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Aprendiendo Biologia
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MNOM*
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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA
DE MÉXICO
FACULTAD DE CIENCIAS
TÍTULO DE LA TESIS
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
ACTUARIO(A), BIÓLOGO(A), FÍSICO(A), MATEMÁTICO(A),
LICENCIADO(A) EN CIENCIAS DE LA COMPUTACIÓN
P R E S E N T A :
NOMBRE DEL ALUMNO
Empezar por nombre(s) y apellidos completos, con mayúsculas
TUTOR(A)
Empezar por grado, nombre(s) y apellidos completos, con mayúsculas
2007
FACULTAD DE CIENCIAS
UNAM
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Tesis Digitales
Restricciones de uso
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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
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respectivo titular de los Derechos de Autor.
1
Hoja
de
datos
del
Jurado
1. Datos
del
alumno
Escalera
Maurer
Andrés
(222)
2302535
Universidad
Nacional
Autónoma
de
México
Facultad
de
Ciencias
Biología
408024505
2. Datos
del
tutor
M.
en
C.
Verónica
Iranzú
Martínez
Santos
3. Datos
del
sinodal
1
Dr.
Alfonso
Miguel
Torre
Blanco
4. Datos
del
sinodal
2
Dra.
Elda
Guadalupe
Espín
Ocampo
5. Datos
del
sinodal
3
Dra.
Bertha
María
Josefina
González
Pedrajo
6. Datos
del
sinodal
4
Dra.
Luisa
Alvarina
Alba
Lois
7. Datos
del
trabajo
escrito
Análisis
de
la
regulación
transcripcional
del
operón
ecp
en
Citrobacter
rodentium.
66
pp.
2012
2
El
presente
trabajo
se
desarrolló
en
el
Departamento
de
Microbiología
Molecular
del
Instituto
de
Biotecnología
de
la
Universidad
Nacional
Autónoma
de
México,
en
Cuernavaca,
Morelos,
México.
En
el
laboratorio
del
Dr.
José
Luis
Puente
García
bajo
la
asesoría
de
la
M.
en
C.
Verónica
Iranzú
Martínez
Santos.
Durante
la
realización
del
trabajo
se
me
proporcionó
una
beca
de
alimentación
y
hospedaje
otorgada
por
el
Instituto
de
Biotecnología
de
febrero
2011
a
enero
2012.
3
Índice
General
1.
Resumen
....................................................................................................................................................................
5
2.
Introducción.
............................................................................................................................................................
6
2.1
Citrobacter
rodentium
..................................................................................................................................
6
2.2
C.
rodentium
como
modelo
animal
...........................................................................................................
9
2.3
Fimbrias.
.........................................................................................................................................................
10
2.3.1
Regulación.
............................................................................................................................................
13
2.3.2
Dominio
EAL
.........................................................................................................................................
15
2.4
Operones
fimbriales
en
C.
rodentium
...................................................................................................
17
2.4.1.
“E.
coli
Common
Pilus”
.....................................................................................................................
19
3.
Antecedentes
........................................................................................................................................................
23
4.
Justificación
...........................................................................................................................................................
26
5.
Objetivos
.................................................................................................................................................................
27
5.1
General.
...........................................................................................................................................................
27
5.2
Particulares.
..................................................................................................................................................
27
6.
Materiales
y
Métodos
.........................................................................................................................................
28
6.1
Cepas,
plásmidos
y
condiciones
de
crecimiento
...............................................................................
28
6.2
Oligonucleótidos
..........................................................................................................................................
30
6.3
Purificación
de
DNA
cromosomal
..........................................................................................................
32
6.4
Construcción
de
fusiones
transcripcionales
......................................................................................
33
6.6
Ensayos
de
actividad
enzimática
de
la
cloranfenicol
acetil
transferasa
(CAT).
.....................
35
6.7
Purificación
de
RNA
total
..........................................................................................................................
36
6.8
Determinación
del
sitio
de
inicio
de
la
transcripción
por
“primer
extension”
......................
37
6.9
“Western
immunoblot”
..............................................................................................................................
37
6.10
Construcción
de
la
cepa
mutante
en
el
gen
Rod_29251
...............................................................
38
6.11
Complementación
de
las
mutantes
ΔROD_29251
y
ΔecpR
.........................................................39
7.
Resultados
.............................................................................................................................................................
40
7.1
Determinación
del
sitio
de
inicio
de
la
transcripción
de
ecpA
.....................................................
40
7.2
Caracterización
de
la
región
reguladora
de
ecp
................................................................................
43
7.3
Cinética
de
expresión
de
ecpA
.................................................................................................................
45
7.4
Condiciones
de
expresión
de
ecpA
........................................................................................................
46
7.5
Papel
de
EcpR
en
la
expresión
de
ecpA
................................................................................................
47
7.6
Papel
del
ROD_29251
en
la
expresión
de
ecpA
.................................................................................
50
7.7
Papel
de
otros
reguladores
en
la
expresión
de
ecpA
.......................................................................
53
8.
Discusión
................................................................................................................................................................
55
9.
Conclusiones.
........................................................................................................................................................
59
10.
Perspectivas.
......................................................................................................................................................
60
11.
Bibliografía.
........................................................................................................................................................
61
4
Lista
de
Abreviaturas
Ap:
ampicilina
Cm:
cloranfenicol.
DO:
densidad
óptica
Kb:
Kilo
bases.
Nal:
ácido
nalidíxico.
Pb:
pares
de
bases.
PCR:
reacción
en
cadena
de
la
polimerasa
rpm:
revoluciones
por
minuto
Stp:
estreptomicina
TA:
temperatura
ambiente
Tc:
tetraciclina.
Tm:
temperatura
de
fusión.
Wt:
silvestre
Lista
de
figuras
Figura
1.
Formación
de
la
estructura
en
forma
de
pedestal
característica
de
las
lesiones
A/E.
....
7
Figura
2.
Representación
esquemática
de
la
isla
de
patogenicidad
LEE
de
C.
rodentium
mostrando
algunos
genes
representativos.
............................................................................................
8
Figura
3.
Representación
esquemática
de
la
biogénesis
de
la
fimbria
tipo
1
por
la
vía
chaperona-‐
usher.
.................................................................................................................................................................
12
Figura
4.
Organización
general
de
los
operones
que
codifican
para
fimbrias
ensambladas
por
la
vía
chaperona-‐usher.
....................................................................................................................................
12
Figura
5.
Organización
de
dominios
en
proteínas
que
contienen
el
dominio
EAL
caracterizadas
estructural
y/o
funcionalmente.
..............................................................................................................
17
Figura
6.
Comparación
entre
los
operones
ecp
de
C.
rodentium
y
EPEC
...............................................
22
Figura.
7.
Modelo
de
la
regulación
transcripcional
del
operón
ecp
en
EPEC
y
EHEC.
.......................
25
Figura.
8.
EcpA
se
expresa
mejor
en
medio
DME
a
26ºC
en
estático.
.....................................................
26
Figura.
9.
Identificación
del
sitio
de
inicio
de
la
transcripción
de
ecpA.
...............................................
41
Figura.
10.
Caracterización
de
la
región
reguladora
de
ecpA.
..................................................................
42
Figura.
11.
“Western
blot”
para
detectar
a
EcpA-‐FLAG.
..............................................................................
44
Figura.
12.
Cinética
de
expresión
de
ecpA.
.....................................................................................................
45
Figura.
13.
Condiciones
de
expresión
de
ecpA.
..............................................................................................
47
Figura.
14.
La
eliminación
de
ecpR
no
afecta
expresión
de
ecpA.
..........................................................
48
Figura.
15.
La
sobre
expresión
de
EcpR
disminuye
la
producción
de
EcpA.
.......................................
49
Figura.
16.
Características
de
la
proteína
codificada
por
el
gen
ROD_29251.
.....................................
50
Figura.
17.
La
proteína
ROD_29251
es
un
regulador
positivo
de
la
expresión
de
ecpA.
.................
52
Figura.
18.
Los
reguladores
específicos
de
virulencia
no
tienen
un
papel
en
la
regulación
de
ecp
.............................................................................................................................................................................
54
Lista
de
tablas
Tabla
1.
Operones
fimbriales
identificados
en
C.
rodentium.
...................................................................
18
Tabla
2.
Cepas
y
plásmidos
utilizados.
.............................................................................................................
28
5
1.
Resumen
Citrobacter
rodentium
es
una
bacteria
entérica
causante
de
la
hiperplasia
colónica
transmisible
en
ratones.
Ha
sido
utilizada
como
modelo
de
estudio
de
los
patógenos
de
humanos
EPEC
y
EHEC
debido
a
que,
al
igual
que
éstas,
provoca
una
lesión
conocida
como
de
adherencia
y
destrucción
(A/E).
La
capacidad
para
generar
esta
lesión
está
conferida
por
la
isla
de
patogenicidad
LEE,
la
cual
fue
adquirida
de
manera
horizontal
por
estas
tres
bacterias.
Además
de
los
genes
de
virulencia
codificados
en
la
isla,
estas
bacterias
utilizan
adhesinas
fimbriales
y
no
fimbriales
para
colonizar
al
hospedero.
Las
fimbrias
son
filamentos
proteicos
que
se
prolongan
a
partir
de
la
membrana
bacteriana
y
permiten
establecer
contacto
con
otras
células,
tanto
bacterianas
como
eucariontes,así
como
con
superficies
abióticas.
Involucradas
en
procesos
como
inmunomodulación,
conjugación,
formación
de
biopelículas,
“twitching
motility”
y
adherencia,
las
fimbrias
son,
en
ocasiones,
factores
de
virulencia.
ECP
es
una
fimbria
que
se
ensambla
por
la
vía
chaperona/usher
y
está
altamente
conservada
en
E.
coli
y
otras
enterobacterias,
entre
las
que
se
encuentra
C.
rodentium.
Se
ha
sugerido
que
ECP
tiene
un
papel
en
procesos
como
formación
de
biopelículas,
colonización
de
plantas
(en
el
caso
de
EHEC)
y
colonización
del
epitelio
intestinal
(en
EPEC
y
EHEC).
Este
trabajo
tuvo
como
objetivo
estudiar
el
mecanismo
de
regulación
a
nivel
transcripcional
del
operón
ecp
en
C.
rodentium.
Para
cumplirlo,
se
determinó
el
sitio
de
inicio
de
la
transcripción,
el
cual
se
localiza
a
88
pb
corriente
arriba
del
ATG,
y
con
base
en
el
cual
se
identificaron
las
cajas
-‐10
y
-‐35.
También
se
determinó
la
región
reguladora
mínima,
la
cual
comprende
hasta
la
posición
-‐407
con
respecto
al
sitio
de
inicio
de
la
transcripción.
A
diferencia
de
lo
que
ocurre
en
EPEC
y
EHEC,
en
C.
rodentium
EcpR
no
parece
estar
involucrada
en
la
regulación
del
operón,
mientras
que
la
proteína
codificada
por
el
gen
ROD_29251,
la
cual
posee
un
dominio
EAL
que
podría
estar
involucrado
en
la
modulación
de
la
concentración
del
segundo
mensajero
c-‐di-‐GMP,
actúa
de
manera
positiva.
Así
mismo,
se
corroboró
que
la
expresión
de
la
fimbria
está
regulada
por
las
condiciones
de
crecimiento.
De
acuerdo
con
los
resultados
obtenidos
en
este
estudio,
los
reguladores
específicos
de
virulencia
(Ler,
GrlR
y
GrlA)
no
juegan
un
papel
en
la
regulación
de
ecp.
En
conjunto
estos
resultados
sientan
las
bases
para
el
estudio
de
la
regulación
de
ECP
en
C.
rodentium.
6
2.
Introducción
2.1
Citrobacter
rodentium
C.
rodentium
es
una
bacteria
Gram-‐negativa
causante
de
la
enfermedad
denominada
hiperplasia
colónica
transmisible
murina
(TMCH,
por
sus
siglas
en
inglés).
Esta
enfermedad
puede
ser
mortal
en
ratones
lactantes
y
ciertas
cepas
endogámicas,
sin
embargo,
en
ratones
adultos
la
infección
normalmente
no
es
letal
y
C.
rodentium
se
puede
encontrar
como
parte
de
la
microbiota
comensal
[33,
54].
El
desarrollo
de
la
infección
por
esta
bacteria
comienza
pocas
horas
después
de
la
inoculación
oral,
cuando
ocurre
la
colonización
en
la
superficie
del
tejido
linfoide
del
ciego
y,
tres
días
después,
las
bacterias
pueden
ser
encontradas
también
en
el
colon
distal.
La
lesión
principal,
visible
entre
los
días
5
y
14
post-‐inoculación
(pi),
es
el
engrosamiento
del
intestino
comenzando
en
el
colon
distal
y,
en
algunos
casos,
se
extiende
al
resto
del
colon.
El
desarrollo
de
la
lesión
es
acompañado
por
la
producción
de
heces
suaves.
Entre
los
días
21-‐28
pi,
C.
rodentium
deja
de
ser
detectable,
a
las
7
semanas
pi
las
lesiones
desaparecen
completamente
y
los
ratones
desarrollan
inmunidad
[32,
55].
C.
rodentium
es
miembro
de
la
familia
Enterobacteriaceae,
está
relacionada
genéticamente
con
Escherichia
coli
y
conforma,
junto
con
E.
coli
enteropatógena
(EPEC)
y
E.
coli
enterohemorrágica
(EHEC),
un
grupo
de
bacterias
patógenas
capaces
de
generar
lesiones
conocidas
como
de
adherencia
y
destrucción
(A/E)
en
el
tracto
gastrointestinal
del
hospedero
[32,
55].
Aunque
C.
rodentium
se
encuentra
menos
relacionada
a
E.
coli
que
a
Salmonella
(tomando
como
referencia
sólo
los
genes
de
mantenimiento),
existen
un
número
significativo
de
genes,
ausentes
en
E.
coli
K-‐12
pero
conservados
en
C.
rodentium,
EHEC
y
EPEC,
que
se
reconocen
como
factores
de
virulencia
y
que
se
encuentran
principalmente
en
elementos
genéticos
móviles.
Es
la
adquisición
de
estos
factores
la
responsable
de
la
convergencia
en
la
estrategia
de
virulencia
de
estos
tres
patógenos
[37].
7
Las
lesiones
A/E
son
esenciales
para
la
patogenicidad
de
estas
bacterias
y
se
caracterizan
por
la
adherencia
íntima
a
la
membrana
de
las
células
epiteliales,
la
destrucción
localizada
de
las
microvellocidades
y
la
formación
de
una
estructura
característica
de
copa
o
pedestal
(Fig.
1)[32,
55].
La
formación
de
esta
lesión
se
da
cuando
la
bacteria
transloca
hacia
el
citoplasma
de
la
célula
hospedera,
a
través
de
un
sistema
de
secreción
tipo
3
(SST3),
una
serie
de
proteínas
efectoras
entre
las
cuales
se
encuentra
Tir.
Esta
proteína
se
integra
en
la
membrana
de
la
célula
eucarionte
donde
actúa
como
receptor
para
una
proteína
de
membrana
externa
de
la
bacteria
llamada
intimina
y,
por
otro
lado,
interactúa
con
proteínas
de
la
célula
hospedera.
El
reclutamiento
de
proteínas
mediado
por
Tir
en
el
interior
de
la
célula
eucarionte,
provoca
una
modificación
del
citoesqueleto
de
actina
que
induce
la
formación
de
la
estructura
en
forma
de
pedestal
debajo
de
la
bacteria
[32,
55].
Patógeno AE!
Adherencia íntima!
Polimerización
localizada de
actina.!
!
!
Intimina!
Fig.
1.
Formación
de
la
estructura
en
forma
de
pedestal
característica
de
las
lesiones
A/E.
La
bacteria
transloca
hacia
el
citoplasma
de
la
célula
hospedera
varias
proteínas
efectoras,
entre
las
cuales
se
encuentra
el
receptor
translocado
de
intimina
(Tir).Tir
se
inserta
en
la
membrana
de
la
célula
hospedera
y
funciona
como
receptor
para
la
proteína
de
membrana
externa
intimina.
Por
otro
lado,
Tir
dispara
la
cascada
de
señalización
que
lleva
al
8
reclutamiento
de
proteínas
de
la
célula
hospedera
y
la
formación
del
pedestal.
Modificado
de
Strynadka
y
Ness,
2002.
La
habilidad
para
inducir
las
lesiones
A/E
es
conferida
por
uno
de
los
elementos
móviles
adquiridos
por
transferencia
horizontal,
la
isla
de
patogenicidad
LEE
(“Locus
of
enterocyte
effacement”).
La
isla
LEE
está
formada
por
5
operones
policistrónicos
que
codifican
para
las
proteínas
del
sistema
de
secreción
tipo
3,
las
proteínas
de
adhesión
Tir
e
intimina
y
las
proteínas
translocadoras
y
efectoras;
así
como
un
operón
bicistrónico
que
codifica
para
los
reguladores
GrlR
y
GrlA
(Fig.
2)
[2,
55,
57].
La
organización
de
los
genes
del
LEE
es
casi
idéntica
en
EPEC,
EHEC
y
C.
rodentium,
sin
embargo
su
localización
dentro
del
cromosoma
es
diferente
[33,
37,
47,
55].
4
R. Mundy
et al.
© 2005 The Authors
Journal compilation © 2005 Blackwell Publishing Ltd,
Cellular Microbiology
rodentium
and EPEC. However, significant differences
were observed between colonization dynamics and the
extent of colonic inflammation and hyperplasia of the wild-
type (wt)
C. rodentium
and DBS255 (
eae
EPEC
!
). In partic-
ular DBS255 (
eae
EPEC
!
) colonizes mice faster, with higher
colony-forming units (cfu) isolated from stools over the
first 5 days of infection (R. Mundy and G. Frankel, unpubl.
data), induction of a stronger inflammatory response and
deeper penetration within the colonic crypts (Frankel
et al
., 1996). In contrast complementation of DBS255 with
a plasmid encoding eaeEHEC" did not restore virulence
(reviewed in Frankel et al., 2001).
All A/E pathogens translocate their own intimin receptor,
Tir, which integrates into the host cell plasma membrane.
Tir is involved in a series of interactions with host cell
proteins resulting in the formation of actin-rich pedestals
beneath the adherent bacteria (reviewed in Frankel et al.,
2001). A C. rodentium tir mutant was incapable of forming
pedestals on HeLa cells; actin pedestal formation was
restored by plasmids encoding TirCR or TirEPEC but not
TirEHEC. These results are consistent with the fact that
pedestal formation induced by EPEC and C. rodentium is
dependent on phosphorylation of tyrosine at positions 474
and 471 (reviewed in Garmendia et al., 2005) and that
TirCRY471F was unable to complement C. rodentium #tir in
vitro (Deng et al., 2003).
In vivo, #tirCR was unable to colonize mice, but coloni-
zation and virulence were restored by plasmid-encoded
wt copies of TirCR, TirEPEC or TirEHEC. Interestingly, plasmid
encoded TirCRY471F was also able to complement #tirCR and
restore colonization and hyperplasia in mice, showing that
phosphorylation of Y471 is not essential for infection of
mice (Deng et al., 2003).
The role of LEE-encoded TTSS effectors
The effects of all known C. rodentium effectors and viru-
lence genes on TMCH are summarized in Table 2. EspB,
which has both translocator and effector functions, was
the second LEE-encoded protein studied in C. rodentium.
A C. rodentium espB mutant is avirulent (Newman et al.,
1999).
MapEPEC was reported to be targeted to, and to interfere
with function of, the mitochondria, to disrupt intestinal
barrier functions and to induce formation of filopodia-like
extensions at the site of bacterial adhesion during initial
stages of infection (reviewed in Garmendia et al., 2005).
Infection of C3H/HeJ and C57Bl/6 mice with three inde-
pendent map mutants has demonstrated that Map is not
essential for colonization and disease (Deng et al., 2004;
Mundy et al., 2004). However, map mutants have an inter-
mediate phenotype in C3H/HeJ mice, being recovered in
significantly lower numbers than the wt strain over the
whole course of infection and persist for longer in the
mouse colon (Mundy et al., 2004). In a mixed infection
with 50% wt and 50% #map, the latter strain was exten-
sively out-competed. Consistent with this finding, map
mutants were found among the attenuated strains in both
C. rodentium and EHEC STM screens (Mundy et al.,
2003) suggesting that Map expression is advantageous in
a competitive environment.
EspF is also targeted to the mitochondria where it is
involved in permeabilization of the mitochondrial mem-
brane and induction of cell death. EspF has a role in
disruption of intestinal barrier functions and in remodelling
of the brush border microvilli (reviewed in Garmendia
et al., 2005). Studies of EspF in the C. rodentium model
have been carried out independently by three different
groups. The espF mutants were made in strains: DBS100
(Deng et al., 2004), ICC169 (Mundy et al., 2004) and
EX33 (Nagai et al., 2005). All groups used the same age
and strain of mouse (C3H/HeJ, 5–6 weeks old) and a
similar inoculum (1–5 $ 108 cfu per mouse). The consen-
sus conclusion is that #espF has a moderate attenuation,
with a defect in early colonization and hyperplasia. C3H/
HeJ mouse colons examined 13 days pi showed only
slight differences in hyperplasia (Mundy et al., 2004).
However, mouse colons examined 4 days earlier at day 9
pi showed more convincing differences between wt and
#espF strains in terms of colon appearance, colon cfu,
Fig. 3. Gene organization, and assigned function, along the LEE region of C. rodentium.
Secuencias de!
inserción !
Sistema de secreción
tipo 3 (SST3)! Intimina! Chaperona Ces!
Regulador! Secretadas por
T3SS!
Orf con función
desconocida!
Modificado de Mundy et al 2005!
A
! Z
!
Fig.
2.
Representación
esquemática
de
la
isla
de
patogenicidad
LEE
de
C.
rodentium
mostrando
algunos
genes
representativos.
La
isla
LEE
contiene
41
marcos
de
lectura
abiertos
(ORF’s),
arreglados
en
5
operones
policistrónicos,
denominados
LEE1
a
LEE5,
y
un
operón
bicistrónico
que
codifica
para
los
reguladores
GrlRA.
Los
operones
LEE1
a
LEE3
contienen
los
genes
que
codifican
para
el
T3SS,
el
operón
LEE4
contiene
la
mayoría
de
los
genes
que
codifican
para
proteínas
efectoras
y
el
operón
LEE5
codifica
para
las
proteínas
necesarias
para
la
adherencia
íntima.
Modificado
de
Mundy
et
al.,
2005.
ecp
9
2.2
C.
rodentium
como
modelo
animal
Las
enfermedades
diarreicas
constituyen
un
problema
de
salud
importante
en
el
mundo
causando
alrededor
de
2
millones
de
muertes
al
año.
Un
número
significativo
de
estos
casos
esta
relacionado
con
cepas
de
E.
coli
diarreogénica,
en
particular
EHEC
y
EPEC
[6,
20].
EPEC
es
una
de
las
principales
causas
de
diarrea
infantil
en
países
en
vías
de
desarrollo.
Estudios
realizados
en
Brasil,
México,
Sudáfrica
y
Bangladesh
han
demostrado
que
entre30
y
40%
de
la
diarrea
infantil
es
causada
por
EPEC
y,
se
estiman
varios
cientos
de
miles
de
muertes
al
año
por
esta
causa
[6].
La
infección
por
EHEC
causa
colitis
hemorrágica,
diarrea
sin
sangre
y
el
síndrome
urémico
hemolítico
(este
último
como
resultado
de
la
producción
de
la
toxina
tipo
Shiga).
El
principal
reservorio
de
EHEC
es
el
tracto
intestinal
bovino
y
la
enfermedad
se
asocia
con
el
consumo
de
alimento
y
agua
contaminados.
A
diferencia
de
EPEC,
los
brotes
de
EHEC
han
sido
detectados
solamente
en
países
desarrollados,
incluyendo
EUA,
Japón
y
Reino
Unido.
La
dosis
infecciosa
en
EHEC
es
mucho
menor
a
la
de
EPEC,
estimada
en
menos
de
100
bacterias
[19].
Aunque
se
han
detectado
infecciones
por
patógenos
A/E
en
diversos
animales,
entre
los
que
se
encuentran:
reces,
cerdos,
cabras,
borregos,
corderos,
caballos,
gatos,
perros,
conejos
y
algunos
primates,
la
única
bacteria
A/E
conocida
capaz
de
causar
enfermedad
en
ratones
es
C.
rodentium
[55].
De
los
animales
anteriormente
mencionados,
los
ratones
presentan
varias
ventajas
como
modelo
animal
para
estudiar
este
tipo
de
enfermedades.
La
gran
cantidad
de
información
con
la
que
se
cuenta,
el
elevado
numero
de
mutantes
y
cepas
disponibles,
la
facilidad
de
manejo
y
el
bajo
costo
(en
comparación
con
el
de
otros
animales)
[33],
hacen
de
la
TMCH
un
modelo
excelente
para
la
investigación
in
vivo
de
las
interacciones
patógeno-‐
hospedero,
brindando
la
posibilidad
de
manipular
ambos
para
estudiar
fenómenos
como
el
reconocimiento
y
eliminación
del
patógeno,
así
como
su
transmisión
[33].
Diversos
estudios
con
C.
rodentium
han
demostrado
la
eficacia
de
este
modelo.
Mutaciones
de
los
genes
de
la
isla
LEE
y
de
algunos
efectores
o
factores
de
virulencia
10
fuera
de
ésta
han
permitido
determinar
la
importancia
que
cada
uno
tiene
para
la
virulencia
[10,
32,
55],
confirmando
la
información
que
se
ha
observado
para
EHEC
y
EPEC
en
ensayos
con
voluntarios,
otros
modelos
animales
y
células
en
cultivo,
así
como
aportando
nueva
información.
Estudios
con
eliminaciones
específicas
en
genes
del
sistema
inmune
han
generado
información
acerca
de
la
relación
entre
componentes
particulares
de
éste,
la
inmunidad
y
la
patología.
De
igual
manera,
se
ha
usado
el
modelo
para
estudiar
el
efecto
de
la
microbiota
en
el
desarrollo
de
la
enfermedad
y
para
estudios
de
transmisión.
Además,
la
hiperplasia
colónica
se
asocia
con
un
aumento
en
la
susceptibilidad
a
carcinógenos
y
algunas
características
de
la
infección
por
C.
rodentium
guardan
parecido
con
los
modelos
animales
para
las
enfermedades
inflamatorias
intestinales,
por
lo
que
la
TMCH
puede
servir
también
como
modelo
para
el
estudio
de
estas
enfermedades
[33].
2.3
Fimbrias.
La
adherencia
es
un
evento
importante
en
la
colonización
de
superficies
hospederas
y
la
promoción
de
ésta
por
fimbrias
es,
por
lo
regular,
un
paso
esencial
en
la
infección
[50].
Las
estructuras
de
superficie
más
comúnmente
involucradas
en
las
primeras
interacciones
de
las
bacterias
con
la
superficie
de
las
células
del
hospedero
son
las
fimbrias
o
pili,
las
cuales
generalmente
se
unen
a
receptores
específicos
en
el
hospedero
[35].
Las
fimbrias
son
filamentos
proteicos
no
flagelares
que
se
prolongan
a
partir
de
la
superficie
bacteriana.
Están
presentes
tanto
en
bacterias
Gram-‐negativas
como
Gram-‐
positivas
y
se
ha
visto
que
están
involucradas
en
procesos
como
conjugación,
adherencia,
formación
de
biopelículas
e
inmunomodulación
[40].
A
diferencia
de
los
flagelos,
las
fimbrias
no
están
involucradas
en
motilidad,
excepto
las
fimbrias
tipo
IV,
las
cuales
median
una
motilidad
especializada
en
superficies
semisólidas
denominada
11
“twitching
motility”
[17].
Las
bacterias
Gram-‐negativas
presentan
una
gran
diversidad
de
fimbrias
que
se
forman
mediante
polimerización
no
covalente
de
varias
subunidades
o
pilinas
[17].
Algunas
fimbrias
son
factores
de
virulencia
y
son
considerados
como
blancos
para
la
elaboración
de
vacunas;
además,
las
características
adhesivas
de
éstas
determinan
el
hospedero
a
infectar
y
el
tropismo
dentro
de
éste
[35].
Entre
los
tipos
de
fimbrias
más
estudiados
se
encuentran
aquellas
que
se
ensamblan
por
la
vía
chaperona-‐usher.
En
esta
vía,
las
pilinas
son
secretadas
por
medio
de
la
vía
general
de
secreción
(SEC)
al
periplasma,
donde
se
unen
a
chaperonas
específicas
que
ayudan
al
plegamiento
e
impiden
el
ensamblaje
prematuro
de
las
subunidades.
Posteriormente,
el
complejo
pilina/chaperona
es
reconocido
por
la
proteína
“usher”
que
forma
un
poro
en
la
membrana
externa
y
sirve
como
plataforma
para
el
ensamblaje
del
pilus
(Fig.
3)
[34].
Fimbria
tipo I
!"#$%&'()'*
+$,-%&'()'*
./*
.0*
!12,'*3$)4#$&'#*
5'#$&&'*6"&*%$&1(*
!"##$%$&##$'()(*+,-,.'$
$,.$/+012$
7#'2(&-892*:"8*;0<*
=$)+*
=$)>*
=$)=*
=$)<*
=$)?*
=$)@*
12
Fig.
3.
Representación
esquemática
de
la
biogénesis
de
la
fimbria
tipo
1
por
la
vía
chaperona-‐
usher.
ME-‐
membrana
externa,
MI-‐
membrana
interna.
En
verde
se
muestra
la
proteína
“usher”
y
en
azul
la
chaperona.
Modificado
de
Nishiyama
et
al.,
2005.
Los
genes
que
codificanpara
fimbrias
ensambladas
por
la
vía
chaperona-‐usher
regularmente
están
agrupados
en
operones,
los
cuales
codifican
para
al
menos
3
proteínas
distintas:
la
subunidad
principal,
la
chaperona
periplásmica
y
la
proteína
“usher”.
Además
pueden
codificar
también
para
proteínas
estructurales
adicionales
(ej.
subunidades
fimbriales
menores),
proteínas
de
ensamblaje
(ej.
chaperonas)
o
proteínas
reguladoras
[35].
Todos
los
operones
fimbriales
examinados
hasta
ahora
codifican
al
menos
para
una
proteína
reguladora
que
activa
o
reprime
la
expresión
de
los
genes
del
operón.
La
mayoría
de
estos
operones
comparten
una
organización
genética
similar:
al
principio
se
encuentran
los
genes
involucrados
en
la
regulación
positiva
o
negativa,
seguidos
de
la
subunidad
estructural
principal.
Los
genes
que
codifican
para
la
chaperona,
la
proteína
“usher”,
proteínas
adaptadoras
y
la
adhesina
fimbrial
constituyen
el
resto
del
operón
(Fig.
4).
!"#$%&'!"!'
!""""""#"""""""""""$"""""""""""""""%""""""""""""""""""""""""""""&""""""""""""""""""""""""""""'""""""""""""""""("""""""""""""""")""""""""""""""*""""""""""""""""+""""""""""""""""","
(#)*+,-.%&' /,0*.&,$.,'1#'#&2,34+,5#'1#+'".+*2' 6*4*&.1,1#2'1#'+,'"*&7,'8.4$.+,$'1#+'".+*2''
6*4*&.1,1'
"$.&-.",+'
9&-+,'1#+'
".+*2'
:2;#$'1#'
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.&.-.,1>$'
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#""""""*"""""""""""$""""""""""""""""!"""""""""""""""&""""""""""""""""""""""""""""'"""""""""""""""""""""""""""""+"""""""""""""","""""""""""""""""""%"
(#)*+,-.%&'
6*4*&.1,1'
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=;,"#$>&,'
"#$."+?23.-,'
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3#34$,&,'#<7#$&,'
91,"7,1>$#2@'
.&.-.,1>$#2@'
7#$3.&,1>$#2'
91;#2.&,'1#'
*&.%&'
/,0*.&,$.,'1#'#&2,34+,5#'1#+'".+*2' 6*4*&.1,1#2'1#'+,'"*&7,'8.4$.+,$'1#+'".+*2''
!"#$%&'#$%'
Fig.
4.
Organización
general
de
los
operones
que
codifican
para
fimbrias
ensambladas
por
la
vía
chaperona-‐usher:
operón
pap
(panel
superior)
y
operón
fim
(panel
inferior).
Al
inicio
de
13
ambos
operones
se
encuentran
genes
que
codifican
para
proteínas
reguladoras;
inmediatamente
después
se
encuentra
el
gen
que
codifica
para
la
subunidad
principal;
hacia
la
mitad
de
los
operones
se
encuentran
los
genes
que
codifican
para
la
maquinaria
de
ensamblaje,
compuesta
por
la
chaperona
y
la
proteína
“usher”.
Hacia
el
final
de
cada
operón
están
los
genes
que
codifican
para
las
subunidades
de
la
punta
fibrilar
del
pilus,
las
cuales
pueden
variar
en
número,
así
como
la
adhesina.
Modificado
de
Thanassi
et
al.,
1998.
Ejemplos
de
operones
que
conservan
esta
organización
son
el
operón
fim,
que
codifica
para
las
fimbrias
tipo
1
(distribuidas
a
lo
largo
de
la
familia
Enterobacteriaceae)
y
el
operón
pap,
que
codifica
para
las
fimbrias
P
(descritas
en
E.
coli
uropatógena,
UPEC).
El
operón
fim
está
compuesto
por
los
genes
fimA-‐H
(Fig.
4
panel
inferior).
FimA
es
la
subunidad
principal
que
forma
la
barra
de
entre
6
y
9
nm
de
ancho
y
de
1
a
2
!m
de
largo
y
se
conecta,
a
través
de
FimF,
a
una
punta
formada
por
FimG
y
FimH,
ésta
última
es
una
adhesina
que
reconoce
receptores
con
manosa
[40].
Los
genes
fimD
y
fimC
codifican
para
una
proteína
de
andamiaje
y
una
chaperona,
respectivamente
[40].
Por
su
parte,
el
operón
pap
está
compuesto
por
11
genes
denominados
papIBAHCDJKEFG
(Fig.
4
panel
superior).
Éstos
codifican
para
las
proteínas
reguladoras
PapI/B,
la
proteína
“usher”
(PapC),
la
chaperona
(PapG)
y
la
pilina
principal
(PapA).
La
punta
fimbrilar
está
compuesta
principalmente
por
PapE
y
PapK
conectadas
por
la
proteína
adaptadora
PapF
a
la
adhesina
PapG
que
reconoce
glicolípidos
con
galactosa
[17].
2.3.1
Regulación.
El
hecho
de
que
en
el
genoma
de
una
bacteria
se
encuentren
codificados
varios
operones
fimbriales
cuyo
producto
tiene
características
que
le
permiten,
en
muchos
casos,
cumplir
funciones
específicas,
hace
necesaria
una
regulación
estricta
de
su
expresión.
Esta
regulación
debe
estar
acoplada
a
señales
externas
que
le
permitan
identificar
el
momento
adecuado
para
su
producción.
Por
ejemplo,
en
el
caso
de
la
virulencia,
ciertas
fimbrias
deben
ser
producidas
durante
la
adherencia
inicial
pero
es
necesario
que
se
dejen
de
producir
en
etapas
posteriores
de
la
infección
para
permitir
14
su
dispersión,
tal
es
el
caso
de
la
fimbria
tipo
IV
BFP
(“bundle
forming
pilus”)
de
EPEC
[22].
Algunos
de
los
mecanismos
de
regulación
transcripcional
descritos
hasta
el
momento
para
la
producción
de
fimbrias
ensambladas
por
la
vía
chaperona/usher
son:
elementos
invertibles,
metilación
del
DNA,
señalización
por
c-‐di-‐GMP
y
unión
de
proteínas
reguladoras
a
DNA.
A
continuación
se
describen
brevemente
algunos
ejemplos
de
cada
uno
de
estos
mecanismos.
La
regulación
mediada
por
un
elemento
invertible
de
la
fimbria
tipo
I
de
E.
coli
ha
sido
ampliamente
estudiada.
La
transcripción
del
operón
fim
es
dependiente
de
la
orientación
de
una
región
de
314
pb
localizada
corriente
arriba
de
fimA
denominada
fimS.
Esta
región
contiene
al
promotor
y
está
flanqueada
por
dos
secuencias
repetidas
invertidas
de
9
pb.
La
transcripción
del
operón
se
da
cuando
fimS
está
orientado
a
favor
de
fimA
(posición
ON),
mientras
que
en
la
orientación
contraria
(posición
OFF)
no
hay
transcripción.
La
inversión
de
fimS
está
mediada
por
la
actividad
de
las
recombinasas
sitio-‐específicas
FimB
y
E,
las
cuales
actúan
de
manera
independientepara
prender
o
apagar
la
expresión
[8].
FimE
media
la
inversión
de
fimS
principalmente
de
la
posición
ON
a
OFF,
mientras
que
FimB
puede
mediar
la
inversión
en
ambas
direcciones.
Además
de
estas
dos
recombinasas,
la
expresión
del
operón
fim
también
es
modulada
positivamente
por
los
reguladores
Lrp
e
IHF
y
negativamente
por
H-‐NS
[8].
Un
caso
de
regulación
de
fimbrias
que
involucra
la
metilación
del
DNA
se
observa
en
la
fimbria
P
de
UPEC.
El
control
de
la
expresión
de
la
subunidad
principal
PapA
está
determinado
por
el
estado
de
metilación
de
dos
sitios
con
secuencia
GATC
que
se
encuentran
corriente
arriba
del
promotor
papAB.
La
transcripción
de
pap
está
influenciada
por
el
regulador
global
Lrp
y
el
específico
PapI.
A
concentraciones
altas
de
Lrp
y
relativamente
bajas
de
PapI,
Lrp
se
une
a
la
región
GATC
más
cercana
al
promotor
inhibiendo
la
transcripción.
Esta
unión
sólo
se
puede
dar
si
los
sitios
no
están
metilados.
Lrp
compite
con
la
metilasa
de
adeninas
de
DNA
(Dam)
por
la
unión
a
15
este
sitio.
Después
de
la
replicación
del
DNA
y
la
división
celular,
las
bajas
concentraciones
relativas
de
Lrp
con
respecto
a
las
de
PapI
permiten
que
Lrp
se
una
al
sitio
GATC
distal
impidiendo
la
metilación
de
éste
pero
permitiendo
la
del
sitio
proximal
y
así,
la
transcripción.
Otras
fimbrias
en
las
que
la
metilación
del
DNA
funciona
como
mecanismo
de
regulación
son
las
K88,
K99
y
Sfa
de
E.
coli.
[8].
En
Klebsiella
pneumoniae
la
síntesis
de
la
fimbria
tipo
3,
la
cual
está
involucrada
en
virulencia
y
formación
de
biopelículas,
se
regula
mediante
la
modulación
de
las
concentraciones
intracelulares
de
c-‐di-‐GMP.
El
incremento
o
disminución
de
este
segundo
mensajero
depende
de
los
cambios
en
la
actividad
relativa
de
las
proteínas
YfiN
(con
actividad
de
diguanilato
ciclasa)
y
MrKJ
(con
actividad
de
fosfodiesterasa).
El
receptor
de
c-‐di-‐GMP,
MrKH
(que
contiene
un
dominio
PilZ
de
unión
a
este
nucleótido),
se
une
a
la
región
reguladora
del
operón
mrk
en
presencia
del
segundo
mensajero,
activando
la
transcripción
[19,
56].
En
esta
misma
bacteria,
la
proteína
FimK,
codificada
por
el
último
gen
del
operón
fim
(fimK),
tiene
un
dominio
EAL
y
se
ha
reportado
que
actúa
como
regulador
negativo
de
la
producción
de
esta
fimbria
[8,
42].
La
represión
y
activación
de
la
transcripción
mediante
la
unión
de
proteínas
a
sitios
en,
o
cercanos
a,
la
región
promotora,
es
otro
de
los
mecanismos
que
intervienen
en
el
control
de
la
producción
de
fimbrias.
Un
ejemplo
de
un
operón
fimbrial
regulado
por
este
mecanismo
es
el
de
la
fimbria
Lpf
(“long
polar
fimbria”),
en
cuya
expresión
intervienen
el
regulador
global
H-‐NS
y
el
específico
de
virulencia
Ler
[8,
52].
En
este
caso,
H-‐NS
se
une
cerca
de
la
región
promotora,
impidiendo
la
actividad
de
la
RNA
polimerasa,
mientras
que
Ler
compite
con
H-‐NS
por
la
unión
al
DNA,
desplazándola
y
permitiendo
así
la
expresión
del
operón
[8,
57].
2.3.2
Dominio
EAL
El
Bis-‐(3´-‐5´)-‐guanosín
monofosfato
cíclico
dimérico
(c-‐di-‐GMP)
es
un
segundo
mensajero
global
en
bacterias.
La
señalización
mediante
este
segundo
mensajero
se
16
encuentra
relacionada
con
la
regulación
de
procesos
como
motilidad,
virulencia,
síntesis
de
fimbrias
y
formación
de
biopelículas,
entre
otros
[43].
Las
proteínas
con
dominios
GGDEF
(con
actividad
de
diguanilato
ciclasa,
DGC)
y
EAL
(con
actividad
de
fosfodiesterasa,
PDE),
nombrados
así
por
algunos
de
sus
aminoácidos
conservados,
están
involucradas
en
la
síntesis
y
la
degradación,
respectivamente,
del
c-‐di-‐GMP
[48].
Este
tipo
de
dominios
se
encuentran
distribuidos
a
lo
largo
de
la
mayoría
de
los
genomas
bacterianos
y,
en
algunas
especies,
se
encuentran
ampliamente
representados.
Ejemplos
de
esto
se
observan
en
Pseudomonas
aeruginosa
con
53;
E.
coli
con
36;
Salmonella
Typhimurium
con
26
y
Vibrio
cholerae
con
53
proteínas
con
uno
o
ambos
dominios
[13].
El
dominio
EAL
cataliza
la
hidrólisis
de
c-‐di-‐GMP
para
formar
el
dinucleótido
lineal
5´-‐fosfoguanilil-‐(3´-‐5´)-‐guanosina
(pGpG),
para
lo
que
requiere
de
Mg2+
o
Mn2+;
mientras
que
el
Zn+2
y
el
Ca+2
interfieren
con
su
actividad.
Aunque
muchos
dominios
EAL
conservan
la
actividad
catalítica,
se
ha
demostrado
que
algunos
carecen
de
ésta
y
funcionan
como
sitios
de
unión
a
ligando
o
de
unión
a
otras
proteínas
[53].
En
algunos
casos,
el
dominio
EAL
se
puede
encontrar
como
dominio
funcional
único,
sin
embargo,
normalmente
se
encuentra
en
el
extremo
C-‐terminal
de
proteínas
que
contienen
otros
dominios
funcionales
en
el
extremo
N-‐terminal,
los
cuales
pueden
funcionar
como
receptores
de
señal,
moduladores
de
la
actividad
del
dominio
EAL
o
cumplir
funciones
de
unión
a
DNA,
entre
otras.
En
la
Fig.
5
se
muestran
algunos
ejemplos
de
proteínas
que
además
de
tener
el
domino
EAL
presentan
dominios
como:
GGDEF
(DGC),
HTH
(unión
a
DNA)
,
BLUF
(detección
de
luz
azul),
REC
(receptor
de
respuesta),
GAF
(dominio
de
unión
a
cGMP)
y
PAS
(detección
de
luz,
O2
y
potencial
redox)
[48].
17
Fig.
5.
Organización
de
dominios
en
proteínas
que
contienenel
dominio
EAL
caracterizadas
estructural
y/o
funcionalmente.
Los
dominios
GGDEF
y
EAL
se
muestran
en
verde
y
azul
respectivamente.
Los
dominios
reguladores
se
muestran
en
rojo
y
gris.
El
número
total
de
residuos
de
aminoácidos
se
muestra
en
el
extremo
C-‐terminal.
Los
sitios
importantes
del
dominio
EAL
incluyen:
E188,
N239,
E272,
D39
y
D303
(que
sirven
para
la
coordinación
del
metal;
mostrados
en
verde),
E359
(que
posiblemente
actúa
como
base
y
en
la
coordinación
del
metal;
mostrado
en
morado)
y
K323
(que
es
una
lisina
probablemente
catalítica;
mostrada
en
azul).
Los
residuos
no
conservados
de
estos
sitios
se
muestran
en
gris.
Modificado
de
Shirmer
et
al.,
2009.
2.4
Operones
fimbriales
en
C.
rodentium
C.
rodentium
tiene
un
total
de
19
operones
fimbriales
(Tabla
1),
de
los
cuales
algunos
se
encuentran
incompletos.
De
aquellos
que
se
encuentran
intactos,
los
productos
de
los
operones
kfc
(“K99-‐like
Factor
Involved
in
Citrobacter
Colonization”)
y
cfc
(“Colonization
Factor
Citrobacter”)
han
sido
relacionados
con
la
colonización
del
tracto
gastrointestinal,
mientras
que
la
fimbria
polar
larga,
Lpf
,parece
no
tiene
ningún
papel
en
la
virulencia
[38].
La
fimbria
CFC
está
codificada
por
un
probable
operón
de
12
genes
y
tiene
homología
con
las
fimbrias
tipo
IV
CFA/III
(“colonization
factor
antigen
III”)
de
E.
coli
enterotoxigénica
(ETEC),
TCP
(“toxin
coregulatied
pilus”)
de
Vibrio
cholerae
y
BFP
de
EPEC.
Las
mutantes
para
dos
de
los
genes
del
operón
(cfcH
y
cfcI),
son
avirulentas
y
pierden
la
capacidad
para
colonizar
el
intestino
[32].
Por
su
18
parte,
la
fimbria
KFC
es
un
homologo
de
la
fimbria
K99
de
ETEC
y
se
ha
propuesto
que
tiene
un
papel
moderado
en
la
colonización
[16].
El
papel
del
resto
de
los
operones
fimbriales,
incluyendo
el
de
ECP
(ver
abajo),
no
ha
sido
determinado.
Tabla
1.
Operones
fimbriales
identificados
en
C.
rodentium.
Modificado
de
Petty
et
al.,
2010.
Identificación
CDS
Genes
Descripciónb
Ortólogo
en
EPEC
Ortólogo
en
Sakai
ROD_01101-‐
01121
hofCB-‐ppD
Fimbria
tipo
IV
E2348_C_0
109-‐0111
ECs0110-‐
0112
ROD-‐03641-‐
03671
Fimbria
chaperona-‐usher
γ4
ROD_03351,
10951-‐11021
crl
csgGFEDBAC
Fimbria
curli
E2348_C_0
233,
1129-‐
1136
ECs0267,1
414-‐1412
ROD_11771-‐
11781
Fimbria
chaperona-‐usher
βe
ROD_18141-‐
18181
lpfEDCBA
Fimbria
polar
larga
(fimbria
chaperona-‐usher
γI)
ROD_191241-‐
10381
Fimbria
chaperona-‐usher
σ
ROD_22311-‐
22341
Fimbria
chaperona-‐usher
γ4
ROD_27771-‐
27801
Fimbria
chaperona-‐usher
γ4
ROD_29201-‐
29241
fimBEAICDFG
HK
Fimbria
tipo
I
(fimbria
chaperona-‐usher
γ1)
E2348_c_4
619-‐4627a
ECs5279a
ROD_29201-‐
2929241
ecpABCDE
ECP
(Fimbria
chaperona-‐usher
alterna
α)
E2348_C_0
249
ECs0323
ROD_29351-‐
29391
Fimbria
chaperona-‐usher
γ4d
ROD_34961-‐
35021
Fimbria
chaperona-‐usher
!
ROD_41241-‐
41291
kfcHGFEDC
Kfc
(fimbria
chaperona-‐usher
κ)
ROD_41381-‐
411551
flp1
rcpCA
tadZABCDE
tadVEFG
Locus
de
adherencia
estrecha
(tad,
“tight
adherence
locus”)(fimbria
tipo
IV)
ROD_44281-‐
44321
hofMNOPQ
Fimbria
tipo
IV
E2348_C_3
635-‐3639
ECs4233-‐
4327
ROD_46461-‐
46571
cfcABCDEFGH
IJPV
CFC
(Fimbria
tipo
IV)
ROD_50611-‐
50651
Fimbria
chaperona-‐ucher
γ4d
ROD_p1161-‐
p1201
Fimbria
chaperona-‐usher
!
19
ROD_p1291-‐
p1301
Fimbria
chaperona-‐usher
γ1d
,e
a
fimk
no
se
encuentra
en
EPEC
y
EHEC.
b
Los
operones
fimbriales
chaperona-‐usher
se
agrupan
en
clados
y
subclados
de
acuerdo
con
la
clasificación
de
proteínas
usher
propuesto
por
Nuccio
y
colaboradores
(2007).
d
Contiene
pseudogenes.
e
Parte
del
operón
se
encuentra
ausente.
2.4.1.
“E.
coli
Common
Pilus”
Las
fimbrias
ECP
miden
entre
5
y
7
nm
de
diámetro
y
entre
0.4
y
5
µm
de
largo.
Fueron
descritas
por
primera
vez
en
2001
por
Pouttu
y
colaboradores,
quienes
la
llamaron
Mat
(“meningitis-‐associated
and
temperature-‐regulated”),
debido
a
que
las
detectaron
sólo
en
cepas
de
E.
coli
asociada
a
meningitis
y
septicemia
en
neonatos
(MENEC)
al
ser
cultivadas
en
medio
LB
a
20ºC
pero
no
a
37ºC
[39].
Posteriormente,
Rendón
y
colaboradores
(2007)
publicaron
un
trabajo
en
el
que
se
muestra
que
ECP
no
sólo
está
codificada
en
los
genomas
de
la
mayoría
de
los
patotipos
de
E.
coli,
sino
que
es
producida
por
un
gran
número
de
éstos,
incluyendo:
EHEC,
EPEC,
ETEC,
UPEC,
E.
coli
enteroagregativa
(EAggEC),
E.
coli
enteroinvasiva
(EIEC),
E.
coli
patogénica
aviar
(APEC)
y
algunas
cepas
comensales.
En
este
trabajo
se
observó
que
el
96%
de
las
176
cepas
analizadas
contienen
a
ecpA
y
el
77%
de
éstas
la
producen.
Debido
al
alto
grado
de
conservación
en
E.
coli
se
propuso
cambiar
el
nombre
de
Mat
por
el
de
ECP
(“E.
coli
common
pilus”)
[42].
Además
de
estar
altamente
conservado
en
E.
coli,
se
han
identificado
homólogos
de
ecpA
en
los
genomas
de
Shigella
boydii,
Aeromonas
hydrophila,
Yersinia
mollaretii
[42],
Serratia
proteamaculans,
S.
odorifera,
Klebsiella
sp.
y
Enterobacter
cancerogenus
[14].
El
papel
de
ECP
en
adherencia
fue
analizado
por
primera
vez
para
EHEC
por
Rendón
y
colaboradores
(2007).
En
este
trabajo,
los
autores
determinaron
que
la
eliminación
de
ecpA
disminuye
significativamente
la
capacidadde
adherencia
de
esta
bacteria
a
células
en
cultivo,
así
como
de
algunas
cepas
comensales,
siendo
éste
el
primer
reporte
de
una
fimbria
involucrada
en
la
adherencia
de
EHEC
[42].
Aunque
se
20
desconoce
el
papel
que
pueda
jugar
ECP
in
vivo,
resultados
obtenidos
con
diferentes
patotipos
de
E.
coli
han
permitido
proponer
que
ECP
juega
un
papel
como
factor
de
adherencia
accesorio
y/o
favorece
la
interacción
entre
bacterias
durante
la
colonización.
Por
ejemplo,
resultados
obtenidos
por
Blackburn
y
colaboradores
(2009),
donde
analizaron
la
presencia
y
expresión
de
ECP
en
ETEC,
muestran
que
el
80%
de
las
cepas
probadas
resultaron
positivas
para
ecpA,
y
en
53%
de
las
43
cepas
analizadas
se
detectó
a
la
proteína.
Estas
cifras
representan
un
porcentaje
mayor
que
el
reportado
para
cualquiera
de
los
factores
de
colonización
conocidos
para
esta
bacteria
[3].
Un
estudio
similar
hecho
en
EPEC
muestra
que
una
alta
proporción
de
los
serotipos
de
EPEC
probados
(63%)
producen
ECP
cuando
se
crecen
en
medio
DME
a
37ºC
con
5%
de
CO2
[46],
condiciones
que
inducen
la
expresión
de
factores
de
virulencia
[11,
18,
41,
45].
En
este
trabajo
también
analizaron
la
capacidad
de
adherencia
a
células
HeLa
de
la
cepa
mutante
en
ecpA
y
observaron
una
disminución
de
19%
con
respecto
a
la
cepa
silvestre,
lo
cual
representa
una
disminución
moderada
en
comparación
con
la
observada
para
la
mutante
de
BFP
(90%).
El
efecto
moderado
de
la
mutación
en
ecpA
se
debe
a
la
presencia
de
las
adhesinas
BFP
e
intimina,
las
cuales
tienen
un
papel
más
importante
en
adherencia.
Sin
embargo,
al
mutar
a
ecpA
en
una
cepa
curada
del
plásmido
EAF
(la
cual
no
expresa
a
BFP)
y
mutada
en
intimina,
se
observa
una
disminución
en
adherencia
de
99.1%
con
respecto
a
la
cepa
silvestre
[46].
En
el
caso
de
EAggEC,
donde
la
adherencia
a
células
en
cultivo
está
principalmente
mediada
por
las
fimbrias
de
adherencia
agregativa
(AAF,
por
sus
siglas
en
inglés)
I,
II
y
III,
una
mutación
sencilla
en
ecpA,
no
afecta
la
capacidad
de
adhesión
de
la
bacteria.
Sin
embargo,
en
una
cepa
negativa
para
las
AAF
I
y
II,
el
número
de
bacterias
que
se
adhieren
a
células
en
cultivo
se
reduce
en
un
98%
cuando
se
muta
a
ecpA,
sugiriendo
que
ECP
tiene
un
papel
en
adherencia
[1].
Al
igual
que
en
ETEC,
ecpA
se
encuentra
conservado
en
casi
todas
las
cepas
probadas
(96.2%
de
130)
y
de
éstas
el
63%
produce
ECP
en
las
condiciones
usadas.
Mientras
que
los
genes
que
codifican
para
AAF/I
y
AAF/II
se
encuentran
sólo
en
el
5.4
y
3.1%,
respectivamente
(AAF/III
se
encuentra
aun
en
menor
proporción)
[1].
21
Además
de
su
papel
como
factor
de
adherencia,
existen
resultados
que
apuntan
hacia
la
importancia
de
las
fimbrias
ECP
en
procesos
como
formación
de
biopelículas
e
interacción
con
espinacas.
Lehti
y
colaboradores,
en
2010,
demostraron
que
ECP
es
esencial
para
la
formación
de
biopelículas
en
MENEC,
ya
que
mutantes
en
cualquiera
de
los
genes
del
operón
pierden
la
capacidad
de
formar
esta
estructura
cuando
se
crecen
en
medio
M63
a
27ºC
[24].
Por
otro
lado,
se
sabe
que
una
de
las
maneras
en
las
que
se
transmiten
las
bacterias
entéricas
es
mediante
el
consumo
de
agua
o
alimentos
contaminados.
Por
esta
razón
otro
de
los
papeles
que
se
han
propuesto
para
ECP
está
relacionado
con
la
supervivencia
en
el
ambiente
y
la
transmisión.
Saldaña
y
colaboradores
en
2011,
demuestran
que
EHEC
es
capaz
de
colonizar
hojas
de
espinacas
y
que
esta
colonización
es
dependiente
de
la
producción
de
flagelos
y
fimbrias,
entre
ellas
ECP.
La
mutante
en
ecpA
mostró
una
reducción
del
83%
en
el
número
de
bacterias
que
se
adhirieron
a
hojas
de
espinacas
[47].
Las
fimbrias
ECP
están
codificadas
en
el
operón
ecp,
el
cual
está
formado
por
6
genes
denominados
ecpRABCDE
(matA-‐F)
(Fig.
6)
[38].
El
primer
gen,
ecpR
(matA),
codifica
para
una
proteína
reguladora
de
196
aa
denominada
EcpR.
Esta
proteína
contiene
un
motivo
HTH
de
unión
a
DNA
en
el
extremo
C-‐terminal
característico
de
la
familia
de
reguladores
transcripcionales
LuxR
[39].
El
segundo
gen,
ecpA,
codifica
para
una
proteína
de
195
aa
del
mismo
nombre.
EcpA
(MatB)
tiene
una
masa
molecular
de
18
kDa
y
es
la
subunidad
principal,
ya
que
se
encuentra
formando
la
barra
de
la
fimbria
y,
aunque
no
guarda
homología
con
ninguna
pilina
descrita
hasta
la
fecha,
tiene
cierta
identidad
con
EcpD.
Esta
última
está
codificada
por
el
quinto
gen
del
operón
y
se
ha
visto
que
se
localiza
en
la
punta
de
la
fimbria
y
presenta
una
afinidad
mayor
a
células
en
cultivo
que
EcpA,
por
lo
que
se
ha
propuesto
que
actúa
como
adhesina
[14].
Por
su
parte,
EcpC
se
predice
como
una
proteína
“usher”,
mientras
que
EcpB
y
EcpE
se
proponen
como
chaperonas
[14].
Se
sabe
que
los
genes
ecpABCDE
son
esenciales
para
la
síntesis
de
la
fimbria,
ya
que
mutantes
en
cualquiera
de
éstos
no
expresan
a
la
subunidad
ni
producen
fimbrias
[23
y
Martínez-‐Santos,
datos
no
publicados].
22
Aunque
el
operón
está
conservado
en
varias
cepas,
la
organización
de
éste
puede
variarentre
ellas.
Por
ejemplo,
en
E.
coli
el
primer
gen
es
ecpR,
mientras
que
en
C.
rodentium
el
primer
gen
es
ecpA.
En
esta
bacteria,
ecpR
se
encuentra
en
orientación
contraria
al
resto
de
los
genes
y
corriente
abajo
del
gen
ROD_29251,
el
cual
a
su
vez
está
corriente
abajo
de
ecpE
(Fig.
6).
La
localización
en
el
cromosoma
también
es
diferente,
ya
que
mientras
en
EPEC
se
encuentra
en
una
región
aparentemente
no
codificante,
en
C.
rodentium
el
operón
se
localiza
corriente
abajo
del
operón
fim.
Aunque
existe
una
clara
homología
entre
los
operones
ecp
de
C.
rodentium
y
de
E.
coli,
los
porcentajes
de
identidad
entre
las
proteínas
codificadas
no
son
muy
altos
(20%,
48%,
42%,
43%,
33%
y
33%,
para
ecpRABCDE,
respectivamente)
(Fig.
3).
!"#$%&
ecp
A B C D E R fimk ROD29251
C.rodentium
A B C D E R
Regulador Pilina
Probable
chaperona
Probable
Usher
Probable
adhesina
Probable
chaperona
EPEC
!"#$ %&#$ %!#$ %'#$ ''#$ ''#$ Identidad entre las proteínas de
C.rodentium y EPEC
Fig.
6.
Comparación
entre
los
operones
ecp
de
C.
rodentium
y
EPEC.
El
operón
ecp
(en
azul)
se
encuentra
tanto
en
C.
rodentium
(arriba)
como
en
EPEC
(abajo).
El
gen
fimK
se
encuentra
corriente
arriba
del
operón
ecp
en
C.
rodentium
y
el
probable
gen
ROD29251
corriente
debajo
de
éste.
Tanto
fimk
como
ROD29251
codifican
para
proteínas
con
probables
dominios
EAL.
Mientras
tanto,
las
regiones
aledañas
a
ecp
en
EPEC
contienen
secuencias
no
codificantes.
La
barra
negra
representa
la
longitud
en
Kb
del
operón
y
se
encuentra
marcada
cada
500
pb.
En
la
parte
de
abajo
se
especifica
la
función
o
probable
función
que
tienen
los
productos
de
los
genes
y
los
porcentajes
de
identidad
entre
las
proteínas
de
C.
rodentium
y
sus
homólogos
en
EPEC
.
Una
característica
interesante
del
operón
ecp
de
C.
rodentium
es
la
presencia
en
esta
región,
de
dos
genes
que
codifican
para
probables
proteínas
reguladoras,
uno
23
corriente
arriba
de
ecpA
(fimK)
y
otro
corriente
abajo
de
ecpE
(ROD_29251).
fimK
mide
aproximadamente
1.2
kb
y
codifica
para
la
proteína
de
419
aa
FimK.
Esta
proteína
contiene
un
dominio
EAL
y
se
ha
visto
que
regula
de
manera
negativa
la
expresión
de
las
fimbrias
tipo
I
en
K.
pneumoniae
[44].
Por
su
parte,
el
gen
ROD_29251
mide
aproximadamente
1.5
kb
y
se
encuentra
307
pb
corriente
abajo
de
ecpE
en
la
misma
orientación.
Este
gen
codifica
para
una
proteína
que
contiene
un
dominio
EAL,
el
cual
está
relacionado
con
la
regulación
del
segundo
mensajero
c-‐di-‐GMP
(ver
arriba).
3.
Antecedentes
Como
se
mencionó
anteriormente,
el
primer
gen
del
operón
ecp
codifica
para
la
proteína
reguladora
EcpR,
la
cual
posee
un
dominio
HTH
de
unión
a
DNA
característico
de
la
familia
LuxR.
Proteínas
pertenecientes
a
esta
familia
actúan
como
activadores
o
represores
clásicos,
uniéndose
a
secuencias
repetidas
invertidas
cercanas
a
la
región
promotora
[34].
Se
ha
reportado
que
en
EPEC
y
EHEC,
EcpR
actúa
como
regulador
positivo
de
la
expresión
de
ECP,
ya
que
una
mutante
en
ecpR
muestra
una
reducción
del
67%
en
la
producción
de
las
fimbrias
con
respecto
a
la
cepa
silvestre;
este
mismo
efecto
se
observa
al
analizar
la
producción
de
la
subunidad
por
“western
blot”.
Consistente
con
su
papel
como
regulador
positivo,
la
sobre
expresión
de
EcpR
aumenta
hasta
30
veces
la
expresión
de
una
fusión
transcripcional
y
en
50%
la
producción
de
las
fimbrias,
con
respecto
a
la
cepa
mutante
[29].
Además
de
regular
la
expresión
de
ecp,
EcpR
también
regula
la
expresión
del
operón
flhDC,
el
cual
codifica
para
un
regulador
de
los
genes
de
síntesis
del
flagelo,
pero
en
este
caso
de
manera
negativa
[23].
Consistente
con
la
presencia
de
un
dominio
HTH
de
unión
a
DNA
en
EcpR,
se
ha
detectado
la
unión
específica
de
ésta
a
las
regiones
reguladoras
tanto
de
flhDC
como
de
ecp
[23,
29].
Para
el
caso
del
operón
ecp,
se
ha
visto
que
EcpR
se
une
a
la
región
reguladora
en
dos
sitios
TTCCT,
localizados
entre
las
posiciones
-‐185
y
-‐189
y
-‐207
y
-‐
24
211,
con
respecto
al
sitio
de
inicio
de
la
transcripción,
el
cual
se
localiza
a
121
pb
corriente
arriba
del
codón
de
inicio
de
ecpR
(Fig.
7)
[29].
Esta
unión
está
mediada
por
el
dominio
HTH
de
unión
a
DNA,
ya
que
una
mutante
puntual
en
este
dominio
pierde
la
capacidad
de
activar
la
expresión
de
fusiones
transcripcionales
y
la
producción
de
EcpA,
así
como
de
unirse
a
DNA,
como
se
determinó
por
ensayos
de
“footprinting”
in
vivo
[29].
Como
ocurre
con
otros
operones
fimbriales,
la
regulación
del
operón
ecp
no
sólo
está
mediada
por
el
regulador
codificado
dentro
del
operón,
sino
también
por
los
reguladores
globales
H-‐NS,
IHF
y
RcsB
[25,
29].
H-‐NS
regula
de
manera
negativa
la
expresión
del
operón,
mientras
que
IHF
lo
hace
de
manera
positiva,
eliminando
la
represión
ejercida
por
H-‐NS
[29].
Por
su
parte,
RcsB
actúa
como
regulador
positivo
uniéndose
a
la
caja
RcsB
localizada
entre
las
posiciones
-‐219
y
-‐206,
con
respecto
al
sitio
de
inicio
de
la
transcripción
(Fig.
7)
[25].
A
pesar
de
que
EcpR
es
considerada
como
miembro
de
la
familia
LuxR
de
proteínas
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