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Analisis-funcional-del-regulador-lysr-ltrr-de-salmonella-enterica-serovar-typhi

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS 
FACULTAD DE CIENCIAS 
BIOMEDICINA 
 
 
“Análisis Funcional del Regulador LysR LtrR de Salmonella enterica serovar 
Typhi” 
 
TESIS 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS 
 
PRESENTA: 
NOÉ BECERRA LOBATO 
 
TUTOR PRINCIPAL DE TESIS: Dr. Ismael Hernández Lucas 
 FACULTAD DE CIENCIAS, UNAM. 
COMITÉ TUTOR: Dr. Juan Miranda Ríos 
 FACULTAD DE CIENCIAS, UNAM. 
 Dr. Alejandro García de los Santos 
 FACULTAD DE CIENCIAS, UNAM. 
 
 
 
MÉXICO, D.F. SEPTIEMBRE, 2014. 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
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fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS 
FACULTAD DE CIENCIAS 
BIOMEDICINA 
 
 
“Análisis Funcional del Regulador LysR LtrR de Salmonella enterica serovar 
Typhi” 
 
TESIS 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS 
 
PRESENTA: 
NOÉ BECERRA LOBATO 
 
TUTOR PRINCIPAL DE TESIS: Dr. Ismael Hernández Lucas 
 FACULTAD DE CIENCIAS, UNAM. 
COMITÉ TUTOR: Dr. Juan Miranda Ríos 
 FACULTAD DE CIENCIAS, UNAM. 
 Dr. Alejandro García de los Santos 
 FACULTAD DE CIENCIAS, UNAM. 
 
 
 
 
MÉXICO, D.F. SEPTIEMBRE, 2014. 
VNIV[!R."'DAD NAqONAL 
AVl'N°MA DE 
MDU(,O 
Dr. Isidro Ávila Martínez 
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS 
FACULTAD DE CIENCIAS 
DIVISiÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO 
Director General de Administración Escolar, UNAM 
Presente 
OFICIO FCIE/DEP/402/14 
ASUNTO: Oficio de Jurado 
Me permito informar a usted que en la reunión ordinaria del Comité Académico del Posgrado en 
Ciencias Biológicas, celebrada el día 26 de mayo de 2014 se aprobó el siguiente jurado para el 
examen de grado de MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS en el campo de conocimiento de 
Biomedicina del (la) alumno (a) BECERRA LOBATO NOÉ con número de cuenta 95359382 con la 
tesis titulada "Análisis Funcional del Regulador LysR LtrR de Salmonella enterica serovar 
Typhi", realizada bajo la dirección del (la) DR. ISMAEL HERNÁNDEZ LUCAS: 
Presidente: 
Vocal: 
Secretario: 
Suplente: 
Suplente: 
DRA. BERTHA MARIA JOSEFINA GONZÁLEZ PEDRAJO 
DRA. JUDITH MIRIAM BOBADILLA DEL VALLE 
DR. JUAN MIRANDA Ríos 
DR. CHRISTIAN SOHLENKAMP 
DR. ALEJANDRO GARCíA DE LOS SANTOS 
Sin otro particular, me es grato enviarle un cordial saludo. 
MCANMJFM/ASR/ipp 
Atentamente 
"POR MI RAZA HABLARA EL EspíRITU" 
Cd . Universitaria, D.F., a 8 de agosto de 2014 
;1\. U G..o~<U; . 
Dra. María del Coro Arizmendi Arriaga 
Coordinadora del Programa 
Agradecimientos 
Al posgrado en ciencias Biológicas de la Universidad Nacional Autónoma de 
México (UNAM) por fortalecer mi formación académica y por el conocimiento 
adquirido en sus instalaciones, el cual permitió desarrollar el presente trabajo. 
 
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por la beca recibida 
durante los estudios de posgrado y a la Dirección General de Asuntos del 
Personal Académico por la beca recibida a través del Programa de Apoyo a 
Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (DGAPA-PAPIIT IN203312), 
ayuda que sirvió para la culminación del presente trabajo. 
 
Al Dr. Ismael Hernández Lucas por la dirección de tesis, conocimientos, 
enseñarme a analizar problemas que se presentan en la investigación y pensar en 
la mejor solución para resolverlos, por la paciencia y apoyo a mi formación y al 
presente trabajo, por disponer de tiempo siempre que se lo pedí y mostrarme que 
el esfuerzo y la persistencia siempre nos llevarán a lograr nuestros objetivos. 
 
Al Dr. Juan Miranda Ríos por haber aceptado ser miembro de mi comité tutoral, 
por su tiempo siempre que lo requerí, preguntas para reflexionar, consejos y 
críticas que cada semestre enriquecieron mi formación y el presente trabajo. 
 
Al Dr. Alejandro García de los Santos, por haber aceptado ser parte de mi comité 
tutoral, por sus consejos, críticas, recomendaciones y disponibilidad de tiempo, 
además de haber contribuido de manera importante en mi formación académica. 
 
Al Dr. Miguel Ángel Ramírez al formar parte de mi comité tutoral, por sus críticas, 
recomendaciones y por el apoyo que me bridó para mejorar el trabajo. 
 
A los sinodales: Dra. Bertha González, Dra. Miriam Bobadilla, Dr. Juan Miranda, 
Dr. Christian Sohlenkamp y Dr. Alejandro García por disponer del tiempo para la 
revisión de tesis, críticas y comentarios.
 
Agradecimientos personales 
 
A la Universidad Nacional Autónoma de México, por proporcionarme una 
educación académica de gran calidad desde el nivel medio superior y por 
brindarme todos los recursos necesarios para culminar la presente etapa. 
 
Al Dr. Ismael Hernández Lucas, por resolver mis dudas y contar siempre con su 
apoyo en todos los aspectos. 
 
A los Dres. Edmundo Calva y José Luis Puente, por ser parte de su laboratorio de 
investigación. Al Dr. Calva, por sus conocimientos compartidos, atención, valiosos 
consejos durante los seminarios, por su participación, apoyo, gran interés y 
recomendaciones en el proyecto. 
 
A los compañeros del laboratorio cuya participación fue valiosa en la realización 
del presente trabajo: Alejandra Vázquez, Marcos Fernández, Amapola Blanco, 
Rosalba Gonzáles, Elvira Villa, José Luis Gama y Rebeca Herrera. 
 
A Lucas-Team: Lili, Esteban, José Miguel y Lorena, por todo lo que aprendí de 
ellos, por su amistad, consejos, por haber hecho siempre juntos de nuestra área 
de trabajo un ambiente de respeto, convivencia, apoyo y ayuda incondicional. 
 
A Ricardo por contestar mis preguntas, por los reactivos, primers, soluciones y/o 
cepas que amablemente me proporcionó cuando los llegué a requerir y por el 
tiempo que además de investigador dedica para estar al pendiente del buen 
funcionamiento del equipo de laboratorio y de la disponibilidad de material en 
vacaciones, ayuda que me permitió avanzar en el proyecto.
 
A Carmen Guadarrama por haber aclarado mis dudas y estar siempre dispuesta a 
hacerlo, por sus charlas, consejos, ayuda y recomendaciones que tuve de ella 
para mejorar los experimentos realizados. 
 
A los miembros del laboratorio Calva-Puente: Crispín, Magdalena, Nayeli, Carmen, 
Panchito, Vero, Víctor, Deyanira, Luary, Irene, Ramón, Sara y Abraham, por su 
ayuda, convivencia, pláticas o consejos que tuve de ellos. 
 
A Deyanira, Olga Nohemí Hernández y Nancy Velázquez por contar siempre con 
su ayuda desde la licenciatura hasta la fecha. 
 
A Guadalupe Ramírez por su compañía, ayuda, por ser una gran persona y 
ejemplo. 
 
A Silvia, Carlo y Gabo por su amistad, convivencia, platicas, risas, porras de 
siempre y por su enseñanza constante en otro idioma. 
 
A todos mis amigos y personas que me quieren, porque de alguna manera 
siempre están conmigo. 
 
 
 
 
3 
Dedicatoria 
 
A mi madre por todo lo que aprendo de ella día a día, por su gran ejemplo,comprensión y apoyo incondicional, por estar conmigo siempre. 
 
A Fredy, Myriam, Maricruz, Valeria y Yaretzi por ser mi familia, por su cariño, 
compañía, amistad y apoyo que tengo siempre de ellos.
4 
ÍNDICE 
 
RESUMEN……………………………………………………………………………................ 6 
ABSTRACT…………………………………………………………………………………....... 7 
 
1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………….............. 8 
1.1. El género Salmonella…………………………………………………………...……. 8 
1.2. Infección por Salmonella…………………………………………………………….. 9 
1.3. Adhesión de Salmonella al hospedero………………………………….…………. 10 
1.4. Vacuola Contenedora de Salmonella (VCS)……………………………................. 11 
1.5. Islas de Patogenicidad en Salmonella (SPIs) y sistemas de secreción……...... 11 
1.5.1. Isla de patogenicidad I en Salmonella (SPI-1)…………………..…………. 12 
1.5.2. Isla de patogenicidad II en Salmonella (SPI-2)…………………………….. 13 
1.6. Factores de virulencia…………………………………………………………..…… 14 
1.7. Regulación transcripcional…………………………………………………..……… 15 
1.8. Reguladores transcripcionales LysR (LTTRs)…………..……………………...... 17 
1.9. LTTRs en Salmonella………………………………………………..……………….. 18 
 
2. ANTECEDENTES……………………………………………………………....………….. 20 
 
3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS……………………………………………………………….. 25 
3.1. Hipótesis…………………………………………………………………………...…… 25 
3.2. Objetivo general …………………………………………………………...…............. 25 
3.3. Objetivos particulares ……………………………………………….…..................... 25 
 
4. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………...……… 26 
4.1. Cepas, plásmidos y oligonucleótidos…………………………………...…………. 26 
4.2. Medios de cultivo y condiciones de crecimiento………………………………….. 29 
4.3. Manipulación de DNA……………………………………………………………...... 30 
4.4. Construcción de fusiones transcripcionales al gen reportero cat…………........ 32 
4.5. Ensayos de expresión de las fusiones transcripcionales al gen 
reportero cat…………………………………………………………….……………. 34 
4.6. Construcción de cepas mutantes………………………………….……………….. 35 
4.7. Complementaciones……………………………………………….………………… 35 
 
5 
4.8. Análisis proteómico………………………………………………………................. 36 
4.8.1. Extracción total de proteínas………………………….…………………...... 36 
4.8.2. Electroforesis en gel de 2 dimensiones (2-DGE)...……….……………….. 36 
4.8.3. Identificación de proteínas mediante espectrometría de masas………… 36 
4.8.4. Búsqueda en la base de datos……………………………………….……… 37 
4.9. Purificación y electroforesis de proteínas de membrana externa……….….…… 37 
 
5. RESULTADOS……………………………………………………………………….......... 39 
5.1. Expresión de la región reguladora STY0036 de S. Typhi IMSS-1 en 
MM-N y MA…………..………………………………………………………….……... 39 
5.2. Análisis proteómico……………………………………………..……………….…… 40 
5.3. Identificación de proteínas reguladas por STY0036……………..………….……. 41 
5.4. Perfil de proteínas de membrana externa de las cepas S. Typhi IMSS-1 y 
S. Typhi IMSS-1 ∆STY0036……………………………………………….…………. 41 
5.5. Expresión de las fusiones ompR, ompC y ompF en MM-N…………….……...... 42 
5.6. Complementación en MM-N de la cepa S. Typhi IMSS-1 ∆STY0036 con 
la proteína STY0036……………………………………..…………………….……... 43 
5.7. Activación de la transcripción de ompR mediante STY0036……….…….……... 44 
5.8. Resistencia de S. Typhi IMSS-1 a deoxicolato de sodio……………..….……..... 46 
5.9. Complementación de las cepas mutantes STY0036, ompR, ompC y 
ompC-ompF crecidas en LB con 5% de deoxicolato de sodio……………...……. 47 
5.10. S. Typhi IMSS-1 ∆STY0036 como célula competente………………..….... 49 
 
6. DISCUSIÓN……………………………………………………………………...…….……. 51 
 
7. CONCLUSIONES………………………………………………………………….……..… 56 
 
8. PERSPECTIVAS…………………………………………………………………….…..…. 57 
 
9. ANEXO………………………………………………………………………………..……... 58 
 
10. REFERENCIAS…………………………………….…….……………………………….. 79 
 
6 
RESUMEN 
Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi) es una bacteria de interés médico, 
causante de fiebre tifoidea en humanos. Por ello es importante entender su 
biología, mecanismos de invasión, sobrevivencia y replicación. Para iniciar el 
proceso de infección, S. Typhi se enfrenta dentro de su hospedero a severas 
condiciones de estrés, promoviendo la expresión de diversos reguladores 
transcripcionales, dentro de los cuales se encuentran los de la familia LysR (LysR-
type transcriptional regulators; LTTR), éstos se encuentran involucrados en 
virulencia y en diversas funciones celulares. 
El trabajo se enfocó en el estudio de STY0036, un LTTR exclusivo del 
género Salmonella descrito por primera vez en el presente trabajo. Ensayos de 
expresión transcripcional con la región reguladora de STY0036, mostraron mayor 
expresión en un medio mínimo (MM-N), bajo en fosfato y magnesio, utilizado para 
inducir la expresión de algunos genes de la isla de patogenicidad SPI-2 
(Salmonella Pathogenicity Island 2) en Salmonella a diferencia de un medio rico 
(medio MA), esta evidencia sugiere su participación en algún proceso de 
sobrevivencia intracelular. Mediante estudios de proteómica, perfiles de proteínas 
de membrana externa y análisis trascripcionales, se hizo evidente la regulación 
positiva de STY0036 sobre OmpR, y este regulador de la familia de dos 
componentes a su vez promueve la síntesis de las porinas OmpC y OmpF. 
Finalmente, para determinar el papel biológico de STY0036, se evaluó el 
crecimiento de la cepa silvestre, y las mutantes: STY0036, ompR, ompC, ompF y 
ompC-ompF en medio líquido Luria Bertani (LB) con la sal biliar deoxicolato de 
sodio, observando crecimiento sólo en la cepa silvestre y la mutante ompF, 
sugiriendo un papel de OmpC en la resistencia de S. Typhi a la sal biliar y por lo 
tanto a su sobrevivencia en los compartimentos intestinales. Además se descubrió 
que S. Typhi es más competente cuando OmpC y OmpF están ausentes. Con 
estos experimentos demostramos el papel esencial de STY0036 en la vía de 
regulación STY0036-ompR-ompC en presencia de la sal biliar deoxicolato de 
sodio. También se demostró que STY0036 está involucrado indirectamente en la 
transformación bacteriana. 
 
7 
ABSTRACT 
Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi) is an important human pathogen 
causing typhoid, also known as typhoid fever. Hence it is very important to study its 
biology and mechanism of pathogenicity. For infection S. Typhi has to withstand 
multiple stress conditions within its host, which promotes the expression of some 
transcriptional regulators. Among these regulators are those transcriptional 
regulators of the LysR family, also called LTTRs (LysR-type transcriptional 
regulators), which are involved in diverse cellular functions and virulence. 
The present study further examined the role of the regulator STY0036, an 
uncharacterized LTTR that is only found in the Salmonella genus. Expression of a 
transcriptional fusion of the STY0036 regulatory region was evaluated under two 
conditions: in N-minimal medium (N-MM) low in phosphate and magnesium which 
is usually used to induce expression of some SPI-2 (Salmonella Pathogenicity 
Island 2) genes and in nutrient-rich medium A (MA). The results showed that 
STY0036 was expressed more in N-MM as compared to MA, which suggests the 
involvement of STY0036 in intracellular survival processes. Through proteomic 
studies, transcriptional analysis and outer membrane protein profiles, it became 
clear that STY0036 regulates OmpR, and this response regulator of the two-
component in turn promotes the synthesis of OmpC and OmpF porins. 
To determine the biological role of STY0036, the growth of the wild-type, 
and the mutants strains: STY0036, ompR, ompC, ompF and ompC-ompF was 
assessed in liquid Luria Bertani (LB) media containing sodium deoxycholate. The 
growth of wild-type strain and ompF mutant was similar, suggesting the role of 
OmpC in allow S. Typhi proliferation under this stress condition found in intestinal 
compartments. Also, we found that S. Typhi is more competent when OmpC and 
OmpF areabsent. We showed the essential role of STY0036 in STY0036-ompR-
ompC genetic network in the presence of the bile salt sodium deoxycholate. Thus, 
the synthesis of the global regulator OmpR as well as the porins OmpC and OmpF 
were found to be dependent on the LysR regulator STY0036. In addition, we have 
data that shows that STY0036 participates in bacterial transformation. 
Introducción 
________________________________________________________________________________________ 
8 
1. INTRODUCCIÓN 
 
1.1. El género Salmonella 
En 1886 Daniel E. Salmon y su compañero Theobald Smith describen por 
primera vez el aislamiento de un bacilo Gram negativo, y se utiliza el nombre 
genérico de Salmonella en honor a los logros de Salmon (Schultz, 2008). Las 
bacterias del género Salmonella pueden infectar diversos mamíferos, reptiles, 
aves e insectos provocándoles enteritis, infección sistémica o fiebre entérica. El 
género consta de dos especies: Salmonella bongori (S. bongori) y Salmonella 
enterica (S. enterica). Esta última ha sido ampliamente estudiada, sus miembros 
son capaces de infectar a un amplio rango de hospederos y está constituida por 
seis subespecies: enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae e indica. Las 
subespecies con mayor importancia médica son: enterica y arizonae. Se han 
descrito 2557 diferentes serovares, el 99% pertenece a la subespecie enterica, 
causantes de enfermedades en animales de sangre caliente (Grimont y Weill, 
2007). 
Los mecanismos de transmisión usualmente son tres: consumir alimentos y 
agua contaminada a través de la interacción directa con animales infectados y por 
contacto con materia fecal contaminada. La gravedad de la enfermedad depende 
del serotipo de Salmonella y la especie del hospedero. Hay dos síndromes clínicos 
asociados con la infección en el humano por S. enterica: Salmonelosis no tifoidea 
(enfermedad gastrointestinal conocida como gastroenteritis) y fiebre tifoidea 
(enfermedad sistémica) (Layton y Galyov, 2007). 
S. enterica serovar Typhi (S. Typhi) y S. enterica serovar Paratyphi (S. 
Paratyphi) están restringidas al humano, estos serovares causan fiebre tifoidea y 
paratifoidea respectivamente, llegan a provocar enfermedad sistémica si no se 
trata oportunamente. Ocasionan enfermedad febril en poblaciones empobrecidas 
con saneamiento inadecuado donde también los viajeros son susceptibles (Crump 
y Mintz, 2010). En el año 2000 la fiebre tifoidea causó aproximadamente 21.7 
millones de enfermos y 217 mil muertes, y la fiebre paratifoidea un estimado de 
5.4 millones de enfermos a nivel mundial (Crump et al., 2004). 
Introducción 
________________________________________________________________________________________ 
9 
S. enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) y S. enterica serovar 
Enteritidis (S. Enteritidis) causan gastroenteritis en humanos y en otros animales. 
La gastroenteritis es una enfermedad emergente en África, causa daño a niños y 
adultos inmunodeprimidos, aproximadamente el 10% de 20 millones de adultos 
con VIH desarrollan la infección al año en este continente, a pesar de usar 
antibióticos como tratamiento (Santos et al., 2009). 
En varios países del mundo, S. enterica infecta al humano, provocando un 
serio problema de salud pública por ser una de las principales causas de 
enfermedades entéricas. 
 
1.2. Infección por Salmonella 
En la naturaleza, la infección por S. enterica ocurre por la ingestión de 
comidas, agua contaminada o por contacto con personas portadoras. Después de 
la ingestión de un número suficiente de bacterias, una parte del inóculo sobrevive 
a un ambiente del estómago bajo en pH para posteriormente entrar al intestino 
delgado donde se establece la infección. 
Después de entrar al intestino delgado, Salmonella inicia la infección 
invadiendo el tejido linfoide del hospedero, incluyendo las placas de Peyer, a 
continuación se adhiere apicalmente a las células epiteliales del íleon y a las 
células M que debido a la ausencia del borde del cepillo así como de glicocalix, 
representan una puerta de entrada para las enterobacterias (Jensen et al., 1998; 
Jepson y Clark, 2001). Enseguida Salmonella entra a la barrera epitelial y 
principalmente infecta fagocitos dentro de la lámina propia. 
En la gastroenteritis la infección es generalmente autolimitada y no avanza 
más allá de la lámina propia, sin embargo en la salmonelosis causante de la fiebre 
tifoidea, los fagocitos infectados por Samonella acceden a los vasos linfáticos y al 
torrente sanguíneo, permitiendo así la diseminación de las bacterias al hígado y 
bazo (Vázquez-Torres et al., 1999). De esta manera, Samonella al diseminarse en 
su hospedero, puede llegar y persistir en la vesícula biliar y en la médula ósea 
(Sinnott y Teall, 1987; Wain et al., 2001). 
 
Introducción 
________________________________________________________________________________________ 
10 
S. Typhi ha sido encontrada formando biopelículas en cálculos biliares del 5% 
de pacientes a quienes se les ha eliminado la vesícula biliar en la ciudad de 
México, además los cálculos biliares han demostrado desempeñar un papel 
importante en la persistencia de Salmonella, en la inducción de éstos en ratones 
dio como resultado una mayor excreción fecal y un aumento en la colonización del 
tejido de la vesícula biliar (Crawford et al., 2010a). 
 
1.3. Adhesión de Salmonella al hospedero 
Como se ha mencionado, la adhesión al huésped es un paso crucial durante la 
patogénesis. Los sistemas de adhesión en S. enterica han sido organizados en 
dos grupos principales: adhesinas fimbriales y no fimbriales, y se diferencian de 
acuerdo con sus vías de ensamblaje (Soto y Hultgren, 1999). 
Como ejemplo del primer grupo, en Salmonella se han predicho 13 loci 
fimbriales, algunos de los cuales son inducidos in vivo y son requeridos para la 
formación de biopelículas, unión a la célula hospedera y colonización (Humphries 
et al., 2001). 
En contraste a las adhesinas fimbriales, las no fimbriales comprenden 
adhesinas mono y oligoméricas que son transportadas a través de un sistema de 
secreción tipo I o autotransportadas a través de las membranas de la bacteria. 
Además varias estructuras de la superficie de Salmonella no involucradas en la 
adhesión también contribuyen a la unión y colonización de los tejidos en el 
huésped. Una de esas estructuras es el flagelo, constituido por una proteína 
polimérica necesaria para la motilidad y otras formas de movimiento dirigido. Los 
flagelos también se involucran en quimiotaxis, inducción de respuesta inmune e 
inflamación y contribuyen a la unión y colonización de tejidos de la mucosa 
(Ramos et al., 2004). Mutaciones en genes estructurales y ensamble de flagelos 
afectan la capacidad de las mutantes para adherirse a las superficies cubiertas por 
colesterol, entre estos FliC, la subunidad principal y conservada de los flagelos. La 
unión de FliC al colesterol podría ser un paso inicial de Salmonella para colonizar 
y formar biopelículas en cálculos biliares en humanos (Crawford et al., 2010b). 
Introducción 
________________________________________________________________________________________ 
11 
Para los lipopolisacáridos (LPS), componentes de la membrana celular externa 
de las bacterias Gram negativas, no hay un factor de unión específico, su efecto 
adhesivo se le atribuye a su carácter anfipático. Las moléculas de LPS en su 
totalidad son requeridas para la colonización de tejidos del huésped. Se ha 
demostrado que cepas deficientes en LPS son incapaces de competir ante cepas 
silvestres en experimentos de colonización en ratones (Nevola et al., 1985). 
 
1.4. Vacuola Contenedora de Salmonella (VCS) 
Posterior a la internalización celular, Salmonella sobrevive y se replica dentro 
de un fagosoma modificado, conocido como Vacuola Contenedora de Salmonella 
(VCS), inicialmente caracterizado porla acumulación de endosomas tempranos, 
éstos contienen marcadores de la vía endocítica temprana como EEA1, Rab5 y 
receptores de transferrina, posteriormente dentro de los siguientes 15 a 60 
minutos, proteínas del endosoma temprano se sustituyen por proteínas 
normalmente encontradas en el endosoma tardío o lisosomas, tales como LAMPs 
(proteínas de membrana asociadas a lisosomas) y ATPasas tipo vacuolar. 
Además las VCS son asociadas con filamentos inducidos por Salmonella en 
células epiteliales (Steele-Mortimer et al., 1999). La sobrevivencia intracelular de 
Salmonella es debido a que la bacteria transloca varias proteínas efectoras hacia 
el citosol de la célula hospedera a través de un sistema de secreción tipo III 
(SST3) codificado por SPI-2. 
 
1.5. Islas de Patogenicidad en Salmonella (SPIs) y sistemas de secreción 
Las islas de patogenicidad son secuencias de DNA que se caracterizan por 
contener genes asociados a virulencia y pueden estar tanto en plásmidos, como 
en cromosomas bacterianos. Las SPIs se describieron por primera vez en E. coli, 
posteriormente se encontraron en varios genomas de bacterias patógenas de 
humanos y plantas. Las SPIs son fragmentos de un tamaño de 10 a 200 kb, se 
presentan en genomas de cepas patógenas y están ausentes en especies no 
patógenas (Hacker y Kaper, 2000). En los genomas secuenciados de Salmonella 
enterica se han identificado y caracterizado algunos genes involucrados en 
Introducción 
________________________________________________________________________________________ 
12 
patogénesis, tales genes se encuentran en las SPIs y la adquisición de estas 
ayudan a la bacteria a invadir, replicar y dispersarse dentro del ambiente hostil del 
hospedero (Marcus et al., 2000). 
A la fecha, en el género Salmonella se han descrito 21 SPIs (Sabbagh et al., 
2010). Las islas de patogenicidad 1 y 2 (SPI-1 y SPI-2) han sido las más 
estudiadas, ambas codifican proteínas efectoras y un SST3 mediante el cual las 
proteínas son translocadas al hospedero, además un sistema de secreción tipo I 
(SSTI) es corregulado por SPI-1. 
El SST3 es usado por bacterias patógenas para liberar factores de virulencia a 
la célula hospedera e interferir o subvertir sus vías de señalización. Constan de 
más de 20 tipos de proteínas, algunas de las cuales son homólogas a las 
involucradas en la construcción del flagelo. Salmonella codifica dos SST3, uno en 
SPI-1 y otro en SPI-2. El SST3 de SPI-1 es requerido para la invasión de células 
no fagocíticas, inducción de respuesta inflamatoria intestinal y diarrea, así como la 
colonización del intestino, en contraste el SST3 codificado por SPI-2 es esencial 
en la sobrevivencia dentro del macrófago y el establecimiento de la enfermedad 
sistémica (Haraga et al., 2008). 
 
1.5.1. Isla de patogenicidad I en Salmonella (SPI-1) 
En 1989, se identificaron en Salmonella genes esenciales para la 
invasividad bacteriana en cultivos celulares (Galán y Curtis, 1989), posteriormente 
se mostró la completa expresión de virulencia oral en parte de una isla de 
patogenicidad adquirida por transferencia horizontal, la SPI-1 (Mills et al., 1995). 
BapA y SiiE son dos proteínas asociadas a superficie implicadas en la invasión y 
adhesión, son secretadas por los sistemas BapBCD y SiiCDF respectivamente a 
través del sistema de secreción tipo I (Latasa et al., 2005; Gerlach et al., 2007). 
SiiE es codificada en SPI-4 y corregulada con SPI-1 (Morgan et al., 2007; Main-
Hester et al., 2008). 
Una vez adherida la bacteria a su hospedero, emplea la SPI-1 para codificar 
el SST3 y translocar proteínas efectoras a través de un inyectisoma. El SST3 
puede translocar al menos 15 proteínas a la célula hospedera, cuatro de ellas, 
Introducción 
________________________________________________________________________________________ 
13 
SopE/SopE2, SopB y SipA en conjunto, inducen rearreglos de actina requeridos 
para la invasión, las restantes en su mayoría están implicadas en procesos 
posteriores a la invasión, incluyendo la supervivencia de la célula huésped, la 
biogénesis de las VCS y la modulación de la respuesta inflamatoria. Aunque 
inicialmente fue caracterizada como isla de invasividad, SPI-1 tiene funciones 
relacionadas con la activación de las vías inmunes innatas. 
 
En macrófagos infectados por Salmonella, la flagelina es translocada al 
citosol a través del SST3, dando como resultado la activación del inflamasoma y la 
caspasa responsable de la mediación de la muerte celular (Ren et al., 2006; Miao 
et al., 2007; Sun et al., 2007). En el epitelio intestinal, la flagelina induce la 
inflamación mientras inhibe la apoptosis vía TLR5, la flagelina debe ser 
translocada hacia el lado basolateral de las células epiteliales, dada a la nula 
expresión de TLR5 en la superficie apical (Gewirtz et al., 2001; Vijay-Kumar et al., 
2006). Los flagelos son regulados usualmente dentro del hospedero, aunque 
dentro de los macrófagos se ha sugerido pueden ser inducidos por el SST3 (Sano 
et al., 2007). 
 
1.5.2. Isla de patogenicidad 2 en Salmonella (SPI-2) 
SPI-2 es esencial para la sobrevivencia intracelular y la virulencia sistémica en 
la tifoidea murina (Hensel et al., 1995; Ochman et al., 1996), además las proteínas 
translocadas por el SST3 de la isla interfieren con el tráfico de oxidasas NADPH 
hacia las VCS, evitando así la exposición de la bacteria a especies reactivas 
tóxicas de oxígeno (Vázquez-Torres et al., 2000). El SST3 codificado en la SPI-2 
se involucra en enfermedades inflamatorias, indicando que las actividades de la 
isla son críticas para la inducción temprana y completa de enterocolitis, así como 
la enfermedad sistémica (Coombes et al., 2005; Coburn et al., 2005; Bispham et 
al., 2001). SPI-2 está involucrada en la inducción de la ciclooxigenasa, así como la 
modulación de la expresión y señalización de citocinas del hospedero (Uchiya et 
al., 2004). 
Introducción 
________________________________________________________________________________________ 
14 
El SST3 de SPI-2 se expresa al detectar el ambiente fagosomal. Su función en 
patogénesis se ha estudiado y se ha mostrado que es esencial en la virulencia en 
el modelo de infección del ratón (Shea et al., 1996; Hensel et al., 1995). Dos 
genes, spvB y spvC codifican los principales factores de virulencia mediada por 
plásmidos en S. Typhimurium (Matsui et al., 2001). Ambos factores son 
translocados a la célula hospedera a través del SST3 de la SPI-2 (Browne et al., 
2008; Mazurkiewicz et al., 2008). El gen spvB codifica una enzima que 
desestabiliza el citoesqueleto de las células eucariotas y también se asocia con la 
citoxicidad de las células huéspedes (Lesnick et al., 2001; Tezcan-Merdol et al., 
2001; Kurita et al., 2003; Browne et al., 2008). SpvC puede inactivar las proteínas 
cinasas activadas por los mitógenos Erk1/2, JNK y p38 en células de mamíferos 
(Li et al., 2007; Mazurkiewicz et al., 2008). Al menos 20 proteínas efectoras en 
Salmonella se sabe que son translocadas por el sistema de secreción a través de 
la membrana fagosomal al citoplasma de la célula eucarionte, sin embargo sus 
funciones específicas en la replicación intracelular o modificación de movimiento 
vesicular permanecen sin entenderse (Haraga et al., 2008). 
Las SPIs contribuyen a la macroevolución al desarrollar variantes patogénicas, 
mientras el proceso de rearreglo, deleción y transferencia de estas tiene fuerte 
impacto en la microevolución y adaptación de los microorganismos patógenos 
durante el proceso de infección (Hacker y Kaper, 2000). 
 
1.6. Factores de virulencia 
La mayoría de los factores de virulencia son codificados en las islas de 
patogenicidad, además de los sistemas de secreción, fimbrias y flagelos 
Salmonella tiene otros factores como superóxido dismutasas y transportadores de 
iones. 
Muchas de las células hospederas producen especies reactivasde oxígeno, en 
gran medida a través de la actividad NADPH oxidasa del fagosoma, requerida 
para eliminar patógenos intracelulares. Para contrarrestar esta actividad, 
Salmonella utiliza la superóxido dismutasa SodCl, que puede conferir protección 
de especies reactivas de oxígeno extracelulares. SodCI se encuentra en el 
Introducción 
________________________________________________________________________________________ 
15 
periplasma y su resistencia a proteasas puede ser una propiedad fundamental 
para permitir su función en condiciones extremas del fagosoma (Krishnakumar et 
al., 2007; Pacello et al., 2008). 
Además de SodCI, S. Typhimurium cuenta con tres sistemas para la captación 
de Mg2+ que le permiten sobrevivir, estos son: CorA, MgtA y MgtB, cada uno de 
ellos es esencial para la virulencia. CorA es un canal de magnesio constitutivo y 
mutante de su gen atenúa la invasión y replicación en células epiteliales de ratón, 
y estudios de microarreglos de esta mutante, muestran la represión de varios 
efectores de virulencia (Papp-Wallace et al., 2008). Los transportadores MgtA y 
MgtB son expresados por el sistema de dos componentes PhoP/PhoQ (Blanc-
Potard y Groisman, 1997) y son inducidos durante la infección, implicando el 
transporte de magnesio en virulencia (Smith et al., 1993). Otros dos sistemas 
implicados en la sobrevivencia intracelular de S. Typhimurium son el sistema 
captador de Zn2+ ZnuABC y el sistema transportador de K+ Trk. El sistema de 
transporte de K+ Trk, es un complejo de proteínas que funciona como un 
transportador de baja actividad, y puede funcionar dando resistencia a los péptidos 
antimicrobianos (Parra-López et al., 1994). El sistema captador de Zn2+ ZnuABC, 
es requerido para el crecimiento de S. Typhimurium en bajas condiciones del ion y 
mutantes en ZnuABC son deficientes para la virulencia en ratones (Ammendola et 
al., 2007). 
 
1.7. Regulación transcripcional 
Las bacterias se adaptan a cambios ambientales drásticos cuando entran al 
hospedero, por ejemplo, cuando Salmonella se encuentra en el tracto 
gastrointestinal, sobrevive a una gran variedad de condiciones como son: pH 
ácido, baja concentración de oxígeno, alta o baja osmolaridad y bajas 
concentraciones de magnesio. Estas condiciones generan cambios en la 
expresión genética para permitir a la bacteria adherirse, invadir y replicarse dentro 
de su hospedero (Figueroa-Ochoa y Verdugo-Rodríguez, 2005). 
La estructura genómica de S. Typhi CT18 está constituida por un cromosoma 
circular de 4.8 Mb y dos plásmidos: pHCM1 de 218 kb, este codifica para la 
Introducción 
________________________________________________________________________________________ 
16 
resistencia a múltiples antibióticos y el pHCM2 de 106 kb, un plásmido críptico 
(Parkhill et al., 2001). Dentro del genoma de Salmonella se localizan factores de 
transcripción (TFs), involucrados en procesos de infección y patogénesis 
(Figueroa-Ochoa y Verdugo-Rodríguez, 2005). Las bacterias cuentan con 
mecanismos complejos para regular la transcripción de sus genes y lo hacen a 
través de los TFs, de estos una docena se han identificado (Pérez-Rueda y 
Collado-Vides, 2000) de los cuales LacI, AraC, CRP, LysR y OmpR son los mayor 
caracterizados. 
El TF OmpR ha sido uno de los reguladores más extensamente estudiados en 
E. coli y Salmonella. OmpR junto con la proteína EnvZ pertenecen a la familia de 
reguladores de dos componentes, sistema responsable del estímulo respuesta, 
donde EnvZ es un sensor cinasa que recibe el estímulo y a su vez transmite la 
señal a OmpR, el regulador de respuesta que interactúa con el DNA. OmpR 
fosforilado por EnvZ regula la transcrpción de los genes ompF y ompC, así bajo 
condiciones de baja osmolaridad OmpR activa la transcripción de ompF, mientras 
que en alta osmolaridad reprime la transcripción de este y activa la de ompC 
(Mizuno y Mizushima, 1990). 
En E. coli se ha reportado el papel de OmpR en la síntesis de porinas (Hall y 
Silhavy 1981; Puente et al., 1991), en esta bacteria cuando se inactiva OmpR se 
afecta la expresión de 100 genes dentro de los cuales se encuentran algunos 
involucrados en motilidad, síntesis de curlis (Vidal et al., 1998), aminoácidos y 
metabolismos de carbohidratos (Oshima et al.,2002), también en E. coli OmpR 
regula negativamente el operón flhDC, el cual está involucrado en la síntesis de 
flagelos para la motilidad (Shin y Park, 1995) mientras en S. Typhimurium el papel 
de regulación del operón permanece sin esclarecerse. 
En S. Typhi se ha reportado que la expresión de OmpR se relaciona con la 
regulación de 305 genes (Perkins et al., 2009). Dentro de estos genes se 
encuentran los relacionados con la síntesis de porinas (Puente et al., 1991; 
Oropeza et al. 1999; Fernández-Mora et al., 2004). En S. Typhimurium OmpR 
controla la expresión del sistema de dos componentes SsrAB, este regula 
positivamente el SST3 codificado en SPI-2 (Garmendia et al., 2003). 
Introducción 
________________________________________________________________________________________ 
17 
Además de OmpR, entre otros TFs presentes en S. Typhi que se describen 
más adelante se encuentran los miembros de la familia LysR (LTTRs), los cuales 
constituyen la familia de reguladores transcripcionales más abundantes en 
procariontes (Pareja et al., 2006). 
A diferencia de las proteínas reguladoras también se han reportado RNAs 
antisentido como micF que regula postranscripcionalmente genes que codifican 
para porinas (Andersen et al., 1989; Chou et al., 1993) y más recientemente se 
han descubierto sRNAs (small Ribonucleic Acids) con función de regulación 
transcripcional en bacterias, estos participan en la adaptación celular a los 
cambios ambientales y se ha mostrado que los sRNAs reguladores tienen un 
papel importante en la virulencia microbiana durante la infección (Michaux et al., 
2014). El sRNA MicA, cuya sobreexpresión aumenta la motilidad en placas de 
agar blando también regula negativamente la expresión de algunas proteínas de 
membrana externa de E. coli y Salmonella (De Lay y Gottesman, 2012). 
 
1.8. Reguladores transcripcionales LysR (LTTRs) 
Los LTTRs fueron descritos por primera vez en 1988 (Henikoff et al., 1988), 
activan la transcripción de genes, operones y regulones involucrados en diversas 
funciones celulares como: metabolismo de aminoácidos, división celular, 
virulencia, fijación de nitrógeno, respuesta a estrés oxidativo y degradación de 
xenobióticos (Schell, 1993; Maddocks y Oyston, 2008; Lönneborg y Brzezinski, 
2011), se consideran reguladores duales por regular positiva y negativamente 
genes blanco y operones en diversos organismos (Schell, 1993). Los LTTRs 
poseen un tamaño aproximado de 300 a 350 aminoácidos, contienen una 
estructura muy conservada en la región N-terminal, la cual presenta un dominio de 
unión al DNA (DBD; DNA-Binding Domain) con un motivo hélice-vuelta-hélice 
alado (wHTH; winged Helix-Turn-Helix) y en la región C-terminal poseen un 
dominio de unión a un inductor (IBD; Inductor-Binding Domain) menos 
conservado. El IBD se subdivide en dos subdominios: RD1 y RD2 entre los cuales 
se encuentra una hendidura de unión al inductor. (Figura 1.1). 
Introducción 
________________________________________________________________________________________ 
18 
La forma activa de un LTTR frecuentemente es un tetrámero, algunos forman 
dímeros en solución y esta estructura parece ser su forma activa, otros forman 
octámeros y también se ha reportado la estructura de hexámero (Tabla 1.1). 
 
 
 
Figura 1.1: Representación típica de un LTTR. Se muestra el dominio de unión al DNA con un motivo HTH en el extremo N-
terminal y el dominio de unión al inductor (IBD) en extremo C-terminal. El IBD a su vez se divide en 2 subdominios, el RD1 
y el RD2 conectados por una hendidura de unión al inductor. Datos sugieren un sitio adicional deunión al DNA (RD1) y un 
sitio de unión al inductor (RD2). 
 
 
 
Tabla 1.1: Estructura de los LTTRs reportados. 
Forma activa Ejemplos Referencias 
 
Dímero MetR, CatR, IlvY, NodD3, Nac, e IciA Maxon et al., 1990; Parsek et al., 1992; Fisher y Long, 1993; Bender, 
1991; Muse y Bender, 1999; Thöny et al., 1991. 
 
 
Tetrámero NahR, CysB, OxyR, CbnR, DntR, ArgP, 
TsaR, AphB y LeuO 
Maddocks y Oyston, 2008; Schell et al., 1990; Hryniewicz y Kredich, 
1994; Muraoka et al., 2003; Smirnova et al., 2004; Monferrer et al., 
2010; Zhou et al., 2010; Taylor et al., 2012; Guadarrama et al., 2014. 
 
 
Hexámero HsdR Sainsbury et al., 2009; Ruangprasert et al., 2010; Gong et al., 2012. 
 
 
Octámero CrgA y ThnR López-Sánchez et al., 2009; Sainsbury et al., 2009. 
 
 
 
1.9. LTTRs en Salmonella 
 Las proteínas reguladoras de la familia LysR se encuentran involucradas en 
virulencia y diversas funciones celulares, algunos de estos reguladores se han 
estudiado en S. Typhimurium, por ejemplo IlvY es necesario para la regulación del 
gen ilvC implicado en la síntesis de isoleucina y valina (Blazey y Burns, 1984); 
OxyR modula la expresión de un regulón implicado en la respuesta celular frente a 
Introducción 
________________________________________________________________________________________ 
19 
condiciones de estrés oxidativo (Christman et al., 1989); MetR es un regulador 
positivo de metA, metE y metH, en donde el producto de metA es una enzima 
requerida para la síntesis de O-succinil homoserina en el primer paso del ciclo 
para la síntesis de metionina (Mares et al., 1992) y los productos de metE y metH 
son enzimas requeridas para la síntesis de metionina (Byerly et al., 1991); SpvR 
es un regulador de la expresión del operón de virulencia spvRABCD; CysB es una 
proteína tipo LysR encargada de regular la síntesis de cisteína en presencia del 
inductor N-acetyl-L-serina, (Hryniewicz y Kredich, 1994; Quan et al., 2002 ); SinR 
es una proteína requerida en la motilidad (Folkesson et al., 2002); Hrg juega un 
papel crucial en la virulencia de Salmonella dentro del macrófago (Lahiri et al., 
2008); HdfR activa la transcripción del operón fimbrial std y posee un papel en la 
adhesión de Salmonella a secciones específicas intestinales (Jakomin et al., 
2008); la proteína YfeR está involucrada en la regulación de un putativo 
transportador dependiente de Na+ (YfeH) a bajas concentraciones de osmolaridad 
y se sugiere que este regulador es requerido para un óptimo crecimiento en 
condiciones de baja osmolaridad (Baños et al., 2011) y YdcI está involucrado en la 
resistencia a estrés ácido (Jennings et al., 2011). En S. Typhi, se ha descrito a la 
proteína LeuO, ésta posee un papel en la regulación de porinas (Fernández-Mora 
et al., 2004; De la Cruz et al., 2007) y de genes involucrados en la respuesta a 
estrés oxidativo y en el control positivo del sistema de defensa antiviral 
denominado Cas/CRISPR (Hernández-Lucas et al., 2008; Medina-Aparicio et al., 
2011). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Antecedentes 
________________________________________________________________________________________ 
20 
2. ANTECEDENTES 
El conocimiento actual sobre los LTTRs presentes en procariontes nos da un 
panorama de su importancia en diversos procesos celulares y de virulencia. En el 
género Salmonella se han caracterizado algunos reguladores como ya se ha 
mencionado, pero específicamente en S. Typhi no se han estudiado a detalle. En 
un análisis in silico realizado en nuestro grupo de trabajo, el cual consistió en la 
identificación de todas las proteínas con dominio HTH clasificadas como LTTRs en 
S. Typhi mediante la base de datos UniprotKB, se identificaron 45 LTTRs (Tabla 
2.1). De estos sólo LeuO ha sido caracterizado en S. Typhi y se ha demostrado su 
participación en diversos procesos biológicos en distintas bacterias (Fang et al., 
2000; Shimada et al., 2011; Dillon et al., 2012; Hernández-Lucas y Calva 2012). 
En S. Typhi, LeuO es el regulador positivo de OmpS1, OmpS2, AssT y del sistema 
CAS/CRISPR, mientras la expresión de OmpX, Tpx y STY1978 es regulada 
negativamente por este regulador (Hernández-Lucas et al., 2008; Medina-Aparicio 
et al., 2011). Las secuencias identificadas de los LTTRs fueron utilizadas para la 
construcción de fusiones transcripcionales. 
 
Tabla 2.1: LTTRs predichos in silico en S. Typhi 
Locus Nombre del 
Gen 
Nombre de la 
proteína 
Descripción Aminoácidos Experimentalmente 
caracterizado 
STY0014 t0014 - Putativo LTTR 315 - 
STY0036 ltrR LtrR Regulador transcripcional de la vía 
ompR-ompF-ompC 
331 En este trabajo 
STY0048 nhaR NhaR Regulador transcripcional del gen 
nhaA, codificante de un antiportador 
NaF/HF 
299 E. coli (Rahav-Manor et al., 
1992) 
STY0134 leuO LeuO Regulador transcripcional del operón 
leuABCD 
314 S. Typhi, S. Typhimurium y 
E. coli (Hernández-Lucas et 
al., 2008; Fang et al., 2000; 
Klauck et al., 1997) 
STY0159 t0143 - Putativo LTTR 313 - 
STY0277 yafC - Putativo LTTR 304 - 
STY0341 sinR SinR Regulador transcripcional de 
respuesta a diferentes señales 
ambientales 
314 S. Typhimurium (Groisman 
et al., 1993) 
Antecedentes 
________________________________________________________________________________________ 
21 
STY0562 allS AllS Regulador transcripcional del regulón 
alantoína 
308 E. coli (Rintoul et al., 2002) 
STY0651 ybdO - Putativo LTTR 300 - 
STY0684 ybeF - Putativo LTTR 317 - 
STY0730 tcuR TucR Regulador transcripcional del operón 
tcuABC 
308 S. Typhimurium (Lewis et al., 
2009) 
STY0950 acT - Putativo LTTR 303 - 
STY1337 cysB CysB Regulador transcripcional de genes 
para la biosíntesis de cisteína 
324 S. Typhimurium y E. coli 
(Hryniewicz y Kredich, 1994; 
Lochowska et al., 2001) 
STY1386 t1581 - Putativo LTTR 301 - 
STY1537 t1444 - Putativo LTTR 290 - 
STY1578 t1408 - Putativo LTTR 299 - 
STY1693 ydhB - Putativo LTTR 310 - 
STY2278 t0805 - Putativo LTTR 304 - 
STY2410 t0675 - Putativo LTTR 302 - 
STY2436 yeiE - Putativo LTTR 287 - 
STY2510 t0583 - Putativo LTTR 292 - 
STY2560 lrhA LrhA Regulador transcripcional del operón 
NADH deshidrogenasa 
312 E. coli (Lehnen et al., 2002) 
STY2655 xapR XapR Regulador transcripcional del operón 
Xantosina 
294 E. coli y S. Typhimurium 
(Jørgensen y Dandanell, 
1999; Hansen et al., 2006) 
STY2660 Desconocido - Putativo LTTR 308 - 
STY2821 t0282 - Putativo LTTR 303 - 
STY3037 t2813 - Putativo LTTR 310 - 
STY3122 gcvA GcvA Proteína reguladora para la vía de 
escisión de glicina 
305 E. coli (Wilson y Stauffer, 
1994) 
STY3158 lysR LysR Activador transcripcional de lysA 311 E. coli (Stragier y Patte, 
1983) 
STY3165 t2930 - Putativo LTTR 287 - 
STY3220 argP (iciA) ArgP (IciA) Regulador transcripcional de argO 297 E. coli (Thöny et al., 1991; 
Nandineni et al., 2004) 
Antecedentes 
________________________________________________________________________________________ 
22 
STY3293 t3046 - Putativo LTTR 227 - 
STY3415 t3155 - Putativo LTTR 298 - 
STY3428 tdcA TdcA Regulador transcripcional del operón 
tdcABCDEFG 
312 S. Typhimurium (Kim et al., 
2008) 
STY3547 t3282 - Putativo LTTR 309 - 
STY3595 metR MetR Regulador transcripcional del regulón 
met 
317 
 
S. Typhimurium y E. coli 
(Byerly et al., 1991; Lorenz y 
Stauffer, 1995) 
STY3649 ilvY IlvY Regulador transcripcional del gen 
ilvC 
295 S. Typhimurium y E. coli 
(Blazey y Burns, 1984; Rhee 
et al., 1998) 
STY3708 hdfR HdfR Activador transcripcional del operón 
fimbrial std 
278 S. Typhimurium y E. coli 
(Jakomin et al., 2008; Ko y 
Park, 2000) 
STY3749 oxyR OxyR Activador transcripcional del regulón 
inducible por peróxido de hidrogeno 
305 S. Typhimurium y E. coli 
(Christman et al., 1989) 
STY3935 yidZ YidZ Regulador transcripcional 
involucrado en la expresión de genes 
de respuesta a la resistencia 
anaeróbica a óxido nítrico 
319 E. coli (Justino et al., 2005) 
STY3944 t3685- Putativo LTTR 302 - 
STY3979 dsdC DsdC Activador deaminasa D-serina 307 E. coli (Nørregaard-Madsen 
et al., 1995) 
STY4058 t3782 - Putativo LTTR 300 - 
STY4196 yhjC - Putativo LTTR 300 - 
STY4468 t4176 - Putativo LTTR 295 - 
STY4867 t4561 - Putativo LTTR 302 - 
 LTTRs presentes en S. Typhi y la función descrita de algunos de ellos en S. Typhimurium y E. coli. En S. Typhi sólo se ha 
descrito LeuO. 
 
Debido a la importancia del regulador transcripcional LeuO, y con el fin de 
elucidar el funcionamiento de otros LTTRs de S. Typhi, se construyeron fusiones 
transcripcionales de las regiones reguladoras de 27 putativos LTTRs. Debido a 
que estos fueron identificados in silico se validaron experimentalmente, y para esto 
se realizó un tamizaje de su expresión en dos condiciones de crecimiento; medio 
rico (MA) (Kawaji et al., 1979) y medio mínimo (MM-N) (Deiwick et al., 1999). El 
MA simula condiciones óptimas de crecimiento en laboratorio y en el MM-N se 
Antecedentes 
________________________________________________________________________________________ 
23 
expresan genes de SPI-2. Estas condiciones posiblemente representan las 
señales ambientales encontradas por Salmonella Typhimurium en el interior del 
fagosoma infectado del hospedero (Deiwick et al., 1999), lo que detectaría la 
expresión de reguladores involucrados en la sobrevivencia de Salmonella Typhi en 
la célula eucariótica. 
Los ensayos de actividad en ambos medios, revelaron la expresión de 21 
LTTRs, principalmente en MM-N a diferencia con el MA donde hubo nula o baja 
expresión (Figura 2.1). Aunque el probable inductor del MM-N no ha sido 
identificado, el tener mayor expresión nos indica la posible existencia de señales 
de inducción para los LTTRs en este medio. Posterior a los ensayos de actividad 
se construyeron 10 mutantes, cada una en un regulador distinto, tomando en 
cuenta que cada uno de éstos tuvo diferente patrón de actividad. Posteriormente 
se llevaron a cabo estudios de proteómica en las 10 cepas y los resultados 
mostraron diferencia en 3 cepas (∆STY0036, ∆STY0651 y ∆STY3293) con 
respecto a la cepa silvestre de S. Typhi. 
A partir de los resultados obtenidos, nos enfocamos específicamente en el 
estudio del regulador STY0036, los análisis in silico realizados en nuestro grupo, 
indican que este regulador tiene un tamaño de 331 aminoácidos con un extremo 
amino terminal con dominio hélice-vuelta-hélice que va de los aminoácidos 12 a 71 
y un dominio carboxilo terminal en los residuos 150 a 291, atributo de los LTTRs. 
El análisis en las bases de datos ubica al regulador sólo en el género Salmonella, 
además se indica que STY0036 de S. Typhi tiene como ortólogo a STM0030 en S. 
Typhimurium. 
Se ha realizado un perfil transcripcional global, basado en microarreglos de S. 
Typhimurium después de la infección de macrófagos, donde STM0030 muestra un 
cambio significativo en su transcripción durante el crecimiento intracelular 
(Eriksson et al., 2003). También, un estudio basado en microarreglos y diseñado 
para identificar genes requeridos por S. Typhimurium para persistir y replicarse en 
el bazo e hígado en ratones, mostró que la bacteria utiliza un repertorio diverso de 
genes para establecer la infección y persistir en su hospedero, dentro de tal 
repertorio se localiza a STM0030 (Lawley et al., 2006). Así, los antecedentes 
Antecedentes 
________________________________________________________________________________________ 
24 
reportados de STM0030 y nuestros resultados experimentales previos del 
proyecto de investigación, de una mayor expresión de STY0036 en MM-N 
comparado con MA, nos sugieren la posibilidad de un papel de STY0036 
involucrado en el crecimiento intracelular. 
 
 
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
A
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ro
t
Perfil transcripcional de fusiones de los LTTRs en S. Typhi IMSS-1
Medio MM-N
Medio MA
 
Figura 2.1: Comparación del perfil de expresión transcripcional de los 27 LTTRs en MM-N y MA, de izquierda a derecha 
STY1537 a STY0684. En general en todas las fusiones se observa mayor actividad específica CAT en MM-N a diferencia 
de MA. 
 
Hipótesis y objetivos 
________________________________________________________________________________________ 
25 
3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 
 
3.1. Hipótesis 
Un análisis in silico predice que STY0036 es miembro de la familia LTTR. Su 
expresión mayor en un medio pobre en nutrientes (MM-N) que en uno rico sugiere 
una posible participación en el crecimiento intracelular, por lo tanto, su función 
podría ser importante para la invasión, sobrevivencia o replicación en macrófagos. 
 
3.2. Objetivo general 
Definir la función de la proteína STY0036 e identificar algunos posibles genes 
blanco del regulador y ver si éste afecta una vía o algún proceso biológico en 
Salmonella enterica serovar Typhi IMSS-1 (S. Typhi IMSS-1). 
 
3.3. Objetivos particulares 
1.- Analizar el perfil proteómico de la cepa silvestre (S. Typhi IMSS-1) y de 
una cepa mutante STY0036 (S. Typhi IMSS-1 ∆STY0036) en condición de 
MM-N. 
 
2.- Observar si hay proteínas cuya transcripción dependa de STY0036 e 
identificarlas. 
 
3.- Determinar el papel biológico de STY0036 en S. Typhi. 
 
4.- Realizar complementaciones genéticas en la cepa IMSS-1 ∆STY0036. 
 
 
 
 
 
 
 
Materiales y métodos 
________________________________________________________________________________________ 
26 
4. MATERIALES Y MÉTODOS 
 
4.1. Cepas, plásmidos y oligonucleótidos 
Las cepas y plásmidos empleados en el presente trabajo se enlistan en la tabla 
4.1 y 4.2 respectivamente. 
 
Tabla 4.1: Cepas bacterianas empleadas en este trabajo 
Cepa Descripción Referencia 
 
Salmonella enterica serovar Typhi 
 
 
IMSS-1 
 
 
Salmonella enterica serovar Typhi, cepa 
aislada de paciente mexicano. 
Puente et al., 1987 
IMSS-1 ∆STY0036 
 
IMSS-1 ∆STY0036 Este trabajo 
IMSS-1 ∆STY0036/pWSK29-STY0036 IMSS-1 ∆STY0036 con plásmido pWSK29-
STY0036; Amp
r 
 
Este trabajo 
IMSS-1 ∆STY0036/pWSK29 
 
IMSS-1 ∆STY0036 con plásmido pWSK29; 
Amp
r
 
 
Este trabajo 
IMSS-1 ∆ompR IMSS-1 ∆ompR Este trabajo 
 
IMSS1 ∆ompR/pFMTy-ompR IMSS-1 ∆ompR con plásmido pFMTy-
ompR; Cm
r 
 
Este trabajo 
IMSS1 ∆ompR/pQE60-ompR IMSS-1 ∆ompR con plásmido pQE60-
ompR; Ap
r 
 
Este trabajo 
IMSS-1 STYC171 IMSS-1 ∆ompC; Km
r 
 
Martínez-Flores et al., 1999 
IMSS-1 STYC171/pVF27 IMSS-1 STYC171 con plásmido pVF27 
(pBR322-ompC); Km
r 
Cm
r
 
 
Este trabajo 
IMSS-1 STYF302 IMSS-1 ∆ompF; Km
r 
 
Martínez-Flores et al., 1999 
IMSS-1 VALE39 IMSS-1 ∆ompC-∆ompF; Km
r 
Cm
r 
 
Secundino et al., 2006 
IMSS-1 VALE39/pVF27 IMSS-1 VALE39 con plásmido pVF27 
(pBR322-ompC); Km
r 
Cm
r 
 
Este trabajo 
IMSS-1 VALE39/pKKompF IMSS-1 ∆ompC-∆ompF, con plásmido 
pKKompF, Km
r 
Cm
r
 Ap
r 
 
Este trabajo 
Escherichia coli 
 
 
E. coli DH5α Escherichia coli Φ80d/lacZ∆M15 ∆(lacZYA-
argF) U169 recA1endA1 hsdR17 (rk-mk+) 
phoA supE44 λ-thi-1 gyrA96 relA1; Nal
r
 
Gibco BRL 
 
Materiales y métodos 
________________________________________________________________________________________ 
27 
Tabla 4.2: Plásmidos usados en este trabajo 
Plásmido Descripción Referencia 
 
pKK232-8 Derivado de pBR322 conteniendo el gen reportero 
cloranfenicol acetil transferasa (CAT) sin promotor; Ap
r
 
 
Pharmacia LKB Biotechnology 
pKK232-9 Derivado de pKK232-8; Km
r
 
 
Hernández-Lucas et al., 2008 
pKKompF pKK232-8 conteniendo región codificadora de1092 bp, con 
782 pb río arriba y 184 pb río abajo del ATG de ompF; Ap
r
 
 
Este trabajo 
pKK232-9 
STY0014-381+102 
 
pKK232-9 conteniendo 381 pb río arriba y 102 pb río abajo 
del ATG de STY0014; Kmr 
Este trabajo 
pKK232-9 
STY0036-471+90 
pKK232-9 conteniendo 471 pb río arriba y 90 pb río abajo del 
ATG de STY0036; Kmr 
 
Este trabajo 
pKK232-9 
STY0159-265+84 
pKK232-9 conteniendo 265 pb río arriba y 84 pb río abajo del 
ATG de STY0159; Km
r 
 
Este trabajo 
pKK232-9 
STY0277-346+129 
 
pKK232-9 conteniendo 346 pb río arriba y 129 pb río abajo 
del ATG de STY0277; Km
r
 
Este trabajo 
pKK232-9 
STY0341-332+178 
pKK232-9 conteniendo 332 pb río arriba y 178 pb río abajo 
del ATG de STY0341; Km
r 
 
Este trabajo 
pKK232-9 
STY0651-376+100 
pKK232-9 conteniendo 376 pb río arriba y 100 pb río abajo 
del ATG de STY0651; Km
r 
 
Este trabajo 
pKK232-9 
STY0684-443+190 
pKK232-9 conteniendo 443 pb río arriba y 190 pb río abajo 
del ATG de STY0684; Km
r 
 
Este trabajo 
pKK232-9 
STY0730-320+89 
pKK232-9 conteniendo 320 pb río arriba y 89 pb río abajo del 
ATG de STY0730; Km
r 
 
Este trabajo 
pKK232-9 
STY1386-557+169 
pKK232-9 conteniendo 557 pb río arriba y 169 pb río abajo 
del ATG de STY1386; Km
r 
 
Este trabajo 
pKK232-9 
STY1537-382+143 
pKK232-9 conteniendo 382 pb río arriba y 143 pb río abajo 
del ATG de STY1537; Km
r 
 
Este trabajo 
pKK232-9 
STY1578-363+97 
pKK232-9 conteniendo 363 pb río arriba y 97 pb río abajo del 
ATG de STY1578; Km
r 
 
Este trabajo 
pKK232-9 
STY1693-383+129 
pKK232-9 conteniendo 383 pb río arriba y 129 pb río abajo 
del ATG de STY1693; Km
r 
 
Este trabajo 
pKK232-9 
STY2278-453+117 
pKK232-9 conteniendo 453 pb río arriba y 117 pb río abajo 
del ATG de STY2278; Km
r 
 
Este trabajo 
pKK232-9 
STY2410-410+191 
pKK232-9 conteniendo 410 pb río arriba y 191 pb río abajo 
del ATG de STY2410; Km
r 
 
Este trabajo 
pKK232-9 
STY2510-374+94 
pKK232-9 conteniendo 374 pb río arriba y 94 pb río abajo del 
ATG de STY2510; Km
r 
 
Este trabajo 
pKK232-9 
STY2660-395+118 
pKK232-9 conteniendo 395 pb río arriba y 118 pb río abajo 
del ATG de STY2660; Km
r
 
Este trabajo 
Materiales y métodos 
________________________________________________________________________________________ 
28 
pKK232-9 
STY2821-371+93 
 
pKK232-9 conteniendo 371 pb río arriba y 93 pb río abajo del 
ATG de STY2821; Km
r
 
Este trabajo 
pKK232-9 
STY3037-279+160 
 
pKK232-9 conteniendo 279 pb río arriba y 160 pb río abajo 
del ATG de STY3037; Km
r
 
Este trabajo 
pKK232-9 
STY3158-403+192 
 
pKK232-9 conteniendo 403 pb río arriba y 192 pb río abajo 
del ATG de STY3158; Km
r
 
Este trabajo 
pKK232-9 
STY3165-476+117 
 
pKK232-9 conteniendo 476 pb río arriba y 117 pb río abajo 
del ATG de STY3165; Km
r
 
Este trabajo 
pKK232-9 
STY3293-615+179 
 
pKK232-9 conteniendo 615 pb río arriba y 179 pb río abajo 
del ATG de STY3293; Km
r
 
Este trabajo 
pKK232-9 
STY3415-345+99 
 
pKK232-9 conteniendo 345 pb río arriba y 99 pb río abajo del 
ATG de STY3415; Km
r
 
Este trabajo 
pKK232-9 
STY3547-393+185 
 
pKK232-9 conteniendo 393 pb río arriba y 185 pb río abajo 
del ATG de STY3547; Km
r
 
Este trabajo 
pKK232-9 
STY3944-320+114 
 
pKK232-9 conteniendo 320 pb río arriba y 114 pb río abajo 
del ATG de STY3944; Km
r
 
Este trabajo 
pKK232-9 
STY4058-484+113 
 
pKK232-9 conteniendo 484 pb río arriba y 113 pb río abajo 
del ATG de STY4058; Km
r
 
Este trabajo 
pKK232-9 
STY4196-700+115 
 
pKK232-9 conteniendo 700 pb río arriba y 115 pb río abajo 
del ATG de STY4196; Km
r
 
Este trabajo 
pKK232-9 
STY4468-365+103 
 
pKK232-9 conteniendo 365 pb río arriba y 103 pb río abajo 
del ATG de STY4468; Km
r
 
Este trabajo 
pKK232-9 
ompC-772+27 
 
pKK232-9 conteniendo 772 pb río arriba y 26 pb río abajo del 
ATG de ompC; Km
r
 
Hernández-Lucas et al., 2008 
pKK232-8 
ompF-782+184 
 
pKK232-8 conteniendo 782 pb río arriba y 184 pb río abajo 
del ATG de ompF; Ap
r
 
Este trabajo 
pKK232-8 
ompR-383+169 
 
pKK232-8 conteniendo 383 pb río arriba y 169 pb río abajo 
del ATG de ompR; Ap
r
 
Este trabajo 
pWSK29 
 
Derivado de pLG339 conteniendo un origen pSC101; Ap
r
 Wang y Kushner, 1991 
pWSK29-STY0036 
 
pWSK29, conteniendo 369 pb río arriba y 145 pb río abajo del 
ATG del gen estructural STY0036, abarcando el gen completo; 
Ap
r
 
 
Este trabajo 
pFMTy-ompR 
 
 
pACYC184 conteniendo la región codificadora de 720 pb y 
297 bp río arriba del gen ompR hasta el codón de termino; 
Cm
r
 
 
Este trabajo 
pQE60 
 
Derivado de pBR322, conteniendo un promotor inducible 
mediante IPTG; Ap
r
 
 
Quiagen 
pQE60-ompR pQE60 conteniendo 717 pb del gen ompR de E. coli sin el 
codón de termino; Ap
r
 
Oropeza y Calva, 2009 
Materiales y métodos 
________________________________________________________________________________________ 
29 
 
 
pVF27 
 
 
 
pBR322 conteniendo la región promotora y codificante de 
ompC; Km
r
 
 
 
 
Puente et al., 1987 
pKD4 Derivado de pANTSg; contiene el gen de resistencia a Km, 
flanqueado por FRT´s 
 
Datsenko y Wanner, 2000 
pKD46 Derivado de pINT-ts, contiene el sistema de recombinación 
del fago lRojo bajo el control de un promotor inducible por 
arabinosa; Amp
R
 
 
Datsenko y Wanner, 2000 
pCP20 Plásmido termosensible, expresa la recombinasa FLP; Amp
r
 
Cm
r
 
Cherepanov y Wackerangel, 
1995 
 
 
 
4.2. Medios de cultivo y condiciones de crecimiento 
Las cepas de S. Typhi y E. coli se crecieron a 37°C en medio LB (1% de triptona, 
0.5% de extracto de levadura y 1% de NaCl, a pH 7.5) suplementado con 
deoxicolato de sodio (Sigma-Aldrich) cuando se requirió. S. Typhi también se 
creció en MM-N (KCl 5mM, (NH4)2SO4 7.5 mM, K2SO4 0.5 mM, KH2PO4 1 mM, 
Tris-HCl (pH 7.5) 100 mM, MgCl2 200 μM, glicerol 0.5% (p/v) y 1% de 
casaminoácidos (Deiwick et al., 1999), y en MA (7 g de caldo nutritivo, 1 g de 
extracto de levadura, 2 ml de glicerol, 3.75 g de K2HPO4 y 1.3 g de KH2PO4 por 
litro) (Kawaji et al., 1979). Cuando se necesitó, los medios se suplementaron con 
los antibióticos mostrados en la tabla 4.3. 
 
Tabla 4.3: Antibióticos y dosis utilizadas en este trabajo 
Antibiótico Concentración µg/ml 
Ampicilina (Ap) 200 
Cloranfenicol (Cm) 34 
Kanamicina (Km) 30 
Estreptomicina (St) 100 
Tetraciclina (Tc) 12 
 
 
Materiales y métodos 
________________________________________________________________________________________ 
30 
4.3. Manipulación de DNA 
El DNA cromosómico de las cepas se aisló mediante un estuche comercial 
(Promega, Madison). El diseño de oligonucleótidos para amplificar las secuencias 
de DNA mediante PCR se realizó con el programa OLIGO 6 y se sintetizaron en la 
unidad de síntesis del Instituto de Biotecnología, UNAM (Tabla 4.4). Las 
reacciones de PCR se amplificaron en un termociclador GeneAmp PCR sistema 
9700 (Roche Applied Biosystems), las enzimas de restricción, ligasas, polimerasas 
y nucleótidos se obtuvieron de las compañías New England Biolabs y Gibco BRL. 
Los plásmidos y productos de PCR se purificaron con los estuches “High pure 
plasmid isolation” y “Purification of PCR products” (Roche Applied Science, 
Germany) respectivamente y las secuencias se obtuvieron en un secuenciador 
automático (Perkin Elmer/Applied Biosystems 377-18). 
 
Tabla 4.4: Oligonucleótidos usados en este trabajo 
Oligonucleótido Secuencia 5´→ 3´ 
 
STY0036 H1P1-F CCA GCC AGG ATA ACC TAT ATG CGG CCA ATA AAA AAT GCT 
AAA TGT AGG CTG GAG CTG CTT CG 
 
STY0036 H2P2-R AAT TTG ATA TTA AAC AGA TCA ATC GCA TAA GGA TGT GCT 
TCC CAT ATG AAT ATC CTC CTT AG 
 
STY0036-F CCG CAA AGA AAT AAG AGA ATC 
STY0036-R AGA AGT CAA TTT ATC AGC GAC 
STY0014/-381-359 BamHI-F CGG GAT CCG GAA AGT TTT GGC GGC CCG ACG 
STY0014/+102+81 KpnI-R GGG GTA CCT AAC TTT TTT GCC GCC ATA GCC 
STY0036/-471-450 BamHI-F CGG GAT CCA CGC ATT AGC GTC ACC TTT AGC 
STY0036/+90+68 KpnI-R GGG GTA CCA GCC CTG GTT GCA TTT CCT TCA G 
STY0159/-265-241 BamHI-F CGG GAT CCG GTA TAA GGG CCA TAC ATA TCT GC 
STY0159/+84+59 KpnI-R GGG GTA CCG TGA AGC TAT GGT TTT CAG CAA TC 
STY0277/-346-322 BamHI-F CGG GAT CCC GCC GTA AAC AAG ACC ATC AGC 
STY0277/+129+106 KpnI-R GGG GTA CCA TCT CCA GCT TTT TAA CTG CCCSTY0341/-332-308 BamHI-F CGG GAT CCG ATA CAA TTA ATG CGC TCC AGA C 
STY0341/+178+154 KpnI-R GGG GTA CCG ATG TGA ATC GCG CCG AAG TAA AG 
STY0651/-376-357 BamHI-F CGG GAT CCA ACA GGT TGT TGG TTT AC 
Materiales y métodos 
________________________________________________________________________________________ 
31 
STY0651/+100+76 KpnI-R GGG GTA CCG TGT TTC CGC TGC TTT GCT AAT GC 
STY0684/-443-441 BamHI-F CGG GAT CCT CTC CTT TTC TAC GCA TCA ACC 
STY0684/+190+168 KpnI-R GGG GTA CCT GGA CTG GCT GAT GGC TGA CGG 
STY0730/-320-296 BamHI-F CGG GAT CCG CAA CAG CAT CAT CAC GAC CAT C 
STY0730/+89+64 KpnI-R GGG GTA CCG AAA CGC CAA TAT CAA GAT CCT GTG 
STY1386/-557-534 BamHI-F CGG GAT CCG TCA TAC TGT TCG TCC CAC ACC 
STY1386/+169+146 MluI-R CGA CGC GTA AGT TTG CGG GTT GTA CGT TGC 
STY1537/-382-359 BamHI-F CGG GAT CCG GAT TTC GTC ACT TCC GCA CGC 
STY1537/+143+121 KpnI-R GGG GTA CCA ACA GAG AGA CGC CCA GTT CGG 
STY1578/-363-340 BamHI-F CGG GAT CCG GTA GAA ATA GAA AGT GAA ACG 
STY1578/+97+75 KpnI-R GGG GTA CCG CGG CTG CGA GAT ATT GAG GCG 
STY1693/-383-360 BamHI-F CGG GAT CCC CAC AGC ATC CCC AGA CTT CCG 
STY1693/+129+107 KpnI-R GGG GTA CCC CAC TCC TCT AAC TGA CGA ACG 
STY2278/-453-431 BamHI-F CGG GAT CCA AGG AAC TGG AAG ATT GGC TGC 
STY2278/+117+95 KpnI-R GGG GTA CCA TGA ACG GTA TAA CTG AGG GCG 
STY2410/-410-388 BamHI-F CGG GAT CCC GCC ACG CAA AGC TCA ATG ACC 
STY2410/+191+169 KpnI-R GGG GTA CCG GCC GTA GTC CTT TAC TGT GGC 
STY2510/-374-352 BamHI-F CGG GAT CCA TAT TTT CCC ACC CAC TGC CCG 
STY2510/+94+71 KpnI-R GGG GTA CCG GCG GAT TGC GTC ATG TAT AGC 
STY2660/-395-373 BamHI-F CGG GAT CCA AAG CCG CTG TAG AGC ATA GGG 
STY2660/+118+96 KpnI-R GGG GTA CCC TTT TAC GCT ATG ACT GAC CGC 
STY2821/-371-349 BglII-F GAA GAT CTC TAA AGA AAA CAG GAT ACC GGC 
STY2821/+93+71 KpnI-R GGG GTA CCT GAT GGC TGA GTG ATA AAT AGG 
STY3037/-279-257 BamHI-F CGG GAT CCG AAA GAA ACG CGC TAA ACG GAA CG 
STY3037/+160+137 KpnI-R GGG GTA CCT TAC GCC AAG CTC TTT TTC AAG C 
STY3158/-403-381 BamHI-F CGG GAT CCA TCA GGG CAC GTT TGC GGA TC 
STY3158/+192+170 KpnI-R GGG GTA CCC TTG CAC CGT CGG ATG TAA G 
STY3165/-476-454 BamHI-F CGG GAT CCG CAA AAA GAA CAG GAA GAA ACC 
STY3165/+117+94 KpnI-R GGG GTA CCG CAA TGG CGG TAC TAA TGG TGG 
STY3293/-615-591 BamHI-F CGG GAT CCA GGG TTA GTT TTG TGG TGG TCT TG 
Materiales y métodos 
________________________________________________________________________________________ 
32 
STY3293/+179+155 KpnI-R GGG GTA CCT GCT CCA GAT ATT GTT GGT GTG TG 
STY3415/-345-322 BamHI-F CGG GAT CCT GCC GTC GCT GTC GCG GTA TTC C 
STY3415/+99+75 KpnI-R GGG GTA CCG CCC CAA CTC ATC AGC CGC TGC 
STY3547/-393-371 BamHI-F CGG GAT CCC TTC AAC CTC AAA CGA ACA GGC 
STY3547/+185+163 KpnI-R GGG GTA CCC CAG CTT CGG TGA GCC CAA TGC 
STY3944/-320-298 BamHI-F CGG GAT CCA GTG GCG CTG CAT ATG GAA AC 
STY3944/+114+90 KpnI-R GGG GTA CCG ATT AAA CCG CTA ACA GCT CCC TG 
STY4058/-484-461 BamHI-F CGG GAT CCT GAT CCG CGT TTG GTT GAC TTG 
STY4058/+113+90 KpnI-R GGG GTA CCT CAC GCG AGA AGG CGA CAA AGC 
STY4196/-700-680 BamHI-F CGG GAT CCG AAT GTG CTG CTG CAA ACT G 
STY4196/+115+93 KpnI-R GGG GTA CCG TAT TTG CCG TGA GAC GCT GCC 
STY4468/-365-345 BamHI-F CGG GAT CCA CGA CGG CGG GAA CAA AG 
STY4468/+103+80 MluI-R CGA CGC GTC TTG CTA ATG GTG GGC TGG GTG 
ompC/-772-748 BamHI-F CGG GAT CCT AGA AGG GAG AAT CGG GTA GAG ACC 
ompC/+27+3 KpnI-R GGG GTA CCC AGG AGG GAC AGT ACT TTA ACT TTC
 
ompF/-782-761 BamHI-F CGG GAT CCG AAA TGG GGC TGA ATA AAG AGG 
ompF/+184+163 KpnI-R GGG GTA CCC AAT CTG GGC ATA AGT CTG GTC 
ompR/-383-362 BamHI-F CGG GAT CCT TTT TAT TAT ACT GAT AGT CGG 
ompR/+169+148 KpnI-R GGG GTA CCT TAA ATC CAG TAC CAT GAG ATG 
pQE60STY0036 NcoI-F CAT GCC ATG GGA CGG CCA ATA AAA AAT GCT AA 
pQE60STY0036 BamHI-R CGG GAT CCA TCG CAT AAG GAT GTG CTT C 
 
 
 
4.4. Construcción de fusiones transcripcionales al gen reportero cat 
Las fusiones transcripcionales STY0036-471+90, ompC-772+27, ompF-
782+184 y ompR-383+169 al gen cat, se construyeron amplificando mediante 
PCR las regiones intergénicas 5´ de los genes STY0036, ompC, ompF y ompR 
respectivamente. Se usaron los oligonucleótidos correspondientes (Tabla 4.4) y 
DNA genómico de S. Typhi IMSS-1 como templado. Los productos de PCR se 
purificaron y posteriormente digerieron con las enzimas de restricción BamHI y 
Materiales y métodos 
________________________________________________________________________________________ 
33 
KpnI, sitios de corte contenidos en los oligonucleótidos. Estas regiones 
reguladoras amplificadas se clonaron en el plásmido pKK232-8 con resistencia a 
ampicilina (Pharmacia LKB Biotechnology, Figura 4.1) o pKK232-9 que tiene el 
gen de ampicilina interrumpido con el de resistencia a kanamicina haciéndolo 
selectivo para este antibiótico (Hernández-Lucas et al., 2008), ambos vectores 
contienen el gen reportero cat sin promotor. 
 
 
Figura 4.1: Mapa de restricción del vector pKK232-8, contiene un gen de cloranfenicol acetil transferasa (cat), se localiza un 
término de transcripción (Ter) río arriba del gen cat y dos términos de transcripción río abajo del gen (Ter y rnnB). El origen 
de replicación (ColE1) es derivado del plásmido pBR322, para su selección se utiliza el gen de resistencia a ampicilina 
(amp). 
 
 
Las fusiones construidas se transformaron en E. coli DH5α mediante choque 
térmico, las clonas se seleccionaron con Ap o Km según el caso, se les purificó el 
plásmido y se secuenciaron en la Unidad de Secuenciación del Instituto de 
Biotecnología UNAM para corroborar la secuencia correcta de los nucleótidos, una 
vez confirmadas las fusiones se electroporaron a S. Typhi IMSS-1 y S. Typhi 
IMSS-1 ∆STY0036, posteriormente se determinó su expresión mediante ensayos 
de actividad transcripcional. 
 
Materiales y métodos 
________________________________________________________________________________________ 
34 
4.5. Ensayos de expresión de las fusiones transcripcionales al gen 
reportero cat 
Los ensayos de actividad transcripcional se realizaron tomando 3 ml de cultivo 
con cepas de S. Typhi crecidas en LB durante 14 horas usando el antibiótico 
correspondiente, se centrifugaron, se lavaron y resuspendieron para inocular 
matraces con 50 ml de MM-N. En la condición de MA se usaron 100 ml de medio 
complementado con Ap o Km y se tomaron 500 µl de precultivo para inocular. Los 
matraces se incubaron a 37°C a 200 rpm y se colectó 1.5 ml de cada muestra 
cuando llegó a una densidad óptica de 0.6 a 595 nm (DO595). Las muestras se 
centrifugaron 2 minutos a 12000 rpm, se desechó el sobrenadante y se lavaron 
con 800 µl de TDTT (Tris-HCl 50 mM pH 7.8 y DL-Ditiotreitol 30 µM). Las pastillas 
se resuspendieron en 600 µl de TDTT, se colocaron 3 minutos en un sonicador 
Vibra Cell (Sonics and Materials, Inc.) con pulsos de 9.9 segundos y reposo de 9.9 
segundos. Posteriormente se centrifugaron 15 minutos a 12000 rpm y el 
sobrenadante se transfirió a tubos eppendorf. 
Las proteínas totales se cuantificaron colocando 10 µl de cada extracto por 
duplicado en placas de 96 pozos (costar), agregando 200 µl de una mezcla de 
reacción del estuche BCA Protein Assay Reagent (Pierce). Las placas se 
incubaron durante 30 minutos a 37°C y se determinó la concentración de proteínas 
a una absorbancia de 562 nm en un lector Ceres 900-C (Bio-Tek Instruments Inc.). 
La actividad enzimática CAT se determinó colocando por duplicado 5 µl de 
cada extracto en placas de 96 pozos, agregando 200 µl de una reacción 
conteniendo DTNB 1mM [ácido 5,5´ditio-bis (2-ácido nitrobenzoico)], acetil-
coenzima A 0.1 mM y cloranfenicol 0.1 mM en Tris-HCl, pH 7.8 0.1 M. 
Posteriormente se determinó la actividad CAT a una absorbancia de 412 nm en el 
lector tipo Ceres a intervalos de 5 segundos durante 5 minutos. La actividad 
específica CAT (µmol/min/mg) se obtuvo al dividir las unidades CAT entre la 
concentración de proteínas totales de cada muestra. 
 
 
Materialesy métodos 
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35 
4.6. Construcción de cepas mutantes 
La mutagénesis se realizó empleando la técnica descrita por Datsenko y 
Wanner (Datsenko y Wanner, 2000), la cual consiste en remplazar las secuencias 
de interés, en este caso los genes STY0036 y ompR por un cassette de 
resistencia a kanamicina generado por PCR utilizando oligonucleótidos con 
secuencias homólogas adyacentes al gen a remover y usando como templado el 
plásmido pKD4. Para la recombinación es necesaria la recombinasa del fago l 
Red, sintetizada bajo el control de un promotor inducible por arabinosa, para esto 
se utilizó el plásmido pKD46. El gen de resistencia a kanamicina insertado en las 
cepas mutantes se eliminó con el plásmido pCP20 el cual expresa la recombinasa 
FLP, esta reconoce secuencias directas repetidas FRT (FLP Recognition Targets) 
que flanquean el gen de resistencia, así la recombinación entre estos sitios elimina 
el casette de kanamicina. Las cepas mutantes se verificaron mediante PCRs y 
secuenciación. 
Las mutantes de S. Typhi IMSS-1: STYC171 (∆ompC), STYF302 (∆ompF) y 
VALE39 (∆ompC-∆ompF) utilizadas en el presente trabajo, habían sido 
previamente construidas y reportadas (Martínez-Flores et al., 1999; Secundino et 
al., 2006). 
 
4.7. Complementaciones 
Para complementar las cepas ∆STY0036 y ∆ompR, las regiones reguladoras y 
codificadoras de ambos genes se amplificaron por PCR, los productos se clonaron 
en los plásmidos pWSK29 y pACY184 obteniendo las construcciones pWSK29-
STY0036 y pFMTy-ompR, posteriormente se transfirieron a las mutantes para 
obtener las cepas complementadas IMSS-1: ∆STY0036/pWSK29-STY0036 y 
∆ompR/pFMTy-ompR. También se utilizó la cepa IMSS-1 ∆ompR/pQE60-ompR, la 
cual está complementada con la región codificadora ompR de E. coli bajo un 
promotor inducible por IPTG (pQE60) (Oropeza y Calva, 2009), la razón de usar 
esta construcción es debido a una identidad muy alta entre ompR de E. coli y S. 
Typhi. Las cepas ∆ompC y ∆ompC-∆ompF se complementaron con el plásmido 
pBR322 conteniendo el gen ompC (pVF27) (Puente et al., 1987). Todas las 
Materiales y métodos 
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36 
construcciones obtenidas se transformaron a las cepas de S. Typhi IMSS-1 
mediante electroporación. 
 
4.8. Análisis proteómico 
 
4.8.1. Extracción total de proteínas 
Las cepas S. Typhi IMSS-1 y S. Typhi IMSS-1 ∆STY0036 se crecieron en 100 
ml de MM-N a una DO595 de 0.6, se centrifugaron los cultivos, las pastillas se 
lavaron con un amortiguador fosfato salino (PBS) 1X y se sonicaron 1 minuto a 24 
kHz en un sonicador Vibra Cell (Sonics and Materials, Inc.), con pulsos de 1 
minuto y reposo de 1 minuto durante 5 ciclos a temperatura de 4°C, utilizando un 
inhibidor de proteasas (Roche Diagnostics, Germany). Para reducir más la 
proteólisis el aislamiento de proteínas se llevó mediante extracción con fenol. Las 
proteínas desnaturalizadas y reducidas (Encarnación et al., 2005), se mezclaron 
con urea 7 M, tiourea 2 M, 4% de 3 -[(3-choloamidopropyl)-dimetilamonio]-1-
propanosulfonato (CHAPS) (Roche Diagnostics, Germany), tributyl fosfina 2 mM, 
2% anfolitos y ditiotreitol 60 mM. Posteriormente se realizó la electroforesis en 2 
dimensiones (2-DGE). 
 
4.8.2. Electroforesis en gel de 2 dimensiones (2-DGE) 
La preparación de muestras, el análisis de electroforesis en 2-DGE y el 
análisis de imágenes, se realizaron como se ha reportado previamente 
(Encarnación et al., 2003). La separación de proteínas en un gradiente de pH se 
realizó mediante electroforesis bidimensional en un gel de poliacrilamida con 
dodecil sulfato de sodio (Sigma, USA). Para identificar el punto isoeléctrico se 
cargaron 500 µg de proteínas totales. 
 
4.8.3. Identificación de proteínas mediante espectrometría de masas 
Las proteínas del gel de dos dimensiones presentes en la cepa silvestre y 
ausentes en los proteomas de las mutantes se identificaron mediante 
espectrofotometría de masas. Las proteínas teñidas con azul coomassie se 
Materiales y métodos 
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37 
cortaron del gel y se mantuvieron a -70°C hasta usarse. Para el análisis de 
espectrometría de masas, las muestras se prepararon utilizando una pequeña 
modificación (Encarnación et al., 2003; Encarnación et al., 2005 y Shevchenko et 
al., 1996). Las proteínas obtenidas del gel se destiñeron, redujeron, alquilaron y 
digirieron con tripsina (Promega, Madison). Los péptidos obtenidos de la digestión 
se desalaron con la punta de una cremallera C18 (Millipore, Bedford, MA), 
posteriormente se obtuvo la espectrometría de masas. 
La espectrometría de masas se determinó con un espectrómetro (Bruker 
Daltonics, Billerica, MA) en modo de reflectrón y extracción retardada. El 
espectrómetro se calibró usando un estándar de calibración (Bruker Daltonics 
206095). Las mezclas de los péptidos se analizaron usando una solución saturada 
de ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico en 50% de ácido trifluoroacético-acetonitrilo 
0,1%. 
 
4.8.4. Búsqueda en la base de datos 
Las proteínas digeridas y procesadas generaron péptidos y sus masas, 
posteriormente se realizó su identificación en la base de datos NCBI, utilizando el 
programa de búsqueda Mascot (Matrix Science, Ltd., Londres, Reino Unido; 
http://www.matrixscience.com). 
 
4.9. Purificación y electroforesis de proteínas de membrana externa 
Las proteínas de membrana externa se aislaron de las cepas de S. Typhi 
IMSS-1 crecidas en MM-N y LB suplementado con 5% de deoxicolato de sodio a 
una DO595 de 0.6 como se describe a continuación: 
Como preinóculo se creció cada cepa en 5 ml de LB en tubos de ensaye con el 
respectivo antibiótico durante 14 horas, se tomaron 3 ml, se centrifugaron y 
lavaron para inocular matraces de 250 ml conteniendo 50 ml de MM-N, la 
densidad óptica inicial para cada matraz en promedio fue de 0.010. Para LB con 
5% de deoxicolato de sodio se tomaron 250 μl de preinóculo y se inocularon 
matraces con 25 ml de medio, con una DO595 de 0.010 al inicio del cultivo. 
Posteriormente, de cada matraz se tomaron 15 ml de cultivo a una DO595 de 0.6 y 
Materiales y métodos 
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se centrifugaron a 7000 rpm durante 8 minutos a 4°C, las pastillas se 
resuspendieron en 1 ml de amortiguador Na2HPO4, pH 7.2 10 mM y se centrifugó 
2 minutos a 12000 rpm a temperatura ambiente, se eliminó el sobrenadante y la 
pastilla, conteniendo las proteínas de interés, se resuspendió en 500 μl de 
Na2HPO4, pH 7.2 10 mM, se vortexeó y las muestras se sonicaron en tubos 
eppendorf hasta quedar totalmente claras, en seguida se centrifugaron 2 minutos 
a 12000 rpm a temperatura ambiente, después el sobrenadante se transfirió a 
tubos nuevos y se centrifugó 1 hora a 12000 rpm a 4°C. Las proteínas de 
membrana externa, se solubilizaron resuspendiéndose en 500 µl de amortiguador 
Na2HPO4 pH 7.2 10 mM, conteniendo 2% de tritón X-100 durante 30 minutos a 
37°C. Posteriormente se centrifugó 1 hora a 12000 rpm a 4°C, se desechó el 
sobrenadante y la pastilla conteniendo las proteínas de membrana se lavó con 500 
µl de Na2HPO4 pH 7.2 10 mM, después se centrifugó 1 hora a 12000 rpm a 4°C, 
se desechó el sobrenadante y finalmente se resuspendieron las muestras en 50 µl 
de PBS 1X pH 7.4. 
Las proteínas de membrana externa se cuantificaron con el estuche BCA 
Protein Assay Reagent, se tomaron 15 µg de cada muestra para ser analizadas 
por electroforesis en un gel de poliacrilamida (12% SDS-PAGE) y se separaron a 
un voltaje de 10 mA durante 23 horas. Las proteínas de membrana externa se 
visualizaron mediante tinción con azul de coomassie. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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