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UNIVERSIDA NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN “Análisis molecular en el exón 28 del gen VWF en pacientes mexicanos con posible Enfermedad de von Willebrand” TESIS Que para obtener el título de: Químico Farmacéutico Biólogo Presenta: Carlos Evet Sánchez Castillo Asesora: Dra. Rosenda Isabel Peñaloza Espinosa Cuautitlán Izcalli, Estado de México 2010 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. I II DEDICATORIAS A mi abuelita Elvia Pérez Rendón eres la piedra angular sobre la cual descansan estos logros. Más de la mitad de mi vida he vivido bajo tu techo y jamás he sentido más que cariño, orgullo y alegría de tu parte, porque he visto como te has limitado en darte varios gustos para que mi formación profesional sea completada, no hay palabras que pueda expresarte todo mi agradecimiento. A mi Mamá Julia por tu apoyo no solo económico, sino moral, ético y profesional que me brindaron las charlas que mantuve contigo. En ti veo un camino profesional el cual quiero igualar y superar como muestra de mi agradecimiento. A las dos mi admiración por sacar adelante a sus hijos y seguir velando por ellos y por sus nietos, a ustedes dedico esta frase la cual refleja lo que de ustedes he aprendido. "Porque mejor es la sabiduría que las piedras preciosas, y todo cuanto se puede desear, no es de compararse con ella. (Proverbios 8: 11) III AGRADECIMIENTOS A mi Papa Ricardo gracias por tu cariño y todos tus cuidados a lo largo de esta trayectoria, gran parte de mi calidad humana la aprendí de ti, siempre te veré como un gran hombre por el cual siento mucho cariño y admiración. A mi madre Maribel Castillo. Eres una mujer como pocas, has tomado decisiones buenas y malas pero jamás te has arrepentido de ellas, de ti he aprendido a nunca rendirme a ser un triunfador y a que no sólo debo de soñar sino a luchar por los sueños. Sé que este logro te enorgullece, pero yo estoy más orgulloso de que tú seas mi madre. A mis tías Elvia, Georgina y Leticia Flores, por el apoyo que cada una de ustedes a su muy particular estilo me han brindado, siempre les estaré agradecido y dispuesto a tenderles la mano y mi apoyo cuando ustedes la necesiten. A mis amigas de la carrera Roció, Susana, Miriam, Vanesa y Liztopigio por compartir mis alegrías, tristezas, y locuras siempre tendrán un lugar especial en mi corazón. A mis grandes amigos, Vicente y Ricardo que han compartido tanto conmigo desde el CCH, la filosofía que tengo de la vida la aprendí con ustedes, Hermanos la palabra AMIGO expresa su verdadero significado en ustedes y mi deseo es que así sea por siempre. A mi amiga Lidia, por ayudarme con tus consejos y sabiduría durante la pérdida de un familiar querido y el cual fue uno de los momentos más obscuros de mi vida. Aunque ya no nos frecuentemos tanto siempre tendrás un lugar especial en mi corazón. A Eva por ser mi mejor amiga, mi TIFERET, por ver más allá de las apariencias, te conocí desde los primeros días de la carrera pero fue a mitad de ella cuando realmente convivimos y nuestra amistad maduro hasta lo que es hoy y sin la cual esta relación no podría ser tan maravillosa. Gracias por creer en mí, por no dejar nunca que me derrumbara y ayudarme a concluir mis estudios, no lo hubiera logrado sin ti. Porque nuestro amor no nos limita sino que nos motiva a seguir adelante. A la familia Morales Almazán, a Sandra, Eva y Minerva por todo el apoyo que me han brindado, las tres me han enseñado valores que ya no se encuentran fácilmente, además de poseer un carácter el cual admiro mucho, siempre tengan presente que las quiero mucho. A la Señora EVA Almazán Aguilar por ser tan buena persona abriéndome las puertas de su casa, haciéndome saber que puedo contar con ella y por ofrecerme su apoyo, comprensión y cariño. A mi Padre Víctor Hugo Flores Por enseñarme a luchar para conseguir mi propio porvenir y no sólo esperar a que mis padres o abuelos me lo proporcionen. El Parkinson detuvo tu carrera IV y tus sueños así que yo seguiré siempre adelante en esa búsqueda por ambos. Te quiero mucho y siempre estaré orgulloso de ser tu hijo. A mi hermano Jorge, a pesar de ser menor que yo me has apoyado mucho, mis respetos por tu responsabilidad en algunas cosas, espero que este logro te motive a madurar y a concluir tus estudios. A mi hermana Linda gracias por tu cariño, cuentas con mi apoyo siempre y recuerda que no es lo mismo conocimiento que sabiduría. A mi hermano Cristian por todo tu apoyo y conocimientos brindados, por despertar en mí la pasión por la lectura y más que nada porque a pesar de las peleas propias de hermanos jamás hemos dejado de hablarnos y puedo asegurar que jamás pasará eso. Con mi mayor cariño te dedico estas palabras GOYA GOYA CACHUN CACHUN RA RA GOYA UNIVERSIDAD. Agradecimiento póstumo a tres personas muy importantes en mi vida: Al QFB Alejandro Rojas por introducirme a este bello mundo que es la carrera de QFB. A mi Abuelo Justino Flores me dejaste a una edad temprana de mi vida pero siempre serás un modelo de hombre a seguir, espero que donde estés te encuentres muy orgulloso. A mi tío Carlos Flores fuiste más que un tío, uno de mis mejores amigos, y un maestro en la vida, en la mayoría de mis recuerdos estás tú presente y mi personalidad refleja mucho de lo bueno que tú tenias. A mis profesores de la universidad: Mario Arturo Delgado, Sandra Díaz, Idalia Ávila, Rosalba Bonilla, Ana Laura Vázquez, Marco Antonio Vega, Maritere Domínguez, José Juan, Yolanda, gracias por los conocimientos que me transmitieron, ayudándome a madurar y forjar un criterio y carácter profesional. Al Químico Mario Flores gracias por compartir tu experiencia y sabiduría así como por hacer amena mi estancia durante el tiempo que realice esta tesis. A la Dra. Rosenda Peñaloza mi asesora de tesis gracias por todo su apoyo, confianza, enseñanza y sabiduría que me transmitió a lo largo de este tiempo, por alentarme a seguir estudiando y por ser un ejemplo de superación para todos los que estamos a su alrededor. A la UNAM por todas las oportunidades y conocimientos que me ha brindado a través de mi formación primero en el CCH-Naucalpan y posteriormente en mi amada FES-Cuautitlan. Porque la educación pública es algo que tenemos que aprovechar y ayudar a mejorar con nuestros éxitos. Aquel que tiene un porqué para vivir se puede enfrentar a todos los "cómos". (Friedrich Nietzsch) V Tesis realizada en: Unidad de Investigación Médica en Genética Humana del Hospital de Pediatría. Centro Médico Nacional Siglo XXI, IMSS. ESTE TRABAJO FUE FINANCIADO POR: El fondo de fomento a la Investigación IMSS, No. 2005-1-I-011 a RP. VI INDICE GENERAL I. INDICE DE TABLAS. II. INDICE DE FIGURAS. III. ABREVIATURAS. IV. RESUMEN. 1 V.GENERALIDADES. 2 5.1 Antecedentes de la enfermedad de von Willebrand (EVW). 2 5.2 Epidemiología. 3 5.3 Gen del factor de von Willebrand. 4 5.4 La proteína del factor de von Willebrand. 5 5.4.1 Biosíntesis del factor devon Willebrand. 7 5.4.2 Función del factor de von Willebrand. 8 5.5 Enfermedad de von Willebrand (EVW). 9 5.5.1 Clasificación de la enfermedad de von Willebrand. 9 5.5.2 Enfermedad de von Willebrand Tipo 1. 10 5.5.3 Enfermedad de von Willebrand Tipo 2A. 10 5.5.4 Enfermedad de von Willebrand Tipo 2B. 11 5.5.5 Enfermedad de von Willebrand Tipo 2M (Milwaukee). 12 5.5.6 Enfermedad de von Willebrand Tipo 2N (Normandia). 12 5.5.7 Enfermedad de von Willebrand Tipo 3. 13 5.5.8 Pseudoenfermedad de von Willebrand. 14 5.5.9 Enfermedad de von Willebrand adquirida. 14 5.6 Herencia de la enfermedad de von Willebrand. 14 5.7 Diagnostico la enfermedad de von Willebrand. 15 VII 5.8 Historial familiar en la enfermedad de von Willebrand. 16 5.9 Pruebas de laboratorio para la enfermedad de von Willebrand. 17 VI. OBJETIVOS. 18 6.1 General. 18 6.2 Particulares. 18 VII. HIPOTESIS. 19 VIII. PACIENTES Y MATERIALES. 20 8.1 Pacientes. 20 8.2 Material. 20 8.2.1 Biológico. 20 8.2.2 Equipos. 20 8.2.3 Reactivos. 21 8.2.3.1 Extracción de DNA. 21 8.2.3.2 Electroforesis. 21 8.2.3.3 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 21 8.2.3.4 Marcado DNA. 22 IX. METODOLOGIAS Y FUNDAMENTOS. 23 9.1 Extracción de DNA por concentración de sales. 23 9.1.1 Fundamento. 23 9.1.2 Metodología. 23 9.2 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 25 9.2.1 Fundamento. 25 9.2.2 Metodología. 26 9.2.3 Visualización de los resultados. 28 VIII 9.3 Electroforesis en gel de agarosa. 28 9.3.1 Fundamento. 28 9.3.2 Metodología. 31 9.3.3 Visualización de los resultados. 31 9.4 Purificación del producto de PCR. 33 9.4.1 Fundamento. 33 9.4.2 Metodología. 33 9.5 Secuenciación. 35 9.5.1 Marcaje con Big Dye. 36 9.5.1.1 Fundamento. 36 9.5.1.2 Metodología. 36 9.5.2 Purificación del marcado. 38 9.5.2.1 Fundamento. 38 9.5.2.2 Metodología. 39 9.5.3 Secuenciación Automatizada. 39 9.5.3.1 Fundamento. 39 9.5.3.2 Metodología. 40 9.5.4 Análisis de los datos obtenidos. 40 X. RESULTADOS Y ANALISIS DE LOS RESULTADOS. 41 10.1 Pacientes. 41 10.2 Amplificación de los 3 segmentos del exón 28 por PCR. 42 10.3 Purificación de los amplificados. 43 10.4 Secuencias. 44 IX XI. DISCUSIÓN. 50 XII. CONCLUSIONES. 54 XIII. GLOSARIO. 55 XIV. BIBLIOGRAFIA. 58 X I. INDICE DE TABLAS. Clasificación de la enfermedad de von Willebrand. 9 Datos de los Primers utilizados para el análisis del exón 28 (gen FVW). 22 Componentes de una PCR para 25 L. 27 Secuencia de primers empleados. 27 Condiciones del Termociclador para PCR 28 Concentraciones recomendadas de agarosa dependiendo del tamaño de DNA. 29 Marcaje del amplificado de PCR para 10 L. 37 Condiciones del Termociclador para el marcado. 37 Resultados de las pruebas realizadas en el laboratorio clínico del hospital de pediatría a los 10 pacientes estudiados. 41 Mutaciones encontradas en el exón 28 del gen FVW. 48 Polimorfismos encontrados en el exón 28 del gen FVW. 49 II. INDICE DE FIGURAS. Localización cromosómica del gen VWF entre otras enfermedades genéticas en el cromosoma 12. 4 Esquema del gen VWF. 4 Esquema del FVW. 6 Resumen de la biosíntesis y su ubicación al interior de la célula de síntesis (megacariocito o células endoteliales). 8 Árbol genealógico que muestra la herencia de la enfermedad de von Willebrand. 15 Patrones de herencia de la enfermedad de von Willebrand. 15 XI Pasos de la reacción en cadena de la polimerasa. 25 Separación del DNA por medio de electroforesis en gel. 30 Preparación del gel de agarosa para la electroforesis. 31 Modelo de transiluminador utilizado en La Unidad de Genética Humana del Hospital de Pediatría CMN Siglo XXI. 32 Electroforesis en gel de agarosa. 32 Ejemplo de purificación del producto de PCR. 33 Principio de la separación con Sephadex. 38 Ejemplo de electroferograma. 40 Ejemplo de una electroforesis en gel de agarosa al 1.2 % para PCR de las tres regiones del exón 28 (A, B, C) del gen VWF en diferentes pacientes. 43 Ejemplo de una electroforesis en gel de agarosa al 2 % de los purificados de las tres regiones del exón 28 (A, B, C) del gen VWF en diferentes pacientes. 44 Ejemplo de cambio de nucleótido en las posiciones 1034 y 1039 del gen VWF. 45 Ejemplo de cambio de nucleótido en la posición 1269 del gen VWF. 46 Ejemplo de cambio de nucleótido en la posición 1196 del gen VWF. 47 XII III. ABREVIATURAS. a.a Aminoácido BLAST Basic Local Alignment Search Tool BrEt Bromuro de etidio cDNA DNA complementario ddNTPs Dideoxinucleótidos trifosfatados DNA Ácido desoxirribonucleíco dNTPs Desoxinucleotidos trifosfatados EDTA Ácido etilendiamina tetraacético EVW Enfermedad de von Willebrand FVII Factor VIII de la coagulación FVW Factor de von Willebrand FVW: Ag Antígeno del Factor de von Willebrand FVW: RCo Actividad del cofactor de ristocetina Gp Glicoproteína INR Índice Nacional de Referencia ISTH Subcomité Científico de la Sociedad Internacional en Trombosis y Hemostasia Kb Kilo bases Nt Nucleótido Pb Pares de bases PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa RIPA Aglutinación de plaquetas inducida por ristocetina RNA Ácido ribonucleico RNAm RNA mensajero SDS Dodécil Sulafato de Sodio Taq DNA Polimerasa Thermus aquaticus TP Tiempo de protrombina TTPa Tiempo de tromboplastina parcial activada VWF Gen del Factor de von Willebrand 1 IV. RESUMEN. La enfermedad de von Willebrand (EVW) es debida a alteraciones cuali o cuantitativas en la proteína FVW y tiene una prevalencia del 1% en la población mundial. El factor de von Willebrand (FVW) es una glicoproteína multimérica que se sintetiza en megacariocitos y células endoteliales, juega un papel importante en la hemostasia al mediar la adhesión de plaquetas a los sitios de daño vascular, facilita la agregación plaquetaria y transporta al FVIII en el torrente sanguíneo protegiéndolo de la proteólisis prolongando su tiempo de vida. El diagnóstico de esta enfermedad es difícil y frecuentemente los casos leves pueden pasar desapercibidos. Las pruebas de laboratorio y el estudio familiar de hemorragias es fundamental para establecer un diagnóstico sin embargo estos estudios no proporcionan un diagnóstico exacto, por lo que en la actualidad se ha comenzado a recurrir al estudio molecular. El gen que codifica esta proteína es conocido como VWF se localiza en el cromosoma 12 (12p13.3), está compuesto de 178 Kilobases (Kb) de DNA y comprende 52 exones siendo el 28 el más grande de ellos con 1380 pb que codifican para 460 aminoácidos e implica a los dominios A1, A2 que son sitios de unión a glicoproteína (Gp) y A3 que es sitio de unión a colágena. El objetivo del presente trabajo fue realizar el análisis molecular del exón 28 del gen VWF siendo el que con mayor frecuencia presenta alteraciones, el estudio se llevo a cabo en 10 pacientes mexicanos con posible EVW canalizados por el Departamento de Hematología del Hospital de Pediatría. Centro Médico Nacional (CMN) Siglo XXI, IMMS.Los resultados obtenidos al finalizar el análisis molecular fueron: la identificación de siete mutaciones (tres reportadas y cuatro sin reportar) y diez polimorfismos (siete reportados y tres sin reporte previo), de estos polimorfismos cinco presentaron cambio de aminoácido. Con los datos obtenidos y gracias a la ayuda de la base de datos Internacional ISTH SSC VWF, Sheffield University se pudo dar un diagnóstico certero de Enfermedad de von Willebrand a 7 de los 10 pacientes, además de poder clasificarlos correctamente. En conclusión es importante realizar el análisis molecular para dar un mejor diagnóstico que repercuta en el tratamiento y en el asesoramiento genético. 2 V. GENERALIDADES. 5.1 Antecedentes de la enfermedad de von Willebrand (EVW). La enfermedad de Von Willebrand (EVW) fue descrita por primera vez en 1926 por el médico Finlandés Erik von Willebrand al publicar un manuscrito en el cual se describía un trastorno hemorrágico de carácter hereditario cuyas características indicaban que dicho trastorno era diferente a la hemofilia. Los primeros estudios que realizó el doctor von Willebrand fueron dentro de una familia que vivía en la isla de Föglö, en el archipiélago Äaland, del Mar Báltico. El propositus fue una niña (Hjördis) de cinco años que sufría sangrados recurrentes de labios, nariz y tobillos, a la edad de 13 años la niña murió durante la menarca, otros cuatro miembros de la familia habían muerto por sangrados no controlados a edad temprana (Lillicrap, 2008; Woods, 2008) En estos estudios iníciales, el doctor von Willebrand diferenció este caso de la hemofilia tras percatarse que las lesiones ocasionadas por esta enfermedad diferían de las producidas por la hemofilia por tratarse de hemorragias externas en la primera y hemorragias internas en el segundo caso. Al analizar el tiempo de sangría y la prueba de fragilidad capilar obtuvo valores anormales. A su vez los estudios de recuento de plaquetas y tiempo de coagulación dieron resultados dentro del rango normal, lo que no ocurre en los caso de hemofilia. Así mismo descubrió que este trastorno mostraba un modo de transmisión autosómico dominante y un predominio de las hemorragias mucocutaneas, por lo que concluyó que se trataba de cambios morfológicos que modificaban la función de las plaquetas y que estaba asociado a lesiones sistémicas de las paredes de los vasos sanguíneos, por lo cual la denomino “Pseudohemofilia hereditaria” (Woods, 2008. Ginsburg and Walter, 2009). En 1957 se informó que el defecto era corregido por un factor plasmático diferente al factor VIII denominándose factor de von Willebrand (FVW), sin embargo seguía la controversia en torno a si el FVW y FVIII eran una misma proteína (Quintana, 2000). En la década de 1960 se descubrió que el antibiótico Ristocetina, estimulaba la agregación plaquetaria en personas normales o hemofílicas pero no en personas que padecían EVW. Si 3 se agregaba plasma pobre en plaquetas de una persona normal o hemofílica a un paciente EVW con un plasma rico en plaquetas, el antibiótico funcionaba. Así se descubrió un nuevo test para detectar al FVW, que todavía no se conocía como tal (Woods, 2008). La controversia quedó aclarada en el año de 1971, cuando dos grupos de investigadores lograron un importante avance al demostrar por primera vez, mediante el uso de pruebas inmunológicas que el factor VIII (FVIII) y FVW eran proteínas distintas. En 1985 el FVW fue clonado y secuenciado por primera vez con lo cual se pudo estudiar la relación entre su estructura y su función, con estudios subsecuentes se ha mejorado la compresión de la base genética en la EVW (Lillicrap and James, 2009; Melo, 2007). 5.2 Epidemiologia. La EVW es el trastorno hemorrágico hereditario más común en los seres humanos, ya que presenta una distribución mundial y también es común en otras especies animales. Se ha encontrado que presenta una prevalencia de 1% en la población mundial (Cooney et al, 1991; Lillicrap, 2008; Quintana, 2000; Turgenton, 2006). Se considera que las formas clínicamente significativas de la enfermedad afectan de 1-3 personas por cada millón de la población. Cabe mencionar que en todos los estudios la prevalencia en mujeres es aproximadamente el doble que la documentada en varones, esto se debe probablemente al potencial único de menorragia en las mujeres (Paper, 2004). En México no hay un registro epidemiológico de la enfermedad, solo se han informado 60 casos en 24 familias con diagnostico de EVW (Ambriz, 1984). La incidencia real se desconoce dada su heterogeneidad genética y clínica, los patrones de laboratorio muestran variabilidad, lo que requiere de una infraestructura para su diagnóstico, por lo que la frecuencia de la enfermedad podría superar lo informado en la literatura. 4 5.3 Gen del factor de von Willebrand. El gen que codifica para el factor de von Willebrand se localiza en el brazo corto del cromosoma 12 en la banda 13, sub-banda 3 (12p13.3) como se muestra en las figuras 1 y 2. Es un gen compuesto de 178 Kilobases (Kb) de DNA y comprende 52 exones que originan un ARNm de 8923 pares de bases (pb) (Greer, 2004; Hashemi, 2007; Melo, 2007). Figura 1: Localización cromosómica del gen VWF entre otras enfermedades genéticas en el cromosoma 12. (Tomada de Passarge, 2007) Figura 2: Esquema del gen VWF. (Tomada de Goodeve, 2009.) El exón 28 es el exón más grande y comprende 1380 pb que codifican para 460 aminoácidos (a.a) e implica a los dominios A1 y A2 del factor, los cuales sirven para la unión a GpIb y para el dominio A3 el cual es el sitio de unión a la colagena (Cooney, 1991; Ginsburg, 2009). 5 Además de su gran tamaño y complejidad genómica, el análisis del gen VWF se complica todavía más por la presencia de una copia parcial pseudogénica que abarca de los exones 23 al 34 en el cromosoma 22 que posee una homología del 97 % respecto al del gen VWF (Lillicrap, 2008; Ruggeri, 1993). El gen VWF codifica para un péptido señal de 22 aminoácidos, un propéptido de 741 aa también conocido como antígeno II del FVW y para la proteína madura de 2050 a.a las dos primeras secuencias son codificadas por los 17 primeros exones, mientras que la proteína madura del FVW es codificada por 35 exones en la porción restante del gen . la proteína precursora de 2813 a.a alcanza un peso de 360 Kilodaltones (KDa) y la subunidad madura de 2050 a.a 270 KDa (Castaman, Federici, 2003). El gen VWF se expresa exclusivamente en dos tipos de células: endotelio vascular y megacariocitos. La transcripción del gen está regulada por una combinación de factores de transcripción ubicuos y específicos al tipo de célula, incluyendo las proteínas GATA,ETS y NFY. También hay varios elementos transcripcionales represivos en la secuencia ascendente del gen (Wang, 2004). 5.4 La proteína del factor de von Willebrand. El FVW es una glicoproteína compleja de alto peso molecular se encuentra en plasma en una concentración de 5-10 µg/mL, es sintetizada y almacenada en megacariocitos y células endoteliales (Perez-Requejo, 1995; González-Chon, 1996). La estructura del FVW está compuesta de un polipéptido de 270 KDa con una subunidad que comprende 2,050 de aminoácidos (a.a), cada subunidad contiene sitios de unión para la colagena y para las glicoproteínas (GpIb y GpIIb/IIIa), está constituido por una serie de segmentos homólogos (dominios), cada uno de los cuales está repetido de dos a cuatro veces. Hay tres repeticiones de A, tres de B, dos de C y cuatro de D. Las diversas funciones de enlace del FVW parecen estar localizadas en estos dominios, como se muestra en la figura 3 (Mancuso, 1989; Ruggeri and Ware, 1993). 6 Envasos sanguíneos intactos, el FVW no interactúa con los receptores de plaquetas, sino cuando el vaso se daña dejando al descubierto el subendotelio lo que permite la unión al FVW, esta interacción induce un cambio conformacional en la molécula de FVW que expone los sitios de unión para que la GpIb de las plaquetas se una al FVW llevándose a cabo el mecanismo de adhesión plaquetaria. El FVW se adhiere a la colagena fibrilar tipo I, III y VI de la pared vascular a otros componentes del subendotelio, por otro lado en superficies con alta actividad ante el estrés (“high shear stress”) se ha demostrado la activación del sitio de unión de la GpIIb/IIIa sobre la membrana plaquetaria, activándose la agregación plaquetaria por medio del FVW (Garcia-Conde, 2003; Quintana, 2006; Shinton, 2008). El factor de von Willebrand también presenta un papel importante como acarreador del factor FVII lo que le permite a éste una mayor estabilidad ya que dicha unión lo protege de la proteólisis prolongando su tiempo de vida. Figura 3: Esquema del FVW: En la figura se señala la organización de los dominios del FVW. Estos dominios son definidos y agrupados de acuerdo a su homología interna. Las barras negras indican la localización de los sitios de unión. Se muestra también la relación de los exones respecto a los dominios del FVW, así como el tamaño del péptido señal, el propéptido y la proteína madura. (Tomada de ISTH-SSCVWF Online Database). 7 5.4.1 Biosíntesis del factor de von Willebrand. En la traducción primaria del ARN se obtiene el pre-pro-FVW, un polipéptido de 2,813 a.a. La proteína recién sintetizada está formada por un péptido señal de veintidós aminoácidos, el propéptido de 741 a.a y la subunidad madura de 2050 a.a. La proteína se sintetiza en células endoteliales y megacariocitos almacenándose en los cuerpos de Weibel-Palade y gránulos alfa respectivamente como se muestra en la figura 4 (Altaf 2008; Jorieux, 1998; Woods, 2008). Existe un proceso postraducional que se inicia cuando el pre-pro-FVW se convierte en pro-FVW al eliminar el péptido señal y la glicosilación de sus cadenas en el retículo endoplásmico, seguido de su dimerización por enlaces disulfuro y la proteólisis de los dominios D1 y D2 (pre y pro péptidos) de la proteína precursora. La glicosilación tipo O y N y los carbohidratos específicos de la glicosilación tipo N son modificados por sulfatación en el aparato de Golgi. Finalmente ocurre la polimerización del factor en más de 50 unidades, quedando de un tamaño de 0.5 a 20 MDa. En la red trans de Golgi la enzima furina o PACE (endoproteasa dependiente de calcio asociada a membrana) escinde el propéptido, proceso importante para la unión al FVIII pero no para la multimerización (Casonato, 2003; Castaman, 2003; Ginsburg, 1992). Los dímeros del propéptido se eliminan antes de la secreción del FVW. Este propéptido originalmente fue conocido como "von Willebrand antígeno II". Hay dos vías de secreción: una constitutiva (relacionada con la síntesis) y una vía regulada que involucra la liberación del FVW mediada por secretagogos (activadores de la secreción). El FVW de megacariocitos y plaquetas proviene de la vía regulada. El FVW circulante en plasma es de origen endotelial “vía constitutiva” (Mendolicchio, 2004). En el plasma, la metaloproteasa ADAMTS-13 actúa sobre los multímeros del FVW en el dominio A2, este proceso crea las diferentes formas en las que se encuentra el factor que van desde su forma de dímero simple hasta las 20 unidades que forman el multimero más complejo (Bowen, 2004; James, 2004). 8 Figura 4: Resumen de la biosíntesis y su ubicación al interior de la célula de síntesis (megacariocito o células endoteliales). El FVW se almacena en los gránulos alfa en megacariocitos y en los cuerpos de Weibe-Palade en las células endoteliales. RE = retículo endoplásmico (Tomada de Lillicrap, 2008). 5.4.2 Función del factor de von Willebrand. El FVW tiene tres funciones fisiológicas principales: 1. Promueve la adhesión de las plaquetas a las estructuras subendoteliales en el sitio de injuria vascular. Aquí el FVW se une al colágeno expuesto a través del dominio A3, esto produce un cambio conformacional en el FVW que muestra el dominio A1, sitio de unión de la GpIb de las plaquetas (Resendiz, 2004). 2. Protege al FVIII de su inactivación y rápido catabolismo, por formación de un complejo no covalente con el mismo, a través de los dominios D’-D3, para estabilizarlo y protegerlo de la degradación proteolítica en la circulación lo que prolonga su vida media de unos minutos a 12 horas (Keeney, 2001; Turgeon, 2006). 3. Facilita la agregación plaquetaria mediante la interacción plaqueta-plaqueta uniéndose a la GpIb plaquetaria y de la GpIIb-IIIa. Dicho enlace no sólo depende de la presencia del FVW y de su calidad, sino también de otras proteínas adhesivas como fibronectina, laminina, trombospondina, y diferentes tipos de colágeno (Paz- Arredondo, 2004). 9 5.5 Enfermedad de von Willebrand (EVW). 5.5.1 Clasificación de la enfermedad de von Willebrand. La clasificación de la EVW se basa en su fisiopatología, diferenciando dos categorías: por deficiencia cuantitativa y por deficiencia cualitativa del FVW, y en un principio la enfermedad se clasificó en tres tipos diferentes: tipo I, tipo II, tipo III. El conocer la clonación molecular de su cDNA y la secuencia de a.a del FVW facilitó el descubrimiento de la diversidad de los defectos moleculares que son responsables para algunos tipos de EVW, sirviendo como base para una nueva clasificación de la enfermedad, establecida en el año de 1994 por la Sociedad Internacional de Hemostasia y Trombosis (como se muestra en la tabla 1 ), misma que fue ratificada en su última publicación de recomendaciones respecto a la clasificación de la EVW en el 2006 (Garcia- Conde, 2003; Kasper, 2005, Lillicrap, 2009; Morales de la Vega, 2008). Tabla 1: Clasificación de la enfermedad de von Willebrand. (Tomado de Quintana, 2000) 10 5.5.2 Enfermedad de von Willebrand Tipo 1. Se manifiesta de forma autosomica dominante, es conocida como EVW clásica presenta penetrancia y fenotipo variable, el patrón de multímeros FVW observados en una electroforesis es reducido por lo que describe al tipo 1 de EVW como una deficiencia cuantitativa parcial del FVW. Presenta una frecuencia del 80 % por lo que es la forma de EVW más común, sin embargo su causa genética aun no ha sido bien comprendida (Montgomery, 2006; Eikenboom, 2006; Rodeghiero, 2005). Se han informado de algunas deleciones y mutaciones de cambio de sentido por ejemplo; C1130F y C1149R, en el dominio D3, estas mutaciones producen un FVW defectuoso que inhibe su secreción siendo retenido en el retículo endoplásmico, permitiendo sólo la liberación de los homodímeros silvestres, también se han encontrado mutaciones en los exones 19, 26, 28, 37 y 52 (ISTH-SSCVWF Online Database; Melo 2007; Sadler, 2005). Existen otros factores que afectan la variedad y penetrancia incompleta de este tipo de EVW como el grupo sanguíneo, ya que en las personas con tipo sanguíneo O los niveles de FVW son más bajos en un 25- 35 % que en los demás grupos sanguíneos. Esto podría deberse a una susceptibilidad mayor del FVW a sufrir proteólisis por ADAMTS-13 (Bowen, 2004; Gill, 2009; Montgomery, 2006). Los pacientes manifiestan síntomas de hemorragias mucocutáneas cuya gravedad por lo general está correlacionada con su nivel de FVW, se evidencia por sangrado prolongado después de cortaduras, cirugías o traumatismos, en las mujeres puede ser detectado por una menstruación excesiva (Turgeon, 2006). 5.5.3 Enfermedad de von Willebrand Tipo 2A. Estepadecimiento se caracteriza por un defecto de tipo cualitativo del FVW con ausencia de multímeros de elevado e intermedio peso molecular, presenta una herencia de tipo autosomica dominante. Existe ya sea una incapacidad biosintética para producir estos 11 multímeros o bien son producidos, segregados y subsiguientemente degradados de manera prematura en el plasma. Se han informado 66 mutaciones de cambio de sentido responsables de este tipo de EVW y estas mutaciones se dividen en dos grupos. En el primero se encuentran mutaciones como V1607D, S1506L y G51505R por mencionar algunas, las cuales afectan el transporte intracelular, provocan defectos en el ensamblaje, en el almacenamiento o en la secreción de los multímeros de alto peso molecular. En el segundo grupo se encuentran mutaciones como R1597W y G1505E que provocan defectos en la proteólisis de multímeros de alto peso molecular, los cuales son necesarios para la unión del complejo de glicoproteínas GPIb-IX-V e incrementa los multímeros de bajo peso molecular (Castaman, 2003; Jenkins, 1998; Melo, 2007.) La mayoría de las mutaciones se han localizado en el exón 28 y tres en el exón 52 abarcando los dominios D2, D3, A1, A2 (ISTH-SSCVWF Online Database). 5.5.4 Enfermedad de von Willebrand Tipo 2B. Esta caracterizada por el aumento en la afinidad del FVW al receptor GpIb plaquetario causando interacciones espontáneas entre FVW y plaquetas en el torrente sanguíneo, presenta un modo de herencia autosómico dominante. En muestras de sangre, esta interacción puede observarse como acumulación de las plaquetas y esta misma anormalidad con frecuencia produce trombocitopenia (recuento plaquetario bajo) leve a moderada, hay un déficit de multímeros de FVW de alto peso molecular en el plasma porque éstos se han ligado a las plaquetas. Otra prueba importante para confirmar la presencia del tipo 2B de la enfermedad es el incremento en la prueba RIPA, usando plasma rico en plaquetas del paciente y concentraciones de ristocetina de <0.6 mg/mL (Lillicrap, 2008; Randi, 1991). Este desorden representa menos del 20% de las variantes del tipo 2, la mayoría de las mutaciones en la EVW tipo 2B se encuentran en el dominio A1 y se sabe que el 90 % son causadas por mutaciones en las posiciones 1306, 1308, 1316 y 1341(ISTH-SSCVWF Online Database; Cooney, 1991; Melo, 2007). 12 Un trastorno similar es causado por una mutación en el gen de la glicoproteína Ibα plaquetaria, lo que causa un incremento en la afinidad de adhesión al dominio A1 del FVW, como las manifestaciones clínicas son similares a la EVW tipo 2B es denominada pseudoenfermedad de von Willebrand. Por esta razón para diferenciar entre estas dos enfermedades se necesitan ya sea pruebas de aglutinación inducida por ristocetina de las plaquetas lavadas del paciente y mezcladas con plasma normal (que mostrará una mayor reactividad en el caso de la pseudoenfermedad de von Willebrand, pero no en el tipo 2B) o análisis de los genes del FVW y de la GpIbα (Lillicrap, 2008). 5.5.5 Enfermedad de von Willebrand Tipo 2M (Milwaukee). La variante 2M se debe a un defecto cualitativo en la función del FVW que no le permite interaccionar adecuadamente con las plaquetas, presenta un modo de herencia autosómico dominante. Se han informado 18 mutaciones de las cuales 17 son de cambio de sentido pero no hay alguna que sea particularmente común en esta variante. La mutación en el tipo Vicenza (R1205H), ha sido informada en familias europeas y está asociada a un cambio en el nucleótido 740. La mayoría de las mutaciones han sido localizadas en el dominio A1, en el asa formada por puentes disulfuro entre C1272-C1458 que evita la unión con GPIbIX. Estas mutaciones incluyen la deleción del segmento R1392-Q1402 y las mutaciones de cambio de sentido G1324S, F1369I e I1425F. Los exones afectados en este tipo de EVW son 18, 27 y 28 que afectan a los dominios A1, D y D3. (ISTH-SSCVWF Online Database; Mancuso, 1996; Melo, 2007). 5.5.6 Enfermedad de von Willebrand Tipo 2N (Normandia). La EVW tipo 2N es causada por mutaciones en el sitio de unión del FVIII, sin cambio en la distribución de los multímeros del FVW en el plasma. Esta última forma mutante cualitativa de la EVW es diferente de todas las anteriores en varios aspectos. Su patrón de herencia es autosómico recesivo y frecuentemente la única anormalidad de laboratorio es un nivel plasmático reducido de FVIII por lo que con frecuencia se le confunde con hemofilia A. La confirmación del tipo 2N de la EVW requiere ya sea de una demostración directa de la disminución del FVW en su capacidad de unión del FVIII o de la 13 documentación de un genotipo correspondiente a la EVW tipo 2N (Lillicrap, 2008; Morales de la Vega, 2008; Jorieux, 1998). Se han descrito 16 mutaciones de cambio de sentido en los exones 18, 19, 20, 21, y 24 que codifican para la región comprendida entre los exones D’ y D3, distintas sustituciones de un solo aminoácido en el FVW maduro en las posiciones que están localizadas en el dominio D’ y en el dominio D3, dan como resultado una baja capacidad de enlace para el FVIII provocando una disminución en grado variable del FVIII:C. Los pacientes muestran una reducción de la actividad del FVIII mientras que la concentración de FVW es normal (ISTH-SSCVWF Online Database; Hilbert, 2003; Melo, 2007; Morales de la Vega, 2008). 5.5.7 Enfermedad de von Willebrand Tipo 3. La EVW tipo 3 es un trastorno de tipo cuantitativo, es muy raro y se hereda de forma autosomica recesiva. Es la forma más severa de la EVW debido a la ausencia o niveles muy bajos de FVW y niveles disminuidos de FVIII. La prevalencia de la EVW tipo 3 se estima en 1 a 3 personas por millón sin embargo suele ser mayor en lugares donde los matrimonios consanguíneos son frecuentes. La mayoría de los padres de pacientes con enfermedad tipo 3 muestran pocos, si no es que nulos síntomas hemorrágicos. Los pacientes manifiestan graves hemorragias mucocutáneas recurrentes, así como frecuentes hemorragias musculo esqueléticas y en tejidos blandos como en los pacientes con hemofilia (Quintana 2000; Lillicrap, 2008). Las eliminaciones totales o parciales del gen han sido relacionadas con esta variante, aunque también han sido informadas mutaciones en casi todos los exones del gen FVW, así mismo se han informado mutaciones que llevan a un corrimiento del marco de lectura o mutaciones sin sentido (Quintana, 2006). Se ha observado que la mutación 2680 del C terminal o R2535X es más frecuente al norte de Europa debido a que la región codificante del FVW contiene 11 codones CGA (arginina) por lo que los nucleótidos CG se convierten en puntos calientes para sufrir cambios de C a T lo que produce un codón de paro UGA (Castaman, 2003; Montgomery, 2006) .Este tipo de mutaciones han sido informadas en los 14 exones 9, 28, 32 y 45 y una eliminación que abarca los exones 26-34 y 27 en mutaciones sin sentido (ISTH-SSCVWF Online Database). 5.5.8 Pseudoenfermedad de von Willebrand. También conocida como Enfermedad de von Willebrand plaquetaria. Se trata de un trastorno raro cuyo cuadro clínico se parece al de la enfermedad de von Willebrand por los niveles bajos o ausencia de las formas multiméricas grandes del FVW en el plasma. Los pacientes con la pseudoenfermedad de von Willebrand tienen una anormalidad plaquetaria en la que se produce agregación espontanea de las plaquetas. Los niveles bajos de multímeros grandes se deben al aumento en el consumo durante la agregación plaquetaria (Turgeon, 2006). 5.5.9 Enfermedad de von Willebrand adquirida. En ocasiones, la enfermedad de von Willebrand se presenta como un trastorno adquirido relacionado a enfermedades autoinmunes, en las cuales se implica la presencia de un anticuerpo circulante contra el FVW y enmieloproliferativos, linfoproliferativos y gammapatias monoclonales benignas. Otro mecanismo causante de las cantidades bajas de FVW es la absorción del componente de coagulación en las superficies celulares anormales. Por lo general las complicaciones hemorrágicas son más graves en la forma adquirida y se observan niveles mucho más bajos en la actividad del FVW (20% o menos) en estas personas (Genderen, 1998; Turgeon, 2006). 5.6 Herencia de la enfermedad de von Willebrand. La forma más frecuente de transmisión es autosómica dominante (Tipos 1, 2A, 2B y 2M), de alta penetrancia, pero de expresión muy variable inter e intra familiar. Aunque en algunos tipos (Tipos 2N y 3) la EVW se hereda como un rasgo autosómico recesivo (como se muestra en la figuras 5 y 6). Su patogenia está determinada por un defecto cuantitativo o cualitativo del factor von Willebrand (FVW). Debido a que el FVW es también 15 transportador del Factor VIII en plasma, la deficiencia del FVW conlleva a una alteración, tanto en la fase primaria como secundaria de la hemostasia (Paper, 2004). Figura 5: Árbol genealógico que muestra la herencia de la enfermedad de von Willebrand (Tomada de Paper, 2004). Figura 6: Patrones de herencia de la enfermedad de von Willebrand (Tomada de Lillicrap, 2009). 5.7 Diagnostico la enfermedad de von Willebrand. La EVW se debe sospechar en aquel paciente con historia de sangramiento mucocutáneo, postoperatorio y especialmente en aquellos con una historia familiar sugerente. Las principales manifestaciones clínicas son hemorragias mucocutáneas como epistaxis, gingivorragias, hemorragias del tubo digestivo, equimosis, hematomas y menorragia. La tendencia hemorrágica es altamente variable y depende del tipo y severidad de la enfermedad (Perez-Requejo 1995; Garcia-Conde, 2003; Woods, 2008). 16 Dado que la única manifestación de hemorragias excesivas en mujeres con EVW pudiera ser la menorragia, es particularmente importante que se realice una evaluación detallada del historial menstrual de la paciente. Una hemorragia prolongada y excesiva a menudo se documenta después de intervenciones quirúrgicas orales, tales como amigdalectomías y extracciones dentales. En contraste, las hemorragias en tejidos blandos, hematomas musculares y hemartrosis pocas veces se manifiestan en la EVW, con excepción del tipo 3 del padecimiento, en el que los niveles de FVIII son bajos. Debido a que muchos de los síntomas hemorrágicos de la EVW también ocurren con frecuencia en la población normal, la elaboración de un cuestionario formal sobre hemorragias podría resultar un medio eficaz y consistente para identificar pacientes que presentan un incremento en hemorragias, particularmente en el ámbito de la atención básica. El valor de una evaluación detallada como ésta en el ámbito de la atención especializada es menos evidente (Federeci, 2006; Haemophilia of Georgia, 2008; Lillicrap, 2008). 5.8 Historial familiar en la enfermedad de von Willebrand. La mayoría de los tipos de EVW son heredados como rasgos autosómicos dominantes, por lo que puede haber evidencia de un historial familiar de hemorragias excesivas. No obstante, este aspecto se complica considerablemente debido al hecho de que la mayoría de las formas de la enfermedad muestran penetración incompleta del fenotipo y expresividad variable de los síntomas hemorrágicos en el seno de las familias. En contraste, el tipo 3 de la enfermedad muestra un patrón hereditario recesivo con padres que por lo general no manifiestan síntomas clínicos. Por último, el tipo 2N de la EVW, en el que se presentan aisladamente bajos niveles de FVIII, también muestra un patrón hereditario recesivo y, por ende, también en este caso es posible que no exista un historial familiar (Budde, 2002; Lillicrap, 2009; Perez-Requejo, 1995). 17 5.9 Pruebas de laboratorio para la enfermedad de von Willebrand. En el laboratorio los componentes críticos del diagnóstico de la EVW incluyen la medición cuantitativa y cualitativa del FVW y del FVIII. Si el paciente tiene un historial crónico de pérdida de sangre, puede haber una deficiencia de hierro o anemia concomitante; el tipo 2B de la EVW frecuentemente está acompañado de una leve trombocitopenia crónica. El tiempo de sangrado no debe ser usado como prueba de detección habitual para la EVW, y la función exacta del analizador de la función plaquetaria, el PFA100®, para el diagnóstico de la EVW todavía no se ha aclarado. Además de estas pruebas de detección de laboratorio, las investigaciones más útiles para el diagnóstico son: una prueba inmunológica para la proteína del FVW, la prueba del antígeno del FVW (FVW:Ag), la prueba del cofactor de ristocetina (FVW:CoR), y una prueba para la función coagulante del FVIII (FVIII:C). Deberán establecerse los rangos normales locales para estas pruebas debido a la considerable variabilidad temporal de los valores del FVW y del FVIII, las pruebas deberán repetirse por lo menos dos veces antes de establecer el diagnóstico de EVW. Al evaluar estos estudios es necesario tomar en cuenta varios factores ambientales y adquiridos. El efecto de los estrógenos en la elevación de los niveles de FVW y FVIII debe tenerse en cuenta durante el embarazo y en el caso de pacientes que toman anticonceptivos orales (Budde, 2002; Lillicrap, 2009; Moore, 2001; Perez-Requejo, 1995; Turgeon, 2006; Rubio, 2004). 18 VI. OBJETIVOS. 6.1 General. Realizar el análisis molecular en el exón 28 del gen VWF a 10 pacientes con diagnóstico probable de Enfermedad de von Willebrand (EVW) del Hospital de Pediatría CMN siglo XXI del IMSS, con el fin de confirmar el padecimiento y precisar el tipo de EVW. 6.2 Particulares. Amplificar por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) el exón 28 del Factor de von Willebrand Purificar los productos de PCR Marcar los purificados de las muestras con Big-Dye Purificar el marcado de las muestras y secuenciar con el fin de detectar alteraciones en la secuencia de nucleótidos. Analizar los resultados de la secuenciación mediante el programa BLAST y la base de datos internacional (ISTH SSC VWF, Sheffield University). 19 VII. HIPOTESIS. Debido a que el exón 28 del gen VWF es el más grande y que en él se encuentra el 43.27 % de las mutaciones reportadas probablemente se encontrarán mutaciones informadas que precisen el tipo de EVW, así como nuevas mutaciones 20 VIII. PACIENTES Y MATERIALES. 8.1 Pacientes. Se tomó, previo consentimiento informado una muestra de sangre periférica a 10 pacientes (124, 128, 129, 146, 150, 160, 163, 175, 184, 187) mexicanos con posible Enfermedad de von Willebrand con un rango de edad de 1-18 años y de los cuales tres son de sexo masculino y siete de sexo femenino. Estos pacientes fueron canalizados por parte del Servicio de Hematología del Hospital de Pediatría del Centro Médico Nacional Siglo XXI a la Unidad de Investigación en Genética Humana del mismo Hospital. 8.2 Material. Tubos con EDTA Tubos eppendorf Puntas (1-20μl, 20-200 μL y 200-1000 μL Gradillas Micropipetas Kit purificación de PCR ( Kit QIAquick PCR) Kit purificación del marcado (Kit QIAquick Marcado) 8.2.1 Biológico. Las muestras biológicas requeridas para el estudio es DNA extraído de leucocitos de sangre periférica (3-5 mL), recolectada en tubos Vacutainers® con EDTA como anticoagulante. 8.2.2 Equipos. Campana luz UV. Termociclador “Mastercycler gradient Eppendorf” 21 Concentrador eppendorf Centrifuga eppendorf Cámarade electroforesis Biorad Transiluminador UV Biorad 8.2.3 Reactivos. 8.2.3.1 Extracción de DNA. Solución de lisis (TRIS-CIH 20 mM, MgCl2 mM) NaCl 5mM NaCl solución saturada SDS (Dodecilbenceno Sulfato de Sodio) 10% Etanol al 100 % Etanol al 70 % 8.2.3.2 Electroforesis. Agarosa Buffer TAE lX Bromuro de Etidio 0.5 µg/mL Colorante de carga 8.2.3.3 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Buffer 10X para PCR (Tris-HCl/NaCl) de invitro gen Cloruro de Magnesio 25mM de invitro gen dNTP´s 2mM de Biogeneica Taq polimerasa de Biogenica Oligonucleótidos sintéticos (Primers)* Agua esterilizada 22 *Tabla 2: Datos de los Primers utilizados para el análisis del exón 28 (gen FVW) REGIÓN ORIENTACIÓN SECUENCIA TAMAÑO AMPLIFICADO TEPERATURA DE FUSION °C (Tm) A Sentido (F) Antisentido (R) CTC AGA AGT GTC CAC AGG TT TGG AGA TTT GGA ACA GTG TG 543 (Pb) 56.4 B Sentido (F) Antisentido (R) AGC GAG GTC TTG AAA TAC AC TTG CTC CTG TTG AAG TCG 482 (Pb) 56.4 C Sentido (F) Antisentido (R) AGC CGA CTT GAA CAG GAG CA CCA GGT GCA GGG GAG AGG 525 (Pb) 60 8.2.3.4 Marcado DNA. Buffer 5X (BigDye Terminator v3.1 5X sequencing buffer) Big Dye terminator de Amplied Biosystem Primers Forward Agua esterilizada 23 IX. METODOLOGIAS Y FUNDAMENTOS. 9.1 Extracción de DNA por concentración de sales. 9.1.1 Fundamento. La extracción de DNA en una muestra celular se basa en las diferentes funciones de las soluciones hipo e hipertónicas sobre los leucocitos para permitir en primer lugar la lisis de la célula y en segundo la precipitación de las proteínas para dejar el DNA libre y que pueda ser precipitado con etanol. El primer paso en el proceso de extracción consiste en la lisis específica de los eritrocitos mediante una solución (TRIS-CIH 20 mM, MgCl2 mM) que deja intactos los leucocitos. Posteriormente los leucocitos se hidratan con una solución hipotónica (NaCl 5 mM), que facilita la lisis de las membranas por acción del SDS 10 % liberando el DNA del núcleo, una solución de NaCl saturada es utilizada para precipitar las proteínas, se utiliza etanol al 100 % para insolubilizar el DNA y etanol al 70% para limpiarlo de las sales presentes en el medio, por último el etanol al 70 % es evaporado y el DNA es resuspendido en agua inyectable estéril ( Montiel, 2007). El DNA aislado puede ser almacenado a una temperatura de 2 a 8 ºC de manera estable aunque, como consecuencia del paso del tiempo, las muestras podrían sufrir una degradación progresiva. Por ello, se recomienda su almacenamiento a –20ºC en aquellos casos en los que las muestras no vayan a ser utilizadas de forma frecuente, preferiblemente en alícuotas de uso individual (Aránega, 2002). NOTA: Es necesaria la utilización de material estéril y guantes durante todo el proceso para evitar la contaminación y degradación del DNA por las DNasas presentes en las superficies. 24 9.1.2 Metodología. 1. Centrifugar sangre total en EDTA a 5,000 rpm /15 minutos y separar los leucocitos, pasando estos a un tubo Eppendorf estéril de1.5 mL 2. Lavar con solución de lisis centrifugando a 2400 rpm /10 minutos si el tubo es grande y a 5000 rpm / 10 minutos si el tubo es eppendorf, repetir 2-3 veces. 3. Se elimina la mayor cantidad de sobrenadante posible dejando el pellet de leucocitos, agregar 180 µL de NaCl a 5 mmol y agitar en vortex, dejar reposar 10 minutos a Tº ambiente. 4. Agregar 90 µL de SDS al 10 %, agitar bien por 10 minutos 5. Agregar 690 µL de NaCl saturada, agitar manualmente por 10 minutos y centrifugar a 13000 rpm / 10 minutos esto con el fin de separar la solución que contiene el DNA de los restos celulares. 6. En caso de tener hemoglobina residual agregare solución de fenol y centrifugar a 10,000 rpm / 10 minutos. 7. Pasar el sobrenadante a dos tubos eppendorf (2 volúmenes). Es fundamental recuperar la mayor parte de sobrenadante posible, aunque un pequeño volumen debe quedar remanente junto con el pellet de proteínas con el fin de evitar la contaminación de la solución de DNA con estas proteínas que interferirían en su purificación. 8. Agregar 800 µL de etanol a los 2 volúmenes y centrifugar a 10,000 rpm / 5 minutos para recuperar el DNA en forma de un pequeño pellet blanco. Puesto que el pellet de DNA es extremadamente lábil, debe prestarse un especial cuidado a la hora de eliminar el sobrenadante lo cual puede realizarse por decantación o por aspiración con una micropipeta 9. Resuspender el botón en 700 µL de etanol al 70% (lavar DNA) y centrifugar 10,000 rpm / 10 minutos repetir 3 veces 10. Evaporar el etanol a 50 ºC / 10 minutos en estufa o leofilizador 11. Resuspender en 200 µL de agua estéril. 12. La muestra de DNA resuspendido puede almacenarse a 2–8ºC hasta su utilización, o bien congelar a –20ºC. 25 9.2 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 9.2.1 Fundamento. Se basa en la síntesis de millones de copias de un fragmento específico de DNA delimitado por el apareamiento de dos moléculas cebadoras o primers con la molécula de DNA. La síntesis y copia del fragmento de DNA sucede por la acción de una DNA polimerasa, que une ácidos nucleicos sintéticos a la hebra simple de la molécula de DNA resultante de la desnaturalización de la cadena doble original, formando una nueva cadena doble que posteriormente será sujeto de desnaturalización y plantilla de nuevas moléculas de DNA (Mas, 2007; Montiel, 2007; Luque, 2001). Como se muestra en la fig. 7 Figura 7: Pasos de la reacción en cadena de la polimerasa: En ella se observa que al terminar el primer ciclo las cadenas nuevas no tienen un tamaño especial, sin embargo este se irá afinando conforme los ciclos progresan (Tomada de obgynacademy.com). 26 Un problema muy importante que se puede plantear en una PCR es el de la contaminación. Debido a la capacidad de esta técnica de amplificar cantidades muy pequeñas de DNA, existe un elevado riesgo de contaminación con moléculas no deseadas que pueden ser amplificadas, llevando a errores en la interpretación de resultados: Para evitarlo es conveniente utilizar pipetas automáticas dedicadas exclusivamente a PCR, además de puntas esterilizadas. Se recomienda también que la PCR se realice en una habitación dedicada exclusivamente a este uso, a ser posible, en campana de flujo laminar (Aránega, 2002;). En la reacción en cadena de la polimerasa siempre nos vamos a encontrar una serie de componentes necesarios para que esta se lleve a cabo. 1. Enzima polimerasa 2. Buffer de la enzima 3. Cationes divalentes (Mg++) 4. Desoxynucleotidos trifosfatos (dNTPs) 5. Cebadores o Primers de sentido y antisentido que se unen a los extremos 3’ 6. DNA genómico o cDNA La mezcla de reacción es sometida cíclicamente a cambios de temperatura, que oscilan entre los 25 a 40 ciclos (Crocker, 2003; Walker, 1997). 9.2.2 Metodología. Normalmente la manera de proceder es preparando una mezcla de N + 1 (siendo N el número de muestras a amplificar) que contenga todos los componentes descritos menos el DNA. Por otro lado, en tubos eppendorf debidamente rotulados, pondremos la cantidad de DNA apropiadamente y añadiremos la cantidad de mezcla necesaria hasta completar el volumen de reacción el volumen de reacción (25 L). 27 Tabla 3: Componentes de una PCR para 25 L Tabla 4: Secuencia de primers empleados REGIÓN ORIENTACIÓN SECUENCIA A Sentido (FW) Antisentido (RV) CTC AGA AGT GTC CAC AGG TT TGG AGA TTT GGA ACA GTG TG B Sentido (FW) Antisentido (RV) AGC GAG GTC TTG AAA TAC AC TTG CTC CTGTTG AAG TCG C Sentido (FW) Antisentido (RV) AGC CGA CTT GAA CAG GAG CA CCA GGT GCA GGG GAG AGG Componentes µL Buffer 10X 2.5 dNTP`s (200 µM) 1.0 MgCl2 (25 mM) 1.5 Primer F (10 pM)* 1.0 Primer R (10 pM)* 1.0 H2O 16 Taq Polimerasa (5 U / µL) 0.25 DNA 2.0 Volumen total 25 *Dependiendo de la región que se desee amplificar se usaran los primers específicos para esa región como se muestra en la tabla 3. 28 Posteriormente son llevadas al Termociclador el cual requiere de diferentes condiciones de hibridación según la región del exón para que se lleve a cabo la reacción. Tabla 5: Condiciones del Termociclador para PCR ** Región A: 50.7 °C. Región B: 53.5 °C. Región C: 61.6 °C. 9.2.3 Visualización de los resultados. Para ver los fragmentos de DNA que se amplificaron en la PCR, se debe llevar parte del producto a un corrimiento electroforético en gel de agarosa o poliacrilamida. 9.3 Electroforesis en gel de agarosa. 9.3.1 Fundamento. Es un método que permite la separación de moléculas en base a su tamaño. Esta separación se realiza en un gel, que es una malla compleja de moléculas poliméricas. Los geles pueden ser de agarosa o poliacrilamida. La agarosa es conveniente para separar fragmentos de ácidos nucleicos en el rango desde unos pocos cientos, hasta aproximadamente 20000 ETAPA TEMPERATURA ºC TIEMPO MINUTOS Inicio 94 4.0 Desnaturalización 94 0.30 Hibridación ** 0.25 Amplificación 68 0.45 Finalización 72 7.0 29 pares de bases. La poliacrilamida es usada para la separación de fragmentos más pequeños de ácidos nucleicos (Etienne, 2001; Klug, 2006). El fundamento de esta separación está basado en que las moléculas de ácidos nucleicos están cargadas negativamente (al pH y condiciones del tampón en el que se encuentran) y al someterlas a un campo eléctrico migran hacia el polo positivo de este a través del gel, a velocidades que dependen de sus tamaños: una molécula pequeña puede seguir su camino a través del gel más fácilmente que una molécula grande. La detección tras la migración se realiza fácilmente gracias al empleo de un colorante intercalante (se intercala entre las bases de los ácidos nucleicos mediante enlaces de tipo Van der Wals ) que contiene el propio gel y es visualizado al emitir luz visible cuando el gel se ilumina con luz ultravioleta (Tagu; 2006; Yabar; 2003). Los geles de alta concentración mejoran la resolución de los fragmentos de DNA de pequeño tamaño. Los geles de baja concentración permiten una mejor separación de los fragmentos de gran tamaño, mientras que tiende a comprimir los de pequeño tamaño. Como ejemplos de concentraciones óptimas según el tamaño de DNA en Kilobases (Kb) podemos considerar los mostrados en la tabla 5 (Aránega, 2002). Tabla 6: Concentraciones recomendadas de agarosa dependiendo del tamaño de DNA. Concentración % agarosa Rango DNA (Kb) 0.8 0.8-1.0 1.0 0.4-8 1.2 0.3-7 2.0 0.1-3 30 La electroforesis es realizada a un pH que permite que las moléculas de DNA continúen cargadas negativamente y en doble cadena como se muestra en la figura 8. Hay numerosos buffers que pueden ser usados en electroforesis, los más comunes son el TBE (tris-borato- EDTA) y el TAE (Tris-acetato-EDTA) ambos mantienen un pH entre 7.5 y 7.8, para cargar adecuadamente la muestra en el gel es necesario la utilización de un colorante o buffer de carga que contiene colorantes que migran hacia el ánodo en el campo eléctrico, el cual tiene tres funciones (Yabar 2003; Watson, 2006). 1. Incrementar la densidad de la muestra 2. Asegurar que el DNA descienda uniformemente en el pocillo 3. Añadir color a la muestra Figura 8. Separación del DNA por medio de electroforesis en gel: La figura muestra a sistema de electroforesis en gel visto en un corte transversal. El DNA posee una carga negativa por lo que migran al polo positivo atravesando el gel (Tomada de Watson, 2006). 31 9.3.2 Metodología. El gel de agarosa debe estar a una concentración de 1.2 % 1. Pesar 0.24 g de agarosa y medir 20 mL de TAE 1x 2. Colocarlos en un matraz Erlen meyer 3. Calentar en horno de microondas hasta disolver perfectamente, sin dejar ebullir. 4. Colocar 1 µL de Bromuro de Etidio (BrEt)* 5. Por otro lado, sellar la placa de electroforesis y colocarle el peine 6. Verter la solución en la placa y dejarla gelificar. *Nota: El BrEt es un agente mutagénico por lo que al manipularlo se tiene que usar guantes. Figura 9: Preparación del gel de agarosa para la electroforesis. Al gelificar el gel se retiran los peines y se coloca en la cámara de electroforesis y se cubre con el buffer TAE1X, para cargar la muestra se coloca en un papel parafilm 2 μL de colorante, posteriormente adicionar 2 μL de la muestra se homogeniza con el colorante de carga y se coloca en un pozo del gel. 9.3.3 Visualización de los resultados. Para visualizar el avance del DNA a través del gel de electroforesis se tiene que llevar el gel a un transiluminador de luz ultravioleta con una longitud de onda de 254-302 nm. La primera nos ofrece una fluorescencia más intensa con el bromuro de etidio pero, causa más daño al DNA. Hay que tener muchas precauciones cuando se use un transiluminador ya que puede dañar los ojos y la piel (figuras 11 y 12). 32 Figura 10: Modelo de transiluminador utilizado en La Unidad de Genética Humana del Hospital de Pediatría CMN Siglo XXI (Tomada de la Universidad de León, 2004). Figura 11. Electroforesis en gel de agarosa: La figura muestra la electroforesis de un producto de PCR en los carriles M se encuentra el marcador de peso molecular de 50 pb, en los carriles 1, 2 y 3 se observan amplificados de 400 pb, el carril 4 es el correspondiente al blanco (Tomada de ACE Revista de Enología). 33 9.4 Purificación del producto de PCR. 9.4.1 Fundamento. 1. El procedimiento de purificación mediante el Kit QIAquick PCR implica la disolución de la reacción del PCR en un buffer de unión y cargado en una membrana de silicio de alta capacidad al cual el DNA es selectivamente adsorbido (Figura 12). Después de un lavado para eliminar enzimas, buffers, primers y DNTPs, el DNA purificado es diluido en buffer TE o agua estéril (QIAquick® Spin Handbook, 2008). . Figura 12. Ejemplo de purificación del producto de PCR: Un exceso de Primer (40 bases) se añadió al las reacciones de PCR que contenía una escala de DNA de 1 Kb. La escala fue purificada con el Sistema de Purificación Rápido de PCR. La línea 1 muestra la mezcla impura y la línea 2 muestra el producto purificado (Tomada de QIAquick® Spin Handbook, 2008). 9.4.2 Metodología. Este procedimiento está diseñado para purificar fragmentos de DNA de cadena sencilla o doble, productos de PCR u otras reacciones enzimáticas, siga el procedimiento como se describe para reacciones de PCR. Los fragmentos en promedio de 100bp a 10kb se limpian de oligonucleótidos, polimerasas y sales usando las columnas de QIAquick en una microcentrífuga. 34 1. Añadir 5 volúmenes de buffer PBI (buffer de unión) a 1 volumen de la reacción de PCR y mezclar, por ejemplo: Añadir 500 ml de buffer PBI a 100 ml de la reacción de PCR. 2. Verificar que el color de la mezcla es amarilla (similar al buffer PBI). Si el color de la muestra es naranja o violeta, añadir 10 ml de Acetato de sodio 3M, pH 5 y mezclar. El color de la mezcla cambiará a amarillo. 3. Poner una columna de QIAquick en un tubo de colecta de 2 ml (incluido en el kit) y agregar toda la muestra en la columna QIAquick, centrifugar por 30 a 60 segundos (Esto retiene al DNA en la columna).4. Desechar lo colectado, poner de nuevo la columna QIAquick en el tubo de colecta, añadir 750 ml de buffer PE (buffer de lavado) a la columna QIAquick y centrifugar por 30 a 60 segundos. 5. Desechar lo colectado, colocando de nuevo la columna QIAquick en el mismo tubo de colecta y centrifugar un minuto más. Es muy importante desechar lo colectado antes de centrifugar de nuevo de lo contrario no será removido completamente el etanol. 6. Poner la columna QIAquick en un tubo eppendorf nuevo de 1.5 ml. 7. Para eluir el DNA agregar 50 ml de buffer EB (10mM Tris.Cl, pH 8.5) o agua bidestilada estéril o inyectable en el centro de la membrana de la columna QIAquick, deje reposar 1 minuto a temperatura ambiente y centrifuge por 1 minuto. Es muy importante que el buffer o agua se deposite directamente en la membrana de la columna QIAquick para la completa elución del DNA que estaba retenido en la columna. El promedio del volumen eluido es de 48 ml, la eficiencia de la elución depende del pH. La eficiencia máxima de elución se consigue con un pH entre 7.0 y 8.5. Cuando use agua asegúrese de que el valor de pH está dentro de este rango, guardar el DNA a –20°C ya que el DNA puede degradarse en ausencia de un agente buffer. El DNA purificado puede eluirse en TE (10mM Tris.Cl, 1mM EDTA, pH 8.0), pero el EDTA puede inhibir reacciones enzimáticas subsecuentes. Producto de PCR Fragmentos puros de DNA 35 NOTAS: El color amarillo del Buffer PBI indica un pH < 7.5. Añadir etanol (96 a 100%) al buffer PE antes de usarlo (ver indicaciones en el envase). Todos los pasos en la microcentrífuga son a10,000 x g (13,000 rpm) en una microcentrífuga de mesa convencional. 9.5 Secuenciación. El método de Sanger se basa en el uso de la DNA polimerasa para sintetizar cadenas de DNA con una terminación específica. Con este método se generan fragmentos de DNA de todos los tamaños posibles que se puedan distinguir entre sí, por el tipo de marcaje que llevan o por la incorporación de un terminador específico. Las enzimás del tipo de la DNA polimerasa requieren de un templado de DNA de cadena sencilla, y realizan la síntesis de la hebra complementaria extendiéndola a partir de un iniciador en dirección 5’ a 3’. Entre los componentes de la reacción se incluyen nucleótidos que no tienen un grupo hidroxilo en su extremo 3’ (ddNTP), para poder obtener una terminación especifica en las cadenas. Una vez que el ddNTP se incorpora como el residuo terminal, evita que la cadena de DNA sintetizada continúe extendiéndose. La incorporación de los ddNTPs es al azar, obteniéndose así fragmentos de todos los tamaños posibles que terminan en un residuo específico (Etienne, 2001; Necochea, 2006;). La marcación del DNA amplificado se lleva a cabo por medio de PCR utilizando Big Dye, al final de la reacción el producto es purificado y corrido en un secuenciador automático, estos pasos son detallados a continuación. 36 9.5.1 Marcaje con Big Dye. 9.5.1.1 Fundamento. El Marcado del DNA con Big Dye se basa en el método del nucleótido terminal. En este caso, el nucleótido responsable de la terminación es un ddNTP marcado con un florocromo. Esto asegura que todas las cadenas sintetizadas a partir de un templado, lleven incorporado una sola marca en el mismo lugar (al final de la cadena, en el extremo 3’). De esta manera, se obtienen fragmentos que producen bandas uniformes y cuyas secuencias se pueden determinar más fácilmente (Walker, 1997; Tagu, 2006). El Big Dye Terminator contiene una mezcla de ddNTP´s (ddATP, ddCTP, ddGTP, y ddTTP) marcados con fluorocromos distintos, dNTP´s (dATP, dCTP, dGTP, y dTTP), DNA polimerasa AmpliTaq y MgCl2. Por lo que se pueden llevar a cabo en el mismo tubo, y ya no se tienen que hacer por separado. Además como las bandas que se ven emiten una señal distinta dependiente del nucleótido terminal incorporado permite que las bandas puedan ser diferenciadas en un solo carril (Necochea, 2006). 9.5.1.2 Metodología. Normalmente la manera de proceder es preparando una mezcla de N + 1 (siendo N el número de muestras a amplificar) que contenga todos los componentes descritos menos el DNA. Por otro lado, en tubos eppendorf debidamente rotulados, pondremos la cantidad de DNA apropiadamente y añadiremos la cantidad de mezcla necesaria hasta completar el volumen de reacción el volumen de reacción (10 L). 37 Tabla 7: Marcaje del amplificado de PCR para 10 L. Posteriormente son llevadas al Termociclador bajo las siguientes condiciones Tabla 8: Condiciones del Termociclador para el marcado. Nota: al concluir el marcado agregar 10 µL de H2O, para un volumen total de 20 µL. Componentes µL Buffer 5X 3 Big Dae 1 Producto de PCR 1-4* Primer 1 H2O cbp 10 Volumen total 10 *Por cada 100 pb 10 ng/l ETAPA TEMPERATURA ºC TIEMPO MINUTOS Inicio 94 2.0 Desnaturalización 96 0.10 Hibridación 50 0.5 Amplificación 60 4.0 38 9.5.2 Purificación del marcado. 9.5.2.1 Fundamento. La purificación del marcado se realiza por medio de una cromatografía de exclusión en gel, (Sephadex), el cual está constituido por microesferas sintéticas derivadas de dextrano en la cual las moléculas de gran tamaño no entran en los poros del Sephadex eluyendo rápidamente al final de la columna, mientras las moléculas pequeñas difunden a través del gel haciendo que su paso por el sephadex sea más lento (como se muestra en la figura 13). Como la molécula del DNA marcado es mayor a las moléculas de reactivos utilizados en el marcado, esta eluye más rápidamente que los reactivos y se puede recolectar en un tubo eppendorf (Analytica-World., Wikipedia). Figura13: Principio de la separación con Sephadex (Tomada de DyeEx™ Handbook. QIAGEN, 2002). 39 9.5.2.2 Metodología. 1. Colocar la columna en un tubo de 1.5 mL 2. Agregar 1 mL de Sephadex* 3. Centrifugar a 3,000 rpm / 3 minutos 4. Desechar el agua y verificar que el volumen de Sephadex en la columna sea de por lo menos ¾ del volumen de la columna. 5. Colocar la columna en tubo eppendorf de 1.5 mL estéril 6. Agregar el DNA marcado a la columna, cuidando que este caiga en el centro de la columna. 7. Centrifugar a 3,000 rpm / 3 minutos para obtener el purificado 8. Leofilizar a 30 ºC / 30 minutos (hasta sequedad) *Nota preparación del Sephadex: Agregar 2.6 g de Sephadex 50Grad en 40 mL de agua inyectable, agitar y dejar reposar por 2 horas posteriormente proceder a su utilización. No utilizar después de 2 días. 9.5.3 Secuenciación Automatizada. 9.5.3.1 Fundamento. Dentro del aparato para secuenciación los fragmentos se separan por medio de una electroforesis capilar dependiendo de su tamaño, como cada banda tiene un florocromo especifico dependiendo del nucleótido en el cual haya terminado ese fragmento, este es detectado por medio de un laser a diferente longitudes de onda y comunicada al detector para ser por ultimo interpretada por el ordenador y expresada en forma de un electroferograma como se muestra en la figura 14 (Necochea, 2006). 40 Figura 14: Ejemplo de electroferograma. 9.5.3.2 Metodología. La unidad de genética humana del hospital de pediatría CMN Siglo XXI no posé un secuenciador automático, por tal motivo al terminar la purificación del marcado, son rotuladas y enviadas al Instituto de biología de la UNAM quien colabora con nosotros. 9.5.4 Análisis de los datos obtenidos. Los resultados obtenidos de la secuenciación son entregados en forma de archivo electrónicoel cual se abre mediante el programa CHROMAS, que nos permite alinear la secuencia de las muestras con la secuencia del exón 28 que está en la red mediante la herramienta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) permitiéndonos detectar si la secuencia presenta alguna alteración, para posteriormente buscar en la base de datos ISTH SSC VWF de la universidad de Sheffield (Novo, 2007; Watson, 2006). 41 X. RESULTADOS Y ANALISIS DE RESULTADOS. 10.1 pacientes. Se realizó el análisis molecular del gen FVW (exón 28) a 10 pacientes canalizados por parte del departamento de hematología de los cuales tres son de sexo masculino y siete son de sexo femenino, cuyo rango es de 1-18 años. En el departamento de hematología se les realizaron diferentes pruebas de laboratorio (tabla 1) con el fin de ayudar al médico a obtener un diagnóstico. Tabla 9: Resultados de las pruebas realizadas en el laboratorio clínico del hospital de pediatría a los 10 pacientes estudiados. M: Masculino. F: Femenino. ND: No determinado. Ivy: Prueba de tiempo de sangrado. TP: Tiempo de protrombina. TTPa: Tiempo de tromboplastina parcial activada. FVW:Ag: Antígeno de FVW. Num. Edad Sexo Diagnostico Ivy Plaquetas TP (Seg.) Testigo TP (Seg.) INR TTPa (Seg.) % Agregación Plaquetaria Ristocetina FVW:Ag 124 18/M EVW ND 220 000 11.1´´ 12.8´´ 0.83 37´´ 62.5 ND 128 12/F EVW ND 276 000 14.7´´ 12.7´´ 1.18 47.32´´ ND ND 129 02/M EVW ND 222 000 20.8´´ 13.1´´ 1.57 51.35´´ ND ND 146 F Coagulopatía ND ND ND ND ND ND ND ND 150 14/F EVW 6´28´´ 234 000 11.98´´ 13.3´´ 0.91 32.53´´ 87.5 55.6 160 07/M Coagulopatía ND 341 000 12.06´´ 13.21´´ 0.93 36.89´´ 53 48.8 163 11/F Coagulopatía 3´49´´ 305 000 10.96´´ 12.1´´ 0.89 26.77´´ 76.25 119 175 1/F Coagulopatía ND 316 000 ND ND ND ND ND ND 184 12/F Probable EVW Confirmar o descartar EVW 8´30´´ 175 000 11.54´´ 12.3´´ 0.89 35.47´´ 106.25 61.7 187 2/F Confirmar o descartar EVW 3´22´´ 314 000 12.63´´ 12.63´´ 0.98 36.25´´ 83.75 86.9 42 De las 10 muestras estudiadas, 4 tenían diagnóstico previo de EVW aun sin clasificar, 2 de Coagulopatía y 2 eran para confirmar o descartar EVW. 3 de los pacientes presentaban un tiempo de sangría normal, en 2 estaba prolongado y 5 no tenia reporte de este estudio. El TP fue normal en 7 de los pacientes y en 1 estaba prolongado. 3 pacientes presentaron un TTPa prolongado y 5 un TTPa normal. El % de agregación plaquetaria con ristocetina esta elevado en 3 pacientes, en 2 es normal, esta disminuido en uno y en 4 no hay reportes del estudio. El FVW es normal en 3 pacientes, en 2 esta disminuido y 5 no presentan reporte del estudio. 10.2 Amplificación de los 3 segmentos del exón 28 por PCR. A partir de la extracción de DNA de leucocitos de sangre periférica tomada de cada uno de los pacientes, se procedió a amplificar el exón 28 en tres regiones denominadas A, B, C, se procede de esta manera debido a que el exón completo es demasiado grande por lo cual al intentar amplificarlo los resultados serian inespecíficos y puede ocurrir el plegamiento de primers. Los productos de PCR de los tres segmentos del exón 28 se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1.2 % (figura 15). 43 Figura 15: Ejemplo de una electroforesis en gel de agarosa al 1.2 % para PCR de las tres regiones del exón 28 (A, B, C con aproximadamente 500 pb cada una) del gen VWF en diferentes pacientes. 10.3 Purificación de los amplificados. Como el producto de PCR contiene restos de reactivos se procede a purificar la reacción con el Kit QIAquick PCR para posteriormente correr una electroforesis en gel de agarosa 1.2 %. Se utiliza un marcador de peso molecular, para verificar que el tamaño del fragmento sin impurezas corresponde al segmento deseado. (figura 16). 44 Figura 16: Ejemplo de una electroforesis en gel de agarosa al 1.2 % de los purificados de las tres regiones del exón 28 (A, B, C con aproximadamente 500 pb cada una) del gen VWF en diferentes pacientes. 10.4 Secuencias. Al obtener los purificados del producto de PCR de cada una de las tres regiones de los pacientes, éstas fueron marcadas con Big Dye Terminator por medio de una reacción de PCR, al finalizar la reacción está fue purificada para eliminar restos de reactivos que pudieran interferir en la secuenciación, posteriormente fueron liofilizadas y enviadas al departamento de secuenciación del Instituto de Biología de la UNAM. El resultado de la secuenciación es un electroferograma el cual nos es entregado vía archivo electrónico y es interpretado por medio del programa CHROMAS, lo que nos permite visualizar la secuencia, el programa contiene una herramienta de nombre BLAST programa que nos permite alinear las secuencias de los pacientes (Query) con la secuencia de referencia (Subjet) en este caso del exón 28 que se encuentra en la base de datos del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI). Por último los cambios encontrados en el análisis de la comparación de las secuencias Query y Subjet son 45 buscados en la base de datos de la universidad de Sheffield con el fin de investigar si ya han sido reportados o se trata de un cambio nuevo. Esta comparación nos permite encontrar algún cambio en los nucleótidos como los que se muestran en las figuras 17, 18 y 19. Figura 17: Ejemplo de cambio de nucleótido en las posiciones 1034 y 1039 del gen VWF. Arriba se ve la secuencia normal correspondiente a las posiciones 1034 y 1039 del exón 28 (gen FVW), abajo se muestra la secuencia alterada en la cual se observa la presencia de otro nucleótido en las mismas posiciones (heterocigotos). Estas alteraciones corresponden a un polimorfismo (F1501) y a una mutación (L1503P) ambas reportadas en la literatura. 46 Figura 18: Ejemplo de cambio de nucleótido en la posición 1269 del gen VWF. Arriba se ve la secuencia normal correspondiente a la posición 1269 del exón 28 (gen FVW), abajo se muestra la secuencia alterada en la cual se observa la presencia de otro nucleótido en la misma posición (heterocigoto). Esta alteración corresponde a la mutación L1580V que ya se encuentra reportada. 47 Figura 19: Ejemplo de cambio de nucleótido en la posición 1196 del gen VWF. Arriba se ve la secuencia normal correspondiente a la posición 1196 del exón 28 (gen FVW), abajo se muestra la secuencia alterada en la cual un nucleótido de Adenina (A) ha sido cambiado (homocigoto) por uno de Citosina (C). Esta alteración corresponde al polimorfismo A1555 que ya se encuentra reportado. Los resultados obtenidos al finalizar el análisis molecular del exón 28 en los 10 pacientes fueron los siguientes: 7 mutaciones de las cuales 3 están reportadas y 4 son nuevas así como 10 polimorfismos de los cuales 7 ya habían sido reportados previamente y 3 no presentan reporte previo. (Tablas 9 y 10) 48 Tabla 10: Mutaciones encontradas en el exón 28 del gen FVW. No. Muestra Cambio de nucleótido No.de Nucleótido en cDNA No. de Nucleótido en exón 28 Cambio de aminoácido Clasificación (Tipo EvW) Referencia 124 G / C 3967 498 Asp1323His --------------- ------------------ 124,128, 150,184 T / C 4106 637 Fel1369Ser --------------- ------------------ 150, 160 T / C 4508 1039 Leu1503Pro 2A Francia / French Network 184 C / G 4687 1218
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