gel se utilizaron 310 µg de proteína. La flecha superior indica el sentido de la 1D y la 
flecha lateral indica el sentido de la 2D la cual se realizó en un gel al 13%. Los círculos rojos muestran 
algunas de las diferencias visibles encontradas al comparar con T98G y los círculos verdes son algunas 
proteínas que ambos geles presentan.Figura 13. Gel en 2D SDS-PAGE representativo de T98G teñido 
con azul de Comassie coloidal. 
Para realizar este gel se utilizaron 310 µg de proteína. La flecha superior indica el 
sentido de la 1D y la flecha lateral indica el sentido de la 2D la cual se realizó en un 
gel al 13%. Los círculos rojos muestran algunas de las diferencias visibles 
encontradas al comparar con U87MG y los círculos verdes son algunas proteínas 
que ambos geles presentan.TABLA 1. ANÁLISIS DENSITOMÉTRICO 
 
Figura 13. Gel en 2D SDS-PAGE representativo de T98G teñido con azul de Comassie coloidal. 
Para realizar este gel se utilizaron 310 µg de proteína. La flecha superior indica el 
sentido de la 1D y la flecha lateral indica el sentido de la 2D la cual se realizó en un 
gel al 13%. Los círculos rojos muestran algunas de las diferencias visibles 
encontradas al comparar con U87MG y los círculos verdes son algunas proteínas 
que ambos geles presentan.TABLA 1. ANÁLISIS DENSITOMÉTRICO 
Figura 13. Gel en 2D SDS-PAGE representativo de T98G teñido con azul de 
Comassie coloidal. 
Para realizar este gel se utilizaron 310 µg de proteína. La flecha superior indica el 
sentido de la 1D y la flecha lateral indica el sentido de la 2D la cual se realizó en un gel 
al 13%. Los círculos rojos muestran algunas de las diferencias visibles encontradas al 
comparar con U87MG y los círculos verdes son algunas proteínas que ambos geles 
presentan. 
 
 
 
28 
 
 
 
 
8.6 ANÁLISIS DE IMAGEN PD-QUEST 
 
Para el análisis de imágenes se usó el software PD-Quest. En modo automático 
este programa identificó un total de 320 proteínas “spots”. Sin embargo, algunos 
de los spots identificados fueron artificios provocados por la tinción, por esta razón 
se hizo una revisión manual como se describe en los métodos, donde se 
identificaron y marcaron 200 de esos spots (color morado). Posteriormente, se 
añadieron 55 spots no detectados por el programa, que tras la inspección visual 
cumplían con las características de spots/proteína las cuales son: estar presentes 
en la mayoría de los geles, encontrarse en al menos un gel de cada línea celular o 
estar en todos los geles de una línea. En la Figura 15 se muestra el resultado del 
análisis de imagen, con el que se obtuvo las densidades de los spots. Estos datos 
de expresión (pixeles/cm2) fueron utilizados para elaborar la base de datos con la 
que se realizó el análisis estadístico. 
Figura 14. Gel en 2D SDS-PAGE representativo de U87MG teñido con azul de 
Comassie coloidal. 
Para realizar este gel se utilizaron 310 µg de proteína. La flecha superior indica el 
sentido de la 1D y la flecha lateral indica el sentido de la 2D la cual se realizó en un gel 
al 13%. Los círculos rojos muestran algunas de las diferencias visibles encontradas al 
comparar con T98G y los círculos verdes son algunas proteínas que ambos geles 
presentan. 
 
 
Figura 15. Selección de proteínas utilizando el programa PD-Quest. 
En el experimento generado por el programa se utilizaron 4 geles de U87MG (Rojo) y 4 
de T98G (Verde) con los cuales se formó un gel maestro (Blanco).Para la selección de 
los spots se utilizó un cuadrante de 7x7. Los recuadros morados representan los spots 
identificados por el programa y marcados manualmente y los recuadros azules son 
aquellos spots que no fueron detectados por el programa y que añadieron 
manualmente.Figura 14. Gel en 2D SDS-PAGE representativo de U87MG teñido 
con azul de Comassie coloidal. 
Para realizar este gel se utilizaron 310 µg de proteína. La flecha superior indica el 
sentido de la 1D y la flecha lateral indica el sentido de la 2D la cual se realizó en un gel 
al 13%. Los círculos rojos muestran algunas de las diferencias visibles encontradas al 
comparar con T98G y los círculos verdes son algunas proteínas que ambos geles 
presentan. 
 
 
Figura 15. Selección de proteínas utilizando el programa PD-Quest. 
En el experimento generado por el programa se utilizaron 4 geles de U87MG (Rojo) y 4 
de T98G (Verde) con los cuales se formó un gel maestro (Blanco).Para la selección de 
los spots se utilizó un cuadrante de 7x7. Los recuadros morados representan los spots 
identificados por el programa y marcados manualmente y los recuadros azules son 
aquellos spots que no fueron detectados por el programa y que añadieron 
manualmente. 
 
TABLA 2. ANÁLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALESFigura 15. Selección 
de proteínas utilizando el programa PD-Quest. 
En el experimento generado por el programa se utilizaron 4 geles de U87MG (Rojo) y 4 
de T98G (Verde) con los cuales se formó un gel maestro (Blanco).Para la selección de 
 
 
29 
 
 
 
 
 
Figura 15. Selección de proteínas utilizando el programa PD-Quest. 
En el experimento generado por el programa se utilizaron 4 geles de U87MG (Rojo) y 4 
de T98G (Verde) con los cuales se formó un gel maestro (Blanco).Para la selección de 
los spots se utilizó un cuadrante de 7x7. Los recuadros morados representan los spots 
identificados por el programa y marcados manualmente y los recuadros azules son 
aquellos spots que no fueron detectados por el programa y que añadieron 
manualmente. 
 
TABLA 2. ANÁLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALESFigura 15. Selección 
de proteínas utilizando el programa PD-Quest. 
En el experimento generado por el programa se utilizaron 4 geles de U87MG (Rojo) y 4 
de T98G (Verde) con los cuales se formó un gel maestro (Blanco).Para la selección de 
los spots se utilizó un cuadrante de 7x7. Los recuadros morados representan los spots 
identificados por el programa y marcados manualmente y los recuadros azules son 
aquellos spots que no fueron detectados por el programa y que añadieron 
manualmente. 
 
 
 
30 
8.7 ANÁLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES (ACP) 
 
Los datos correspondientes a la densidad de cada spot fueron utilizados para el 
ACP, en el cual se definieron siete componentes principales (CP). Cada uno de 
estos CP representa una parte del fenómeno equivalente a la varianza expresada 
y la importancia que tiene (Tabla 2). De esta forma el CP1 explica el 31%, el CP2, 
el CP 3 el 15.6%, etc. El CP1 agrupa entonces, el 31% de las proteínas lo cual lo 
define como el más importante. Al graficarlo, se encontró que este componente 
es capaz de distinguir entre ambas líneas (figura16), por tal razón el análisis se 
enfocó en las proteínas que componen a ese factor. 
 
 
 
 
 CP1 CP2 CP3 CP4 CP5 CP6 CP7 
Varianza expresada (%) 31.21 24.11 15.63 10.64 8.44 6.50 3.43 
Acumulado (%) 31.21 55.32 70.96 81.61 90.05 96.56 100 
TABLA 2. ANÁLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES 
 
Figura 16. Gráfica del CP1. 
El resultado obtenido al graficar el CP1 logró distinguir y separar entre la línea celular T98G (Azul) y 
U87Mg (Anaranjado) 
 
TABLA 3. PROTEÍNAS QUE FORMAN A CP1Figura 16. Gráfica del CP1.El resultado obtenido al graficar el CP1 logró distinguir y separar entre la línea 
celular T98G (Azul) y U87Mg (Anaranjado) TABLA 2. ANÁLISIS DE 
COMPONENTES PRINCIPALES 
 
Figura 16. Gráfica del CP1. 
El resultado obtenido al graficar el CP1 logró distinguir y separar entre la línea celular T98G (Azul) y 
U87Mg (Anaranjado) 
 
TABLA 3. PROTEÍNAS QUE FORMAN A CP1Figura 16. Gráfica del CP1. 
El resultado obtenido al graficar el CP1 logró distinguir y separar entre la línea celular T98G (Azul) y 
U87Mg (Anaranjado) 
 
Figura 16. Gráfica del CP1. 
El resultado obtenido al graficar el CP1 logró distinguir y separar entre la línea celular T98G (Azul) y 
U87Mg (Anaranjado) 
 
TABLA 3. PROTEÍNAS QUE FORMAN A CP1Figura 16. Gráfica del CP1. 
El resultado obtenido al graficar el CP1 logró distinguir y separar entre la línea 
celular T98G (Azul) y U87Mg (Anaranjado) TABLA 2. ANÁLISIS DE 
COMPONENTES PRINCIPALES 
 
Figura 16. Gráfica del CP1. 
Figura 16. Gráfica del CP1. 
El resultado obtenido al graficar el CP1 logró distinguir y separar entre la línea celular 
T98G (Azul) y U87Mg (Anaranjado) 
 
TABLA 3. PROTEÍNAS QUE FORMAN A CP1Figura 16. Gráfica del CP1. 
El resultado obtenido al graficar el CP1 logró distinguir y separar entre la línea celular 
T98G (Azul) y U87Mg (Anaranjado) 
 
 
 
31 
Para obtener la caracterización del cambio metabólico se debería identificar al 
menos las 46 proteínas por las que está formado el CP1, las cuales fueron 
determinadas por el valor del peso de factor (Pf) que presentaron. De acuerdo con 
esta evaluación las 46 proteínas son candidatos que pueden representar la firma 
molecular para cada línea. 
Al comparar con reportes previos (Ramão et al., 2012), se encontró que algunos 
spots coinciden con proteínas ya identificadas, y por las condiciones y ubicación 
en el gel podrían tratarse de las mismas. Sin embargo, aquellos spots con un Pf 
alto, los cuales son muy importantes dentro del CP (Anaranjado) no están 
identificadas, lo que sería ideal para orientarnos sobre las posibles vías afectadas 
(Tabla 3). 
Por otra parte, se graficaron los valores de expresión obtenidos para cada spot 
que conforma el CP1 (Figura 17). Cada perfil representa una firma biológica que 
representan un patrón biológico de expresión para cada estado (oxidativo y 
glicolítico). 
Posteriormente se generó una gráfica en la que se ubicó a los seis spot más 
importantes del CP, aquellos con un Pf alto (Estrellas), con la finalidad de observar 
su comportamiento en ambas líneas. En la Figura 18 se muestra que cinco de las 
proteínas que caracterizan al CP1 incrementan su expresión en la línea U87MG 
(estado glicolítico). 
 
 
 
 
 
32 
 
 TABLA 3. PROTEÍNAS QUE FORMAN A CP1 
 
Figura 17. Perfil de espresión del CP1. 
El perfil de cada línea celular representa una firma proteica que podría caracterizan el estado oxidativo 
(T98G) y el glicolítico (U87MG). El grado de expresión se estableció del 1-5, donde 1 es poco expresado y 
5 altamente expresado. 
 
Figura . Perfil de espresión del CP1. 
El perfil de cada línea celular representa una firma proteica que podría caracterizan el estado oxidativo 
(T98G) y el glicolítico (U87MG). El grado de expresión se estableció del 1-5, donde 1 es poco expresado y 
5 altamente expresado. 
 
Figura 18. Comparación gráfica del perfil de expresión del CP1 entre T98G y U87MG.Figura 17. 
Perfil de espresión1. 
El perfil de cada línea celular representa una firma proteica que podría caracterizan el estado oxidativo 
(T98G) y el glicolítico (U87MG). El grado de expresión se estableció del 1-5, donde 1 es poco expresado y 
5 altamente expresado. 
 
Figura . Perfil de espresión del CP1. 
El perfil de cada línea celular representa una firma proteica que podría caracterizan el estado oxidativo 
(T98G) y el glicolítico (U87MG). El grado de expresión se estableció del 1-5, donde 1 es poco expresado y 
5 altamente expresado.Figura . Perfil de espresión del CP1. 
El perfil de cada línea celular representa una firma proteica que podría caracterizan el estado oxidativo 
(T98G) y el glicolítico (U87MG). El grado de expresión se estableció del 1-5, donde 1 es poco expresado y 
5 altamente expresado. 
 
Figura . Perfil de espresión del CP1. 
El perfil de cada línea celular representa una firma proteica que podría caracterizan el estado oxidativo 
(T98G) y el glicolítico (U87MG). El grado de expresión se estableció del 1-5, donde 1 es poco expresado y 
5 altamente expresado.Figura 18. Comparación gráfica del perfil de expresión del CP1 entre T98G y 
U87MG.Figura 17. Perfil de espresión del CP1. 
El perfil de cada línea celular representa una firma proteica que podría caracterizan el estado oxidativo 
(T98G) y el glicolítico (U87MG). El grado de expresión se estableció del 1-5, donde 1 es poco expresado y 
5 altamente expresado. 
 
Figura . Perfil de espresión del CP1. 
El perfil de cada línea celular representa una firma proteica que podría caracterizan el estado oxidativo 
(T98G) y el glicolítico (U87MG). El grado de expresión se estableció del 1-5, donde 1 es poco expresado y 
5 altamente expresado. 
 
Figura . Perfil de espresión del CP1. 
El perfil de cada línea celular representa una firma proteica que podría caracterizan el estado oxidativo 
(T98G) y el glicolítico (U87MG). El grado de expresión se estableció del 1-5, donde 1 es poco expresado y 
5 altamente expresado. 
 
Figura . Perfil de espresión del CP1. 
El perfil de cada línea celular representa una firma proteica que podría caracterizan el estado oxidativo 
(T98G) y el glicolítico (U87MG). El grado de expresión se estableció del 1-5, donde 1 es poco expresado y 
5 altamente expresado. 
 
Figura 18. Comparación gráfica del perfil de expresión del CP1 entre T98G y U87MG.Figura 17. 
Perfil de espresión del CP1. 
 
 
33 
 Figura 17. Perfil de espresión del CP1. 
El perfil de cada línea celular representa una firma proteica que podría caracterizan el 
estado oxidativo (T98G) y el glicolítico (U87MG). El grado de expresión se estableció del 
1-5, donde 1 es poco expresado y 5 altamente expresado. 
 
Figura . Perfil de espresión del CP1. 
El perfil de cada línea celular representa una firma proteica que podría caracterizan el 
estado oxidativo (T98G) y el glicolítico (U87MG). El grado de expresión se estableció del 
1-5, donde 1 es poco expresado y 5 altamente expresado. 
 
 
 
34 
 
 
Figura 18. Comparación gráfica del perfil de expresión del CP1 entre T98G y U87MG. 
Las proteínas del CP1 más importantes con base al valor del peso de factor que presentaron fueron resaltadas en circulosT98G (azul) 
y U87MG(rojo). 
 
 
35 
9 DISCUSIÓN 
 
En este trabajo fueron utilizadas las líneas celulares T98G y U87MG de 
glioblastoma que presentan un metabolismo, oxidativo y glicolítico 
respectivamente. De acuerdo con esto el modelo emula un estado temprano y otro 
avanzado en el proceso de progresión tumoral, de acuerdo a lo postulado por 
Warburg y las observaciones hechas en varios tipos de cáncer (Cuezva et al., 
2002). Aunque ambas líneas celulares provienen del mismo tejido (la glia), 
presentan ciertas diferencias, por ejemplo la morfología de U87MG que crece 
formando cúmulos celulares, por otra parte T98G mantiene las características de 
la célula normal y crece formando una monocapa. 
Otra diferencia que presentan estas líneas celulares es la tasa de crecimiento. Se 
ha reportado que U87MG tiene una proliferación celular muy rápida y que al 
inseminarse en ratones forma tumores (Donoghue et al., 2011) y al alcanzar la 
confluencia necesaria en 21 días coincidió con lo reportado por Muira et al., 2010. 
Sin embargo, la línea T98G tuvo un crecimiento más rápido y alcanzó la 
confluencia necesaria en 15 días. Cabe resaltar que la diferencia en el tiempo de 
crecimiento no modificó la eficiencia en la obtención de proteínas, pues fue casi la 
misma. 
Al determinar la integridad de las proteínas se encontró, como seesperaba, un 
patrón de expresión similar entre ambas líneas ya que existen coincidencias en la 
formación de bandas diferenciándose únicamente en la intensidad de expresión. 
Sin embargo también evidenció la existencia de bandas que solo se expresan en 
una u otra línea. 
Con la inmunodetección se encontró que la expresión de porina en ambas líneas 
es la misma, por lo cual se entiende que presentan la misma cantidad de 
mitocondrias, es decir, aparentemente en el estado avanzado de glioblastoma 
como en las células U87MG, las mitocondrias están presentes casi en la misma 
cantidad que en un estado inicial como lo es T98G. Esto coincide con la teoría de 
 
 
36 
que las mitocondrias redireccionan o reducen su función, lo cual coincide con la 
hipótesis de Warburg donde la glicólisis experimentada por las células 
cancerígenas se debe a una reducida actividad bioenergética mitocondrial 
(Warburg, 1956a) y no a la desaparición de éstos organelos como se creía, lo cual 
promueve la teoría de la evolución del perfil bioenergético, en el que la célula 
cancerosa pasa de un estado de un estado metabólico a otro (OXPHOS-Glicólisis) 
según lo necesite, por tal razón es necesario que mantenga un número de 
mitocondrias constante (Rossignol et al., 2011). 
La glicólisis activada y la baja actividad mitocondrial son necesarias para la 
progresión tumoral que caracteriza el fenotipo de U87MG (Cuezva et al 2009; 
Sanchéz-Arago et al, 2013b), sin embargo, ya que la mitocondria puede tener un 
impacto positivo o negativo dentro de la carcinogénesis, como represor tumoral en 
la proliferación o participar en la evasión de muerte celular se cree que debe haber 
otras proteínas mitocondriales que influyan significativamente en este 
padecimiento (Sánchez, 2014). 
 
IF1 por ejemplo es una proteína que está relacionada con la carcinogénesis, 
además puede influir en la biogénesis de la estructura mitocondrial. La inhibición 
de la H+-ATP sintasa mediada por IF1 promueve la reprogramación metabólica de 
la célula tumoral a una glicólisis activa, por lo cual se esperaría que estuviera 
expresada mayormente en U87MG que ya tiene un metabolismo glicolítico. Sin 
embargo, fue en la línea T98G donde presentó mayor expresión (Sánchez, 2014). 
Por lo que se cree que su expresión está sujeta a eventos específicos durante la 
carcinogénesis, el hecho de que se encuentre en menor cantidad, podría indicar 
una hidrólisis de ATP más activa y la generación de un ambiente favorable en la 
carcinogénesis. Por otro lado, se ha demostrado que las células T98G pueden 
formar supercomplejos (Fernández, 2014), lo que evidencia una mejor regulación 
bioenergética en la que puede estar implicada la IF1 como en la evolución del 
perfil bioenergético el cual consiste en cambios en el metabolismo por activación 
de las diferentes rutas utilizándolas según lo necesite la célula (Campanella et al 
2008). 
 
 
37 
 
Para saber qué mecanismos además de los mitocondriales pueden estar 
influyendo en la progresión tumoral se realizó el análisis del proteoma completo de 
estas células, con el propósito de ponderar la participación mitocondrial. 
Fernández en 2014 demostró que a nivel mitocondrial existen diferencias 
significativas donde los complejos de la cadena OXPHOS disminuyen en U87MG 
en comparación con la línea T98G y reveló que el contenido de supercomplejos es 
mayor en T98G. Los resultados con el proteoma celular mostraron disimilitudes 
entre ambas líneas. 
 
El resultado del análisis estadístico por ACP es una estrategia poco utilizada en el 
análisis de expresión de spots en geles 2D. Generalmente en esta etapa, los 
análisis que se hacen son pruebas de t de Student, este tipo de pruebes es muy 
limitada para análisis de este tipo de datos. El ACP evidenció la formación de 7 
componentes principales, donde el CP1 (Figura 16) logró distinguir y separar a las 
líneas celulares T98G y U87MG, con lo cual se muestra que este grupo de 
proteínas es capaz de definir un estado con respecto al otro. Sin embargo, al 
comparar los valores de varianza explicada del análisis a nivel celular (31%) con 
respecto al análisis y resultados del proteoma el mitocondrial (50%), se encontró 
que disminuía en la célula completa lo cual indica, como se esperaba, que no solo 
los factores mitocondriales influyen en el proceso. Por tal razón, dentro del CP1 se 
ubicaron aquellos spots con proteínas ya identificadas con el propósito de definir 
los procesos que se ven implicados. Aunque no se han identificado proteínas, al 
comparar los resultados con los reportes previos (Ramao et al 2012) se encontró 
que algunos spots coinciden con las proteínas identificadas y podría tratarse de 
ellas (Tabla 3), cabe destacar que esas proteínas no solo están relacionadas al 
cambio metabólico, sino también a otros factores que pueden explicar la diferencia 
en la capacidad tumorigénica. (Anexo 1). 
Por otra parte, las proteínas ubicadas dentro de un componente, CP1 por ejemplo, 
mostraron cambios en la expresión en los dos modelos, lo cual puede reflejar un 
perfil proteico que distinga entre los estados del proceso de carcinogénesis 
 
 
38 
(Figura 17) en el que si establece la importancia de la proteína determinada por el 
peso de factor y la expresión en la siguiente etapa de la carcinogénesis, se forma 
entonces una firma proteica para cada estado. Estas proteínas al ubicarse en 
distintos grupos de expresión y al distinguir entre los diferentes estados 
metabólicos, podrían representar una firma para cada estado (Figura 18). De 
esta forma las proteínas que forman cada factor al representar una firma para 
cada estado únicamente se deben identificar para conocer la ruta que se ve 
implicada. Y en el caso de las proteínas que presenten un peso de factor alto, 
podrían ser postularlas como como posibles blancos terapeúticos. 
 
 
 
 
39 
10 CONCLUSIONES 
 
 El análisis por Western Blot evidenció que el número de mitocondrias es 
constante en ambos etapas de la progresión tumoral, lo cual hace pensar 
que en etapas tempranas y avanzadas las mitocondrias no desaparecen, 
solo re-direccionan su función. 
 
 La sobre-expresión de IF1 en la línea T98G refuerza la teoría de la 
evolución del perfil bioenergético y se considera que la razón por la que se 
encuentra mayormente en T98G es porque ahí todavía se conserva el 
fenotipo oxidativo y podría desactivarse, propiciando el cambio hacía la 
glicólisis. 
 
 El APC es una herramienta útil en el estudio del proteoma,a diferencia de 
las pruebas de t o fold change permite evidenciar todas las interacciones 
del fenómeno, caracterizar y clasificar la importancia de los factores y 
determinar las proteínas más importantes de cada componente de acuerdo 
con el peso de factor. 
 
 Se formaron siete componentes que caracterizan el proteoma de ambas 
líneas, donde el CP1 explica el 31.21% del fenómeno y separa los estados 
oxidativo y glicólitico de ambas líneas celulares. 
 
 El perfil proteico formado por las proteínas del CP 1 formó una firma de 
proteínas que distingue entre las líneas T98G y U87MG. 
 
 Con base en el valor de peso de factor, aquellas proteínas que tengan un 
valor más alto son más importantes, por lo cual, éstas, son ahora 
candidatas a identificar. 
 
 
 
40 
11 PERSPECTIVAS 
 
Se requiere continuar con los datos obtenidos del ACP e identificar las 
proteínas más importantes de cada factor para así conocer que rutas se ven 
implicadas en el proceso de carcinogénesis. 
Ponderar el efecto que puede tener en las células al bloquear de manera 
independiente la función de las proteínas que evidenció el análisis. 
Probar nuevamente porina e IF1 en estado sano e intermedios de la 
carcinogénesis, con el propósito de observar si sus niveles varían según en la 
etapa en que se encuentre 
 
 
 
41 
12 REFERENCIAS 
ABTA (2015). Glioblastoma. Recuperado el 12