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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS FACULTAD DE CIENCIAS BIOMEDICINA “Análisis Funcional del Regulador LysR LtrR de Salmonella enterica serovar Typhi” TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS PRESENTA: NOÉ BECERRA LOBATO TUTOR PRINCIPAL DE TESIS: Dr. Ismael Hernández Lucas FACULTAD DE CIENCIAS, UNAM. COMITÉ TUTOR: Dr. Juan Miranda Ríos FACULTAD DE CIENCIAS, UNAM. Dr. Alejandro García de los Santos FACULTAD DE CIENCIAS, UNAM. MÉXICO, D.F. SEPTIEMBRE, 2014. UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS FACULTAD DE CIENCIAS BIOMEDICINA “Análisis Funcional del Regulador LysR LtrR de Salmonella enterica serovar Typhi” TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS PRESENTA: NOÉ BECERRA LOBATO TUTOR PRINCIPAL DE TESIS: Dr. Ismael Hernández Lucas FACULTAD DE CIENCIAS, UNAM. COMITÉ TUTOR: Dr. Juan Miranda Ríos FACULTAD DE CIENCIAS, UNAM. Dr. Alejandro García de los Santos FACULTAD DE CIENCIAS, UNAM. MÉXICO, D.F. SEPTIEMBRE, 2014. VNIV[!R."'DAD NAqONAL AVl'N°MA DE MDU(,O Dr. Isidro Ávila Martínez POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS FACULTAD DE CIENCIAS DIVISiÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO Director General de Administración Escolar, UNAM Presente OFICIO FCIE/DEP/402/14 ASUNTO: Oficio de Jurado Me permito informar a usted que en la reunión ordinaria del Comité Académico del Posgrado en Ciencias Biológicas, celebrada el día 26 de mayo de 2014 se aprobó el siguiente jurado para el examen de grado de MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS en el campo de conocimiento de Biomedicina del (la) alumno (a) BECERRA LOBATO NOÉ con número de cuenta 95359382 con la tesis titulada "Análisis Funcional del Regulador LysR LtrR de Salmonella enterica serovar Typhi", realizada bajo la dirección del (la) DR. ISMAEL HERNÁNDEZ LUCAS: Presidente: Vocal: Secretario: Suplente: Suplente: DRA. BERTHA MARIA JOSEFINA GONZÁLEZ PEDRAJO DRA. JUDITH MIRIAM BOBADILLA DEL VALLE DR. JUAN MIRANDA Ríos DR. CHRISTIAN SOHLENKAMP DR. ALEJANDRO GARCíA DE LOS SANTOS Sin otro particular, me es grato enviarle un cordial saludo. MCANMJFM/ASR/ipp Atentamente "POR MI RAZA HABLARA EL EspíRITU" Cd . Universitaria, D.F., a 8 de agosto de 2014 ;1\. U G..o~<U; . Dra. María del Coro Arizmendi Arriaga Coordinadora del Programa Agradecimientos Al posgrado en ciencias Biológicas de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) por fortalecer mi formación académica y por el conocimiento adquirido en sus instalaciones, el cual permitió desarrollar el presente trabajo. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por la beca recibida durante los estudios de posgrado y a la Dirección General de Asuntos del Personal Académico por la beca recibida a través del Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (DGAPA-PAPIIT IN203312), ayuda que sirvió para la culminación del presente trabajo. Al Dr. Ismael Hernández Lucas por la dirección de tesis, conocimientos, enseñarme a analizar problemas que se presentan en la investigación y pensar en la mejor solución para resolverlos, por la paciencia y apoyo a mi formación y al presente trabajo, por disponer de tiempo siempre que se lo pedí y mostrarme que el esfuerzo y la persistencia siempre nos llevarán a lograr nuestros objetivos. Al Dr. Juan Miranda Ríos por haber aceptado ser miembro de mi comité tutoral, por su tiempo siempre que lo requerí, preguntas para reflexionar, consejos y críticas que cada semestre enriquecieron mi formación y el presente trabajo. Al Dr. Alejandro García de los Santos, por haber aceptado ser parte de mi comité tutoral, por sus consejos, críticas, recomendaciones y disponibilidad de tiempo, además de haber contribuido de manera importante en mi formación académica. Al Dr. Miguel Ángel Ramírez al formar parte de mi comité tutoral, por sus críticas, recomendaciones y por el apoyo que me bridó para mejorar el trabajo. A los sinodales: Dra. Bertha González, Dra. Miriam Bobadilla, Dr. Juan Miranda, Dr. Christian Sohlenkamp y Dr. Alejandro García por disponer del tiempo para la revisión de tesis, críticas y comentarios. Agradecimientos personales A la Universidad Nacional Autónoma de México, por proporcionarme una educación académica de gran calidad desde el nivel medio superior y por brindarme todos los recursos necesarios para culminar la presente etapa. Al Dr. Ismael Hernández Lucas, por resolver mis dudas y contar siempre con su apoyo en todos los aspectos. A los Dres. Edmundo Calva y José Luis Puente, por ser parte de su laboratorio de investigación. Al Dr. Calva, por sus conocimientos compartidos, atención, valiosos consejos durante los seminarios, por su participación, apoyo, gran interés y recomendaciones en el proyecto. A los compañeros del laboratorio cuya participación fue valiosa en la realización del presente trabajo: Alejandra Vázquez, Marcos Fernández, Amapola Blanco, Rosalba Gonzáles, Elvira Villa, José Luis Gama y Rebeca Herrera. A Lucas-Team: Lili, Esteban, José Miguel y Lorena, por todo lo que aprendí de ellos, por su amistad, consejos, por haber hecho siempre juntos de nuestra área de trabajo un ambiente de respeto, convivencia, apoyo y ayuda incondicional. A Ricardo por contestar mis preguntas, por los reactivos, primers, soluciones y/o cepas que amablemente me proporcionó cuando los llegué a requerir y por el tiempo que además de investigador dedica para estar al pendiente del buen funcionamiento del equipo de laboratorio y de la disponibilidad de material en vacaciones, ayuda que me permitió avanzar en el proyecto. A Carmen Guadarrama por haber aclarado mis dudas y estar siempre dispuesta a hacerlo, por sus charlas, consejos, ayuda y recomendaciones que tuve de ella para mejorar los experimentos realizados. A los miembros del laboratorio Calva-Puente: Crispín, Magdalena, Nayeli, Carmen, Panchito, Vero, Víctor, Deyanira, Luary, Irene, Ramón, Sara y Abraham, por su ayuda, convivencia, pláticas o consejos que tuve de ellos. A Deyanira, Olga Nohemí Hernández y Nancy Velázquez por contar siempre con su ayuda desde la licenciatura hasta la fecha. A Guadalupe Ramírez por su compañía, ayuda, por ser una gran persona y ejemplo. A Silvia, Carlo y Gabo por su amistad, convivencia, platicas, risas, porras de siempre y por su enseñanza constante en otro idioma. A todos mis amigos y personas que me quieren, porque de alguna manera siempre están conmigo. 3 Dedicatoria A mi madre por todo lo que aprendo de ella día a día, por su gran ejemplo,comprensión y apoyo incondicional, por estar conmigo siempre. A Fredy, Myriam, Maricruz, Valeria y Yaretzi por ser mi familia, por su cariño, compañía, amistad y apoyo que tengo siempre de ellos. 4 ÍNDICE RESUMEN……………………………………………………………………………................ 6 ABSTRACT…………………………………………………………………………………....... 7 1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………….............. 8 1.1. El género Salmonella…………………………………………………………...……. 8 1.2. Infección por Salmonella…………………………………………………………….. 9 1.3. Adhesión de Salmonella al hospedero………………………………….…………. 10 1.4. Vacuola Contenedora de Salmonella (VCS)……………………………................. 11 1.5. Islas de Patogenicidad en Salmonella (SPIs) y sistemas de secreción……...... 11 1.5.1. Isla de patogenicidad I en Salmonella (SPI-1)…………………..…………. 12 1.5.2. Isla de patogenicidad II en Salmonella (SPI-2)…………………………….. 13 1.6. Factores de virulencia…………………………………………………………..…… 14 1.7. Regulación transcripcional…………………………………………………..……… 15 1.8. Reguladores transcripcionales LysR (LTTRs)…………..……………………...... 17 1.9. LTTRs en Salmonella………………………………………………..……………….. 18 2. ANTECEDENTES……………………………………………………………....………….. 20 3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS……………………………………………………………….. 25 3.1. Hipótesis…………………………………………………………………………...…… 25 3.2. Objetivo general …………………………………………………………...…............. 25 3.3. Objetivos particulares ……………………………………………….…..................... 25 4. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………...……… 26 4.1. Cepas, plásmidos y oligonucleótidos…………………………………...…………. 26 4.2. Medios de cultivo y condiciones de crecimiento………………………………….. 29 4.3. Manipulación de DNA……………………………………………………………...... 30 4.4. Construcción de fusiones transcripcionales al gen reportero cat…………........ 32 4.5. Ensayos de expresión de las fusiones transcripcionales al gen reportero cat…………………………………………………………….……………. 34 4.6. Construcción de cepas mutantes………………………………….……………….. 35 4.7. Complementaciones……………………………………………….………………… 35 5 4.8. Análisis proteómico………………………………………………………................. 36 4.8.1. Extracción total de proteínas………………………….…………………...... 36 4.8.2. Electroforesis en gel de 2 dimensiones (2-DGE)...……….……………….. 36 4.8.3. Identificación de proteínas mediante espectrometría de masas………… 36 4.8.4. Búsqueda en la base de datos……………………………………….……… 37 4.9. Purificación y electroforesis de proteínas de membrana externa……….….…… 37 5. RESULTADOS……………………………………………………………………….......... 39 5.1. Expresión de la región reguladora STY0036 de S. Typhi IMSS-1 en MM-N y MA…………..………………………………………………………….……... 39 5.2. Análisis proteómico……………………………………………..……………….…… 40 5.3. Identificación de proteínas reguladas por STY0036……………..………….……. 41 5.4. Perfil de proteínas de membrana externa de las cepas S. Typhi IMSS-1 y S. Typhi IMSS-1 ∆STY0036……………………………………………….…………. 41 5.5. Expresión de las fusiones ompR, ompC y ompF en MM-N…………….……...... 42 5.6. Complementación en MM-N de la cepa S. Typhi IMSS-1 ∆STY0036 con la proteína STY0036……………………………………..…………………….……... 43 5.7. Activación de la transcripción de ompR mediante STY0036……….…….……... 44 5.8. Resistencia de S. Typhi IMSS-1 a deoxicolato de sodio……………..….……..... 46 5.9. Complementación de las cepas mutantes STY0036, ompR, ompC y ompC-ompF crecidas en LB con 5% de deoxicolato de sodio……………...……. 47 5.10. S. Typhi IMSS-1 ∆STY0036 como célula competente………………..….... 49 6. DISCUSIÓN……………………………………………………………………...…….……. 51 7. CONCLUSIONES………………………………………………………………….……..… 56 8. PERSPECTIVAS…………………………………………………………………….…..…. 57 9. ANEXO………………………………………………………………………………..……... 58 10. REFERENCIAS…………………………………….…….……………………………….. 79 6 RESUMEN Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi) es una bacteria de interés médico, causante de fiebre tifoidea en humanos. Por ello es importante entender su biología, mecanismos de invasión, sobrevivencia y replicación. Para iniciar el proceso de infección, S. Typhi se enfrenta dentro de su hospedero a severas condiciones de estrés, promoviendo la expresión de diversos reguladores transcripcionales, dentro de los cuales se encuentran los de la familia LysR (LysR- type transcriptional regulators; LTTR), éstos se encuentran involucrados en virulencia y en diversas funciones celulares. El trabajo se enfocó en el estudio de STY0036, un LTTR exclusivo del género Salmonella descrito por primera vez en el presente trabajo. Ensayos de expresión transcripcional con la región reguladora de STY0036, mostraron mayor expresión en un medio mínimo (MM-N), bajo en fosfato y magnesio, utilizado para inducir la expresión de algunos genes de la isla de patogenicidad SPI-2 (Salmonella Pathogenicity Island 2) en Salmonella a diferencia de un medio rico (medio MA), esta evidencia sugiere su participación en algún proceso de sobrevivencia intracelular. Mediante estudios de proteómica, perfiles de proteínas de membrana externa y análisis trascripcionales, se hizo evidente la regulación positiva de STY0036 sobre OmpR, y este regulador de la familia de dos componentes a su vez promueve la síntesis de las porinas OmpC y OmpF. Finalmente, para determinar el papel biológico de STY0036, se evaluó el crecimiento de la cepa silvestre, y las mutantes: STY0036, ompR, ompC, ompF y ompC-ompF en medio líquido Luria Bertani (LB) con la sal biliar deoxicolato de sodio, observando crecimiento sólo en la cepa silvestre y la mutante ompF, sugiriendo un papel de OmpC en la resistencia de S. Typhi a la sal biliar y por lo tanto a su sobrevivencia en los compartimentos intestinales. Además se descubrió que S. Typhi es más competente cuando OmpC y OmpF están ausentes. Con estos experimentos demostramos el papel esencial de STY0036 en la vía de regulación STY0036-ompR-ompC en presencia de la sal biliar deoxicolato de sodio. También se demostró que STY0036 está involucrado indirectamente en la transformación bacteriana. 7 ABSTRACT Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi) is an important human pathogen causing typhoid, also known as typhoid fever. Hence it is very important to study its biology and mechanism of pathogenicity. For infection S. Typhi has to withstand multiple stress conditions within its host, which promotes the expression of some transcriptional regulators. Among these regulators are those transcriptional regulators of the LysR family, also called LTTRs (LysR-type transcriptional regulators), which are involved in diverse cellular functions and virulence. The present study further examined the role of the regulator STY0036, an uncharacterized LTTR that is only found in the Salmonella genus. Expression of a transcriptional fusion of the STY0036 regulatory region was evaluated under two conditions: in N-minimal medium (N-MM) low in phosphate and magnesium which is usually used to induce expression of some SPI-2 (Salmonella Pathogenicity Island 2) genes and in nutrient-rich medium A (MA). The results showed that STY0036 was expressed more in N-MM as compared to MA, which suggests the involvement of STY0036 in intracellular survival processes. Through proteomic studies, transcriptional analysis and outer membrane protein profiles, it became clear that STY0036 regulates OmpR, and this response regulator of the two- component in turn promotes the synthesis of OmpC and OmpF porins. To determine the biological role of STY0036, the growth of the wild-type, and the mutants strains: STY0036, ompR, ompC, ompF and ompC-ompF was assessed in liquid Luria Bertani (LB) media containing sodium deoxycholate. The growth of wild-type strain and ompF mutant was similar, suggesting the role of OmpC in allow S. Typhi proliferation under this stress condition found in intestinal compartments. Also, we found that S. Typhi is more competent when OmpC and OmpF areabsent. We showed the essential role of STY0036 in STY0036-ompR- ompC genetic network in the presence of the bile salt sodium deoxycholate. Thus, the synthesis of the global regulator OmpR as well as the porins OmpC and OmpF were found to be dependent on the LysR regulator STY0036. In addition, we have data that shows that STY0036 participates in bacterial transformation. Introducción ________________________________________________________________________________________ 8 1. INTRODUCCIÓN 1.1. El género Salmonella En 1886 Daniel E. Salmon y su compañero Theobald Smith describen por primera vez el aislamiento de un bacilo Gram negativo, y se utiliza el nombre genérico de Salmonella en honor a los logros de Salmon (Schultz, 2008). Las bacterias del género Salmonella pueden infectar diversos mamíferos, reptiles, aves e insectos provocándoles enteritis, infección sistémica o fiebre entérica. El género consta de dos especies: Salmonella bongori (S. bongori) y Salmonella enterica (S. enterica). Esta última ha sido ampliamente estudiada, sus miembros son capaces de infectar a un amplio rango de hospederos y está constituida por seis subespecies: enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae e indica. Las subespecies con mayor importancia médica son: enterica y arizonae. Se han descrito 2557 diferentes serovares, el 99% pertenece a la subespecie enterica, causantes de enfermedades en animales de sangre caliente (Grimont y Weill, 2007). Los mecanismos de transmisión usualmente son tres: consumir alimentos y agua contaminada a través de la interacción directa con animales infectados y por contacto con materia fecal contaminada. La gravedad de la enfermedad depende del serotipo de Salmonella y la especie del hospedero. Hay dos síndromes clínicos asociados con la infección en el humano por S. enterica: Salmonelosis no tifoidea (enfermedad gastrointestinal conocida como gastroenteritis) y fiebre tifoidea (enfermedad sistémica) (Layton y Galyov, 2007). S. enterica serovar Typhi (S. Typhi) y S. enterica serovar Paratyphi (S. Paratyphi) están restringidas al humano, estos serovares causan fiebre tifoidea y paratifoidea respectivamente, llegan a provocar enfermedad sistémica si no se trata oportunamente. Ocasionan enfermedad febril en poblaciones empobrecidas con saneamiento inadecuado donde también los viajeros son susceptibles (Crump y Mintz, 2010). En el año 2000 la fiebre tifoidea causó aproximadamente 21.7 millones de enfermos y 217 mil muertes, y la fiebre paratifoidea un estimado de 5.4 millones de enfermos a nivel mundial (Crump et al., 2004). Introducción ________________________________________________________________________________________ 9 S. enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) y S. enterica serovar Enteritidis (S. Enteritidis) causan gastroenteritis en humanos y en otros animales. La gastroenteritis es una enfermedad emergente en África, causa daño a niños y adultos inmunodeprimidos, aproximadamente el 10% de 20 millones de adultos con VIH desarrollan la infección al año en este continente, a pesar de usar antibióticos como tratamiento (Santos et al., 2009). En varios países del mundo, S. enterica infecta al humano, provocando un serio problema de salud pública por ser una de las principales causas de enfermedades entéricas. 1.2. Infección por Salmonella En la naturaleza, la infección por S. enterica ocurre por la ingestión de comidas, agua contaminada o por contacto con personas portadoras. Después de la ingestión de un número suficiente de bacterias, una parte del inóculo sobrevive a un ambiente del estómago bajo en pH para posteriormente entrar al intestino delgado donde se establece la infección. Después de entrar al intestino delgado, Salmonella inicia la infección invadiendo el tejido linfoide del hospedero, incluyendo las placas de Peyer, a continuación se adhiere apicalmente a las células epiteliales del íleon y a las células M que debido a la ausencia del borde del cepillo así como de glicocalix, representan una puerta de entrada para las enterobacterias (Jensen et al., 1998; Jepson y Clark, 2001). Enseguida Salmonella entra a la barrera epitelial y principalmente infecta fagocitos dentro de la lámina propia. En la gastroenteritis la infección es generalmente autolimitada y no avanza más allá de la lámina propia, sin embargo en la salmonelosis causante de la fiebre tifoidea, los fagocitos infectados por Samonella acceden a los vasos linfáticos y al torrente sanguíneo, permitiendo así la diseminación de las bacterias al hígado y bazo (Vázquez-Torres et al., 1999). De esta manera, Samonella al diseminarse en su hospedero, puede llegar y persistir en la vesícula biliar y en la médula ósea (Sinnott y Teall, 1987; Wain et al., 2001). Introducción ________________________________________________________________________________________ 10 S. Typhi ha sido encontrada formando biopelículas en cálculos biliares del 5% de pacientes a quienes se les ha eliminado la vesícula biliar en la ciudad de México, además los cálculos biliares han demostrado desempeñar un papel importante en la persistencia de Salmonella, en la inducción de éstos en ratones dio como resultado una mayor excreción fecal y un aumento en la colonización del tejido de la vesícula biliar (Crawford et al., 2010a). 1.3. Adhesión de Salmonella al hospedero Como se ha mencionado, la adhesión al huésped es un paso crucial durante la patogénesis. Los sistemas de adhesión en S. enterica han sido organizados en dos grupos principales: adhesinas fimbriales y no fimbriales, y se diferencian de acuerdo con sus vías de ensamblaje (Soto y Hultgren, 1999). Como ejemplo del primer grupo, en Salmonella se han predicho 13 loci fimbriales, algunos de los cuales son inducidos in vivo y son requeridos para la formación de biopelículas, unión a la célula hospedera y colonización (Humphries et al., 2001). En contraste a las adhesinas fimbriales, las no fimbriales comprenden adhesinas mono y oligoméricas que son transportadas a través de un sistema de secreción tipo I o autotransportadas a través de las membranas de la bacteria. Además varias estructuras de la superficie de Salmonella no involucradas en la adhesión también contribuyen a la unión y colonización de los tejidos en el huésped. Una de esas estructuras es el flagelo, constituido por una proteína polimérica necesaria para la motilidad y otras formas de movimiento dirigido. Los flagelos también se involucran en quimiotaxis, inducción de respuesta inmune e inflamación y contribuyen a la unión y colonización de tejidos de la mucosa (Ramos et al., 2004). Mutaciones en genes estructurales y ensamble de flagelos afectan la capacidad de las mutantes para adherirse a las superficies cubiertas por colesterol, entre estos FliC, la subunidad principal y conservada de los flagelos. La unión de FliC al colesterol podría ser un paso inicial de Salmonella para colonizar y formar biopelículas en cálculos biliares en humanos (Crawford et al., 2010b). Introducción ________________________________________________________________________________________ 11 Para los lipopolisacáridos (LPS), componentes de la membrana celular externa de las bacterias Gram negativas, no hay un factor de unión específico, su efecto adhesivo se le atribuye a su carácter anfipático. Las moléculas de LPS en su totalidad son requeridas para la colonización de tejidos del huésped. Se ha demostrado que cepas deficientes en LPS son incapaces de competir ante cepas silvestres en experimentos de colonización en ratones (Nevola et al., 1985). 1.4. Vacuola Contenedora de Salmonella (VCS) Posterior a la internalización celular, Salmonella sobrevive y se replica dentro de un fagosoma modificado, conocido como Vacuola Contenedora de Salmonella (VCS), inicialmente caracterizado porla acumulación de endosomas tempranos, éstos contienen marcadores de la vía endocítica temprana como EEA1, Rab5 y receptores de transferrina, posteriormente dentro de los siguientes 15 a 60 minutos, proteínas del endosoma temprano se sustituyen por proteínas normalmente encontradas en el endosoma tardío o lisosomas, tales como LAMPs (proteínas de membrana asociadas a lisosomas) y ATPasas tipo vacuolar. Además las VCS son asociadas con filamentos inducidos por Salmonella en células epiteliales (Steele-Mortimer et al., 1999). La sobrevivencia intracelular de Salmonella es debido a que la bacteria transloca varias proteínas efectoras hacia el citosol de la célula hospedera a través de un sistema de secreción tipo III (SST3) codificado por SPI-2. 1.5. Islas de Patogenicidad en Salmonella (SPIs) y sistemas de secreción Las islas de patogenicidad son secuencias de DNA que se caracterizan por contener genes asociados a virulencia y pueden estar tanto en plásmidos, como en cromosomas bacterianos. Las SPIs se describieron por primera vez en E. coli, posteriormente se encontraron en varios genomas de bacterias patógenas de humanos y plantas. Las SPIs son fragmentos de un tamaño de 10 a 200 kb, se presentan en genomas de cepas patógenas y están ausentes en especies no patógenas (Hacker y Kaper, 2000). En los genomas secuenciados de Salmonella enterica se han identificado y caracterizado algunos genes involucrados en Introducción ________________________________________________________________________________________ 12 patogénesis, tales genes se encuentran en las SPIs y la adquisición de estas ayudan a la bacteria a invadir, replicar y dispersarse dentro del ambiente hostil del hospedero (Marcus et al., 2000). A la fecha, en el género Salmonella se han descrito 21 SPIs (Sabbagh et al., 2010). Las islas de patogenicidad 1 y 2 (SPI-1 y SPI-2) han sido las más estudiadas, ambas codifican proteínas efectoras y un SST3 mediante el cual las proteínas son translocadas al hospedero, además un sistema de secreción tipo I (SSTI) es corregulado por SPI-1. El SST3 es usado por bacterias patógenas para liberar factores de virulencia a la célula hospedera e interferir o subvertir sus vías de señalización. Constan de más de 20 tipos de proteínas, algunas de las cuales son homólogas a las involucradas en la construcción del flagelo. Salmonella codifica dos SST3, uno en SPI-1 y otro en SPI-2. El SST3 de SPI-1 es requerido para la invasión de células no fagocíticas, inducción de respuesta inflamatoria intestinal y diarrea, así como la colonización del intestino, en contraste el SST3 codificado por SPI-2 es esencial en la sobrevivencia dentro del macrófago y el establecimiento de la enfermedad sistémica (Haraga et al., 2008). 1.5.1. Isla de patogenicidad I en Salmonella (SPI-1) En 1989, se identificaron en Salmonella genes esenciales para la invasividad bacteriana en cultivos celulares (Galán y Curtis, 1989), posteriormente se mostró la completa expresión de virulencia oral en parte de una isla de patogenicidad adquirida por transferencia horizontal, la SPI-1 (Mills et al., 1995). BapA y SiiE son dos proteínas asociadas a superficie implicadas en la invasión y adhesión, son secretadas por los sistemas BapBCD y SiiCDF respectivamente a través del sistema de secreción tipo I (Latasa et al., 2005; Gerlach et al., 2007). SiiE es codificada en SPI-4 y corregulada con SPI-1 (Morgan et al., 2007; Main- Hester et al., 2008). Una vez adherida la bacteria a su hospedero, emplea la SPI-1 para codificar el SST3 y translocar proteínas efectoras a través de un inyectisoma. El SST3 puede translocar al menos 15 proteínas a la célula hospedera, cuatro de ellas, Introducción ________________________________________________________________________________________ 13 SopE/SopE2, SopB y SipA en conjunto, inducen rearreglos de actina requeridos para la invasión, las restantes en su mayoría están implicadas en procesos posteriores a la invasión, incluyendo la supervivencia de la célula huésped, la biogénesis de las VCS y la modulación de la respuesta inflamatoria. Aunque inicialmente fue caracterizada como isla de invasividad, SPI-1 tiene funciones relacionadas con la activación de las vías inmunes innatas. En macrófagos infectados por Salmonella, la flagelina es translocada al citosol a través del SST3, dando como resultado la activación del inflamasoma y la caspasa responsable de la mediación de la muerte celular (Ren et al., 2006; Miao et al., 2007; Sun et al., 2007). En el epitelio intestinal, la flagelina induce la inflamación mientras inhibe la apoptosis vía TLR5, la flagelina debe ser translocada hacia el lado basolateral de las células epiteliales, dada a la nula expresión de TLR5 en la superficie apical (Gewirtz et al., 2001; Vijay-Kumar et al., 2006). Los flagelos son regulados usualmente dentro del hospedero, aunque dentro de los macrófagos se ha sugerido pueden ser inducidos por el SST3 (Sano et al., 2007). 1.5.2. Isla de patogenicidad 2 en Salmonella (SPI-2) SPI-2 es esencial para la sobrevivencia intracelular y la virulencia sistémica en la tifoidea murina (Hensel et al., 1995; Ochman et al., 1996), además las proteínas translocadas por el SST3 de la isla interfieren con el tráfico de oxidasas NADPH hacia las VCS, evitando así la exposición de la bacteria a especies reactivas tóxicas de oxígeno (Vázquez-Torres et al., 2000). El SST3 codificado en la SPI-2 se involucra en enfermedades inflamatorias, indicando que las actividades de la isla son críticas para la inducción temprana y completa de enterocolitis, así como la enfermedad sistémica (Coombes et al., 2005; Coburn et al., 2005; Bispham et al., 2001). SPI-2 está involucrada en la inducción de la ciclooxigenasa, así como la modulación de la expresión y señalización de citocinas del hospedero (Uchiya et al., 2004). Introducción ________________________________________________________________________________________ 14 El SST3 de SPI-2 se expresa al detectar el ambiente fagosomal. Su función en patogénesis se ha estudiado y se ha mostrado que es esencial en la virulencia en el modelo de infección del ratón (Shea et al., 1996; Hensel et al., 1995). Dos genes, spvB y spvC codifican los principales factores de virulencia mediada por plásmidos en S. Typhimurium (Matsui et al., 2001). Ambos factores son translocados a la célula hospedera a través del SST3 de la SPI-2 (Browne et al., 2008; Mazurkiewicz et al., 2008). El gen spvB codifica una enzima que desestabiliza el citoesqueleto de las células eucariotas y también se asocia con la citoxicidad de las células huéspedes (Lesnick et al., 2001; Tezcan-Merdol et al., 2001; Kurita et al., 2003; Browne et al., 2008). SpvC puede inactivar las proteínas cinasas activadas por los mitógenos Erk1/2, JNK y p38 en células de mamíferos (Li et al., 2007; Mazurkiewicz et al., 2008). Al menos 20 proteínas efectoras en Salmonella se sabe que son translocadas por el sistema de secreción a través de la membrana fagosomal al citoplasma de la célula eucarionte, sin embargo sus funciones específicas en la replicación intracelular o modificación de movimiento vesicular permanecen sin entenderse (Haraga et al., 2008). Las SPIs contribuyen a la macroevolución al desarrollar variantes patogénicas, mientras el proceso de rearreglo, deleción y transferencia de estas tiene fuerte impacto en la microevolución y adaptación de los microorganismos patógenos durante el proceso de infección (Hacker y Kaper, 2000). 1.6. Factores de virulencia La mayoría de los factores de virulencia son codificados en las islas de patogenicidad, además de los sistemas de secreción, fimbrias y flagelos Salmonella tiene otros factores como superóxido dismutasas y transportadores de iones. Muchas de las células hospederas producen especies reactivasde oxígeno, en gran medida a través de la actividad NADPH oxidasa del fagosoma, requerida para eliminar patógenos intracelulares. Para contrarrestar esta actividad, Salmonella utiliza la superóxido dismutasa SodCl, que puede conferir protección de especies reactivas de oxígeno extracelulares. SodCI se encuentra en el Introducción ________________________________________________________________________________________ 15 periplasma y su resistencia a proteasas puede ser una propiedad fundamental para permitir su función en condiciones extremas del fagosoma (Krishnakumar et al., 2007; Pacello et al., 2008). Además de SodCI, S. Typhimurium cuenta con tres sistemas para la captación de Mg2+ que le permiten sobrevivir, estos son: CorA, MgtA y MgtB, cada uno de ellos es esencial para la virulencia. CorA es un canal de magnesio constitutivo y mutante de su gen atenúa la invasión y replicación en células epiteliales de ratón, y estudios de microarreglos de esta mutante, muestran la represión de varios efectores de virulencia (Papp-Wallace et al., 2008). Los transportadores MgtA y MgtB son expresados por el sistema de dos componentes PhoP/PhoQ (Blanc- Potard y Groisman, 1997) y son inducidos durante la infección, implicando el transporte de magnesio en virulencia (Smith et al., 1993). Otros dos sistemas implicados en la sobrevivencia intracelular de S. Typhimurium son el sistema captador de Zn2+ ZnuABC y el sistema transportador de K+ Trk. El sistema de transporte de K+ Trk, es un complejo de proteínas que funciona como un transportador de baja actividad, y puede funcionar dando resistencia a los péptidos antimicrobianos (Parra-López et al., 1994). El sistema captador de Zn2+ ZnuABC, es requerido para el crecimiento de S. Typhimurium en bajas condiciones del ion y mutantes en ZnuABC son deficientes para la virulencia en ratones (Ammendola et al., 2007). 1.7. Regulación transcripcional Las bacterias se adaptan a cambios ambientales drásticos cuando entran al hospedero, por ejemplo, cuando Salmonella se encuentra en el tracto gastrointestinal, sobrevive a una gran variedad de condiciones como son: pH ácido, baja concentración de oxígeno, alta o baja osmolaridad y bajas concentraciones de magnesio. Estas condiciones generan cambios en la expresión genética para permitir a la bacteria adherirse, invadir y replicarse dentro de su hospedero (Figueroa-Ochoa y Verdugo-Rodríguez, 2005). La estructura genómica de S. Typhi CT18 está constituida por un cromosoma circular de 4.8 Mb y dos plásmidos: pHCM1 de 218 kb, este codifica para la Introducción ________________________________________________________________________________________ 16 resistencia a múltiples antibióticos y el pHCM2 de 106 kb, un plásmido críptico (Parkhill et al., 2001). Dentro del genoma de Salmonella se localizan factores de transcripción (TFs), involucrados en procesos de infección y patogénesis (Figueroa-Ochoa y Verdugo-Rodríguez, 2005). Las bacterias cuentan con mecanismos complejos para regular la transcripción de sus genes y lo hacen a través de los TFs, de estos una docena se han identificado (Pérez-Rueda y Collado-Vides, 2000) de los cuales LacI, AraC, CRP, LysR y OmpR son los mayor caracterizados. El TF OmpR ha sido uno de los reguladores más extensamente estudiados en E. coli y Salmonella. OmpR junto con la proteína EnvZ pertenecen a la familia de reguladores de dos componentes, sistema responsable del estímulo respuesta, donde EnvZ es un sensor cinasa que recibe el estímulo y a su vez transmite la señal a OmpR, el regulador de respuesta que interactúa con el DNA. OmpR fosforilado por EnvZ regula la transcrpción de los genes ompF y ompC, así bajo condiciones de baja osmolaridad OmpR activa la transcripción de ompF, mientras que en alta osmolaridad reprime la transcripción de este y activa la de ompC (Mizuno y Mizushima, 1990). En E. coli se ha reportado el papel de OmpR en la síntesis de porinas (Hall y Silhavy 1981; Puente et al., 1991), en esta bacteria cuando se inactiva OmpR se afecta la expresión de 100 genes dentro de los cuales se encuentran algunos involucrados en motilidad, síntesis de curlis (Vidal et al., 1998), aminoácidos y metabolismos de carbohidratos (Oshima et al.,2002), también en E. coli OmpR regula negativamente el operón flhDC, el cual está involucrado en la síntesis de flagelos para la motilidad (Shin y Park, 1995) mientras en S. Typhimurium el papel de regulación del operón permanece sin esclarecerse. En S. Typhi se ha reportado que la expresión de OmpR se relaciona con la regulación de 305 genes (Perkins et al., 2009). Dentro de estos genes se encuentran los relacionados con la síntesis de porinas (Puente et al., 1991; Oropeza et al. 1999; Fernández-Mora et al., 2004). En S. Typhimurium OmpR controla la expresión del sistema de dos componentes SsrAB, este regula positivamente el SST3 codificado en SPI-2 (Garmendia et al., 2003). Introducción ________________________________________________________________________________________ 17 Además de OmpR, entre otros TFs presentes en S. Typhi que se describen más adelante se encuentran los miembros de la familia LysR (LTTRs), los cuales constituyen la familia de reguladores transcripcionales más abundantes en procariontes (Pareja et al., 2006). A diferencia de las proteínas reguladoras también se han reportado RNAs antisentido como micF que regula postranscripcionalmente genes que codifican para porinas (Andersen et al., 1989; Chou et al., 1993) y más recientemente se han descubierto sRNAs (small Ribonucleic Acids) con función de regulación transcripcional en bacterias, estos participan en la adaptación celular a los cambios ambientales y se ha mostrado que los sRNAs reguladores tienen un papel importante en la virulencia microbiana durante la infección (Michaux et al., 2014). El sRNA MicA, cuya sobreexpresión aumenta la motilidad en placas de agar blando también regula negativamente la expresión de algunas proteínas de membrana externa de E. coli y Salmonella (De Lay y Gottesman, 2012). 1.8. Reguladores transcripcionales LysR (LTTRs) Los LTTRs fueron descritos por primera vez en 1988 (Henikoff et al., 1988), activan la transcripción de genes, operones y regulones involucrados en diversas funciones celulares como: metabolismo de aminoácidos, división celular, virulencia, fijación de nitrógeno, respuesta a estrés oxidativo y degradación de xenobióticos (Schell, 1993; Maddocks y Oyston, 2008; Lönneborg y Brzezinski, 2011), se consideran reguladores duales por regular positiva y negativamente genes blanco y operones en diversos organismos (Schell, 1993). Los LTTRs poseen un tamaño aproximado de 300 a 350 aminoácidos, contienen una estructura muy conservada en la región N-terminal, la cual presenta un dominio de unión al DNA (DBD; DNA-Binding Domain) con un motivo hélice-vuelta-hélice alado (wHTH; winged Helix-Turn-Helix) y en la región C-terminal poseen un dominio de unión a un inductor (IBD; Inductor-Binding Domain) menos conservado. El IBD se subdivide en dos subdominios: RD1 y RD2 entre los cuales se encuentra una hendidura de unión al inductor. (Figura 1.1). Introducción ________________________________________________________________________________________ 18 La forma activa de un LTTR frecuentemente es un tetrámero, algunos forman dímeros en solución y esta estructura parece ser su forma activa, otros forman octámeros y también se ha reportado la estructura de hexámero (Tabla 1.1). Figura 1.1: Representación típica de un LTTR. Se muestra el dominio de unión al DNA con un motivo HTH en el extremo N- terminal y el dominio de unión al inductor (IBD) en extremo C-terminal. El IBD a su vez se divide en 2 subdominios, el RD1 y el RD2 conectados por una hendidura de unión al inductor. Datos sugieren un sitio adicional deunión al DNA (RD1) y un sitio de unión al inductor (RD2). Tabla 1.1: Estructura de los LTTRs reportados. Forma activa Ejemplos Referencias Dímero MetR, CatR, IlvY, NodD3, Nac, e IciA Maxon et al., 1990; Parsek et al., 1992; Fisher y Long, 1993; Bender, 1991; Muse y Bender, 1999; Thöny et al., 1991. Tetrámero NahR, CysB, OxyR, CbnR, DntR, ArgP, TsaR, AphB y LeuO Maddocks y Oyston, 2008; Schell et al., 1990; Hryniewicz y Kredich, 1994; Muraoka et al., 2003; Smirnova et al., 2004; Monferrer et al., 2010; Zhou et al., 2010; Taylor et al., 2012; Guadarrama et al., 2014. Hexámero HsdR Sainsbury et al., 2009; Ruangprasert et al., 2010; Gong et al., 2012. Octámero CrgA y ThnR López-Sánchez et al., 2009; Sainsbury et al., 2009. 1.9. LTTRs en Salmonella Las proteínas reguladoras de la familia LysR se encuentran involucradas en virulencia y diversas funciones celulares, algunos de estos reguladores se han estudiado en S. Typhimurium, por ejemplo IlvY es necesario para la regulación del gen ilvC implicado en la síntesis de isoleucina y valina (Blazey y Burns, 1984); OxyR modula la expresión de un regulón implicado en la respuesta celular frente a Introducción ________________________________________________________________________________________ 19 condiciones de estrés oxidativo (Christman et al., 1989); MetR es un regulador positivo de metA, metE y metH, en donde el producto de metA es una enzima requerida para la síntesis de O-succinil homoserina en el primer paso del ciclo para la síntesis de metionina (Mares et al., 1992) y los productos de metE y metH son enzimas requeridas para la síntesis de metionina (Byerly et al., 1991); SpvR es un regulador de la expresión del operón de virulencia spvRABCD; CysB es una proteína tipo LysR encargada de regular la síntesis de cisteína en presencia del inductor N-acetyl-L-serina, (Hryniewicz y Kredich, 1994; Quan et al., 2002 ); SinR es una proteína requerida en la motilidad (Folkesson et al., 2002); Hrg juega un papel crucial en la virulencia de Salmonella dentro del macrófago (Lahiri et al., 2008); HdfR activa la transcripción del operón fimbrial std y posee un papel en la adhesión de Salmonella a secciones específicas intestinales (Jakomin et al., 2008); la proteína YfeR está involucrada en la regulación de un putativo transportador dependiente de Na+ (YfeH) a bajas concentraciones de osmolaridad y se sugiere que este regulador es requerido para un óptimo crecimiento en condiciones de baja osmolaridad (Baños et al., 2011) y YdcI está involucrado en la resistencia a estrés ácido (Jennings et al., 2011). En S. Typhi, se ha descrito a la proteína LeuO, ésta posee un papel en la regulación de porinas (Fernández-Mora et al., 2004; De la Cruz et al., 2007) y de genes involucrados en la respuesta a estrés oxidativo y en el control positivo del sistema de defensa antiviral denominado Cas/CRISPR (Hernández-Lucas et al., 2008; Medina-Aparicio et al., 2011). Antecedentes ________________________________________________________________________________________ 20 2. ANTECEDENTES El conocimiento actual sobre los LTTRs presentes en procariontes nos da un panorama de su importancia en diversos procesos celulares y de virulencia. En el género Salmonella se han caracterizado algunos reguladores como ya se ha mencionado, pero específicamente en S. Typhi no se han estudiado a detalle. En un análisis in silico realizado en nuestro grupo de trabajo, el cual consistió en la identificación de todas las proteínas con dominio HTH clasificadas como LTTRs en S. Typhi mediante la base de datos UniprotKB, se identificaron 45 LTTRs (Tabla 2.1). De estos sólo LeuO ha sido caracterizado en S. Typhi y se ha demostrado su participación en diversos procesos biológicos en distintas bacterias (Fang et al., 2000; Shimada et al., 2011; Dillon et al., 2012; Hernández-Lucas y Calva 2012). En S. Typhi, LeuO es el regulador positivo de OmpS1, OmpS2, AssT y del sistema CAS/CRISPR, mientras la expresión de OmpX, Tpx y STY1978 es regulada negativamente por este regulador (Hernández-Lucas et al., 2008; Medina-Aparicio et al., 2011). Las secuencias identificadas de los LTTRs fueron utilizadas para la construcción de fusiones transcripcionales. Tabla 2.1: LTTRs predichos in silico en S. Typhi Locus Nombre del Gen Nombre de la proteína Descripción Aminoácidos Experimentalmente caracterizado STY0014 t0014 - Putativo LTTR 315 - STY0036 ltrR LtrR Regulador transcripcional de la vía ompR-ompF-ompC 331 En este trabajo STY0048 nhaR NhaR Regulador transcripcional del gen nhaA, codificante de un antiportador NaF/HF 299 E. coli (Rahav-Manor et al., 1992) STY0134 leuO LeuO Regulador transcripcional del operón leuABCD 314 S. Typhi, S. Typhimurium y E. coli (Hernández-Lucas et al., 2008; Fang et al., 2000; Klauck et al., 1997) STY0159 t0143 - Putativo LTTR 313 - STY0277 yafC - Putativo LTTR 304 - STY0341 sinR SinR Regulador transcripcional de respuesta a diferentes señales ambientales 314 S. Typhimurium (Groisman et al., 1993) Antecedentes ________________________________________________________________________________________ 21 STY0562 allS AllS Regulador transcripcional del regulón alantoína 308 E. coli (Rintoul et al., 2002) STY0651 ybdO - Putativo LTTR 300 - STY0684 ybeF - Putativo LTTR 317 - STY0730 tcuR TucR Regulador transcripcional del operón tcuABC 308 S. Typhimurium (Lewis et al., 2009) STY0950 acT - Putativo LTTR 303 - STY1337 cysB CysB Regulador transcripcional de genes para la biosíntesis de cisteína 324 S. Typhimurium y E. coli (Hryniewicz y Kredich, 1994; Lochowska et al., 2001) STY1386 t1581 - Putativo LTTR 301 - STY1537 t1444 - Putativo LTTR 290 - STY1578 t1408 - Putativo LTTR 299 - STY1693 ydhB - Putativo LTTR 310 - STY2278 t0805 - Putativo LTTR 304 - STY2410 t0675 - Putativo LTTR 302 - STY2436 yeiE - Putativo LTTR 287 - STY2510 t0583 - Putativo LTTR 292 - STY2560 lrhA LrhA Regulador transcripcional del operón NADH deshidrogenasa 312 E. coli (Lehnen et al., 2002) STY2655 xapR XapR Regulador transcripcional del operón Xantosina 294 E. coli y S. Typhimurium (Jørgensen y Dandanell, 1999; Hansen et al., 2006) STY2660 Desconocido - Putativo LTTR 308 - STY2821 t0282 - Putativo LTTR 303 - STY3037 t2813 - Putativo LTTR 310 - STY3122 gcvA GcvA Proteína reguladora para la vía de escisión de glicina 305 E. coli (Wilson y Stauffer, 1994) STY3158 lysR LysR Activador transcripcional de lysA 311 E. coli (Stragier y Patte, 1983) STY3165 t2930 - Putativo LTTR 287 - STY3220 argP (iciA) ArgP (IciA) Regulador transcripcional de argO 297 E. coli (Thöny et al., 1991; Nandineni et al., 2004) Antecedentes ________________________________________________________________________________________ 22 STY3293 t3046 - Putativo LTTR 227 - STY3415 t3155 - Putativo LTTR 298 - STY3428 tdcA TdcA Regulador transcripcional del operón tdcABCDEFG 312 S. Typhimurium (Kim et al., 2008) STY3547 t3282 - Putativo LTTR 309 - STY3595 metR MetR Regulador transcripcional del regulón met 317 S. Typhimurium y E. coli (Byerly et al., 1991; Lorenz y Stauffer, 1995) STY3649 ilvY IlvY Regulador transcripcional del gen ilvC 295 S. Typhimurium y E. coli (Blazey y Burns, 1984; Rhee et al., 1998) STY3708 hdfR HdfR Activador transcripcional del operón fimbrial std 278 S. Typhimurium y E. coli (Jakomin et al., 2008; Ko y Park, 2000) STY3749 oxyR OxyR Activador transcripcional del regulón inducible por peróxido de hidrogeno 305 S. Typhimurium y E. coli (Christman et al., 1989) STY3935 yidZ YidZ Regulador transcripcional involucrado en la expresión de genes de respuesta a la resistencia anaeróbica a óxido nítrico 319 E. coli (Justino et al., 2005) STY3944 t3685- Putativo LTTR 302 - STY3979 dsdC DsdC Activador deaminasa D-serina 307 E. coli (Nørregaard-Madsen et al., 1995) STY4058 t3782 - Putativo LTTR 300 - STY4196 yhjC - Putativo LTTR 300 - STY4468 t4176 - Putativo LTTR 295 - STY4867 t4561 - Putativo LTTR 302 - LTTRs presentes en S. Typhi y la función descrita de algunos de ellos en S. Typhimurium y E. coli. En S. Typhi sólo se ha descrito LeuO. Debido a la importancia del regulador transcripcional LeuO, y con el fin de elucidar el funcionamiento de otros LTTRs de S. Typhi, se construyeron fusiones transcripcionales de las regiones reguladoras de 27 putativos LTTRs. Debido a que estos fueron identificados in silico se validaron experimentalmente, y para esto se realizó un tamizaje de su expresión en dos condiciones de crecimiento; medio rico (MA) (Kawaji et al., 1979) y medio mínimo (MM-N) (Deiwick et al., 1999). El MA simula condiciones óptimas de crecimiento en laboratorio y en el MM-N se Antecedentes ________________________________________________________________________________________ 23 expresan genes de SPI-2. Estas condiciones posiblemente representan las señales ambientales encontradas por Salmonella Typhimurium en el interior del fagosoma infectado del hospedero (Deiwick et al., 1999), lo que detectaría la expresión de reguladores involucrados en la sobrevivencia de Salmonella Typhi en la célula eucariótica. Los ensayos de actividad en ambos medios, revelaron la expresión de 21 LTTRs, principalmente en MM-N a diferencia con el MA donde hubo nula o baja expresión (Figura 2.1). Aunque el probable inductor del MM-N no ha sido identificado, el tener mayor expresión nos indica la posible existencia de señales de inducción para los LTTRs en este medio. Posterior a los ensayos de actividad se construyeron 10 mutantes, cada una en un regulador distinto, tomando en cuenta que cada uno de éstos tuvo diferente patrón de actividad. Posteriormente se llevaron a cabo estudios de proteómica en las 10 cepas y los resultados mostraron diferencia en 3 cepas (∆STY0036, ∆STY0651 y ∆STY3293) con respecto a la cepa silvestre de S. Typhi. A partir de los resultados obtenidos, nos enfocamos específicamente en el estudio del regulador STY0036, los análisis in silico realizados en nuestro grupo, indican que este regulador tiene un tamaño de 331 aminoácidos con un extremo amino terminal con dominio hélice-vuelta-hélice que va de los aminoácidos 12 a 71 y un dominio carboxilo terminal en los residuos 150 a 291, atributo de los LTTRs. El análisis en las bases de datos ubica al regulador sólo en el género Salmonella, además se indica que STY0036 de S. Typhi tiene como ortólogo a STM0030 en S. Typhimurium. Se ha realizado un perfil transcripcional global, basado en microarreglos de S. Typhimurium después de la infección de macrófagos, donde STM0030 muestra un cambio significativo en su transcripción durante el crecimiento intracelular (Eriksson et al., 2003). También, un estudio basado en microarreglos y diseñado para identificar genes requeridos por S. Typhimurium para persistir y replicarse en el bazo e hígado en ratones, mostró que la bacteria utiliza un repertorio diverso de genes para establecer la infección y persistir en su hospedero, dentro de tal repertorio se localiza a STM0030 (Lawley et al., 2006). Así, los antecedentes Antecedentes ________________________________________________________________________________________ 24 reportados de STM0030 y nuestros resultados experimentales previos del proyecto de investigación, de una mayor expresión de STY0036 en MM-N comparado con MA, nos sugieren la posibilidad de un papel de STY0036 involucrado en el crecimiento intracelular. 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 A ct iv id a d E sp e cí fi ca C A T μ m o l/ m in / m g p ro t Perfil transcripcional de fusiones de los LTTRs en S. Typhi IMSS-1 Medio MM-N Medio MA Figura 2.1: Comparación del perfil de expresión transcripcional de los 27 LTTRs en MM-N y MA, de izquierda a derecha STY1537 a STY0684. En general en todas las fusiones se observa mayor actividad específica CAT en MM-N a diferencia de MA. Hipótesis y objetivos ________________________________________________________________________________________ 25 3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 3.1. Hipótesis Un análisis in silico predice que STY0036 es miembro de la familia LTTR. Su expresión mayor en un medio pobre en nutrientes (MM-N) que en uno rico sugiere una posible participación en el crecimiento intracelular, por lo tanto, su función podría ser importante para la invasión, sobrevivencia o replicación en macrófagos. 3.2. Objetivo general Definir la función de la proteína STY0036 e identificar algunos posibles genes blanco del regulador y ver si éste afecta una vía o algún proceso biológico en Salmonella enterica serovar Typhi IMSS-1 (S. Typhi IMSS-1). 3.3. Objetivos particulares 1.- Analizar el perfil proteómico de la cepa silvestre (S. Typhi IMSS-1) y de una cepa mutante STY0036 (S. Typhi IMSS-1 ∆STY0036) en condición de MM-N. 2.- Observar si hay proteínas cuya transcripción dependa de STY0036 e identificarlas. 3.- Determinar el papel biológico de STY0036 en S. Typhi. 4.- Realizar complementaciones genéticas en la cepa IMSS-1 ∆STY0036. Materiales y métodos ________________________________________________________________________________________ 26 4. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1. Cepas, plásmidos y oligonucleótidos Las cepas y plásmidos empleados en el presente trabajo se enlistan en la tabla 4.1 y 4.2 respectivamente. Tabla 4.1: Cepas bacterianas empleadas en este trabajo Cepa Descripción Referencia Salmonella enterica serovar Typhi IMSS-1 Salmonella enterica serovar Typhi, cepa aislada de paciente mexicano. Puente et al., 1987 IMSS-1 ∆STY0036 IMSS-1 ∆STY0036 Este trabajo IMSS-1 ∆STY0036/pWSK29-STY0036 IMSS-1 ∆STY0036 con plásmido pWSK29- STY0036; Amp r Este trabajo IMSS-1 ∆STY0036/pWSK29 IMSS-1 ∆STY0036 con plásmido pWSK29; Amp r Este trabajo IMSS-1 ∆ompR IMSS-1 ∆ompR Este trabajo IMSS1 ∆ompR/pFMTy-ompR IMSS-1 ∆ompR con plásmido pFMTy- ompR; Cm r Este trabajo IMSS1 ∆ompR/pQE60-ompR IMSS-1 ∆ompR con plásmido pQE60- ompR; Ap r Este trabajo IMSS-1 STYC171 IMSS-1 ∆ompC; Km r Martínez-Flores et al., 1999 IMSS-1 STYC171/pVF27 IMSS-1 STYC171 con plásmido pVF27 (pBR322-ompC); Km r Cm r Este trabajo IMSS-1 STYF302 IMSS-1 ∆ompF; Km r Martínez-Flores et al., 1999 IMSS-1 VALE39 IMSS-1 ∆ompC-∆ompF; Km r Cm r Secundino et al., 2006 IMSS-1 VALE39/pVF27 IMSS-1 VALE39 con plásmido pVF27 (pBR322-ompC); Km r Cm r Este trabajo IMSS-1 VALE39/pKKompF IMSS-1 ∆ompC-∆ompF, con plásmido pKKompF, Km r Cm r Ap r Este trabajo Escherichia coli E. coli DH5α Escherichia coli Φ80d/lacZ∆M15 ∆(lacZYA- argF) U169 recA1endA1 hsdR17 (rk-mk+) phoA supE44 λ-thi-1 gyrA96 relA1; Nal r Gibco BRL Materiales y métodos ________________________________________________________________________________________ 27 Tabla 4.2: Plásmidos usados en este trabajo Plásmido Descripción Referencia pKK232-8 Derivado de pBR322 conteniendo el gen reportero cloranfenicol acetil transferasa (CAT) sin promotor; Ap r Pharmacia LKB Biotechnology pKK232-9 Derivado de pKK232-8; Km r Hernández-Lucas et al., 2008 pKKompF pKK232-8 conteniendo región codificadora de1092 bp, con 782 pb río arriba y 184 pb río abajo del ATG de ompF; Ap r Este trabajo pKK232-9 STY0014-381+102 pKK232-9 conteniendo 381 pb río arriba y 102 pb río abajo del ATG de STY0014; Kmr Este trabajo pKK232-9 STY0036-471+90 pKK232-9 conteniendo 471 pb río arriba y 90 pb río abajo del ATG de STY0036; Kmr Este trabajo pKK232-9 STY0159-265+84 pKK232-9 conteniendo 265 pb río arriba y 84 pb río abajo del ATG de STY0159; Km r Este trabajo pKK232-9 STY0277-346+129 pKK232-9 conteniendo 346 pb río arriba y 129 pb río abajo del ATG de STY0277; Km r Este trabajo pKK232-9 STY0341-332+178 pKK232-9 conteniendo 332 pb río arriba y 178 pb río abajo del ATG de STY0341; Km r Este trabajo pKK232-9 STY0651-376+100 pKK232-9 conteniendo 376 pb río arriba y 100 pb río abajo del ATG de STY0651; Km r Este trabajo pKK232-9 STY0684-443+190 pKK232-9 conteniendo 443 pb río arriba y 190 pb río abajo del ATG de STY0684; Km r Este trabajo pKK232-9 STY0730-320+89 pKK232-9 conteniendo 320 pb río arriba y 89 pb río abajo del ATG de STY0730; Km r Este trabajo pKK232-9 STY1386-557+169 pKK232-9 conteniendo 557 pb río arriba y 169 pb río abajo del ATG de STY1386; Km r Este trabajo pKK232-9 STY1537-382+143 pKK232-9 conteniendo 382 pb río arriba y 143 pb río abajo del ATG de STY1537; Km r Este trabajo pKK232-9 STY1578-363+97 pKK232-9 conteniendo 363 pb río arriba y 97 pb río abajo del ATG de STY1578; Km r Este trabajo pKK232-9 STY1693-383+129 pKK232-9 conteniendo 383 pb río arriba y 129 pb río abajo del ATG de STY1693; Km r Este trabajo pKK232-9 STY2278-453+117 pKK232-9 conteniendo 453 pb río arriba y 117 pb río abajo del ATG de STY2278; Km r Este trabajo pKK232-9 STY2410-410+191 pKK232-9 conteniendo 410 pb río arriba y 191 pb río abajo del ATG de STY2410; Km r Este trabajo pKK232-9 STY2510-374+94 pKK232-9 conteniendo 374 pb río arriba y 94 pb río abajo del ATG de STY2510; Km r Este trabajo pKK232-9 STY2660-395+118 pKK232-9 conteniendo 395 pb río arriba y 118 pb río abajo del ATG de STY2660; Km r Este trabajo Materiales y métodos ________________________________________________________________________________________ 28 pKK232-9 STY2821-371+93 pKK232-9 conteniendo 371 pb río arriba y 93 pb río abajo del ATG de STY2821; Km r Este trabajo pKK232-9 STY3037-279+160 pKK232-9 conteniendo 279 pb río arriba y 160 pb río abajo del ATG de STY3037; Km r Este trabajo pKK232-9 STY3158-403+192 pKK232-9 conteniendo 403 pb río arriba y 192 pb río abajo del ATG de STY3158; Km r Este trabajo pKK232-9 STY3165-476+117 pKK232-9 conteniendo 476 pb río arriba y 117 pb río abajo del ATG de STY3165; Km r Este trabajo pKK232-9 STY3293-615+179 pKK232-9 conteniendo 615 pb río arriba y 179 pb río abajo del ATG de STY3293; Km r Este trabajo pKK232-9 STY3415-345+99 pKK232-9 conteniendo 345 pb río arriba y 99 pb río abajo del ATG de STY3415; Km r Este trabajo pKK232-9 STY3547-393+185 pKK232-9 conteniendo 393 pb río arriba y 185 pb río abajo del ATG de STY3547; Km r Este trabajo pKK232-9 STY3944-320+114 pKK232-9 conteniendo 320 pb río arriba y 114 pb río abajo del ATG de STY3944; Km r Este trabajo pKK232-9 STY4058-484+113 pKK232-9 conteniendo 484 pb río arriba y 113 pb río abajo del ATG de STY4058; Km r Este trabajo pKK232-9 STY4196-700+115 pKK232-9 conteniendo 700 pb río arriba y 115 pb río abajo del ATG de STY4196; Km r Este trabajo pKK232-9 STY4468-365+103 pKK232-9 conteniendo 365 pb río arriba y 103 pb río abajo del ATG de STY4468; Km r Este trabajo pKK232-9 ompC-772+27 pKK232-9 conteniendo 772 pb río arriba y 26 pb río abajo del ATG de ompC; Km r Hernández-Lucas et al., 2008 pKK232-8 ompF-782+184 pKK232-8 conteniendo 782 pb río arriba y 184 pb río abajo del ATG de ompF; Ap r Este trabajo pKK232-8 ompR-383+169 pKK232-8 conteniendo 383 pb río arriba y 169 pb río abajo del ATG de ompR; Ap r Este trabajo pWSK29 Derivado de pLG339 conteniendo un origen pSC101; Ap r Wang y Kushner, 1991 pWSK29-STY0036 pWSK29, conteniendo 369 pb río arriba y 145 pb río abajo del ATG del gen estructural STY0036, abarcando el gen completo; Ap r Este trabajo pFMTy-ompR pACYC184 conteniendo la región codificadora de 720 pb y 297 bp río arriba del gen ompR hasta el codón de termino; Cm r Este trabajo pQE60 Derivado de pBR322, conteniendo un promotor inducible mediante IPTG; Ap r Quiagen pQE60-ompR pQE60 conteniendo 717 pb del gen ompR de E. coli sin el codón de termino; Ap r Oropeza y Calva, 2009 Materiales y métodos ________________________________________________________________________________________ 29 pVF27 pBR322 conteniendo la región promotora y codificante de ompC; Km r Puente et al., 1987 pKD4 Derivado de pANTSg; contiene el gen de resistencia a Km, flanqueado por FRT´s Datsenko y Wanner, 2000 pKD46 Derivado de pINT-ts, contiene el sistema de recombinación del fago lRojo bajo el control de un promotor inducible por arabinosa; Amp R Datsenko y Wanner, 2000 pCP20 Plásmido termosensible, expresa la recombinasa FLP; Amp r Cm r Cherepanov y Wackerangel, 1995 4.2. Medios de cultivo y condiciones de crecimiento Las cepas de S. Typhi y E. coli se crecieron a 37°C en medio LB (1% de triptona, 0.5% de extracto de levadura y 1% de NaCl, a pH 7.5) suplementado con deoxicolato de sodio (Sigma-Aldrich) cuando se requirió. S. Typhi también se creció en MM-N (KCl 5mM, (NH4)2SO4 7.5 mM, K2SO4 0.5 mM, KH2PO4 1 mM, Tris-HCl (pH 7.5) 100 mM, MgCl2 200 μM, glicerol 0.5% (p/v) y 1% de casaminoácidos (Deiwick et al., 1999), y en MA (7 g de caldo nutritivo, 1 g de extracto de levadura, 2 ml de glicerol, 3.75 g de K2HPO4 y 1.3 g de KH2PO4 por litro) (Kawaji et al., 1979). Cuando se necesitó, los medios se suplementaron con los antibióticos mostrados en la tabla 4.3. Tabla 4.3: Antibióticos y dosis utilizadas en este trabajo Antibiótico Concentración µg/ml Ampicilina (Ap) 200 Cloranfenicol (Cm) 34 Kanamicina (Km) 30 Estreptomicina (St) 100 Tetraciclina (Tc) 12 Materiales y métodos ________________________________________________________________________________________ 30 4.3. Manipulación de DNA El DNA cromosómico de las cepas se aisló mediante un estuche comercial (Promega, Madison). El diseño de oligonucleótidos para amplificar las secuencias de DNA mediante PCR se realizó con el programa OLIGO 6 y se sintetizaron en la unidad de síntesis del Instituto de Biotecnología, UNAM (Tabla 4.4). Las reacciones de PCR se amplificaron en un termociclador GeneAmp PCR sistema 9700 (Roche Applied Biosystems), las enzimas de restricción, ligasas, polimerasas y nucleótidos se obtuvieron de las compañías New England Biolabs y Gibco BRL. Los plásmidos y productos de PCR se purificaron con los estuches “High pure plasmid isolation” y “Purification of PCR products” (Roche Applied Science, Germany) respectivamente y las secuencias se obtuvieron en un secuenciador automático (Perkin Elmer/Applied Biosystems 377-18). Tabla 4.4: Oligonucleótidos usados en este trabajo Oligonucleótido Secuencia 5´→ 3´ STY0036 H1P1-F CCA GCC AGG ATA ACC TAT ATG CGG CCA ATA AAA AAT GCT AAA TGT AGG CTG GAG CTG CTT CG STY0036 H2P2-R AAT TTG ATA TTA AAC AGA TCA ATC GCA TAA GGA TGT GCT TCC CAT ATG AAT ATC CTC CTT AG STY0036-F CCG CAA AGA AAT AAG AGA ATC STY0036-R AGA AGT CAA TTT ATC AGC GAC STY0014/-381-359 BamHI-F CGG GAT CCG GAA AGT TTT GGC GGC CCG ACG STY0014/+102+81 KpnI-R GGG GTA CCT AAC TTT TTT GCC GCC ATA GCC STY0036/-471-450 BamHI-F CGG GAT CCA CGC ATT AGC GTC ACC TTT AGC STY0036/+90+68 KpnI-R GGG GTA CCA GCC CTG GTT GCA TTT CCT TCA G STY0159/-265-241 BamHI-F CGG GAT CCG GTA TAA GGG CCA TAC ATA TCT GC STY0159/+84+59 KpnI-R GGG GTA CCG TGA AGC TAT GGT TTT CAG CAA TC STY0277/-346-322 BamHI-F CGG GAT CCC GCC GTA AAC AAG ACC ATC AGC STY0277/+129+106 KpnI-R GGG GTA CCA TCT CCA GCT TTT TAA CTG CCCSTY0341/-332-308 BamHI-F CGG GAT CCG ATA CAA TTA ATG CGC TCC AGA C STY0341/+178+154 KpnI-R GGG GTA CCG ATG TGA ATC GCG CCG AAG TAA AG STY0651/-376-357 BamHI-F CGG GAT CCA ACA GGT TGT TGG TTT AC Materiales y métodos ________________________________________________________________________________________ 31 STY0651/+100+76 KpnI-R GGG GTA CCG TGT TTC CGC TGC TTT GCT AAT GC STY0684/-443-441 BamHI-F CGG GAT CCT CTC CTT TTC TAC GCA TCA ACC STY0684/+190+168 KpnI-R GGG GTA CCT GGA CTG GCT GAT GGC TGA CGG STY0730/-320-296 BamHI-F CGG GAT CCG CAA CAG CAT CAT CAC GAC CAT C STY0730/+89+64 KpnI-R GGG GTA CCG AAA CGC CAA TAT CAA GAT CCT GTG STY1386/-557-534 BamHI-F CGG GAT CCG TCA TAC TGT TCG TCC CAC ACC STY1386/+169+146 MluI-R CGA CGC GTA AGT TTG CGG GTT GTA CGT TGC STY1537/-382-359 BamHI-F CGG GAT CCG GAT TTC GTC ACT TCC GCA CGC STY1537/+143+121 KpnI-R GGG GTA CCA ACA GAG AGA CGC CCA GTT CGG STY1578/-363-340 BamHI-F CGG GAT CCG GTA GAA ATA GAA AGT GAA ACG STY1578/+97+75 KpnI-R GGG GTA CCG CGG CTG CGA GAT ATT GAG GCG STY1693/-383-360 BamHI-F CGG GAT CCC CAC AGC ATC CCC AGA CTT CCG STY1693/+129+107 KpnI-R GGG GTA CCC CAC TCC TCT AAC TGA CGA ACG STY2278/-453-431 BamHI-F CGG GAT CCA AGG AAC TGG AAG ATT GGC TGC STY2278/+117+95 KpnI-R GGG GTA CCA TGA ACG GTA TAA CTG AGG GCG STY2410/-410-388 BamHI-F CGG GAT CCC GCC ACG CAA AGC TCA ATG ACC STY2410/+191+169 KpnI-R GGG GTA CCG GCC GTA GTC CTT TAC TGT GGC STY2510/-374-352 BamHI-F CGG GAT CCA TAT TTT CCC ACC CAC TGC CCG STY2510/+94+71 KpnI-R GGG GTA CCG GCG GAT TGC GTC ATG TAT AGC STY2660/-395-373 BamHI-F CGG GAT CCA AAG CCG CTG TAG AGC ATA GGG STY2660/+118+96 KpnI-R GGG GTA CCC TTT TAC GCT ATG ACT GAC CGC STY2821/-371-349 BglII-F GAA GAT CTC TAA AGA AAA CAG GAT ACC GGC STY2821/+93+71 KpnI-R GGG GTA CCT GAT GGC TGA GTG ATA AAT AGG STY3037/-279-257 BamHI-F CGG GAT CCG AAA GAA ACG CGC TAA ACG GAA CG STY3037/+160+137 KpnI-R GGG GTA CCT TAC GCC AAG CTC TTT TTC AAG C STY3158/-403-381 BamHI-F CGG GAT CCA TCA GGG CAC GTT TGC GGA TC STY3158/+192+170 KpnI-R GGG GTA CCC TTG CAC CGT CGG ATG TAA G STY3165/-476-454 BamHI-F CGG GAT CCG CAA AAA GAA CAG GAA GAA ACC STY3165/+117+94 KpnI-R GGG GTA CCG CAA TGG CGG TAC TAA TGG TGG STY3293/-615-591 BamHI-F CGG GAT CCA GGG TTA GTT TTG TGG TGG TCT TG Materiales y métodos ________________________________________________________________________________________ 32 STY3293/+179+155 KpnI-R GGG GTA CCT GCT CCA GAT ATT GTT GGT GTG TG STY3415/-345-322 BamHI-F CGG GAT CCT GCC GTC GCT GTC GCG GTA TTC C STY3415/+99+75 KpnI-R GGG GTA CCG CCC CAA CTC ATC AGC CGC TGC STY3547/-393-371 BamHI-F CGG GAT CCC TTC AAC CTC AAA CGA ACA GGC STY3547/+185+163 KpnI-R GGG GTA CCC CAG CTT CGG TGA GCC CAA TGC STY3944/-320-298 BamHI-F CGG GAT CCA GTG GCG CTG CAT ATG GAA AC STY3944/+114+90 KpnI-R GGG GTA CCG ATT AAA CCG CTA ACA GCT CCC TG STY4058/-484-461 BamHI-F CGG GAT CCT GAT CCG CGT TTG GTT GAC TTG STY4058/+113+90 KpnI-R GGG GTA CCT CAC GCG AGA AGG CGA CAA AGC STY4196/-700-680 BamHI-F CGG GAT CCG AAT GTG CTG CTG CAA ACT G STY4196/+115+93 KpnI-R GGG GTA CCG TAT TTG CCG TGA GAC GCT GCC STY4468/-365-345 BamHI-F CGG GAT CCA CGA CGG CGG GAA CAA AG STY4468/+103+80 MluI-R CGA CGC GTC TTG CTA ATG GTG GGC TGG GTG ompC/-772-748 BamHI-F CGG GAT CCT AGA AGG GAG AAT CGG GTA GAG ACC ompC/+27+3 KpnI-R GGG GTA CCC AGG AGG GAC AGT ACT TTA ACT TTC ompF/-782-761 BamHI-F CGG GAT CCG AAA TGG GGC TGA ATA AAG AGG ompF/+184+163 KpnI-R GGG GTA CCC AAT CTG GGC ATA AGT CTG GTC ompR/-383-362 BamHI-F CGG GAT CCT TTT TAT TAT ACT GAT AGT CGG ompR/+169+148 KpnI-R GGG GTA CCT TAA ATC CAG TAC CAT GAG ATG pQE60STY0036 NcoI-F CAT GCC ATG GGA CGG CCA ATA AAA AAT GCT AA pQE60STY0036 BamHI-R CGG GAT CCA TCG CAT AAG GAT GTG CTT C 4.4. Construcción de fusiones transcripcionales al gen reportero cat Las fusiones transcripcionales STY0036-471+90, ompC-772+27, ompF- 782+184 y ompR-383+169 al gen cat, se construyeron amplificando mediante PCR las regiones intergénicas 5´ de los genes STY0036, ompC, ompF y ompR respectivamente. Se usaron los oligonucleótidos correspondientes (Tabla 4.4) y DNA genómico de S. Typhi IMSS-1 como templado. Los productos de PCR se purificaron y posteriormente digerieron con las enzimas de restricción BamHI y Materiales y métodos ________________________________________________________________________________________ 33 KpnI, sitios de corte contenidos en los oligonucleótidos. Estas regiones reguladoras amplificadas se clonaron en el plásmido pKK232-8 con resistencia a ampicilina (Pharmacia LKB Biotechnology, Figura 4.1) o pKK232-9 que tiene el gen de ampicilina interrumpido con el de resistencia a kanamicina haciéndolo selectivo para este antibiótico (Hernández-Lucas et al., 2008), ambos vectores contienen el gen reportero cat sin promotor. Figura 4.1: Mapa de restricción del vector pKK232-8, contiene un gen de cloranfenicol acetil transferasa (cat), se localiza un término de transcripción (Ter) río arriba del gen cat y dos términos de transcripción río abajo del gen (Ter y rnnB). El origen de replicación (ColE1) es derivado del plásmido pBR322, para su selección se utiliza el gen de resistencia a ampicilina (amp). Las fusiones construidas se transformaron en E. coli DH5α mediante choque térmico, las clonas se seleccionaron con Ap o Km según el caso, se les purificó el plásmido y se secuenciaron en la Unidad de Secuenciación del Instituto de Biotecnología UNAM para corroborar la secuencia correcta de los nucleótidos, una vez confirmadas las fusiones se electroporaron a S. Typhi IMSS-1 y S. Typhi IMSS-1 ∆STY0036, posteriormente se determinó su expresión mediante ensayos de actividad transcripcional. Materiales y métodos ________________________________________________________________________________________ 34 4.5. Ensayos de expresión de las fusiones transcripcionales al gen reportero cat Los ensayos de actividad transcripcional se realizaron tomando 3 ml de cultivo con cepas de S. Typhi crecidas en LB durante 14 horas usando el antibiótico correspondiente, se centrifugaron, se lavaron y resuspendieron para inocular matraces con 50 ml de MM-N. En la condición de MA se usaron 100 ml de medio complementado con Ap o Km y se tomaron 500 µl de precultivo para inocular. Los matraces se incubaron a 37°C a 200 rpm y se colectó 1.5 ml de cada muestra cuando llegó a una densidad óptica de 0.6 a 595 nm (DO595). Las muestras se centrifugaron 2 minutos a 12000 rpm, se desechó el sobrenadante y se lavaron con 800 µl de TDTT (Tris-HCl 50 mM pH 7.8 y DL-Ditiotreitol 30 µM). Las pastillas se resuspendieron en 600 µl de TDTT, se colocaron 3 minutos en un sonicador Vibra Cell (Sonics and Materials, Inc.) con pulsos de 9.9 segundos y reposo de 9.9 segundos. Posteriormente se centrifugaron 15 minutos a 12000 rpm y el sobrenadante se transfirió a tubos eppendorf. Las proteínas totales se cuantificaron colocando 10 µl de cada extracto por duplicado en placas de 96 pozos (costar), agregando 200 µl de una mezcla de reacción del estuche BCA Protein Assay Reagent (Pierce). Las placas se incubaron durante 30 minutos a 37°C y se determinó la concentración de proteínas a una absorbancia de 562 nm en un lector Ceres 900-C (Bio-Tek Instruments Inc.). La actividad enzimática CAT se determinó colocando por duplicado 5 µl de cada extracto en placas de 96 pozos, agregando 200 µl de una reacción conteniendo DTNB 1mM [ácido 5,5´ditio-bis (2-ácido nitrobenzoico)], acetil- coenzima A 0.1 mM y cloranfenicol 0.1 mM en Tris-HCl, pH 7.8 0.1 M. Posteriormente se determinó la actividad CAT a una absorbancia de 412 nm en el lector tipo Ceres a intervalos de 5 segundos durante 5 minutos. La actividad específica CAT (µmol/min/mg) se obtuvo al dividir las unidades CAT entre la concentración de proteínas totales de cada muestra. Materialesy métodos ________________________________________________________________________________________ 35 4.6. Construcción de cepas mutantes La mutagénesis se realizó empleando la técnica descrita por Datsenko y Wanner (Datsenko y Wanner, 2000), la cual consiste en remplazar las secuencias de interés, en este caso los genes STY0036 y ompR por un cassette de resistencia a kanamicina generado por PCR utilizando oligonucleótidos con secuencias homólogas adyacentes al gen a remover y usando como templado el plásmido pKD4. Para la recombinación es necesaria la recombinasa del fago l Red, sintetizada bajo el control de un promotor inducible por arabinosa, para esto se utilizó el plásmido pKD46. El gen de resistencia a kanamicina insertado en las cepas mutantes se eliminó con el plásmido pCP20 el cual expresa la recombinasa FLP, esta reconoce secuencias directas repetidas FRT (FLP Recognition Targets) que flanquean el gen de resistencia, así la recombinación entre estos sitios elimina el casette de kanamicina. Las cepas mutantes se verificaron mediante PCRs y secuenciación. Las mutantes de S. Typhi IMSS-1: STYC171 (∆ompC), STYF302 (∆ompF) y VALE39 (∆ompC-∆ompF) utilizadas en el presente trabajo, habían sido previamente construidas y reportadas (Martínez-Flores et al., 1999; Secundino et al., 2006). 4.7. Complementaciones Para complementar las cepas ∆STY0036 y ∆ompR, las regiones reguladoras y codificadoras de ambos genes se amplificaron por PCR, los productos se clonaron en los plásmidos pWSK29 y pACY184 obteniendo las construcciones pWSK29- STY0036 y pFMTy-ompR, posteriormente se transfirieron a las mutantes para obtener las cepas complementadas IMSS-1: ∆STY0036/pWSK29-STY0036 y ∆ompR/pFMTy-ompR. También se utilizó la cepa IMSS-1 ∆ompR/pQE60-ompR, la cual está complementada con la región codificadora ompR de E. coli bajo un promotor inducible por IPTG (pQE60) (Oropeza y Calva, 2009), la razón de usar esta construcción es debido a una identidad muy alta entre ompR de E. coli y S. Typhi. Las cepas ∆ompC y ∆ompC-∆ompF se complementaron con el plásmido pBR322 conteniendo el gen ompC (pVF27) (Puente et al., 1987). Todas las Materiales y métodos ________________________________________________________________________________________ 36 construcciones obtenidas se transformaron a las cepas de S. Typhi IMSS-1 mediante electroporación. 4.8. Análisis proteómico 4.8.1. Extracción total de proteínas Las cepas S. Typhi IMSS-1 y S. Typhi IMSS-1 ∆STY0036 se crecieron en 100 ml de MM-N a una DO595 de 0.6, se centrifugaron los cultivos, las pastillas se lavaron con un amortiguador fosfato salino (PBS) 1X y se sonicaron 1 minuto a 24 kHz en un sonicador Vibra Cell (Sonics and Materials, Inc.), con pulsos de 1 minuto y reposo de 1 minuto durante 5 ciclos a temperatura de 4°C, utilizando un inhibidor de proteasas (Roche Diagnostics, Germany). Para reducir más la proteólisis el aislamiento de proteínas se llevó mediante extracción con fenol. Las proteínas desnaturalizadas y reducidas (Encarnación et al., 2005), se mezclaron con urea 7 M, tiourea 2 M, 4% de 3 -[(3-choloamidopropyl)-dimetilamonio]-1- propanosulfonato (CHAPS) (Roche Diagnostics, Germany), tributyl fosfina 2 mM, 2% anfolitos y ditiotreitol 60 mM. Posteriormente se realizó la electroforesis en 2 dimensiones (2-DGE). 4.8.2. Electroforesis en gel de 2 dimensiones (2-DGE) La preparación de muestras, el análisis de electroforesis en 2-DGE y el análisis de imágenes, se realizaron como se ha reportado previamente (Encarnación et al., 2003). La separación de proteínas en un gradiente de pH se realizó mediante electroforesis bidimensional en un gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (Sigma, USA). Para identificar el punto isoeléctrico se cargaron 500 µg de proteínas totales. 4.8.3. Identificación de proteínas mediante espectrometría de masas Las proteínas del gel de dos dimensiones presentes en la cepa silvestre y ausentes en los proteomas de las mutantes se identificaron mediante espectrofotometría de masas. Las proteínas teñidas con azul coomassie se Materiales y métodos ________________________________________________________________________________________ 37 cortaron del gel y se mantuvieron a -70°C hasta usarse. Para el análisis de espectrometría de masas, las muestras se prepararon utilizando una pequeña modificación (Encarnación et al., 2003; Encarnación et al., 2005 y Shevchenko et al., 1996). Las proteínas obtenidas del gel se destiñeron, redujeron, alquilaron y digirieron con tripsina (Promega, Madison). Los péptidos obtenidos de la digestión se desalaron con la punta de una cremallera C18 (Millipore, Bedford, MA), posteriormente se obtuvo la espectrometría de masas. La espectrometría de masas se determinó con un espectrómetro (Bruker Daltonics, Billerica, MA) en modo de reflectrón y extracción retardada. El espectrómetro se calibró usando un estándar de calibración (Bruker Daltonics 206095). Las mezclas de los péptidos se analizaron usando una solución saturada de ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico en 50% de ácido trifluoroacético-acetonitrilo 0,1%. 4.8.4. Búsqueda en la base de datos Las proteínas digeridas y procesadas generaron péptidos y sus masas, posteriormente se realizó su identificación en la base de datos NCBI, utilizando el programa de búsqueda Mascot (Matrix Science, Ltd., Londres, Reino Unido; http://www.matrixscience.com). 4.9. Purificación y electroforesis de proteínas de membrana externa Las proteínas de membrana externa se aislaron de las cepas de S. Typhi IMSS-1 crecidas en MM-N y LB suplementado con 5% de deoxicolato de sodio a una DO595 de 0.6 como se describe a continuación: Como preinóculo se creció cada cepa en 5 ml de LB en tubos de ensaye con el respectivo antibiótico durante 14 horas, se tomaron 3 ml, se centrifugaron y lavaron para inocular matraces de 250 ml conteniendo 50 ml de MM-N, la densidad óptica inicial para cada matraz en promedio fue de 0.010. Para LB con 5% de deoxicolato de sodio se tomaron 250 μl de preinóculo y se inocularon matraces con 25 ml de medio, con una DO595 de 0.010 al inicio del cultivo. Posteriormente, de cada matraz se tomaron 15 ml de cultivo a una DO595 de 0.6 y Materiales y métodos ________________________________________________________________________________________ 38 se centrifugaron a 7000 rpm durante 8 minutos a 4°C, las pastillas se resuspendieron en 1 ml de amortiguador Na2HPO4, pH 7.2 10 mM y se centrifugó 2 minutos a 12000 rpm a temperatura ambiente, se eliminó el sobrenadante y la pastilla, conteniendo las proteínas de interés, se resuspendió en 500 μl de Na2HPO4, pH 7.2 10 mM, se vortexeó y las muestras se sonicaron en tubos eppendorf hasta quedar totalmente claras, en seguida se centrifugaron 2 minutos a 12000 rpm a temperatura ambiente, después el sobrenadante se transfirió a tubos nuevos y se centrifugó 1 hora a 12000 rpm a 4°C. Las proteínas de membrana externa, se solubilizaron resuspendiéndose en 500 µl de amortiguador Na2HPO4 pH 7.2 10 mM, conteniendo 2% de tritón X-100 durante 30 minutos a 37°C. Posteriormente se centrifugó 1 hora a 12000 rpm a 4°C, se desechó el sobrenadante y la pastilla conteniendo las proteínas de membrana se lavó con 500 µl de Na2HPO4 pH 7.2 10 mM, después se centrifugó 1 hora a 12000 rpm a 4°C, se desechó el sobrenadante y finalmente se resuspendieron las muestras en 50 µl de PBS 1X pH 7.4. Las proteínas de membrana externa se cuantificaron con el estuche BCA Protein Assay Reagent, se tomaron 15 µg de cada muestra para ser analizadas por electroforesis en un gel de poliacrilamida (12% SDS-PAGE) y se separaron a un voltaje de 10 mA durante 23 horas. Las proteínas de membrana externa se visualizaron mediante tinción con azul de coomassie. Resultados
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