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Analisis-molecular-en-el-exon-28-del-gen-VWF-en-pacientes-mexicanos-con-posible-enfermedad-de-von-Willebrand

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UNIVERSIDA NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN 
 
 
 
“Análisis molecular en el exón 28 del gen VWF en pacientes mexicanos 
con posible Enfermedad de von Willebrand” 
 
TESIS 
Que para obtener el título de: 
 
Químico Farmacéutico Biólogo 
 
Presenta: 
Carlos Evet Sánchez Castillo 
 
Asesora: Dra. Rosenda Isabel Peñaloza Espinosa 
 
 
Cuautitlán Izcalli, Estado de México                                                         2010 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
I 
 
 
 
II 
 
 
DEDICATORIAS 
 
 
A mi abuelita Elvia Pérez Rendón eres la piedra angular sobre la cual descansan estos 
logros. Más de la mitad de mi vida he vivido bajo tu techo y jamás he sentido más que 
cariño, orgullo y alegría de tu parte, porque he visto como te has limitado en darte varios 
gustos para que mi formación profesional sea completada, no hay palabras que pueda 
expresarte todo mi agradecimiento. 
 
 
A mi Mamá Julia por tu apoyo no solo económico, sino moral, ético y profesional que me 
brindaron las charlas que mantuve contigo. En ti veo un camino profesional el cual 
quiero igualar y superar como muestra de mi agradecimiento. 
 
 
A las dos mi admiración por sacar adelante a sus hijos y seguir velando por ellos y por 
sus nietos, a ustedes dedico esta frase la cual refleja lo que de ustedes he aprendido. 
 
"Porque mejor es la sabiduría que las piedras preciosas, y todo cuanto se puede desear, 
no es de compararse con ella. 
(Proverbios 8: 11) 
 
 
 
 
 
III 
 
AGRADECIMIENTOS 
A mi Papa Ricardo gracias por tu cariño y todos tus cuidados a lo largo de esta trayectoria, 
gran parte de mi calidad humana la aprendí de ti, siempre te veré como un gran hombre por el 
cual siento mucho cariño y admiración. 
A mi madre Maribel Castillo. Eres una mujer como pocas, has tomado decisiones buenas y 
malas pero jamás te has arrepentido de ellas, de ti he aprendido a nunca rendirme a ser un 
triunfador y a que no sólo debo de soñar sino a luchar por los sueños. Sé que este logro te 
enorgullece, pero yo estoy más orgulloso de que tú seas mi madre. 
A mis tías Elvia, Georgina y Leticia Flores, por el apoyo que cada una de ustedes a su muy 
particular estilo me han brindado, siempre les estaré agradecido y dispuesto a tenderles la 
mano y mi apoyo cuando ustedes la necesiten. 
A mis amigas de la carrera Roció, Susana, Miriam, Vanesa y Liztopigio por compartir mis 
alegrías, tristezas, y locuras siempre tendrán un lugar especial en mi corazón. 
A mis grandes amigos, Vicente y Ricardo que han compartido tanto conmigo desde el CCH, la 
filosofía que tengo de la vida la aprendí con ustedes, Hermanos la palabra AMIGO expresa su 
verdadero significado en ustedes y mi deseo es que así sea por siempre. 
A mi amiga Lidia, por ayudarme con tus consejos y sabiduría durante la pérdida de un 
familiar querido y el cual fue uno de los momentos más obscuros de mi vida. Aunque ya no 
nos frecuentemos tanto siempre tendrás un lugar especial en mi corazón. 
A Eva por ser mi mejor amiga, mi TIFERET, por ver más allá de las apariencias, te conocí 
desde los primeros días de la carrera pero fue a mitad de ella cuando realmente convivimos y 
nuestra amistad maduro hasta lo que es hoy y sin la cual esta relación no podría ser tan 
maravillosa. Gracias por creer en mí, por no dejar nunca que me derrumbara y ayudarme a 
concluir mis estudios, no lo hubiera logrado sin ti. Porque nuestro amor no nos limita sino que 
nos motiva a seguir adelante. 
A la familia Morales Almazán, a Sandra, Eva y Minerva por todo el apoyo que me han 
brindado, las tres me han enseñado valores que ya no se encuentran fácilmente, además de 
poseer un carácter el cual admiro mucho, siempre tengan presente que las quiero mucho. A la 
Señora EVA Almazán Aguilar por ser tan buena persona abriéndome las puertas de su casa, 
haciéndome saber que puedo contar con ella y por ofrecerme su apoyo, comprensión y cariño.  
A mi Padre Víctor Hugo Flores Por enseñarme a luchar para conseguir mi propio porvenir y 
no sólo esperar a que mis padres o abuelos me lo proporcionen. El Parkinson detuvo tu carrera 
 
IV 
 
y tus sueños así que yo seguiré siempre adelante en esa búsqueda por ambos. Te quiero mucho 
y siempre estaré orgulloso de ser tu hijo. 
A mi hermano Jorge, a pesar de ser menor que yo me has apoyado mucho, mis respetos por tu 
responsabilidad en algunas cosas, espero que este logro te motive a madurar y a concluir tus 
estudios. A mi hermana Linda gracias por tu cariño, cuentas con mi apoyo siempre y recuerda 
que no es lo mismo conocimiento que sabiduría. A mi hermano Cristian por todo tu apoyo y 
conocimientos brindados, por despertar en mí la pasión por la lectura y más que nada porque a 
pesar de las peleas propias de hermanos jamás hemos dejado de hablarnos y puedo asegurar 
que jamás pasará eso. Con mi mayor cariño te dedico estas palabras GOYA GOYA CACHUN 
CACHUN RA RA GOYA UNIVERSIDAD. 
Agradecimiento póstumo a tres personas muy importantes en mi vida: 
Al QFB Alejandro Rojas por introducirme a este bello mundo que es la carrera de QFB. 
A mi Abuelo Justino Flores me dejaste a una edad temprana de mi vida pero siempre serás un 
modelo de hombre a seguir, espero que donde estés te encuentres muy orgulloso. 
A mi tío Carlos Flores fuiste más que un tío, uno de mis mejores amigos, y un maestro en la 
vida, en la mayoría de mis recuerdos estás tú presente y mi personalidad refleja mucho de lo 
bueno que tú tenias. 
A mis profesores de la universidad: Mario Arturo Delgado, Sandra Díaz, Idalia Ávila, 
Rosalba Bonilla, Ana Laura Vázquez, Marco Antonio Vega, Maritere Domínguez, José Juan, 
Yolanda, gracias por los conocimientos que me transmitieron, ayudándome a madurar y forjar 
un criterio y carácter profesional. 
Al Químico Mario Flores gracias por compartir tu experiencia y sabiduría así como por hacer 
amena mi estancia durante el tiempo que realice esta tesis. 
A la Dra. Rosenda Peñaloza mi asesora de tesis gracias por todo su apoyo, confianza, 
enseñanza y sabiduría que me transmitió a lo largo de este tiempo, por alentarme a seguir 
estudiando y por ser un ejemplo de superación para todos los que estamos a su alrededor. 
A la UNAM por todas las oportunidades y conocimientos que me ha brindado a través de mi 
formación primero en el CCH-Naucalpan y posteriormente en mi amada FES-Cuautitlan. 
Porque la educación pública es algo que tenemos que aprovechar y ayudar a mejorar con 
nuestros éxitos. 
Aquel que tiene un porqué para vivir se puede enfrentar a todos los "cómos". (Friedrich 
Nietzsch) 
 
V 
 
Tesis realizada en: 
Unidad de Investigación Médica en Genética Humana del Hospital de 
Pediatría. Centro Médico Nacional Siglo XXI, IMSS. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ESTE TRABAJO FUE FINANCIADO POR: El fondo de fomento a la 
Investigación IMSS, No. 2005-1-I-011 a RP. 
 
VI 
 
INDICE GENERAL 
I. INDICE DE TABLAS. 
II. INDICE DE FIGURAS. 
III. ABREVIATURAS. 
IV. RESUMEN. 1 
V.GENERALIDADES. 2 
5.1 Antecedentes de la enfermedad de von Willebrand (EVW). 2 
5.2 Epidemiología. 3 
5.3 Gen del factor de von Willebrand. 4 
5.4 La proteína del factor de von Willebrand. 5 
5.4.1 Biosíntesis del factor devon Willebrand. 7 
5.4.2 Función del factor de von Willebrand. 8 
5.5 Enfermedad de von Willebrand (EVW). 9 
5.5.1 Clasificación de la enfermedad de von Willebrand. 9 
5.5.2 Enfermedad de von Willebrand Tipo 1. 10 
5.5.3 Enfermedad de von Willebrand Tipo 2A. 10 
5.5.4 Enfermedad de von Willebrand Tipo 2B. 11 
5.5.5 Enfermedad de von Willebrand Tipo 2M (Milwaukee). 12 
5.5.6 Enfermedad de von Willebrand Tipo 2N (Normandia). 12 
 5.5.7 Enfermedad de von Willebrand Tipo 3. 13 
5.5.8 Pseudoenfermedad de von Willebrand. 14 
 5.5.9 Enfermedad de von Willebrand adquirida. 14 
5.6 Herencia de la enfermedad de von Willebrand. 14 
5.7 Diagnostico la enfermedad de von Willebrand. 15 
 
 
VII 
 
5.8 Historial familiar en la enfermedad de von Willebrand. 16 
5.9 Pruebas de laboratorio para la enfermedad de von Willebrand. 17 
VI. OBJETIVOS. 18 
6.1 General. 18 
6.2 Particulares. 18 
VII. HIPOTESIS. 19 
VIII. PACIENTES Y MATERIALES. 20 
8.1 Pacientes. 20 
8.2 Material. 20 
8.2.1 Biológico. 20 
8.2.2 Equipos. 20 
8.2.3 Reactivos. 21 
8.2.3.1 Extracción de DNA. 21 
8.2.3.2 Electroforesis. 21 
8.2.3.3 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 21 
8.2.3.4 Marcado DNA. 22 
IX. METODOLOGIAS Y FUNDAMENTOS. 23 
9.1 Extracción de DNA por concentración de sales. 23 
9.1.1 Fundamento. 23 
9.1.2 Metodología. 23 
9.2 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 25 
9.2.1 Fundamento. 25 
9.2.2 Metodología. 26 
9.2.3 Visualización de los resultados. 28 
 
 
VIII 
 
9.3 Electroforesis en gel de agarosa. 28 
9.3.1 Fundamento. 28 
9.3.2 Metodología. 31 
9.3.3 Visualización de los resultados. 31 
9.4 Purificación del producto de PCR. 33 
9.4.1 Fundamento. 33 
9.4.2 Metodología. 33 
9.5 Secuenciación. 35 
9.5.1 Marcaje con Big Dye. 36 
9.5.1.1 Fundamento. 36 
9.5.1.2 Metodología. 36 
9.5.2 Purificación del marcado. 38 
9.5.2.1 Fundamento. 38 
9.5.2.2 Metodología. 39 
9.5.3 Secuenciación Automatizada. 39 
9.5.3.1 Fundamento. 39 
9.5.3.2 Metodología. 40 
9.5.4 Análisis de los datos obtenidos. 40 
X. RESULTADOS Y ANALISIS DE LOS RESULTADOS. 41 
10.1 Pacientes. 41 
10.2 Amplificación de los 3 segmentos del exón 28 por PCR. 42 
10.3 Purificación de los amplificados. 43 
10.4 Secuencias. 44 
 
 
 
IX 
 
XI. DISCUSIÓN. 50 
XII. CONCLUSIONES. 54 
XIII. GLOSARIO. 55 
XIV. BIBLIOGRAFIA. 58 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
X 
 
I. INDICE DE TABLAS. 
Clasificación de la enfermedad de von Willebrand. 9 
Datos de los Primers utilizados para el análisis del exón 28 (gen FVW). 22 
Componentes de una PCR para 25 L. 27 
Secuencia de primers empleados. 27 
Condiciones del Termociclador para PCR 28 
Concentraciones recomendadas de agarosa dependiendo del tamaño de DNA. 29 
Marcaje del amplificado de PCR para 10 L. 37 
Condiciones del Termociclador para el marcado. 37 
Resultados de las pruebas realizadas en el laboratorio clínico del hospital de 
pediatría a los 10 pacientes estudiados. 41 
Mutaciones encontradas en el exón 28 del gen FVW. 48 
Polimorfismos encontrados en el exón 28 del gen FVW. 49 
 
 
 
II. INDICE DE FIGURAS. 
Localización cromosómica del gen VWF entre otras enfermedades  
genéticas en el cromosoma 12.                4 
Esquema del gen VWF. 4 
Esquema del FVW. 6 
Resumen de la biosíntesis y su ubicación al interior de la célula 
de síntesis (megacariocito o células endoteliales). 8 
Árbol genealógico que muestra la herencia de la enfermedad de von Willebrand. 15 
Patrones de herencia de la enfermedad de von Willebrand. 15 
 
XI 
 
Pasos de la reacción en cadena de la polimerasa. 25 
Separación del DNA por medio de electroforesis en gel. 30 
Preparación del gel de agarosa para la electroforesis. 31 
Modelo de transiluminador utilizado en La Unidad de Genética Humana del 
Hospital de Pediatría CMN Siglo XXI. 32 
Electroforesis en gel de agarosa. 32 
Ejemplo de purificación del producto de PCR. 33 
Principio de la separación con Sephadex. 38 
Ejemplo de electroferograma. 40 
Ejemplo de una electroforesis en gel de agarosa al 1.2 % para PCR de las 
tres regiones del exón 28 (A, B, C) del gen VWF en diferentes pacientes. 43 
Ejemplo de una electroforesis en gel de agarosa al 2 % de los purificados 
de las tres regiones del exón 28 (A, B, C) del gen VWF en diferentes pacientes. 44 
Ejemplo de cambio de nucleótido en las posiciones 1034 y 1039 del gen VWF. 45 
Ejemplo de cambio de nucleótido en la posición 1269 del gen VWF. 46 
Ejemplo de cambio de nucleótido en la posición 1196 del gen VWF. 47 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
XII 
 
III. ABREVIATURAS. 
a.a Aminoácido 
BLAST Basic Local Alignment Search Tool 
BrEt Bromuro de etidio 
cDNA DNA complementario 
ddNTPs Dideoxinucleótidos trifosfatados 
DNA Ácido desoxirribonucleíco 
dNTPs Desoxinucleotidos trifosfatados 
EDTA Ácido etilendiamina tetraacético 
EVW Enfermedad de von Willebrand 
FVII Factor VIII de la coagulación 
FVW Factor de von Willebrand 
FVW: Ag Antígeno del Factor de von Willebrand 
FVW: RCo Actividad del cofactor de ristocetina 
Gp Glicoproteína 
INR Índice Nacional de Referencia 
ISTH Subcomité Científico de la Sociedad Internacional en 
Trombosis y Hemostasia 
Kb Kilo bases 
Nt Nucleótido 
Pb Pares de bases 
PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa 
RIPA Aglutinación de plaquetas inducida por ristocetina 
RNA Ácido ribonucleico 
RNAm RNA mensajero 
SDS Dodécil Sulafato de Sodio 
Taq DNA Polimerasa Thermus aquaticus 
TP Tiempo de protrombina 
TTPa Tiempo de tromboplastina parcial activada 
VWF Gen del Factor de von Willebrand  
 
1 
 
IV. RESUMEN. 
 
La enfermedad de von Willebrand (EVW) es debida a alteraciones cuali o cuantitativas en 
la proteína FVW y tiene una prevalencia del 1% en la población mundial. El factor de von 
Willebrand (FVW) es una glicoproteína multimérica que se sintetiza en megacariocitos y 
células endoteliales, juega un papel importante en la hemostasia al mediar la adhesión de 
plaquetas a los sitios de daño vascular, facilita la agregación plaquetaria y transporta al 
FVIII en el torrente sanguíneo protegiéndolo de la proteólisis prolongando su tiempo de 
vida. 
 
El diagnóstico de esta enfermedad es difícil y frecuentemente los casos leves pueden pasar 
desapercibidos. Las pruebas de laboratorio y el estudio familiar de hemorragias es 
fundamental para establecer un diagnóstico sin embargo estos estudios no proporcionan un 
diagnóstico exacto, por lo que en la actualidad se ha comenzado a recurrir al estudio 
molecular. 
 
El gen que codifica esta proteína es conocido como VWF se localiza en el cromosoma 12 
(12p13.3), está compuesto de 178 Kilobases (Kb) de DNA y comprende 52 exones siendo 
el 28 el más grande de ellos con 1380 pb que codifican para 460 aminoácidos e implica a 
los dominios A1, A2 que son sitios de unión a glicoproteína (Gp) y A3 que es sitio de 
unión a colágena. 
 
El objetivo del presente trabajo fue realizar el análisis molecular del exón 28 del gen VWF 
siendo el que con mayor frecuencia presenta alteraciones, el estudio se llevo a cabo en 10 
pacientes mexicanos con posible EVW canalizados por el Departamento de Hematología 
del Hospital de Pediatría. Centro Médico Nacional (CMN) Siglo XXI, IMMS.Los resultados obtenidos al finalizar el análisis molecular fueron: la identificación de siete 
mutaciones (tres reportadas y cuatro sin reportar) y diez polimorfismos (siete reportados y 
tres sin reporte previo), de estos polimorfismos cinco presentaron cambio de aminoácido. 
Con los datos obtenidos y gracias a la ayuda de la base de datos Internacional ISTH SSC 
VWF, Sheffield University se pudo dar un diagnóstico certero de Enfermedad de von 
Willebrand a 7 de los 10 pacientes, además de poder clasificarlos correctamente. 
 
En conclusión es importante realizar el análisis molecular para dar un mejor diagnóstico 
que repercuta en el tratamiento y en el asesoramiento genético. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2 
 
V. GENERALIDADES. 
 
5.1 Antecedentes de la enfermedad de von Willebrand (EVW). 
 
La enfermedad de Von Willebrand (EVW) fue descrita por primera vez en 1926 por el 
médico Finlandés Erik von Willebrand al publicar un manuscrito en el cual se describía un 
trastorno hemorrágico de carácter hereditario cuyas características indicaban que dicho 
trastorno era diferente a la hemofilia. Los primeros estudios que realizó el doctor von 
Willebrand fueron dentro de una familia que vivía en la isla de Föglö, en el archipiélago 
Äaland, del Mar Báltico. El propositus fue una niña (Hjördis) de cinco años que sufría 
sangrados recurrentes de labios, nariz y tobillos, a la edad de 13 años la niña murió durante 
la menarca, otros cuatro miembros de la familia habían muerto por sangrados no 
controlados a edad temprana (Lillicrap, 2008; Woods, 2008) 
 
En estos estudios iníciales, el doctor von Willebrand diferenció este caso de la hemofilia 
tras percatarse que las lesiones ocasionadas por esta enfermedad diferían de las producidas 
por la hemofilia por tratarse de hemorragias externas en la primera y hemorragias internas 
en el segundo caso. Al analizar el tiempo de sangría y la prueba de fragilidad capilar 
obtuvo valores anormales. A su vez los estudios de recuento de plaquetas y tiempo de 
coagulación dieron resultados dentro del rango normal, lo que no ocurre en los caso de 
hemofilia. Así mismo descubrió que este trastorno mostraba un modo de transmisión 
autosómico dominante y un predominio de las hemorragias mucocutaneas, por lo que 
concluyó que se trataba de cambios morfológicos que modificaban la función de las 
plaquetas y que estaba asociado a lesiones sistémicas de las paredes de los vasos 
sanguíneos, por lo cual la denomino “Pseudohemofilia hereditaria” (Woods, 2008. 
Ginsburg and Walter, 2009). 
 
En 1957 se informó que el defecto era corregido por un factor plasmático diferente al 
factor VIII denominándose factor de von Willebrand (FVW), sin embargo seguía la 
controversia en torno a si el FVW y FVIII eran una misma proteína (Quintana, 2000). 
En la década de 1960 se descubrió que el antibiótico Ristocetina, estimulaba la agregación 
plaquetaria en personas normales o hemofílicas pero no en personas que padecían EVW. Si 
 
3 
 
se agregaba plasma pobre en plaquetas de una persona normal o hemofílica a un paciente 
EVW con un plasma rico en plaquetas, el antibiótico funcionaba. Así se descubrió un 
nuevo test para detectar al FVW, que todavía no se conocía como tal (Woods, 2008). 
 
La controversia quedó aclarada en el año de 1971, cuando dos grupos de investigadores 
lograron un importante avance al demostrar por primera vez, mediante el uso de pruebas 
inmunológicas que el factor VIII (FVIII) y FVW eran proteínas distintas. En 1985 el FVW 
fue clonado y secuenciado por primera vez con lo cual se pudo estudiar la relación entre su 
estructura y su función, con estudios subsecuentes se ha mejorado la compresión de la base 
genética en la EVW (Lillicrap and James, 2009; Melo, 2007). 
 
5.2 Epidemiologia. 
 
La EVW es el trastorno hemorrágico hereditario más común en los seres humanos, ya que 
presenta una distribución mundial y también es común en otras especies animales. Se ha 
encontrado que presenta una prevalencia de 1% en la población mundial (Cooney et al, 
1991; Lillicrap, 2008; Quintana, 2000; Turgenton, 2006). Se considera que las formas 
clínicamente significativas de la enfermedad afectan de 1-3 personas por cada millón de la 
población. Cabe mencionar que en todos los estudios la prevalencia en mujeres es 
aproximadamente el doble que la documentada en varones, esto se debe probablemente al 
potencial único de menorragia en las mujeres (Paper, 2004). 
 
En México no hay un registro epidemiológico de la enfermedad, solo se han informado 60 
casos en 24 familias con diagnostico de EVW (Ambriz, 1984). La incidencia real se 
desconoce dada su heterogeneidad genética y clínica, los patrones de laboratorio muestran 
variabilidad, lo que requiere de una infraestructura para su diagnóstico, por lo que la 
frecuencia de la enfermedad podría superar lo informado en la literatura. 
 
 
 
 
 
 
4 
 
5.3 Gen del factor de von Willebrand. 
 
El gen que codifica para el factor de von Willebrand se localiza en el brazo corto del 
cromosoma 12 en la banda 13, sub-banda 3 (12p13.3) como se muestra en las figuras 1 y 2. 
Es un gen compuesto de 178 Kilobases (Kb) de DNA y comprende 52 exones que 
originan un ARNm de 8923 pares de bases (pb) (Greer, 2004; Hashemi, 2007; 
Melo, 2007). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1: Localización cromosómica del gen VWF entre otras enfermedades genéticas en el 
cromosoma 12. (Tomada de Passarge, 2007) 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2: Esquema del gen VWF. (Tomada de Goodeve, 2009.) 
 
El exón 28 es el exón más grande y comprende 1380 pb que codifican para 460 
aminoácidos (a.a) e implica a los dominios A1 y A2 del factor, los cuales sirven para la 
unión a GpIb y para el dominio A3 el cual es el sitio de unión a la colagena (Cooney, 1991; 
Ginsburg, 2009). 
 
5 
 
Además de su gran tamaño y complejidad genómica, el análisis del gen VWF se complica 
todavía más por la presencia de una copia parcial pseudogénica que abarca de los exones 
23 al 34 en el cromosoma 22 que posee una homología del 97 % respecto al del gen VWF 
(Lillicrap, 2008; Ruggeri, 1993). 
 
El gen VWF codifica para un péptido señal de 22 aminoácidos, un propéptido de 741 aa 
también conocido como antígeno II del FVW y para la proteína madura de 2050 a.a las dos 
primeras secuencias son codificadas por los 17 primeros exones, mientras que la proteína 
madura del FVW es codificada por 35 exones en la porción restante del gen . la proteína 
precursora de 2813 a.a alcanza un peso de 360 Kilodaltones (KDa) y la subunidad madura 
de 2050 a.a 270 KDa (Castaman, Federici, 2003). 
 
El gen VWF se expresa exclusivamente en dos tipos de células: endotelio vascular y 
megacariocitos. La transcripción del gen está regulada por una combinación de factores de 
transcripción ubicuos y específicos al tipo de célula, incluyendo las proteínas GATA,ETS 
y NFY. También hay varios elementos transcripcionales represivos en la secuencia 
ascendente del gen (Wang, 2004). 
 
5.4 La proteína del factor de von Willebrand. 
 
El FVW es una glicoproteína compleja de alto peso molecular se encuentra en plasma en 
una concentración de 5-10 µg/mL, es sintetizada y almacenada en megacariocitos y células 
endoteliales (Perez-Requejo, 1995; González-Chon, 1996). La estructura del FVW está 
compuesta de un polipéptido de 270 KDa con una subunidad que comprende 2,050 de 
aminoácidos (a.a), cada subunidad contiene sitios de unión para la colagena y para las 
glicoproteínas (GpIb y GpIIb/IIIa), está constituido por una serie de segmentos homólogos 
(dominios), cada uno de los cuales está repetido de dos a cuatro veces. Hay tres 
repeticiones de A, tres de B, dos de C y cuatro de D. Las diversas funciones de enlace del 
FVW parecen estar localizadas en estos dominios, como se muestra en la figura 3 
(Mancuso, 1989; Ruggeri and Ware, 1993). 
 
 
6 
 
Envasos sanguíneos intactos, el FVW no interactúa con los receptores de plaquetas, sino 
cuando el vaso se daña dejando al descubierto el subendotelio lo que permite la unión al 
FVW, esta interacción induce un cambio conformacional en la molécula de FVW que 
expone los sitios de unión para que la GpIb de las plaquetas se una al FVW llevándose a 
cabo el mecanismo de adhesión plaquetaria. El FVW se adhiere a la colagena fibrilar tipo 
I, III y VI de la pared vascular a otros componentes del subendotelio, por otro lado en 
superficies con alta actividad ante el estrés (“high shear stress”) se ha demostrado la 
activación del sitio de unión de la GpIIb/IIIa sobre la membrana plaquetaria, activándose la 
agregación plaquetaria por medio del FVW (Garcia-Conde, 2003; Quintana, 2006; 
Shinton, 2008). 
 
El factor de von Willebrand también presenta un papel importante como acarreador del 
factor FVII lo que le permite a éste una mayor estabilidad ya que dicha unión lo protege de 
la proteólisis prolongando su tiempo de vida. 
 
Figura 3: Esquema del FVW: En la figura se señala la organización de los dominios del FVW. 
Estos dominios son definidos y agrupados de acuerdo a su homología interna. Las barras negras 
indican la localización de los sitios de unión. Se muestra también la relación de los exones respecto 
a los dominios del FVW, así como el tamaño del péptido señal, el propéptido y la proteína 
madura. (Tomada de ISTH-SSCVWF Online Database). 
 
 
 
 
7 
 
5.4.1 Biosíntesis del factor de von Willebrand. 
 
En la traducción primaria del ARN se obtiene el pre-pro-FVW, un polipéptido de 
2,813 a.a. La proteína recién sintetizada está formada por un péptido señal de veintidós 
aminoácidos, el propéptido de 741 a.a y la subunidad madura de 2050 a.a. La proteína se 
sintetiza en células endoteliales y megacariocitos almacenándose en los cuerpos de 
Weibel-Palade y gránulos alfa respectivamente como se muestra en la figura 4 
(Altaf 2008; Jorieux, 1998; Woods, 2008). 
 
Existe un proceso postraducional que se inicia cuando el pre-pro-FVW se convierte en 
pro-FVW al eliminar el péptido señal y la glicosilación de sus cadenas en el retículo 
endoplásmico, seguido de su dimerización por enlaces disulfuro y la proteólisis de los 
dominios D1 y D2 (pre y pro péptidos) de la proteína precursora. La glicosilación tipo O y 
N y los carbohidratos específicos de la glicosilación tipo N son modificados por 
sulfatación en el aparato de Golgi. Finalmente ocurre la polimerización del factor en más 
de 50 unidades, quedando de un tamaño de 0.5 a 20 MDa. En la red trans de Golgi la 
enzima furina o PACE (endoproteasa dependiente de calcio asociada a membrana) escinde 
el propéptido, proceso importante para la unión al FVIII pero no para la multimerización 
(Casonato, 2003; Castaman, 2003; Ginsburg, 1992). 
 
Los dímeros del propéptido se eliminan antes de la secreción del FVW. Este propéptido 
originalmente fue conocido como "von Willebrand antígeno II". Hay dos vías de secreción: 
una constitutiva (relacionada con la síntesis) y una vía regulada que involucra la liberación 
del FVW mediada por secretagogos (activadores de la secreción). El FVW de 
megacariocitos y plaquetas proviene de la vía regulada. El FVW circulante en plasma es de 
origen endotelial “vía constitutiva” (Mendolicchio, 2004). 
 
En el plasma, la metaloproteasa ADAMTS-13 actúa sobre los multímeros del FVW en el 
dominio A2, este proceso crea las diferentes formas en las que se encuentra el factor que 
van desde su forma de dímero simple hasta las 20 unidades que forman el multimero más 
complejo (Bowen, 2004; James, 2004). 
 
 
8 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4: Resumen de la biosíntesis y su ubicación al interior de la célula de síntesis 
(megacariocito o células endoteliales). El FVW se almacena en los gránulos alfa en megacariocitos 
y en los cuerpos de Weibe-Palade en las células endoteliales. RE = retículo endoplásmico (Tomada 
de Lillicrap, 2008). 
 
5.4.2 Función del factor de von Willebrand. 
 
El FVW tiene tres funciones fisiológicas principales: 
 
1. Promueve la adhesión de las plaquetas a las estructuras subendoteliales en el sitio 
de injuria vascular. Aquí el FVW se une al colágeno expuesto a través del dominio 
A3, esto produce un cambio conformacional en el FVW que muestra el dominio 
A1, sitio de unión de la GpIb de las plaquetas (Resendiz, 2004). 
 
2. Protege al FVIII de su inactivación y rápido catabolismo, por formación de un 
complejo no covalente con el mismo, a través de los dominios D’-D3, para 
estabilizarlo y protegerlo de la degradación proteolítica en la circulación lo que 
prolonga su vida media de unos minutos a 12 horas (Keeney, 2001; Turgeon, 
2006). 
 
3. Facilita la agregación plaquetaria mediante la interacción plaqueta-plaqueta 
uniéndose a la GpIb plaquetaria y de la GpIIb-IIIa. Dicho enlace no sólo depende 
de la presencia del FVW y de su calidad, sino también de otras proteínas adhesivas 
como fibronectina, laminina, trombospondina, y diferentes tipos de colágeno (Paz-
Arredondo, 2004). 
 
9 
 
5.5 Enfermedad de von Willebrand (EVW). 
 
5.5.1 Clasificación de la enfermedad de von Willebrand. 
 
La clasificación de la EVW se basa en su fisiopatología, diferenciando dos categorías: por 
deficiencia cuantitativa y por deficiencia cualitativa del FVW, y en un principio la 
enfermedad se clasificó en tres tipos diferentes: tipo I, tipo II, tipo III. 
 
El conocer la clonación molecular de su cDNA y la secuencia de a.a del FVW facilitó el 
descubrimiento de la diversidad de los defectos moleculares que son responsables para 
algunos tipos de EVW, sirviendo como base para una nueva clasificación de la 
enfermedad, establecida en el año de 1994 por la Sociedad Internacional de Hemostasia y 
Trombosis (como se muestra en la tabla 1 ), misma que fue ratificada en su última 
publicación de recomendaciones respecto a la clasificación de la EVW en el 2006 (Garcia-
Conde, 2003; Kasper, 2005, Lillicrap, 2009; Morales de la Vega, 2008). 
 
Tabla 1: Clasificación de la enfermedad de von Willebrand. (Tomado de Quintana, 2000) 
 
 
 
 
 
10 
 
5.5.2 Enfermedad de von Willebrand Tipo 1. 
 
 Se manifiesta de forma autosomica dominante, es conocida como EVW clásica presenta 
penetrancia y fenotipo variable, el patrón de multímeros FVW observados en una 
electroforesis es reducido por lo que describe al tipo 1 de EVW como una deficiencia 
cuantitativa parcial del FVW. Presenta una frecuencia del 80 % por lo que es la forma de 
EVW más común, sin embargo su causa genética aun no ha sido bien comprendida 
(Montgomery, 2006; Eikenboom, 2006; Rodeghiero, 2005). 
 
Se han informado de algunas deleciones y mutaciones de cambio de sentido por ejemplo; 
C1130F y C1149R, en el dominio D3, estas mutaciones producen un FVW defectuoso que 
inhibe su secreción siendo retenido en el retículo endoplásmico, permitiendo sólo la 
liberación de los homodímeros silvestres, también se han encontrado mutaciones en los 
exones 19, 26, 28, 37 y 52 (ISTH-SSCVWF Online Database; Melo 2007; Sadler, 2005). 
 
Existen otros factores que afectan la variedad y penetrancia incompleta de este tipo de 
EVW como el grupo sanguíneo, ya que en las personas con tipo sanguíneo O los niveles de 
FVW son más bajos en un 25- 35 % que en los demás grupos sanguíneos. Esto podría 
deberse a una susceptibilidad mayor del FVW a sufrir proteólisis por ADAMTS-13 
(Bowen, 2004; Gill, 2009; Montgomery, 2006). 
 
Los pacientes manifiestan síntomas de hemorragias mucocutáneas cuya gravedad por lo 
general está correlacionada con su nivel de FVW, se evidencia por sangrado prolongado 
después de cortaduras, cirugías o traumatismos, en las mujeres puede ser detectado por una 
menstruación excesiva (Turgeon, 2006). 
 
5.5.3 Enfermedad de von Willebrand Tipo 2A. 
 
Estepadecimiento se caracteriza por un defecto de tipo cualitativo del FVW con ausencia 
de multímeros de elevado e intermedio peso molecular, presenta una herencia de tipo 
autosomica dominante. Existe ya sea una incapacidad biosintética para producir estos 
 
11 
 
multímeros o bien son producidos, segregados y subsiguientemente degradados de manera 
prematura en el plasma. 
 
Se han informado 66 mutaciones de cambio de sentido responsables de este tipo de EVW y 
estas mutaciones se dividen en dos grupos. En el primero se encuentran mutaciones como 
V1607D, S1506L y G51505R por mencionar algunas, las cuales afectan el transporte 
intracelular, provocan defectos en el ensamblaje, en el almacenamiento o en la secreción 
de los multímeros de alto peso molecular. En el segundo grupo se encuentran mutaciones 
como R1597W y G1505E que provocan defectos en la proteólisis de multímeros de alto 
peso molecular, los cuales son necesarios para la unión del complejo de glicoproteínas 
GPIb-IX-V e incrementa los multímeros de bajo peso molecular (Castaman, 2003; Jenkins, 
1998; Melo, 2007.) La mayoría de las mutaciones se han localizado en el exón 28 y tres en 
el exón 52 abarcando los dominios D2, D3, A1, A2 (ISTH-SSCVWF Online Database). 
 
5.5.4 Enfermedad de von Willebrand Tipo 2B. 
 
Esta caracterizada por el aumento en la afinidad del FVW al receptor GpIb plaquetario 
causando interacciones espontáneas entre FVW y plaquetas en el torrente sanguíneo, 
presenta un modo de herencia autosómico dominante. En muestras de sangre, esta 
interacción puede observarse como acumulación de las plaquetas y esta misma 
anormalidad con frecuencia produce trombocitopenia (recuento plaquetario bajo) leve a 
moderada, hay un déficit de multímeros de FVW de alto peso molecular en el plasma 
porque éstos se han ligado a las plaquetas. Otra prueba importante para confirmar la 
presencia del tipo 2B de la enfermedad es el incremento en la prueba RIPA, usando plasma 
rico en plaquetas del paciente y concentraciones de ristocetina de <0.6 mg/mL (Lillicrap, 
2008; Randi, 1991). 
 
Este desorden representa menos del 20% de las variantes del tipo 2, la mayoría de las 
mutaciones en la EVW tipo 2B se encuentran en el dominio A1 y se sabe que el 90 % son 
causadas por mutaciones en las posiciones 1306, 1308, 1316 y 1341(ISTH-SSCVWF Online 
Database; Cooney, 1991; Melo, 2007). 
 
12 
 
Un trastorno similar es causado por una mutación en el gen de la glicoproteína Ibα 
plaquetaria, lo que causa un incremento en la afinidad de adhesión al dominio A1 del 
FVW, como las manifestaciones clínicas son similares a la EVW tipo 2B es denominada 
pseudoenfermedad de von Willebrand. Por esta razón para diferenciar entre estas dos 
enfermedades se necesitan ya sea pruebas de aglutinación inducida por ristocetina de las 
plaquetas lavadas del paciente y mezcladas con plasma normal (que mostrará una mayor 
reactividad en el caso de la pseudoenfermedad de von Willebrand, pero no en el tipo 2B) o 
análisis de los genes del FVW y de la GpIbα (Lillicrap, 2008). 
 
5.5.5 Enfermedad de von Willebrand Tipo 2M (Milwaukee). 
 
La variante 2M se debe a un defecto cualitativo en la función del FVW que no le permite 
interaccionar adecuadamente con las plaquetas, presenta un modo de herencia autosómico 
dominante. Se han informado 18 mutaciones de las cuales 17 son de cambio de sentido 
pero no hay alguna que sea particularmente común en esta variante. La mutación en el tipo 
Vicenza (R1205H), ha sido informada en familias europeas y está asociada a un cambio en 
el nucleótido 740. La mayoría de las mutaciones han sido localizadas en el dominio A1, en 
el asa formada por puentes disulfuro entre C1272-C1458 que evita la unión con GPIbIX. 
Estas mutaciones incluyen la deleción del segmento R1392-Q1402 y las mutaciones de 
cambio de sentido G1324S, F1369I e I1425F. Los exones afectados en este tipo de EVW 
son 18, 27 y 28 que afectan a los dominios A1, D y D3. (ISTH-SSCVWF Online Database; 
Mancuso, 1996; Melo, 2007). 
 
5.5.6 Enfermedad de von Willebrand Tipo 2N (Normandia). 
 
 La EVW tipo 2N es causada por mutaciones en el sitio de unión del FVIII, sin cambio en 
la distribución de los multímeros del FVW en el plasma. Esta última forma mutante 
cualitativa de la EVW es diferente de todas las anteriores en varios aspectos. Su patrón de 
herencia es autosómico recesivo y frecuentemente la única anormalidad de laboratorio es 
un nivel plasmático reducido de FVIII por lo que con frecuencia se le confunde con 
hemofilia A. La confirmación del tipo 2N de la EVW requiere ya sea de una demostración 
directa de la disminución del FVW en su capacidad de unión del FVIII o de la 
 
13 
 
documentación de un genotipo correspondiente a la EVW tipo 2N (Lillicrap, 2008; 
Morales de la Vega, 2008; Jorieux, 1998). 
 
Se han descrito 16 mutaciones de cambio de sentido en los exones 18, 19, 20, 21, y 24 que 
codifican para la región comprendida entre los exones D’ y D3, distintas sustituciones de 
un solo aminoácido en el FVW maduro en las posiciones que están localizadas en el 
dominio D’ y en el dominio D3, dan como resultado una baja capacidad de enlace para el 
FVIII provocando una disminución en grado variable del FVIII:C. Los pacientes muestran 
una reducción de la actividad del FVIII mientras que la concentración de FVW es normal 
(ISTH-SSCVWF Online Database; Hilbert, 2003; Melo, 2007; Morales de la Vega, 2008). 
 
5.5.7 Enfermedad de von Willebrand Tipo 3. 
 
 La EVW tipo 3 es un trastorno de tipo cuantitativo, es muy raro y se hereda de forma 
autosomica recesiva. Es la forma más severa de la EVW debido a la ausencia o niveles 
muy bajos de FVW y niveles disminuidos de FVIII. La prevalencia de la EVW tipo 3 se 
estima en 1 a 3 personas por millón sin embargo suele ser mayor en lugares donde los 
matrimonios consanguíneos son frecuentes. La mayoría de los padres de pacientes con 
enfermedad tipo 3 muestran pocos, si no es que nulos síntomas hemorrágicos. Los 
pacientes manifiestan graves hemorragias mucocutáneas recurrentes, así como frecuentes 
hemorragias musculo esqueléticas y en tejidos blandos como en los pacientes con 
hemofilia (Quintana 2000; Lillicrap, 2008). 
 
Las eliminaciones totales o parciales del gen han sido relacionadas con esta variante, 
aunque también han sido informadas mutaciones en casi todos los exones del gen FVW, así 
mismo se han informado mutaciones que llevan a un corrimiento del marco de lectura o 
mutaciones sin sentido (Quintana, 2006). Se ha observado que la mutación 2680 del C 
terminal o R2535X es más frecuente al norte de Europa debido a que la región codificante 
del FVW contiene 11 codones CGA (arginina) por lo que los nucleótidos CG se convierten 
en puntos calientes para sufrir cambios de C a T lo que produce un codón de paro UGA 
(Castaman, 2003; Montgomery, 2006) .Este tipo de mutaciones han sido informadas en los 
 
14 
 
exones 9, 28, 32 y 45 y una eliminación que abarca los exones 26-34 y 27 en mutaciones 
sin sentido (ISTH-SSCVWF Online Database). 
 
5.5.8 Pseudoenfermedad de von Willebrand. 
 
También conocida como Enfermedad de von Willebrand plaquetaria. Se trata de un 
trastorno raro cuyo cuadro clínico se parece al de la enfermedad de von Willebrand por los 
niveles bajos o ausencia de las formas multiméricas grandes del FVW en el plasma. Los 
pacientes con la pseudoenfermedad de von Willebrand tienen una anormalidad plaquetaria 
en la que se produce agregación espontanea de las plaquetas. Los niveles bajos de 
multímeros grandes se deben al aumento en el consumo durante la agregación plaquetaria 
(Turgeon, 2006). 
 
5.5.9 Enfermedad de von Willebrand adquirida. 
 
En ocasiones, la enfermedad de von Willebrand se presenta como un trastorno adquirido 
relacionado a enfermedades autoinmunes, en las cuales se implica la presencia de un 
anticuerpo circulante contra el FVW y enmieloproliferativos, linfoproliferativos y 
gammapatias monoclonales benignas. Otro mecanismo causante de las cantidades bajas de 
FVW es la absorción del componente de coagulación en las superficies celulares 
anormales. Por lo general las complicaciones hemorrágicas son más graves en la forma 
adquirida y se observan niveles mucho más bajos en la actividad del FVW (20% o menos) 
en estas personas (Genderen, 1998; Turgeon, 2006). 
 
5.6 Herencia de la enfermedad de von Willebrand. 
 
La forma más frecuente de transmisión es autosómica dominante (Tipos 1, 2A, 2B y 2M), 
de alta penetrancia, pero de expresión muy variable inter e intra familiar. Aunque en 
algunos tipos (Tipos 2N y 3) la EVW se hereda como un rasgo autosómico recesivo (como 
se muestra en la figuras 5 y 6). Su patogenia está determinada por un defecto cuantitativo 
o cualitativo del factor von Willebrand (FVW). Debido a que el FVW es también 
 
15 
 
transportador del Factor VIII en plasma, la deficiencia del FVW conlleva a una alteración, 
tanto en la fase primaria como secundaria de la hemostasia (Paper, 2004). 
  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5: Árbol genealógico que muestra la herencia de la enfermedad de von Willebrand (Tomada 
de Paper, 2004). 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6: Patrones de herencia de la enfermedad de von Willebrand 
(Tomada de Lillicrap, 2009). 
 
5.7 Diagnostico la enfermedad de von Willebrand. 
 
La EVW se debe sospechar en aquel paciente con historia de sangramiento mucocutáneo, 
postoperatorio y especialmente en aquellos con una historia familiar sugerente. Las 
principales manifestaciones clínicas son hemorragias mucocutáneas como epistaxis, 
gingivorragias, hemorragias del tubo digestivo, equimosis, hematomas y menorragia. La 
tendencia hemorrágica es altamente variable y depende del tipo y severidad de la 
enfermedad (Perez-Requejo 1995; Garcia-Conde, 2003; Woods, 2008). 
 
 
16 
 
Dado que la única manifestación de hemorragias excesivas en mujeres con EVW pudiera 
ser la menorragia, es particularmente importante que se realice una evaluación detallada 
del historial menstrual de la paciente. Una hemorragia prolongada y excesiva a menudo se 
documenta después de intervenciones quirúrgicas orales, tales como amigdalectomías y 
extracciones dentales. En contraste, las hemorragias en tejidos blandos, hematomas 
musculares y hemartrosis pocas veces se manifiestan en la EVW, con excepción del tipo 3 
del padecimiento, en el que los niveles de FVIII son bajos. 
 
Debido a que muchos de los síntomas hemorrágicos de la EVW también ocurren con 
frecuencia en la población normal, la elaboración de un cuestionario formal sobre 
hemorragias podría resultar un medio eficaz y consistente para identificar pacientes que 
presentan un incremento en hemorragias, particularmente en el ámbito de la atención 
básica. El valor de una evaluación detallada como ésta en el ámbito de la atención 
especializada es menos evidente (Federeci, 2006; Haemophilia of Georgia, 2008; Lillicrap, 
2008). 
 
5.8 Historial familiar en la enfermedad de von Willebrand. 
 
La mayoría de los tipos de EVW son heredados como rasgos autosómicos dominantes, por 
lo que puede haber evidencia de un historial familiar de hemorragias excesivas. No 
obstante, este aspecto se complica considerablemente debido al hecho de que la mayoría de 
las formas de la enfermedad muestran penetración incompleta del fenotipo y expresividad 
variable de los síntomas hemorrágicos en el seno de las familias. 
 
En contraste, el tipo 3 de la enfermedad muestra un patrón hereditario recesivo con padres 
que por lo general no manifiestan síntomas clínicos. Por último, el tipo 2N de la EVW, en 
el que se presentan aisladamente bajos niveles de FVIII, también muestra un patrón 
hereditario recesivo y, por ende, también en este caso es posible que no exista un historial 
familiar (Budde, 2002; Lillicrap, 2009; Perez-Requejo, 1995). 
 
 
 
 
17 
 
5.9 Pruebas de laboratorio para la enfermedad de von Willebrand. 
 
En el laboratorio los componentes críticos del diagnóstico de la EVW incluyen la medición 
cuantitativa y cualitativa del FVW y del FVIII. 
 
Si el paciente tiene un historial crónico de pérdida de sangre, puede haber una deficiencia 
de hierro o anemia concomitante; el tipo 2B de la EVW frecuentemente está acompañado 
de una leve trombocitopenia crónica. El tiempo de sangrado no debe ser usado como 
prueba de detección habitual para la EVW, y la función exacta del analizador de la función 
plaquetaria, el PFA100®, para el diagnóstico de la EVW todavía no se ha aclarado. 
 
Además de estas pruebas de detección de laboratorio, las investigaciones más útiles para el 
diagnóstico son: una prueba inmunológica para la proteína del FVW, la prueba del 
antígeno del FVW (FVW:Ag), la prueba del cofactor de ristocetina (FVW:CoR), y una 
prueba para la función coagulante del FVIII (FVIII:C). Deberán establecerse los rangos 
normales locales para estas pruebas debido a la considerable variabilidad temporal de los 
valores del FVW y del FVIII, las pruebas deberán repetirse por lo menos dos veces antes 
de establecer el diagnóstico de EVW. 
 
 Al evaluar estos estudios es necesario tomar en cuenta varios factores ambientales y 
adquiridos. El efecto de los estrógenos en la elevación de los niveles de FVW y FVIII debe 
tenerse en cuenta durante el embarazo y en el caso de pacientes que toman anticonceptivos 
orales (Budde, 2002; Lillicrap, 2009; Moore, 2001; Perez-Requejo, 1995; Turgeon, 2006; 
Rubio, 2004). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
18 
 
VI. OBJETIVOS. 
 
6.1 General. 
 
 Realizar el análisis molecular en el exón 28 del gen VWF a 10 pacientes con 
diagnóstico probable de Enfermedad de von Willebrand (EVW) del Hospital de 
Pediatría CMN siglo XXI del IMSS, con el fin de confirmar el padecimiento y 
precisar el tipo de EVW. 
 
 
 
6.2 Particulares. 
 
 
 Amplificar por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) el exón 28 
del Factor de von Willebrand 
 
 Purificar los productos de PCR 
 
 Marcar los purificados de las muestras con Big-Dye 
 
 Purificar el marcado de las muestras y secuenciar con el fin de detectar alteraciones 
en la secuencia de nucleótidos. 
 
 Analizar los resultados de la secuenciación mediante el programa BLAST y la base 
de datos internacional (ISTH SSC VWF, Sheffield University). 
 
 
 
 
 
 
 
 
19 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
VII. HIPOTESIS. 
 
Debido a que el exón 28 del gen VWF es el más grande y que en él se encuentra el 43.27 % 
de las mutaciones reportadas probablemente se encontrarán mutaciones informadas que 
precisen el tipo de EVW, así como nuevas mutaciones 
 
 
20 
 
VIII. PACIENTES Y MATERIALES. 
 
8.1 Pacientes. 
 
Se tomó, previo consentimiento informado una muestra de sangre periférica a 10 pacientes 
(124, 128, 129, 146, 150, 160, 163, 175, 184, 187) mexicanos con posible Enfermedad de 
von Willebrand con un rango de edad de 1-18 años y de los cuales tres son de sexo 
masculino y siete de sexo femenino. Estos pacientes fueron canalizados por parte del 
Servicio de Hematología del Hospital de Pediatría del Centro Médico Nacional Siglo XXI 
a la Unidad de Investigación en Genética Humana del mismo Hospital. 
 
8.2 Material. 
 
 Tubos con EDTA 
 Tubos eppendorf 
 Puntas (1-20μl, 20-200 μL y 200-1000 μL 
 Gradillas 
 Micropipetas 
 Kit purificación de PCR ( Kit QIAquick PCR) 
 Kit purificación del marcado (Kit QIAquick Marcado) 
 
8.2.1 Biológico. 
 
Las muestras biológicas requeridas para el estudio es DNA extraído de leucocitos de 
sangre periférica (3-5 mL), recolectada en tubos Vacutainers® con EDTA como 
anticoagulante. 
 
8.2.2 Equipos. 
 
 Campana luz UV. 
 Termociclador “Mastercycler gradient Eppendorf” 
 
 
 
21 
 
 Concentrador eppendorf 
 Centrifuga eppendorf 
 Cámarade electroforesis Biorad 
 Transiluminador UV Biorad 
 
8.2.3 Reactivos. 
 
8.2.3.1 Extracción de DNA. 
 
 Solución de lisis (TRIS-CIH 20 mM, MgCl2 mM) 
 NaCl 5mM 
 NaCl solución saturada 
 SDS (Dodecilbenceno Sulfato de Sodio) 10% 
 Etanol al 100 % 
 Etanol al 70 % 
 
8.2.3.2 Electroforesis. 
 
 Agarosa 
 Buffer TAE lX 
 Bromuro de Etidio 0.5 µg/mL 
 Colorante de carga 
 
8.2.3.3 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 
 
 Buffer 10X para PCR (Tris-HCl/NaCl) de invitro gen 
 Cloruro de Magnesio 25mM de invitro gen 
 dNTP´s 2mM de Biogeneica 
 Taq polimerasa de Biogenica 
 Oligonucleótidos sintéticos (Primers)* 
 Agua esterilizada 
 
 
 
22 
 
*Tabla 2: Datos de los Primers utilizados para el análisis del exón 28 (gen FVW) 
REGIÓN  ORIENTACIÓN  SECUENCIA TAMAÑO  
AMPLIFICADO 
TEPERATURA DE 
FUSION °C (Tm) 
A  Sentido (F) 
Antisentido (R) 
CTC AGA AGT GTC CAC AGG TT 
TGG AGA TTT GGA ACA GTG TG 
543 (Pb)  56.4  
B  Sentido (F) 
Antisentido (R) 
AGC GAG GTC TTG AAA TAC AC 
TTG CTC CTG  TTG AAG TCG 
482 (Pb)  56.4 
C  Sentido (F) 
Antisentido (R) 
AGC CGA CTT GAA CAG GAG CA 
CCA GGT GCA GGG GAG AGG 
525 (Pb)  60 
 
 
8.2.3.4 Marcado DNA. 
 
 Buffer 5X (BigDye  Terminator v3.1 5X sequencing buffer) 
 Big Dye terminator de Amplied Biosystem 
 Primers Forward 
 Agua esterilizada 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
23 
 
IX. METODOLOGIAS Y FUNDAMENTOS. 
 
9.1 Extracción de DNA por concentración de sales. 
 
9.1.1 Fundamento. 
 
La extracción de DNA en una muestra celular se basa en las diferentes funciones de las 
soluciones hipo e hipertónicas sobre los leucocitos para permitir en primer lugar la lisis de 
la célula y en segundo la precipitación de las proteínas para dejar el DNA libre y que 
pueda ser precipitado con etanol. 
 
El primer paso en el proceso de extracción consiste en la lisis específica de los eritrocitos 
mediante una solución (TRIS-CIH 20 mM, MgCl2 mM) que deja intactos los leucocitos. 
Posteriormente los leucocitos se hidratan con una solución hipotónica (NaCl 5 mM), que 
facilita la lisis de las membranas por acción del SDS 10 % liberando el DNA del núcleo, 
una solución de NaCl saturada es utilizada para precipitar las proteínas, se utiliza etanol al 
100 % para insolubilizar el DNA y etanol al 70% para limpiarlo de las sales presentes en el 
medio, por último el etanol al 70 % es evaporado y el DNA es resuspendido en agua 
inyectable estéril ( Montiel, 2007). 
 
El DNA aislado puede ser almacenado a una temperatura de 2 a 8 ºC de manera estable 
aunque, como consecuencia del paso del tiempo, las muestras podrían sufrir una 
degradación progresiva. Por ello, se recomienda su almacenamiento a –20ºC en aquellos 
casos en los que las muestras no vayan a ser utilizadas de forma frecuente, preferiblemente 
en alícuotas de uso individual (Aránega, 2002). 
 
NOTA: Es necesaria la utilización de material estéril y guantes durante todo el proceso para evitar 
la contaminación y degradación del DNA por las DNasas presentes en las superficies. 
 
 
 
 
 
 
24 
 
9.1.2 Metodología. 
 
1. Centrifugar sangre total en EDTA a 5,000 rpm /15 minutos y separar los leucocitos, 
pasando estos a un tubo Eppendorf estéril de1.5 mL 
2. Lavar con solución de lisis centrifugando a 2400 rpm /10 minutos si el tubo es 
grande y a 5000 rpm / 10 minutos si el tubo es eppendorf, repetir 2-3 veces. 
3. Se elimina la mayor cantidad de sobrenadante posible dejando el pellet de 
leucocitos, agregar 180 µL de NaCl a 5 mmol y agitar en vortex, dejar reposar 10 
minutos a Tº ambiente. 
4. Agregar 90 µL de SDS al 10 %, agitar bien por 10 minutos 
5. Agregar 690 µL de NaCl saturada, agitar manualmente por 10 minutos y 
centrifugar a 13000 rpm / 10 minutos esto con el fin de separar la solución que 
contiene el DNA de los restos celulares. 
6. En caso de tener hemoglobina residual agregare solución de fenol y centrifugar a 
10,000 rpm / 10 minutos. 
7. Pasar el sobrenadante a dos tubos eppendorf (2 volúmenes). Es fundamental 
recuperar la mayor parte de sobrenadante posible, aunque un pequeño volumen 
debe quedar remanente junto con el pellet de proteínas con el fin de evitar la 
contaminación de la solución de DNA con estas proteínas que interferirían en su 
purificación. 
8. Agregar 800 µL de etanol a los 2 volúmenes y centrifugar a 10,000 rpm / 5 minutos 
para recuperar el DNA en forma de un pequeño pellet blanco. Puesto que el pellet 
de DNA es extremadamente lábil, debe prestarse un especial cuidado a la hora de 
eliminar el sobrenadante lo cual puede realizarse por decantación o por aspiración 
con una micropipeta 
9. Resuspender el botón en 700 µL de etanol al 70% (lavar DNA) y centrifugar 
10,000 rpm / 10 minutos repetir 3 veces 
10. Evaporar el etanol a 50 ºC / 10 minutos en estufa o leofilizador 
11. Resuspender en 200 µL de agua estéril. 
12. La muestra de DNA resuspendido puede almacenarse a 2–8ºC hasta su utilización, 
o bien congelar a –20ºC. 
 
 
 
25 
 
9.2 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 
 
9.2.1 Fundamento. 
 
Se basa en la síntesis de millones de copias de un fragmento específico de DNA delimitado 
por el apareamiento de dos moléculas cebadoras o primers con la molécula de DNA. La 
síntesis y copia del fragmento de DNA sucede por la acción de una DNA polimerasa, que 
une ácidos nucleicos sintéticos a la hebra simple de la molécula de DNA resultante de la 
desnaturalización de la cadena doble original, formando una nueva cadena doble que 
posteriormente será sujeto de desnaturalización y plantilla de nuevas moléculas de DNA 
(Mas, 2007; Montiel, 2007; Luque, 2001). Como se muestra en la fig. 7 
 
Figura 7: Pasos de la reacción en cadena de la polimerasa: En ella se observa que al terminar el 
primer ciclo las cadenas nuevas no tienen un tamaño especial, sin embargo este se irá afinando 
conforme los ciclos progresan (Tomada de obgynacademy.com). 
 
 
 
 
26 
 
Un problema muy importante que se puede plantear en una PCR es el de la contaminación. 
Debido a la capacidad de esta técnica de amplificar cantidades muy pequeñas de DNA, 
existe un elevado riesgo de contaminación con moléculas no deseadas que pueden ser 
amplificadas, llevando a errores en la interpretación de resultados: Para evitarlo es 
conveniente utilizar pipetas automáticas dedicadas exclusivamente a PCR, además de 
puntas esterilizadas. Se recomienda también que la PCR se realice en una habitación 
dedicada exclusivamente a este uso, a ser posible, en campana de flujo laminar (Aránega, 
2002;). 
 
En la reacción en cadena de la polimerasa siempre nos vamos a encontrar una serie de 
componentes necesarios para que esta se lleve a cabo. 
 
1. Enzima polimerasa 
2. Buffer de la enzima 
3. Cationes divalentes (Mg++) 
4. Desoxynucleotidos trifosfatos (dNTPs) 
5. Cebadores o Primers de sentido y antisentido que se unen a los extremos 3’ 
6. DNA genómico o cDNA 
 
La mezcla de reacción es sometida cíclicamente a cambios de temperatura, que oscilan 
entre los 25 a 40 ciclos (Crocker, 2003; Walker, 1997). 
 
9.2.2 Metodología. 
 
 Normalmente la manera de proceder es preparando una mezcla de N + 1 (siendo N el 
número de muestras a amplificar) que contenga todos los componentes descritos menos el 
DNA. Por otro lado, en tubos eppendorf debidamente rotulados, pondremos la cantidad de 
DNA apropiadamente y añadiremos la cantidad de mezcla necesaria hasta completar el 
volumen de reacción el volumen de reacción (25 L). 
 
 
 
 
 
27 
 
Tabla 3: Componentes de una PCR para 25 L 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabla 4: Secuencia de primers empleados 
 
REGIÓN  ORIENTACIÓN SECUENCIA 
A  Sentido (FW) 
Antisentido (RV) 
CTC AGA AGT GTC CAC AGG TT 
TGG AGA TTT GGA ACA GTG TG 
B  Sentido (FW) 
Antisentido (RV) 
AGC GAG GTC TTG AAA TAC AC 
TTG CTC CTGTTG AAG TCG 
C  Sentido (FW) 
Antisentido (RV) 
AGC CGA CTT GAA CAG GAG CA 
CCA GGT GCA GGG GAG AGG 
 
Componentes  µL 
Buffer 10X 2.5 
dNTP`s (200 µM) 1.0 
MgCl2 (25 mM) 1.5 
Primer F (10 pM)* 1.0 
Primer R (10 pM)* 1.0 
H2O 16 
Taq Polimerasa  (5 U / µL)  0.25 
DNA  2.0 
Volumen total   25 
*Dependiendo de la región que se desee 
amplificar se usaran los primers específicos para 
esa región como se muestra en la tabla 3. 
 
28 
 
 
Posteriormente son llevadas al Termociclador el cual requiere de diferentes condiciones de 
hibridación según la región del exón para que se lleve a cabo la reacción. 
 
Tabla 5: Condiciones del Termociclador para PCR 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
** Región A: 50.7 °C. Región B: 53.5 °C. Región C: 61.6 °C. 
 
9.2.3 Visualización de los resultados. 
 
Para ver los fragmentos de DNA que se amplificaron en la PCR, se debe llevar parte del 
producto a un corrimiento electroforético en gel de agarosa o poliacrilamida. 
 
9.3 Electroforesis en gel de agarosa. 
9.3.1 Fundamento. 
Es un método que permite la separación de moléculas en base a su tamaño. Esta separación 
se realiza en un gel, que es una malla compleja de moléculas poliméricas. Los geles 
pueden ser de agarosa o poliacrilamida. La agarosa es conveniente para separar fragmentos 
de ácidos nucleicos en el rango desde unos pocos cientos, hasta aproximadamente 20000 
ETAPA  TEMPERATURA ºC  TIEMPO MINUTOS 
Inicio  94  4.0 
Desnaturalización 94  0.30 
Hibridación  **  0.25 
Amplificación  68  0.45 
Finalización  72  7.0 
 
29 
 
pares de bases. La poliacrilamida es usada para la separación de fragmentos más pequeños 
de ácidos nucleicos (Etienne, 2001; Klug, 2006). 
El fundamento de esta separación está basado en que las moléculas de ácidos nucleicos 
están cargadas negativamente (al pH y condiciones del tampón en el que se encuentran) y 
al someterlas a un campo eléctrico migran hacia el polo positivo de este a través del gel, a 
velocidades que dependen de sus tamaños: una molécula pequeña puede seguir su camino 
a través del gel más fácilmente que una molécula grande. La detección tras la migración se 
realiza fácilmente gracias al empleo de un colorante intercalante (se intercala entre las 
bases de los ácidos nucleicos mediante enlaces de tipo Van der Wals ) que contiene el 
propio gel y es visualizado al emitir luz visible cuando el gel se ilumina con luz 
ultravioleta (Tagu; 2006; Yabar; 2003). 
 
Los geles de alta concentración mejoran la resolución de los fragmentos de DNA de 
pequeño tamaño. Los geles de baja concentración permiten una mejor separación de los 
fragmentos de gran tamaño, mientras que tiende a comprimir los de pequeño tamaño. 
Como ejemplos de concentraciones óptimas según el tamaño de DNA en Kilobases (Kb) 
podemos considerar los mostrados en la tabla 5 (Aránega, 2002). 
 
Tabla 6: Concentraciones recomendadas de agarosa dependiendo del tamaño de DNA. 
 
Concentración % agarosa Rango DNA (Kb)
0.8 0.8-1.0 
1.0 0.4-8 
1.2 0.3-7 
2.0 0.1-3 
 
 
 
30 
 
La electroforesis es realizada a un pH que permite que las moléculas de DNA continúen 
cargadas negativamente y en doble cadena como se muestra en la figura 8. Hay numerosos 
buffers que pueden ser usados en electroforesis, los más comunes son el TBE (tris-borato-
EDTA) y el TAE (Tris-acetato-EDTA) ambos mantienen un pH entre 7.5 y 7.8, para cargar 
adecuadamente la muestra en el gel es necesario la utilización de un colorante o buffer de 
carga que contiene colorantes que migran hacia el ánodo en el campo eléctrico, el cual 
tiene tres funciones (Yabar 2003; Watson, 2006). 
1. Incrementar la densidad de la muestra 
2. Asegurar que el DNA descienda uniformemente en el pocillo 
3. Añadir color a la muestra 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 8. Separación del DNA por medio de electroforesis en gel: La figura muestra a sistema de 
electroforesis en gel visto en un corte transversal. El DNA posee una carga negativa por lo que 
migran al polo positivo atravesando el gel (Tomada de Watson, 2006). 
 
 
 
 
 
 
 
31 
 
9.3.2 Metodología. 
 
El gel de agarosa debe estar a una concentración de 1.2 % 
1. Pesar 0.24 g de agarosa y medir 20 mL de TAE 1x 
2. Colocarlos en un matraz Erlen meyer 
3. Calentar en horno de microondas hasta disolver perfectamente, sin dejar ebullir. 
4. Colocar 1 µL de Bromuro de Etidio (BrEt)* 
5. Por otro lado, sellar la placa de electroforesis y colocarle el peine 
6. Verter la solución en la placa y dejarla gelificar. 
*Nota: El BrEt es un agente mutagénico por lo que al manipularlo se tiene que usar 
guantes. 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 9: Preparación del gel de agarosa para la electroforesis. 
 
Al gelificar el gel se retiran los peines y se coloca en la cámara de electroforesis y se cubre 
con el buffer TAE1X, para cargar la muestra se coloca en un papel parafilm 2 μL de 
colorante, posteriormente adicionar 2 μL de la muestra se homogeniza con el colorante de 
carga y se coloca en un pozo del gel. 
 
9.3.3 Visualización de los resultados. 
 
Para visualizar el avance del DNA a través del gel de electroforesis se tiene que llevar el 
gel a un transiluminador de luz ultravioleta con una longitud de onda de 254-302 nm. 
La primera nos ofrece una fluorescencia más intensa con el bromuro de etidio pero, causa 
más daño al DNA. Hay que tener muchas precauciones cuando se use un transiluminador 
ya que puede dañar los ojos y la piel (figuras 11 y 12). 
 
32 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 10: Modelo de transiluminador utilizado en La Unidad de Genética Humana del Hospital de 
Pediatría CMN Siglo XXI (Tomada de la Universidad de León, 2004). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 11. Electroforesis en gel de agarosa: La figura muestra la electroforesis de un producto de 
PCR en los carriles M se encuentra el marcador de peso molecular de 50 pb, en los carriles 1, 2 y 3 
se observan amplificados de 400 pb, el carril 4 es el correspondiente al blanco (Tomada de ACE 
Revista de Enología). 
 
 
 
 
 
33 
 
9.4 Purificación del producto de PCR. 
 
9.4.1 Fundamento. 
 
1. El procedimiento de purificación mediante el Kit QIAquick PCR implica la 
disolución de la reacción del PCR en un buffer de unión y cargado en una 
membrana de silicio de alta capacidad al cual el DNA es selectivamente adsorbido 
(Figura 12). Después de un lavado para eliminar enzimas, buffers, primers y 
DNTPs, el DNA purificado es diluido en buffer TE o agua estéril (QIAquick® Spin 
Handbook, 2008). 
. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 12. Ejemplo de purificación del producto de PCR: Un exceso de Primer (40 bases) se añadió 
al las reacciones de PCR que contenía una escala de DNA de 1 Kb. La escala fue purificada con el 
Sistema de Purificación Rápido de PCR. La línea 1 muestra la mezcla impura y la línea 2 muestra 
el producto purificado (Tomada de QIAquick® Spin Handbook, 2008). 
 
9.4.2 Metodología. 
 
Este procedimiento está diseñado para purificar fragmentos de DNA de cadena sencilla o 
doble, productos de PCR u otras reacciones enzimáticas, siga el procedimiento como se 
describe para reacciones de PCR. Los fragmentos en promedio de 100bp a 10kb se limpian 
de oligonucleótidos, polimerasas y sales usando las columnas de QIAquick en una 
microcentrífuga. 
 
34 
 
1. Añadir 5 volúmenes de buffer PBI (buffer de unión) a 1 volumen de la reacción 
de PCR y mezclar, por ejemplo: Añadir 500 ml de buffer PBI a 100 ml de la 
reacción de PCR. 
2. Verificar que el color de la mezcla es amarilla (similar al buffer PBI). Si el color 
de la muestra es naranja o violeta, añadir 10 ml de Acetato de sodio 3M, pH 5 y 
mezclar. El color de la mezcla cambiará a amarillo. 
3. Poner una columna de QIAquick en un tubo de colecta de 2 ml (incluido en el 
kit) y agregar toda la muestra en la columna QIAquick, centrifugar por 30 a 60 
segundos (Esto retiene al DNA en la columna).4. Desechar lo colectado, poner de nuevo la columna QIAquick en el tubo de 
colecta, añadir 750 ml de buffer PE (buffer de lavado) a la columna QIAquick y 
centrifugar por 30 a 60 segundos. 
5. Desechar lo colectado, colocando de nuevo la columna QIAquick en el mismo 
tubo de colecta y centrifugar un minuto más. Es muy importante desechar lo 
colectado antes de centrifugar de nuevo de lo contrario no será removido 
completamente el etanol. 
6. Poner la columna QIAquick en un tubo eppendorf nuevo de 1.5 ml. 
7. Para eluir el DNA agregar 50 ml de buffer EB (10mM Tris.Cl, pH 8.5) o agua 
bidestilada estéril o inyectable en el centro de la membrana de la columna 
QIAquick, deje reposar 1 minuto a temperatura ambiente y centrifuge por 1 minuto. 
Es muy importante que el buffer o agua se deposite directamente en la membrana 
de la columna QIAquick para la completa elución del DNA que estaba retenido en 
la columna. 
El promedio del volumen eluido es de 48 ml, la eficiencia de la elución depende del 
pH. La eficiencia máxima de elución se consigue con un pH entre 7.0 y 8.5. 
Cuando use agua asegúrese de que el valor de pH está dentro de este rango, guardar 
el DNA a –20°C ya que el DNA puede degradarse en ausencia de un agente buffer. 
El DNA purificado puede eluirse en TE (10mM Tris.Cl, 1mM EDTA, pH 8.0), pero 
el EDTA puede inhibir reacciones enzimáticas subsecuentes. 
 
 
 
 
Producto de PCR 
Fragmentos 
puros de 
DNA 
 
35 
 
NOTAS: 
 
 El color amarillo del Buffer PBI indica un pH < 7.5. 
 
 Añadir etanol (96 a 100%) al buffer PE antes de usarlo (ver indicaciones en el 
envase). 
 
 Todos los pasos en la microcentrífuga son a10,000 x g (13,000 rpm) en una 
microcentrífuga de mesa convencional. 
 
9.5 Secuenciación. 
 
El método de Sanger se basa en el uso de la DNA polimerasa para sintetizar cadenas de 
DNA con una terminación específica. Con este método se generan fragmentos de DNA de 
todos los tamaños posibles que se puedan distinguir entre sí, por el tipo de marcaje que 
llevan o por la incorporación de un terminador específico. Las enzimás del tipo de la DNA 
polimerasa requieren de un templado de DNA de cadena sencilla, y realizan la síntesis de 
la hebra complementaria extendiéndola a partir de un iniciador en dirección 5’ a 3’. Entre 
los componentes de la reacción se incluyen nucleótidos que no tienen un grupo hidroxilo 
en su extremo 3’ (ddNTP), para poder obtener una terminación especifica en las cadenas. 
Una vez que el ddNTP se incorpora como el residuo terminal, evita que la cadena de DNA 
sintetizada continúe extendiéndose. La incorporación de los ddNTPs es al azar, 
obteniéndose así fragmentos de todos los tamaños posibles que terminan en un residuo 
específico (Etienne, 2001; Necochea, 2006;). 
 
La marcación del DNA amplificado se lleva a cabo por medio de PCR utilizando Big Dye, 
al final de la reacción el producto es purificado y corrido en un secuenciador automático, 
estos pasos son detallados a continuación. 
 
 
 
 
 
 
36 
 
9.5.1 Marcaje con Big Dye. 
 
9.5.1.1 Fundamento. 
 
El Marcado del DNA con Big Dye se basa en el método del nucleótido terminal. En este 
caso, el nucleótido responsable de la terminación es un ddNTP marcado con un 
florocromo. Esto asegura que todas las cadenas sintetizadas a partir de un templado, lleven 
incorporado una sola marca en el mismo lugar (al final de la cadena, en el extremo 3’). De 
esta manera, se obtienen fragmentos que producen bandas uniformes y cuyas secuencias se 
pueden determinar más fácilmente (Walker, 1997; Tagu, 2006). 
 
 El Big Dye Terminator contiene una mezcla de ddNTP´s (ddATP, ddCTP, ddGTP, y 
ddTTP) marcados con fluorocromos distintos, dNTP´s (dATP, dCTP, dGTP, y dTTP), 
DNA polimerasa AmpliTaq y MgCl2. Por lo que se pueden llevar a cabo en el mismo tubo, 
y ya no se tienen que hacer por separado. Además como las bandas que se ven emiten una 
señal distinta dependiente del nucleótido terminal incorporado permite que las bandas 
puedan ser diferenciadas en un solo carril (Necochea, 2006). 
 
9.5.1.2 Metodología. 
 
Normalmente la manera de proceder es preparando una mezcla de N + 1 (siendo N el 
número de muestras a amplificar) que contenga todos los componentes descritos menos el 
DNA. Por otro lado, en tubos eppendorf debidamente rotulados, pondremos la cantidad de 
DNA apropiadamente y añadiremos la cantidad de mezcla necesaria hasta completar el 
volumen de reacción el volumen de reacción (10 L). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
37 
 
Tabla 7: Marcaje del amplificado de PCR para 10 L. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Posteriormente son llevadas al Termociclador bajo las siguientes condiciones 
 
Tabla 8: Condiciones del Termociclador para el marcado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nota: al concluir el marcado agregar 10 µL de H2O, para un volumen total de 20 µL. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Componentes µL 
Buffer 5X 3 
Big Dae 1 
Producto de PCR 1-4* 
Primer 1 
H2O cbp 10 
Volumen total 10 
*Por cada 100 pb 10 ng/l 
 
ETAPA TEMPERATURA 
ºC 
TIEMPO 
MINUTOS 
Inicio 94 2.0 
Desnaturalización 96 0.10 
Hibridación 50 0.5 
Amplificación 60 4.0 
 
38 
 
9.5.2 Purificación del marcado. 
 
9.5.2.1 Fundamento. 
 
La purificación del marcado se realiza por medio de una cromatografía de exclusión en gel, 
(Sephadex), el cual está constituido por microesferas sintéticas derivadas de dextrano en la 
cual las moléculas de gran tamaño no entran en los poros del Sephadex eluyendo 
rápidamente al final de la columna, mientras las moléculas pequeñas difunden a través del 
gel haciendo que su paso por el sephadex sea más lento (como se muestra en la figura 13). 
Como la molécula del DNA marcado es mayor a las moléculas de reactivos utilizados en el 
marcado, esta eluye más rápidamente que los reactivos y se puede recolectar en un tubo 
eppendorf (Analytica-World., Wikipedia). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura13: Principio de la separación con Sephadex 
(Tomada de DyeEx™ Handbook. QIAGEN, 2002). 
 
 
 
 
 
 
39 
 
9.5.2.2 Metodología. 
 
1. Colocar la columna en un tubo de 1.5 mL 
2. Agregar 1 mL de Sephadex* 
3. Centrifugar a 3,000 rpm / 3 minutos 
4. Desechar el agua y verificar que el volumen de Sephadex en la columna sea de por 
lo menos ¾ del volumen de la columna. 
5. Colocar la columna en tubo eppendorf de 1.5 mL estéril 
6. Agregar el DNA marcado a la columna, cuidando que este caiga en el centro de la 
columna. 
7. Centrifugar a 3,000 rpm / 3 minutos para obtener el purificado 
8. Leofilizar a 30 ºC / 30 minutos (hasta sequedad) 
 
 *Nota preparación del Sephadex: Agregar 2.6 g de Sephadex 50Grad en 40 mL de agua 
inyectable, agitar y dejar reposar por 2 horas posteriormente proceder a su utilización. No 
utilizar después de 2 días. 
 
9.5.3 Secuenciación Automatizada. 
 
9.5.3.1 Fundamento. 
 
Dentro del aparato para secuenciación los fragmentos se separan por medio de una 
electroforesis capilar dependiendo de su tamaño, como cada banda tiene un florocromo 
especifico dependiendo del nucleótido en el cual haya terminado ese fragmento, este es 
detectado por medio de un laser a diferente longitudes de onda y comunicada al detector 
para ser por ultimo interpretada por el ordenador y expresada en forma de un 
electroferograma como se muestra en la figura 14 (Necochea, 2006). 
 
 
 
 
 
 
40 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 14: Ejemplo de electroferograma. 
 
9.5.3.2 Metodología. 
La unidad de genética humana del hospital de pediatría CMN Siglo XXI no posé un 
secuenciador automático, por tal motivo al terminar la purificación del marcado, son 
rotuladas y enviadas al Instituto de biología de la UNAM quien colabora con nosotros. 
9.5.4 Análisis de los datos obtenidos. 
Los resultados obtenidos de la secuenciación son entregados en forma de archivo 
electrónicoel cual se abre mediante el programa CHROMAS, que nos permite alinear la 
secuencia de las muestras con la secuencia del exón 28 que está en la red mediante la 
herramienta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) permitiéndonos detectar si la 
secuencia presenta alguna alteración, para posteriormente buscar en la base de datos ISTH 
SSC VWF de la universidad de Sheffield (Novo, 2007; Watson, 2006). 
 
 
41 
 
X. RESULTADOS Y ANALISIS DE RESULTADOS. 
 
10.1 pacientes. 
 
Se realizó el análisis molecular del gen FVW (exón 28) a 10 pacientes canalizados por 
parte del departamento de hematología de los cuales tres son de sexo masculino y siete son 
de sexo femenino, cuyo rango es de 1-18 años. En el departamento de hematología se les 
realizaron diferentes pruebas de laboratorio (tabla 1) con el fin de ayudar al médico a 
obtener un diagnóstico. 
 
Tabla 9: Resultados de las pruebas realizadas en el laboratorio clínico del hospital de 
pediatría a los 10 pacientes estudiados. 
 
M: Masculino. F: Femenino. ND: No determinado. Ivy: Prueba de tiempo de sangrado. TP: 
Tiempo de protrombina. TTPa: Tiempo de tromboplastina parcial activada. FVW:Ag: 
Antígeno de FVW. 
 
 
 
Num.  Edad 
Sexo 
Diagnostico  Ivy  Plaquetas  TP 
(Seg.) 
Testigo 
TP 
(Seg.) 
INR  TTPa 
(Seg.) 
% Agregación 
Plaquetaria 
Ristocetina 
FVW:Ag 
124  18/M  EVW 
 
ND  220 000  11.1´´  12.8´´  0.83 37´´  62.5  ND 
128  12/F  EVW  ND  276 000  14.7´´  12.7´´  1.18 47.32´´  ND  ND 
129  02/M  EVW  ND  222 000  20.8´´  13.1´´  1.57 51.35´´  ND  ND 
146  F  Coagulopatía  ND  ND  ND  ND  ND  ND  ND  ND 
150  14/F  EVW 
 
6´28´´  234 000  11.98´´ 13.3´´  0.91 32.53´´  87.5  55.6 
160  07/M  Coagulopatía  ND  341 000  12.06´´ 13.21´´  0.93 36.89´´  53  48.8 
163  11/F  Coagulopatía  3´49´´  305 000  10.96´´ 12.1´´  0.89 26.77´´  76.25  119 
175  1/F  Coagulopatía  ND  316 000  ND  ND  ND  ND  ND  ND 
184  12/F  Probable EVW 
Confirmar o 
descartar 
EVW 
 
 
8´30´´ 
 
 
175 000 
 
 
11.54´´
 
 
12.3´´ 
 
 
0.89
 
 
35.47´´ 
 
 
106.25 
 
 
61.7 
187  2/F  Confirmar o 
descartar 
EVW 
3´22´´  314 000  12.63´´ 12.63´´  0.98 36.25´´  83.75  86.9 
 
42 
 
 De las 10 muestras estudiadas, 4 tenían diagnóstico previo de EVW aun sin 
clasificar, 2 de Coagulopatía y 2 eran para confirmar o descartar EVW. 
 
 3 de los pacientes presentaban un tiempo de sangría normal, en 2 estaba 
prolongado y 5 no tenia reporte de este estudio. 
 
 El TP fue normal en 7 de los pacientes y en 1 estaba prolongado. 
 
 3 pacientes presentaron un TTPa prolongado y 5 un TTPa normal. 
 
 El % de agregación plaquetaria con ristocetina esta elevado en 3 pacientes, en 2 es 
normal, esta disminuido en uno y en 4 no hay reportes del estudio. 
 
 El FVW es normal en 3 pacientes, en 2 esta disminuido y 5 no presentan reporte 
del estudio. 
 
10.2 Amplificación de los 3 segmentos del exón 28 por PCR. 
 
A partir de la extracción de DNA de leucocitos de sangre periférica tomada de cada uno de 
los pacientes, se procedió a amplificar el exón 28 en tres regiones denominadas A, B, C, se 
procede de esta manera debido a que el exón completo es demasiado grande por lo cual al 
intentar amplificarlo los resultados serian inespecíficos y puede ocurrir el plegamiento de 
primers. 
 
Los productos de PCR de los tres segmentos del exón 28 se visualizaron mediante 
electroforesis en gel de agarosa al 1.2 % (figura 15). 
 
 
 
 
 
 
 
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Figura 15: Ejemplo de una electroforesis en gel de agarosa al 1.2 % para PCR de las tres regiones 
del exón 28 (A, B, C con aproximadamente 500 pb cada una) del gen VWF en diferentes pacientes. 
 
10.3 Purificación de los amplificados. 
 
Como el producto de PCR contiene restos de reactivos se procede a purificar la reacción 
con el Kit QIAquick PCR para posteriormente correr una electroforesis en gel de agarosa 
1.2 %. Se utiliza un marcador de peso molecular, para verificar que el tamaño del 
fragmento sin impurezas corresponde al segmento deseado. (figura 16). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Figura 16: Ejemplo de una electroforesis en gel de agarosa al 1.2 % de los purificados de las tres 
regiones del exón 28 (A, B, C con aproximadamente 500 pb cada una) del gen VWF en diferentes 
pacientes. 
 
10.4 Secuencias. 
 
Al obtener los purificados del producto de PCR de cada una de las tres regiones de los 
pacientes, éstas fueron marcadas con Big Dye Terminator por medio de una reacción de 
PCR, al finalizar la reacción está fue purificada para eliminar restos de reactivos que 
pudieran interferir en la secuenciación, posteriormente fueron liofilizadas y enviadas al 
departamento de secuenciación del Instituto de Biología de la UNAM. 
 
El resultado de la secuenciación es un electroferograma el cual nos es entregado vía 
archivo electrónico y es interpretado por medio del programa CHROMAS, lo que nos 
permite visualizar la secuencia, el programa contiene una herramienta de nombre BLAST 
programa que nos permite alinear las secuencias de los pacientes (Query) con la secuencia 
de referencia (Subjet) en este caso del exón 28 que se encuentra en la base de datos del 
Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI). Por último los cambios 
encontrados en el análisis de la comparación de las secuencias Query y  Subjet son 
 
45 
 
buscados en la base de datos de la universidad de Sheffield con el fin de investigar si ya 
han sido reportados o se trata de un cambio nuevo. 
 
Esta comparación nos permite encontrar algún cambio en los nucleótidos como los que 
se muestran en las figuras 17, 18 y 19. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 17: Ejemplo de cambio de nucleótido en las posiciones 1034 y 1039 del gen VWF. Arriba se 
ve la secuencia normal correspondiente a las posiciones 1034 y 1039 del exón 28 (gen FVW), 
abajo se muestra la secuencia alterada en la cual se observa la presencia de otro nucleótido en las 
mismas posiciones (heterocigotos). Estas alteraciones corresponden a un polimorfismo (F1501) y a 
una mutación (L1503P) ambas reportadas en la literatura. 
 
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Figura 18: Ejemplo de cambio de nucleótido en la posición 1269 del gen VWF. Arriba se ve la 
secuencia normal correspondiente a la posición 1269 del exón 28 (gen FVW), abajo se muestra la 
secuencia alterada en la cual se observa la presencia de otro nucleótido en la misma posición 
(heterocigoto). Esta alteración corresponde a la mutación L1580V que ya se encuentra reportada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Figura 19: Ejemplo de cambio de nucleótido en la posición 1196 del gen VWF. Arriba se ve la 
secuencia normal correspondiente a la posición 1196 del exón 28 (gen FVW), abajo se muestra la 
secuencia alterada en la cual un nucleótido de Adenina (A) ha sido cambiado (homocigoto) por uno 
de Citosina (C). Esta alteración corresponde al polimorfismo A1555 que ya se encuentra reportado. 
 
Los resultados obtenidos al finalizar el análisis molecular del exón 28 en los 10 pacientes 
fueron los siguientes: 7 mutaciones de las cuales 3 están reportadas y 4 son nuevas así 
como 10 polimorfismos de los cuales 7 ya habían sido reportados previamente y 3 no 
presentan reporte previo. (Tablas 9 y 10) 
 
 
 
 
 
 
 
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Tabla 10: Mutaciones encontradas en el exón 28 del gen FVW. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
No. 
Muestra 
Cambio de 
nucleótido 
No.de 
Nucleótido en 
cDNA 
No. de 
Nucleótido en  
exón 28 
Cambio de 
aminoácido 
Clasificación 
(Tipo EvW) 
Referencia 
124 G / C 
 
3967 498 Asp1323His --------------- ------------------ 
124,128, 
150,184 
T / C 4106 637 Fel1369Ser --------------- ------------------ 
150, 160 T / C 
 
4508 1039 Leu1503Pro 2A Francia / French 
Network 
184 C / G 4687 1218

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