Analisis-de-pesticidas-organofosforados-en-muestras-biologicas-por-microextraccion-en-fase-lquida-HF-LPME-y-cromatografa-de-gases-acoplada-a-espectrometra-de-masas-GC-MS

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
ANÁLISIS DE PESTICIDAS ORGANOFOSFORADOS EN MUESTRAS BIOLÓGICAS 
POR MICROEXTRACCIÓN EN FASE LÍQUIDA (HF-LPME) Y CROMATOGRAFÍA 
DE GASES ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS (GC-MS) 
 
TESIS 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
 
QUÍMICO 
 
PRESENTA 
 
MARCO ANTONIO ESPINOSA NERI 
 
 
 
 
 CIUDAD UNIVERSITARIA, CDMX. 2017
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE: Profesor Francisco Rojo Callejas 
VOCAL: Profesora Silvia Citlalli Gama González 
SECRETARIO: Profesora Patricia Díaz Arista 
1er. SUPLENTE: Profesor Marcos Francisco Villanueva Hernández 
2° SUPLENTE: Profesor Joaquín Preza de la Vega 
 
Sitio donde desarrolló el tema: 
Laboratorio 102, División de Estudios de Posgrado, Facultad de Química, UNAM 
 
 
 
ASESOR DEL TEMA: M. EN C. FRANCISCO ROJO CALLEJAS 
(Nombre y firma) 
SUSTENTANTE: MARCO ANTONIO ESPINOSA NERI 
 
 
 
 
 
 
CONTENIDO 
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 1 
2. OBJETIVOS ........................................................................................................ 3 
2.1 Objetivo General ............................................................................................ 3 
2.2 Objetivos particulares .................................................................................... 3 
3. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................. 4 
4. ANTECEDENTES ............................................................................................... 5 
4.1 Pesticidas organofosforados .......................................................................... 5 
4.1.1 Propiedades fisicoquímicas ..................................................................... 6 
4.1.2 Organofosforados en el Medio Ambiente .............................................. 10 
4.1.3 Vías de absorción y efectos en la salud humana .................................. 11 
4.1.4 Pesticidas organofosforados en México ................................................ 13 
4.2 Microextracción en fase líquida (LPME) ...................................................... 14 
4.3 Microextracción en fase líquida con fibra hueca (HF-LPME) ....................... 16 
4.3.1 Descripción y fundamentos de la técnica .............................................. 16 
4.3.2 Factores que afectan la HF-LPME......................................................... 20 
4.4 Tamiz neonatal y muestras de sangre seca ................................................ 24 
4.5 Fibra hueca .................................................................................................. 30 
4.6 Cromatografía de gases .............................................................................. 31 
4.7 Espectrometría de masas ............................................................................ 34 
5. DESARROLLO EXPERIMENTAL ..................................................................... 37 
5.1 Materiales y preparación de la muestra ....................................................... 37 
5.2 HF-LPME ..................................................................................................... 37 
5.3 Tamiz neonatal y desorción de analitos ....................................................... 38 
5.4 Equipo y análisis por GC-MS ..................................................................... 39 
5.5 Parámetros estadísticos .............................................................................. 41 
5.5.1 Límite de detección ................................................................................ 41 
5.5.2 Intervalo lineal ....................................................................................... 42 
5.5.3 Reproducibilidad intermedia .................................................................. 43 
5.5.4 Recobro relativo..................................................................................... 43 
 
 
6. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE DATOS .......................................................... 44 
6.1 Separación de los compuestos .................................................................... 44 
6.2 Optimización de los parámetros para las microextracciones ....................... 46 
6.2.1 Optimización de la Temperatura de extracción ..................................... 46 
6.2.2 Optimización del Tiempo de extracción ................................................. 50 
 6.2.3 Optimización del secado previo a la extracción…………………………..52 
 6.3 Cuantificación de las extracciones .............................................................. 58 
6.3.1 Curvas de calibración sin muestra de sangre ........................................ 58 
6.3.2 Curvas de calibración con muestra de sangre ....................................... 60 
7. CONCLUSIONES ............................................................................................. 64 
8. REFERENCIAS……………………………………………………………………….65 
Índice de figuras 
Figura 1. Clasificación de acuerdo con la CICOPLAFEST 
Figura 2. Estructura base de los compuestos organofosforados 
Figura 3. Esquema de los residuos de plaguicidas en el ambiente 
Figura 4. Esquema del proceso de sinapsis 
Figura 5. Arreglo básico de HF-LPME 
Figura 6. Sistemas utilizados en HF-LMPE 
Figura 7. Configuración de la instrumentación para HF-LPME desarrollada por 
Pedersen-Bjergaard y Rasmussen 
Figura 8. Configuración de la instrumentación para HF-LPME desarrollada por el 
equipo de Lee 
Figura 9. Sistema automatizado de HF-LPME 
Figura 10. Micrografía de las paredes de la fibra de polipropileno 
Figura 11. Esquema de una columna para cromatografía de gases 
Figura 12. Esquema de un cromatograma de gases 
Figura 13. Esquema de la instrumentación para cromatografía de gases 
Figura 14. Esquema de un espectrómetro de masas clásico 
Figura 15. Cromatograma de separación a 1 µg/mL por inyección directa en 
modo SCAN 
 
Figura 16. Cromatograma de separación a 1 µg/mL por inyección directa en 
modo SIM 
Figura 17. Cromatograma de extracción a 5 ppm en modo SIM (con muestra de 
sangre seca) 
Figura 18. Cromatograma de extracción a 5 ppm en modo SIM (sin muestra de 
sangre seca) 
Figura 19. Optimización de la temperatura de extracción (1-5) 
Figura 20. Coeficiente de variación para diferentes temperaturas 
de extracción (1-5) 
Figura 21. Optimización de la temperatura de extracción (6-11) 
Figura 22. Coeficiente de variación para diferentes temperaturas 
de extracción (6-11) 
Figura 23. Optimización de la temperatura de extracción (12-17) 
Figura 24. Coeficiente de variación para diferentes temperaturas 
 de extracción (12-17) 
Figura 25. Optimización del tiempo de extracción (1-5) 
Figura 26. Optimización del tiempo de extracción (6-11) 
Figura 27. Optimización del tiempo de extracción (12-17) 
Figura 28. Coeficiente de variación para diferentes tiempos de extracción 
(4 compuestos) 
Figura 29. Optimización del secado previo a la extracción (comparación) 
Figura 30. Coeficiente de variación del secado previo a la extracción 
(comparación)Figura 31. Reproducibilidad intermedia (comparación) 
Figura 32. Coeficiente de variación de la reproducibilidad intermedia 
(comparación) 
Figura 33. Curvas de calibración (1-5) 
Figura 34. Curvas de calibración (6-10) 
Figura 35. Curvas de calibración (11-15) 
Figura 36. Curvas de calibración (16-18) 
Figura 37. Curvas de calibración (1-5) 
Figura 38. Curvas de calibración (6-10) 
 
Figura 39. Curvas de calibración (11-15) 
Figura 40. Curvas de calibración (16-18) 
Índice de tablas 
Tabla 1. Toxicidad aguda en ratas por plaguicidas (CICOPLAFEST) 
Tabla 2. Valores de presión de vapor comunes para plaguicidas 
Tabla 3. Valores de volatilidad en plaguicidas 
Tabla 4. Coeficiente de adsorción de carbono orgánico para plaguicidas 
Tabla 5. Plaguicidas organofosforados de interés (clasificación toxicológica) 
Tabla 6. Plaguicidas organofosforados restringidos en México 
Tabla 7. Tamiz neonatal. Metodologías utilizadas por institución. Mexico, 2008 
Tabla 8. Enfermedades detectadas vía tamiz por institución 
Tabla 9. Parámetros evaluados en HF-LPME 
Tabla 10. Iones seleccionados para el método SIM 
Tabla 11. Límite de detección calculado para cada compuesto 
Tabla 12. Valores de pendiente y r obtenidos para cada compuesto 
Tabla 13. Valores de pendiente y r obtenidos para cada compuesto con muestra 
de sangre seca 
Tabla 14. Valores de recobro relativo obtenidos para algunos compuestos 
Listado de abreviaturas 
 OPPs: Compuestos organofosforados 
 HF-LPME: Microextracción en fase líquida con fibra hueca 
 SPME: Microextracción en fase sólida 
 SDME: Microextracción de gota única 
 GC: Cromatografía de gases 
 MS: Espectrometría de masas 
 SIM: Monitoreo selectivo de iones 
 CV: Coeficiente de variación 
Introducción 
 
 
1 
1. INTRODUCCIÓN 
Plaguicida (Producto Fitosanitario) se denomina a cualquier tipo de sustancia 
química de origen natural o sintético u organismo vivo, sustancias semejantes o 
subproductos, que se utilizan de forma individual o en mezclas para controlar o 
destruir algún tipo de plaga, incluidos los vectores de enfermedades humanas y de 
animales, para la protección de los cultivos y productos agrícolas.1,2,3 De acuerdo 
con la Comisión Intersecretarial para el Control del Proceso y Uso de Plaguicidas, 
Fertilizantes y Sustancias Tóxicas (CICOPLAFEST), existe una amplia gama de 
alternativas químicas, dichos compuestos se pueden clasificar según su 
concentración, organismos que controlan, modo de acción, composición o 
estructura química, su persistencia en el ambiente y el uso al que se destinan. 
Esta clasificación se muestra en la figura 1.1 
 
Figura 1. Clasificación de acuerdo con la Comisión Intersecretarial para el Control 
del Proceso y Uso de Plaguicidas, Fertilizantes y Sustancias Tóxicas 
(CICOPLAFEST) 1
Organismos que 
controlan
Insecticidas, Acaricidas
Fungicidas, Bactericidas
Rodenticidas, Herbicidas
Avicidas, etc.
Modo de acción
De contacto, Repelentes
Fumigantes, Defoliantes
Sistemáticos, 
De ingestión
Composición química
Organoclorados
Organofosforados
Carbamatos, Piretroides
Organoazufrados, Ftálimidas
Carboxamidas, etc.
Persistencia 
(semanas)
Ligeramente (< 4 )
Poco persistentes (4-26)
Moderadamente (27-52)
Altamente (52-1040)
Permanentes (< 1040))
Uso
Agrícola, Pecuario, Forestal
Doméstico,Urbano,
Industrial, Para jardinería
Concentración
Ingrediente activo
Plaguicida técnico
Plaguicida formulado
Introducción 
 
 
2 
Es claro que al aumentar la población a nivel mundial, también se genera una 
creciente demanda de alimentos y agua potable, la cual también es directamente 
proporcional al uso de plaguicidas, que, a pesar de su nivel de toxicidad, puedan 
asegurar la productividad del campo, la inversión económica y por ende satisfacer 
la demanda de alimentos. Dada la naturaleza de este tipo de compuestos, es 
importante contar con un organismo regulador eficiente, como método de 
prevención en el uso irracional o excesivo de pesticidas, ya que el empleo 
excesivo puede causar algún tipo de intoxicación grave, deterioro ambiental o 
incluso una catástrofe a nivel mundial. Al tomar en cuenta las deficiencias 
operativas actuales en la industria agrícola, se vuelve una importante prioridad el 
uso y desarrollo de métodos de detección capaces de cuantificar cualquier tipo de 
compuesto químico utilizado como pesticida, incluso a bajas concentraciones, que 
pueda poner en riesgo la salud del consumidor y la estabilidad social de cualquier 
región del mundo. La micro extracción en fase líquida utilizando fibra hueca se ha 
convertido en una herramienta bastante útil y versátil en la detección y 
cuantificación de cualquier tipo de pesticida, principalmente orgánicos. Debido a 
su uso frecuente y a su amplia variedad, los pesticidas organofosforados son el 
centro de estudio en este trabajo ya que uno de sus principales efectos es inhibir 
la actividad de la enzima acetilcolinesterasa, fenómeno que ocurre a nivel de la 
sinapsis nerviosa. El mecanismo de envenenamiento por estos pesticidas consiste 
en sobrecargar las terminales nerviosas con un flujo constante de señales debido 
a dicha inhibición, lo que deriva en la acumulación de acetilcolina y genera temblor 
y convulsiones musculares.3,4,5 
Tabla 1. Toxicidad aguda en ratas por plaguicidas (CICOPLAFEST)1 
Tipo toxicológico 
 
 
DL50 en mg/kg 
via oral 
DL50 en 
mg/kg 
percutánea 
DL50 en 
mg/kg 
inhalación 
I ≤ 50 ≤ 200 ≤ 0.2 
II 50-100 200-2000 0.2-2.0 
III 500-5000 2000-20000 2.0-20 
IV ≥ 5000 ≥ 20000 ≥20 
Objetivos 
 
 
3 
2. OBJETIVOS 
2.1 Objetivo General 
Desarrollar una metodología práctica y eficaz para la detección y cuantificación de 
compuestos organofosforados mediante el uso de la prueba del tamiz neonatal, 
las técnicas de microextracción en fase líquida con fibra hueca y cromatografía de 
gases acoplada a espectrometría de masas, la cual se pueda convertir en una 
herramienta capaz de diagnosticar intoxicaciones por este tipo de compuesto qe 
permita administrar un tratamiento oportuno. 
 2.2 Objetivos particulares 
 
 Establecer las condiciones operacionales adecuadas para separar a los 
pesticidas organofosforados (OPPs) en cromatografía. 
 Utilizar la técnica de microextracción en fase líquida con fibra hueca 
para extraer los OPPs disueltos desde una fase acuosa. 
 Determinar las condiciones óptimas de desorción de los analitos en 
muestras de sangre seca fortificadas. 
 Aplicar la técnica de extracción a muestras de sangre seca fortificadas. 
 Evaluar el porcentaje de recobro de los solutos. 
 Validar lo parámetros del método (intervalo lineal, límites de detección 
cuantificación, repetibilidad y reproducibilidad intermedia).
Justificación 
 
 
4 
3. JUSTIFICACIÓN 
Existen diferentes métodos que permiten diagnosticar la contaminación por 
plaguicidas organofosforados, que basados en la determinación de los niveles de 
la enzima colinesterasa, por técnicas espectrofotométricas y colorimétricos 
principalmente. El desarrollo de un método sencillo, barato y eficaz que ayude a 
determinar intoxicaciones por OPPs en la población en general, permitiría la 
prescripción del tratamiento adecuado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Antecedentes 
 
 
5 
4. ANTECEDENTES 
4.1 Pesticidas organofosforados 
Los compuestos organofosforados son esteres derivados de los ácidos fosfórico, 
fosforotiocio o fosfonotioico y además pueden contener otro tipo de grupos 
funcionales tales como amidas, tioles, oxígenos del ácido sustituidos por azufre y 
otros radicales, obteniéndose así una amplia gama de combinaciones que pueden 
aumentar en gran medida su nivel de toxicidad.1 
Los pesticidas organofosforados representan un grupo ampliamente usado, la 
mayoría, clasificados como insecticidas y acaricidas, son compuestos muy 
heterogéneos que comparten una estructura química fosfórica derivada de ácidos. 
La mayoríason sintetizados por la industria química con precedente en los gases 
de guerra y desarrollados a partir de la Segunda Guerra Mundial, siendo el 
BLANDAN el primer insecticida de uso práctico comercializado en Alemania en 
1944. Actualmente existen miles de compuestos de este tipo, pero pocos son 
usados como pesticidas y como reguladores del crecimiento de plagas en el 
mundo. Estos compuestos son componentes de diferentes pesticidas comerciales 
La mayoría pueden agruparse en fosfatos, fosforotionatos, fosforoditioatos, 
fosforotiolatos, fosforoamidatos, fosforodiamidatos, pirofosfatos, fosfonatos y 
fosfotionatos. Su estructura general es caracterizada por la presencia de tres 
funciones éster en general y se representa en la figura 2.6 
 
Figura 2. Estructura base de los organofosforados14 
Antecedentes 
 
 
6 
4.1.1 Propiedades fisicoquímicas 
Los plaguicidas en general poseen ciertas propiedades que se relacionan a su 
capacidad de persistir en el medio ambiente, la tendencia de estos a pasar a la 
fase gaseosa se asocia a que tan volátil son y dicha propiedad se mide a partir de 
la constante de Henry que depende de la presión de vapor en estado líquido y de 
la solubilidad en agua.4 
Solubilidad en agua 
Es una medida que determina la máxima concentración de un plaguicida a 
disolverse en un litro de agua y por lo general tiene un intervalo de 1 a 100,000 
mg/L. Los plaguicidas muy solubles en agua se absorben con baja afinidad a los 
suelos y son fácilmente transportados del lugar de aplicación, por el contrario los 
plaguicidas con baja solubilidad tienen mayor afinidad por el suelo donde pueden 
sedimentarse y llegar a la base de los mantos acuíferos.4 6,16 
Presión de vapor 
Es una medida de la volatilidad de una sustancia química (plaguicida) en estado 
puro y es un patrón determinante de la velocidad en que este se volatiliza en el 
aire desde el suelo o cuerpos de agua superficiales contaminados. La presión de 
vapor se incrementa con el aumento de temperatura.4,6 
Tabla 2. Valores de presión de vapor comunes para plaguicidas4 
Presión de vapor 
del plaguicida 
(Pa) 
Afinidad del 
plaguicida al suelo 
o agua 
Plaguicida 
< 1.0 x10-8 Alta Bajo potencial para 
volatilizarse ( retenido 
en el suelo o 
solubilizar en agua) 
>1.0 x10-3 Baja Alto potencial para 
volatilizarse 
 
 
Antecedentes 
 
 
7 
Constante de Henry (H) 
Describe la tendencia de un plaguicida a volatilizarse del agua o del suelo húmedo 
y su valor se calcula usando la presión de vapor, solubilidad en agua y masa 
molecular del compuesto. Un alto valor indicaría que un plaguicida tiene un 
potencial elevado para volatilizarse del suelo húmedo y un valor bajo predice un 
mayor potencial de lixiviación.4,6 
Tabla 3. Valores de volatilidad en plaguicidas4 
Volatilidad del plaguicida 
 
Intervalos del valor (atm m3 / mol) 
No volátil 
El plaguicida 
puede 
disolverse en 
agua 
menor a 3 
x10-7 
 
 
Constante (H) 
Baja 
 Presión de 
vapor baja 
 Alta 
solubilidad 
 Potencial para 
lixiviar 
Baja 
volatilidad 
3 x10-7 a 1 
x10-5 
Volatilidad 
moderada 
El plaguicida 
puede 
evaporase 
1 x10-5 a 1 
x10-3 
 
 
Constante (H) 
Alta 
 Presión de 
vapor alta 
 Solubilidad 
baja 
 Potencial para 
volatilizar en 
suelo humedo 
Alta volatilidad Mayor a 1 
x10-3 
 
 
 
Coeficiente de adsorción de carbono orgánico (Koc) 
También conocido como coeficiente de adsorción suelo/agua es una medida de la 
tendencia de un compuesto orgánico a ser absorbido o retenido por los suelos o 
sedimentos. Este valor es específico para cada plaguicida e independiente de las 
propiedades del suelo. 
Antecedentes 
 
 
8 
Los valores del Koc van de 1 a 10,000,000. Un Koc elevando indica que el 
compuesto se fija con firmeza en la materia orgánica del suelo.4,6 
Tabla 4. Coeficiente de adsorción de carbón orgánico para plaguicidas4 
Adsorción del plaguicida al 
suelo 
 
Valores del coeficiente 
Muy débil 
El plaguicida 
puede ser 
volátil 
menor a 10 
 
 
Koc Bajo 
 Puede 
distribuirse en 
agua y aire 
 Puede no ser 
fijado al suelo 
 Vía de 
exposición 
inhalatoria 
Débil 10 a 100 
moderada 100 a 1000 
De moderada 
a fuerte 
El plaguicida 
puede ser 
soluble en 
grada 
1000 a 
10,000 
 
 
Koc Alto 
 Puede fijarse 
al suelo, 
sedimento, 
biota y 
materia 
orgánica 
 Puede 
moverse a 
aguas 
superficiales 
 Vía de 
exposición 
por cadena 
alimenticia 
fuerte 10,000 a 
100,000 
 
 
Muy fuerte Mayores a 
100,000 
 
Coeficiente de partición Octanol/agua (Kow) 
Es una medida de cómo una sustancia química puede distribuirse entre dos 
disolventes inmiscibles, uno polar (agua) y otro no polar (octanol). Dicho valor 
puede dar una idea de la polaridad de un plaguicida y al extrapolarse permitiría 
determinar en casos específicos la forma en como un plaguicida puede distribuirse 
en el tejido de grasa animal. Un Kow alto describe a un plaguicida que puede 
Antecedentes 
 
 
9 
fijarse con firmeza a la materia orgánica presente, bioacumularse en la grasa 
corporal de animales y su punto de contaminación principal seria por incorporación 
la cadena alimenticia. Kow= C octanol / C agua.4,6,15 
Vida media 
Vida media se define como el tiempo (días, semanas o años) requerido para que 
la mitad del plaguicida presente después de una aplicación, se descomponga en 
productos de degradación. Dicho factor depende de varios factores tales como la 
temperatura, el pH y los microorganismos presentes en el suelo, clima, luz, agua y 
oxígeno disponible.4,6,17 
 Vida media en el suelo: Está determinada por el tipo de suelo y de 
organismos que se encuentran presentes, así como del pH y temperatura 
Vida media en el aire (fotólisis): Tiempo requerido para que la mitad de un 
plaguicida aplicado se degrade al ser expuesto a la luz del sol. 
 Vida media por agua (hidrólisis): Tiempo requerido para que la mitad de un 
plaguicida aplicado se degrade por la acción del agua. 
 
La mayor parte de los compuestos organofosforados son líquidos incoloros que 
poseen un aroma característico y bastante fuerte. La gran mayoría son solubles en 
agua y en disolventes orgánicos. Además poseen un alto coeficiente de reparto 
aceite/agua y una presión de vapor baja que los hace que sean poco volátiles y de 
fácil absorción.1 También son altamente degradables, es decir, sufren hidrólisis en 
medio alcalino en la tierra y en líquidos biológicos, no siendo persistentes en el 
ambiente. Asimismo son liposolubles, lo que facilita su absorción por que 
atraviesan fácilmente las barrera biológicas (piel y mucosas), también penetran en 
el Sistema Nervioso Central. Algunos pueden almacenarse en el tejido graso, lo 
que puede provocar una toxicidad retardada debido a su liberación tardía. Es 
importante mencionar que este tipo de compuestos deben mantenerse alejados 
del calor y del fuego, asi como mantenerse en áreas ventiladas.1,4,6,17 
Antecedentes 
 
 
10 
Tabla 5. Plaguicidas organofosforados de interés (Clasificación toxicológica) 
Clorpirifos (III) Fenclorofos Profos 
Coumafos (II) Fensulfotion (I) Sulprofos (II) 
Demeton-S (II) Fention (I) Tetraclorvinfos (IV) 
Diazinon (III) Gution (II) Tokution 
Dibrom (I) Metil Paration (I) Tributilfosforotritiato 
Diclorvos (II) Forato (I) Tricloronato (I) 
Disulfoton (I) Fosdrin (I) 
 
4.1.2 Organofosforados en el Medio Ambiente 
La mayoría de los plaguicidas son diluidos o disueltos en agua para su aplicación 
en forma de aspersión mediante un sistema manual o automático y su transporte 
depende de los movimientos de gases, líquidos y partículas sólidas dentro del 
ambiente. Se depositan en la superficie de los cultivos, pero dados los 
mecanismos de fumigación y las condiciones climatológicas particulares de cada 
región, pueden involucrarse algunas rutas alternas donde éstos pueden 
depositarse. Los compuetos organofosforados en particular, tienen la ventaja 
primordialde que gran parte de ellos pueden ser degradados biológica o 
químicamente en forma rápida en o por plantas, animales y en el suelo, por lo que 
sus efectos se pueden observar fundamentalmente a corto plazo. Cuando son 
rociados, una parte se volatiliza y se transfiere en el aire de la zona donde pueden 
ser transportados por el viento y quedan depositados en suelos vecinos, 
posteriormente son eliminados vía fotodescomposicion, condensados en las 
nubes y subsecuentemente regresados a tierra mediante la lluvia o pueden 
situarse por tiempo indeterminado en la atmósfera dependiendo de las 
propiedades fisicoquímicas de cada compuesto. Una vez depositados pueden 
acumularse tanto en el suelo como en los cultivos o incluso en los animales como 
residuos si son agregados en exceso y pueden filtrarse en la zona mediante el 
sistema de riego o por la lluvia propia, donde contaminan los cuerpos de agua 
cercanos. 
Antecedentes 
 
 
11 
En el subsuelo pueden contaminar los mantos acuíferos, adsorberse sobre la 
superficie mineral/orgánica o según las propiedades del suelo o por la acción de 
microrganismos, pueden transformarse químicamente.6,7,8,9,11,12 La descripción 
gráfica a detalle se muestra en la figura 2. 
 
Figura 3. Esquema de los residuos de plaguicidas en el ambiente12 
 
4.1.3 Vías de absorción y efectos en la salud humana 
Este tipo de compuestos pueden introducirse en el organismo por inhalación de 
vapores o polvos, también absorberse vía gastrointestinal y por vía cutánea A 
través de la piel y de las mucosas expuestas. Una vez absorbidos, los 
organofosforados y sus metabolitos se distribuyen rápidamente por todos los 
órganos y tejidos, aunque las concentraciones más elevadas se alcanzan en el 
hígado y riñones. 
Antecedentes 
 
 
12 
El catabolismo o descomposición de los compuestos organofosforados más 
sencillos se da a través de las enzimas estearasas A, las cuales hidrolizan a una 
velocidad considerable, actuando como detoxificadoras. Muchos de estos 
compuestos sintéticos, al igual que los carbamatos, son altamente tóxicos e 
inhiben competitivamente la actividad de la colinesterasa, enzima estearasa de 
tipo B responsable de la degradación catalítica y terminación de la actividad 
biológica del neurotransmisor acetilcolina, que al acumularse en el espacio 
sináptico, altera el funcionamiento normal de los impulsos nerviosos, ésta 
acumulación de acetilcolina produce una sobre estimulación de los órganos 
efectores colinérgicos.13,14 Generalmente los signos de una intoxicación aguda 
ocurren cuando la actividad de la enzima disminuye a la mitad del valor medio 
normal, por lo que los trabajadores de la industria agrícola serian en tal caso los 
más susceptibles a presentar los primeros síntomas por intoxicación con OPP´s. 
La eliminación de los organofosforados es rápida y tiene lugar por la orina y, en 
menor cantidad, por heces y aire expirado. Su máxima excreción se alcanza a los 
dos días, luego disminuye paulatinamente.6,8,9,10,12 
 
Figura 4. Esquema del proceso de Sinapsis13 
Antecedentes 
 
 
13 
4.1.4 Pesticidas organofosforados en México 
En nuestro país, el uso de plaguicidas aumento en el año de 1994 con la apertura 
del Tratado de Libre Comercio de América del Norte (TLC), en donde los 
insecticidas y herbicidas procedentes de EUA y Canadá entran a México sin 
impuesto alguno. 
La regulación en el proceso de elaboración, comercialización y en el uso de 
plaguicidas se inició en 1987 con la creación de la Comisión Intersecretarial para 
el Control del Proceso y Uso de Plaguicidas, Fertilizantes y Sustancias Tóxicas 
(CICOPLAFEST), a través del decreto publicado en el Diario Oficial de la 
Federación el día 15 de octubre de ese año, donde se estableció la participación 
de las Secretarías de Comercio y Fomento Industrial, de Agricultura y Recursos 
Hidráulicos (ahora SAGARPA), de Salud, la Procuraduría Federal de Protección al 
Ambiente (PROFEPA), además del Instituto Nacional de Ecología (INE). La 
principal actividad de esta comisión es revisar y evaluar la información científico-
técnica sobre las propiedades y efectos de los plaguicidas, y con base en este 
procedimiento, se otorga o se prohíbe el uso de un plaguicida. El 27 de octubre de 
1988 se publicó el reglamento interno de la CICOPLAFEST, en el cual se 
encuentran contenidos los lineamientos que la comisión deberá seguir para dar 
cumplimiento a sus objetivos de creación. Hoy en día existen al menos 50 
plaguicidas de tipo organofosforado con uso autorizado, algunos otros se 
encuentran restringidos, dado su nivel de toxicidad, el manejo y aplicación de 
éstos se efectuara bajo la responsabilidad y supervisión del técnico autorizado que 
los haya recomendado.1,5,7,9 También existe el empleo de plaguicidas 
organofosforados en México que están prohibidos en otros países, todos ellos de 
tipo toxicológico I y II, los más destacados se mencionan en la tabla 6. 
 
 
 
 
Antecedentes 
 
 
14 
Tabla 6. Organofosforados restringidos en México (CICOPLAFEST)5 
Organofosforados 
restringidos en 
México 
(Tipo 
Toxicológico) 
Organofosforad
os prohibidos 
en México 
(Tipo 
Toxicológico) 
Organofosforados 
prohibidos en otros 
países y autorizados en 
México (Tipo 
Toxicológico) 
Forato (I) Cianofos (1) Azinfos Metílico (I) 
Metamidofos (I) EPN (1) Fosfamidón (I) 
Mevinfos (I) Formotion (1) Metidatión (I) 
Paratión etílico Paratión etílico 
(1) 
Ometoato (II) 
 Triamifos (1) Sulprofos (II) 
 Paratión Metílico (I) 
4.2 Microextracción en fase líquida (LPME) 
Los métodos de separación y extracción se han convertido a lo largo del tiempo 
en una herramienta bastante útil en el desarrollo de nuevos procedimientos en la 
química, ya sea como métodos de preparación de muestras o incluso como 
tratamientos subsecuentes en la síntesis de nuevos compuestos. Dentro de la 
química analítica, la búsqueda y desarrollo de nuevas técnicas de extracción 
capaces de mejorar los análisis en costo, tiempo y precisión, han sido un tema 
prioritario en los últimos años. Sin embargo, a pesar del desarrollo actual, la 
mayoría de los instrumentos analíticos no permiten el uso directo de las matrices 
naturales en las que se encuentran los analitos, por lo que es necesario introducir 
técnicas de preparación de muestra en los procesos de análisis, las cuales pueden 
afectar negativamente el análisis. A pesar de que mediante su empleo es posible 
aislar y pre concentrar a los analitos de interés, logrando también incorporarlos a 
un medio compatible con los instrumentos para su determinación analítica final. 
La Microextracción en fase líquida surge a partir del desarrollo y evolución de 
técnicas convencionales, como la extracción líquido-líquido, que requiere el 
empleo de disolventes orgánicos tóxicos de alta pureza en grandes cantidades, 
además de utilizar tiempos largos para obtener la mayor cantidad de analito. 
Aunque algunas de sus desventajas se han ido superando a lo largo del tiempo, 
Antecedentes 
 
 
15 
su operación en múltiples etapas, y problemas de formación de emulsiones la 
vuelven poco atractiva diferentes áreas donde ésta puede utilizarse. 
La LPME es una técnica a escala de la extracción líquido-líquido y representa un 
avance reciente en el campo de preparación de muestras. Combina 
simultáneamente y en un solo paso, la extracción, concentración y limpieza de la 
muestra. Una característica importante de estos procedimientos es que casi todo 
el disolvente orgánico con el que se extraen los analitos se puede inyectar en los 
instrumentos de separación, mientras que solamente parte del disolvente se 
inyecta cuando se usa la extracción líquido-líquido. A diferencia de los métodos 
clásico de extracción, en ésta se reduce el consumo de disolventes en gran 
medida, lo que implica una exposición menor por parte de los analistas. 
Esta técnica de extracción surgeen 1996 con el desarrollo de un sistema en el 
que una gota de disolvente orgánico se formaba dentro de una gota acuosa más 
grande, realizado por Liu y Dasgupta. Después se introdujo una nueva técnica de 
microextracción por Jeannot y Cantwell en la que una micro-gota de disolvente 
orgánico se suspendía de un tubo de teflón inmerso en una disolución acuosa en 
agitación.20 
Actualmente, la gota de disolvente orgánico queda suspendida de la punta de una 
jeringa para cromatografía y es colocada dentro de la disolución acuosa. Esta 
técnica es conocida como SDME (single-drop microextraction).18 El problema 
principal de esta técnica es que la micro-gota suspendida de la punta de la aguja 
de la jeringa se desplaza fácilmente por la agitación de la muestra acuosa, por lo 
que mantenerla cerca de la jeringa es casi imposible. Además, la microextracción 
a base de gota funciona mejor con matrices limpias, ya que partículas o burbujas 
presentes en la muestra pueden afectar la extracción al volver inestable a la gota, 
sin mencionar que las partículas son potencialmente perjudiciales para el 
instrumento analítico. 
 
Antecedentes 
 
 
16 
4.3 Microextracción en fase líquida con fibra hueca (HF-LPME) 
4.3.1 Descripción y fundamentos de la técnica 
La HF-LPME se desarrolló en la década de los 90´s en la universidad de Oslo 
Noruega por Pedersen-Bjergaard y Rasmussen21. Con el propósito de mejorar la 
microextracción en fase líquida con la gota de disolvente orgánico22. 
Esta configuración utiliza una fibra hueca y porosa colocada en el extremo de una 
jeringa de cromatografía y que contiene a la fase aceptora (Orgánica). 
 
Figura 5. Arreglo básico de HF-LPME 
 
Existen dos tipos de sistemas totalmente compatibles con este tipo de técnica, 
ambos son descritos a continuación: 
 
 
 
Antecedentes 
 
 
17 
Sistema de dos fases 
El sistema HF-LPME en dos fases (figura 6) permite que los analitos de interés 
sean extraídos desde una matriz acuosa (fase donadora). Hacia un disolvente 
orgánico (fase aceptora) presente en las paredes porosas dentro del lumen de la 
fibra hueca. Este procedimiento es compatible con GC y MS23, y se ilustra con la 
siguiente ecuación: 
𝐴 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 ↔ 𝐴 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑎𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜𝑟𝑎 Ecuación 1 
Donde el analito de interés es representado por A y que se encuentra distribuido 
según sus propiedades entre la muestra y la fase aceptora. El coeficiente de 
distribución de A está definido por: 
𝐷𝑎𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜𝑟/𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 = 
𝐶𝑒𝑞,𝑎𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜𝑟
𝐶𝑒𝑞,𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
= 𝛼𝐷 ∙ 𝐾𝑎𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜𝑟/𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 Ecuación 2 
 
Sistema de tres fases 
En este sistema HF-LPME (figura 6), al igual que en el de dos fases, los analitos 
de interés pueden ser extraídos desde una muestra acuosa (fase donadora) hacia 
un disolvente orgánico impregnado en las paredes de la fibra (fase intermedia) y 
subsecuentemente pasarán a una disolución acuosa dentro de la fibra (fase 
aceptora) para completar el proceso.24 Este modo de extracción es limitado para 
analitos ácidos y básicos con grupos funcionales ionizables, por lo queen estos 
casos es importante ajustar el pH tanto en la muestra como en la fase aceptora, lo 
que complica el estudio. Al obtener una disolución acuosa al final de la extracción, 
el análisis posterior es totalmente compatible con HPLC Y CE.23 Este proceso se 
ilustra con la siguiente ecuación. 
𝐴 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 ↔ 𝐴 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑜𝑟𝑔á𝑛𝑖𝑐𝑎 ↔ 𝐴 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑎𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜𝑟𝑎 Ecuación 3 
Donde el analito de interés es representado por A y que se distribuye según sus 
propiedades entre la muestra, la fase orgánica y la fase aceptora. 
Antecedentes 
 
 
18 
 
Figura 6. Sistemas utilizados en HF-LPME26 
Ambos sistemas se pueden desarrollar con dos tipos de configuración conocidos y 
creados para aprovechar en gran medida este tipo de técnica. La primera 
generada a partir del desarrollo de la técnica por parte del equipo de Pedersen-
Bjergaard y Rasmussen (figura 7) y la segunda desarrollada por Lee y sus 
colaboradores 
 
Figura 7. Configuración de la instrumentación para HF-LPME desarrollada por 
Pedersen-Bjergaard y Rasmussen23 
Antecedentes 
 
 
19 
En este modo de empleo (figura 7), se utiliza una fibra conectada por los extremos 
con una jeringa, dentro de ésta se adiciona la disolución aceptora mediante una de 
las jeringas, mientras que la segunda se utiliza para recolectar o extraer la fase 
aceptora junto con los analitos recabados después de la extracción. El sistema es 
completado al introducir la fibra y las puntas de las jeringas en un vial que contiene 
a la fase donadora. 
 
Figura 8. Configuración de la instrumentación para HF-LPME desarrollada por el 
equipo de Lee25 
La configuración creada por Lee (figura 8), utiliza un trozo de fibra conectada con 
una jeringa en el extremo superior, el extremo inferior se expone directamente a la 
disolución acuosa contenida en un vial para extraer los analitos. La jeringa 
utilizada introduce la fase aceptora en la fibra y extrae la misma disolución una vez 
terminado el proceso. Una de las ventajas más importantes con el uso de la fibra 
hueca, es que el disolvente orgánico o fase aceptora, se encuentra protegida y la 
velocidad de agitación se puede aumentar en gran medida si temor a perder los 
analitos. 
 
 
 
Antecedentes 
 
 
20 
4.3.2 Factores que afectan la eficiencia de la HF-LPME 
La microextracción en fase líquida es una técnica de extracción al equilibrio donde 
la concentración de analito en la fase aceptora incrementa hasta un nivel máximo 
y permanece en equilibrio, por lo anterior no es considerada como una técnica 
exhaustiva de análisis tal como la extracción líquido-líquido tradicional y la 
extracción en fase sólida. Al igual que otras técnicas, La HF-LPME se afecta por 
varios factores que en mayor o menor medida determinan su eficiencia. 
El fenómeno de difusión o migración de los analitos contenidos en la fase 
donadora, hacia la fase aceptora es un parámetro importante dentro de la técnica, 
algunos de los factores que intervienen directamente en este proceso son: la 
velocidad de agitación, la temperatura, tiempo, la disolución acuosa (pH, fuerza 
iónica y volumen), el tipo y el volumen de fase orgánica utilizada, el tipo de 
material con el que están hechas las fibras, así como el sistema utilizado (dos o 
tres fases) y la configuración empleada. 
Velocidad de Agitación 
Una velocidad de agitación adecuada puede favorecer la transferencía de los 
analitos hacia la fase orgánica. Aunque el tiempo de equilibrio es inversamente 
proporcional a la velocidad de agitación, una agitación excesiva puede afectar la 
precisión de los resultados.28 Tomando en cuenta que la fibra protege a la fase 
aceptora, las velocidades de agitación que se pueden utilizar son cada vez 
mayores, por lo tanto el tiempo de equilibrio y de la extracción como tal tiende a 
disminuir. 
Temperatura 
El principal efecto de la temperatura en el proceso es la capacidad de aumentar la 
solubilidad de los analitos en la fase acuosa, impidiendo su difusión hacia la fase 
orgánica. También puede afectar la viscosidad de los líquidos, que disminuye 
cuando aumenta su temperatura lo que favorece el proceso de transferencia de 
masa. Sin embargo, la solubilidad de disolventes en agua se incrementa conforme 
Antecedentes 
 
 
21 
aumenta la temperatura, lo que favorece la mezcla de la fase aceptora y la 
donadora y en consecuencia, la eficiencia de la extracción se ve perjudicada.27 
 
Fase aceptora 
El disolvente utilizado debe ser poco miscible en la fase acuosa y debe ser 
compatible con los analitos de interés (coeficiente de partición elevado) y con la 
fibra. Debe ser un disolvente volátil de baja masa molar para que favorecer la 
introducción de los analitos en el sistema cromatográfico. Adicionalmente, deberá 
tener unabaja toxicidad para reducir los riesgos a la salud de los analistas y 
minimizar los posibles efectos de contaminación ambiental. 
Disolución donadora (pH y matriz) 
El pH de la disolución acuosa que participa en el proceso afecta principalmente, el 
sistema de tres fases debido a que esta limitado para analitos con propiedades 
ácido-base (con grupos funcionales ionizables). Debido a que participan dos fases 
acuosas, el pH debe ajustarse en ambas para permitir el paso entre las tres fases. 
En la primera etapa los analitos beben permanecer en estado neutro, con lo que 
se evita que sean compatibles con la fase acuosa inicial (muestra) y de esta 
manera pasen a la fase orgánica contenida en el lumen de la fibra. Una vez 
retenidos en la segunda fase, el pH de la fase aceptora debe ajustarse para que 
los analitos sean compatibles con ella, es decir permanezcan en un estado 
ionizado y sean solubles en la tercera fase. Para el sistema de dos fases es 
necesario ajustar el pH solo en la disolución donadora. Las sales y los sólidos 
contenidos en la disolución acuosa pueden afectar el proceso, la adición de sales 
se puede reducir la solubilidad de los analitos y favorecer su migración hacia la 
fase orgánica, por lo que la fuerza iónica es otro parámetro que interviene en el 
estudio.29,30,31,32,33,34 
 
Antecedentes 
 
 
22 
Tiempo de extracción 
El tiempo invertido en cualquier tipo de extracción es un parámetro importante ya 
que la transferencia de masa entre ambas fases aumenta proporcionalmente 
hasta llegar a un estado de equilibrio en donde la concentración de analito 
permanece constante. Es importante considerar que si se invierte un tiempo largo 
la eficacia de la extracción no será mayor, por lo que un tiempo aproximado para 
llegar al equilibrio será de 15 a 45 minutos, al utilizar volúmenes pequeños de 
ambas fases.28 Los tiempos cortos impedirían llegar al estado de equilibrio con lo 
que los analitos quedarían repartidos entre ambas fases. En la práctica, los 
tiempos de extracción se fijan en un punto en el que la sensibilidad y la precisión 
se maximicen a lo largo de un tiempo experimental aceptable.18,24 
Fibra 
El tipo de material con el que están hechas las fibras y su compatibilidad con los 
analitos de interés es un factor importante que se debe considerar en el proceso. 
El tamaño de los poros y el diámetro de la fibra, así como su longitud, son otros 
factores involucrados. 
Volumen de las fases acuosa y orgánica. 
 El recobro (R) de los analitos de interés depende de la relación de volúmenes 
entre ambas fases, según la siguiente ecuación: 
𝑅 =
𝐾𝑜𝑟𝑔á𝑛𝑖𝑐𝑜/𝑎𝑐𝑢𝑜𝑠𝑜𝑉𝑜𝑟𝑔
𝐾𝑜𝑟𝑔á𝑛𝑖𝑐𝑜/𝑎𝑐𝑢𝑜𝑠𝑜𝑉𝑜𝑟𝑔+𝑉𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
×100% Ecuación 4 
El volumen de la fase orgánica incluye al disolvente inmovilizado dentro de las 
paredes de la fibra hueca. Este volumen generalmente se encuentra en el 
intervalo de 5 a 30 L. En HF-LPME de dos fases, el volumen de disolvente 
orgánico usado como fase aceptora dentro de la fibra suele ser de entre 2 a 30 L. 
En total, el volumen de disolvente orgánico empleado en cada análisis varía entre 
10 a 40 L. Los volúmenes pequeños de muestra favorecen la obtención de 
recobros más altos para extracciones al equilibrio.24 
Antecedentes 
 
 
23 
Uno de los grandes retos en el desarrollo de esta técnica es incluir un equipo que 
permita realizar extracciones en secuencia ya que, a diferencia de otras técnicas 
como SPME y SDME, en los cuales no existe tanta dependencia manual por parte 
del analista, en HF-LPME esta dependencia es un factor importante en el proceso 
e influye directamente en él. Dada la versatilidad de la técnica, estudios actuales 
han generado metodologías semi-automatizadas que permiten, en la medida de lo 
posible, realizar un mayor número de extracciones con alto nivel de precisión, 
repetibilidad y reproducibilidad, linealidad y robustez. Uno de los sistemas semi-
automatizados realizados actualmente por Zhao y Lee, permite introducir e 
inyectar la fase orgánica en a jeringa mediante un sistema de bombeo que 
controla el embolo.22 
De manera paralela se ha desarrollado otro sistema semiautomatizado de HF-
LPME, que consiste en colocar una fibra en forma de U con un extremo sujeto a 
un microembudo de acero inoxidable y el otro se mantiene abierto en una pequeña 
abertura del septum de un vial que contiene todo el proceso de extracción.35 La 
única diferencia de esta técnica con otras, es que el vial estará conectado 
directamente a la fibra, por consecuencia el uso de estos viales permite utilizar un 
equipo GC con automuestreador. Otra configuración utiliza la misma fibra en 
forma vertical con un extremo de la fibra conectado a una micropipeta sujeta a la 
tapa de un vial (figura 9). 
Antecedentes 
 
 
24 
 
Figura 9. Sistema automatizado de HF-LPME36 
4.4 Tamiz neonatal y muestras de sangre seca 
Es un procedimiento clínico preventivo realizado en los recién nacidos para la 
detección oportuna de enfermedades congénitas y así evitar daños graves a la 
salud de los mismos.42 Esta técnica fue desarrollada en 1963 por Robert Guthrie y 
establecida bajo los principios formulados por Wilson y Jungner. Dicha prueba 
consiste en recolectar seis gotas de sangre capilar del talón del bebe entre un 
periodo de 48 a 72 horas después del nacimiento por sugerencia de los médicos, 
debido que al iniciar la alimentación a través de la leche materna, los resultados 
generados por este procedimiento podrían proporcionar falsos positivos y 
negativos.39 La sangre se recolecta en un papel filtro especial hecho de fibras de 
algodón, conocido como la tarjeta de Guthrie, la muestra se deja secar al aire 
durante un periodo de tiempo a temperatura ambiente, para después proceder a 
realizar los análisis necesarios.41 
 
Antecedentes 
 
 
25 
El tamiz neonatal en México se realiza desde 1974, cuando Velázquez y sus 
colaboradores introdujeron esta práctica preventiva después de recibir un 
entrenamiento con Guthrie y Susi, que fueron los creadores del tamiz.38 
Aunque esta técnica fue creada inicialmente para la detección de tres 
enfermedades principalmente: fenilcetonuria, hipotiroidismo y toxoplasmosis 
congénita, siguiendo los estándares internacionales y las evidencias científicas 
que existían en ese momento, en años recientes, el avance de la ciencia y la 
tecnología han permitido que el tamiz neonatal se realice para un número cada 
vez mayor de enfermedades. Actualmente es posible la detección de 100 
enfermedades al menos teóricamente, sin incluir los estudios actuales para el 
tamiz de condiciones tales como: inmunodeficiencia combinada severa, 
enfermedades lisosomales y el síndrome X frágil, entre otras.40 
En 1988 se estableció la primera norma técnica mexicana que hizo obligatoria la 
realización del tamiz en todas las instituciones que atienden a recién nacidos y en 
1995 se transformó en Norma Oficial Mexicana, aunque éstas solo contemplaron 
de manera obligatoria la detección del hipotiroidismo congénito.41 En el año de 
2001 se emitió una nueva norma sobre la prevención de defectos al nacimiento, 
en la que solo se recomienda (pero no se establece como obligatoria) la detección 
de errores innatos del metabolismo, la lista de enfermedades generada por esta 
norma comprende las siguientes enfermedades: fenilcetonuria, hiperplasia 
suprarrenal congénita, galactosemia, fibrosis quística, enfermedad de orina de 
jarabe de maple, homocistinuria e hipotiroidismo congénito. Este programa se 
encuentra contemplado en la Norma Oficial Mexicana NOM-034-SSA2-2002 y 
regulado actualmente por el Centro Nacional de Equidad de Género y Salud 
Reproductiva de la Secretaría de Salud.43 
 
 
 
Antecedentes 
 
 
26 
Con el grado de desarrollo que cada país tiene es inevitable tener gran 
variabilidad en las técnicas utilizadas y en el número de enfermedadesque se 
pueden detectar vía tamiz neonatal. A continuación se muestran en la tabla 7 
algunos datos relevantes respecto al tipo de metodologías que se utilizan y el tipo 
de enfermedades que se detectan en algunas instituciones de salud en nuestro 
país (tabla 8).38 
Tabla 7. Tamiz neonatal. Metodologías utilizadas por institución. México, 2008.38 
Técnicas 
utilizadas 
SSA IMSS ISSSTE PEMEX SEDENA 
ELISA o DELFIA x x 
Microelisa x x 
Espectrometría 
de masas en 
tándem 
 x 
Electroforesis por 
isoelectroenfoque 
 x 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Antecedentes 
 
 
27 
Tabla 8. Enfermedades detectadas via tamiz por institución.38 
Enfermedad SSA IMSS ISSSTE PEMEX SEDENA 
Estimación del 
número de 
nacimientos en 
cada institución 
(2005) 
743 
651 
456 
453 
82 628 8 
853 
5 902 
Hipotiroidismo 
congénito 
x x x x x 
Hiperplasia 
suprarrenal 
congénita 
 x x 
Aminoacidopatías x(fenilceto
nuria solo 
en algunas 
unidades 
médicas) 
x(fenilceto
nuria solo 
en algunas 
unidades 
médicas) 
x 
Acidemias 
orgánicas 
 x 
Defectos de 
oxidación de ácidos 
grasos 
 x 
Galactosemia x 
Hemoglobinopatías x 
Deficiencia de 
biotinidasa 
 x x 
Fibrosis quística x 
Toxoplasmosis x 
 
Ante estas diferencias, diversas organizaciones internacionales se han 
manifestado a favor del correcto establecimiento de los programas de tamiz 
neonatal. 
La Academia Americana de Pediatría ha fijado su postura sobre el tamiz ampliado, 
en la que se recomienda la detección de 28 enfermedades metabólicas más el 
tamiz auditivo en todo recién nacido en Estados Unidos de America, debido a que 
Antecedentes 
 
 
28 
al encontrar una gran diversidad de técnicas utilizadas por cada institución de 
salud, los diagnósticos revelados por los médicos pueden ser ineficaces e incluso 
erróneos, al no contar con los instrumentos y equipos adecuados para revelar un 
esquema integral de la salud de los recién nacidos.38 El tamiz neonatal ampliado 
se introdujo de manera oficial en Enero de 2013 junto con el tamiz auditivo al 
prematuro y el tamiz oftalmológico neonatal, en un decreto por el que se reforma 
el artículo 61 de la Ley General de Salud, aunque todavía no se practica con éxito 
en todo el país.37 
El tamiz neonatal es una de las aplicaciones más conocidas de análisis de 
muestras de sangre seca (dried blood spots, en inglés), que además de funcionar 
como una prueba preventiva en neonatos, también se utiliza para determinaciones 
toxicinéticas46 y farmacocinéticas47 así como en el monitoreo terapéutico de 
fármacos45, utilizando una amplia gama de técnicas y métodos analíticos propias 
del tamiz, técnicas cromatográficas, espectrometría de masas, así como sus 
diferentes variaciones y combinaciones. Este método es limitado en el análisis de 
compuestos volátiles dado que al introducirlos en el papel son sensibles a los 
cambios de temperatura en el proceso de secado que se utilice.18,48 
Además existen algunas consideraciones que deben tenerse al practicar este 
método de toma de muestra en el tamiz neonatal. Por ejemplo, se debe tener en 
cuenta el efecto del hematocrito en la viscosidad de la sangre y procurar que el 
volumen de las gotas de sangre sea constante en todos los casos, ya que estos 
factores pueden generar desviaciones de los valores reales que tienen las 
concentraciones de los analitos. Debido a las propiedades fisicoquímicas de la 
tarjeta de Guthrie, algunos analitos pueden permanecer en la superficie a menores 
concentraciones y permear la muestra a mayores concentraciones, dando como 
resultado un mayor recobro a bajas concentraciones pero menor recobro a altas 
concentraciones del analito. Por esto es importante optimizar el método de 
extracción para efectuar el tamiz neonatal.52 
Antecedentes 
 
 
29 
Algunas de las ventajas en el uso de muestras de sangre seca son: es posible 
tener acceso a información fisiológica que no estaría disponible fuera de un 
ambiente clínico, pueden ser tomadas por personas con poco entrenamiento 
médico y su transporte no requiere de condiciones especiales por lo que pueden 
ser enviadas por paquetería o mediante el servicio postal. Las grandes 
desventajas de usar este método, es que la mayoría de los análisis clínicos 
requieren suero o plasma y no son directamente comparables, dado que la 
fracción celular de la sangre se remueve cuando es sometida a la centrifugación. 
Lo anterior hace necesario desarrollar nuevas metodologías para cuantificar 
analitos en muestras de sangre seca y validar su precisión, linealidad, robustez y 
límites de detección y cuantificación. Además, actualmente no son comunes los 
equipos para realizar pruebas automatizadas en estas muestras. Otro punto 
importante es que el pequeño volumen de muestra contenido en un círculo de 
sangre seca puede ser una limitación insuperable para el análisis de algunos 
compuestos que requieren altas cantidades de sangre, especialmente en las 
etapas tempranas de investigación, cuando aún no se han desarrollado 
metodologías más sensibles. Pocos son los laboratorios de análisis clínicos que 
tienen experiencia con el manejo de este tipo de muestras para analitos diferentes 
a los estudiados rutinariamente en la prueba del tamiz neonatal, por lo que es 
posible que sea difícil encontrar uno que pueda analizarlas.48,49,50,51 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Antecedentes 
 
 
30 
4.5 Fibra hueca 
La fibra utilizada está hecha de polipropileno y es la más común para análisis de 
pesticidas, aunque también existen fibras de otros polímeros como; 
politetrafluoroetileno y difluoruro de polivinilideno. El costo que representan es 
muy pequeño, además de que se puede utilizar una fibra para cada análisis. El 
uso de este tipo de fibras incluye a muchos tipos de contaminantes ambientales, y 
el análisis de matrices biológicas.26,53,54 
 
 
Figura 10. Micrografía de las paredes de la fibra de polipropileno.24 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Antecedentes 
 
 
31 
4.6 Cromatografía de gases55,56,57,58,59 
La cromatografía de gases es un método físico de separación en el cual los 
componentes de una mezcla, son distribuidos entre dos fases, una de las cuales 
se denomina estacionaria (columna), mientras que la otra se mueve en una 
dirección definida y es denominada como fase móvil (gas acarreador). De acuerdo 
con su utilidad esta técnica se clasifica en analítica, ya que se utiliza para 
determinar los compuestos químicos presentes y su concentración en una 
mezcla. En dicha técnica los analitos introducidos en el sistema son volatilizados 
rápidamente y son transportados por el flujo de gas, para efectuar la separación se 
establece un equilibrio de reparto de éstos entre ambas fases, el tiempo que 
permanecen dentro de la columna es proporcional a la afinidad que tengan con las 
fases, al eluir de la columna pasan al sistema de detección, el cual puede variar de 
acuerdo a su principio y que tiene como función la medición de los analitos en la 
corriente de gas , generar una señal y convertirla en una señal que se pueda 
asociar a una propiedad física representada en una gráfica llamada 
cromatograma. Un buen detector es altamente sensible, tiene una respuesta lineal 
sobre un amplio intervalo de concentraciones y es relativamente insensible a 
variaciones de flujo y temperatura. 
 
 
Figura 11. Esquema de una columna para cromatografía de gases18 
 
Antecedentes 
 
 
32 
Esta señal es elaborada por una comparación entre el gas acarreador puro 
(blanco) y el mismo gas llevando cada uno de los componentes previamente 
separados en la columna, esto se traduce en una señal eléctrica que es 
amplificada y registrada al momento de salir. Cada señal obtenida en el 
cromatograma aparece en forma de un pico y cada pico generalmente representa 
a un compuesto que ya logro su separación de la mezcla inicial. A dicha señalse 
le asigna un tiempo de retención y es característico de cada analito previamente 
determinado con disoluciones de estándares (figura 12). 
 
 
Figura 12. Cromatograma típico18 
 
Existen dos modalidades de trabajo en cromatografía de gases; cromatografía de 
gas-líquido (GLC) y cromatografía de gas-sólido (GSC). En la primera la fase 
estacionaria es un líquido impregnado en la superficie de un sólido inerte que 
actúa como soporte y donde el proceso se efectúa como una partición de analitos 
entre ambas fases. En la segunda, la fase estacionaria es un sólido adherido al 
mismo soporte en donde los analitos son retenidos por adsorción física. 
Antecedentes 
 
 
33 
 
Figura 13. Esquema de la instrumentación para cromatografía de gases59 
 
La instrumentación utilizada en cromatografía de gases se puede observar en la 
figura 13. El gas empleado debe ser químicamente inerte como helio o hidrógeno, 
disponibles en un tanque presurizado que utilizan reguladores de presión (10-50 
psi) y medidores de flujo (1-25 mL/min en columnas capilares). El puerto de 
inyección permite que la muestra sea introducida en el flujo del gas transportador, 
se sitúa en la entrada de la columna y contiene su propio sistema de 
calentamiento, además suele tener una membrana de caucho de silicona, que 
sella el sistema y donde solo puede introducirse una micro-jeringa hipodérmica. 
Posteriormente la muestra pasa al inserto que está hecho de vidrio y tiene dos 
configuraciones posibles (Split y Splitless). Enseguida pasa por la columna donde 
se presente el equilibrio y finalmente llega al detector, en donde las señales son 
recibidas y transformadas por un programa para que se puedan entender y utilizar 
como mejor sea posible. 
 
 
Antecedentes 
 
 
34 
4.7 Espectrometría de masas60,61,62 
La espectrometría de masa (EM) es una técnica de análisis cualitativo de amplio 
uso para la determinación de estructuras orgánicas, puede utilizarse por sí sola o 
en combinación con otras técnicas de análisis. La EM está basada en la obtención 
de iones a partir de la fragmentación de moléculas orgánicas en estado neutro y 
que son separados de acuerdo con su relación masa-carga para ser identificados 
por un sistema de detección. Un espectro de masas es una gráfica en dos 
dimensiones que relaciona la abundancia de los iones en función de su relación 
masa-carga. 
 
 
 
Figura 14. Esquema de un espectrómetro de masas clásico 
La instrumentación debe incluir cuatro partes principalmente: un sistema de 
introducción de muestra, cámara de ionización, un analizador para la separación 
de iones y un sistema de detección junto con un registrador. 
 
 
Antecedentes 
 
 
35 
Existen tres tipos de sistema de introducción de muestra: un primer tipo es el de 
Introducción Indirecta en donde la vaporización de la muestra se realiza en un 
recipiente de vidrio o metal, externo al espectrómetro que se mantiene a 
temperatura elevada y se utiliza para el análisis de gases, líquidos y sólidos 
sublimables. Los compuestos deberán poseer una presión igual o superior a 10-6 
mm de Hg y la muestra debe ser trabajada a una temperatura a la cual los 
compuestos no se pirolicen. Tambien existe el sistema de introducción directa que 
incorpora los compuestos mediante un capilar contenido en una varilla metálica la 
cual se conecta a la fuente de iones. Ambos sistemas directo e indirecto trabajan 
en alto vacío y poseen controladores de temperatura. Finalmente el sistema de 
introducción a partir de un cromatógrafo de gases que es uno de los más 
utilizados dado que la muestra se introduce en estado gaseoso y el cromatógrafo 
realiza una separación adicional de los componentes de una mezcla. 
La cámara de ionización ocupa principalmente dos métodos para producir la 
ionización de los compuestos en estado gaseoso. Por un lado la ionización por 
impacto o bombardeo electrónico, en donde la muestra es ionizada por medio de 
un haz de electrones producido por un filamento incandescente; estos electrones 
son acelerados por una diferencia de potencial variable entre el filamento y la 
fuente de iones, con lo que adquieren energías de 5 a 70 eV. Por otro lado la 
ionización química utiliza como agente ionizante un ion que transfiere su carga a 
los analitos por medio de una reacción bimolecular; para producir éste fenómeno 
se introduce metano en la fuente de iones a una presión de 1 mm de Hg, en estas 
condiciones los electrones ionizan a las moléculas de metano que por su parte 
genera una reacción con los analitos. 
En el extremo final de la cámara de ionizacion, se encuentra situado el analizador 
de masas, en donde se produce la separación de los iones. Los más utilizados 
son: el analizador magnético que utiliza un campo magnético perpendicular al 
movimiento de los iones que los obliga a cambiaria una trayectoria de tipo circular, 
el analizador cuadrupolar que tiene como principio generar un potencial constante 
sobre cuatro barras metálicas de sección circular o hiperbólica, paralelas y 
Antecedentes 
 
 
36 
dispuestas sobre una circunferencia, con esto se consigue que el haz de iones 
generado por la fuente incida sobre el dispositivo. El analizador de trampa de 
iones utiliza una zona de confinamiento electromagnética generada por dos 
señales de radiofrecuencia, se forma por tres electrodos de superficie hiperbólica 
que genera una cavidad en las que se produce la ionización, la fragmentación y el 
análisis de masas, en el cual es aplicado un potencial de radiofrecuencia para 
cada electrodo para generar un campo electromagnético cuadrupolar 
tridimensional en el que los iones quedan controlados y que siguen una trayectoria 
oscilante estable. 
El sistema de detección mide la corriente de iones de baja intensidad que sale del 
analizador y traduce la señal medida en otra entendible y trazable. El multiplicador 
de electrones es el más común ya que utiliza la energía cinética de los iones que 
inciden sobre una placa recubierta por óxidos de tierras raras, al chocar con la 
placa, ésta emite una corriente de electrones dirigidos a otra placa y así 
sucesivamente, se pueden utilizar hasta 16 placas lo que produce una 
amplificación de la corriente iónica generada por los impactos ocasionados. Todo 
el sistema descrito anteriormente se lleva a cabo en condiciones de alto vacio, del 
orden de 10-5 torr, de forma que la trayectoria que siguen lo iones al interior del 
espectrómetro es libre de colisiones. 
 
 
 
 
 
 
Desarrollo Experimental 
 
 
37 
5. DESARROLLO EXPERIMENTAL 
5.1 Materiales y preparación de la muestra 
 
Estándares 
Se utilizaron dos estándares analíticos los cuales se describen a continuación: 
1. Estándar ChemService OPP-8140JM con 1 mL de una mezcla de 20 OPPs 
con concentración 100 µg/mL cada uno y disueltos en diclorometano. 
 
2. Kit de estandares AccuStandard M-622-SET Ampolletas de 1 mL de 27 
estándares individuales con una concentración de 100 µg/mL disueltos en 
hexano 
 
A partir de los reactivo anteriores se prepararon disoluciones madre a una 
concentración de 10 µg/mL utilizando diclorometano (TEDIA > 99.9%) y hexano 
(Sigma-Aldrich > 95% grado HPLC) respectivamente. Para las disoluciones 
acuosas en la determinación de las condiciones óptimas de extracción y para la 
fase acuosa, se utilizó agua desionizada y acetona (CROMASOL > 99.5% grado 
pesticida). La fase orgánica utilizada fue Tolueno (J.F. Baker > 99.9%). 
5.2 HF-LPME y optimización de parámetros 
Se utilizaron fibras de polipropileno AccurelPP Q3/2 marca Membrana con un 
grosor de pared de 200 µm, un diámetro interno de 600 µm y un tamaño de poro 
de 2 µm. La longitud de la fibra utilizada fue de 2.2 cm que se conectó a la jeringa 
para líquidos de cromatografía de 10 µL (SGE Analytical Science) en la que 
previamente se adicionaron 5 µL de fase orgánica (tolueno). La fibra se amarrócon hilo comercial utilizado para zurcir prendas en la punta de la aguja para que 
quedara fija, luego se humedeció en tolueno por 20 segundos e inmediatamente 
se introdujo en el vial que contenía los estándares (optimización de parámetros de 
extracción) o la muestra acuosa de sangre fortificada tratada. En 5 mL de fase 
donadora agua:acetona (80:20). Pasado el tiempo establecido en la extracción, se 
Desarrollo Experimental 
 
 
38 
recuperaron los 5µL de tolueno desde la fibra y para el análisis se inyecto 1 µL de 
esta fase, desechando el resto. Se utilizaron viales de 5 mL con fondo cónico 
(Supelco) y un agitador triangular pequeño (1000 RPM), además de una parrilla de 
calentamiento y agitación (Super-Nouva, Barnstead Thermolyne). Los parámetros 
evaluados en el proceso de microextracción se muestran en la tabla 9 y el arreglo 
general se muestra en la figura 8. 
Tabla 9. Parámetros evaluados en HF-LPME 
Parámetro Valores analizados 
Temperatura de extracción (oC) 20, 30 y 40 
Tiempo de extracción (min) 10, 20 Y 30 
Secado Baño de agua (30 oC) y con N2 
(Infra) 
 
5.3 Tamiz neonatal y desorción de analitos 
En esta etapa de analis se utilizaron tarjetas modelo Whatman 903 y las muestras 
de sangre se tomaron utilizando lancetas Accu-Chek con un punzador de la misma 
marca. Los círculos contenidos en la tarjeta se llenaron dejando caer una gota 
normal 24 horas previo al análisis. Se utilizaron círculos de sangre seca cortados 
por una perforadora manual de 6 mm de diámetro para realizar las pruebas de 
desorción. 
Los círculos de sangre seca se colocaron en una caja de Petri donde fueron 
fortificados con el estándar mencionado, por medio de una micropipeta de 
repetición (Multipette plus Eppendorf) con puntas de 0.1mL. Posteriormente se 
dejó evaporar el disolvente por 30 segundos entre cada adición de 10 µL de 
estándar, una vez concluido el tiempo, el círculo fue transportado hacia un vial de 
fondo cónico que contenía la fase acuosa. La desorción se llevó a cabo mediante 
la agitación con vortex (IKA, Lab Dancer 2800 rpm) por un tiempo de 3 minutos. 
Finalmente el círculo de papel fue retirado y se realizaron análisis por triplicado 
para cada parámetro evaluado. 
Desarrollo Experimental 
 
 
39 
5.4 Equipo y análisis por GC-MS 
Para todos los análisis se utilizó un Cromatografo Agilent 5890 Series II Plus 
equipado con una columna Thermo TR-5MS 20 m x 0.18mm x 0.18 µm de película 
de fase estacionaria (95% dimetilarilenpolisiloxano- 5% fenilpolisilfenilensiloxano), 
inyección en modo splittless y un flujo de helio 0.5 mL/min. Las condiciones de 
temperatura del inyector y la línea de transferencia fueron de 300 oC. El programa 
de temperatura utilizado inició en 70 oC por un minuto, seguido de una rampa de 
calentamiento de 20 oC/min hasta 160 oC donde permaneció 3 minutos. Se 
continuó con una segunda rampa de calentamiento de 10 oC/min hasta 300 oC, 
donde permaneció por un minuto. Se estableció un Solvent Delay en el equipo de 
4:50 minutos, por lo que la adquisición de los datos comenzó una vez terminado 
este. 
El equipo de masas utilizado fue un espectrómetro de masas DE cuadrupolo 
sencillo con ionización electrónica (70 eV) Agilent modelo 5973 en modo SCAN 
para las pruebas de optimización de parámetros cromatográficos y de extracción, 
y en modo SIM (Monitoreo Selectivo de Iones) para las pruebas posteriores. La 
temperatura de la fuente de iones permaneció a 230oC y la del cuadrupolo a 
150oC. Los espectros de masas se obtuvieron en un intervalo de 50 a 400 uma. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Desarrollo Experimental 
 
 
40 
 
Tabla 10. Iones seleccionados para el método SIM 
Organofosforado Iones 
utilizados 
Organofosforado Iones 
utilizados 
Diclorovos 109, 145, 
185 
Fention 153, 169, 
278 
Fosdrin 127, 192, 
224 
Tricloronato 269, 297 
Profos 158, 200, 
242 
Tetraclorovinfos 240, 331, 
333 
Forato 121, 260 Tokution 162, 267, 
309 
Demeton-S 88, 171, 
258 
Butifos 169, 202, 
314 
Diazinon 152, 179, 
304 
Fensulfotion 265, 293, 
308 
Disulfoton 186, 274, 
142 
Sulprofos 188, 312, 
354 
Fenclorofos 125, 285, 
287 
Gution 132, 160 
Metil paration 246. 263 Coumafos 109, 226, 
362 
Clorpirifos 197, 258, 
314 
 
 
 
 
 
 
Desarrollo Experimental 
 
 
41 
 
5.5 Parámetros estadísticos 
5.5.1 Límite de detección 
Se determinó el límite de detección para los analitos realizando siete repeticiones 
con círculos de sangre de 6 mm de diámetro, a los cuales se adicionaron 100 µL 
disolución estándar a 1 ppm (10 µL cada 30 segundos). Considerando que se dejó 
evaporar el disolvente y que el volumen de cada gota de sangre es de 50 µL (cita), 
la concentración final calculada con la ecuación (X) es de 2 µg/mL. 
1
µg
mL
𝑥
100µL
50µL
= 2µg/mL Ecuación 8 
 
Para realizar el cálculo del límite de detección se utilizaron las siguientes 
ecuaciones: 
𝐿𝐷á𝑟𝑒𝑎 = 𝑡 (𝛼 = 0.95, φ = 6)𝑥
𝜎
⎷7
 Ecuación 9 
Donde el factor de cobertura t de student se utilizó al 95% de confianza con seis 
grados de libertad. El factor de respuesta se obtuvo al dividir el área promedio de 
las siete repeticiones entre la concentración de estándar utilizada. Obteniendo 
como primer dato el límite de detección en función del área obtenida de cada pico. 
𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑠𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑎 =
𝐴𝑟𝑒𝑎 𝑝𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑢𝑡𝑖𝑙𝑖𝑧𝑎𝑑𝑎
 Ecuación 10 
Desarrollo Experimental 
 
 
42 
Finalmente el límite de detección en función de la concentración se obtuvo 
dividiendo el límite de detección en función del área obtenida para cada 
compuesto entre el factor de respuesta calculado 
𝑳𝑫𝒄𝒐𝒏𝒄𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂𝒄𝒊ó𝒏 =
𝑳𝑫𝒂𝒓𝒆𝒂
𝑭𝒂𝒄𝒕𝒐𝒓 𝒅𝒆 𝒓𝒆𝒔𝒑𝒖𝒆𝒔𝒕𝒂
 Ecuación 11 
5.5.2 Intervalo lineal 
Se realizaron curvas de calibración utilizando círculos de papel (tarjeta) del mismo 
tamaño con y sin gota de sangre, a los cuales se adiciono un volumen de 
disolución estándar a 10 µg/mL y dejando evaporar el disolvente cada 30 
segundos por cada 10 µL adicionados. Tomando en cuenta el volumen que se 
utilizó la gota de sangre (5 0µL), el volumen adicionado en cada punto se 
estableció para obtener concentraciones de 0 hasta 10 µg/mL. Cada punto se 
realizó por duplicado considerando que el procedimiento utilizado influiría en la 
linealidad del sistema. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Desarrollo Experimental 
 
 
43 
5.5.3 Reproducibilidad intermedia 
Este proceso se llevó a cabo con el apoyo de un compañero entrenado en el 
análisis por HF-LPME, realizando el mismo procedimiento utilizado en el punto 5 
de la curva de calibración con gota de sangre. Para la evaluación de este 
parámetro este parámetro, el análisis se llevó a cabo con los mismos 
instrumentos, equipos y condiciones de operación. 
5.5.4 Recobro relativo 
Dado que los resultados obtenidos en los parámetros anteriores no son muy 
precisos, se decidió comparar el promedio de dos inyecciones directas a una 
concentración de 10 µg/mL con el promedio de dos inyecciones obtenidas de la 
extracción a la misma concentración. 
 
 
 
 
 
 
Resultados y Análisis de datos 
 
 
44 
6. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE DATOS 
6.1 Separación de los compuestos 
La separación obtenida en el análisis por cromatografía de gases se llevó a cabo 
en el programa de temperatura que se muestra a continuación: 
 Temperatura inicial de 70 oC por un minuto 
 1era rampa; 20 oC/min hasta 160 oC 
 3 minutos a 160 oC 
 2da rampa; 10 oC/min hasta 300 oC 
 1 minuto a 300 oC 
 
 
Figura 15. Cromatograma de separación a 1 µg/mL por inyección directa en modo 
SCAN. 
 
 
 
 
 
 
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
4 8 12 16 20 24
A
b
u
n
d
an
ci
a
Tiempo (min)
Resultados y Análisis de datos 
 
 
45 
 
 
 
Figura 16. Cromatograma de separación a 1 µg/mL por inyección directaen modo 
SIM 
 
 
Figura 17. Cromatograma de extracción de OPPs a 5 ppm en modo SIM (con 
muestra de sangre seca) 
 
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
4 8 12 16 20 24
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b
u
n
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an
ci
a 
Tiempo (min)
0
2000
4000
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8000
10000
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14000
16000
18000
20000
4 8 12 16 20 24
A
b
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d
an
ci
a
Tiempo (min)
Resultados y Análisis de datos 
 
 
46 
 
 
Figura 18. Cormatograma de extracción de OPPs a 5 ppm (sin muestra de sangre 
seca) 
El programa de temperatura permitió en la medida de los posible separar e 
identificar a la mayoría de los compuestos de interés. Las figuras 15, 16, 17 y 18 
representan los espectros que reflejan una mejor separación a diferentes 
concentraciones y en modo de trabajo distinto, aunque se puede observar tres 
parejas de compuestos que se encuentran sobrelapados dado que son 
compuestos con estructura química muy aparecida, por lo que co-eluyen dos 
parejas de compuestos en este caso. Para el modo SIM se eligieron iones que no 
compartieran dichos compuestos. 
6.2 Optimización de los parámetros para las microextracciones 
 
6.2.1 Optimización de la temperatura de extracción 
Para determinar temperatura óptima para este análisis, se tomó en cuenta que las 
condiciones del medio ambiente impedirían establecer temperaturas inferiores 
ellas. Tomando esto como referencia, así como las temperaturas de ebullición de 
los disolventes utilizados y referencias en el análisis de pesticidas 
organofosforados, se decidió evaluar la temperatura desde 20 hasta 40 oC. 
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
4 8 12 16 20 24
A
b
u
n
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an
ci
a
Tiempo (min)
Resultados y Análisis de datos 
 
 
47 
Los resultados obtenidos fueron tratados evaluando el coeficiente de variación con 
la desviación estándar y el área promedio de los triplicados realizados. Las figuras 
19, 21 y 23 muestran la áreas obtenidas de cada compuesto para los tres valores 
de temperatura. Las figuras 20, 22 y 24 muestran los coeficientes de variación 
obtenidos para cada compuesto en los tres valores de tempreratura utilizados. La 
figura muestran una desviación estándar baja, un área promedio mayor y por lo 
tanto un coeficiente de variación bajo para el análisis realizado a 30 oC en la 
mayoría de los casos. Los resultados obtenidos a 20 y a 40 oC comparados con 
30 oC, muestran coeficientes de variación mayor y por ende áreas de pico 
menores, así como valores de desviación estándar altos. 
 
Figura 19. Optimización de la temperatura de extracción (1-5) 
 
 
 
 
 
 
 
0
5000
10000
15000
20000
25000
15 20 25 30 35 40 45
A
re
a 
p
ro
m
e
d
io
 (
u
a)
Temperatura (◦C)
Diclorovos
Fosdrin
Profos
Forato
Demeton-S
Resultados y Análisis de datos 
 
 
48 
 
 
Figura 20. Coeficiente de variación para diferentes temperaturas de extracción 
(1-5) 
 
Figura 21. Optimización de la temperatura de extracción (6-11) 
 
 
 
 
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
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15 20 25 30 35 40 45
C
o
e
fi
ci
e
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te
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e
 v
ar
ia
ci
ó
n
 (
%
)
Temperatura (◦C)
Diclorovos
Fosdrin
Profos
Forato
Demeton-S
0
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30000
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A
re
a 
p
ro
m
e
d
io
 (
u
a)
Temperatura (◦C)
Diazinon
Disulfoton
Metíl Paration
Fenclorofos
Clorpirifos
Fention
Resultados y Análisis de datos 
 
 
49 
 
 
Figura 22. Coeficiente de variación para diferentes temperaturas de extracción 
(6-11) 
 
 
Figura 23. Optimización de la temperatura de extracción (12-17) 
 
 
 
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
15 20 25 30 35 40 45
C
o
e
fi
ci
e
n
te
 d
e
 v
ar
ia
ci
ó
n
 (
%
)
Temperatura (◦C)
Diazinon
Disulfoton
Metíl Paration
Fenclorofos
Clorpirifos
Fention
0
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10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
15 20 25 30 35 40 45
A
re
a 
p
ro
m
e
d
io
 (
u
a)
Temperatura (◦C)
Tricloronato
Tokution
Butifos
Sulprofos
Gution
Cumafos
Resultados y Análisis de datos 
 
 
50 
 
 
Figura 24. Coeficiente de variación para diferentes temperaturas de extracción 
(12-17) 
 
6.2.2 Optimización del tiempo de extracción 
La determinación del tiempo de extracción adecuado para el análisis por HF-
LPME, muestra una diferencia muy marcada puesto que a medida que se 
aumentó el tiempo, la señal de los compuestos empieza a decrecer, incluso en la 
mayoría de los casos se perdían los analitos de interés, por lo que no se lograron 
identificar. Las figuras 25, 26 y 27 muestran las áreas obtenidas para cada 
compuesto, cabe resaltar que se observa una tendencia negativa a media que 
aumenta el tiempo. En la figura 28 se presenta los valores de coeficiente de 
variación obtenidos, solo son presentados 4 compuestos por que la mayoría se 
perdieron en el proceso 
 
 
 
 
 
0
20
40
60
80
100
120
140
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15 20 25 30 35 40 45
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fi
ci
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n
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 v
ar
ia
ci
ó
n
 (
%
)
Temperatura (◦C)
Tricloronato
Tokution
Butifos
Sulprofos
Gution
Cumafos
Resultados y Análisis de datos 
 
 
51 
 
 
 
Figura 25. Optimización tiempo de extracción (1-5) 
 
 
Figura 26. Optimización tiempo de extracción (6-11) 
 
 
 
0
5000
10000
15000
20000
25000
5 10 15 20 25 30 35
A
re
a 
p
ro
m
e
d
io
 (
u
a)
Tiempo (min)
Diclorovos
Fosdrin
Profos
Forato
Demeton-S
0
10000
20000
30000
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5 10 15 20 25 30 35
A
re
a 
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 (
u
a)
Tiempo (min)
Diazinon
Disulfoton
Metíl Paration
Fenclorofos
Clorpirifos
Fention
Resultados y Análisis de datos 
 
 
52 
 
 
 
Figura 27. Optimización tiempo de extracción (12-17) 
 
 
Figura 28. Coeficiente de variación para diferentes tiempos de extracción 
(4 compuestos) 
 
 
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
5 10 15 20 25 30 35
A
re
a 
p
ro
m
e
d
io
 (
u
a)
Tiempo (min)
Tricloronato
Tokution
Butifos
Sulprofos
Gution
Cumafos
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
5 10 15 20 25 30 35
C
o
e
fi
ci
e
n
te
 d
e
 V
ar
ic
ac
ió
n
 (
%
)
Tiempo (min)
Forato
Fention
Butifos
Gution
Resultados y Análisis de datos 
 
 
53 
6.2.3 Secado previo a la extracción 
Los métodos de secado utilizados en el análisis proporcionan resultados muy 
variados ya que al utilizar nitrógeno, se obtienen picos de mayor intensidad y por 
ende áreas más grandes para algunos organofosforados en particular (forato, 
disulfoton, metíl paration, fention), a diferencia del secado en baño de agua. La 
desventaja encontrada al utilizar nitrógeno es que también se obtienen 
coeficientes de variación más altos, por lo que los resultados son inciertos. Las 
figuras 29 y 30 muestran que un baño de agua complementario obtiene áreas 
promedio de mayor intensidad. El uso de un secado complementario se evaluó 
dado que las disoluciones estándar utilizadas no son compatibles con la fase 
aceptora y por consecuencia la técnica de extracción se podía ver afectada 
 
 
Figura 31. Optimización del secado previo a la extracción (comparación) 
 
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
100000
D
ic
lo
ro
vo
s
Fo
sd
ri
n
P
ro
fo
s
Fo
ra
to
D
e
m
e
to
n
-S
D
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zi
n
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Baño de agua
Secado con
Nitrogeno
Area 
promedio
Resultados y Análisis de datos 
 
 
54 
 
Figura 30. Coeficiente de variación del secado previo a la extracción 
(comparación) 
 
Reproducibilidad Intermedia 
La reproducibilidad en este método se pudo comparar con el análisis realizado en 
las mismas condiciones operativas con la ayuda de un compañero entrenado 
(Analista 2). Las gráficas mostradas indican una mayor dispersión de los datos 
obtenidos por parte del Analista 2, dado que los coeficientes de variación son más 
altos