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Biología

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN

ANÁLISIS DEL POLIMORFISMO DEL GEN NKG2D EN
CÁNCER DE MAMA Y CÁNCER GÁSTRICO

T E S I S
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO
PRESENTA:
ADRIÁN BLADIMIR LEÓN PAZ

ASESORA: DRA. MARTHA ESTHELA PÉREZ RODRÍGUEZ
COASESORA: M. EN C. ANA LAURA VÁZQUEZ MARTÍNEZ

CUAUTITLÁN IZCALLI, ESTADO DE MÉXICO, 2015

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
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FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN
UNIDAD DE ADMINISTRACIÓN ESCOLAR
DEPARTAMENTO DE EXÁMENES PROFESIONALES
VXIVER'.DAD ~AqOxAIL
AV')O¡:¡OMA DE
M [lUc:,O
M. EN C .. JORGE ALFREDO CUELLAR ORDAZ
DIRECTOR DE LA FES CUAUTlTLAN
PRESENTE
t: :~ ,', ,.;;... .
Con base en el Reglamento General de Exámenes, y la Dirección de la Facultad, nos permitimos a
comunicar a usted. que revisamos el: Trabajo de Tesis
Análisis del polimorfismo del gen NKG2D en cáncer de mama y cáncer gástrico.
Que presenta el pasante: Adrián Bladimir León Paz
Con número de cuenta: 305056946 para obtener el Titulo de: Quimico Farmacéutico Biólogo
Considerando que dicho trabajo reúne los requisitos necesarios para ser discutido en el EXAMEN PROFESIONAL
. correspondiente, otorgamos nuestro VOTO APROBATORIO,
ATENTAMENTE
"POR MI RAZA HABLARA EL EspíRITU"
Cuautitlán Izcal/i, Méx. a 18 de Noviembre de 2014.
PROFESORES QUE INTEGRAN EL JURADO
NOMBRE FIRMA
PRESIDENTE Dra. Sandra Díaz Barriga Arcea
VOCAL Dr. Víctor Manuel Zendej as Buitrón
ter. SUPLENTE
M. en C. Ana Laura Vázguez Martínez ....... \.--"·<.<'.&.1'" )//.>,m;¡ /lr?6.
-M~. ~cn~c~.~M~a~r~ite~r~e~D~o~m=í~ng~U~e~Z~R~O~ja~s~--------~ ~, 1
QFB. María Lucero Paniagua García ~
SECRETARIO
2do. SUPLENTE
NOTA: los sinodales suplentes están obligados a presentarse el día y hora del Examen Profesional (art. 127).
HMl/iac
iii

El presente trabajo se realizó en el laboratorio de Histocompatibilidad de la
Unidad de Investigación Médica en Inmunología CMN-SXXI bajo la dirección
de la Dra. Martha Esthela Pérez Rodríguez.

El siguiente trabajo recibió los siguientes apoyos financieros:
FIS/IMSS/PROT/G09/768
INSTITUTO DE CIENCIA TECNOLOGÍA DEL DISTRITO
FEDERAL (PICSA 12-209)

Mi embrión vieron tus ojos,
Y en tu libro estaban escritas todas aquellas cosas
Que fueron luego formadas,
Sin faltar una de ellas.
Salmos 139:16

ÍNDICE
ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................................. vii
ÍNDICE DE TABLAS ............................................................................................................... viii
ABREVIATURAS ....................................................................................................................... ix
1. RESUMEN ............................................................................................................................... 1
2. MARCO TEÓRICO .................................................................................................................. 2
2.1. CÁNCER DE MAMA ................................................................................................................... 4
2.1.1. RESEÑA HISTÓRICA........................................................................................................................ 4
2.1.2. DEFINICIÓN ........................................................................................................................................ 5
2.1.3. ANATOMÍA DE LA GLÁNDULA MAMARIA............................................................................. 5
2.1.4. TIPOS HISTOLÓGICOS ................................................................................................................... 6
2.1.5. EPIDEMIOLOGÍA .............................................................................................................................. 6
2.1.6. FACTORES DE RIESGO ................................................................................................................... 8
2.1.7. SIGNOS Y SÍNTOMAS ...................................................................................................................... 8
2.1.8. DIAGNÓSTICO.................................................................................................................................... 9
2.1.9. TRATAMIENTO .............................................................................................................................. 10
2.2. CÁNCER GÁSTRICO ................................................................................................................ 11
2.2.1. RESEÑA HISTÓRICA..................................................................................................................... 11
2.2.2. DEFINICIÓN ..................................................................................................................................... 11
2.2.3. ANATOMÍA DEL ESTÓMAGO .................................................................................................... 12
2.2.4. TIPOS DE CÁNCER GÁSTRICO ................................................................................................. 12
2.2.5. EPIDEMIOLOGÍA ........................................................................................................................... 13
2.2.6. FACTORES DE RIESGO ................................................................................................................ 14
2.2.7. CÁNCER GÁSTRICO Y HELICOBACTER PYLORI ................................................................. 14
2.2.8. FACTORES DE VIRULENCIA DE H. PYLORI ......................................................................... 16
2.2.9. SIGNOS Y SÌNTOMAS ................................................................................................................... 17
2.2.10. DIAGNÓSTICO .............................................................................................................................. 18
2.2.11. TRATAMIENTO ........................................................................................................................... 18
2.3. EL RECEPTOR NKG2D ........................................................................................................... 20
2.3.1. FAMILIA DEL RECEPTOR NKG2 ............................................................................................. 20
2.3.2. LOCALIZACIÓN .............................................................................................................................. 21
2.3.3. ESTRUCTURA.................................................................................................................................. 21
2.3.4. VÍA DE SEÑALIZACIÓN ............................................................................................................... 22
2.3.5. LIGANDOS ........................................................................................................................................ 23
2.3.6. NKG2D Y CÁNCER......................................................................................................................... 23
2.3.7. POLIMORFISMO DEL GEN NKG2D ......................................................................................... 24
vi

3. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................... 27
4. OBJETIVO GENERAL ......................................................................................................... 29
5. OBJETIVOS PARTICULARES ............................................................................................ 30
6. HIPÓTESIS ........................................................................................................................... 31
7. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................... 32
8. RESULTADOS ...................................................................................................................... 36
9. DISCUSIÓN .......................................................................................................................... 41
10. CONCLUSIONES ............................................................................................................... 42
11. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................. 43
12. ANEXOS ............................................................................................................................. 48
A. FUNDAMENTO DE LA EXTRACCIÓN DE DNA ........................................................... 48
B. FUNDAMENTO DE LA PCR ............................................................................................... 49
C. EL EQUILIBRIO DE HARDY - WEINBERG .................................................................... 52
D. EL ÍNDICE DE OR ................................................................................................................. 53

vii

ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Tipos de cáncer más comunes en México .................................................... 3
Figura 2. Exploración mamaria: códice badiano ......................................................... 4
Figura 3. Anatomía de la glándula mamaria ................................................................. 5
Figura 4. Porcentaje de avisas perdidos por CM ........................................................... 7
Figura 5. Anatomía del estómago ................................................................................... 12
Figura 6. Adenocarcinoma tubular ................................................................................ 13
Figura 7. Tasa de mortalidad por CG ............................................................................. 14
Figura 8. Helicobacter pilory ............................................................................................ 15
Figura 9. Alelos relacionados a la actividad natural citotóxica ........................... 21
Figura 10. Activación de las células NK vía receptor NKG2D ............................... 23
Figura 11. Curvas de amplificación para los SNP de NKG2D ................................ 36
Figura 12. Curva de amplificación para heterocigoto ............................................. 36
Figura 13. Distribución alélica de las muestras ........................................................ 37

viii

ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Tipos histológicos de Cáncer de Mama ........................................................... 6
Tabla 2. Principales factores de riesgo asociados a CG ........................................... 15
Tabla 3. Polimorfismos del gen NKG2D ........................................................................ 26
Tabla 4. Características de la población de estudio ................................................. 33
Tabla 5. Cebadores y sondas usados en la genotipificación de NKG2D ............ 34
Tabla 6. Equilibrio de Hardy – Weinberg para los SNP de NKG2D ..................... 37
Tabla 7. Frecuencias alélicas y genotípicas de los SNP de NKG2D ..................... 39
Tabla 8. Análisis de la asociación de los haplotipos de NKG2D ........................... 40

ABREVIATURAS
A
ADCA
AVISAs
C
CaCu
CM
CD
cDNA
CG
CMN
CMV-H
DAP 10
DAP 12
DNA
dNTP
EDTA
FISH
FRET

G
GIST
hb
HER-2

HLA – E
IC
IMSS
ITIM
Klrk1

MHC

MIC
MICA
MICB
MRM
NK
NKC
NKG2D
OMS
OR
PCR
PI3K
PHW
rs
RT-PCR
SNP
Adenina
Adenocarcinoma gástrico
Años de vida ajustados por discapacidad
Citocina
Cáncer cervicouterino
Cáncer de Mama
Grupo de diferenciación (del inglés Cluster of differentiation)
DNA complementario
Cáncer Gástrico
Centro Médico Nacional
Citomegalovirus humano
Proteína adaptadora 10
Proteína adaptadora 12
Ácido desoxirribonucleico
Desoxirribonucleótido trifosfato
Ácido etilendiaminotetraacético
Hibridación in situ fluorescente (del inglés Fluorescent in situ hibridization)
Transferencia energética de fluorescencia por resonancia (del inglés
Fluorescence resonance energy transfer)
Guanina
Tumor del estroma gastrointestinal (del inglés Gastrointestinal Stromal Tumor)
Bloque de haplotipos (del inglés haplotype block)
Receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (del inglés Human
epidermal growth factor receptor – 2)
Antígenos Leucocitarios Humanos clase E (del inglés Human L
Intervalo de confianza
Instituto Mexicano del Seguro Social
(del inglés Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibition Motif)
Receptor de las células asesinas similar a lectina perteneciente a la subfamilia K
miembro 1 (del inglés Killer cell lectin-like receptor K 1)
Complejo principal de histocompatibilidad (del inglés Major Histocompatibility
Complex)
Proteínas relacionadas al MHC clase I
Proteínas relacionadas al MHC clase I tipo A
Proteínas relacionadas al MHC clase I tipo B
Mastectomía radical modificada
Células asesinas naturales (del inglés Natural Killer)
Complejo NK (del inglés NK Complex)
Receptor de las células NK grupo 2 miembro D
Organización Mundial de la Salud
Relación de Odds (del inglés Odds ratio)
Reacción en cadena de la polimerasa
Fosfoinositol-3-cinasa (del inglés Phosphoinositol-3-kinasa)
Principio de Hardy – Weinberg
Identificación numérica del SNP (del inglés Reference SNP ID)
Reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscriptasa
Polimorfismo de un solo nucleótido (del inglés Single Nucleotide Polimorfism)
x

T
Taq
UIM
ULBP
UMAE
VPH
X2
Timina
Termophilus aquaticus
Unidad de Investigación Médica
Proteína unida a UL-16 (del inglés UL binding protein)
Unidad de Medicina de Alta Especialidad
Virus del Papiloma Humano
Prueba de Chi cuadrada

1. RESUMEN
NKG2D es un receptor inmunológico que se encuentra en las células NK y otros
linfocitos encargados de la respuesta inmunitaria innata y adaptativa. Este
receptor reconoce ligandos expresados en células cancerígenas y desempeña una
función muy importante en su eliminación a través del proceso de
inmunovigilancia. La baja actividad citotóxica de las células NK ha sido asociada
con el desarrollo de cáncer y puede ser evaluada a través del polimorfismo del gen
NKG2D.
Este trabajo pretende elucidar el impacto de dicho polimorfismo sobre el riesgo
de padecer cáncer de mama y/o cáncer gástrico en la población mexicana
estableciendo las frecuencias alélicas de los SNP rs2255336, rs1049174 y
rs2617160 en personas sanas y pacientes con cáncer del Instituto Mexicano del
Seguro Social para determinar sí existen diferencias significativas entre ambos
grupos mediante su genotipificación por PCR en tiempo real.
El análisis estadístico consistió en laprueba de Χ2 con un grado de libertad a un
valor de p≤0.05 para determinar sí existen diferencias significativas entre las
frecuencias alélicas y haplotípicas de ambos grupos de estudio. Se realizó el
cálculo de OR (Odds Ratio) para determinar la asociación con cáncer de mama
y/o cáncer gástrico. El programa utilizado para la determinación de los
haplotipos de NKG2D fue Haploview (4.2).
Con base en este estudio el alelo C del SNP de NKG2D rs1049174 y el haplotipo
CGT representan un factor de protección contra cáncer gástrico en la población
mexicana. Por el contrario, el haplotipo GGT se considera un factor de riesgo para
el desarrollo de cáncer gástrico y cáncer de mama.

2. MARCO TEÓRICO
En nuestro país el cáncer es la tercera causa de muerte, únicamente después de
las enfermedades del corazón y la diabetes mellitus. Si bien muchos casos son
tratables, el 60% no se detecta en etapas tempranas (INSP, 2008). Por tal motivo,
es importante realizarse controles médicos, especialmente cuando hay
antecedentes familiares de la enfermedad.
El cáncer es clasificado de acuerdo al órgano en el cuál se presenta por lo que
existen diversos tipos de cáncer, en nuestro país los más comunes son los que se
describen a continuación:
 Cáncer de próstata. Es el de mayor prevalencia en México, el mecanismo
más sencillo para detectarlo es a través de controles a partir de los 40 años.
Cuando está avanzado se refleja por medio de problemas para orinar e
inflamación de la próstata (Cárdenas, J. S. 2008).
 Cáncer de mama. Es el segundo más común en el país y el primero en la
población femenina. En el 70% de los casos se presentan en personas de
entre 30 y 54 años y la tasa de mortalidad mayor se observa en mayores de
60 años (Martínez, M.O. 2009). Para atacarlo a tiempo es necesario
realizarse controles frecuentes para observar la aparición de nódulos en la
mama o en el ganglio de la axila. En casos avanzados, se puede advertir
secreción anormal a través del pezón y cambio en el color o en la textura
de la piel de las mamas y retracción del pezón (Pérez-Sánchez, V.M. 2008).
 Cáncer cérvicouterino. El tercer tipo de cáncer con más prevalencia en
México está asociado a la presencia del Virus del Papiloma Humano
(VPH), por lo que es fundamental realizarse pruebas de Papanicolaou y
colposcopia anualmente así como la utilización de preservativo, ya que el
VPH es transmitido por contacto sexual (Lazcano, P.E. 2007).
 Cáncer de pulmón. Es el cuarto más frecuente en México y el segundo con
mayor tasa de mortalidad en hombres. En etapas tempranas puede
producir fiebre, pérdida de peso y fatiga. Otros de los síntomas son: tos
persistente, sangre al expectorar y, en ocasiones, dolor en el pecho
(Gennari, R. 2007).
3

 Cáncer de estómago. El 6.2 % de los enfermos de cáncer mexicanos
presentan tumores en el estómago (Serrano, A. 2009). Es uno de los más
difíciles de detectar debido a que los síntomas (ardor en el estómago que
provoca dolor intenso, dolor en la boca del estómago y sangrado intestinal)
generalmente se asocian a otros padecimientos gástricos de menor
relevancia, como la gastritis no atrófica (Correa, P. 2006). La siguiente
figura ilustra los tipos de cáncer más comunes de acuerdo al género:

Figura 1. Tipos de cáncer más comunes en México. Fuente: Fuentes-Pacheco,
M.I. (2013) Cáncer en las Américas: Perfiles de país 2013. Organización
Panamericana de la Salud. México.

http://andador.mx/wp-content/uploads/2014/02/tipos-cancer-infografia.jpg
4

2.1 CÁNCER DE MAMA
2.1.1 RESEÑA HISTÓRICA

Figura 2. Exploración mamaria: Códice Badiano. Fuente: Loustalot, L.
Compendio de anatomía patológica de la glándula mamaria. (2002)
Secretaría de Salud. México. p. i
Hace unos cinco mil años, en la necrópolis situada cerca de Gizeh en Egipto
fueron encontrados restos humanos con tumores óseos. Tanto la medicina
egipcia, como el Papiro de Ebers (1500 a.C.) y el Papiro de Edwin Smith hacen
alusión a cierto tipo de tumores (Peterson, B. 1982).
La palabra cáncer fue asumida por Hipócrates (460 – 370 a.C.) y proviene del
griego karkinos que significa “cangrejo”, término que deriva de las
protuberancias que, en similitud al crustáceo, sobresalen a cada lado del cuerpo
en el cáncer de mama (Jones, W.H. 1923).
El códice Badiano también hace alusión al cáncer de mama, prueba de ello es un
pictograma de la exploración mamaria que se puede observar en la figura 2, lo
que parece indicar que dicha práctica diagnóstica era utilizada por las sociedades
antiguas (Loustalot, L. 2002).
Fue durante la época del renacimiento entre los siglos XV y XVI, cuando artistas,
pintores y escultores científicos, como Miguel Ángel y Leonardo da Vinci,
mostraron en sus pinturas y esculturas parte de la anatomía humana y sus
trabajos culminaron con el magnífico tratado “De humani corpuris fabrica” de
1543 (Baum, M. 1993).
5

2.1.2 DEFINICIÓN
El cáncer de mama o adenocarcinoma mamario es el crecimiento anormal de las
células del epitelio de los conductos o lobulillos mamarios y que tienen la
capacidad de diseminarse. Es una enfermedad maligna en donde la proliferación
acelerada, desordenada y no controlada de células pertenecientes a distintos
tejidos de la glándula mamaria forman un tumor que invade los tejidos vecinos y
puede migrar a órganos distantes del cuerpo en el trastorno denominado
metástasis (Martínez, T. 2007).
2.1.3 ANATOMÍA DE LA GLÁNDULA MAMARIA
La mama consta de entre seis y diez sistemas principales de conductos, cada uno
de los cuales está dividido en lobulillos; las unidades funcionales del parénquima
mamario (Ver Figura 3). La areola, el pezón y las desembocaduras de los
conductos galactóforos principales están revestidos de epitelio escamoso
estratificado (Cotran, R.S. 2000). El revestimiento de los conductos mamarios
principales se convierte en un epitelio columnar pseudoestratificado y después en
un epitelio cuboidal de dos capas (Quiroz, G.F. 2003).

Figura 3. Anatomía de la glándula mamaria. Fuente: Loustalot, L.
Compendio de anatomía patológica de la glándula mamaria. (2002)
Secretaría de Salud. México. p. 36.

2.1.4 TIPOS HISTOLÓGICOS
El adenocarcinoma mamario se clasifica de acuerdo al tipo de tejido que presenta
la transformación siendo los más importantes el carcinoma ductal y lobulillar
(Martínez, T. 2007). Como se observa en la tabla 1, un alto porcentaje de casos de
cáncer de mama tienen la capacidad de diseminarse a otros tejidos, de ahí la
importancia de una detección temprana en el primer nivel de atención médica.
Tabla 1. Tipos histológicos de cáncer de mama y sus
porcentajes de distribución relativa.
Carcinoma in situ
Subtipos histológicos
Carcinoma ductal in situ
Carcinoma lobulillar in situ
Carcinoma invasor
Subtipos histológicos
Carcinoma ductal infiltrante
Carcinoma lobulillar infiltrante
Carcinoma tubular / cribiforme infiltrante
Carcinoma coloide (mucinoso) infiltrante
Carcinoma medular infiltrante
Carcinoma papilar infiltrante
15-30%

80%
20%
70-85%

79%
10%
6%
2%
2%
1%
Fuente: Cotran R.S. Pathologic Basis of Disease.1999. 6th Ed; p.1107.
2.1.5 EPIDEMIOLOGÍA
En México, el cáncer de mama ocupa en la actualidad el primer lugar en
incidencia de las neoplasias malignas en las mujeres, representa 11.34% de todos
los casos de cáncer. Hay un incremento global de aproximadamente 1.5% anual,
sin embargo en los países de economía emergente este aumento es de
aproximadamente 5% (Lozano R. et al 2008). El grupo de edad más afectado se
encuentra entre los 40 y los 59 años de edad. El cáncer de mama en el año 2008,
reporta una incidencia de 13 939 casos y una mortalidad de 5 217 (Ferlay, J.
2008).
7

El cáncer de mama representa una pesada carga de muertes prematuras ya que
el 60 % de las mujeres quemueren tienen entre 30 y 59 años de edad. También
existe cierta evidencia de que la edad promedio de inicio de la enfermedad es
menor en los países en vías de desarrollo que en los desarrollados (Rodríguez-
Cuevas, 2000).
Análisis recientes de las tendencias de mortalidad y morbilidad ilustran la carga
de la enfermedad en los de economía emergente (Brown, M.L. 2009). Como
proporción de todos los años de vida ajustados por discapacidad (AVISAs)
perdidos por cáncer, el cáncer de mama supera al cáncer cérvicouterino y
prostático en las regiones en vías de desarrollo del mundo, con excepción de Asia
subcontinental y África subsahariana (Figura 4).
Figura 4. Porcentaje de AVISAs perdidos por cáncer de mama, cérvicouterino
y de próstata como proporción de todos los canceres por región.
Fuente: Brown ML, Goldie SJ. Chapter 29. Health service interventions for
cancer control in developing countries. Disease Control Priorities in Developing
Countries. 2a. ed. Jamison DT, Bremen JG, Meashan. 2009.

2.1.6 FACTORES DE RIESGO
Como ocurre en otros tipos de cáncer, en el cáncer de mama existen factores que
pueden estar solos o en conjunto y favorecer el desarrollo de esta neoplasia.
Pueden estar presentes durante periodos largos y algunos de estos factores tienen
riesgos relativos menores. La presencia de dos o más aumentan la posibilidad de
desarrollar esta enfermedad (Cárdenas, J.S. 2008). Los más importantes son:
● Edad avanzada.
● Menstruación a temprana edad (antes de los 12 años).
● Edad avanzada al momento del primer parto (34 años) o nuliparidad.
● Antecedentes de enfermedad benigna de mama (hiperplasia ductal atípica).
● Madre o hermana(s) con cáncer de mama.
● Tratamiento con radioterapia dirigida a la mama/pecho 10 a 15 años
previos al diagnóstico de cáncer de mama.
● Densidad mamaria aumentada en una mastografía.
● Terapia de reemplazo hormonal.
● Consumir bebidas alcohólicas.
● Ser de raza blanca.
● Alteraciones genéticas.
2.1.7 SIGNOS Y SÍNTOMAS
El cáncer de mama en etapas iniciales se presenta de manera subclínica en la
mayoría de los casos, es decir que solamente es detectable por estudios de imagen
(mastografía, ultrasonido y resonancia magnética), y en menor proporción por
tumores palpables (McDonald, S. 2004). El cáncer de mama se presenta como un
tumor en la glándula mamaria, región axilar o supraclavicular y presenta una
serie de síntomas como son:
■ Retracción de la piel o del pezón.
9

■ Asimetría de las glándulas mamarias.
■ Exudado a través del pezón.
■ Erosión del pezón.
■ Enrojecimiento e induración generalizada de la glándula mamaria
(Loustalot L. 2002).
2.1.8 DIAGNÓSTICO
Además de los signos clínicos, otros datos de sospecha son la mamografía
sugestiva de malignidad, antecedentes familiares de cáncer de mama o
antecedentes personales de hiperplasia atípica (IMSS, 2012).
El fundamento del diagnóstico de cáncer de mama es la confirmación histológica
del mismo, para esto se prefiere la realización de biopsias de mínima invasión con
la obtención de material tisular que permite determinar factores pronósticos y
predictivos de suma importancia en el manejo integral de las pacientes, por
ejemplo la determinación de receptores hormonales y de Her2/neu (Agarwai, T.
2003).
La evaluación patológica del cáncer de mama debe incluir de manera
indispensable tipo histológico, grado, permeación vascular y linfática, tamaño del
tumor, márgenes, numero de ganglios y tamaño de la metástasis ganglionar,
estudios de inmunohistoquímica que evalúen la presencia o no de receptores
hormonales para estrógenos y progesterona, Ki67 (>14%), la sobre expresión del
gen Her2/neu, además de estudios complementarios como citoqueratinas y
factores de crecimiento epidérmico, etc. (Pérez-Sánchez, 2008).
El término HER-2/neu proviene del inglés Human Epidermal Growth Factor
Receptor-2. Se trata de un oncogén que codifica para un receptor de factores de
crecimiento y se encuentra sobre expresado en células epiteliales malignas
(Chantal, T. 2005).
Los tumores que presentan la sobre expresión son más agresivos, tienen un
crecimiento más rápido, una mayor probabilidad de recurrencia pos tratamiento
y pueden responder de manera diferente a las terapias habituales por lo que
generalmente los pacientes tienen un pronóstico negativo (Joensu, H. 2006). La
10

clasificación molecular del cáncer de mama ha recibido mayor importancia por la
repercusión pronostica y predictiva esto debe ser evaluado mediante estudios de
microarreglos y RT-PCR (Sorlie, T. 2001).
2.1.9 TRATAMIENTO
El tratamiento es multimodal (cirugía, quimioterapia, hormonoterapia, terapia
biológica y radioterapia), el uso de cada una depende de la etapa clínica en la que
se encuentre la paciente. La cirugía es la principal modalidad de tratamiento local
del cáncer mamario, existen diversos procedimientos quirúrgicos,
considerándose la mastectomía radical modificada (MRM) el tratamiento
estándar (Goldhrisch, A. 2009)
Sin embargo, si el cáncer de mama se detecta en una etapa clínica temprana, se
puede ofrecer un tratamiento conservador en el que la paciente puede incluso
conservar su seno sin llevar a cabo el tratamiento oncológico radical (De Vita, T.V.
2008).
Dependiendo del tamaño tumoral, el número de ganglios linfáticos con
metástasis y de otros factores clínicos y patológicos se ofrecerá tratamiento con
radioterapia, hormonoterapia y/o quimioterapia coadyuvante. Estos
tratamientos prolongan la supervivencia, el período libre de enfermedad y
disminuyen el riesgo de recurrencia local y a distancia (Goldhrisch, A. 2009).
Recientemente la terapia biológica ha demostrado efectos benéficos en el
tratamiento del cáncer de mama, específicamente el trastuzumab incrementa la
supervivencia cuando se administra como tratamiento coadyuvante a mujeres
cuyos tumores expresan la oncoproteína Her-2 (Joensu H., 2006).

2.2 CÁNCER GÁSTRICO
2.2.1 RESEÑA HISTÓRICA
La primera autopsia por esta enfermedad la hizo Antonio Benivieni en Italia,
quien vivió entre los años 1443 y 1502. El primer análisis estadístico de incidencia
y mortalidad del cáncer gástrico se llevó a cabo en Verona, Italia desde 1760 –
1839 y demostró que era el más frecuente y letal de aquella época (Santoro E,
2005).
En 1828 Johanes Peter Mueller fue el primero en plantear una causa celular del
cáncer mientras Joseph Claude Recamier propuso que la invasión y la
diseminación a distancia eran resultado de traslocación de células y acuñó el
término metástasis (Recamier, 1829). El 29 de enero de 1881, la cirugía del cáncer
gástrico vivió uno de sus hitos con la realización por parte el profesor Theodor
Billroth de la primera extirpación de un tumor de píloro (Azagra, 1994).
En 1994, Helicobacter pylori fue reconocido por la Agencia Internacional para la
Investigación en Cáncer y la Organización Mundial para la Salud (OMS) como un
carcinógeno categoría I, por lo que fue recomendado que todos los pacientes con
úlceras en quienes se detectara el microorganismo deberían recibir terapia de
erradicación (Ahmed, N. 2005).
2.2.2 DEFINICIÓN
El cáncer gástrico o cáncer de estómago es un tipo de crecimiento tisular maligno
producido por la proliferación contigua de células anormales con capacidad de
invasión y destrucción de otros tejidos y órganos, en particular el esófago y el
intestino delgado. En las formas metastásicas, las células tumorales pueden
infiltrar los vasos linfáticos de los tejidos, diseminarse a los ganglios y penetrar
en la circulación sanguínea para establecerse en cualquier otro órgano del cuerpo
(Onate, O. 2001).

2.2.3 ANATOMÍA DEL ESTÓMAGO
Desde el punto de vista topográfico, el estómago tiene cinco regiones: 1) cardias
y unión gastroesofágica; 2) fundus; 3) cuerpo; 4) antro, y 5) píloro (Figura5). El
fundus y el cuerpo albergan glándulas secretoras de ácido, mientras que el antro
aloja epitelio superficial secretor de sustancias alcalinas, y células G endocrinas
las cuales son secretoras de gastrina.

Figura 5. Anatomía del estómago. Fuente: American Cancer Society, 2013.
2.2.4 TIPOS DE CÁNCER GÁSTRICO
El cáncer gástrico se clasifica clínicamente como temprano o avanzado con el
objetivo de determinar la intervención médica apropiada, además se clasifica
histológicamente basándose en la composición morfológica predominante del
tejido (Hu, B. 2012). El carcinoma gástrico temprano se define como un
carcinoma invasivo propio de la mucosa y/o submucosa gástrica con o sin
metástasis, independientemente del tamaño del tumor (Hamilton, R. 2000).
Histológicamente, la mayoría de formas de carcinoma gástrico temprano se
encuentran bien diferenciadas, principalmente con forma tubular (Figura 6).
El pronóstico de carcinoma gástrico temprano es excelente, con un rango de
sobrevivencia de 5 años en un 90 % de los pacientes. En contraste, el carcinoma
gástrico avanzado el cual invade las capas más internas del tejido tiene un
pronóstico mucho peor con una sobrevivencia de 5 años en un 60 % de los
afectados por este tipo de cáncer. Histológicamente, el cáncer gástrico avanzado
13

presenta a menudo una marcada heterogeneidad en cuanto a arquitectura y
citología con varios patrones de crecimiento en coexistencia (Everett, S.M. 1997).

Figura 6. Adenocarcinoma tubular. Morfología irregular y glándulas
neoplásicas fusionadas con moco intraluminal y desechos.
Fuente: Hu B, et al Gastric cancer: Classification, histology and application
of molecular pathology. J Gastrointest Oncol 2012; 3(3):251-261.
La clasificación OMS 2010 reconoce cuatro principales patrones de crecimiento
histológico en el cáncer gástrico: tubular, papilar, mucinoso y pobremente
cohesivo, además de variantes histológicas poco comunes (Lauwers, G.Y. 2010).
2.2.5 EPIDEMIOLOGÍA
El cáncer gástrico es la segunda tumoración más frecuente en el mundo, con 900
mil casos nuevos notificados cada año (Ferlay, J. 2008). En México, en las últimas
décadas se ha informado un incremento de 4.43 a 9 casos por cada 100 mil
habitantes. Datos del INEGI del año 2008 revelaron que el cáncer gástrico
representó la cuarta causa de muerte entre varones con 10.4% y la quinta entre
mujeres con 8.4% (Figura 7).

Figura 7. Tasa de mortalidad por CG según grupos de edad y sexo.
Fuente: Instituto Nacional de Geografía y Estadística 2008.

2.2.6 FACTORES DE RIESGO
Un factor de riesgo es cualquier característica que afecte la probabilidad de tener
una enfermedad como el cáncer. Algunos factores de riesgo, como el hábito de
fumar o el tipo de dieta pueden cambiarse; otros como la edad de la persona o sus
antecedentes familiares, no se pueden cambiar (Cárdenas, J.S. 2008). Los
factores de riesgo más importantes para el caso del cáncer gástrico se muestran
en el siguiente cuadro 2.
2.2.7 CÁNCER GÁSTRICO y Helicobacter pylori
Helicobacter pylori es un bacilo Gram-negativo, microaerofílico, con forma
espiral que mide 2.5 - 4.0 μm de largo por 0.5 – 1.0 μm de ancho, tiene una pared
celular lisa, cubierta por un glucocalix de 40 nm (Figura 8). Aunque la prevalencia
de la infección por Helicobacter pylori es elevada, se reporta que entre el 10% y
el 20% de los casos desarrollan síntomas de la infección mientras que el 17% de
los infectados desarrolla ulcera gástrica, el 4% cursan con complicaciones de la
úlcera y solo 1% desarrolla cáncer gástrico (Cervantes – García, E. 2006).

Tabla 2. Principales factores de riesgo asociados a CG
Incidencia según el
sexo
El cáncer de estómago es más frecuente entre los hombres que
entre las mujeres.
Edad

Las tasas del cáncer de estómago en las personas de más de
50 años aumentan bruscamente. La mayoría de las personas
diagnosticadas con cáncer de estómago se encuentran entre
los 60 y 89 años de edad.
Origen étnico

El cáncer de estómago es más común entre las personas de
origen hispano, las personas de raza negra y los
asiáticos/isleños del Pacífico en comparación con las personas
de raza blanca que no son de origen hispano.
Geografía

A escala mundial, el cáncer de estómago es más común en
Japón, China, Europa oriental y del sur y América Central y del
sur. Esta enfermedad es menos común en África occidental y
del sur, Asia Central y del sur, y Norteamérica.
Infección con
Helicobacter pylori

Las infecciones con la bacteria H. pylori parece ser la causa
principal de cáncer de estómago, especialmente cánceres en
la parte inferior (distal) del estómago.
Alimentación

Un riesgo aumentado de cáncer de estómago se ha visto en
personas que llevan una alimentación que contiene grandes
cantidades de alimentos ahumados, pescado y carne salada y
vegetales conservados en vinagre. Los nitritos y nitratos son
sustancias que se encuentran comúnmente en las carnes
curadas. Ciertas bacterias, como la H. pylori, pueden convertir
a los nitritos y nitratos en compuestos que han demostrado que
causan cáncer de estómago en animales. Por otra parte,
consumir muchas frutas, verduras y vegetales frescos parece
reducir el riesgo de cáncer de estómago.
Consumo de tabaco

El hábito de fumar aumenta el riesgo de cáncer de estómago,
particularmente para los cánceres de la sección superior del
estómago cercana al esófago. La tasa de cáncer de estómago
es alrededor del doble para los fumadores.
Sobrepeso u obesidad

El sobrepeso o la obesidad es una posible causa de cánceres
del cardias, aunque todavía no está claro cuán contundente
es esta asociación.
Fuente: Onate-Ocaña L.F. Gastric cancer in Mexico. Gastric cáncer, 2001.

Figura 8. Helicobacter pylori. Fuente: Serrano A. (2009) Helicobacter pylori
y cáncer gástrico. Cancerología 4: 193-204.
16

La prevalencia de la infección ha sido relacionada con las distintas entidades
patológicas gastrointestinales. Actualmente, tres fenotipos de enfermedad
gastrointestinal relacionada a Helicobacter pylori han sido descritos: gastritis
leve, úlcera duodenal y cáncer gástrico, en este último se observa inflamación de
la mucosa gástrica, atrofia de la membrana y disminución de la secreción de ácido
clorhídrico (Serrano, A. 2009).
Durante el proceso carcinogénico se han detectado cambios histológicos
ordenados en una secuencia establecida que se originan en la inflamación,
formación de gastritis no atrófica y luego atrófica, metaplasia intestinal, displasia
y, finalmente, la presencia del adenocarcinoma gástrico (ADCA); a esta serie de
cambios histológicos se le conoce como secuencia de Correa (Correa, P. 2006).
2.2.8 FACTORES DE VIRULENCIA DE H. pylori
Los factores de virulencia que le permiten al bacilo colonizar y dañar las células
epiteliales gástricas incluyen la producción de ureasa, la cual hidroliza la urea y
conlleva a la formación de amoniaco y dióxido de carbono que favorece la
alcalinización del pH gástrico (Sgouros, S. 2006). Otros factores que favorecen la
colonización incluyen las adhesinas, proteínas de choque térmico, proteínas de
absorción de metales y la generación de hipoclorhidria.
De igual importancia son los mecanismos que le permiten al Helicobacter pylori
evadir la respuesta inmune del hospedero. Entre estos mecanismos se encuentra
la participación de la fosfolipasa A2 y C que degradan los elementos lipídicos de
la mucosa con lo que reduce su protección; además, la catalasa y superóxido
dismutasa protegen al bacilo de los efectos de metabolitos tóxicos (Cervantes G.,
2006).
No obstante, los factores de virulencia más importantes y mejor estudiados son
la proteína citotóxica de membrana externa (CagA), codificada por el gen cagA y,
la proteína de la citotoxina vacuolizante (VacA), codificada por el gen vacA.
Aquellascepas Cag-positivas producen mayor inflamación gástrica y mayor
riesgo de cáncer (Onate, O. 2001).
La influencia de los polimorfismos es una de las áreas mejor estudiadas en el
cáncer gástrico. La participación de modificaciones en el funcionamiento de
17

diversos genes, asociados o no con Helicobacter pylori, ha sido sujeto de estudio
intenso (Ahmed, N. 2005). Múltiples genes y polimorfismos se han analizado; sin
embargo, la mayoría pueden ser integrados en categorías de acuerdo con sus
funciones naturales, ya sea como protectores contra el daño de la mucosa,
participantes en la respuesta inflamatoria, eliminación de carcinógenos, síntesis
y reparación del DNA, regulación en la expresión de genes, adhesión celular o
control del ciclo celular (Hu, B. 2012).
2.2.9 SIGNOS Y SÍNTOMAS
Lamentablemente, el cáncer de estómago en etapa inicial pocas veces causa
síntomas, razón por la cual el cáncer de estómago es tan difícil de detectar
tempranamente (Serrano A. 2009). Los signos y síntomas del cáncer de estómago
pueden incluir:
· Falta de apetito.
· Pérdida de peso.
· Dolor abdominal.
· Malestar impreciso en el abdomen.
· Sensación de llenura en el abdomen superior después de comer una comida
pequeña.
· Acidez o indigestión.
· Náuseas.
· Vómitos, con o sin sangre.
· Acumulación de líquido en el abdomen.

2.2.10 DIAGNÓSTICO
Una endoscopia superior es el estudio principal que se utiliza para detectar cáncer
de estómago. Si se observan áreas anormales, se pueden tomar biopsias usando
instrumentos que se pasan a través del endoscopio. Las muestras de tejido se
envían a un laboratorio de patología para determinar si hay cáncer presente
(Azagra, 1994).
Cuando se observa a través de un endoscopio, el cáncer de estómago puede tener
el aspecto de una úlcera, de un pólipo (forma parecida a un hongo) o masa
protuberante o de áreas de mucosa engrosadas, difusas y planas conocidas como
linitis plástica (Correa, P. 2006).
Si una muestra de biopsia contiene células de adenocarcinoma, puede que se
hagan pruebas para determinar si contiene una cantidad muy elevada de una
proteína promotora del crecimiento llamada HER2 (Johnsonn, S. 2010).
Los estudios por imágenes utilizan ondas sonoras, rayos X, campos magnéticos o
sustancias radiactivas para obtener imágenes del interior del cuerpo. Los estudios
por imágenes se pueden realizar por un número de razones, incluyendo:
· Para ayudar a determinar si un área sospechosa pudiera ser cancerosa.
· Saber cuán lejos se propagó el cáncer.
· Ayudar a determinar si el tratamiento ha sido eficaz (De Vita, 2004).
2.2.11 TRATAMIENTO
Los tratamientos principales para el cáncer de estómago son:
 Cirugía. Dependiendo del tipo y la etapa del cáncer de estómago, se podría
realizar la cirugía para remover el cáncer y parte o todo el estómago, así
como algunos ganglios linfáticos cercanos. Por lo general, el tipo de
operación depende de la parte del estómago donde se encuentre el cáncer
y el tamaño del tumor.

 Quimioterapia. Se pueden utilizar diversos medicamentos antineoplásicos
para tratar el cáncer de estómago, incluyendo 5-FU (fluorouracilo),
capecitabina (Xeloda®), carboplatino, cisplatino, entre otros (Johnsonn,
S. 2010).

 Terapia dirigida. El trastuzumab (Herceptin) es un anticuerpo
monoclonal, una versión artificial de una proteína muy específica del
sistema inmune, que ataca a la proteína HER2 (Chantal, T. 2005).
Administrar trastuzumab con quimioterapia puede ayudar a algunos
pacientes con cáncer de estómago avanzado, positivo a HER2, a vivir por
más tiempo en comparación con la quimioterapia por sí sola (Hamilton,
R. 2000).
 Radioterapia. La radioterapia usa rayos o partículas de alta energía para
destruir las células cancerosas en un área específica del cuerpo. La
radiación se puede emplear antes de la cirugía para tratar de reducir el
tamaño del tumor y así facilitar la cirugía. Después de la cirugía, se puede
usar para destruir los remanentes muy pequeños de cáncer que no pueden
ser vistos o extirpados durante la cirugía (Brown, M. L. 2009).

2.3 EL RECEPTOR NKG2D

2.3.1 FAMILIA DEL RECEPTOR NKG2
La familia del receptor NKG2 está formada por cinco genes (A, B, C, D, E y F)
ubicados en el brazo corto del cromosoma 12 en la región 13.1 dentro del complejo
de genes de Natural Killer. Los receptores NKG2 se expresan en la célula NK en
forma de heterodímero unidos a CD94, el cual es codificado dentro del mismo
cromosoma, aunque la excepción es el gen D que se expresa en forma
homodímera.
El receptor NKG2A es inhibidor de las células NK y presenta en la región
citoplasmática residuos ITIM (del inglés Immunoreceptor Tyrosine-based
Inhibition Motif); en cambio, el receptor NKG2C tiene una función activadora al
asociarse con la molécula adaptadora DAP-12. NKG2A y NKG2C se unen a la
molécula HLA-E, molécula de clase I no clásica reconocida por células NK,
linfocitos T citotóxicos y más recientemente por un subgrupo de linfocitos T
CD8+ con fenotipo de memoria, llamados CTLs-NK (Eagle, R.A., 2007).
Aunque no es claro como la familia de receptores CD94-NKG2 interactúa con
HLA-E, la asociación entre CD94 y NKG2 es crítica para la actividad biológica de
esta familia. Los miembros de la familia CD94-NKG2 difieren en su afinidad por
HLA-E, siendo esta más fuerte con el receptor NKG2A que con NKG2C; las bases
estructurales para esta observación son aún desconocidas (Li, P., 2007).
La función activadora del homodímero NKG2D se inicia al unirse a la molécula
MIC, en tanto que la función de NKG2E y F se desconoce. Recientemente se ha
identificado un haplotipo en la región del complejo NK (Figura 9), el cual se
relaciona con la actividad citotóxica.

Figura 9. Alelos relacionados a la actividad natural citotóxica en el bloque 1
de haplotipos de NKG2D. Fuente: Hiroki, F. (2008) Carcinogenesis 29 (2):316.
2.3.2 LOCALIZACIÓN
NKG2D es un potente receptor activador expresado en todas las células NK
(Bauer, S. et. Al. 1999). Se expresa también en la mayoría de células NKT y
subpoblaciones de linfocitos Tγδ (Raulet, D.H. 2003). Todos los linfocitos T
CD8+ expresan el receptor NKG2D, mientras que la expresión en linfocitos T
CD4+ se ha reportado sobre todo en condiciones patológicas (Allez, M. et. Al.
2007).
En ese sentido, el receptor NKG2D es expresado en células efectoras tanto de la
inmunidad innata como en la respuesta inmune adaptativa y está implicado en la
inmunovigilancia de infecciones virales y procesos neoplásicos así como en
algunas enfermedades autoinmunes y reacciones post trasplante. El gen Nkg2d
(Klrk1) se localiza en el complejo NK (NKC) situado en el cromosoma 6 en el ratón
y en el cromosoma 12 en el humano (Glienke, J. et. Al. 1998).
2.3.3 ESTRUCTURA
NKG2D es un receptor tipo C similar a lectina y pertenece al grupo 2 de los
receptores NK como miembro D. Ha sido también clasificado como receptor
asesino similar a lectina de la subfamilia K miembro 1 mejor conocido como
KLRK1 por sus siglas en inglés (Nausch, N. 2008 y Cerwenka, A. 2000). NKG2D
es atípico en comparación con otros receptores NK ya que, aunque pertenece a la
familia NKG2, no comparte la mayoría de sus propiedades como son su expresión
heterodímera, su estructura o su asociación con la molécula CD94.
22

NKG2D es un homodímero que reconoce cierto número de ligandos inducidos
por estrés celular relacionados a las moléculas MHC clase I. NKG2D participa
como un sensor molecular que detecta ligandos auto inducidos en células con
infecciones virales, daño al DNA o transformación tumoral. (Champsaur, M. 2010
y Lanier, L. 2010).
El receptor NKG2D consiste en dos proteínas transmembranales tipo II unidas
por puentes disulfuro con residuos de amino ácidos cargados positivamenteen
sus dominios transmembranales y colas intracelulares muy cortas que no poseen
propiedades de señalización (Houchins, J.P. et. Al. 1991). La transducción de la
señal opera a través de dos proteínas adaptadoras, DAP 10 y DAP 12, las cuales se
asocian con el receptor como homodímeros (Diefenbach, A. 2002).
2.3.4 VIA DE SEÑALIZACIÓN
El complejo de señalización de NKG2D se observa como una estructura
hexamérica debido a que cada homodímero de NKG2D se une a dos
homodímeros de proteínas adaptadoras que en el humano es DAP 10 (Garrity, D.
2005). DAP10 tiene un motivo YxxM en su cola citoplasmática el cual, por
fosforilación, estimula la subunidad p85 de la fosfoinositol-3-cinasa (PI3K) y
Grb2–Vav1 (Figura 10). Esta señalización estimula la supervivencia y
citotoxicidad de células NK y favorece la coestimulación de linfocitos T activados
(Wu, J., 2000).

Figura 10. Activación de las células NK vía receptor NKG2D.
Fuente: Biljana, Z. et al. Regulation of immune cell function and differentiation
by the NKG2D receptor Cell. Mol. Life Sci. (2011) 68:3519–3529
2.3.5 LIGANDOS
En humanos, NKG2D se acopla a las proteínas relacionadas al MHC clase I MICA
y MICB (Bauer, S. 1999). NKG2D también reconoce glicoproteínas de superficie
que se unen al citomegalovirus humano (HCMV) proteínas UL-16 (ULBP)
(Bacon, L. 2004). Los ligandos de NKG2D son principalmente inducidos por
estrés celular, aunque algunos de ellos están expresados en niveles bajos en
ciertos tejidos (Whang, M.I. 2009).
2.3.6 NKG2D Y CÁNCER
El papel potencial de NKG2D en respuestas citotóxicas anti tumores fue
rápidamente reconocido y discutido como un resurgimiento del modelo de
inmunovigilancia contra tumores (Lanier, L. 2001). Los primeros experimentos
mostraron que la sobreexpresión de los ligandos de NKG2D en células
cancerígenas provocó el rechazo del tumor después del trasplante en ratones
(Diefenbach, A. 2001).
En humanos, fue encontrado que la expresión de los ligandos de NKG2D tiene
una alta correlación con la tasa de infiltración de linfocitos T en tumores sólidos
(Groh, V. 1999). Paradójicamente, algunos tumores habían mostrado una sobre
proliferación
citotoxicidad
supervivencia
celular
producción
de citocinas
24

expresión de los ligandos de NKG2D, convirtiéndose en blanco de células NK y
linfocitos T citotóxicos. Una posible explicación a este suceso es que la infección
viral conduce a la sobre expresión de dichos ligandos y algunos tumores son
provocados por virus por lo tanto muestran una expresión de estas proteínas in
vivo (Gourzi, P. 2006).
Sin embargo, también los tumores que no tienen un origen viral, como en cáncer
de mama, pueden expresar altos niveles de ligandos de NKG2D sugiriendo una
causa distinta a este fenómeno. Una hipótesis es que la inducción de ligandos de
NKG2D es el resultado del proceso oncogénico en sí mismo. Los ligandos de
NKG2D son genes expresados en respuesta al estrés celular y aumentan su
transcripción por determinados estímulos como daño al DNA (Soriani, A. et. Al.
2009), shock térmico (Groh, V. et. Al. 1999) y cambios en niveles hormonales
(Basu, S. et. Al. 2008).
Muchos, sí no es que todos estos procesos ocurren fácilmente en células malignas.
La oncogénesis está generalmente asociada con inestabilidad genómica, las
proteínas de choque térmico son frecuentemente imitadas por tumores para
promover su supervivencia y muchos tumores, como el cáncer de mama, ovario y
endometrio, recurren a estrógenos para estimular su crecimiento (Lanier, L.
2001). Además, las células que proliferan rápidamente han mostrado la
inducción de ligandos de NKG2D. La expresión elevada de estas moléculas en
células cancerígenas puede ser por lo tanto un efecto del proceso oncogénico
(Champsaur, M. 2010).
2.3.7 POLIMORFISMO DEL GEN NKG2D
Los polimorfismos son variantes en la secuencia del DNA que coexisten
simultáneamente en una población en un locus específico. Para que estas
variantes sean consideradas polimorfismos, el alelo menos frecuente tiene que
aparecer con una frecuencia mínima de 1%. Existen varios tipos de polimorfismos
(inserciones, deleciones, cambios en el número de secuencias repetidas), sin
embargo, los más frecuentes son los polimorfismos de un solo nucleótido o SNP
(por sus siglas en inglés Single Nucleotide Polimorfism).
Estos SNP son altamente abundantes pues se estima que se presenta uno por cada
1000 pares de bases. La mayoría de los SNP se localizan en regiones del genoma
25

que no codifican, por lo que no poseen un impacto directo en el fenotipo de un
individuo. La reciente importancia de estos SNP se encuentra en que pueden ser
usados para identificar genes que predisponen a desórdenes multifactoriales
comunes como lo es el cáncer.
Las células NK son las encargadas de proveer un mecanismo de defensa temprano
contra infecciones virales, pero lo que llevó a su descubrimiento fue su actividad
citotóxica contra tumores. Es decir, su capacidad para lisar células tumorales in
vitro sin la necesidad de una previa inmunización por parte del hospedero fue lo
que les dio su nombre de asesinas naturales (Kiessling, et. Al. 1975). El
mecanismo inicial de inmunovigilancia contra el cáncer parece ser una
citotoxicidad vía antígeno tumoral no específico que involucra a las células NK
(Herberman, R.B. 1983).
En varios estudios pasados acerca de la inmunovigilancia contra el cáncer, ha
quedado claro el importante papel de la actividad natural citotóxica para prevenir
el cáncer (Brittenden, J. 1996, Moretta, A 1997 y Smyth, M.J. 2000), pero ha sido
una tarea ardua extrapolar estos resultados para dar una estimación de riesgo de
cáncer en humanos. Una de las cuestiones más decisivas ha sido establecer sí las
diferencias interindividuales en la defensa inmunológica del hospedero podría
predecir el futuro desarrollo de los tipos de cáncer más comunes (Hayashi, T.
2006).
Bajo esta premisa Imai K. y cols. realizaron un estudio de cohortes prospectivo en
el año de 1986 que duro 11 años. Al comienzo de este estudio Imai K. y cols.
evaluaron la actividad citotóxica por el método de isótopo liberado usando la
línea celular K567 como células blanco y clasificaron a los sujetos de estudio con
alto, medio y bajo nivel de actividad citotóxica. Los individuos con altos o
medianos niveles de actividad citotóxica de linfocitos en sangre periférica
tuvieron un riesgo disminuido de sufrir cáncer en comparación con los individuos
de baja actividad citotóxica (Imai, K. 2000).
Esta fue la primera evidencia del papel vital que desempeña la defensa
inmunológica natural en la incidencia de cáncer entre la población general,
indicando la posibilidad de inmunoprevención de cáncer utilizando la actividad
citotóxica natural como un biomarcador (Nakachi, K. 2004). Sin embargo, las
26

diferencias inmunogenéticas de cada individuo que determinan la actividad
citotóxica natural necesitan ser clarificadas.
Recientemente, fueron identificados dos haplotipos en la región del complejo NK
asociados con la actividad natural citotóxica, NK hb-1 y NK hb-2. El tipo HNK
está relacionado con alta actividad citotóxica y se ha demostrado una fuerte
asociación con la reducción de riesgo de cáncer en la población japonesa
(Hayashi, T. 2006).
El grupo NKG2D hb-1 consiste en dos haplotipos, uno con alta actividad NK
(HNK1) y el otro con baja actividad NK (LNK1), y puede ser evaluado con respecto
a cinco SNP que se encuentran estrechamente ligados: rs1049174, rs2617160,
rs2617170, rs2617171 y rs1982526 (Hiroki, F. 2008). El grupo NKG2D hb-2 está
conformado por los SNP rs2255336, rs2246809 y rs2617169. El análisis del
polimorfismo de NKG2D y su asociación con cáncer gástrico y cáncer de mama
se realizó con los SNP rs1049174, rs2617160 y rs2255336, la tabla 3 muestra sus
respectivos genotipos.Tabla 3. Polimorfismos del gen NKG2D
SNP Alelos Genotipos

rs1049174

C-G
CC
CG
GG

rs2255336

G-A
GG
GA
AA

rs2617160

T-A
TT
TA
AA

3. JUSTIFICACIÓN
El término científico o médico para cáncer es neoplasma maligno, el cual se
explica como un crecimiento relativamente autónomo del tejido no sujeto a las
reglas y regulaciones de la proliferación de las células normales. En México, a
partir de 2006 el cáncer de mama (CM) constituye la primera causa de muerte
por patología maligna en mujeres mayores de 25 años, superando la mortalidad
por cáncer cervicouterino (CaCu).
Por otro lado, el cáncer gástrico (CG) representa la cuarta causa de muerte por
cáncer entre varones y la quinta entre mujeres. Factores de riesgo asociados con
el desarrollo de esta enfermedad son la infección por Helicobacter pylori,
tabaquismo, ingesta alta de sal y factores relacionados con la dieta.
Se sabe que el cáncer es un padecimiento desencadenado por múltiples factores
y que la constitución genética del individuo y las células del sistema inmune
desempeñan un rol muy importante.
Las células Natural Killer (NK) son linfocitos productores de citocinas
inflamatorias y/o citotóxicas que constituyen un componente primordial en la
respuesta inmune innata contra infecciones y procesos neoplásicos. Las células
NK expresan una gran variedad de receptores activadores dedicados a inducir
esta tarea, entre los cuales se encuentra el receptor Natural Killer Group 2D
(NKG2D).
Este receptor es expresado no sólo en las células NK sino también en células Tγδ,
así como en subconjuntos de células T CD4+ y CD8+ y ha sido estudiado
intensamente debido a su vital contribución en el sistema de inmunovigilancia.
NKG2D esta codificado por Klrk1, un gen localizado en el complejo de genes NKC
en el cromosoma 12.
Ha sido demostrado que la actividad natural citotóxica de linfocitos de sangre
periférica es inversamente proporcional al riesgo de padecer cáncer. Además de
que dicha condición puede ser evaluada con respecto a los haplotipos del gen
NKG2D.
28

Por lo anterior, este estudio pretende elucidar el impacto del polimorfismo de este
gen sobre el riesgo de padecer cáncer de mama debido a la alta incidencia de esta
neoplasia entre las mujeres mexicanas y en cáncer gástrico ya que ha sido
demostrada la asociación del polimorfismo de NKG2D en un tipo de cáncer
similar como lo es el cáncer colorectal en la población japonesa.
Se han incluido dos tipos de cáncer distintos debido a que se pretende comparar
el comportamiento genético de la enfermedad en una misma población con
padecimientos de un mismo tipo en tejidos diferentes para determinar sí la
respuesta inmune desarrollada por NKG2D es generalmente similar o
localmente distinta en ambos tejidos.

4. OBJETIVO GENERAL
Genotipificar los SNP del gen NKG2D en un grupo de pacientes con cáncer de
mama, cáncer gástrico y un grupo de personas sanas mediante la técnica de PCR
en tiempo real para determinar el impacto del polimorfismo de NKG2D sobre el
riesgo de sufrir tales enfermedades.

5. OBJETIVOS PARTICULARES
1. Realizar la extracción de DNA a partir de leucocitos de sangre
periférica en todos los sujetos de estudio mediante la técnica de salting
out.
2. Tipificar mediante PCR en tiempo real los SNP del gen NKG2D en
la posición 3 285 489 C→G (rs1049174); 3 305 721 (rs2617160) T→A
y 3 292 450 G→A (rs2255336) en pacientes con cáncer de mama, cáncer
gástrico y en individuos sanos.
3. Establecer las frecuencias alélicas, genotípicas y haplotípicas del
gen NKG2D en cada uno de los grupos de estudio.
4. Determinar mediante un análisis estadístico sí existen diferencias
significativas en las frecuencias obtenidas en el grupo control y los grupos
de casos; en caso afirmativo establecer la asociación entre estos grupos
calculando el índice OR.

6. HIPÓTESIS
Sí existen diferencias significativas en las frecuencias alélicas o genotípicas del
polimorfismo del gen NKG2D entre el grupo control y el grupo de pacientes,
entonces habrá una asociación con el riesgo de padecer cáncer de mama y/o
cáncer gástrico.

7. MATERIALES Y MÉTODOS
Tipo de estudio: Casos y controles.
Población de estudio: El estudio de los SNP del gen NKG2D fue desarrollado en
54 pacientes con gastritis no atrófica, 97 pacientes con cáncer gástrico y 262
pacientes con cáncer de mama del Instituto Mexicano del Seguro Social que
acudieron a diversas unidades médicas del Valle de México entre junio de 2011 a
enero de 2012 diagnosticados mediante biopsia y sintomatología; así como en 125
personas sanas seleccionadas aleatoriamente (Tabla 4).
Criterios de inclusión
 Pacientes adultos diagnosticados con cáncer de mama o gástrico.
 Pacientes que no cursaron con otra enfermedad al momento del estudio.
 Pacientes del Valle de México.
 Pacientes con padres y abuelos mexicanos.
Criterios de exclusión
 Pacientes con espondiloartropatía, diabetes o cualquier enfermedad
relacionada genéticamente.
 Pacientes que tengan un familiar con cualquier enfermedad citada
anteriormente.
Criterios de eliminación
 DNA degradado o insuficiente.
 Resultados de genotipificación incompletos.
Criterios para el grupo control
 Personas sanas con padres y abuelos mexicanos.
 Sin antecedentes familiares de espondiloartropatía, diabetes o cualquier
enfermedad relacionada genéticamente.
33

Tabla 4. Características de la población de estudio
Variable

Controles, n
125
Casos, n
413
Gástritis no
atrófica
54
Cáncer
gástrico
97
Cáncer de
mama
262
Género
Masculino
Femenino
Edad
<50
50 – 64
65 – 75
>75
Media (SD)

75 (60)
50 (40)

109 (87.2)
16 (12.8)
–
–
35.2 (11.5)

21 (38.9)
33 (61.1)

21 (38.9)
17 (31.5)
9 (16.7)
7 (12.9)
53.3 (16.2)

41 (42.3)
56 (57.7)

22 (22.7)
29 (29.9)
27 (27.8)
19 (19.6)
62.7 (13.4)

3 (0.2)
259 (98.8)

83 (31.7)
112 (42.7)
47 (17.9)
20 (7.6)
56.1 (12.2)

Obtención de la muestra: Se tomó una muestra de sangre periférica de 10 mL a
cada uno de los sujetos de estudio en tubos con anticoagulante EDTA al 10%.
Extracción del DNA: El DNA de cada individuo fue extraído a partir de la fracción
de glóbulos blancos (buffy coat) en sangre periférica mediante la técnica de
salting out (Miller, S.A. et. Al. 1988). La muestra de sangre se centrifugó a 3500
rpm durante 7 minutos y se obtuvo la capa de glóbulos blancos a la cual se le
agregaron 700 μL de buffer de lisis (50 mM de Tris HCl, 50 mM EDTA pH 8, 1 %
de SDS y 50 mM de NaCl).
Posteriormente se centrifugó la mezcla a 12 mil rpm por 5 minutos y se decantó
cuidadosamente. Se agregaron 800 μL de buffer de lisis 1 y se agitó en un vórtex
para después centrifugar a 12 mil rpm un minuto. El último paso se repitió hasta
obtener un sobrenadante totalmente claro.
El pellet se resuspendió en 400 μL de buffer de lisis y se agregaron 10 μL de SDS
al 20 % y 110 μL de perclorato de sodio 5 M. Se mezcló cuidadosamente por 10
minutos en el agitador basculante y se agregaron 200 μL de NaCl 5 M.
A continuación se centrifugó a 12 mil rpm por 5 minutos y se decantó en un nuevo
tubo agregando un volumen similar de isopropanol a – 20 °C mezclando
suavemente por inversión y se centrifugó a 12 mil rpm por 5 minutos. El pellet se
lavó tres veces con 1 mL de etanol al 70 % a – 20 °C centrifugándolo a 12 mil rpm
34

durante un minuto entre cada lavado. Se dejó secar para eliminar los residuos de
etanol y se resuspendió en 100 μL de agua destilada.
Preparación de diluciones de DNA: Una vez obtenida la solución concentrada deDNA se procedió a verificar su pureza en un fluoroespectrometro de acuerdo al
coeficiente 260/280 obteniéndose valores de 1.8 – 2.0 que indican una adecuada
desproteinización. Se prepararon diluciones a 10 ng/μL utilizando el equipo
citado anteriormente para llevar a cabo la amplificación del DNA.
Determinación del genotipo de NKG2D por PCR en tiempo real: La
genotipificación se llevó a cabo por PCR en tiempo real mediante el método de
discriminación alélica con sondas Taq ManTM (Syvänen, 2001) en un
termociclador Step One Real-time PCR System siguiendo las instrucciones de la
casa comercial (Applied Biosystems, Foster City, CA). Dicha reacción contiene
DNA muestra (11.25 µL), master mix universal (12.50 µL) y una sonda específica
para cada SNP (1.25 µL) [VIC/FAM] (Ver Tabla 5).

Condiciones de la PCR en tiempo real: La reacción de amplificación consistió en
30 segundos a 60 ºC seguidos por 10 minutos a 95 ºC, posteriormente se
programaron 50 ciclos de 15 segundos a 92 ºC (desnaturalización) y 1 minuto a
60 ºC (hibridación/extensión) por último se mantuvo la reacción 30 segundos a
60 ºC.

Análisis estadístico: Se realizó la prueba de equilibrio de Hardy-Weinberg para
confirmar que la distribución genotípica obtenida es producto del azar. Los datos
obtenidos fueron analizados mediante la prueba de Χ2 considerando un valor de
P < 0.05 como parámetro para determinar que existen diferencias significativas
entre las frecuencias alélicas, genotípicas y haplotípicas del grupo control y los
pacientes con cáncer. Por último, se calculó el índice OR para determinar el tipo
de asociación de NKG2D con cáncer. Un índice de OR > 1.0 indica una asociación
de riesgo mientras que un OR < 1.0 se considera un factor protector.

8. RESULTADOS
La clasificación alélica de cada SNP por PCR en tiempo real se llevó a cabo
satisfactoriamente para todas las muestras. Se obtuvieron curvas de
amplificación en las cuales se observó el incremento en la fluorescencia emitida
para cada sonda alelo específica lo que permitió su clasificación. (Figuras 11 y 12).
La línea roja representa el valor umbral o treshold determinado automáticamente
por el software por encima del cual se considera un resultado significativo.

Figura 11. Curvas de amplificación para homocigoto dominante (izquierda) y
homocigoto recesivo (derecha).

Figura 12. Curva de amplificación para heterocigoto.

La genotipificación de los SNP de NKG2D está representada en el gráfico de
distribución alélica (Figura 13) que clasifica las muestras en homocigoto
37

dominante, homocigoto recesivo y heterocigoto asignando un color distinto de
acuerdo a los resultados de la amplificación en tiempo real. El cuadro en color
negro situado en la esquina inferior izquierda representa el control interno de la
reacción de amplificación.

Figura 13. Distribución alélica de las muestras.
La prueba de equilibrio de Hardy – Weinberg para la población en estudio resultó
satisfactoria ya que no se encontraron diferencias significativas entre las
frecuencias alélicas obtenidas experimentalmente y las frecuencias alélicas
esperadas concluyendo así que la distribución genotípica de la población es
producto del azar (Tabla 6).
Tabla 6. Equilibrio de Hardy – Weinberg para los SNP de NKG2D
SNP PHW Alelos
rs1049174 0.1017 C/G
rs2255336 0.5723 G/A
rs2617160 0.1976 T/A

La tabla 7 muestra los resultados de genotipificación agrupados en frecuencias
alélicas y frecuencias genotípicas. El grupo de pacientes con cáncer gástrico
38

demostró una asociación con el alelo C (OR=0.59 95% CI 0.40-0.87) y con el
genotipo CC (OR=0.49 95% CI 0.28-0.85) para el SNP rs1049174. Los demás
grupos de estudio no presentaron ninguna asociación en la comparación alélica y
genotípica de los casos y controles.
Los resultados del análisis de la asociación de las frecuencias haplotípicas se
muestran en la Tabla 8. El haplotipo GGT se encuentra asociado a gastritis no
atrófica y a cáncer gástrico con un OR de 7.1 y 14.96 respectivamente indicando
un posible factor de riesgo para estos padecimientos. Por el contrario, el haplotipo
CGT representa un factor protector contra cáncer gástrico en la población
mexicana de acuerdo a los resultados obtenidos de OR=0.62 (95% CI=0.44 –
0.88, p=0.0106).

Tabla 7. Frecuencias alélicas y genotípicas de los SNP de NKG2D
Grupo de estudio SNP Frecuencia alélica Frecuencia genotípica
Control
(125)

rs1049174 C
171 (0.68)
G
79 (0.32)
CC
61 (0.49)
CG
49 (0.39)
GG
15 (0.12)
rs2255336 G
233 (0.93)
A
17 (0.07)
GG
108 (0.86)
AG
17 (0.14)
AA
0
rs2617160 T
172 (0.69)
A
78 (0.31)
TT
61 (0.49)
AT
50 (0.40)
AA
14 (0.11)
Gastritis no atrófica
(54)
rs1049174 C
64 (0.59)
G
44 (0.41)
CC
21 (0.39)
CG
22 (0.41)
GG
11 (0.20)
rs2255336 G
99 (0.92)
A
9 (0.08)
GG
45 (0.83)
AG
9 (0.17)
AA
0
rs2617160 T
68 (0.63)
A
40 (0.37)
TT
23 (0.42)
AT
22 (0.41)
AA
9 (0.17)
Cáncer gástrico
(97)
rs1049174 C†
109 (0.56)
G
85 (0.44)
CC††
31 (0.32)
CG
47 (0.48)
GG
19 (0.20)
rs2255336 G
181 (0.93)
A
13 (0.07)
GG
84 (0.87)
AG
13 (0.13)
AA
0
rs2617160 T
120 (0.62)
A
74 (0.38)
TT
35 (0.36)
AT
50 (0.52)
AA
12 (0.12)
Cáncer de mama
(262)
rs1049174 C
347 (0.66)
G
177 (0.34)
CC
118 (0.45)
CG
111 (0.42)
GG
33 (0.13)
rs2255336 G
475 (0.91)
A
49 (0.09)
GG
215 (0.82)
AG
45 (0.17)
AA
2 (0.1)
rs2617160 T
351 (0.67)
A
173 (0.33)
TT
123 (0.47)
AT
105 (0.40)
AA
34 (0.13)
† P < 0.05 OR=0.59 (95% CI 0.40-0.87) †† P < 0.05 OR=0.49 (95% CI 0.28-0.85) El alelo C y el genotipo CC del SNP rs1049174 se encuentra asociado a cáncer gástrico.

Tabla 8. Análisis de la asociación de los haplotipos de NKG2D

Haplotipo

Controles
Casos
Gastritis no atrófica Cáncer gástrico Cáncer de mama
n n P OR (95% CI) n P OR (95% CI) n P OR (95% CI)
CGT

170
(0.68)

63
(0.583)
0.0783 –

109
(0.562)
0.0106

0.62
(0.44 - 0.88)

342
(0.653)
0.4529 –
GGA

61
(0.244)

32
(0.296)
0.3248 –

61
(0.314)
0.0917 –

127
(0.242)
0.9412 –
GAA

16
(0.064)

7
(0.065)
0.9032 –

13
(0.067)
0.955 –

42
(0.080)
0.4024 –
GGT

1
(0.004)

3
(0.028)
0.0354
7.1
(0.73 - 69.18)

3
(0.057)
0.0007

14.96
(1.91 - 116.96)

13
(0.025)

0.5112
6.3
(0.82 – 48.69)
41

9. DISCUSIÓN
Las frecuencias alélicas de los SNP de NKG2D mostradas en la tabla 7 son
consistentes en todos los grupos de estudio. Los alelos C, G y T correspondientes
a cada polimorfismo mostraron una mayor frecuencia en el grupo control en
comparación con los pacientes, sin embargo estas diferencias no resultaron
significativas. Únicamente en el grupo de cáncer gástrico se obtuvieron
diferencias estadísticamente significativas para el alelo C y el genotipo CC del
SNP rs1049174 en comparación con el grupo control.
La asociación del SNP rs1049174 con cáncer gástrico establece que el alelo C y el
genotipo CC en es un factor de protección para el desarrollo de cáncer gástrico en
la población mexicana. Estos resultados difieren con los obtenidos en estudios
anteriores en los cuales se determinó el alelo C como un factor de riesgo para el
desarrollo de cáncer colorrectal en la población japonesa (Hiroki, F. 2008). Sin
embargo, se ha demostrado que el efecto del genotipo sobre el fenotipo de la
enfermedad varía entre desórdenes y poblaciones debido a la heterogeneidad
genética y ambiental (Weiss, K. 2000).
La estratificación de los pacientes en gastritis no atrófica y cáncer gástrico mostró
un incremento significativo en la frecuencia del haplotipo GGT en pacientes
diagnosticadoscon cáncer gástrico en comparación con los controles siendo este
haplotipo un factor de riesgo para el desarrollo de este tipo de cáncer. Asimismo,
se encontró cierta asociación significativa del haplotipo GGT y cáncer de mama.
De acuerdo con Gavin P. D. la inmunovigilancia contra el cáncer parece ser un
proceso multivariable en el cual las respuestas inmunológicas son influenciadas
por el origen celular del tumor, el modo de transformación, la localización
anatómica, la respuesta estromal, el perfil de producción de citocinas y la
inmunogenicidad inherente (Gavin, P.D. 2004). Se deben evaluar otros factores
genéticos e inmunológicos para establecer en que aspectos la respuesta inmune
contra el cáncer es generalmente similar o localmente distinta en los diferentes
tejidos.

10. CONCLUSIONES
 Se consiguió llevar a cabo la extracción de DNA en leucocitos de sangre
periférica por el método de salting out.

 Se realizó la genotipificación de los SNP de NKG2D (rs1049174,
rs2255336 y rs2617160) por PCR tiempo real en personas sanas, pacientes
con gastritis no atrófica, cáncer gástrico y cáncer de mama.

 Se establecieron las frecuencias alélicas, genotípicas y haplotípicas en los
cuatro grupos de estudio.

 Se determinaron las diferencias significativas entre el grupo control y los
tres grupos de casos por la prueba de X2. Se determinó la asociación de
NKG2D con cáncer gástrico y gastritis no atrófica por el índice de OR.

 Se demostró la asociación que existe entre el polimorfismo del gen NKG2D
y el riesgo de cáncer gástrico en la población mexicana.

 El alelo C del SNP rs1049174 constituye un factor protector para el
desarrollo de cáncer gástrico en la población mexicana, en tanto que el
haplotipo GGT constituye un factor de riesgo para el desarrollo de cáncer
gástrico y cáncer de mama.

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